TW202330626A - 雙特異性抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了雙特異性抗體及其應用。所提供的雙特異性抗體能夠特異性單一地或者同時結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，同時還能夠特異性結合PD-L1。所提供的雙特異性抗體表現出與抗原的高親和力、特異性，具有腫瘤殺傷的效果，能夠應用於治療腫瘤。
Description
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種雙特異性抗體及其應用。
轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)作為TGF-β超家族，在多種免疫細胞，例如調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)、DC細胞、CD3+T細胞、M2巨噬細胞等中表現，並調節細胞的生長和分化。在腫瘤微環境中，免疫細胞的活性通常會受到環境中TGF-β的影響，表現出免疫抑制。正是由於TGF-β所發揮的效力和多樣性，家族成員中諸如TGF-β1、β2和β3等亞型以潛伏的、無活性的形式產生，而且需要嚴格調控的細胞外活化步驟才能獲得與其受體相結合的能力(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2016；8(a022103),Cytokine Growth Factor Rev.2013；24：355-372)。TGF-β1是被免疫細胞例如Tregs表現的主要亞型。Treg細胞正是透過產生活性TGF-β來介導免疫抑制效應，從而防止自身免疫等疾病的產生。然而，惡性腫瘤會利用該機制釋放出大量TGF-β，幫助癌細胞快速分裂，同時借助於Treg細胞抑制其他免疫細胞對癌細胞的殺傷功效。
糖蛋白A重複主導序列(glycoprotein A repetitions predominant，GARP)是一種結合潛伏轉化生長因子β(TGF-β)的I型跨
膜細胞表面受體，主要活化在Treg、B細胞表面和血小板中，並在人類乳腺、肺和結腸腫瘤中高表現。GARP能夠與潛伏的TGF-β(latency associated peptide，LAP)形成複合物(Proc Natl Acad Sci USA.2009；106(32)：13445-50)，可以調節膜結合潛伏的TGF-β的能力，並與αVβ8整合素或者αVβ6整合素相結合，從細胞表面釋放TGF-β並使其活化。
鑒於GARP的高表現為腫瘤提供了生長所需TGF-β的活化和儲存，也增強了Treg的抑制性表型和維持Treg介導的外周耐受性，GARP抑制劑逐漸在腫瘤治療中嶄露頭角。靶向GARP的抗體也在快速推進，例如首個進入臨床的GARP抑制劑ARGX-115，其以GARP為靶點，抑制活性TGF-β的釋放以及Treg的免疫抑制活性，從而重新活化癌細胞的免疫反應，抑制疾病進展。第一三共製藥公司開發的DS-1055(針對GARP設計的單株抗體)也在復發/難治性晚期或轉移性頭頸部、胃和食道癌中開展臨床試驗。
雙特異性抗體(Bispecific antibody，BsAb)是能同時特異性結合兩個抗原或者抗原表位的抗體。自1960年Nisonoff及其合作者首次提出BsAb的概念以來，雙特異性抗體隨著基因工程抗體技術的逐漸成熟，得到了快速發展。由於BsAb可以靶向多個抗原或者抗原表位，相較於單株抗體表現出更多的優勢，而且也逐漸展現出比單株抗體聯用療法更高的療效。例如，可以將特異性免疫效應細胞重定向到鄰近的腫瘤細胞，以增強腫瘤殺傷；而且可以透過兩個不同的細胞表面抗原的相互作用增加結合的特異性；同時相較於單一抗體聯用來說，可以降低開發成本、臨床試驗。雙特異性抗體現已成為抗體工程領域的研究熱點，在腫瘤治療及自身免疫
疾病等領域中具有廣泛的應用前景。國內國外多個製藥公司針對不同的靶點展開了雙特異性抗體的研究。
然而，雙特異性抗體涉及兩個或者兩個以上實體的相互作用，使得相較於單株抗體來說更加複雜。針對不同靶點的雙特異性抗體的開發還需要進一步改進。
本發明要求於2021年09月30日遞交的申請號為202111162303.X的中國專利申請的優先權，並將其全部或者部分引用在本文中。
本發明提供了雙特異性抗體及其在疾病治療中的用途。本發明透過靶向GARP、TGF-β和/或GARP-TGFβ複合體來抑制活性TGF-β的釋放以及Treg的免疫抑制功能，從而重新活化癌細胞的免疫反應，抑制疾病進展。而且所提供的雙特異性抗體還能夠特異性結合PD-L1，能夠提高PD-1/PD-L1耐藥的抗腫瘤活性。
本發明的第一方面提供了一種雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；所述第一抗原結合部分包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序
列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；所述第一抗原結合部分還包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區：包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；
所述第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，所述第二抗原結合部分能夠結合PD-L1；所述HCDR序列和所述LCDR序列是基於IMGT定義方案獲得的。
所提供的雙特異性抗體具有第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，第一抗原結合部分能夠特異性靶向GARP、TGF-β或GARP-TGF-β複合物中的一種、兩種或者三種，活化免疫細胞的反應；第二抗原結合部分能夠特異性靶向PD-L1，阻斷PD-1/PD-L1訊號路徑，解除免疫抑制，恢復機體的免疫殺傷能力。所提供的雙特異性抗體經驗證表現出優異的腫瘤治療效果。
本發明的第二方面提供了一種雙特異性抗體，包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；所述第一抗原結合部分包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCDR1包含SEQ ID NO：1或4或7或10或13或16所示的序列，HCDR2包含SEQ ID NO：2或5或8或11或14或17所示的序列，HCDR3包含SEQ ID NO：3或6或9或12或15或18所示的序列，LCDR1包含SEQ ID NO：19或22或25或27或30或33所示的序列，LCDR2包含SEQ ID NO：20或23或28或31或34所示的序列，LCDR3包含SEQ ID NO：21或24或26或29或32或35所示的序列；所述第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，所述第二抗原結合部分能夠結合PD-L1；所述HCDR1、HCDR2、HCDR3序列和所述LCDR1、LCDR2、LCDR3序列是基於IMGT定義方案獲得的。
本發明的第三方面提供了一種雙特異性抗體，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；所述第一抗原結合部分能夠結合GARP、TGF-β和/或GARP-TGF-β複合物；
所述第二抗原結合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
所述CDR1包含選自下組的序列：SEQ ID NO：60、63和66，或者與SEQ ID NO：60、63和66相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；
所述CDR2包含選自下組的序列：SEQ ID NO：61、64和67，或者與SEQ ID NO：61、64和67相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；
所述CDR3包含選自下組的序列：SEQ ID NO：62、65、68和69，或者與SEQ ID NO：62、65、68和69相比，具有一個、兩個或者三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
本發明的第四方面提供了一種雙特異性抗體，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；所述第一抗原結合部分包括重鏈可變區和輕鏈可變區；所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列；所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：25、20和
26所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列；所述第二抗原結合部分包含CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO：60或63或66所示的序列，所述CDR2包含SEQ ID NO：61或64或67所示的序列，所述CDR3包含SEQ ID NO：62或65或68或69所示的序列。
本發明的第五方面提供了一種雙特異性抗體，包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；所述第一抗原結合部分包括：如SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；所述第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，所述第二抗原結合部分能夠結合PD-L1。
本發明的第六方面提供了一種雙特異性抗體，包含與TGFβ、GARP和/或GARP-TGFβ複合物特異性結合的第一抗原結合部分，和與PD-L1特異性結合的第二抗原結合部分；進一步包括重鏈第一恆定結構域CH1和輕鏈恆定結構域CL，所述第一抗原結合部分分別和重鏈第一恆定結構域CH1、輕鏈恆定結構域CL共價連接；進一步包括Fc區，所述Fc區透過鉸鏈區和重鏈第一恆定結構域CH1連接，所述第二抗原結合部分透過連接子與Fc區和/或與輕鏈恆定結構域CL共價連接。
本發明的第七方面提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包
括重鏈可變區，所述重鏈可變區：包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
本發明的第八方面提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中(1)具有包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列；或者(2)具有包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列；或者(3)具有包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列；或者(4)具有包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR
序列；或者(5)具有包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列；或者(6)具有包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列。
本發明的第九方面提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1或4或7或10或13或16所示的序列，HCDR2包含SEQ ID NO：2或5或8或11或14或17所示的序列，HCDR3包含SEQ ID NO：3或6或9或12或15或18所示的序列，LCDR1包含SEQ ID NO：19或22或25或27或30或33所示的序列，LCDR2包含SEQ ID NO：20或23或28或31或34所示的序列，LCDR3包含SEQ ID NO：21或24或26或29或32或35所示的序列。
本發明的第十方面提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包括：如SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示的輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本發明的第十一方面提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼上述第一方面至第六方面任一所述的雙特異性抗體，或者編碼第七方面至第十方面任一所述的單株抗體或抗原結合片段。
本發明的第十二方面提供了一種構建體，包含上述第十一方
面所述的多核苷酸。
本發明的第十三方面提供了一種宿主細胞，含有上述第十一方面所述的多核苷酸或者第十二方面所述的構建體。
本發明的第十四方面提供了一種藥物組合物，包括：上述第一方面至第六方面任一所述的雙特異性抗體、或第七方面至第十方面任一所述的單株抗體或抗原結合片段；以及藥學上可接受的載體。
本發明的第十五方面提供了一種抗體偶聯物，包括上述第一方面至第六方面任一所述的雙特異性抗體、或第七方面至第十方面任一所述的單株抗體或抗原結合片段；以及與雙特異性抗體或單株抗體或抗原結合片段連接的功能小分子。
本發明的第十六方面提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括上述第一方面至第六方面任一實施例所述的雙特異性抗體，或第七方面至第十方面任一所述的單株抗體或抗原結合片段。
本發明的第十七方面提供了一種生產上述雙特異性抗體或者生產上述單株抗體或抗原結合片段的方法，包括：培養第十三方面所述的宿主細胞，以及從培養物中收集所述的雙特異性抗體或者所述的單株抗體或抗原結合片段。
本發明的第十八方面提供了一種預防及/或治療疾病的方法，包括：給予有需要的受試者有效量的上述第一方面至第六方面任一所述的雙特異性抗體，或者上述第七方面至第十方面任一所述的單株抗體或抗原結合片段，或者第十四方面所述的藥物組合物，或者第十五方面所述的抗體偶聯物。
本發明的第十九方面提供了一種上述第一方面至第六方面任一所述的雙特異性抗體，或者上述第七方面至第十方面任一所述的單株抗體或抗原結合片段在製備藥物或者試劑盒或者在製備抗體偶聯物中的用途。
圖1是根據本發明的實施例提供的一種雙特異性抗體的結構示意圖。
圖2是根據本發明的實施例提供的一種雙特異性抗體的結構示意圖。
圖3是根據本發明的實施例提供的一種雙特異性抗體的結構示意圖。
圖4是根據本發明的實施例提供的一種雙特異性抗體的結構示意圖。
圖5是根據本發明的實施例提供的利用FACS檢測抗體與GARP-TGF-β複合物的結合活性結果。
圖6是根據本發明的實施例提供的抗體與TGF-β的結合活性結果。
圖7是根據本發明的實施例提供的抗體對於TGF-β的中和活性結果圖。
圖8是根據本發明的實施例提供的抗體在動物模型中的藥效試驗結果圖。
下面結合具體示例對於本發明的技術方案進行詳細說明。同時，為了方便本領域技術人員理解，對於本發明的一些術語進行解釋和說明，需要說明的是，這些解釋和說明僅用來方便本領域技術人員的理解，而不應看作是本發明保護範圍的限制。
術語「雙特異性抗體」包含與至少兩種不同生物分子的表位特異性結合的抗原結合部分，而且為了區分，分別稱為「第一抗原結合部分」和「第二抗原結合部分」。下文對於「第一抗原結合部分」和「第二抗原結合部分」也會有解釋和說明。除非另外說明，否則所列出的雙特異性抗體中與抗原的結合順序是任意的。當然，雙特異性抗體在與不同生物分子特異性結合時，有可能和該特定生物分子的不止一個抗原表位結合。
本文中，術語「抗體」作最廣泛意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質或者多肽，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於完整抗體形式或者抗體的抗原結合片段。
本文中，「完整抗體」或「完全抗體」等均用來表示相同的含義，指示包含雙硫鍵相互連接的至少兩個重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(縮寫為VH)和重鏈恆定區(縮寫為CH)組成。重鏈恆定區包括重鏈第一恆定結構域(CH1)、重鏈第二恆定結構域(CH2)和重鏈第三恆定結構域(CH3)。每條輕鏈由輕鏈可變區(縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區也就是輕鏈恆定結構域(CL)。VH和VL區可以進一步劃分為互補決定區(也稱為超變區或者高變區，縮寫為CDR)，其間插有保守的框架區(FR)。每個VH和VL包含三個CDR和四個FR，從胺基端(N端)到羧基端(C端)按照如下序列排列：FR1、CDR1、
FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈可變區的CDR從重鏈胺基酸序列的胺基末端開始分別被稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3，輕鏈可變區的CDR從輕鏈胺基酸序列的胺基末端開始分別稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3。
「抗原結合片段」，或者「抗原結合部分」(如第一抗原結合部分、第二抗原結合部分)是指包含全長抗體的一部分，通常包含與抗原結合的可變域或者可變區。術語「可變區」或「可變域」是指涉及抗原與抗體重鏈或輕鏈結合的域。如上文提到的，完整抗體的重鏈和輕鏈的可變區通常具有相似的結果，每個域包括四個保守的框架區和三個高變區。抗原結合片段或者抗原結合部分的實例可以為Fab、Fab’、F(ab’)2、雙特異性Fab’和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體、單域抗體等。完整抗體經木瓜蛋白酶消化產生兩個完全相同的抗原結合片段，稱為Fab片段，其各自含有重鏈和輕鏈可變區以及輕鏈恆定結構域和重鏈第一恆定結構域(CH1)。Fab’片段在重鏈第一恆定結構域CH1的羧基末端增加了少數殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。完整抗體經胃蛋白酶消化獲得F(ab’)2片段。F(ab’)2片段具有透過雙硫鍵連接在一起的兩個抗原結合F(ab)部分，F(ab’)2片段為雙價抗體。單鏈抗體由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區透過一個約10-25個胺基酸組成的柔性短胜肽連接而成的融合蛋白。單域抗體是由單個單體的可變區組成的抗體片段。由於單域抗體通常來源於駱駝科動物抗體或鯊魚科動物抗重鏈的可變區，因此也常稱為奈米抗體。
例如，奈米抗體僅僅含有重鏈CDR區，是具有完整功能的
最小的抗原結合片段。奈米抗體包括三個CDR區(CDR1-CDR3)和四個框架區FR(FR1-FR4)。框架區FR1、框架區FR2、框架區FR3和框架區FR4，分別被互補決定區CDR1、互補決定區CDR2和互補決定區CDR3隔開。
術語「及/或」用於連接兩個或者多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或者可選項中的任意兩項或者多項。
術語「包含」或者「包括」意指包括所提到的要素或者步驟，但是不排除其他要素或者步驟。當然，除非另有說明，包含或者包括也涵蓋了由所提及的要素或者步驟組成的情形。例如，當提及包含某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
本文所提到的「親和力」或者「結合親和力」按照本領域的通常含義來理解，用來反映抗原和抗體或者抗原結合片段上的結合位點之間的強度和/或穩定性。
「特異性結合」或「特異性結合於」、「結合」、「特異性靶向」特定抗原或表位，或對特定抗原或表位「具有特異性」或者「能夠結合」意味著與非特異性相互作用相區分，這種特異性結合可以透過本領域常用的一些方法測得。抗體與抗原結合的能力可以透過酵素連結免疫吸附測定(ELISA)或者本領域技術人員熟悉的其他技術來測量。例如可以透過流式細胞儀測定對攜帶有抗原的細胞進行檢測，透過測定細胞的陽性率指標來檢測待測抗體與標記抗體的競爭結合情況。由於細胞表面的抗原空間結構更接近於體內存在的形式，所以透過該方法更能反映真實情況。結合本發明的具體實施方式，所提供的抗體具有
100nM、
50nM、
20nM、
10nM、
5nM、
1nM、
0.5nM、
0.1nM、
0.05nM的EC50值。除此之外，還可以透過表面電漿子共振技術(SPR)或生物薄膜干涉技術(BLI)測定抗體與抗原的結合活性。
本文中所提供的無論是單株抗體或抗原結合片段，還是雙特異性抗體，或者是多核苷酸，通常是可分離的或者重組的。「可分離的」是指能夠從表現多肽或者蛋白的細胞或者細胞培養物中鑒定並且分離及/或回收。通常，分離的多肽將透過至少一個純化步驟來製備。「分離的抗體」是指基本上不含具有不同抗原。「重組」意味著可以使用基因重組技術在外源宿主細胞中產生抗體。
「人類化」抗體通常是指基於來源於非人物種的抗原結合部分，和基於人的免疫球蛋白分子的部分結構和序列組成的抗體。例如，人類化抗體中，除CDR之外的整個抗體由人類來源的多核苷酸編碼，其保留了抗原的結合活性，同時降低了免疫原性。
本文中所示出的第一抗原結合部分和第二抗原結合部分的CDR序列是根據已有的定義方案分析獲得的，例如第一抗原結合部分的CDR序列，以及第二抗原結合部分的CDR序列是根據IMGT定義方案獲得的。還可以透過Kabat(例如可以參見U.S.Dept.of Health and Human Servies,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))、Chothia(例如可以參見J.Mol.Biol.196：901-917(1987))等定義方案獲得。本領域技術人員可知的是，由於定義方法的差異所帶來的差異CDR，也都包含在本發明的保護範圍之內。
雙特異性抗體
本發明提供了一種雙特異性抗體，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，第一抗原結合部分和第二抗原結合部分分別靶向不同的靶抗原。在本文中，第一抗原結合部分能夠特異性靶向TGFβ、GARP以及GARP-TGF-β複合物中的一個，兩個或者三個；第二抗原結合部分特異性靶向PD-L1。第一抗原結合部分無論是特異性靶向TGFβ，還是靶向GARP，或者是靶向GARP-TGFβ複合物，亦或者是靶向這三者的任意兩個或者三個；均能夠直接或者間接實現對於TGF-β的調節，活化癌細胞的免疫反應，抑制疾病進展。需要說明的是，如文中所示，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量，也不用來表示先後順序。術語「第一抗原結合部分」、「第二抗原結合部分」分別意指能夠與不同靶抗原結合的部分，其可以是完整抗體，也可以是完整抗體的一部分，例如重鏈可變區、Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(ScFv)、或者單域抗體(sdAb)等等。
本發明提供了一種雙特異性抗體，包含與TGFβ、GARP和/或GARP-TGF-β複合物特異性結合的第一抗原結合部分，和與PD-L1特異性結合的第二抗原結合部分；進一步包括重鏈第一恆定結構域CH1和輕鏈恆定結構域CL，所述第一抗原結合部分分別和重鏈第一恆定結構域CH1、輕鏈恆定結構域CL共價連接；進一步包括Fc區，所述Fc區透過鉸鏈區和重鏈第一恆定結構域CH1連接，所述第二抗原結合部分透過連接子與Fc區和/或與輕鏈恆定結構域CL共價連接。所形成的IgG型結構除了提到的重鏈可變區以及輕鏈可變區序列之外，其他序列可以採用哺乳動物來源的天然序列(例如可以是人類的天然序列)。在一種具體實施方式中，重鏈第
一恆定結構域，重鏈第二恆定結構域以及重鏈第三恆定結構域所形成的序列如SEQ ID NO：92所示。
在一種具體實施方式中，輕鏈恆定結構域序列如SEQ ID NO：93所示。
所提供的雙特異性抗體中，Fc區序列不受限制，可以是天然來源的Fc區，例如來自於人的Fc區，也可以是經過改造的Fc區。經過改造的Fc區可以為發生突變的Fc區，例如可以在Fc區的某些位點發生突變，調節抗體的ADCC效應功能。
所提供的雙特異性抗體至少具有下列性質之一：(a)與PD-L1特異性結合；(b)與糖蛋白A重複主導序列(GARP)特異性結合；(c)與GARP-TGF-β複合物特異性結合；(d)與TGF-β特異性結合；(e)對免疫細胞具有活性調節功能包括但不限於對調節性T細胞的免疫抑制功
能具有抑制活性等；(f)具有抗腫瘤活性。
本發明所提供的雙特異性抗體同時顯示出與TGF-β、GARP和/或GARP-TGF-β複合物特異性結合的活性，以及與PD-L1特異性結合的活性。透過TGF-β報告基因實驗和Treg釋放TGF-β中和實驗等檢測方法，確定了雙特異性抗體既能結合GARP-TGF-β1複合物、又能捕獲已釋放到微環境中TGF-β1的差異化分子。而且所提供的雙特異性抗體能夠與PD-L1特異性結合，透過同時阻斷PD-1/PD-L1和TGF-β訊號路徑，解除免疫抑制，避免PD-L1(PD-1)軸和TGF-β軸途徑之間可能存在的互補作用，成倍恢復機體免疫能力，達到增效殺傷的效果。
在至少一些實施方式中，所述第二抗原結合部分透過連接子與Fc區的羧酸端(C端)連接，如圖1和圖2所示。需要說明的是，所給出的示圖中沒有專門繪出雙硫鍵。圖1示出了分別有一個第二抗原結合部分與Fc區的羧基端(C端)連接。第二抗原結合部分可以根據需要設置為Trap結構、奈米抗體、單鏈抗體，或者可以為其他可以和PD-L1結合的融合蛋白。結合具體實施方式，第二抗原結合部分可以為抗PD-L1奈米抗體。
Fc區的C端在連接奈米抗體時，可以連接相同的奈米抗體，也可以分別連接不同的奈米抗體。另外，也可以根據需要僅僅在Fc的任意其中一個C端連接奈米抗體。圖2示出了Fc區的C端分別連接了兩個第二抗原結合部分。結合具體實施方式，Fc的C端分別連接了兩個PD-L1奈米抗體。同樣地，Fc區的C端可以分別連接相同的奈米抗體，也可以連接不同的奈米抗體。另外，Fc區C端分別所連接的奈米抗體的個數可以相同(例如可以為兩個或以上)，也可以不同(例如可以為兩個或以上)。以Fc區的任意其中
一個羧基端為例，其所連接的兩個或兩個以上的奈米抗體可以相同也可以不同。抗PD-L1奈米抗體可以是已公開或者市售的奈米抗體，也可以透過抗體庫篩選獲得。例如申請號為202110903293.4的中國專利申請中記載了透過羊駝免疫的方法獲得抗PD-L1奈米抗體文庫，並進行篩選和鑒定，獲得了親和力以及特異性結合以及腫瘤殺傷效果良好的奈米抗體。在這裡也根據需要將申請號為PCT/CN2022/110423的國際專利申請文本(優先權申請號為202110903293.4)中所記載的內容全部或者部分援引在本文中。結合具體實施方式，Fc的C端也可以分別連接一個單鏈抗體。PD-L1單鏈抗體可以是已公開或者市售的單鏈抗體。Fc的C端所連接的單鏈抗體可以相同，也可以不同；也可以僅在Fc的任意其中一個C端連接單鏈抗體。
在至少一些實施方式中，所述第二抗原結合部分透過連接子與輕鏈恆定結構域的羧基端(C端)連接。在至少一些具體實施方式中，所述第二抗原結合部分分別透過連接子與輕鏈恆定結構域的羧基端連接，如圖3所示。第二抗原結合部分可以根據需要，選擇單鏈抗體、單域抗體，或者其他形式的融合蛋白等等。輕鏈恆定結構域的羧基端所連接的第二抗原結合部分可以相同，也可以不同，或者僅在輕鏈恆定結構域的任意其中一個羧基端連接第二抗原結合部分。在一些具體實施方式中，輕鏈恆定結構域的羧基端(C端)各自連接兩個抗PD-L1奈米抗體。同樣地，根據需要，輕鏈恆定結構域的C端也可以分別連接一個抗PD-L1奈米抗體或者連接兩個以上的抗PD-L1奈米抗體等等。以輕鏈恆定結構域的任意其中一個羧基端為例，其所連接的抗PD-L1奈米抗體的個數可以相同，也可以不同。
在至少一些實施方式中，所述第二抗原結合部分透過第一連
接子與Fc區的C端連接，透過第二連接子與輕鏈恆定結構域的C端連接，如圖4所示。同樣地，與Fc區的C端連接的第二抗原結合部分或者與輕鏈恆定結構域連接的第二抗原結合部分可以相同，也可以不同。第二抗原結合部分可以根據需要，選擇Trap結構、單鏈抗體、單域抗體，或者其他形式的融合蛋白。第一連接子和第二連接子可以相同，也可以不同。
本文中，可用的連接子為本領域常用的連接子，可以為一些寡肽或者多肽。這些寡肽或者多肽可以是任何能夠提供柔性的胺基酸序列。連接子包括但不限於以下組成的組：GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGGSGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGS等等。
所提供的雙特異性抗體透過和TGFβ、GARP或者GARP-TGFβ複合物結合，以及PD-L1結合，活化癌細胞的免疫反應，抑制疾病進展。
本發明提供了一種雙特異性抗體，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；第一抗原結合部分包括：如SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；所述第二抗原結合部分能夠結合PD-L1。所示出
的重鏈可變區和輕鏈可變區序列的CDR序列，因為抗體序列的分析方法的不同，CDR序列也會稍有差異，如上文提到的經典的KabatCDR定義方案、IMGT定義方案，Chothia定義方案等。所分析出的不同的CDR序列，均包含在本發明的保護範圍之內。
本發明還提供了一種雙特異性抗體，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；第二抗原結合部分能夠結合PD-L1；所述第一抗原結合部分包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
在一些實施方式中，所述第一抗原結合部分還可以進一步包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR
序列，或者與SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
各序列如下所示。所提到的雙特異性抗體的第一抗原結合部分或者第二抗原結合部分可以根據需要選擇完整抗體或者僅僅其中的一部分片段，只要能夠靶向不同的靶抗原即可。第一抗原結合部分或者第二抗原結合部分可以僅僅是重鏈可變區、Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(ScFv)、或者單域抗體(sdAb)等。
所提供的雙特異性抗體的第一抗原結合部分能夠結合GARP，TGFβ，或者GARP-TGFβ複合物，或者能夠特異性結合這三者的任意兩種或者三種。同時能夠結合PD-L1，阻斷PD-1/PD-L1路徑，增強免疫細胞對於腫瘤細胞的殺傷作用。
在一些具體實施方式中，所提供的雙特異性抗體具有包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的雙特異性抗體具有包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列。在一些實施方式中，所提供的雙特異性抗體具有包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列。在一些實施方式中，所提供的雙特
異性抗體具有SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的雙特異性抗體具有包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的雙特異性抗體具有包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列。所示出的HCDR序列和LCDR序列作為雙特異性抗體的第一抗原結合部分，與靶抗原特異性結合。
在一些實施方式中，所提供的雙特異性抗體包括下列中的至少一種：與SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的重鏈可變區，和與SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的輕鏈可變區。其中SEQ ID NO：42、43、44、45、46和47分別為人類化的重鏈可變區序列。SEQ ID NO：54、55、56、57、58和59分別為人類化的輕鏈可變區序列。所示出的重鏈可變區和輕鏈可變區序列作為雙特異性抗體的第一抗原結合部分，與靶抗原特異性結合。第一抗原結合部分的輕鏈可變區和重鏈可變區的序列，經過人類化之後，免疫原性更低，而且保留了與靶抗原(如GARP、TGFβ，及/或GARP-TGFβ複合物)的結合活性。可以透過本領域
常用的方法(例如互補決定區移植法)獲得人類化的抗體序列。在一些實施方式中，所提供的人類化的抗體序列保留了CDR區序列，將框架區序列替換為人類的框架區序列。人類的框架區序列可以透過已經發表的人類的序列獲得。例如透過資料庫比對和電腦同源建模，尋找出具有最大同源性的人的FR區模板，綜合考慮確定FR區需要是否需要進行回復突變以及恢復突變的關鍵殘基，獲得高親和力的人類化抗體。這些序列通常記載在常用的資料庫中，例如PDB蛋白質結構資料庫、IMGT、Genebank等資料庫。
本文中所提到的「序列同一性」是指逐個胺基酸或者核苷酸序列比較，序列相同的程度。為了確定序列同一性的比值，可以按照本領域已知的多種方式實現。例如可以使用公開的可以獲得的軟體如BLAST、ALIGN、BLAST-2等軟體獲得。在一些具體實施方式中，序列同一性是由於保守胺基酸取代帶來的。「保守胺基酸取代」是指用具有相似生理化學特性的側鏈的不同胺基酸殘基置換另一胺基酸殘基。例如可以在具有疏水性側鏈的胺基酸殘基之間(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)發生保守胺基酸取代，在具有中性親水性側鏈的殘基之間(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)發生保守胺基酸取代，在具有酸性側鏈的殘基之間(例如Asp、Glu)發生保守胺基酸取代，在具有鹼性側鏈的胺基酸之間(例如His、Lys和Arg)發生保守胺基酸取代，或者在具有芳香族側鏈的殘基之間(例如Trp、Tyr和Phe)進行保守胺基酸取代。如本領域已知，保守胺基酸取代通常不會引起蛋白質構象結構的顯著變化，因此可以保留蛋白質的生物活性。所提到的保守胺基酸取代可以是1個保守胺基酸取代、2個保守胺基酸取代、
3個保守胺基酸取代、4個保守胺基酸取代、5個保守胺基酸取代、6個保守胺基酸取代、7個保守胺基酸取代、8個保守胺基酸取代、9個保守胺基酸取代或者10個保守胺基酸取代等等。本文中所用到的胺基酸的名稱以本領域通用的標準的單字母或者三字母代碼表示。
所示出的各序列分別如下：
在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID
NO：36所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：48所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，所述第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：38所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：39所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：51所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：40所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：52所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：53所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：42所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：54所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：55所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：56所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：45所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：57所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：59所示的輕鏈可變區。
第二抗原結合部分能夠特異性靶向PD-L1。如上文中所提到的，第二抗原結合部分只要能夠特異性靶向PD-L1即可，其表現形式不受
限制。例如可以是完整抗體，也可以是完整抗體的一部分，包括但不限於重鏈可變區、Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體或者奈米抗體等等。第二抗原結合部分可以根據需要透過抗體庫篩選獲得，也可以是市售的或者已經公開的抗體序列。在一些具體實施方式中，所述第二抗原結合部分為單域抗體。在一些優選實施方式中，所形成的雙特異性抗體的結構為透過連接子連接IgG型抗體與第二抗原結合部分的結構，IgG型抗體包含第一抗原結合部分。第一抗原結合部分與Fc形成IgG型抗體，第二抗原結合部分透過連接子與IgG型抗體連接，形成雙特異性抗體結構。
在一些具體實施方式中，所提供的第二抗原結合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含選自下組的序列：SEQ ID NO：60、63和66，或者與SEQ ID NO：60、63和66相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；CDR2包含選自下組的序列：SEQ ID NO：61、64和67，或者與SEQ ID NO：61、64和67相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；以及CDR3包含選自下組的序列：SEQ ID NO：62、65、68和69，或者與SEQ ID NO：62、65、68和69相比，具有一個、兩個或者三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
在一些具體實施方式中，所述第二抗原結合部分包含具有SEQ ID NO：60所示的CDR1序列、SEQ ID NO：61所示的CDR2序列和SEQ ID NO：62所示的CDR3序列。在一些具體實施方式中，所述第二抗原結合部分包含具有SEQ ID NO：63所示的CDR1序列、SEQ ID NO：64所示的CDR2序列和SEQ ID NO：65所示的CDR3序列。在一些具體實施方式中，所述第二抗原結合部分具有SEQ ID NO：66所示的CDR1序列、
SEQ ID NO：67所示的CDR2序列和SEQ ID NO：68所示的CDR3序列。在一些具體實施方式中，第二抗原結合部分具有SEQ ID NO：60所示的CDR1序列、SEQ ID NO：61所示的CDR2序列和SEQ ID NO：69所示的CDR3序列。所示出的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列可以和框架區FR形成單域抗體。框架區FR序列不做特殊限制，可以是鼠源的，也可以是人類的，或者是部分鼠源、部分人類的。
本發明還提供了一種雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分能夠特異性結合GARP、TGF-β和/或GARP-TGF-β複合物；所述第二抗原結合部分能夠特異性結合PD-L1。在一些具體實施方式中，第二抗原結合部分為抗PD-L1奈米抗體。
在一些實施方式中，第二抗原結合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含選自下組的序列：SEQ ID NO：60、63和66，或者與SEQ ID NO：60、63和66相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；CDR2包含選自下組的序列：SEQ ID NO：61、64和67，或者與SEQ ID NO：61、64和67相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；CDR3包含選自下組的序列：SEQ ID NO：62、65、68和69，或者與SEQ ID NO：62、65、68和69相比，具有一個、兩個或者三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。根據本發明的具體實施方式，所提到的胺基酸取代、缺失或者增加，可以是保守胺基酸取代帶來的，也可以是不同資料庫表徵CDR區時的差異帶來的。本領域技術人員應知的是，利用不同資料庫表徵CDR區時，表徵出來的CDR區序列會有所差異，
這些差異也應包含在本發明的保護範圍之內。
在一些具體實施方式中，所述第二抗原結合部分包含：(1)具有CDR1為SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列；或者(2)具有CDR1為SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列；或者(3)具有CDR1為SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列；或者(4)具有CDR1為SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。
在至少一些實施方式中，所述第二抗原結合部分進一步包括框架區FR，所述框架區包括FR1、FR2、FR3和FR4，所述FR1、FR2、FR3和FR4分別包括如下所示胺基酸序列：(1)FR1包括選自SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：80，或者與SEQ ID NO：70、74、77或者80相比，具有一個、兩個或者三個保守胺基酸取代的序列；(2)FR2包括選自SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：78，或者與SEQ ID NO：71、75或者78相比，具有一個、兩個或者三個保守胺基酸取代的序列；(3)FR3包括選自SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81，或者與SEQ ID NO：72、76、79或者81相比，具有一個、兩個、三個或者四個保守胺基酸取代的序列；(4)FR4選自SEQ ID NO：73，或者與SEQ ID NO：73相比，具有一個或者兩個保
守胺基酸取代的序列。
在一些具體實施方式中，所述框架區包括FR1為SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列、FR2為SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列、FR3為SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列和FR4為SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。在一些具體實施方式中，所述框架區包括FR1為SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列、FR2為SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列、FR3為SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列和FR4為SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。在一些具體實施方式中，所述框架區包括FR1為SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列、FR2為SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、FR3為SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列和FR4為SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。在一些具體實施方式中，所述框架區包括FR1為SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列、FR2為SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列、FR3為SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列和FR4為SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。在一些具體實施方式中，所述框架區包括FRI為SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列、FR2為SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列、FR3為SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列和FR4為SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，所述第二抗原結合部分選自具有如SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些實施方式中，所述第二抗原結合部分與SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的胺基酸序列相比，序列同一性在85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%
以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或者99%以上。所提供的SEQ ID NO：88、89、90、91或92所示的胺基酸序列為人類化後的抗體序列。所提供的人類化的序列具有低的免疫原性，而且具有和靶蛋白高的親和力。
本發明還提供了一種雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括：第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分能夠結合TGFβ、GARP和/或GARP-TGF-β複合物，所述第二抗原結合部分能夠結合PD-L1。
在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列；或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列；或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列；或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列；或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列；或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列；所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列；或者包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列；或者包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列；或者包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列；或者包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列；或者包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列。第二抗原結合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：60或63或66所示的序列，所述
CDR2包含SEQ ID NO：61或64或67所示的序列；所述CDR3包含SEQ ID NO：62或65或68或69所示的序列。
在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：36所示的重鏈可變區，和SEQ ID NO：48所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區，和SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：38所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：39所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：51所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：40所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：52所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：53所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：42所示的重
鏈可變區和SEQ ID NO：54所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：55所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：56所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：45所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：57所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。在一些具體實施方式中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：59所示的輕鏈可變區；所述第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的序列。
單株抗體或抗原結合片段
本發明提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包括如SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO：
48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示的輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本發明還提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包括重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。在一些實施方式中，所提供到的與HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列可以是由於不同資料庫在計算CDR序列時的差異帶來的。
在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段還包括輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列具有一個或者
兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
本發明還提供了一種單株抗體或抗原結合片段，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1或4或7或10或13或16所示的序列，HCDR2包含SEQ ID NO：2或5或8或11或14或17所示的序列，HCDR3包含SEQ ID NO：3或6或9或12或15或18所示的序列，LCDR1包含SEQ ID NO：19或22或25或27或30或33所示的序列，LCDR2包含SEQ ID NO：20或23或28或31或34所示的序列，LCDR3包含SEQ ID NO：21或24或26或29或32或35所示的序列。
在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體具有包含SEQ
ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體具有包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體具有包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體具有包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體具有包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列。在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體具有包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，和具有包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列。
在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體或者抗原結合片段包含與SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41所示的序列具有至少80%、85%、90%序列同一性的重鏈可變區，和與SEQ ID NO：42或43或44或45或46或47所示的序列具有至少80%、85%、90%序列同一性的輕鏈可變區。
在一些具體實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m212抗體，包含：SEQ ID NO：36所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：48所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m305抗體，包含SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：
49所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m107抗體，包含SEQ ID NO：38所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m202抗體，包含SEQ ID NO：39所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：51所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m301抗體，包含SEQ ID NO：40所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：52所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m109抗體，包含SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：53所示的輕鏈可變區。所示出的抗體表現出與GARP/TGFβ複合體的特異性結合，例如與哺乳動物包括人GARP/TGFβ複合體或者與食蟹猴GARP/TGFβ複合體的強的特異性結合活性。所示出的抗體表現出GARP或者TGFβ的特異性結合，例如與人、食蟹猴等的GARP或者TGFβ表現出強的特異性結合。
所提供的單株抗體或抗原結合片段也可以是經過人類化改造的。透過人類化，可以降低抗體或者抗原結合片段的免疫原性，同時保持和靶抗原的結合活性。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m212-hu抗體，其包含SEQ ID NO：42所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：54所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m305-hu抗體，其包含SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：55所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m107-hu抗體，其包含SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：56所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供
的單株抗體或抗原結合片段為m202-hu抗體，其包含SEQ ID NO：45所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：57所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m301-hu抗體，其包含SEQ ID NO：46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所提供的單株抗體或抗原結合片段為m109-hu抗體，其包含SEQ ID NO：47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：59所示的輕鏈可變區。
多核苷酸
本發明還提供了一種多核苷酸，其編碼所述的雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段。所提到的多核苷酸是可分離的，包括但不限於DNA、RNA或者cDNA等等。可以採用本領域的常規方法獲得分離的多核苷酸序列，編碼雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段。
構建體
為了製備本發明所提到的抗體，可以將編碼抗體的多核苷酸序列插入到可複製的表現載體中，並在宿主細胞或者無細胞表現系統中表現。本發明還提供了一種構建體，包含上述所述的多核苷酸。本領域常用的多種方法都可以用來獲得構建體，包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等等，例如可以將多核苷酸插入到表現載體多克隆位點形成構建體。構建體中可以根據需要含有啟動子、終止子、標記基因等多種操縱因子，這些操縱因子可操作地與多核苷酸進行連接。啟動子通常用來提供開始轉錄的訊號，啟動子可以根據需要選擇乳糖啟動子(Lac)、Trp啟動子、Tac啟動子、噬菌體的PL和PR啟動子；終止子在轉錄過程中提供轉錄終止的訊號，構建體上的標記基因常用作篩選。當然還可以根據
需要還有增強子，增強蛋白的表現。表現載體不做特殊限制，可以是市售的一些表現載體，也可以是根據需要人工改造後的表現載體，例如質體、噬菌體、病毒等。病毒可以為植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒等。構建體可以在體外表現抗體或者蛋白，也可以被轉入到細胞中表現抗體或者蛋白。
宿主細胞
本發明還提供了一種宿主細胞，含有上述多核苷酸或者上述構建體。任何適用於多核苷酸或者構建體進行抗體或蛋白表現的細胞都可以作為宿主細胞。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；也可以是真核細胞，例如酵母細胞、哺乳動物細胞等。常用的宿主細胞可以是酵母細胞、CHO、HEK-293細胞、COS細胞、果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞。採用本領域常用的方法可以獲得含有多核苷酸或者構建體的宿主細胞，如顯微注射法、電穿孔法、化學轉染法、病毒介導的轉化法等。
藥物組合物
本發明還提供了一種藥物組合物，包括：上述第一方面任一所述的雙特異性抗體、或上述所述的單株抗體或抗原結合片段，以及藥學上可接受的載體。
所提到的藥學上可接受的載體在採用的劑量或者濃度下是可以被受試者接受的。藥學上可接受的載體包括但不限於緩衝劑或鹽，例如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，氯化鈉、醋酸鈉、枸機酸、枸機酸鈉、檸檬酸鹽、Tris；糖類，如海藻糖、聚山梨醇、蔗糖、甘露醇；表面活性劑如聚山梨酯；防腐劑如氯己雙銨、苯紮氯銨、苄索氯銨；胺基酸如組胺酸、鹽
酸組胺酸、甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸等。可以透過本領域常用的方法獲得無菌的藥物製劑，例如透過無菌濾膜過濾的方法獲得。本領域技術人員可以根據需要將藥物組合物選擇不同的藥學上可接受的載體，製備成不同的劑型，例如凍乾劑型、注射劑等多種劑型。所製備的不同的藥物劑型可以被配製成任何合適的施用途徑施用於受試者，包括但不限於靜脈、真皮、肌肉、腹膜、皮下、經鼻、口服、經直腸、局部、吸入、透皮等等。
抗體偶聯物
本發明還提供了一種抗體偶聯物，所述抗體偶聯物包括所述的雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段，以及與所述雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段連接的功能小分子或蛋白酶。所提到的功能小分子可以為已開發的或者未開發的小分子藥物，小分子藥物透過與雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段進行化學偶聯，增強抗腫瘤藥物的治療效果，並可以減少不良反應。還可以透過連接子將毒素、化療藥物、光敏劑等小分子偶聯到所提到的抗體上。當然還可以透過將抗體與protac分子等偶聯，獲得抗體Protac偶聯物，如透過連接子將抗體和蛋白酶靶向配體(如E3連接酶配體)連接，拉近目標蛋白和細胞內的E3泛素連接酶的距離，利用泛素-蛋白酶體路徑特異性的降解靶蛋白。
試劑盒
本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括上述雙特異性抗體或者上述單株抗體或抗原結合片段。試劑盒還可以根據需要包括容器，緩衝試劑、對照物如陽性對照物和陰性對照物。本領域技術人員可以
根據需要進行相應的選擇。相應地，試劑盒中還可以包括使用說明書，以便於本領域技術人員的操作和使用。
生產抗體的方法
本發明又提供了一種生產上述雙特異性抗體的方法，包括：培養上述宿主細胞，以及從培養物中收集所述的雙特異性抗體。
本發明還提供了一種生產單株抗體或抗原結合片段的方法，包括：培養上述宿主細胞，以及從培養物中收集所述的單株抗體或抗原結合片段。
從培養物中收集的雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段經過純化可以獲得基本上純的產物。「基本上純的」是指雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段的純度達到95%以上，96%以上，97%以上，98%以上，99%以上，甚至是99.5%、99.6%、99.7%、99.8%以上。
預防及/或治療疾病的方法
另外，本發明又提供了一種預防及/或治療疾病的方法，包括：給予有需要的受試者有效量的上述雙特異性抗體，或者單株抗體或抗原結合片段。
所提到的「治療有效量」能夠導致疾病症狀的嚴重性降低，疾病無症狀期的頻率和持續時間增加，或者防止因疾病引起的痛苦降低。「預防有效量」通常會低於治療有效量。經過雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段的治療後，相較於未經過抗體治療的受試者來說，受試者體內細胞的抑制率達到10%以上，15%以上，20%以上，25%以上，30%以上，40%以上，45%以上，50%以上，55%以上，60%以上，65%以上，70%
以上，75%以上，80%以上，85%以上，甚至是90%以上或者95%以上。所提到的受試者可以是動物也可以是人。例如可以是哺乳動物，包括牛、羊、鼠、馬等。
所提供的雙特異性抗體或者單株抗體或其抗原結合片段，可以用於治療的疾病包括但不限於癌症以及自身免疫性疾病。在一些實施方式中，本發明所提供的方法可以用於治療TGF-β相關的疾病，GARP相關的疾病，也可以用於治療PD-1/PD-L1相關的疾病。TGF-β相關的疾病包括但不限於發炎疾病，慢性感染，癌症，纖維化，心血管疾病，腦血管疾病和神經退化性疾病等。在一些實施方式中，所提到癌症包括但不限於肺癌、結腸癌、腎癌、泌尿道上皮癌、前列腺癌、多形性膠質細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌和血液癌症等等。
本發明還提供了雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段在製備藥物或者試劑盒中的用途。所述藥物用於治療癌症。應用所提供的雙特異性抗體或者單株抗體或抗原結合片段，可以製備藥物，用於治療多種疾病。還可以用來製備試劑盒，作為免疫診斷試劑使用。
下面參考實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。需要說明的是，這些實施例僅用於方便本領域技術人員的理解，不應看作是對本發明保護範圍的限制。下面詳細描述本發明的實施例，所描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。來源於第二抗原結合部分的PD-L1結合部分，序列製備以及獲得方式記載於申請號為PCT/CN2022/110423的國際專利申請文本(優先權申請號為202110903293.4的中國專利申請文本)中。根據需要將申請號為
PCT/CN2022/110423的國際專利申請(優先權申請號為202110903293.4)中所記載的內容全部或者部分援引在本申請中。PD-L1奈米抗體透過羊駝免疫的方法獲得抗PD-L1奈米文庫，進行篩選和鑒定，獲得候選奈米抗體。將人類的PD-L1蛋白胞外域序列和人免疫球蛋白Fc區序列構成的融合蛋白和弗氏佐劑混合，乳化，免疫健康羊駝，刺激B細胞表現抗原特異性的奈米抗體。然後採集羊駝血，分離淋巴細胞，採用Trizol法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，並從反轉錄的cDNA中PCR擴增獲得VHH抗體基因片段。VHH基因片段與酵母展示載體共同電轉化感受態酵母菌中，酵母同源重組酶將片段與載體連接形成完整質體，建立庫插入率高和多樣性優越的酵母轉化子文庫，並在營養缺陷培養基中保持傳代穩定。將表現抗體的酵母細胞和富集了靶蛋白抗原的磁珠共孵育，並多次的富集培養後，用流式細胞儀鑒定磁珠富集產物，並進行分選。經過多輪篩選，篩選獲得5個高表現的陽性克隆，分別命名為抗體A~抗體E。抗體A的胺基酸序列如SEQ ID NO：82所示，抗體B的胺基酸序列如SEQ ID NO：83所示，抗體C的胺基酸序列如SEQ ID NO：84所示，抗體D的胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示，抗體E的胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示。經過人類化的抗體為抗體Ahu，胺基酸序列如SEQ ID NO：87所示；抗體Bhu，胺基酸序列如SEQ ID NO：88所示；抗體Chu，胺基酸序列如SEQ ID NO：89所示；抗體D1hu，胺基酸序列如SEQ ID NO：90所示；抗體D2hu，胺基酸序列如SEQ ID NO：91所示。
這些抗體以及人類化後的抗體經FACS和ELISA實驗證實和hPD-L1、食蟹猴PD-L1具有高的結合活性。而且表現出對於PD-1/PD-L1
的阻斷活性以及對於CD80/PD-L1的阻斷活性。
例如，透過FACS檢測抗體和人類的PD-L1的結合活性。實驗過程為：採用流式細胞儀對不同抗體與抗原的親和力進行檢測。將內源性表現PD-L1抗原的MDA-MB-231細胞按1×105個/孔加入到96孔盤中。然後加入不同濃度的樣品，4攝氏溫度條件下孵育30分鐘。然後加入螢光標記的羊抗人IgG二抗(廠商：Abcam)，以檢測結合到細胞表面的抗體。利用幾何值生成抗體-抗原結合劑量反應曲線，並利用Graphpad Prism V6.0軟體繪製四參數的原始數據，確定抗體結合抗原的EC50結果。實驗結果表明，抗體A、抗體B、抗體C、抗體D和抗體E的EC50值分別為0.089nM、0.031nM、0.042nM、0.039nM、0.053nM，和陽性對照(阿替利珠單抗，0.059nM)相似，表現出高的結合活性。採用類似的方法測定人類化的抗體的結合活性，抗體Ahu、抗體Bhu、抗體Chu、抗體D1hu、抗體D2hu的EC50值分別為0.051nM、0.18nM、0.025nM、0.18nM和0.29nM。
再例如透過FACS測定抗體對於PD-1/PD-L1的阻斷活性。實驗過程為：採用基於競爭性流式細胞的方法，檢測抗體對於PD-1與其配體PD-L1的阻斷作用。復蘇過量表現PD-1的293T-PD-1細胞株(廠商：康源博創生物科技(北京)有限公司)，將細胞按1×105個/孔鋪在96孔盤中，將不同濃度的抗體稀釋液(起始工作濃度為200nM，4倍稀釋)和PD-L1-Biotin稀釋液(2μg/ml，50μl/孔)混合，室溫孵育30分鐘。然後將混合液按100μl每孔加入細胞中，混合均勻，4攝氏溫度孵育60分鐘，然後用含FACS緩衝液(含2%FBS的PBS)洗滌，在1200rpm下離心4分鐘，棄掉上清液。按照100μl/孔加入PE標記的鏈霉親和素，避光孵育30
分鐘，孵育結束後用FACS緩衝液洗滌。加入120μl的FACS緩衝液重懸細胞，上機檢測。根據FSC/SSC對活細胞進行射門，並測量其平均螢光值。用幾何值生成抗體-抗原阻斷反應曲線，並利用Graphpad Prism V6.0軟體繪製四參數圖形，確定IC50值。實驗結果表明，抗體A、抗體B、抗體C、抗體D和抗體E的IC50值分別為1.024nM、2.077nM、1.678nM、2.103nM、2.536nM，抗體均能阻斷抗原和其配體的結合。採用類似的方法測定人類化的抗體的阻斷活性，抗體Ahu、抗體Bhu、抗體Chu、抗體D1hu、抗體D2hu的IC50值分別為4.0nM、3.4nM、1.0nM、2.6nM和12nM。
透過FACS測定抗體對於CD-80/PD-L1的阻斷活性。實驗過程為：採用基於競爭性流式細胞的方法，檢測抗體對於PD-L1與CD-80的阻斷作用。復蘇過量表現PD-L1的293T-PD-L1細胞株(廠商：康源博創生物科技(北京)有限公司)，將細胞按1×105每孔鋪在96孔盤中，將不同濃度的抗體稀釋液(起始工作濃度為200nM，4倍稀釋)加入細胞中，4℃孵育60分鐘。孵育結束後用含FACS緩衝液洗滌，在1200rpm條件下離心4分鐘，棄掉上清液。然後按照100μl/孔加入human-CD80-mFc(2μg/ml)，4℃避光孵育30分鐘。孵育結束後用FACS緩衝液洗滌。每孔加入100μl 1：200稀釋的螢光標記的羊抗鼠二抗(廠商：Abcam)，4℃避光孵育30分鐘。孵育結束後用FACS緩衝液洗滌，流式上機檢測。測量其平均螢光值。用幾何值生成抗體-抗原阻斷反應曲線，並利用Graphpad Prism V6.0軟體繪製四參數圖形，確定IC50值。實驗結果表明，抗體A、抗體B、抗體C、抗體D和抗體E的IC50值分別為3.954nM、3.355nM、4.146nM、4.757nM、2.979nM，抗體均能阻斷抗原和其配體的結合。類似的方法測定人類化的抗
體的阻斷活性，抗體Ahu、抗體Bhu、抗體Chu和抗體D1hu的IC50值分別約為1.8nM、1.7nM、3.2nM和1.5nM。
實施例1 製備獲得單株抗體
透過雜交瘤的方式篩選獲得單株抗體。利用人抗原(GARP、TGFβ和GARP-TGF-β複合物)免疫小鼠，使小鼠體內產生特異性抗體。將小鼠骨髓瘤細胞和小鼠的脾臟細胞融合，融合後的細胞鋪板。然後加入HAT選擇性培養基篩選，骨髓瘤細胞無法存活，而脾臟細胞存活時間也很短。最終使得只有融合了淋巴細胞的骨髓瘤細胞存活，即篩選獲得雜交瘤細胞。
然後透過有限稀釋克隆細胞的方法選出能夠產生特定抗體的雜交瘤細胞。將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養盤上，使每孔細胞不超過一個，培養增殖，當克隆長到一定大小後，利用ELISA的方式檢測各孔上清液中的細胞分泌的抗體，可與特定抗原(GARP、TGF-β，及/或GARP-TGF-β複合物)結合的培養孔為陽性孔，並繼續進行稀釋，直至獲得單株細胞。
透過上述方法，篩選獲得了一百多個陽性克隆，並從中進行差異化篩選活性高的克隆。最終挑選出了15個候選克隆測序，並選擇了其中6個克隆。然後利用哺乳動物細胞體系對所獲得的不同抗體進行表現純化，獲得純度至少在90%以上的不同的抗體，分別命名為m212抗體、m305抗體、m107抗體、m202抗體、m301抗體和m109抗體。
實施例2
實施例2對於抗體與GARP、GARP-TGF-β複合物的結合活
性進行了測試。將表現GARP、TGF-β的質體同時轉染至293細胞株中，構建過量表現GARP-TGFβ複合物的293-GARP/TGFβ穩轉細胞株。
將293-GARP/TGFβ細胞按照100μl/孔加入96孔盤中，細胞濃度為1-2×106個/ml。利用FACS緩衝液(即含2%FBS的PBS溶液)清洗，然後按100μl/孔加入不同的待測抗體(分別為m212抗體，m305抗體，m107抗體，m202抗體，m301抗體和m109抗體，抗體初始濃度為200nM，4倍梯度稀釋)，於4℃孵育30min。利用緩衝液清洗，加入螢光標記的羊抗人二抗(廠商：Abcam)，4℃孵育30min。使用緩衝液清洗，加入緩衝液重懸細胞，流式上機檢測螢光信號。使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測樣品的EC50值，如下表1和圖5所示。
表1
從表1結合圖5的結果可以看出，m212抗體、m305抗體、m107抗體、m202抗體、m301抗體以及m109抗體均能夠結合GARP-TGF-β複合體。
將表現GARP的質體轉染至CHO-K1細胞株中，構建過量表現GARP的CHO-K1-GARP細胞株。將CHO-K1-GARP細胞按照100μl/孔加入96孔盤中，細胞濃度為1-2×106個/ml。利用FACS緩衝液(即含2%FBS的PBS溶液)清洗，然後按100μl/孔加入不同的待測抗體(分別以m212抗體，m305抗體，m107抗體為例；抗體初始濃度為200nM，4倍梯度稀釋)，於4℃孵育30min。利用緩衝液清洗，加入螢光標記的羊抗人二抗(廠商：Abcam)，4℃孵育30min。使用緩衝液清洗，加入緩衝液重懸細胞，流式上機檢測螢光信號。使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測樣品的EC50值，如下表2所示。
表2
從表2可以看出，m212抗體、m305抗體、m107抗體均能夠特異性結合GARP蛋白。
實施例3
實施例3對於抗體與TGF-β的結合活性進行了鑒定。使用人類轉化生長因子β1(hTGF-β1，廠商：ACRO)包覆細胞培養盤，100ng/孔，4℃孵育過夜。然後使用PBST清洗，每孔加入200μl BSA，於37℃條
件下阻斷1h。使用PBST清洗，並按照100μL/孔加入不同濃度的待測抗體(分別以m107抗體、m202抗體、m301抗體、m109抗體為例，各抗體的初始濃度為31.25nM，4倍梯度稀釋)，37℃條件下孵育2h。使用PBST清洗，並按照100μL/孔加入羊抗人二抗(1%BSA稀釋，1：10000，廠商：Jackson)，37℃孵育1h。使用PBST清洗，加入100μl TMB顯色液顯色10-15min後，加入50μl 2M硫酸終止反應。採用酶標儀讀取OD450值，並使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測抗體的EC50值，如下表3和圖6所示。
表3
實驗結果表明，m107抗體、m202抗體、m301抗體、m109抗體均能夠與TGF-β發生特異性結合。
實施例4 TGF-β分泌中和實驗
抗CD3抗體可以與TCR複合物結合，活化T淋巴細胞，介導T淋巴細胞分泌TGF-β；抗CD28抗體可以協同抗CD3抗體體外活化及擴增T淋巴細胞。利用抗CD3及CD28抗體可以協同刺激活化免疫細胞。
製備濃度為1μg/ml的抗CD3抗體及抗CD28抗體(廠商：
Biolegend)，按照100μl/孔加入96孔盤中，4℃包覆過夜。然後按照100μl/孔加入Treg細胞(細胞濃度為5×105個/ml)。按100μl/孔加入不同濃度的待測抗體(分別為266nM和66nM)，置於培養箱中培養96h。最後採用TGF-β ELISA檢測試劑盒(廠商：BD)檢測上清中TGF-β的含量。使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0分析得到實驗結果，實驗結果如圖7所示。
從圖7可以看出，以m202抗體、m301抗體、m109抗體和m107抗體為例，這些抗體均可以抑制或中和Treg細胞產生的TGF-β。
實施例5
採用互補決定區移植法(CDR-Grafting method)獲得人類化抗體，透過將抗體和範本的胺基酸序列統一劃分為FR區和CDR區，然後將CDR區移植到模板的FR區上，使得決定抗體特異性的CDR區和人類抗體的框架區相互組合，達到人類化的目的。同時為了避免抗體親和力下降，透過電腦類比等技術計算出關鍵胺基酸殘基位點，利用回復突變的方法保證人類化抗體的親和力。經過設計，m212人類化後的抗體編號為m212-hu，m305人類化後的抗體編號為m305-hu，m107人類化後的抗體編號為m107-hu，m202人類化後的抗體編號為m202-hu，m301人類化的抗體編號為m301-hu，109人類化後的抗體編號為m109-hu。然後分別對這些人類化抗體的活性進行檢測。
分別將293-GARP/TGFβ細胞株及CHO-K1-GARP細胞系，按100μl/孔加入96孔細胞盤中，其中細胞濃度為1-2×106個/ml。利用FACS緩衝液(2% FBS)清洗。然後按照100μl/孔加入不同濃度的待測抗體(初始濃度200nM，4-5倍梯度稀釋)，於4℃孵育30min。使用FACS
緩衝液清洗，加入螢光標記的羊抗人二抗，4℃孵育30min。使用FACS緩衝液清洗，並加入150-200μl FACS緩衝液重懸細胞，流式上機檢測螢光訊號。利用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測樣品的EC50值，如下表4和表5所示。
表4
以上述抗體為例，經過人類化後的抗體，表現出與GARP-TGF-β複合體的強的特異性結合活性。
表5
實驗結果表明，以上述抗體為例，表現出與GARP蛋白的
強的結合活性。
使用hTGF-β1(廠商：ACRO)包覆酶標板，100ng/孔，4℃孵育過夜。然後使用PBST清洗，每孔加入200μl BSA，37℃阻斷1h。使用PBST清洗，按照100μL/孔加入不同濃度的待測抗體(初始濃度為31.25nM，使用1% BSA 4倍梯度稀釋)，於37℃孵育2h。使用PBST清洗，然後按100μl/孔加入羊抗人二抗(1：10000，1%BSA稀釋)，於37℃孵育1h。使用PBST清洗，加入100μl TMB顯色液顯色10-15min，加入50μl 2M硫酸終止反應。用酶標儀讀取OD450值，並使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測抗體的EC50值，如下表6所示。
表6
實驗結果表明：以上述抗體為例，經過人類化的抗體也表現出與TGF-β的特異性結合活性。而且參考實施例4所提到的方法檢測人類化後抗體對於TGF-β的中和活性，其結果表明各抗體均可以與TGF-β發生特異性結合，並中和TGF-β。
實施例6
本實施例主要描述了將抗人GARP或抗GARP-TGF-β複合
體抗體和抗PD-L1抗體進行基因工程改造，構建表現抗GARP及PD-L1或者抗TGF-β，GARP-TGF-β複合體和PD-L1的雙特異性抗體。雙特異性抗體在命名時用b開頭，以和m開頭的單抗區分，雙特異性抗體透過(G4S)4接頭連接在一起。在連接的過程中，抗PD-L1奈米抗體和IgG型結構的重鏈第三恆定結構域連接，如圖1所示，則命名時兩個抗原結合部分中間用H連接(以示區分)，兩個抗原結合部分仍然保留之前的編號。例如，“b212-hu-H-D2hu”表示雙特異性抗體，其透過利用m212-hu的抗體序列和抗PD-L1奈米抗體D2hu的抗體序列連接完成，並且奈米抗體和IgG型結構的重鏈第三恆定結構域連接。若奈米抗體和IgG型結構的重鏈第三恆定結構域連接時，若奈米抗體部分僅用一個編號表示，則表示羧基端僅連接一個奈米抗體相同，且重鏈第三恆定結構域的兩個對稱羧基端連接的一個奈米抗體相同；若所連接的奈米抗體不同，則需要示出所連接的所有奈米抗體編號。例如“b301-H-Bhu-D2hu”表示雙特異性抗體，其透過利用m301-hu的抗體序列和抗PD-L1奈米抗體Bhu以及D2hu的抗體序列連接完成，Bhu和D2hu分別與IgG型結構的重鏈第三恆定結構域的羧基端連接。
參考圖3所示，在連接的過程中，抗PD-L1奈米抗體和IgG型結構的輕鏈恆定結構域分別連接(與圖3不同的是，輕鏈恆定結構域的C端分別連接一個抗PD-L1奈米抗體)，則在命名時兩個抗原結合部分中間用L連接(以示區分)。參考圖2所示，在連接的過程中，IgG型結構的重鏈恆定結構域的羧基端可以分別對稱的連接兩個抗PD-L1奈米抗體，以重鏈恆定結構域的任意其中一個羧基端為例，如果其所連接的兩個奈米抗體不同，則在命名時兩個奈米抗體中間用“-”連接，所連接的兩個奈米抗體分別
用奈米抗體的編號表示，所連接的兩個奈米抗體之間可以透過(G4S)3連接。
然後透過暫態轉染CHO-S細胞生產雙特異性抗體蛋白，收集上清液透過蛋白A親和柱純化所述抗體，純化抗體純度透過HPLC和SDS-PAGE進行測定，雙特異性抗體的純度在90%以上。
實施例7 雙特異性抗體結合活性
培養293-GARP/TGFβ細胞株，CHO-K1-GARP細胞株及MC38-hPD-L1(廠商：康源博創生物科技(北京)有限公司)細胞株，調整細胞濃度至1-2×106個/ml，按100μl/孔加入96孔細胞盤中。然後按100μl/孔加入不同濃度的待測抗體(初始濃度200nM，4-5倍梯度稀釋)，4℃孵育30min。使用FACS緩衝液清洗，加入螢光標記的羊抗人二抗，4℃孵育30min。使用FACS緩衝液清洗，加入150-200μl FACS緩衝液重懸細胞，流式上機檢測螢光信號。使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測抗體的EC50值，如下表7-9所示。
表7 不同抗體對於293-GARP/TGFβ細胞株的結合結果
表8不同抗體對於CHO-K1-GARP細胞株的結合結果
表9不同抗體對於MC38-hPD-L1細胞株的結合結果
實施例8 TGFβ報告基因阻斷活性
培養293F-GAPR/TGFβ/αvβ6細胞，將細胞(細胞密度0.6×106個/mL)按照50μl/孔加入細胞培養盤中；將293-SBE-Luciferase細胞(細胞密度1.8×106個/ml)按50μl/孔繼續加入細胞培養盤中。然後將不同濃度的待測抗體(初始濃度為400nM或133.33nM，3倍梯度稀釋)按100μl/孔加入細胞培養盤中，混勻後置於培養箱中培養18-24h。每孔加入100μl的螢光素酶底物ONE-GloTM Luciferase Assay system，避光孵育5min，然後使用酶標儀讀取發光訊號值。使用資料處理軟體Graphpad Prism6.0計算得到待測樣品IC50值，如下表10所示。
表10
以上述雙抗為例所示出的結果來看，上述雙抗表現出與TGF-β的阻斷活性。
實施例9 PD-L1抗體報告基因阻斷體系
實施例9透過報告基因實驗研究了抗體對於PD-L1/PD-1路徑的阻斷作用。該實驗借助於兩種細胞株完成。Jurkat-PD1-CD3zeta-NFAT-Luc2細胞株(廠商：康源博創生物技術(北京)
有限公司)在Jurkat細胞中穩定表現PD-1 ECD及CD3zeta組成的融合蛋白，同時插入了NF-AT所驅動的螢光素酶報告基因；293T-hPD-L1細胞(廠商：康源博創生物技術(北京)有限公司)，即表現人PD-L1的293T細胞。當兩種細胞共同培養時，PD-1/PD-L1相互作用作為第一訊號，胞內的CD3zeta鏈作為第二訊號向內傳遞活化訊號，NFAT驅動的螢光素酶報告基因得以表現，發出螢光；當加入PD-L1抗體時，阻斷PD-1/PD-L1的結合，抑制活化訊號的傳遞，螢光素酶報告基因不能表現。
將293T-hPD-L1細胞按2×104個/孔鋪於96孔盤中，將Jurkat-PD1-CD3zeta-NFAT-Luc2效應細胞按照2×104個/孔繼續加到96孔盤中；然後加入不同濃度的待測抗體(起始濃度為60μg/ml，4倍梯度稀釋)，於37℃下孵育18-24h。每孔加入100μl的螢光素酶底物ONE-GloTM Luciferase Assay system檢測試劑，避光孵育5分鐘；酶標儀讀取96孔盤中的螢光訊號。以相對螢光值作為y-軸，抗體樣品的濃度作為x-軸，畫出四參數曲線。使用GraphPad Prism 6.0軟體分析該曲線並得出雙抗的IC50值，如下表11所示。以示出的抗體為例，單抗沒有表現出PD-L1阻斷活性，雙抗表現出PD-L1阻斷活性。而且參考實施例5的方法，這些抗體也表現出TGF-β中和活性。
表11
實施例10 體內活性評價
構建MC38-hPD-L1KL#3細胞，該細胞敲除了鼠源PD-L1，同時插入了人PD-L1基因。實驗取MC-38-hPD-L1 KL#3細胞，接種在C57BL/6-hGARP轉殖基因雌性小鼠(廠商：集萃藥康)右側肩胛部位皮下，每隻接種體積0.1ml，細胞密度為1 x 106/隻，當腫瘤體積達到75-100mm3時，對小鼠進行分組，如表12所示。將實驗小鼠將分成5組，每組6隻，腹腔給藥4次，每週兩次。給藥後每隔3-4天測量小鼠體重及腫瘤體積。
表12
動物實驗結果表明，所示出的抗體均表現出抗腫瘤效果，表
現出腫瘤大小和體積得到抑制，例如抑瘤率(TGI)結果在45%~60%之間。而且雙抗的抗腫瘤效果明顯更優於單抗，抑瘤率可以達到75%以上。
在本發明的描述中，「多個」的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
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Claims (30)
- 一種雙特異性抗體，其特徵在於，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，該第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，該第二抗原結合部分能夠結合PD-L1；該第一抗原結合部分選自：(1)具有包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；和具有SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者(2)具有包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；和具有SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者(3)具有包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；和具有SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者(4)具有SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；和具有SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺 基酸取代、缺失或者增加的序列；或者(5)具有包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；和具有SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者(6)具有包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；和具有SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；該HCDR序列和所述LCDR序列是基於IMGT定義方案獲得的。
- 一種雙特異性抗體，其特徵在於，包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；該第一抗原結合部分包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中：HCDR1包含SEQ ID NO：1或4或7或10或13或16所示的序列，HCDR2包含SEQ ID NO：2或5或8或11或14或17所示的序列，HCDR3包含SEQ ID NO：3或6或9或12或15或18所示的序列，LCDR1包含SEQ ID NO：19或22或25或27或30或33所示的序列，LCDR2包含SEQ ID NO：20或23或28或31或34所示的序列，LCDR3包含SEQ ID NO：21或24或26或29或32或35所示的序列；該第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，該第二抗原結合部分能夠結合PD-L1；該HCDR1、HCDR2、HCDR3序列和該LCDR1、LCDR2、HCDR3序列是基於IMGT定義方案獲得的。
- 根據請求項1或2中任一項所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第一抗原結合部分包含：與SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區，和與SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、1%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區。
- 根據請求項3所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第一抗原結合部分包含：(1)SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41所示的重鏈可變區，和SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53所示的輕鏈可變區；或者(2)SEQ ID NO：42或43或44或45或46或47所示的重鏈可變區，和SEQ ID NO：54或55或56或57或58或59所示的輕鏈可變區。
- 根據請求項1或2中任一項所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第二抗原結合部分為單域抗體；該雙特異性抗體為透過連接子分別連接IgG型抗體與第二抗原結合部分的結構，其中該IgG型抗體包含第一抗原結合部分。
- 根據請求項1或2中任一項所述的雙特異性抗體，其特徵在於， 該第二抗原結合部分包含：(a)CDR1，該CDR1包含選自下組的序列：SEQ ID NO：60、63和66，或者與SEQ ID NO：60、63和66相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；(b)CDR2，該CDR2包含選自下組的序列：SEQ ID NO：61、64和67，或者與SEQ ID NO：61、64和67相比，具有一個或者兩個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；以及(c)CDR3，該CDR3包含選自下組的序列：SEQ ID NO：62、65、68和69，或者與SEQ ID NO：62、65、68和69相比，具有一個、兩個或者三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列。
- 根據請求項6所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第二抗原結合部分選自：(1)具有SEQ ID NO：60所示的CDR1序列、SEQ ID NO：61所示的CDR2序列和SEQ ID NO：62所示的CDR3序列；或者(2)具有SEQ ID NO：63所示的CDR1序列、SEQ ID NO：64所示的CDR2序列和SEQ ID NO：65所示的CDR3序列；或者(3)具有SEQ ID NO：66所示的CDR1序列、SEQ ID NO：67所示的CDR2序列和SEQ ID NO：68所示的CDR3序列；或者(4)具有SEQ ID NO：60所示的CDR1序列、SEQ ID NO：61所示的CDR2序列和SEQ ID NO：69所示的CDR3序列。
- 根據請求項6所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第二抗原結合部分還包含框架區，該框架區包括FR1、FR2、FR3和FR4，該FR1、FR2、FR3和FR4分別包括如下所示胺基酸序列：(1)FR1包括選自SEQ ID NO：70或74或77或80所示的序列，或者與SEQ ID NO：70或74或77或80所示的序列相比，具有一個、兩個或者三個保守胺基酸取代的序列；(2)FR2包括選自SEQ ID NO：71或75或78所示的序列，或者與SEQ ID NO：71或75或78所示的序列相比，具有一個、兩個或者三個保守胺基酸取代的序列；(3)FR3包括選自SEQ ID NO：72或76或79或81所示的序列，或者與SEQ ID NO：72或76或79或81所示的序列相比，具有一個、兩個、三個或者四個保守胺基酸取代的序列；(4)FR4選自SEQ ID NO：73所示的序列，或者與SEQ ID NO：73所示的序列相比，具有一個或者兩個保守胺基酸取代的序列。
- 根據請求項6所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第二抗原部分還包括框架區FR，該框架區FR選自：(1)SEQ ID NO：70所示的FR1序列、SEQ ID NO：71所示的FR2序列、SEQ ID NO：72所示的FR3序列和SEQ ID NO：73所示的FR4序列；或者(2)SEQ ID NO：74所示的FR1序列、SEQ ID NO：75所示的FR2 序列、SEQ ID NO：76所示的FR3序列和SEQ ID NO：73所示的FR4序列；或者(3)SEQ ID NO：77所示的FR1序列、SEQ ID NO：78所示的FR2序列、SEQ ID NO：79所示的FR3序列和SEQ ID NO：73所示的FR4序列；或者(4)SEQ ID NO：80所示的FR1序列、SEQ ID NO：78所示的FR2序列、SEQ ID NO：79所示的FR3序列和SEQ ID NO：73所示的FR4序列；或者(5)SEQ ID NO：70所示的FR1序列、SEQ ID NO：71所示的FR2序列、SEQ ID NO：81所示的FR3序列和SEQ ID NO：73所示的FR4序列。
- 根據請求項6所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第二抗原結合部分選自：(a)具有如SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的胺基酸序列；(b)與(a)相比，序列同一性在85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或者99%以上的胺基酸序列。
- 一種雙特異性抗體，其特徵在於，包括第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，該第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，該第二抗原結合部分能夠結合PD-L1；該第一抗原結合部分包括重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區：包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列；該輕鏈可變區：包含SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者包含SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列；該第二抗原結合部分包含CDR1、CDR2和CDR3；該CDR1包含SEQ ID NO：60或63或66所示的序列，該CDR2包含SEQ ID NO：61或64或67所示的序列，該CDR3包含SEQ ID NO：62或65或68或69所示的序列。
- 根據請求項11所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第一抗原結合部分選自：(1)具有包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列；或者(2)具有包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列；或者(3)具有包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列；或者(4)具有SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列；或者(5)具有包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列；或者(6)具有包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列；該第二抗原結合部分選自：(1)具有CDR1為SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列；或者(2)具有CDR1為SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列；或者(3)具有CDR1為SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列；或者(4)具有CDR1為SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列、CDR2為SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列、CDR3為SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列：該第一抗原結合部分與重鏈第一恆定結構域CH1、輕鏈恆定結構域VL以及Fc區形成IgG型結構，該第二抗原結合部分透過連接子與該IgG型結構連接。
- 根據請求項12所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第一抗原結合部分包括：(1)SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41所示的重鏈可變區，和SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53所示的輕鏈可變區；或者(2)SEQ ID NO：42或43或44或45或46或47所示的重鏈可變區，和SEQ ID NO：54或55或56或57或58或59所示的輕鏈可變區；該第二抗原結合部分包括：具有SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示的胺基酸序列。
- 一種雙特異性抗體，其特徵在於，包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分；該第一抗原結合部分包括：如SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58 或59所示輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；該第一抗原結合部分能夠結合TGF-β、GARP或者GARP-TGF-β複合物，該第二抗原結合部分能夠結合PD-L1。
- 根據請求項14所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該第二抗原結合部分包含：如SEQ ID NO：82或83或84或85或86或87或88或89或90或91所示胺基酸的CDR1、CDR2和CDR3序列。
- 一種雙特異性抗體，其特徵在於，包含：與TGF-β、GARP和/或GARP-TGF-β複合物特異性結合的第一抗原結合部分和與PD-L1特異性結合的第二抗原結合部分；該雙特異性抗體進一步包括重鏈第一恆定結構域CH1和輕鏈恆定結構域CL，該第一抗原結合部分分別和重鏈第一恆定結構域CH1、輕鏈恆定結構域CL共價連接；該雙特異性抗體進一步包括Fc區，該Fc區透過鉸鏈區和重鏈第一恆定結構域CH1連接，該第二抗原結合部分透過連接子與Fc區及/或與輕鏈恆定結構域CL進行連接。
- 根據請求項16所述的雙特異性抗體，其特徵在於，選自下列中的至少一種：(i)該第二抗原結合部分透過連接子與所述Fc區的羧基端(C端)連 接；(ii)該第二抗原結合部分透過連接子與輕鏈恆定結構域的羧基端(C端)連接；(iii)該第二抗原結合部分的至少部分透過第一連接子與Fc區的羧基端(C端)連接，至少部分透過第二連接子與輕鏈恆定結構域的羧基端(C端)連接。
- 根據請求項16所述的雙特異性抗體，其特徵在於，至少具有下列性質之一：(a)與PD-L1特異性結合；(b)與糖蛋白A重複主導序列(GARP)特異性結合；(c)與GARP-TGF-β複合物特異性結合；(d)與TGF-β特異性結合；(e)對調節性T細胞的免疫抑制功能具有抑制活性；(f)具有抗腫瘤活性。
- 一種單株抗體或抗原結合片段，其特徵在於，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列，和SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：4、5和6所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO： 4、5和6所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列，和SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：7、8和9所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列，和SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：25、20和26所示的LCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列，和SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：27、28和29所示的LCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：13、14和15所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列，和SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；或者包含SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列，或者與SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列，和SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列，或者與SEQ ID NO：33、34和35所示的LCDR序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失或者增加的序列；該HCDR序列和LCDR序列是基於IMGT定義方案獲得的。
- 一種單株抗體或抗原結合片段，其特徵在於，包括：如SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示的輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
- 根據請求項19或20所述的單株抗體或抗原結合片段，其特徵在於，包含：與SEQ ID NO：36或37或38或39或40或41或42或43或44或45或46或47所示的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區，和與SEQ ID NO：48或49或50或51或52或53或54或55或56或57或58或59所示的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區。
- 根據請求項19或20所述的單株抗體或抗原結合片段，其特徵在於，選自：SEQ ID NO：36所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：48所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：38所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：39所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：51所示的輕鏈可變 區；或者SEQ ID NO：40所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：52所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：53所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：42所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：54所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：55所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：56所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：45所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：57所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區；或者SEQ ID NO：47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：59所示的輕鏈可變區。
- 一種多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體或者編碼請求項19至22中任一項所述的單株抗體或抗原結合片段。
- 一種構建體，其特徵在於，包含請求項23所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其特徵在於，含有請求項23所述的多核苷酸或者請求項24所述的構建體。
- 一種藥物組合物，其特徵在於，包括：請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體、或請求項19至22中任一項所述的單株抗體或抗原結合片段；以及藥學上可接受的載體。
- 一種抗體偶聯物，其特徵在於，包括：請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體、或請求項19至22中任一項所述的單株抗體或抗原結合片段；以及與該雙特異性抗體或者該單株抗體或抗原結合片段連接的功能小分子。
- 一種試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包括請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體或請求項19至22中任一項所述的單株抗體或抗原結合片段。
- 一種生產請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體或者生產請求項19至22中任一項所述的單株抗體或抗原結合片段的方法，其特徵在於，包括：培養請求項25所述的宿主細胞，以及從培養物中收集所述的雙特異性抗體或者所述的單株抗體或抗原結合片段。
- 請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體，或者請求項19至22中任一項所述的單株抗體或抗原結合片段在製備藥物或者試劑盒或抗體偶聯物中的用途。
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