WO2024138521A1 - 抗体及其应用 - Google Patents
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Definitions
- the present invention relates to the field of bioengineering, and specifically to antibodies, nucleic acids encoding the same, vectors containing the nucleic acids, host cells expressing or secreting the antibodies, kits containing the foregoing, methods for preparing hot-start chimeric DNA polymerases or variants thereof, hot-start chimeric DNA polymerases or variants thereof, and amplification methods.
- embodiments of the present invention provide an isolated antibody that specifically neutralizes the polymerization activity of a chimeric DNA polymerase or a variant thereof, the antibody comprising:
- CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1
- CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:7
- the chimeric DNA polymerase or variant thereof is derived from a B family DNA polymerase.
- the chimeric DNA polymerase variant comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:13.
- the antibody comprises a heavy chain variable region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:14 or SEQ ID NO:16 and a light chain variable region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:15 or SEQ ID NO:17.
- the antibody is a full-length antibody or an antigen-binding fragment thereof.
- embodiments of the present invention provide a nucleic acid encoding the antibody described in any embodiment of the first aspect.
- the vector is an expression vector.
- an embodiment of the present invention provides a kit, comprising the antibody described in any embodiment of the first aspect, the nucleic acid described in any embodiment of the second aspect, the vector described in any embodiment of the third aspect, or the host cell described in any embodiment of the fourth aspect.
- an embodiment of the present invention provides a hot-start chimeric DNA polymerase or a variant thereof, obtained by the method described in any embodiment of the sixth aspect.
- the hot-start chimeric DNA polymerase or variants thereof is used for PCR amplification or NGS library amplification.
- the reaction system for PCR amplification and the reaction system for NGS library amplification are prepared at 4°C-25°C, for example, 4°C or 20-25°C.
- the antibodies provided in the embodiments of the present invention can not only act to inhibit the polymerization activity of the chimeric DNA polymerase or its variants independently developed by the inventors in the early stage, so as to be further applied to conventional PCR amplification, site-directed mutagenesis and NGS library construction, but can also be used to inhibit the polymerization activity of the same type of DNA polymerase currently available on the market.
- FIG. 4 is a schematic flow chart of a method for preparing an antibody according to an embodiment of the present invention.
- VL and VH are encoded by different genes, they can be connected by a synthetic linker using recombinant methods to make them into a single protein chain, in which the VL and VH regions pair to form a monovalent molecule called a single-chain Fv (scFv).
- scFv single-chain Fv
- antibodies specific to a target antigen are prepared by conventional hybridoma technology.
- a carrier protein e.g., KLH
- the immunization route and schedule of the host animal are generally consistent with the mature and conventional techniques used for antibody stimulation and production.
- General techniques for producing antibodies are known in the art and are described herein. It is expected that any mammalian subject (including mice) or cells producing antibodies therefrom can be manipulated as a basis for producing mammalian (including mouse) hybridoma cell lines.
- a host animal is inoculated intraperitoneally, intramuscularly, orally, subcutaneously, intraplantarly and/or intradermally with a certain amount of an immunogen (including a B family chimeric DNA polymerase or a variant thereof as described herein).
- an immunogen including a B family chimeric DNA polymerase or a variant thereof as described herein.
- Hybridomas can be prepared from lymphocytes and fixed myeloma cells using conventional somatic cell hybridization techniques of Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 or Buck, D.W. et al., modified In Vitro, 18:377-381 (1982).
- Available myeloma cell lines including but not limited to X63-Ag8.653 and those from Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA
- the technique involves fusing myeloma cells and lymphoid cells using a fusion agent (e.g., polyethylene glycol) or by electrical means well known to those skilled in the art.
- a fusion agent e.g., polyethylene glycol
- a target antigen or a fragment containing a target amino acid sequence conjugated to a protein that is immunogenic in the species to be immunized e.g., keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor
- each protein is contacted with a microtiter plate coated with a target (e.g., a limited amount of target) on the bottom surface.
- a target e.g., a limited amount of target
- the plate is washed with a buffer to remove non-specifically bound polypeptides.
- the amount of the binding protein bound to the target on the plate is determined by using an antibody probe plate that can recognize the binding protein (e.g., a label or constant part of the binding protein).
- the antibody is connected to a detection system (e.g., an enzyme that produces a colorimetric product when a suitable substrate is provided, such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase (HRP)).
- a detection system e.g., an enzyme that produces a colorimetric product when a suitable substrate is provided, such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase (HRP)
- the nucleotide sequences encoding the two chains of the antibody are cloned into two vectors, which can be introduced into the same or different cells.
- the two chains When the two chains are expressed in different cells, they can be separated from the host cells expressing them, and the separated heavy and light chains can be mixed and incubated under suitable conditions to form antibodies.
- polyadenylation signals examples include, but are not limited to, the human collagen I polyadenylation signal, the human collagen II polyadenylation signal, and the SV40 polyadenylation signal.
- the hot-start chimeric DNA polymerase prepared by the antibody of the embodiment of the present invention has good stability.
- the hot-start chimeric DNA polymerase is generally formulated into a PCR ReadyMix form.
- the accelerated stability test in the following embodiment shows that the hot-start chimeric DNA polymerase prepared by the antibody of the embodiment of the present invention and the chimeric DNA polymerase in a mass ratio of 2:1 can be stored at -20°C for at least 1 year in the form of PCR ReadyMix.
- the isolated antibody specifically neutralizes the polymerization activity of the chimeric DNA polymerase or its variants, and the antibody comprises: a heavy chain complementary determining region 1 (CDR1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, a heavy chain complementary determining region 2 (CDR2) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:7, a heavy chain complementary determining region 3 (CDR3) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or SEQ ID NO:8, a light chain complementary determining region 1 (CDR1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4 or SEQ ID NO:9, a light chain complementary determining region 2 (CDR2) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 or SEQ ID NO:10, and a light chain complementary determining region 3 (CDR3) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or SEQ ID NO:11.
- CDR1 heavy chain complementary determining region 1
- CDR2 heavy chain complementary determining region 2
- the sequence of the heavy chain complementary determining region 3 (CDR3) shown in SEQ ID NO:3 is ARRLGSPWWYFDV.
- the sequence of the light chain complementary determining region 2 (CDR2) shown in SEQ ID NO:5 is FAS.
- the sequence of the heavy chain complementary determining region 3 (CDR3) shown in SEQ ID NO:8 is ARVPLYYGSGWNAMDY.
- the sequence of the light chain complementary determining region 1 (CDR1) shown in SEQ ID NO:9 is QNINAW.
- the sequence of the light chain complementary determining region 2 (CDR2) shown in SEQ ID NO:10 is KAS.
- the sequence of the light chain complementary determining region 3 (CDR3) shown in SEQ ID NO:11 is QQGQSYPWT.
- the isolated antibody specifically neutralizes the polymerization activity of a chimeric DNA polymerase or a variant thereof, the antibody comprising: 6 CDRs comprising, or essentially consisting of, or consisting of the following amino acid sequences: a heavy chain complementary determining region 1 (CDR1) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, a heavy chain complementary determining region 2 (CDR2) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7, and a heavy chain complementary determining region 3 (CDR3) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8, and a light chain complementary determining region 1 (CDR1) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9, a light chain complementary determining region 2 (CDR2) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10, and a light chain complementary determining region 3 (CDR3) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:11.
- CDR1 heavy chain complementary determining region 1
- CDR2 heavy chain complementary determining region 2
- CDR3 heavy chain complementary determining
- the antibody comprises a heavy chain complementary determining region 1 (CDR1), a heavy chain complementary determining region 2 (CDR2), and a heavy chain complementary determining region 3 (CDR3), which collectively have at least 90% (e.g., 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%) sequence identity with the heavy chain CDRs of the antibodies provided herein.
- CDR1 heavy chain complementary determining region 1
- CDR2 heavy chain complementary determining region 2
- CDR3 heavy chain complementary determining region 3
- the antibody comprises a light chain complementary determining region 1 (CDR1), a light chain complementary determining region 2 (CDR2), and a light chain complementary determining region 3 (CDR3), which collectively have at least 90% (e.g., 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%) sequence identity with the light chain CDRs of the antibodies provided herein.
- CDR1 light chain complementary determining region 1
- CDR2 light chain complementary determining region 2
- CDR3 light chain complementary determining region 3
- the antibody comprises the same heavy chain complementary determining regions (CDR1, CDR2, CDR3) and the same light chain complementary determining regions (CDR1, CDR2, CDR3) as the isolated antibody, such as any antibody provided herein.
- the antibody comprises the same heavy chain variable regions (CDR1, CDR2, CDR3) and the same light chain variable regions (CDR1, CDR2, CDR3) as the isolated antibody, such as any reference antibody provided herein.
- the chimeric DNA polymerase has an amino acid sequence that is at least 85% (e.g., 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%) identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:12.
- the chimeric DNA polymerase variant has the sequence described in SEQ ID NO: 13
- the antibody comprises: a heavy chain variable region (VH) sequence comprising, or consisting essentially of, or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the antibody comprises: a light chain variable region (VL) sequence comprising, or consisting essentially of, or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the antibody comprises: a heavy chain variable region (VH) sequence comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region (VL) sequence comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
- the antibody comprises: a heavy chain variable region (VH) sequence comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region (VL) sequence comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
- the antibody comprises: a heavy chain variable region (VH) sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:14 and a light chain variable region (VL) sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:15.
- the antibody comprises a VH region having at least 85% (e.g., 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the VH region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:14; and a VL region having at least 85% (e.g., 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the VL region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:15.
- the antibody comprises a VH region having at least 85% (e.g., 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the VH region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:16; and a VL region having at least 85% (e.g., 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the VL region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:17.
- any of the antibodies disclosed herein may comprise an amino acid sequence having at least 85% (e.g., 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the 11F2F12, 30E5H7, 30E5H9, 12H2H6, 12H2G5, or 12H2G1 antibody.
- the antibody is 11F2F12C2 or 12H2G1D1. It should be noted that, in this article, 11F2F12C2 and MM001 can be used interchangeably, and 12H2G1D1 and MM002 can be used interchangeably.
- the antibody is a full-length antibody or an antigen-binding fragment thereof. In some instances, the antibody is a Fab or a single-chain antibody.
- the inhibition rate of antibodies 11F2F12, 30E5H7, 30E5H9, 12H2H6, 12H2G5, and 12H2G1 on the polymerization activity of the chimeric polymerase is greater than 90%, and the inhibition rate of antibodies 11F2F12C2 and 12H2G1D1 on the polymerization activity of the chimeric polymerase is greater than 98%.
- Embodiments of the second aspect of the present invention provide isolated nucleic acids (nucleic acid sets), the nucleic acid encoding the antibody as described in any embodiment of the first aspect.
- the heavy chain and light chain of the antibody are encoded by two independent nucleic acid molecules (nucleic acid sets).
- the heavy chain and light chain of the antibody are encoded by one nucleic acid molecule, which can be a polycistronic form or under the control of different promoters.
- the nucleic acid or nucleic acid set is located on one or two vectors. In some instances, one or two vectors can be one or two expression vectors.
- embodiments of the present invention provide a method for preparing a hot-start chimeric DNA polymerase or a variant thereof, comprising using an antibody as described in any embodiment of the first aspect.
- the hot-start chimeric DNA polymerase or variant thereof is prepared by using antibodies and chimeric DNA polymerase or variant thereof in a mass ratio of 0.75:1 to 10:1, preferably 1:1 to 8:1, more preferably 2:1 to 6:1, for example 4:1.
- chimeric DNA polymerase was used as an antigen to immunize mice, and then the affinity activity and neutralization activity of antibodies in the serum collected from the immunized mice were detected.
- antibodies can specifically bind to DNA polymerase, they inhibit the synthesis of double-stranded DNA involved in DNA polymerase.
- a reaction system containing the following components: 2 ⁇ L diluted hot start chimeric DNA polymerase solution, 4 ⁇ L 5 ⁇ reaction buffer (10 mM Tris-HCl, 80 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 0.1% NP40, 0.1% Tween 20, pH 9.0), 0.5 ⁇ L 10 mM dNTPs, 11.5 ⁇ L nuclease-free water, 2 ⁇ L the above fluorescent probe substrate.
- the positive control group (PC) is the above reaction system without antibody; the negative control group (NC) is the above reaction system without chimeric DNA polymerase.
- the neutralization activity of antibodies detected by the M13-7p substrate method was basically consistent with the neutralization activity of antibodies detected by the probe method.
- the antibodies produced by 12 of the 200 first subclone cells had significant inhibitory ability on the polymerization activity of the chimeric DNA polymerase, and 6 of them inhibited the polymerization activity of the chimeric DNA polymerase by more than 90%. They were: 11F2F12, 30E5H7, 30E5H9, 12H2H6, 12H2G5 and 12H2G1.
- MM003 was not monoclonal.
- the stable cell lines MM001 and MM002 corresponding to the monoclonal antibodies 11F2F12C2 and 12H2G1D1 were stored in liquid nitrogen.
- This example is based on the two monoclonal antibodies in Example 2, and the nucleic acids encoding the antibodies are sequenced and the antibodies are purified.
- the cell laboratory is routinely disinfected and irradiated with ultraviolet light for 30 minutes.
- cDNA was synthesized by RT-PCR (SuperScript TM II Reverse Transcriptase, Invitrogen TM , Catalog #18064071).
- the light chain variable region fragment and the heavy chain variable region fragment were respectively connected to the T vector (pMD 19-T vector cloning kit, Takara, catalog number #6013), and then transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ . After amplification, the samples were sent for sequencing.
- the coding sequences of the light chain variable region fragment and the heavy chain variable region fragment of antibodies MM001 and MM002 were determined by sequencing, and then the amino acid sequences of the light chain variable region fragment and the heavy chain variable region fragment were determined by DNA transcription and translation.
- This example is based on the antibodies MM001 and MM002 purified in Example 3, and verifies the performance of the hot-start chimeric DNA polymerase prepared by the antibodies in multiple ways.
- Antibodies MM001 and MM002 were incubated with B family chimeric DNA polymerase (SEQ ID NO:12) for 15 min at 25°C, 30°C and 37°C, respectively, at antibody-chimeric DNA polymerase mass ratios of 2:1, 4:1 and 6:1, respectively, to obtain hot start chimeric DNA polymerases.
- B family chimeric DNA polymerase SEQ ID NO:12
- the neutralization activity of the hot start chimeric DNA polymerases was detected by the M13-7p substrate method.
- Table 6 shows that antibodies MM001 and MM002 exhibited more than 98% inhibition of the polymerization activity of chimeric DNA polymerase at three different reaction temperatures and three different antibody-polymerase mass ratios.
- the antibody MM001/MM002 at a mass ratio of 2:1 was incubated with a chimeric DNA polymerase variant (SEQ ID NO: 13) at 37°C for 15 minutes to obtain a hot start chimeric DNA polymerase variant.
- SEQ ID NO: 13 chimeric DNA polymerase variant
- the effect of the antibody MM001/MM002 on the polymerization activity of the chimeric DNA polymerase variant was detected by the M13-7p substrate method.
- PCR reaction systems containing the hot-start chimeric DNA polymerases prepared at various mass ratios as above for the smaller target fragment hACTG1 (485 bp) and the larger target fragment hCYB5A (998 bp) were prepared at room temperature, left at room temperature for more than 30 minutes, and then PCR amplification was performed at an annealing temperature of 61°C. The results are shown in FIG8 .
- the hot-start chimeric DNA polymerase prepared by the antibody in the embodiment of the present invention has an excellent specific amplification effect, and is superior to the non-hot-start chimeric DNA polymerase and the commercial hot-start polymerase of the same type in terms of annealing temperature.
- a PCR reaction system containing antibodies MM001 and MM002 in the embodiment of the present invention to prepare a hot start chimeric DNA polymerase was prepared at room temperature (e.g., room temperature, such as 20-30°C) using the E. coli gDNA rRNA-1.5kb gene as a template, and a corresponding PCR reaction system containing a commercial hot start polymerase of the same type (Supplier K-HS, purchased from Kapa Biosystems, catalog number #2611) was used as a control.
- inventive embodiments of the present disclosure relate to each individual feature, system, article, material, kit, and/or method described herein.
- any combination of two or more such features, systems, articles, materials, kits, and/or methods is included within the scope of the invention of the present disclosure if such features, systems, articles, materials, kits, and/or methods are not mutually contradictory.
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Abstract
提供了抗体、编码其的核酸、包含核酸的载体、宿主细胞、试剂盒、制备热启动嵌合DNA聚合酶或其变体的方法、热启动嵌合DNA聚合酶或其变体、以及扩增方法。该抗体能够特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体，使用该抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶在常规PCR扩增以及常温PCR扩增体系中表现优异。
Description
本发明涉及生物工程领域，具体地涉及抗体、编码其的核酸、包含核酸的载体、表达或分泌抗体的宿主细胞、包含前述的试剂盒，制备热启动嵌合DNA聚合酶或其变体的方法、热启动嵌合DNA聚合酶或其变体、以及扩增方法。
在PCR技术的实际应用中，由于反应体系中的DNA聚合酶在室温条件下也会发生聚合反应，会导致由低严谨度的引物错配所引发的非特异性扩增，这种非特性扩增在后续PCR反应过程中还会消耗引物和其他成分，并导致包括引物二聚体在内的非特异性条带的产生以及目标DNA条带产量的降低，甚至出现扩增不出目标产物的问题。
目前以上技术问题通常通过热启动PCR技术来解决。热启动PCR过程中，在高温加热前，抗聚合酶的抗体和聚合酶孵育后形成复合物，即热启动DNA聚合酶(抗体热启动酶)，以抑制聚合酶的聚合活性，达到抑制低温条件下或预变性前升温阶段由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的聚合酶非特异性扩增作用；高温加热后，抗聚合酶的抗体失活，聚合酶恢复活性，从而实现期望的扩增作用。但目前的热启动DNA聚合酶在热启动PCR中的扩增特异性还有待进一步提高。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明的实施例提供了抗体，编码该抗体的核酸，包含核酸的载体，表达或分泌抗体的宿主细胞，包含上述抗体、核酸、载体或宿主细胞的试剂盒、制备热启动嵌合DNA聚合酶或其变体的方法、热启动嵌合DNA聚合酶或其变体、以及扩增方法。其中，所述抗体能够特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性。
第一方面，本发明的实施例提供了分离的抗体，所述抗体特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，所述抗体包含：
具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)、具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)、具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10所 示氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)。
在一些实施例中，所述分离的抗体特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，所述抗体包含：
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)，和包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)；
或者
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)，和SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)。
在一些实施例中，所述嵌合DNA聚合酶或其变体来源于B家族DNA聚合酶。
在一些实施例中，所述嵌合DNA聚合酶包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述嵌合DNA聚合酶变体包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗体包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，所述抗体包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区；或者所述抗体包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，所述抗体为11F2F12、30E5H7、30E5H9、12H2H6、12H2G5、12H2G1。
在一些实施例中，所述抗体为11F2F12C2、12H2G1D1。
在一些实施例中，所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
第二方面，本发明的实施例提供了核酸，所述核酸编码第一方面任一实施例中所述的抗体。
在一些实施例中，编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明的实施例提供了载体，所述载体包含第二方面任一实施例中所述的核酸。
在一些实施例中，所述载体是表达载体。
第四方面，本发明的实施例提供了宿主细胞，表达或分泌第一方面任一实施例中所述的抗体。
在一些实施例中，在允许抗体表达的合适条件下培养该宿主细胞能够从细胞培养物(例如从培养基)收获如第一方面任一实施例的抗体。
第五方面，本发明的实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面任一实施例中所述的抗体、第二方面任一实施例中所述的核酸、第三方面任一实施例中所述的载体或第四方面任一实施例中所述的宿主细胞。
第六方面，本发明的实施例提供了制备热启动嵌合DNA聚合酶或其变体的方法，包括使用第一方面任一实施例中所述的抗体。
在一些实施例中，所述抗体和嵌合DNA聚合酶或其变体以0.75:1至10:1、优选1:1至8:1、更优选2:1至6:1、例如4:1的质量比制备所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
在一些实施例中，所述抗体和嵌合DNA聚合酶或其变体在20至40℃、例如25至37℃、例如30℃的温度下制备所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
第七方面，本发明的实施例提供了热启动嵌合DNA聚合酶或其变体，由第六方面任一实施例中所述的方法获得。
第八方面，本发明的实施例提供了扩增方法，包括使用第六方面任一实施例中所述的方法获得的或第七方面任一实施例中所述的热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
在一些实施例中，使用所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体进行PCR扩增或NGS建库扩增。
在一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系和所述NGS建库扩增的反应体系在4℃-25℃配制，例如4℃或20-25℃。
本发明的实施例提供的抗体对嵌合DNA聚合酶或其变体的中和活性大于98％，能够有效抑制低温下或预变性前升温阶段的非特异性扩增。
本发明的实施例提供的抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶，在4℃-25℃温度下配制反应体系进行扩增时非特异性扩增产物明显少于同类商品化聚合酶。
本发明的实施例提供的抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶PCR扩增的退火温度范围优于同类型商品化聚合酶，适用温度范围广，便于使用者根据实际情况调整温度。
本发明的实施例提供的抗体，不仅可以作用于抑制发明人前期自主研发的嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，以进一步应用于常规PCR扩增、定点突变及NGS建库等，也可以用于抑制目前市售的同类型的DNA聚合酶的聚合活性中。
为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为荧光探针法检测抗体中和活性原理示意图。
图2为M13-7p法检测抗体中和活性原理示意图。
图3为M13-7p法检测包含根据本发明实施例的抗体的血清的中和活性的结果示意图。
图4为制备根据本发明实施例的抗体的方法的示意性流程图。
图5为荧光探针法检测根据本发明实施例的抗体中和活性的结果示意图。
图6为根据本发明实施例的抗体的轻链序列和重链序列的扩增结果示意图。
图7为根据本发明实施例的抗体SDS-PAGE分析示意图。
图8为根据本发明实施例的抗体与酶以不同的质量比制备出的热启动嵌合DNA聚合酶的扩增效果示意图。
图9为根据本发明实施例的抗体制备热启动嵌合DNA聚合酶的加速稳定性测试结果示意图。
图10为常规冰上配制条件下根据本发明实施例的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶的扩增效果示意图。
图11为常温配制条件下根据本发明实施例的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶的扩增效果示意图。
图12为根据本发明实施例的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶与商品化聚合酶的NGS建库数据统计图。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
抗体是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶标，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整的(例如全长)多克隆或单克隆抗体，还包括其抗原结合片段(例 如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA、IgM或其亚类，并且该抗体不必是任何特定类别。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的多种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
典型的抗体分子包含通常参与抗原结合的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，以及重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，和其间穿插着的被称为“框架区”(“FR”)的更保守的区。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，它们按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可使用本领域已知的方法精确地鉴定，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义，所有这些在本领域中是众所周知的。参见，例如Kabat,E.A等人.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242,Chothia等人,(1989)Nature 342:877；Chothia,C.等人.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；以及Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs)。
本文所述抗体可以是全长抗体，其包含两条重链和两条轻链，重链和轻链各自包含可变结构域和恒定结构域。或者，本文所述抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。全长抗体的术语“抗原结合片段”中涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)保留功能的分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，从而使它们成为一条蛋白链，其中VL和VH区配对形成被称为单链Fv(scFv)的单价分子。参见例如，Bird等人.(1988)Science 242:423-426；以及Huston等人.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。
可以通过本领域已知的任何方法制备本文所述的能够结合嵌合DNA聚合酶或其变体 (优选B家族嵌合DNA聚合酶或其变体)的抗体。参见例如Harlow和Lane,(1998)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。
在一些实施例中，通过常规杂交瘤技术制备对靶抗原(例如，B家族嵌合DNA聚合酶或其变体)具有特异性的抗体。任选地与载体蛋白(例如KLH)连接的全长靶抗原或其片段可用于免疫宿主动物以产生与该抗原结合的抗体。宿主动物的免疫接种途径和时间表通常与用于抗体刺激和产生的已经成熟且常规的技术一致。用于产生抗体的一般技术是本领域已知的，并在本文中进行了描述。预期可以操纵任何哺乳动物受试者(包括小鼠)或由其产生抗体的细胞，以作为产生哺乳动物(包括小鼠)杂交瘤细胞系的基础。通常，用一定量的免疫原(包括本文所述的B家族嵌合DNA聚合酶或其变体)对宿主动物进行腹膜内、肌肉内、经口、皮下、足底内和/或皮内接种。
可以使用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497或者Buck,D.W.等人的修改In Vitro,18:377-381(1982)的常规体细胞杂交技术由淋巴细胞和固定的骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤细胞系(包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的那些)可用于杂交。通常，该技术涉及使用融合剂(例如聚乙二醇)或者通过本领域技术人员众所周知的电手段融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合后，将细胞与融合培养基分离，并在选择性生长培养基(例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基)中生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文所述的补充或未补充血清的任何培养基均可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种替代，EBV永生化B细胞可用于产生本文所述的单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤扩增并且亚克隆，并通过常规免疫测定方法(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定法)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤细胞包括产生能够干扰DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体的亲本杂交瘤细胞的所有衍生物、后代细胞。产生这样的抗体的杂交瘤细胞可以使用已知方法在体外或体内生长。如果需要，可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱法和超滤，从培养基或体液中分离单克隆抗体。可以除去不希望的活性物质(如果有的话)，例如通过在由附着于固相的免疫原制成的吸附剂上运行制备并从免疫原上洗脱或释放期望的抗体。用使用双官能或衍生剂与在待免疫接种的物种中是免疫原性的蛋白质(例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合的靶抗原或含靶氨基酸序列的片段对宿主动物进行免疫接种可产生抗体(例如单克隆抗体)的群体，所述双官能或衍生剂是例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的 烷基。
如果需要，可以对目的(例如，由杂交瘤细胞产生的)抗体(单克隆或多克隆)进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到载体中以表达或繁殖。可以将编码目的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，然后可以将该宿主细胞扩增并冷冻以备将来使用。对于本领域技术人员显而易见的是，可以对抗体进行一个或多个多核苷酸改变，并且仍然保持其与靶抗原的结合特异性。
在替代实施例中，从合适的抗体文库中分离能够与本文所述的靶抗原结合的抗体。包含多种抗体组分的抗体文库可用于根据本领域已知的常规选择过程来鉴定与特定靶抗原(例如，在这种情况下B家族嵌合聚合酶或其变体)结合的抗体。在选择过程中，可以用靶抗原或其片段探测抗体文库，并且可以分离能够与靶抗原结合的文库成员，通常是通过保留在载体上。可以进行多轮(例如，包括阳性和阴性选择)这样的筛选过程，以富集能够与靶抗原结合的抗体库。然后可以分离富集库的各个克隆，并进一步表征以鉴定具有期望结合活性和生物学活性的克隆。也可以通过常规方法确定重链可变结构域和轻链可变结构域的序列。有许多本领域已知的常规方法可以鉴定和分离能够与本文所述靶抗原结合的抗体，包括噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术。
可以使用ELISA测定来评估结合蛋白。例如，使每种蛋白质与底表面已用靶标(例如有限量的靶标)包被的微量滴定板接触。用缓冲液洗涤板以去除非特异性结合的多肽。然后，通过用可以识别结合蛋白(例如结合蛋白的标签或恒定部分)的抗体探测板来确定结合至板上的靶标的结合蛋白的量。将抗体连接至检测系统(例如，当提供适当底物时产生比色产物的酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(HRP))。OD450是利用Elisa方法评价血清对抗原亲和效果的具体参数，是指样品组经Elisa反应后在450波长下测定的光吸收值。因为测定体系本身具有一定的基数(即测定体系本身具有一定的光吸收，为空白)，所以最终评价的指标是OD
450-OD
空白。当(OD
450-OD
空白)越高，表明血清中特异性亲和抗体越多。
在一些实例中，通过如下示例的重组技术制备中和DNA聚合酶聚合活性的抗体。
可以将编码本文所述的抗体的重链和轻链的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码重链和轻链的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。或者，编码重链和轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者由同一启动子表达。必要时，可以在重链和轻链编码序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中，将编码抗体的两条链的核苷酸序列克隆到两个载体中，可以将它们引入相同或不同的细胞中。当两条链在不同细胞中表达时，可以将它们各自从表达它们的宿主细胞中分离出来，并且可以将分离的重链和轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。
通常，可以使用本领域已知的方法将编码抗体的一条或全部链的核酸序列克隆到合适的表达载体中并与合适的启动子可操作地连接。例如，可以在合适的条件下使核苷酸序列和载体与限制酶接触，以在每个分子上产生可以彼此配对的互补末端，并用连接酶连接在一起。或者，可以将合成核酸接头连接至基因的末端。这些合成接头含有对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
多种启动子可用于表达本文所述的抗体，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒LTR例如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子和单纯疱疹tk病毒启动子。
可以使用包括操纵子阻遏物的可调节启动子。在一个实施例中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可充当转录调节剂，以调节来自带有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录(M.Brown等人,Cell,49:603-612(1987)；Gossen和Bujard(1992)；M.Gossen等人,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))，将四环素阻遏物(tetR)与转录激活因子(VP 16)结合在一起，形成tetR哺乳动物细胞转录激活因子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，带有源自人类巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子的带有tetO的最小启动子，以产生tetR-tet操纵子系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施例中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵子正确地位于CMVIE启动子的TATA元件下游时，单独的四环素阻遏物(tetR)而不是tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以作为有效的反式调节剂来调节哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人,Human Gene Therapy,10(16):1392-1399(2003))。这种四环素诱导型开关的一个特殊优点是实现可调节作用不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活因子或阻遏物融合蛋白，这在某些情况下对细胞可能具有毒性(Gossen等人,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Shockett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995))。
另外，载体可以包含例如以下的一些或全部：选择性标记基因，例如用于选择在哺乳动物细胞中稳定或瞬时转染子的新霉素基因；来自人CMV立即早期基因的增强子/启动子序列，用于高水平的转录；来自SV40的转录终止和RNA处理信号，用于mRNA稳定；SV40多瘤病毒的复制起点和ColE1，用于适当的游离复制；内部核糖体结合位点(IRES)，多用途的多克隆位点；以及T7和SP6RNA启动子，用于有义和反义RNA的体外转录。用于产生包含转基因的载体的合适的载体和方法是本领域众所周知的并且是可获得的。
可用于实施本文所述方法的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于人胶原蛋白I聚腺苷酸化信号、人胶原蛋白II聚腺苷酸化信号和SV40聚腺苷酸化信号。
可以将包含编码任何抗体的核酸的一种或多种载体(例如表达载体)引入合适的宿主细胞中以产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞以表达抗体或其任何多肽链。这样 的抗体或其多肽链可以通过常规方法例如亲和纯化由培养的细胞回收(例如，从细胞或培养上清液中回收)。如果需要，可以在合适的条件下将抗体的多肽链孵育一段合适的时间以产生抗体。
在一些实施例中，用于制备本文所述抗体的方法涉及编码也如本文所述的抗DNA聚合酶或其变体的抗体的重链和轻链二者的重组表达载体。可通过常规方法(例如磷酸钙介导的转染)将重组表达载体引入合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)。可以选择阳性转化宿主细胞并在合适的条件下进行培养，以表达形成抗体的两条多肽链，可以从细胞或培养基中回收它们。必要时，可以在合适的条件下孵育从宿主细胞回收的两条链，以形成抗体。
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种编码抗嵌合DNA聚合酶或其变体的抗体的重链，并且另一种编码抗嵌合DNA聚合酶或其变体的抗体的轻链。可通过常规方法(例如磷酸钙介导的转染)将两种重组表达载体两者引入合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。或者，可以将每种表达载体引入合适的宿主细胞中。可以选择阳性转化子并在合适的条件下培养，以允许抗体的多肽链表达。当将两种表达载体引入相同的宿主细胞时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如果需要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，然后在合适的条件下孵育以形成抗体。当将两种表达载体引入不同的宿主细胞中时，它们各自可以从相应的宿主细胞或从相应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下孵育两条多肽链以形成抗体。
使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞并从培养基中回收抗体。例如，一些抗体可以通过亲和色谱用蛋白A或蛋白G偶联的基质分离。
编码如本文所述的抗嵌合DNA聚合酶或其变体的抗体的重链、轻链或两者的任何核酸，含有所述核酸的载体(例如表达载体)，和包含载体的宿主细胞均在本公开内容的范围内。
由此制备的抗嵌合DNA聚合酶或其变体的抗体可以使用本领域已知的方法表征，从而检测和/或测量嵌合DNA聚合酶或其变体活性的降低、改善或中和。例如，亲和活性和中和活性。
在本发明的实施例中，术语“亲和活性”指抗体结合目标嵌合DNA聚合酶或其变体的能力。在一些具体实施例中，亲和活性是指通过ELISA酶联免疫反应检测含有相应抗体的血清或亚克隆细胞对嵌合DNA聚合酶或其变体作为抗原的滴度。
在本发明的实施例中，术语“中和活性”指抗体和目标嵌合DNA聚合酶或其变体结合后抑制上述DNA聚合酶本身的聚合活性的能力。由于具有中和活性的抗体一定具有结合抗体 的能力，但能够结合并不意味着一定具有中和活性，因此在进行亲和活性筛选后，仍然需要对抗体的中和活性进行验证。
在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶或其变体来源于B家族DNA聚合酶。B家族DNA聚合酶包括phi29、Pfu、Kod聚合酶等，目前广泛应用于二代测序中，通常具有较高的连续合成能力和链置换活性。嵌合DNA聚合酶为基于上述野生DNA聚合酶进行工程化改造所获得的性能提高的DNA聚合酶。
需要说明的是，B家族DNA聚合酶的成员具有很高的序列同源性且空间结构具有很高的保守性。因此，本领域技术人员可以预期的是根据本发明实施例的抗体可以广泛用于中和目前市售的B家族DNA聚合酶的聚合活性。
本发明的实施例中通过荧光探针法(分子信标法)检测血清中抗体的中和活性。分子信标法是通过检测荧光信号产生的速率反映目标嵌合DNA聚合酶或其变体的活性被抑制的程度，原理如图1所示。分子信标法使用两端分别带有荧光发光基团和荧光的发卡结构作为模板进行扩增，当反应体系中不存在具有中和活性的抗体时，目标嵌合DNA聚合酶或其突变体的聚合活性使其能够延伸引物进而打开发卡结构，使得发光基团和淬灭基团分离，产生荧光信号；而当反应体系中存在具有中和活性的抗体时，目标嵌合DNA聚合酶或其突变体的聚合活性被抑制，嵌合DNA聚合酶或其变体不能打开发卡结构，因此无法分离发光基团和淬灭基团。因此，在同时设置不含抗体的反应体系作为阳性对照和不含DNA聚合酶或其变体的反应体系的阴性对照时，可以通过检测血清中荧光信号产生的速率，来确定抗体中和活性的高低。可以理解的是荧光信号产生的速率越慢，抗体的中和活性越强。该方法可以用于对抗体的中和活性进行初步定性分析。
本发明的实施例中通过M13-7P底物法进一步筛选了抗体的中和活性。M13-7P底物法通过检测双链DNA的产量反映目标嵌合DNA聚合酶或其变体的活性的抑制程度，该方法的原理如图2所示。M13-7P底物法使用M13-7p底物作为模板进行扩增，该底物由7条M13引物和单链DNA M13(NEB)通过预退火形成。当反应体系中不存在具有中和活性的抗体时，目标嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性允许引物引导合成双链DNA(dsDNA)；而当反应体系中存在具有中和活性的抗体时，目标嵌合DNA聚合酶或其突变体的聚合活性被抑制，无法合成双链DNA。由此，通过qubit试剂盒定量检测反应体系中双链DNA的产量，可以确定抗体中和活性的高低。可以理解的是合成的双链DNA产量越高，抗体的中和活性能力越弱；反之，合成的双链DNA产量越低，抗体的中和活性能力越强。该方法可以用于对抗体的中和活性进行进一步定量分析。
在一些实施例中，通过本发明实施例的抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶具有很好的稳定性。在实际应用中，考虑产品的使用便捷性和性能稳定性，一般将热启动嵌合DNA聚 合酶配制成PCR ReadyMix形式。如下实施例中的加速稳定性测试表明，本发明实施例的抗体与嵌合DNA聚合酶以2:1质量比制备的热启动嵌合DNA聚合酶以PCR ReadyMix形式可在-20℃保存至少1年。
以下具体描述本发明第一方面的实施例提供了分离的抗体。
在一些实施例中，所述分离的抗体特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，所述抗体包含：具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)、具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)、具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)。
SEQ ID NO:1所示的重链互补决定区1(CDR1)的序列为GFTFSSYA。
SEQ ID NO:2所示的重链互补决定区2(CDR2)的序列为ITSGGIYT。
SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区3(CDR3)的序列为ARRLGSPWWYFDV。
SEQ ID NO:4所示的轻链互补决定区1(CDR1)的序列为QSLLNSNNQKNY。
SEQ ID NO:5所示的轻链互补决定区2(CDR2)的序列为FAS。
SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区6(CDR3)的序列为QQHYSTPYT。
SEQ ID NO:1所示的重链互补决定区1(CDR1)的序列为GFTFSSYA。
SEQ ID NO:7所示的重链互补决定区2(CDR2)的序列为ISSGYST。
SEQ ID NO:8所示的重链互补决定区3(CDR3)的序列为ARVPLYYGSGWNAMDY。
SEQ ID NO:9所示的轻链互补决定区1(CDR1)的序列为QNINAW。
SEQ ID NO:10所示的轻链互补决定区2(CDR2)的序列为KAS。
SEQ ID NO:11所示的轻链互补决定区3(CDR3)的序列为QQGQSYPWT。
在一些实施例中，所述分离的抗体特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，所述抗体包含：包含以下氨基酸序列的6个CDR、或基本上由以下氨基酸序列组成的6个CDR、或由以下氨基酸序列组成的6个CDR：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)。
在一些实施例中，所述分离的抗体特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，所述抗体包含：包含以下氨基酸序列的6个CDR、或基本上由以下氨基酸序列组成的6个 CDR、或由以下氨基酸序列组成的6个CDR：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)，和SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)。
在一些实施例中，抗体包含重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，它们共同地与本文提供的抗体的重链CDR具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，抗体包含轻链互补决定区1(CDR1)、轻链互补决定区2(CDR2)和轻链互补决定区3(CDR3)，它们共同地与本文提供的抗体的轻链CDR具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施例中，抗体包含与分离的抗体，例如本文提供的任何抗体相同的重链互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)和相同的轻链互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)。在一个具体实例中，抗体包含与分离的抗体，例如本文提供的任何参考抗体相同的重链可变区(CDR1、CDR2、CDR3)和相同的轻链可变区(CDR1、CDR2、CDR3)。
在一个具体实施例中，抗体包含与抗体MM001相同的VL CDR1、CDR2、CDR3和VH CDR1、CDR2、CDR3。
在一个具体实施例中，抗体包含与抗体MM002相同的VL CDR1、CDR2、CDR3和VH CDR1、CDR2、CDR3。
在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶基本上由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成。在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶变体包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶基本上由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成。在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，嵌合DNA聚合酶变体具有与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。
嵌合DNA聚合酶具有SEQ ID NO:12所述的序列
嵌合DNA聚合酶变体具有SEQ ID NO:13所述的序列
在一些实施例中，抗体包含：包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列组成的重链可变区(VH)序列。在一些实施例中，抗体包含：包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)序列。在一些实施例中，抗体包含：包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区(VH) 序列和包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)序列。在一些实施例中，抗体包含：基本上由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列组成的重链可变区(VH)序列和基本上由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)序列。在一些实施例中，抗体包含：由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列组成的重链可变区(VH)序列和由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)序列。
在一些实施例中，所述抗体包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗体包含：包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成的重链可变区(VH)序列。在一些实施例中，抗体包含：包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:17所示氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:17所示氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)序列。在一些实施例中，抗体包含：包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区(VH序)列和包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)序列。在一些实施例中，抗体包含：基本上由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成的链可变区(VH)序列和基本上由SEQ ID NO:17所示氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)序列。在一些实施例中，抗体包含：由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成的VH序列和由SEQ ID NO:17所示氨基酸序列组成的VL序列。
在一些实施例中，本文公开的任何抗体可以包含与本文公开的分离的抗体的VH具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的重链可变结构域(VH)。替代地或另外，抗体可以包含与分离的抗体的VL具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的VH区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VH区。在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的VL区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VL区。在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的VH区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VH区；和与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的VL区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VL区。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的VH区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VH区。在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的VL区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VL区。在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的VH区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VH区；和与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的VL区具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的VL区。
SEQ ID NO:14所示的重链可变区的序列为
SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的序列为
SEQ ID NO:16所示的重链可变区的序列为
SEQ ID NO:17所示的轻链可变区的序列为
在一些实施例中，抗体为11F2F12、30E5H7、30E5H9、12H2H6、12H2G5、或12H2G1。
在一些实施例中，本文公开的任何抗体可以包含与11F2F12、30E5H7、30E5H9、12H2H6、12H2G5或12H2G1抗体具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体为11F2F12C2或12H2G1D1。需要说明的是，在本文中11F2F12C2与MM001可以互换使用，并且12H2G1D1与MM002可以互换使用。
在一些实施例中，本文公开的任何抗体可以包含与11F2F12C2或12H2G1D1抗体具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体是全长抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，抗体是Fab或单链抗体。
根据本发明的实施例，抗体11F2F12、30E5H7、30E5H9、12H2H6、12H2G5、12H2G1对嵌合聚合酶的聚合活性的抑制率大于90％，抗体为11F2F12C2、12H2G1D1对嵌合聚合酶的聚合活性的抑制率大于98％。
本发明第二方面的实施例提供了分离的核酸(核酸集)，所述核酸编码如第一方面任一实施例所述的抗体。在一些实施例中，抗体的重链和轻链由两个独立的核酸分子(核酸集)编码。在另一些实施例中，抗体的重链和轻链由一个核酸分子编码，该核酸分子可以是多顺反子形式或在不同启动子的控制下。在一些实施例中，核酸或核酸集位于一个或两个载体上。在一些实例中，一个或两个载体可以是一个或两个表达载体。
在一些实施例中，编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。在一些实施例中，编码SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，编码SEQ ID NO:16氨基酸序列所示的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。在一些实施例中，编码SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明的实施例提供了载体，所述载体包含如第二方面任一实施例所述的核酸(核酸集)。在一些实施例中，核酸或核酸集位于一个或两个载体上。在一些实施例中，所述载体是表达载体。
第四方面，本发明的实施例还提供了宿主细胞，表达或分泌如第一方面实施例所述的抗体。在一些实施例中，在允许抗体表达的合适条件下培养该宿主细胞能够从细胞培养物(例如从培养基)收获如第一方面任一实施例的抗体。
在一个实例中，可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA并进行测序。分离后，可将DNA置于一种或多种表达载体中，然后将其转染入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞(否则其将不会产生免疫球蛋白蛋白质)，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。
第五方面，本发明的实施例提供了试剂盒，所述试剂盒包含如第一方面任一实施例所述的抗体、如第二方面任一实施例所述的核酸、如第三方面任一实施例所述的载体。在一些实施例中，试剂盒还可以包含第四方面任一实施例所述的宿主细胞。
第六方面，本发明的实施例提供了制备热启动嵌合DNA聚合酶或其变体方法，包括使 用如第一方面任一实施例中所述的抗体。
在一些实施例中，抗体和嵌合DNA聚合酶或其变体以0.75:1至10:1、优选1:1至8:1、更优选2:1至6:1、例如4:1的质量比制备所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
在一些具体实施例中，将本发明实施例的抗体与嵌合DNA聚合酶或其变体以2:1的质量比，在37℃温度孵育15分钟，从而获得热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。在一些具体实例中，可以将热启动嵌合DNA聚合酶或其变体配制成PCR ReadyMix(2×)形式。
在一些实施例中，抗体和嵌合DNA聚合酶或其变体在20至40℃、例如25至37℃、例如30℃的温度下制备所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
第七方面，本发明的实施例提供了热启动嵌合DNA聚合酶或其变体，由第六方面任一实施例中所述的方法获得。第八方面，本发明的实施例提供了扩增方法，包括使用第六方面任一实施例中所述的方法获得的或第七方面任一实施例中所述的热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
在一些实施例中，使用所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体进行PCR扩增和NGS建库扩增。
在一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系和所述NGS建库扩增的反应体系在4℃-25℃配制，例如4℃或20-25℃。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例
实施例1
本实施例使用嵌合DNA聚合酶作为抗原免疫小鼠，然后检测从免疫小鼠收集的血清中抗体的亲和活性及中和活性。
1.1嵌合DNA聚合酶作为抗原免疫小鼠
使用嵌合DNA聚合酶(SEQ ID NO:12，纯度90％以上，溶解于1×PBS缓冲液中作为储存液)作为抗原对5只BALB/c小鼠进行三轮免疫攻击。
第一轮免疫：每只小鼠腹腔注射100μg弗氏完全佐剂，总计量1ml/只。
第二、三轮免疫：小鼠腹腔注射50μg/0.5ml/只弗氏不完全佐剂，每轮免疫间隔2周。
第三轮免疫后10天后，采集小鼠后肢隐静脉血，在EP管中室温静置一小时后，3000rpm离心10min，获得上清，即血清，在-80℃保存。
1.2 ELISA测定法检测血清中抗体的亲和活性
(1)将嵌合DNA聚合酶的储备液稀释至0.5μg/ml，并将其以每孔100μL的量加入酶 标板后，使酶标板在4℃包被过夜。
(2)加入200μL PBST至酶标板孔内，将酶标板震荡洗涤10分钟，上述使用PBST洗涤的步骤重复3次；再次加入200μL PBS至酶标板孔内，将酶标板震荡洗涤10分钟，上述使用PBS的洗涤步骤重复3次。
(3)加入200μL封闭液(1％BSA-PBS)至酶标板孔内，37℃孵育1-2小时。
(4)加入100μL稀释后的免疫后血清至酶标板孔内，37℃孵育2小时。然后重复步骤(2)。
(5)加入100μL新鲜配制的羊抗鼠抗体稀释溶液(Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)至酶标板孔内，产品号ab97023，购自abcam)，37℃孵育1小时。重复步骤(2)。
(6)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物在室温条件下进行避光反应，反应时间10分钟。
(7)加入50μL终止液(0.1mol/L的硫酸)至进行避光反应的酶标板孔，使用酶标仪测量酶标板中液体在450nm波长下的吸光度。
ELISA反应检测小鼠血清中抗体的亲和活性的结果如下表1所示。结果表明，3轮免疫后5只小鼠血清效价均大于1:512000，可进行细胞融合。
表1 5只小鼠三次免疫后血清效价
1.3荧光探针法检测包含抗体的血清的中和活性
(1)混合2μL的嵌合DNA聚合酶(0.13mg/ml)与3.9μL的来自免疫前和免疫后小鼠A-E的血清，将混合物在37℃孵育15分钟。
(2)加入11.5μL PBS缓冲液以获得浓度为0.015mg/ml的嵌合DNA聚合酶-血清混合液，将该混合物置于冰上备用。
(3)将引物1(TGTACAGCTAATCC，SEQ ID NO:22)与5’端带有荧光基团和3’端带有淬灭基团的分子信标(5’FAM-CGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-3’Dabcyl，SEQ ID NO:23)以等摩尔混合，然后以0.5℃/min的退火速率从95℃降温至30℃，以获得荧光探针底物。
(4)配制包含以下成分的反应体系：2μL的步骤(2)获得的嵌合DNA聚合酶-血清预混液，4μL 5×反应缓冲液(10mM Tris-HCl，80mM KCl，2mM MgCl
2，0.1％NP40，0.1％Tween 20，pH 9.0)，0.5μL 10mM dNTPs，11.5μL无核酸酶的水，2μL的步骤(3)获得的荧光探针底物。阳性对照组(PC)为不含血清的上述反应体系；阴性对照组(NC)为不含嵌合DNA聚合酶的上述反应体系。
(5)将上述反应体系在40℃孵育1小时，并采用qPCR检测法监测聚合反应产生的荧光信号，每30s采集一次荧光信号。
由于抗体可以特异性结合DNA聚合酶，因此会抑制DNA聚合酶参与的聚合反应，表现为荧光信号产生速度降低。由此，当qPCR检测法的结果显示荧光信号产生速度被抑制时，表明该则血清样品中存在具有中和活性的抗体。
图3显示了荧光探针法检测包含抗体的血清的中和活性，其中各组分别为未经血清孵 育的嵌合DNA聚合酶组(PC)；不含酶的反应混合液组(NC)，在检测体系中以无核酸的水替代酶；免疫前血清&酶组(NC2)，表示用来自免疫前小鼠的血清与嵌合DNA聚合酶孵育；免疫后血清&酶热激组(PC2)，表示热启动嵌合DNA聚合酶经95℃3分钟的热刺激处理后，在抗体失活的情况下加入荧光探针反应体系；以及免疫后血清&酶组，表示用免疫后血清与嵌合DNA聚合酶孵育，制备热启动嵌合DNA聚合酶，即为处理组。
图3结果显示，对于5只经免疫小鼠A-E，与未经血清孵育的嵌合DNA聚合酶组(PC)的荧光信号相比，免疫后血清&酶组的荧光信号与不含酶的反应混合液组(NC)的荧光信号一致，即反应体系没有或几乎没有发生聚合反应，表明反应体系中的嵌合DNA聚合酶的聚合活性被抑制，因此确定5只免疫后小鼠的血清中均包含具有中和活性的抗体。此外，免疫后血清&酶热刺激组经过热刺激后，荧光信号增加，且增速与PC组相差不大，表明热刺激能够使嵌合DNA聚合酶的聚合活性恢复。
1.4 M13-7P底物法检测包含抗体的血清中和活性
(1)混合2μL的嵌合DNA聚合酶(0.13mg/ml)与3.9μL的来自免疫后小鼠A-E的血清，将混合物在37℃孵育15分钟。
(2)加入11.5μL PBS缓冲液以获得浓度为0.015mg/ml的嵌合DNA聚合酶-血清混合液，将该混合物置于冰上备用。
(3)将M13单链DNA(M13mp18 Single-stranded DNA，购自NEB，货号#N4040S)和表2所示的7种引物通过梯度降温(以0.5℃/min的退火速率从95℃的温度降温至30℃)的方式进行退火，以获得M13-7p底物。
表2 M13-7p检测中使用的引物序列
| 引物名称和编号 | 碱基序列(5'端至3'端) |
| M13-引物2,SEQ ID NO:24 | CAAAGCGAACCAGACCGGAAGCAAACTCCAACA |
| M13-引物3,SEQ ID NO:25 | AGACAGCATCGGAACGAGGGTAGCAACGGCT |
| M13-引物4,SEQ ID NO:26 | GAACCAGAGCCACCACCGGAACCGCCTC |
| M13-引物5,SEQ ID NO:27 | AGCGAACCTCCCGACTTGCGGGAGG |
| M13-引物6,SEQ ID NO:28 | ACCTTTTACATCGGGAGAAACAATAACGGATTCGCCTGATTGC |
| M13-引物7,SEQ ID NO:29 | GCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGT |
| M13-引物8,SEQ ID NO:30 | AGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC |
(4)配制包含以下成分的反应体系：1μL的步骤(2)获得的嵌合DNA聚合酶-血清混合液，5μL 5×反应缓冲液(10mM Tris-HCl，80mM KCl，2mM MgCl
2，0.1％NP40，0.1％Tween 20，pH9.0)，3μL M13-7P底物，1μL 10mM dNTPs，2μL 2mM MgCl
2，13μL 无核酸酶的水。阳性对照组(PC)为不含血清的上述反应体系；阴性对照组(NC)为不含嵌合DNA聚合酶的反应体系。
(5)将上述反应体系在40℃孵育20分钟，然后向反应体系中加入2.5μL EDTA(0.5M)以终止反应。
(6)使用Qubit
TM dsDNA HS检测试剂盒检测合成的双链DNA的产量，以确定抗体对嵌合DNA聚合酶的中和活性。
由于抗体可以特异性结合DNA聚合酶，因此会抑制DNA聚合酶参与的双链DNA合成。双链DNA产量越低，说明嵌合DNA聚合酶的聚合活性越低，相应地抗体的中和活性越强。
表3 M13-7底物法检测包含抗体的血清的中和活性
表3结果显示，对于5只经免疫小鼠A-E，其血清中均含有具有中和活性的抗体，并且抑制率可达97.3％。此外，经95℃热激处理3分钟后，嵌合DNA聚合酶的聚合活性能完全恢复。
基于以上亲和活性与中和活性的检测结果，选择免疫后小鼠A用于进行后续细胞融合试验。
实施例2
本实施例利用免疫后小鼠A的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤细胞，并根据图4所示流程图获得上述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
2.1制备杂交瘤细胞
(1)处死免疫后小鼠A，并固定于解剖板上以取出脾脏。将脾脏置于玻璃匀浆器中进行匀浆，获得小鼠脾细胞。
(2)将稀释后的脾细胞与小鼠SP2/0Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合。
(3)将成功融合后的细胞在96孔板中培养，该细胞即为杂交瘤初始克隆细胞。
2.2第一亚克隆细胞产生的抗体的亲和活性
(1)使用目标嵌合DNA聚合酶对96孔板进行包被，然后向包被后的96孔板加入初始克隆细胞的上清液进行Elisa反应，以检测抗体的亲和活性。
(2)基于抗体的亲和活性的检测结果，选择30-40株亲和力较高的杂交瘤初始克隆细胞进行第一轮有限稀释，以获得对应所选择的各个初始克隆细胞的第一亚克隆细胞。然后多个第一亚克隆细胞中，选择5-7株作为第一亚克隆细胞。
(3)对200株第一亚克隆细胞的上清液进行Elisa亲和活性检测，其中所用抗原为1μg/mL的嵌合DNA聚合酶，检测体系为10μL。
以下表4显示了200株第一亚克隆细胞产生的抗体的Elisa检测结果，其中空白的OD值为0.045。
表4 Elisa检测法确定的第一亚克隆细胞抗体的亲和活性
2.3第一亚克隆细胞产生的抗体的中和活性
(1)将200株第一亚克隆细胞的上清液(各5ml)加入200μL的Protein A琼脂糖树脂(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号#10600-P07E-RN)进行亲和吸附，然后以洗脱液(0.1M甘氨酸，0.02M精氨酸，醋酸，pH3.0)进行洗脱并透析至1×PBS缓冲液中，以获得纯化的各个第一亚克隆细胞产生的抗体。
(2)以2:1的质量比等体积混合抗体(0.26mg/ml)和嵌合DNA聚合酶(0.13mg/ml)，然后将上述混合物在37℃的条件下孵育15分钟以获得热启动嵌合DNA聚合酶。
(3)荧光探针法检测抗体的中和活性
a.加入PBS以获得稀释40倍的热启动嵌合DNA聚合酶溶液。
b.配制包含以下成分的反应体系：2μL稀释后的热启动嵌合DNA聚合酶溶液，4μL 5×反应缓冲液(10mM Tris-HCl，80mM KCl，2mM MgCl
2，0.1％NP40，0.1％Tween 20，pH9.0)，0.5μL 10mM dNTPs，11.5μL无核酸酶的水，2μL前述荧光探针底物。阳性对照组(PC)为不含抗体的上述反应体系；阴性对照组(NC)为不含嵌合DNA聚合酶的上述反应体系。
c.将上述反应体系在40℃孵育1小时，并采用qPCR检测法监测扩增反应中产生的荧光信号。
图5显示了荧光探针法检测抗体的中和活性。图5显示，相对于阳性对照组，200株抗体中的12株抗体&酶组表现出明显降低的荧光信号变化速率，表明该12株抗体具有强效中和活性，分别为1-39(16G4E2)、1-1(26E2B1)、2-19(30E5B10)、1-49(6D7G1)、1-47(6D7G4)、2-62(30E5H7)、2-1(11F2F12)、3-9(30E5H9)、3-18(12H2H6)、3-72(12H2G1)、3-40(30E5C10)和3-39(12H2G5)。
(4)M13-7p底物法检测抗体的中和活性
a.加入PBS以获得稀释2倍的热启动嵌合DNA聚合酶溶液。
b.配制包含以下成分的反应体系：1μL稀释后的热启动嵌合DNA聚合酶，5μL 5×反应缓冲液(10mM Tris-HCl，80mM KCl，2mM MgCl
2，0.1％NP40，0.1％Tween 20，pH9.0)，3μL M13-7p底物，1μL 10mM dNTPs，2μL 2mM MgCl
2，13μL无核酸酶的水)。阳性对照组(PC)为不含抗体的上述反应体系；阴性对照组(NC)为不含有嵌合DNA聚合酶的上述反应体系。
c.将上述反应体系在40℃孵育20分钟，然后向反应体系中加入2.5μL EDTA(0.5M)以终止反应。
d.使用Qubit
TM dsDNA HS检测试剂盒检测合成的双链DNA的产量，以确定抗体对嵌 合DNA聚合酶的中和活性。
由于抗体可以特异性结合DNA聚合酶，因此会抑制DNA聚合酶参与的双链DNA合成。双链DNA产量越低，说明嵌合DNA聚合酶的聚合活性越低，相应地抗体的中和活性越强。
表5 M13-7p底物法检测抗体的中和活性
如表5所示，M13-7p底物法检测的抗体中和活性与探针法检测的抗体中和活性结果基本上一致。200株中的12株第一亚克隆细胞产生的抗体对嵌合DNA聚合酶的聚合活性具有显著抑制能力，其中6株抗体对嵌合DNA聚合酶的聚合活性的抑制高达90％以上。分别是：11F2F12、30E5H7、30E5H9、12H2H6、12H2G5和12H2G1。
2.4基于二亚克隆细胞产生的抗体进行筛选和保种
(1)基于2.3中确定的中和活性较高的6株抗体，选择11F2F12、12H2G1、30E5H9三株第一亚克隆细胞进一步亚克隆化以获得相应的第二亚克隆细胞。
(2)进一步对第二亚克隆细胞产生的抗体进行中和活性确认，结果见表6所示。
表6 M13-7p底物法检测二亚细胞对应抗体的中和活性
| 二亚细胞株编号 | ID | 活性抑制程度 |
| MM001 | 12H2G1D1 | 96.76％ |
| MM002 | 11F2F12C2 | 98.08％ |
| MM003 | 30E5H9A5 | 93.08％ |
进一步分析确认，三株二亚细胞株中，MM003非单克隆。将单克隆抗体11F2F12C2及12H2G1D1所对应的稳定细胞株MM001和MM002保存在液氮中，
实施例3
本实施例基于实施例2中的两种单克隆抗体，对编码抗体的核酸进行测序，并对抗体 进行纯化。
3.1单克隆抗体对应的二亚细胞的培养。
a.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30分钟。
b.培养基在37℃的恒温水浴箱中放置20分钟以上。
c.从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃直至冻存液完全融化。
d.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入9mL培养液(RPMI 1640培养基，20％FBS)，1000rpm离心5分钟。
e.用4mL培养液悬浮细胞后转入T25培养瓶中，37℃静置培养。获得足量细胞用于后续步骤。
3.2确定抗体轻链和重链的可变区序列
(1)分别提取细胞株MM001和MM002的总RNA(PureLink RNA Mini Kit,Invitrogen
TM，货号#12183018A)。
(2)使用上述总RNA作为模板，通过RT-PCR合成cDNA(SuperScript
TM II Reverse Transcriptase，Invitrogen
TM，货号#18064071)。
(3)以cDNA为模板通过Mouse IgG Library Primer Set试剂盒(购自progen，货号#F2010)，分别使用11对轻链扩增引物及11对重链扩增引物进行PCR扩增。
(4)对22个扩增产物分别进行凝胶电泳，以确定包含重链可变区的扩增产物和包含轻链可变区的扩增产物。如图6所示，第八对重链引物对成功扩增出MM001和MM002细胞株分泌出的抗体的重链可变区片段；第五对轻链引物对成功扩增出MM001和MM002细胞株分泌出的抗体的轻链可变区片段，抗体的轻链和重链的可变区DNA片段集中在400bp附近。
(5)将第八重链引物对扩增产物和第五轻链引物对扩增产物重新进行凝胶电泳，并使用
凝胶提取试剂盒(购自Omega，货号#D2500-02)回收胶中对应的轻链可变区片段和重链可变区片段。
(6)将轻链可变区片段和重链可变区片段分别连接到T载体中(pMD 19-T载体克隆试剂盒，Takara，货号#6013)，然后转化进大肠杆菌DH5α后，扩增后送样测序。
经测序，分别确定抗体MM001和MM002的轻链可变区片段和重链可变区片段各自的编码序列。然后，通过DNA转录翻译确定轻链可变区片段和重链可变区片段的氨基酸序列。
通过IMGT数据库比对，确定出重链可变区片段和轻链可变区片段中各自的3个互补决定区序列。
3.3抗体纯化及储存
(1)将3.1获得的MM001和MM002细胞株在无血清HybriSFM-P1B培养基(购自上海奥浦迈生物科技股份有限公司，货号H081801-001)中进行驯化培养。
(2)将驯化培养后的细胞在HybriSFM-P1B杂交瘤细胞培养基中悬浮培养。
(3)使用Protein A琼脂糖树脂柱，对离心后获得的悬浮培养体系的上清液进行亲和纯化。
a.制备用Protein A琼脂糖树脂(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号#10600-P07E-RN)纯化柱。
b.将细胞上清液上样到纯化柱进行亲和吸附，上样速度为8ml/min(结合缓冲液为1×PBS)。
c.使用洗脱液(0.1M甘氨酸，0.02M精氨酸，醋酸，pH3.0)进行洗脱以获得纯化抗体。然后将洗脱下来的抗体透析至2×PBS中。在280nm处测定吸光度，以Bradford检测法计算抗体浓度。
(4)将抗体以1.2mg/mL的浓度储存至储存液(1×PBS+50％甘油)中。
(5)对抗体进行SDS-PAGE分析。
抗体的SDS-PAGE分析结果如图7所示，抗体的轻链和重链分别位于25kDa和55kDa附近，且纯度较高，满足应用要求。
实施例4
本实施例基于实施例3中纯化获得的抗体MM001和MM002，以多种方式验证该抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶性能。
4.1不同条件下制备热启动嵌合DNA聚合酶
分别在25℃、30℃和37℃的温度，分别以2:1、4:1和6:1的抗体-嵌合DNA聚合酶质量质量比，分别将抗体MM001和MM002与B家族嵌合DNA聚合酶(SEQ ID NO:12)孵育15分钟，以获得热启动嵌合DNA聚合酶。通过M13-7p底物法检测热启动嵌合DNA聚合酶的中和活性。
表6抗体-聚合酶质量比和温度对热启动嵌合DNA聚合酶的聚合活性的影响
表6显示抗体MM001和MM002在3个不同反应温度下以三种不同的抗体-聚合酶质量比都表现出98％以上的对嵌合DNA聚合酶聚合活性的抑制作用。
4.2抗体对嵌合DNA聚合酶变体的聚合活性的影响
将质量比为2:1的抗体MM001/MM002与嵌合DNA聚合酶变体(SEQ ID NO:13)在37℃条件下孵育15分钟，以获得热启动嵌合DNA聚合酶变体。通过M13-7p底物法检测抗体MM001/MM002对嵌合DNA聚合酶变体的聚合活性的影响。
表7抗体MM001/MM002对嵌合DNA聚合酶变体聚合活性的影响
表7显示了两种MM001和MM002对嵌合DNA聚合酶变体聚合活性的影响。结果表明，抗体MM001和MM002对嵌合DNA聚合酶变体也具有良好的中和效果。
4.3不同抗体-聚合酶质量比制备的热启动嵌合DNA聚合酶的扩增效果
以不同的抗体-聚合酶质量比(0.75:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、8:1和10:1)，分别将抗体MM001和M002与B家族嵌合DNA聚合酶(SEQ ID NO:12)在37℃孵育15分钟，以分别获得热启动嵌合DNA聚合酶。
常温下配制包含如上各种质量比制备的热启动嵌合DNA聚合酶的分别针对较小目的片段hACTG1(485bp)和较大目的片段hCYB5A(998bp)的PCR反应体系，在室温放置30分钟以上，然后以61℃退火温度进行PCR扩增，结果如图8所示。
图8的凝胶电泳结果显示，相对于非热启动嵌合DNA聚合酶的扩增产物呈显出明显弥散状，所有抗体-聚合酶质量比制备的热启动DNA聚合酶的弥散状扩增产物显著减少，同时目标扩增产物的条带更加集中，表明热启动嵌合DNA聚合酶改善了PCR扩增。进一步地，相对于非热启动嵌合DNA聚合酶，当抗体-嵌合DNA聚合酶的质量比大于或等于2:1 时，扩增性能显著增强，并且大于2:1的各个质量比在扩增性能方面无明显差别。
4.4热启动嵌合DNA聚合酶的加速稳定性测试
在37℃温度以2:1的抗体-聚合酶质量比，将抗体和嵌合DNA聚合酶孵育15分钟，以获得热启动嵌合DNA聚合酶。将热启动嵌合DNA聚合酶配制为PCR ReadyMix(2×)形式。将PCR ReadyMix形式的热启动嵌合DNA聚合酶放置于37℃烘箱中进行为期两周的加速稳定性测试，并以特定时间间隔取样并通过M13-7p测定法检测抗体的中和活性，结果参见表8。
表8加速稳定性测试
表8示出了将PCR ReadyMix形式的热启动聚合酶放置于37℃烘箱保存至16天，其对嵌合DNA聚合酶的聚合活性的抑制作用仍然保持在99％以上，表明本发明实施例中的抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶具有良好的稳定性。
以E.coli gDNA rRNA-1.5kb基因作为模板，分别基于包含上述保藏不同天数的PCR ReadyMix形式的热启动嵌合DNA聚合酶的PCR反应体系进行扩增反应(其中以PCR ReadyMix形式的非热启动嵌合DNA聚合酶作为对照)。然后，计算并比较保藏不同天数的PCR ReadyMix形式的热启动嵌合DNA聚合酶获得扩增产物的产量(相对于PCR ReadyMix形式的非热启动嵌合DNA聚合酶)，结果如表9所示。同时，对各个扩增产物进行凝胶电泳，如图9所示。
表9加速稳定性测试
表9及如图9显示，加速稳定性测试进行8天后，本发明实施例中的抗体所制备的热启动嵌合DNA聚合酶依然具有优秀的热启动效果和扩增效果。加速稳定性测试进行8天后，与非热启动嵌合DNA聚合酶相比，热启动嵌合DNA聚合酶获得扩增产物的产量仍在73％以上，表明抗体MM001和MM002制备的热启动嵌合DNA聚合酶可在-20℃长时间保存(例如1年)。
4.5 0-4℃使用热启动嵌合DNA聚合酶进行常规PCR扩增反应
在冰上(0-4℃)配制包含以抗体MM001和MM002制备的热启动嵌合DNA聚合酶的分别针对较小目的片段hUQCRC1(315bp)、中等目的片段hPRPH(744bp)以及较大目的片段hCYB5A(998bp)的PCR反应体系，并分别以包含非热启动嵌合DNA聚合酶和商品化同类型热启动聚合酶(Supplier K-HS，购自Kapa Biosystems公司，货号#KK2611)的相应PCR反应体系作为对照。以不同的退火温度(55.4℃、58.1℃、61℃和63.7℃)分别对上述不同反应体系进行PCR扩增反应，其中采用经典的三步法扩增程序，循环数为30。然后，对所有扩增产物分别进行凝胶电泳以比较以抗体MM001和MM002制备的热启动嵌合DNA聚合酶的扩增效果。
图10示出了本发明实施例中的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶在不同退火温度下进行PCR扩增反应的扩增效果。图10显示，相比于非热启动嵌合DNA聚合酶和商品化同类型热启动聚合酶，采用本发明实施例提供的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶在0-4℃配制PCR扩增体系，扩增反应后的弥散状扩增产物显著减少；此外，在58.1℃的退 火温度仍然能够以明显更高的特异性扩增出较大的目的片段hCYB5A(998bp)和中等目的片段hPRPH(744bp)，甚至在低至55.4℃的退火温度仍然能够以显著更高的特异性扩增出较小目的片段hUQCRC1(315bp)。这些结果表明本发明实施例中的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶具有优异的特异性扩增效果，并且在退火温度方面优于非热启动嵌合DNA聚合酶和商品化同类型热启动聚合酶。
4.6常温下使用热启动嵌合DNA聚合酶进行PCR扩增反应
考虑到在配制大量PCR反应体系时，难以一直将其保持0至4℃。因此，以E.coli gDNA rRNA-1.5kb基因作为模板，在常温(例如室温，诸如20-30℃)配制包含本发明实施例中的抗体MM001和MM002制备热启动嵌合DNA聚合酶的PCR反应体系，并以包含商品化同类型热启动聚合酶(Supplier K-HS，购自Kapa Biosystems公司，货号#2611)的相应PCR反应体系作为对照。以不同的退火温度(50.0℃、51.0℃、53.1℃、56.4℃、60.6℃、63.9℃、66.0℃和67.0℃)分别对上述不同反应体系进行PCR扩增反应，其中采用经典的三步法扩增程序，循环数为30。然后，对所有扩增产物分别进行凝胶电泳以比较以抗体MM001和MM002制备的热启动嵌合DNA聚合酶的扩增效果。
图11示出了本发明实施例中的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶在不同退火温度下进行PCR扩增反应的扩增效果。图11显示，采用商品化同类型热启动聚合酶配制PCR扩增体系，以60.6℃退火温度进行扩增反应的扩增产物明显减少，以63.9℃退火温度进行扩增反应的扩增产物非常少至几乎消失，而以66.0℃和67.0℃的退火温度进行扩增反应完全无法获得扩增产物。相比之下，采用本发明实施例提供的抗体制备出的热启动嵌合DNA聚合酶在常温下配制PCR扩增体系，在63.9℃的退火温度仍然能够稳定获得目的扩增产物，与50.0℃、51.0℃、53.1℃、56.4℃和60.6℃的退火温度进行扩增反应相比，目的扩增产物没有显著减少；并且即使在66.0℃和67.0℃的退火温度进行扩增反应也可以获得少量目的扩增产物。这些结果表明，即使在常温下使用本发明实施例中的抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶进行扩增反应，也可以获得优异的扩增效果，并且在退火温度方面优于非热启动嵌合DNA聚合酶和商品化同类型热启动聚合酶。
4.7热启动嵌合DNA聚合酶应用于NGS扩增
将MM002抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶应用于WES建库，并以包含商品化同类型热启动聚合酶(Supplier K-HS，购自Kapa Biosystems公司，货号#2611)的相应应用作为对照，比较建库产量及建库质量结果见图12所示。华大测序G400平台Standard MPS测序报告显示，经由MM002抗体制备的热启动嵌合DNA聚合酶建库产量及基因覆盖度与 商品对照酶相当。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求之内。
尽管已经在本文中描述和示出了多个发明实施例，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文所述的功能和/或获得其结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且这些变型和/或修改中的每一个都被认为在本文所述的发明实施例的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造均是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识或仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体发明实施例的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施例仅以示例的方式给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实践本发明的实施例。本公开内容的发明实施例涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法的任意组合包括在本公开内容的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应被理解为控制字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请关于其各自被引用的主题通过引用并入本文，在某些情况下，其可以涵盖整个文献。
除非明确相反地指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的未用数量词限定的名词应理解为表示“至少一个”。
如在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为是指这样结合的元素中的“一个或两个”，即在某些情况下共同存在而在另一些情况下分开存在的元素。用“和/或”所示的多个元素应以相同的方式解释，即，如此连接的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”子句明确标识的元素之外，还可以任选地存在其他元素，无论其与具体标识的那些元素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，在一个实施例中，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及可以仅指A(任选地包含B以外的元素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包含A以外的元素)；在又一个实施例中，指A和B两者(任选地包含其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/ 或”相同的含义。例如，当分开列表中的项目，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即包含若干元素或元素列表中的至少一个，但也包括了多于一个；以及任选地未指出的项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”或当在权利要求书中使用时“由...组成”将指包含若干元素或元素列表中的精确一个元素。一般而言，本文中使用的术语“或”仅当在排他性术语例如“两个中的任一个”、“…中的一个”、“…中的仅一个”或“…中的恰好一个”之前时才解释为表示互斥的替代方案(“一个或另一个但不是全部两个”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由…组成”应具有专利法领域中所使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应被理解为是指从元素列表中的任一个或多个元素中选择的至少一个元素，但未必包含元素列表中具体所示的每个和每一个元素的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许短语“至少一个”所指代的元素列表中具体指出的元素以外元素可以任选地存在，无论其与具体指出的那些元素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指，在一个实施例中指至少一个A，任选地包含多于一个A，并且不存在B(并且任选地包含B以外的元素)；在另一个实施例中，指至少一个B，任选地包含多于一个B，并且不存在A(并且任选地包含A以外的元素)；在另一些实施例中，指至少一个A，任选地包含多于一个A，以及至少一个B，任选地包含多于一个B(并且任选地包含其他元素)；等等
还应理解的是，除非有明显的相反指示，否则在包括多于一个步骤或动作的本文要求保护的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序未必限于记载的方法的步骤或动作的顺序。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (23)
- 分离的抗体，其特征在于，所述抗体特异性中和嵌合DNA聚合酶或其变体的聚合活性，所述抗体包含：具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1、具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链互补决定区2、具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链互补决定区3、具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链互补决定区3。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含：具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1、具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链互补决定区2、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链互补决定区3、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链互补决定区3；或者具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1、具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链互补决定区2、具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链互补决定区3、具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链互补决定区3；可选的，所述嵌合DNA聚合酶或其变体来源于B家族DNA聚合酶。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述嵌合DNA聚合酶包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述嵌合DNA聚合酶变体包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区；或者所述抗体包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为11F2F12、30E5H7、30E5H9、 12H2H6、12H2G5或12H2G1。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为11F2F12C2或12H2G1D1。
- 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
- 核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1-9中任一项所述的抗体。
- 根据权利要求10所述的核酸，其特征在于，编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求10所述的核酸，其特征在于，编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
- 载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求10-12中任一项所述的核酸，任选地，所述载体是表达载体。
- 宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达或分泌如权利要求1-9中任一项所述的抗体。
- 根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，在允许抗体表达的合适条件下培养该宿主细胞能够从细胞培养物收获如如权利要求1-9中任一项所述的抗体。
- 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-9中任一项所述的抗体、如权利要求10-12中任一项所述的核酸、如权利要求13所述的载体或权利要求14或15所述的宿主细胞。
- 一种制备热启动嵌合DNA聚合酶或其变体的方法，其特征在于，包括使用如权利要求1-9中任一项所述的抗体。
- 根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗体和嵌合DNA聚合酶或其变体以0.75:1至10:1、优选1:1至8:1、更优选2:1至6:1、例如4:1的质量比制备所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
- 根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述抗体和嵌合DNA聚合酶或其变体在20至40℃、例如25至37℃、例如30℃的温度下制备所述热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
- 一种热启动嵌合DNA聚合酶或其变体，由如权利要求17至19中任一项所述的方法获得。
- 一种核酸扩增方法，其特征在于，包括使用如权利要求17至19中任一项所述的方法获得的或根据权利要求20所述的热启动嵌合DNA聚合酶或其变体。
- 根据权利要求21所述的核酸扩增方法，其特征在于，使用所述热启动嵌合DNA 聚合酶或其变体进行PCR扩增或NGS建库扩增。
- 根据权利要求19所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系和所述NGS建库扩增的反应体系在4-25℃配制，例如4℃或20-25℃。
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