CN112626009B - 一种调整干细胞成软骨分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调整干细胞成软骨分化的方法，包括将干细胞置于诱导培养基里培养，所述诱导培养基含诱导因子，所述诱导因子为人源化抗体，所述抗体具有体外诱导干细胞向软骨细胞分化的作用，还可以促进干细胞体外增殖，因而可以用于干细胞增殖或诱导干细胞向软骨细胞发育，并且可用于制备诱导干细胞增殖并诱导其成软骨分化的培养基。

Description

一种调整干细胞成软骨分化的方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养领域，特别地涉及一种调整干细胞成软骨分化的方法。
背景技术
干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。干细胞是对疾病进行基因治疗时理想载体。造血干细胞具有自我更新、多向分化重建长期造血、采集和体外处理容易等特点。因此是基因治疗最理想的载体细胞之一，以此为基础的基因治疗，在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景。
软骨组织工程是治疗软骨损伤疾病的重要生物工程手段。在软骨组织工程中，种子细胞的选择主要考虑以下几点：细胞易获取并且来源充足，对取材对象损伤小；较低的免疫排斥；具有诱导分化潜力并且增殖分化能力较强等；可以通过体外扩增技术获取大量传代细胞。在诱导具有分化潜力的细胞向软骨向分化的研究中，间充质干细胞具有不可替代的成软骨诱导分化能力被广泛关注。相较于其它干细胞，脐带间充质干细胞具有低免疫原型，同时具备成软骨潜力，可以作为软骨组织工程的细胞来源之一。
人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一类具有多向分化能力和自我更新能力的间充质干细胞。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于hUC-MSCs的提取。但如何调整人脐带间充质干细胞成软骨分化，是业界亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种调整干细胞成软骨分化的方法
本发明是以如下技术方案实现的：
一种调整干细胞成软骨分化的方法，包括将干细胞置于诱导培养基里培养，所述诱导培养基含诱导因子，所述诱导因子为人源化cyclinD1抗体。
进一步地，所述诱导培养基成分包括：转铁蛋白、烟酸肌醇酯、地塞米松、人源化cyclinD1单抗、DMEM培养基和胎牛血清。
进一步地，所述诱导培养基成分含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5 mg/L烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、人源化cyclinD1单抗50mg/L、 DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
进一步地，所述人源化cyclinD1单抗能与cyclinD1蛋白特异性结合，所述人源化cyclinD1单抗包含氨基酸序列如SEQ ID NO:01所示的 CDR-L1，和氨基酸序列如SEQ IDNO:02所示的CDR-L2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:03所示的CDR-L3，和氨基酸序列如SEQ IDNO:04所示的 CDR-H1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:05所示的CDR-H2，和氨基酸序列如SEQID NO:06所示的CDR-H3。
进一步地，所述抗体重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。
进一步地，所述抗体轻链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
进一步地，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一 Fc端的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本发明提供了一种调整干细胞成软骨分化的方法，所述抗体具有体外诱导干细胞向软骨细胞分化的作用，还可以促进干细胞体外增殖，因而可以用于干细胞增殖或诱导干细胞向软骨细胞发育，并且可用于制备诱导干细胞增殖并诱导其成软骨分化的培养基。
具体实施方式
定义
本发明术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出特定的抗原结合活性。
术语“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分，抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和/或由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的类别是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“IgG”是免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4。
本发明术语“人源化”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人 FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR对应于非人抗体的那些HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已人源化的抗体。
抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。
本发明术语“结合”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用。除非另有说明，本发明所述“结合力”是指结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示，亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量。
本发明术语“同一性”、“相似度”为比对序列并引入间隙以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现为了确定百分比氨基酸序列同一性的目的比对，包括但不限于使用公众可用的计算机软件如BLAST、ALIGN或 Mega软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
Wnt蛋白家族是一类在进化上高度保守的分泌型糖蛋白，参与细胞增殖、再生、分化和细胞迁移等多种生物学过程。Wnt信号通路包括经典Wnt/ β-catenin信号通路和非经典通路。在经典Wnt信号通路中无Wnt蛋白结合时一部分β-catenin与包膜上的E-钙黏着蛋白结合参与细胞与细胞间的黏附；在胚胎发育中，软骨蛋白开始于软骨间质细胞凝集成软骨结节，随后分化成软骨细胞并产生软骨特异性细胞外基质蛋白如II型胶原和蛋白聚糖；最后经历一次单向扩散形成有序的平行列，推出细胞周期，变成预肥大、肥大的软骨细胞，多种经典和非经典Wnt信号通路成分在这个过程中发挥调节作用，细胞周期蛋白D1在体内会引起软骨细胞增殖抑制和延迟软骨细胞肥大。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例1：
使用购自上海研生生化试剂有限公司的抗原蛋白cyclinD1蛋白(细胞周期蛋白D1)进行小鼠免疫，实验动物为6至8周龄雌性BALB/c小鼠(购自江苏艾菱菲生物科技有限公司)。具体地，将所述抗原蛋白溶于生理盐水，首次免疫使用80μg人与等体积完全福氏佐剂采用双推法混匀并按 0.5ml/只注射量注射小鼠，腹部皮下注射，2周后进行加强免疫，加强免疫使用40μg人cyclinD1蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液，按0.25ml/ 只注射量注射小鼠腹腔，加强免疫3次，末次免疫三天后取小鼠静脉血并分离血清，用ELISA法测定获得抗体的效价，选择抗体效价高的小鼠细胞制备单脾细胞悬液，将单脾细胞悬液与骨髓瘤细胞共同培养至对数生长期，将上述杂交瘤细胞悬浮液分装至96孔板上，培养杂交瘤细胞，待杂交瘤细胞面积长至孔底面积一半以上，吸出悬浮液上清液供抗体检测。将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行核苷酸序列测定。序列测定具体方法包括：提取细胞mRNA后合成cDNA第一链，将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆进行DNA测序，测序由金唯智生物科技完成。
实施例2：
经过PCR扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、 CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区 CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4、抗体重链恒定区序列序列鼠源IgVH2，将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接获得LC全长序列；将抗体重链可变区和重链恒定区连接获得VC全长序列。人源化形式的抗人 cyclinD1抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，选取与鼠源抗人cyclinD1嵌合单抗非CDR区匹配度最高的人源化模板，参考Germline数据库，其中重链可变区的模板为人源IgVH4-11*03，轻链可变区的模板为人源IGKV1-43*02，将鼠源抗体CDR区替换上述人源化模板并的CDR区得到人源化抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，得到人源化抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表 1所示。
表1.重链可变区氨基酸序列及轻链可变区氨基酸序列
人源化单抗 VH VL
ORI SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8
Fhxx-01 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:11
Xxjk-01 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12
将人抗体IgG1重链恒定区(如SEQ ID NO:13所示)分别与上述获得的人源化抗人cyclinD1单抗的重链可变区(分别如SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10所示)连接得到对应的重链全长序列。将人抗体Kappa 轻链的恒定区(如SEQ ID NO:14所示)分别与人源化抗人cyclinD1单抗的轻链可变区(分别如SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12所示) 连接得到对应的轻链全长序列。
将上述所有重链全长序列与轻链全长序列对应组合得到人源化抗体全长序列(分别为ORI组、Fhxx-01组、Xxjk-01组)，将编码上述序列的核苷酸序列克隆到真核细胞表达载体X0GC中，之后分别将含抗体的重链和轻链的表达载体转染ExpiCHO细胞(购自invitrogen)。转染前一天接种细胞，转染当天用新鲜的ExpiCHO表达培养基将细胞稀释，稀释密度为60 ×105细胞/mL。按照转染体积取出质粒，用OptiPROTMSFM培养基将质粒稀释至转染体积的4％，取出6.4倍质粒量的ExpiFectamineTM转染试剂用 OptiPROTMSFM培养基将转染试剂稀释至转染体积的4％。将稀释后的转染试剂加入到稀释的质粒中，轻轻混匀，室温静置1～5min，慢慢滴加到细胞中。之后放入细胞培养箱120rpm摇床37℃培养20小时。向细胞中慢慢滴加0.006倍转染体积的ExpiCHOTM Enhancer和0.24倍转染体积的ExpiCHOTMFeed，放入120rpm摇床32℃培养。离心收集转染10天的细胞培养上清。通过ELISA的方法测定表达量，收集人源化cyclinD1单抗。
实施例3：
利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测实施例2获得的人源化 cyclinD1单抗(ORI、Fhxx-01、Xxjk-01组统称人源化cyclinD1单抗)与 cyclinD1抗原结合的动力学常数，具体地，分别将人源化cyclinD1单抗溶于的醋酸钠缓冲溶液中并偶联到CM芯片上，之后用1M乙醇胺封闭。结合阶段将不同浓度的对应的人源化cyclinD1单抗以25μL/min的速度注入 5min，解离阶段用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入10min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore3000软件进行分析计算，分别计算人源化cyclinD1单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。
表2.人源化cyclinD1单抗与cyclinD1抗原结合的动力学常数
Figure BDA0002888880090000071
表2结果表明鼠源抗人cyclinD1嵌合单抗均可以与cyclinD1蛋白(抗原)有效结合。ORI、Fhxx-01、Xxjk-01结合和解离速度相当。
实施例4：
为了确定上述单抗的热稳定性，将人源化cyclinD1单抗(ORI、Fhxx-01、 Xxjk-01统称人源化cyclinD1单抗)置于40℃高温条件下，在第2周和第4 周分别取样进行SE-HPLC检测以观察热稳定性，测试采用色谱法，流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液,0.1mol/L硫酸钠缓冲液,pH 6.7；流速为 0.6mL/min；色谱柱温度为27℃；样品池温度:4℃；检测波长280nm；用缓冲液稀释样品至2mg/mL上样，上样体积为20μL，用面积归一化法计算主峰比例处理数据，结果如表3所示.
表3.人源化cyclinD1单抗热稳定性测试结果
Figure BDA0002888880090000081
热稳定性测试表明三种抗体组合均显示出了良好的热稳定性。
实施例5：
蛋白聚糖和胶原蛋白为软骨特异性基质产物，通过测定不同培养基培养后的细胞中的蛋白聚糖及胶原蛋白含量，鉴定不同培养基对干细胞成软骨细胞的分化促进能力。
A1诱导培养基(下简称A1组)含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5mg/L 烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、人源化cyclinD1单抗(Fhxx-01)25mg/L、 DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
A2诱导培养基(下简称A2组)含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5mg/L 烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、人源化cyclinD1单抗(Fhxx-01)50mg/L、 DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
B1诱导培养基(下简称B1组)含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5mg/L 烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、人源化cyclinD1单抗(Xxjk-01)25mg/L、 DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
B2诱导培养基(下简称B2组)含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5mg/L 烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、人源化cyclinD1单抗(Xxjk-01)50mg/L、 DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
C培养基(下简称C组)含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5mg/L烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
1)测定诱导细胞中的胶原蛋白含量
诱导18d后，取各组细胞上清250μL，加入羟脯氨酸消化液50μL，加入羟脯氨酸反应液2mL，60℃水浴15min，冷却后3500r/min离心10min，取150μL上清，560nm波长处测定吸光度值。以一系列浓度梯度的羟脯氨酸标准液制作标准曲线，将吸光度值代入标准曲线求得胶原蛋白含量，具体如表4所示。
2)测定诱导细胞中的蛋白聚糖含量
诱导18d后，取各组细胞上清200μL，加入40μL木瓜蛋白酶消化24h；加入100μL8mol/L盐酸胍和750μL 0.25％阿利新蓝溶液，4℃反应1h； 12000r/min离心15min，弃上清，加入150μL异丙醇溶解沉淀，600nm波长处测定吸光度值。以一系列浓度梯度的硫酸软骨素标准液制作标准曲线，将吸光度值代入标准曲线求得蛋白聚糖含量，具体如表4所示。
表4成软骨蛋白含量检测
编码 胶原蛋白含量(μg/mL) 蛋白聚糖含量(μg/mL)
A1 511.02 53.51
A2 549.73 64.88
B1 377.61 48.21
B2 457.38 55.32
C 116.41 11.45
蛋白聚糖和胶原蛋白为成软骨过程中的特异性基质产物，A1,A2,B1,B2 相较于对照组C出现了明显的诱导成软骨分化趋势，人源化cyclinD1单抗 (Fhxx-01)的组合相较于含人源化cyclinD1单抗(Xxjk-01)的组合蛋白聚糖和胶原蛋白含量更高，说明人源化cyclinD1单抗(Fhxx-01)的组合更能够促进干细胞成软骨分化。含人源化cyclinD1单抗的组合的蛋白聚糖和胶原蛋白含量显著高于对照组C，说明人源化cyclinD1单抗可以进一步促进干细胞成软骨分化，可以用于制备促进脐带间充质干细胞成软骨分化的培养基。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 杭州优渡生物科技有限公司
<120> 一种调整干细胞成软骨分化的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR-L1
<400> 1
Arg Pro Gln Phe Asn Gln Leu Met Pro Val
1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR-L2
<400> 2
Trp Glu Ser Trp Arg Gln
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR-L3
<400> 3
Gln Val Val Glu Leu Asp Trp Val Cys
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR-H1
<400> 4
Ala Ala His Pro Trp Ser Asp Gly Lys Trp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR-H2
<400> 5
Pro Cys His Tyr Met Leu Gln
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR-H3
<400> 6
Ala Asn Cys Met Thr Asn Asp Glu Ile Cys
1 5 10
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> VH ORI
<400> 7
Gly Tyr Gln Arg Ser Ser Asn Asn Phe Tyr Ile Trp Leu Gln Ala Arg
1 5 10 15
Ser Val Met Trp Leu Ser Tyr His Trp Met Ala Ala His Pro Trp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Trp Tyr Met Glu Glu Glu Tyr Trp Glu Asp Cys Ala Asn
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Arg Cys Thr Asn Leu Trp Glu Tyr Ala Pro Cys His
50 55 60
Tyr Met Leu Gln Ala Leu Phe Cys Phe Leu Arg Phe Arg Gln Phe Gly
65 70 75 80
Asn Met Val Thr Phe Val Pro Asn Leu Trp Pro Ile Asn Ala Asn Cys
85 90 95
Met Thr Asn Asp Glu Ile Cys Met Lys Leu Lys Cys Trp Arg Val Thr
100 105 110
Tyr Ala Trp Ser Ile Thr
115
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> VL ORI
<400> 8
Gln Ser Val Ser Thr Gln Gly Ala His Glu Gln Gly Phe Val Thr Val
1 5 10 15
Val Pro Val Leu Asn His Asp Glu Cys Tyr Leu Thr Ser Phe Lys Arg
20 25 30
Pro Gln Phe Asn Gln Leu Met Pro Val Ala Glu Thr Gly Ser Asp Leu
35 40 45
Asp Asp Met Met Tyr Gly Asn Gly Gln Pro Leu Trp Glu Ser Trp Arg
50 55 60
Gln Trp Pro Ile Pro Ile Phe Asn Tyr Gly Val Cys Trp Asp Ile His
65 70 75 80
Pro Gly Trp Lys Arg Asp Gln Val Val Glu Leu Asp Trp Val Cys Trp
85 90 95
Asp Glu Val Asn Asp Tyr Pro Met Cys Gly Val Ala Asn
100 105
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Fhxx-01 VH
<400> 9
Gly Tyr Gln Arg Ser Ser Asn Asn Phe Tyr Ile Trp Leu Glu Ala Arg
1 5 10 15
Ser Val Met Trp Leu Ser Tyr His Trp Met Ala Ala His Pro Trp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Trp Tyr Met Glu Glu Glu Tyr Trp Glu Asp Cys Ala Asn
35 40 45
Gly Lys Ile Ser Arg Cys Thr Asn Leu Trp Glu Tyr Ala Pro Cys His
50 55 60
Tyr Met Leu Gln Ala Leu Phe Cys Phe Leu Arg Phe Arg Gln Phe Gly
65 70 75 80
Asn Met Val Thr Phe Val Pro Asn Leu Trp Pro Ile Asn Ala Asn Cys
85 90 95
Met Thr Asn Asp Glu Ile Cys Met Lys Leu Lys Cys Trp Arg Val Thr
100 105 110
Tyr Ala Gly Ser Ile Thr
115
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Xxjk-01VH
<400> 10
Gly Tyr Gln Arg Ser Ser Asn Asn Phe Tyr Ile Trp Leu Gln Ala Arg
1 5 10 15
Ser Ser Met Trp Leu Ser Tyr His Trp Met Ala Ala His Pro Trp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Trp Tyr Met Glu Glu Glu Tyr Trp Glu Asp Cys Ala Asn
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Arg Cys Thr Asn Leu Trp Glu Tyr Ala Pro Cys His
50 55 60
Tyr Met Leu Gln Ala Leu Phe Cys Phe Leu Arg Phe Arg Gln Phe Gly
65 70 75 80
Asn Met Val Thr Phe Val Pro Asn Leu Ala Pro Ile Asn Ala Asn Cys
85 90 95
Met Thr Asn Asp Glu Ile Cys Met Lys Leu Lys Cys Trp Arg Val Thr
100 105 110
Tyr Ala Trp Ser Ile Thr
115
<210> 11
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Fhxx-01 VL
<400> 11
Gln Ser Val Ser Thr Gln Gly Ala His Gly Gln Gly Phe Val Thr Val
1 5 10 15
Val Pro Val Leu Asn His Asp Glu Cys Tyr Leu Thr Ser Phe Lys Arg
20 25 30
Pro Gln Phe Asn Gln Leu Met Pro Val Ala Glu Thr Gly Ser Asp Leu
35 40 45
Asp Asp Met Met Tyr Gly Asn Gly Gln Pro Leu Trp Glu Ser Trp Arg
50 55 60
Gln Trp Pro Ile Pro Ile Phe Asn Tyr Gly Val Cys Trp Asp Ile Arg
65 70 75 80
Pro Gly Trp Lys Arg Asp Gln Val Val Glu Leu Asp Trp Val Cys Trp
85 90 95
Asp Glu Val Asn Asp Tyr Pro Met Cys Gly Val Ala Asn
100 105
<210> 12
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Xxjk-01VL
<400> 12
Gln Ser Val Ser Thr Gln Gly Ala His Glu Gln Gly Phe Val Thr Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Leu Asn His Asp Glu Cys Tyr Leu Thr Ser Phe Lys Arg
20 25 30
Pro Gln Phe Asn Gln Leu Met Pro Val Ala Glu Thr Gly Ser Asp Leu
35 40 45
Asp Asp Met Met Tyr Gly Trp Gly Gln Pro Leu Trp Glu Ser Trp Arg
50 55 60
Gln Trp Pro Ile Pro Ile Ala Asn Tyr Gly Val Cys Trp Asp Ile His
65 70 75 80
Pro Gly Trp Lys Arg Asp Gln Val Val Glu Leu Asp Trp Val Cys Trp
85 90 95
Asp Glu Val Asn Asp Tyr His Met Cys Gly Val Ala Asn
100 105
<210> 13
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> 人抗体IgG1重链恒定区
<400> 13
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> 人抗体轻链的恒定区
<400> 14
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
20 25 30
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
35 40 45
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
50 55 60
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 110

Claims (7)

1.一种调整干细胞成软骨分化的方法，其特征在于，包括将干细胞置于诱导培养基里培养，所述诱导培养基含诱导因子，所述诱导因子为人源化cyclinD1抗体,所述人源化cyclinD1单抗能与cyclinD1蛋白特异性结合，所述人源化cyclinD1单抗包含氨基酸序列如SEQ ID NO:01所示的CDR-L1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:02所示的CDR-L2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:03所示的CDR-L3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:04所示的CDR-H1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:05所示的CDR-H2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:06所示的CDR-H3。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导培养基成分包括：转铁蛋白、烟酸肌醇酯、地塞米松、人源化cyclinD1单抗、DMEM培养基和胎牛血清。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述诱导培养基成分含终浓度为2.0mg/L转铁蛋白、2.5mg/L烟酸肌醇酯、0.25μmol/L地塞米松、人源化cyclinD1单抗50mg/L、DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗体重链可变区氨基酸序列选自SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗体轻链可变区氨基酸序列选自SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示，所述抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
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