CN114591430B - Bsa单克隆抗体及其应用、含有抗体的bsa检测试剂盒 - Google Patents

Bsa单克隆抗体及其应用、含有抗体的bsa检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种BSA抗体B2以及BSA抗体B6，及其在ELISA检测样本中BSA含量中的应用，和含有上述抗体的BSA检测试剂盒。本发明为BSA ELISA检测试剂盒的抗体原料提供开发方法，采用杂交瘤技术制备了6株抗BSA的单克隆抗体，从中筛选到两株用于双抗夹心ELISA配对，ELISA检测灵敏度高，特异性强。通过杂交瘤测序获得了这两株抗体的氨基酸序列，抗体的氨基酸序列可以用于基因工程技术快速制备单克隆抗体。

Description

BSA单克隆抗体及其应用、含有抗体的BSA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种BSA单克隆抗体及其应用，以及含有抗体的BSA检测试剂盒，属于生物工程技术领域。
背景技术
牛血清白蛋白（BSA），是血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，等电点为4.7。BSA不仅在生化实验中有广泛的应用，例如在ELISA和WesternBlotting中作为封闭剂，在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中的蛋白浓度，对酶起保护作用，BSA也在生物制品的生产中广泛存在，例如血清培养基中含有大量BSA，大多数商业无血清培养基的配方中也含有显著BSA。生物制品经过纯化后可能依然存在痕量残留的BSA，微量的BSA的残留会导致免疫反应或者疾病的产生。BSA的残留是生物制品质量控制的指标，与安全性有关。BSA的残留可以用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测，而目前市场上BSA ELISA检测试剂盒的灵敏度都较低。
发明内容
本发明筛选到两株BSA抗体，用于双抗夹心ELISA配对时，ELISA检测灵敏度高，特异性强。
本发明采用的技术方案为：一种BSA抗体B2，其特征在于其氨基酸序列为：
轻链可变区序列为：
VKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSLYDESWVRQTPEKRLEWVAEIFLGVYRYVPESKVRFTMSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCVRLCYWEPEVKKCWGQGTTVTVSS，
其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：LYDES，
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：EIFLGVYRYVPESKV，
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：LCYWEPEVKKC ；
重链可变区序列为：
DIELTQSPLTLSVTIGQPASISCESDLSLKESLDWLLQRPGQSPKRLIYEDLNADCGVPDRFTGSGSGTDSTLKISRVEAEDLGVYYCEIKGTFRWSFGGGTKLEIK，
其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：SDLSLKESLD，
重链可变区CDR2氨基酸序列为：EDLNADC，
重链可变区CDR3氨基酸序列为：EIKGTFRWS 。
本发明还公开了上述的BSA抗体B2在ELISA检测样本中BSA的应用。
本发明还公开了一种BSA抗体B6，其特征在于其氨基酸序列为：
轻链可变区序列为：
VQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGQYVSWVKQRPGQGLEWIGEDNKSSRQGTEYSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDEVRSETYWGQGTTVTVSS，
其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：GQYVS ，
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：EDNKSSRQGTEYS ，
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：DEVRSETY ；
重链可变区序列为：
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRTEDKSLSYHWFQQKSHESPRLLIKDAYQKISGIPSRFNGCGSGTDFTLNINSVETEDFGMFFCQTSGWTHFGSGTKLEIKR，
其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：RTEDKSLSYH，
重链可变区CDR2氨基酸序列为：DAYQKIS，
重链可变区CDR3氨基酸序列为：QTSGWTH。
本发明还公开了上述的BSA抗体B6在ELISA检测样本中BSA的应用。
本发明还公开了上述的BSA抗体B2与BSA抗体B6联合在双抗夹心ELISA检测样本中BSA含量中的应用。
优选的，所述应用的程序为：包被BSA抗体B2，洗板，明胶封闭，洗板，加检测样本孵育，洗板，加生物素标记的BSA抗体B6孵育，洗板，加HRP标记的亲和素孵育，洗板，加TMB显色，加终止液后酶标仪读数。
本发明还公开了一种BSA检测试剂盒，其特征在于：包含上述的BSA抗体B2和BSA抗体B6。
本发明为BSA ELISA检测试剂盒的抗体原料提供开发方法，采用杂交瘤技术制备了6株抗BSA的单克隆抗体，从中筛选到两株用于双抗夹心ELISA配对，ELISA检测灵敏度高，特异性强。通过杂交瘤测序获得了这两株抗体的氨基酸序列，抗体的氨基酸序列可以用于基因工程技术快速制备单克隆抗体。
附图说明
图1为 BSA的SDS-PAGE图。
图2为小鼠血清效价检测结果图。
图3为6株抗体的SDS-PAGE图。
图4为双抗夹心ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
本发明采用细胞生物学实验方法制备杂交瘤，筛选得到6株抗BSA的单克隆抗体杂交瘤，将其中2株应用到ELISA试剂盒的开发中。
1. 生物材料
雌性Balb/c（6至8周龄）小鼠，北京维通利华有限公司。
SP2/0骨髓瘤细胞，中科院细胞库。
2. 实验试剂与耗材
表1实验试剂与耗材
试剂或耗材 品牌 货号
BSA Sigma A7030
10×PBS 上海生工 E607016
10×PBST 上海生工 C006162
弗式完全佐剂 Sigma F5881
弗式非完全佐剂 Sigma F5506
RPMI1640培养基 HyClone SH30809.01B
青链霉素 HyClone Sv30010
胎牛血清 Gibco 26140079
L-谷氨酰胺 Gibco 25030-081
DMSO 上海生工 A100231
HAT培养基添加剂 Sigma H0262
HT培养基添加剂 Sigma H0137
PEG1450 Sigma P7181
可溶性单组份TMB底物溶液 YEASEN 36602ES60
脱脂奶粉 YEASEN 36120ES60
96孔酶标板 Corning Ym-2028A
96孔细胞培养板 Corning 3599
24孔细胞培养板 Corning 3524
6孔细胞培养板 Corning 3516
细胞培养皿 Corning 430167
Protein G亲和纯化介质 YEASEN 36405ES08
甘氨酸 YEASEN 60112ES76
甘油 上海生工 A501745
生物素-N-琥珀酰亚胺基酯 上海生工 C100212
透析袋 YEASEN 20534ES03
明胶 Sigma G7765
HRP标记亲和素 上海生工 D111037-0100
实施例1 小鼠免疫和血清效价测定
商业化的BSA绝大多来自牛血清的天然提取，SDS-PAGE对纯度进行鉴定，结果如图1所以，BSA的纯度较高，可以用于动物免疫和ELISA的检测抗原。以BSA作为免疫原，取6周龄的Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，ELISA检测免疫后的小鼠效价。具体做法是：
免疫3只6周龄的Balb/c小鼠，首次免疫用弗式完全佐剂乳化BSA蛋白，后面的免疫均用非完全佐剂乳化BSA蛋白，免疫佐剂与蛋白等体积混合乳化，免疫剂量均为每只200 μg蛋白，每周免疫一次，采用皮下多点注射的方式。第三次免疫后每次免疫前眼眶采血，用ELISA检测血清的效价。更具体做法是用1 μg/ml的BSA蛋白（溶于PBS）包板，5%脱脂奶粉封闭，用PBS梯度稀释血清，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，TMB显色，OD450值是阴性对照的2.1倍视为阳性。ELISA流程依次为：包被，洗板三次，封闭，洗板三次，加血清稀释样本，洗板五次，加酶标二抗，洗板五次，加TMB显色，加磷酸终止显色，酶标仪OD450检测。细胞融合前三天对小鼠进行冲击免疫，100 μg BSA（溶于PBS）注入小鼠腹腔。如图2所示，免疫4周后小鼠血清效价达到峰值，8000：1，随着免疫次数的增加，小鼠血清效价下降。1#小鼠免疫4周后用于细胞融合，2#小鼠免疫6周后用于细胞融合，3#小鼠免疫7周后小鼠血清效价降到2000：1，3#小鼠不用于杂交瘤的制备。
实施例2 细胞融合和杂交瘤筛选
取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。具体做法是：
提前培养足够量的SP2/0，不少于108个，保证细胞处于对数生长期。收集SP2/0，用无血清的RPMI1640培养基洗三次。取经冲击免疫的小鼠的脾脏，研磨得到脾细胞，用RPMI1640培养基洗脾细胞三次。脾细胞与SP2/0的细胞数2：1至5：1的比例混合。1000 r/min，10分钟，去培养基，于1分钟内加1 ml PEG1450入细胞中，边加边轻轻搅拌。加完PEG1450后两分钟内，匀速加入2 ml RPMI1640培养液终止PEG1450的作用，之后2分钟内加RPMI1640培养基50 ml体积。1000 r/min，10 分钟，离心去除上清。加入含有20% FBS，终浓度为1×HAT的RPMI1640培养液200 ml吹起细胞，将含有细胞的培养液分至10块96孔细胞培养板，放入37℃细胞培养箱中培养。
融合细胞培养4天后，用含有20% FBS，终浓度为1×HAT的1640培养液进行半换液。融合后7至10天后，ELISA检测前一天早晚用含有20% FBS，终浓度为1×HT的1640培养液各进行一次全换液。用1 μg/ml的BSA蛋白包板，间接ELISA检测融合板细胞培养基，每孔取50μl培养基检测。筛选出阳性杂交瘤细胞株。检测后将阳性孔中的细胞转入到24孔板中培养，培养基含HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合剂）。
共用两只小鼠进行两次细胞融合，得到6株阳性杂交瘤细胞。将杂交瘤及其分泌的抗体命名为B1，B2，B3，B4，B5，B6。
实施例3 杂交瘤单克隆化
24孔板中细胞培养三天后进行ELISA检测，对阳性孔中的细胞计数，取200个细胞入96孔板中培养。培养一周左右，挑取1至3个克隆的孔进行ELISA检测，阳性孔细胞转移到24孔培养。这为一次单克隆化，如此重复，进行四次单克隆化。6株细胞经四次单克隆化后96孔板中所有有细胞生长的孔均为阳性，可见均获得稳定细胞株。
实施例4 小鼠腹水制备和抗体亲和纯化
将经过四次单克隆化的抗BSA特异性杂交瘤细胞株在24孔板、6孔板、培养皿中依次扩大培养，收集细胞离心，用PBS重悬至2×106个/ml，每只小鼠注射106个细胞。注射细胞前一周给每只小鼠腹腔注射1 ml石蜡油。7至10天后小鼠腹水形成，处死小鼠，用注射器抽取腹水。低速离心腹水10分钟，取中间层，弃下层细胞沉淀和上层油脂。
用10倍腹水体积的PBS稀释腹水，0.4 μm的滤膜过滤。将过滤后的样品与平衡好的Protein G填料孵育1小时。重力层析柱纯化，用PBS洗涤杂蛋白，pH2.7的甘氨酸缓冲液洗脱目的蛋白，用pH8.5的1 M Tris-HCl将洗脱后的样品的pH值调到中性。OD280测抗体浓度，超滤管浓缩，PBS透析换液，SDS-PAGE检测抗体纯度，SDS-PAGE结果如图3所示，抗体纯度大于98%。浓缩后的抗体加一倍体积的甘油冻存于-20℃。
对纯化后的抗体作效价检测，采用的ELISA方法与血清效价检测方法相同，检测结果如表2所示，可见获得的抗体均为高效价抗体。
表2 抗体效价检测结果
抗体号 1K 2K 4K 8K 16K 32K 64K 128K 256K 512K 1024K 阴性
B1 2.015 1.573 0.940 0.752 0.557 0.405 0.305 0.270 0.157 0.176 0.171 0.150
B2 2.134 1.687 0.900 0.728 0.537 0.403 0.335 0.357 0.208 0.137 0.144 0.168
B3 2.058 1.581 0.898 0.703 0.561 0.419 0.383 0.375 0.262 0.165 0.153 0.158
B4 2.120 1.463 1.062 0.889 0.613 0.569 0.469 0.392 0.296 0.188 0.199 0.138
B5 2.008 1.501 1.047 0.919 0.609 0.419 0.248 0.192 0.152 0.222 0.139 0.171
B6 2.208 1.639 0.981 0.846 0.648 0.538 0.454 0.371 0.269 0.184 0.161 0.143
实施例5 抗体生物素标记
从冷藏室里取出生物素试剂，平衡至室温。用PBS稀释抗体，将2 mg抗体溶于0.5ml PBS。在DMSO中制备10 mM生物素试剂溶液。2 mg NHS-Biotin溶于590 μl DMSO。以生物素与抗体的摩尔比20：1的比例混合生物素试剂与抗体溶液。冰上孵育2小时。此时抗体标记完成，透析去除过量的生物素试剂。按照这个方法将抗体6株抗BSA抗体均标记上。
ELISA检测抗体的标记效果。1 μg/ml的BSA包被酶标板，100 μl每孔，4℃包被过夜，0.2%的明胶200 μl每孔，37℃封闭1小时。标记抗体从1 mg/ml开始二倍稀释，共11个浓度梯度，100 μl每孔，37℃1小时。HRP标记亲和素稀释5000倍用，100 μl每孔，37℃40分钟。TMB 100 μl每孔，37℃15分钟。ELISA流程依次为：包被，洗板三次，封闭，洗板三次，加标记抗体孵育，洗板五次，加HRP标记亲和素，洗板五次，加TMB显色，加磷酸终止显色，酶标仪OD450检测。
表3 抗体标记效果检测结果
抗体号 1K 2K 4K 8K 16K 32K 64K 128K 256K 512K 1024K 阴性
B1 2.319 2.202 1.992 1.808 1.562 1.229 1.026 0.804 0.618 0.424 0.203 0.144
B2 2.301 2.215 2.022 1.811 1.602 1.218 1.116 0.821 0.509 0.308 0.175 0.138
B3 2.228 2.112 1.904 1.620 1.328 1.090 0.779 0.502 0.311 0.237 0.165 0.149
B4 2.221 2.111 1.921 1.721 1.449 1.129 0.901 0.599 0.402 0.290 0.144 0.152
B5 2.224 2.010 1.877 1.632 1.315 1.044 0.802 0.602 0.419 0.318 0.188 0.125
B6 2.391 2.112 1.901 1.659 1.420 1.129 0.885 0.677 0.431 0.332 0.150 0.144
实施例6 抗体ELISA夹心法配对
以2 μg/ml的抗体，100 μl每孔包被酶标板，4℃过夜包被。0.2%的明胶200 μl每孔，37℃封闭1小时。BSA抗原使用浓度为1 ng/ml，100 μl每孔，37℃1小时。检测抗体（生物素标记的抗体）用0.2 μg/ml，00 μl每孔，37℃1小时。HRP标记的亲和素稀释5000倍使用，100 μl每孔，37℃40分钟。TMB显色液100 μl每孔，37℃显色15分钟。ELISA流程依次为：包被抗体，洗板三次，封闭，洗板三次，加BSA抗原孵育，洗板五次，加标记抗体孵育，洗板五次，加HRP标记亲和素，洗板五次，加TMB显色，加磷酸终止显色，酶标仪OD450检测。如表4所示为配对方法排列，举例B1+B2，B1为包被抗体，B2为检测抗体，1，3，5，7，9列中抗原样本为1 ng/ml的BSA，2，4，6，8列中以PBS代替抗原样本，作为阴性对照孔。表5为抗体配对ELISA结果，以抗体B2包被，生物素标记抗体B6为检测抗体，OD值最高，于是选择这一对抗体进一步进行双抗夹心ELISA的调试。
表4 包被抗体和检测抗体配对
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1A B1+<i>B2</i> B1+<i>B2</i> B1+<i>B3</i> B1+<i>B3</i> B1+<i>B4</i> B1+<i>B4</i> B1+<i>B5</i> B1+<i>B5</i> B1+<i>B6</i> B1+<i>B6</i>
1B B1+<i>B2</i> B1+<i>B2</i> B1+<i>B3</i> B1+<i>B3</i> B1+<i>B4</i> B1+<i>B4</i> B1+<i>B5</i> B1+<i>B5</i> B1+<i>B6</i> B1+<i>B6</i>
1C B2+<i>B1</i> B2+<i>B1</i> B2+<i>B3</i> B2+<i>B3</i> B2+<i>B4</i> B2+<i>B4</i> B2+<i>B5</i> B2+<i>B5</i> B2+<i>B6</i> B2+<i>B6</i>
1D B2+<i>B1</i> B2+<i>B1</i> B2+<i>B3</i> B2+<i>B3</i> B2+<i>B4</i> B2+<i>B4</i> B2+<i>B5</i> B2+<i>B5</i> B2+<i>B6</i> B2+<i>B6</i>
1E B3+<i>B1</i> B3+<i>B1</i> B3+<i>B2</i> B3+<i>B2</i> B3+<i>B4</i> B3+<i>B4</i> B3+<i>B5</i> B3+<i>B5</i> B3+<i>B6</i> B3+<i>B6</i>
1F B3+<i>B1</i> B3+<i>B1</i> B3+<i>B2</i> B3+<i>B2</i> B3+<i>B4</i> B3+<i>B4</i> B3+<i>B5</i> B3+<i>B5</i> B3+<i>B6</i> B3+<i>B6</i>
1G B4+<i>B1</i> B4+<i>B1</i> B4+<i>B2</i> B4+<i>B2</i> B4+<i>B3</i> B4+<i>B3</i> B4+<i>B5</i> B4+<i>B5</i> B4+<i>B6</i> B4+<i>B6</i>
1H B4+<i>B1</i> B4+<i>B1</i> B4+<i>B2</i> B4+<i>B2</i> B4+<i>B3</i> B4+<i>B3</i> B4+<i>B5</i> B4+<i>B5</i> B4+<i>B6</i> B4+<i>B6</i>
2A B5+<i>B1</i> B5+<i>B1</i> B5+<i>B2</i> B5+<i>B2</i> B5+<i>B3</i> B5+<i>B3</i> B5+<i>B4</i> B5+<i>B4</i> B5+<i>B6</i> B5+<i>B6</i>
2B B5+<i>B1</i> B5+<i>B1</i> B5+<i>B2</i> B5+<i>B2</i> B5+<i>B3</i> B5+<i>B3</i> B5+<i>B4</i> B5+<i>B4</i> B5+<i>B6</i> B5+<i>B6</i>
表5 包被抗体和检测抗体配对检测结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1A 0.303 0.140 0.323 0.138 0.342 0.132 0.320 0.133 0.312 0.132
1B 0.298 0.139 0.327 0.129 0.340 0.136 0.318 0.136 0.314 0.121
1C 0.312 0.132 0.342 0.144 0.319 0.134 0.312 0.142 0.380 0.133
1D 0.315 0.143 0.346 0.130 0.332 0.141 0.315 0.136 0.378 0.142
1E 0.168 0.138 0.291 0.146 0.345 0.144 0.340 0.126 0.321 0.144
1F 0.163 0.147 0.288 0.138 0.344 0.133 0.343 0.146 0.323 0.142
1G 0.343 0.151 0.289 0.140 0.321 0.136 0.324 0.139 0.327 0.151
1H 0.340 0.137 0.290 0.135 0.324 0.129 0.327 0.134 0.325 0.145
2A 0.295 0.140 0.338 0.136 0.358 0.142 0.367 0.148 0.332 0.140
2B 0.291 0.145 0.330 0.141 0.356 0.146 0.363 0.132 0.335 0.136
实施例7 双抗夹心ELISA调试
如表6所示分别以1 μg/ml、1.5 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml的浓度包被抗体B2，100μl每孔包被酶标板，4℃过夜包被。0.2%的明胶200 μl每孔，37℃封闭1小时。BSA抗原使用浓度为1 ng/ml，100 μl每孔，37℃1小时。检测抗体（生物素标记的抗体）分别用0.2 μg/ml、0.4 μg/ml、0.8 μg/ml的浓度，100 μl每孔，37℃1小时。HRP标记的亲和素稀释5000倍使用，100 μl每孔，37℃40分钟。TMB显色液100 μl每孔，37℃显色15分钟。ELISA流程依次为：包被抗体，洗板三次，封闭，洗板三次，加BSA抗原孵育，洗板五次，加标记抗体孵育，洗板五次，加HRP标记亲和素，洗板五次，加TMB显色，加磷酸终止显色，酶标仪OD450检测。1，3，5，7列中抗原样本为1 ng/ml的BSA，2，4，6，8列中以PBS代替抗原样本，作为阴性对照孔。选择阳性值较高，阴性值较低，抗体用量较少的条件为最佳条件，如表6所示，包被抗体B2用2 μg/ml，检测抗体B6用0.2 μg/ml为最佳条件。
表6 包被抗体浓度和检测抗体使用浓度调试结果
Figure 198049DEST_PATH_IMAGE002
以包被抗体B2 2 μg/ml，生物素标记的抗体B6为检测抗体，使用浓度为0.2 μg/ml做双抗夹心ELISA，BSA标准抗原使用浓度为48、24、12、6、3、1.5、0.75 ng/ml，检测的OD450如表7所示，采用二次多项式方程拟合数据，得到拟合方式：Y=a+bX+cX2，a=0.258002，b=0.067590，c=̵0.000566，相关系数R2为0.992566。标准曲线如图4所示。可见使用这两株抗体可以用于BSA的定量。
表7标准曲线制作检测结果
48 ng/ml 24 ng/ml 12 ng/ml 6 ng/ml 3 ng/ml 1.5 ng/ml 0.75 ng/ml 0
A 2.201 1.510 1.007 0.684 0.509 0.404 0.310 0.132
B 2.215 1.496 1.001 0.692 0.515 0.412 0.296 0.140
平均值 2.208 1.503 1.004 0.688 0.512 0.408 0.303 0.136
实施例8 双抗夹心ELISA检测特异性测试
按照上述调试好的ELISA方法用于检测HEK293、Vero、CHO细胞裂解液。细胞裂解液均从1 mg/ml开始2倍稀释，以1 ng/ml的BSA样本为阳性样本。如表8所示，三种细胞裂解液不同浓度均检测为阴性，可见本发明的两种抗体用于ELISA检测特异性好。
表8 双抗夹心ELISA检测特异性测试结果
HEK293裂解液 Vero裂解液 CHO裂解液 1 ng/ml BSA 阴性样本
1 mg/ml 0.142 0.129 0.132 0.392 0.136
500 μg/ml 0.139 0.134 0.135 0.389 0.141
250 μg/ml 0.134 0.140 0.134 － －
125 μg/ml 0.140 0.132 0.140 － －
62.5 μg/ml 0.142 0.137 0.129 － －
31.25 μg/ml 0.134 0.142 0.136 － －
15.63 μg/ml 0.136 0.136 0.141 － －
7.81 μg/ml 0.132 0.138 0.136 － －
实施例9 杂交瘤测序
将B2和B6两株抗体的杂交瘤1.0×106个交给杂交瘤测序服务公司，测得抗体的核苷酸序列，转换为氨基酸序列分别如下，
B2抗体的轻链可变区序列为：VKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSLYDESWVRQTPEKRLEWVAEIFLGVYRYVPESKVRFTMSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCVRLCYWEPEVKKCWGQGTTVTVSS（SEQ ID No.1）
轻链可变区CDR1氨基酸序列为：LYDES（SEQ ID No.2）
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：EIFLGVYRYVPESKV（SEQ ID No.3）
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：LCYWEPEVKKC （SEQ ID No.4）
B2抗体的重链可变区序列为：DIELTQSPLTLSVTIGQPASISCESDLSLKESLDWLLQRPGQSPKRLIYEDLNADCGVPDRFTGSGSGTDSTLKISRVEAEDLGVYYCEIKGTFRWSFGGGTKLEIK（SEQ ID No.5）
重链可变区CDR1氨基酸序列为：SDLSLKESLD（SEQ ID No.6）
重链可变区CDR2氨基酸序列为：EDLNADC（SEQ ID No.7）
重链可变区CDR3氨基酸序列为：EIKGTFRWS （SEQ ID No.8）
B6抗体的轻链可变区序列为：VQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGQYVSWVKQRPGQGLEWIGEDNKSSRQGTEYSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDEVRSETYWGQGTTVTVSS（SEQ IDNo.9）
轻链可变区CDR1氨基酸序列为：GQYVS （SEQ ID No.10）
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：EDNKSSRQGTEYS （SEQ ID No.11）
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：DEVRSETY （SEQ ID No.12）
B6抗体的重链可变区序列为：DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRTEDKSLSYHWFQQKSHESPRLLIKDAYQKISGIPSRFNGCGSGTDFTLNINSVETEDFGMFFCQTSGWTHFGSGTKLEIKR（SEQ ID No.13）
重链可变区CDR1氨基酸序列为：RTEDKSLSYH（SEQ ID No.14）
重链可变区CDR2氨基酸序列为：DAYQKIS（SEQ ID No.15）
重链可变区CDR3氨基酸序列为：QTSGWTH （SEQ ID No.16）。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> BSA单克隆抗体及其应用、含有抗体的BSA检测试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr Asp
20 25 30
Glu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Glu Ile Phe Leu Gly Val Tyr Arg Tyr Val Pro Glu Ser Lys Val Arg
50 55 60
Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Leu
85 90 95
Cys Tyr Trp Glu Pro Glu Val Lys Lys Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Tyr Asp Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ile Phe Leu Gly Val Tyr Arg Tyr Val Pro Glu Ser Lys Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Cys Tyr Trp Glu Pro Glu Val Lys Lys Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Glu Ser Asp Leu Ser Leu Lys Glu Ser
20 25 30
Leu Asp Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Asp Leu Asn Ala Asp Cys Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Glu Ile Lys Gly Thr Phe Arg Trp
85 90 95
Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Asp Leu Ser Leu Lys Glu Ser Leu Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Asp Leu Asn Ala Asp Cys
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ile Lys Gly Thr Phe Arg Trp Ser
1 5
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Gln Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Glu Asp Asn Lys Ser Ser Arg Gln Gly Thr Glu Tyr Ser Lys Ala Thr
50 55 60
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser
65 70 75 80
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Glu Val
85 90 95
Arg Ser Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Gln Tyr Val Ser
1 5
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Asp Asn Lys Ser Ser Arg Gln Gly Thr Glu Tyr Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Glu Val Arg Ser Glu Thr Tyr
1 5
<210> 13
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Thr Glu Asp Lys Ser Leu Ser Tyr
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
35 40 45
Asp Ala Tyr Gln Lys Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Asn Gly Cys
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Phe Gly Met Phe Phe Cys Gln Thr Ser Gly Trp Thr His Phe Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Arg Thr Glu Asp Lys Ser Leu Ser Tyr His
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ala Tyr Gln Lys Ile Ser
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Thr Ser Gly Trp Thr His
1 5

Claims (7)

1.一种BSA抗体B2，其特征在于其氨基酸序列为：
轻链可变区序列为：
VKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSLYDESWVRQTPEKRLEWVAEIFLGVYRYVPESKVRFTMSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCVRLCYWEPEVKKCWGQGTTVTVSS，
其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：LYDES，
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：EIFLGVYRYVPESKV，
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：LCYWEPEVKKC ；
重链可变区序列为：
DIELTQSPLTLSVTIGQPASISCESDLSLKESLDWLLQRPGQSPKRLIYEDLNADCGVPDRFTGSGSGTDSTLKISRVEAEDLGVYYCEIKGTFRWSFGGGTKLEIK，
其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：SDLSLKESLD，
重链可变区CDR2氨基酸序列为：EDLNADC，
重链可变区CDR3氨基酸序列为：EIKGTFRWS 。
2.权利要求1所述的BSA抗体B2在ELISA检测样本中BSA的应用。
3.一种BSA抗体B6，其特征在于其氨基酸序列为：
轻链可变区序列为：
VQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGQYVSWVKQRPGQGLEWIGEDNKSSRQGTEYSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDEVRSETYWGQGTTVTVSS，
其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：GQYVS ，
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：EDNKSSRQGTEYS ，
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：DEVRSETY ；
重链可变区序列为：
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRTEDKSLSYHWFQQKSHESPRLLIKDAYQKISGIPSRFNGCGSGTDFTLNINSVETEDFGMFFCQTSGWTHFGSGTKLEIKR，
其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：RTEDKSLSYH，
重链可变区CDR2氨基酸序列为：DAYQKIS，
重链可变区CDR3氨基酸序列为：QTSGWTH。
4.权利要求3所述的BSA抗体B6在ELISA检测样本中BSA的应用。
5.权利要求1所述的BSA抗体B2与权利要求3所述的BSA抗体B6联合在双抗夹心ELISA检测样本中BSA含量中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于其步骤包括：包被BSA抗体B2，洗板，明胶封闭，洗板，加检测样本孵育，洗板，加生物素标记的BSA抗体B6孵育，洗板，加HRP标记的亲和素孵育，洗板，加TMB显色，加终止液后酶标仪读数。
7.一种BSA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的BSA抗体B2和权利要求3所述的BSA抗体B6。
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