CN113321733A

CN113321733A - 一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用

Info

Publication number: CN113321733A
Application number: CN202110548532.9A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 周国栋; 张松; 黄青刚; 林芬
Original assignee: Xiamen Tongrenxin Biology Technology Co ltd
Current assignee: Xiamen Tongrenxin Biology Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-05-19
Also published as: CN113321733B

Abstract

本申请涉及生物工程的技术领域，具体公开了一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用。所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体为单克隆抗体1C4；所述单克隆抗体1C4包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；以及该Taq DNA聚合酶单克隆抗体的应用；包含该Taq DNA聚合酶单克隆抗体的反应体系和试剂盒及各自的应用。本申请提供的Taq DNA聚合酶单克隆抗体能够很好的达到热启动的效果，且成本较低，可有效替代进口抗体。

Description

一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用

技术领域

本申请涉及生物工程的技术领域，更具体地说，它涉及一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是在生物体外、对特定DNA片段进行放大扩增的分子生物学技术，其被广泛应用于分子生物学实验中，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便及重复性好等特点，其特异性主要依赖于特定DNA片段两端互补的特定引物。PCR技术的原理类似于双链DNA分子的天然复制过程，即在DNA聚合酶的催化作用下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，复制出与母链DNA互补的子链DNA；经过多次循环反应，获得特定DNA片段。因此，DNA聚合酶是实现DNA复制的关键。

Taq DNA聚合酶是一种普遍使用的耐热DNA聚合酶。但在低温条件下，该聚合酶仍具有一定的聚合酶活性。当特定引物的3’端存在少数几个与非扩增目标区的模板DNA序列配对的碱基时，很容易产生非特异性扩增或者引物二聚体，从而影响特定DNA片段的扩增。

目前，通过提高Taq DNA聚合酶的最适反应温度，以达到热启动的目的，从而减少非特异性扩增或者引物二聚体的产生。常见的提高Taq DNA聚合酶最适反应温度的方法主要有：物理隔绝法、化学修饰法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行突变和改造。其中，物理隔绝法是一种比较有效的降低低温非特异扩增的方法，其包括利用抑制剂或者Taq DNA聚合酶抗体对Taq DNA聚合酶活性区域进行封闭，抑制剂包括核酸复合体、蛋白质、小分子化合物等。

针对上述中的相关技术，一方面，上述抑制剂与Taq DNA聚合酶的结合并不完全契合，且稳定性不高，难以达到低温抑制Taq DNA聚合酶活性，高温分解、不再抑制Taq DNA聚合酶活性的理想效果，因此，利用抑制剂的封闭方法的应用并不广泛。另一方面，虽然利用Taq DNA聚合酶抗体作为封闭剂，可以与Taq DNA聚合酶活性位点结合紧密，在低温条件下抗体结合能力稳定，具有较好的封闭效果；在高温条件下抗体失活，Taq DNA聚合酶活性基团暴露，起到了良好的热启动作用；但是，目前很多国内的PCR试剂盒使用的Taq DNA聚合酶抗体均为进口抗体，进口抗体成本较高，且实现热启动PCR供应链的稳定性不够，容易产生非特异性扩增或者引物二聚体。因此，迫切需要寻求新的方法来解决上述问题。

发明内容

本申请提供一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用。该Taq DNA聚合酶单克隆抗体能够很好的达到热启动的效果，且成本较低，可有效替代进口抗体。

第一方面，本申请提供一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体，采用如下的技术方案：

一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体，所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体为单克隆抗体1C4；

所述单克隆抗体1C4包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；

所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.1第76-99位、SEQ ID NO.1第151-174位和SEQ ID NO.1第289-318位所示；

所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.2第79-96位、SEQ ID NO.2第148-156位和SEQ ID NO.2第265-291位所示。

优选的，所述单克隆抗体1C4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本申请提供上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

第三方面，本申请提供上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体在降低Taq DNA聚合酶的突变体的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

第四方面，本申请提供上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体在制备Taq DNA聚合酶及其突变体的热启动酶中的应用。

第五方面，本申请提供一种宿主细胞，采用如下的技术方案：

一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含编码上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体的核酸或包含所述核酸的载体。

第六方面，本申请提供一种反应体系，采用如下的技术方案：

一种反应体系，所述反应体系包括权利要求1-3任一所述的Taq聚合酶单克隆抗体和Taq DNA聚合酶。

优选的，所述反应体系中，单克隆抗体1C4和Taq DNA聚合酶的摩尔比为(1.0-1.5)：1。

第七方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下的技术方案：

一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的Taq DNA聚合酶单克隆抗体、Taq DNA聚合酶和反应液。

第八方面，本申请提供上述反应体系或试剂盒在DNA扩增中的应用。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

本申请通过小鼠单克隆抗体技术筛选出获得一株Taq DNA聚合酶抗体，为单克隆抗体1C4。在不影响Taq DNA聚合酶活性的情况下，单克隆抗体1C4在低温度条件下能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和二聚体的产生；随着温度的升高，Taq DNA聚合酶的活性位点逐渐暴露，在Taq DNA聚合酶最佳的退火及延伸条件下，单克隆抗体1C4可以与Taq DNA聚合酶完全分离，使Taq DNA聚合酶活性达到最大，为实现热启动PCR扩增提供了良好的支撑。此外，Taq DNA聚合酶逐渐释放的过程可以有效保护Taq DNA聚合酶的活性，在有效降低非特异扩增的基础上，还能够在变性过程中，逐步释放Taq DNA聚合酶，使高温对Taq DNA聚合酶活性的影响更低，保证了Taq DNA聚合酶的热稳定性。

附图说明

图1为单克隆抗体杂交瘤细胞的扩增抑制筛选结果(未封闭的Ex Taq DNA聚合酶(图中以“未封闭的Ex Taq酶”表示)有荧光信号；而封闭后的Ex Taq DNA聚合酶(图中以“抗体封闭后的Ex Taq酶”表示)没有荧光信号)。

图2为单克隆抗体1C4封闭和未封闭的Ex Taq DNA聚合酶在不同模板质粒浓度下的PCR产物的电泳结果(未封闭的Ex Taq DNA聚合酶图中以“未封闭的Taq酶”表示；而封闭后的Ex Taq DNA聚合酶图中以“抗体1C4封闭的Taq酶”表示)。

具体实施方式

为使本申请的目的、方法及优点更加清楚明确，下面结合附图1-2、制备例1-2、实施例1-2以及性能检测试验对本申请做出详细说明。

本申请涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：

弗氏完全佐剂Freund's Adjuvant，Complete(货号为F5881，sigma公司)；

弗氏不完全佐剂Freund's Adjuvant，Incomplete(货号为F5506，sigma公司)；

HAT Media Supplement(50×)(货号为H0262，sigma公司)；

HT Media Supplement(50×)(货号为H0137，sigma公司)；

PEG(货号为P7181，sigma公司)；

Ex Taq DNA聚合酶(货号为RR001Q，TaKaRa公司)；

PBS(货号为B320KJ，上海源培生物)；

胎牛血清FBS(货号为FBS500，上海源培生物)；

DMEM(货号为L110KJ，上海源培生物)；

Penicillin-Streptomycin(货号为S110JV，上海源培生物)；

HRP标记羊抗鼠抗体(货号为PS00901C，杭州隆基生物)；

Trizol试剂(货号15596-018，Invitrogen公司)；

逆转录cDNA试剂盒(货号6110A，Taraka公司)；

DNA回收试剂盒(货号28704，Qiagen公司)；

Protein A Resin(货号为SA023010，常州天地人和生物科技有限公司)。

本发明涉及的引物和探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

制备例

制备例1

本制备例为动物免疫、细胞融合与杂交瘤细胞的初步筛选过程。

1.动物免疫：

本制备中所用的动物为8周龄BALB/C雌鼠。利用Ex Taq DNA聚合酶抗体对8周龄BALB/C雌鼠进行免疫，具体免疫方式为：

(1)第一次免疫：

将Ex Taq DNA聚合酶抗体与弗氏完全佐剂等体积混合，获得免疫原A；

每只雌鼠背部皮下分3到4点注射50μg免疫原A；

(2)第二次免疫：

BALB/C雌鼠第一次免疫两周后进行第二次免疫；

将Ex Taq DNA聚合酶抗体与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得免疫原B；

每只雌鼠背部皮下分3到4点注射50μg免疫原B；

(3)第三次免疫：(与第二次免疫的免疫原相同)

BALB/C雌鼠第二次免疫两周后进行第三次免疫；

每只雌鼠背部皮下分3到4点注射50μg免疫原B；

(4)加强免疫：

BALB/C雌鼠第三次免疫两周后进行加强免疫；

将Ex Taq DNA聚合酶抗体与生理盐水等体积混合，获得免疫原C；

每只雌鼠腹腔注射50μg免疫原B。

2.细胞融合

BALB/C雌鼠加强免疫后第三天开始细胞融合。

(1)脾细胞悬液的制备：

取加强免疫后第三天的BALB/C雌鼠：

A.颈脱位致死BALB/C雌鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬液；

B.摘除眼球采血，并分离血清作为杂交瘤细胞筛选(抗体检测)时的阳性对照。

(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：

提前两周复苏骨髓瘤细胞(保证使用时细胞处于对数生长期)，得到骨髓瘤细胞悬液。

(3)饲养层细胞的制备：

融合前一天获得的BALB/C雌鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养，得到含饲养层细胞的细胞板。

(4)细胞融合(PEG介导)：

按照脾细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液的细胞数量比为3:1的比例，将脾细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液于无血清的DMEM培养基中混匀，获得混合细胞悬液A；

将混合细胞悬液A移入离心管中，1200rpm离心5min，去掉上清，用手指轻弹离心管底部，使两种细胞松散混匀，将离心管置于装有37℃水的烧杯中保温；

在1min内向离心管中加入1ml 50％的PEG(pH 8.0)融合细胞，边加边摇动，加完后静置30s；继续向离心管中加入无血清的DMEM培养基终止融合，1000rpm离心5min；

用HAT培养基将离心管中的沉淀悬浮，分装到96孔含有饲养层细胞的细胞板中，获得含有杂交瘤细胞的细胞板，并于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。

其中，配制500ml HAT培养基需要以下原料：100ml FBS；5ml青霉素-链霉素(Penicillin-streptomycin)；10ml HAT培养基添加剂(HAT Media Supplement)；385mlDMEM。

3.杂交瘤细胞的筛选

含有杂交瘤细胞的细胞板于细胞培养箱中培养至第7天，杂交瘤细胞细胞覆盖孔底10％-50％时，筛选阳性孔，筛选方法为常规间接ELISA法，用Ex Taq DNA聚合酶包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为HRP标记羊抗鼠抗体。细胞融合步骤中分离的血清作为阳性对照，筛选出抗体效价较高的阳性杂交瘤细胞。细胞板上筛选出抗体效价较高的阳性杂交瘤细胞的原始孔为阳性孔。

4.杂交瘤细胞的克隆化

由于从细胞板的阳性孔中得到的阳性杂交瘤细胞，来源于二个或者多个杂交瘤细胞，且该二个或者多个杂交瘤细胞分泌的抗体是不同质的。因此，为了获得完全同质的单克隆抗体，需要对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。

克隆化的前一天制备饲养层细胞并铺板，其制备方法同细胞融合步骤中饲养层细胞的制备方法；

用移液枪将阳性孔内的阳性杂交瘤细胞吹打混匀，用HT培养基将阳性孔内的阳性杂交瘤细胞稀释至每个孔内1个细胞，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；

在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，最终初步筛选获得了6株单克隆抗体杂交瘤细胞株，

其中，配制500ml HT培养基需要以下原料：100ml FBS；5ml青霉素-链霉素(Penicillin Streptomycin)；10ml HT培养基添加剂(HT Media Supplement)；385mlDMEM。

制备例2

本制备为单克隆抗体杂交瘤细胞的扩增抑制筛选过程。

为了检测初步筛选出来的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的抗体是否有封闭TaqDNA聚合酶活性区域的作用，利用分子信标检测实验进行验证。

1.基本原理：分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，由环状区、茎干区以及荧光基团和淬灭基团组成。本制备例中所用的分子信号的序列如下：5′-FAM-CGGCCAAGGATGCTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3′，设计一条与上述分子信标的环状区相匹配的核苷酸引物，该核苷酸引物的序列如下：5′-TGTACAGCTAGCATCC-3′，退火后杂交。

若此时PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶存在活性，核苷酸就会延伸，分子信标被打开，就可以检测到分子信标的荧光。反之，则不能检测到分子信标的荧光。

2.筛选过程

分别利用制备例1筛选获得的6株单克隆抗体杂交瘤细胞株培养获得的上清液，进行单克隆抗体杂交瘤细胞的功能筛选。具体包括以下步骤：

(1)配置PCR反应体系

使用Ex Taq DNA聚合酶中的10×Reaction Buffer作为反应液，在PCR管中按照表1所示体系配制50μl的PCR反应体系。

表1PCR反应体系(一)

体系	体积(μl)
		封闭或者未封闭的Takara Ex Taq(5U/μl)	0.25
10×Ex Taq buffer	5
		dNTP Mixture(各2.5mM)	4
分子信标	终浓度0.2μmol/L
		引物	终浓度0.4μmol/L
无菌水补充至总体积为	50

(2)功能筛选

筛选仪器：Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪。

筛选条件：55℃孵育12min，每2min采集一次荧光信号。

筛选过程：利用制备例1筛选获得的6株单克隆抗体杂交瘤细胞株的上清液分别与Ex Taq DNA聚合酶混合后进行上述试验。

筛选结果：上述筛选出的6株单克隆抗体杂交瘤细胞株中，有1株杂交瘤细胞没有荧光信号，其余5株均出现了荧光信号，检测结果如图1所示。

图1为单克隆抗体杂交瘤细胞的扩增抑制筛选结果。如图1所示，未封闭的Ex TaqDNA聚合酶(图中以“未封闭的Ex Taq酶”表示)有荧光信号；而封闭后的Ex Taq DNA聚合酶(图中以“抗体封闭后的Ex Taq酶”表示)没有荧光信号。

由上述结果可知，筛选出的1株没有荧光信号的单克隆抗体杂交瘤细胞可以封闭Ex Taq DNA聚合酶的活性区域，将该株单克隆抗体杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞1C4；将杂交瘤细胞1C4分泌的抗体命名为单克隆抗体1C4。

实施例

实施例1

本实施例为单克隆抗体1C4的基因测序，以制备例2筛选出的杂交瘤细胞1C4为试验对象。具体包括以下步骤：

(1)提取杂交瘤细胞IC4的总RNA

使用Trizol试剂从培养的杂交瘤细胞IC4中提取总RNA。

过程简述如下：

离心并收集5×10⁶的杂交瘤细胞IC4到1.5ml离心管中，吸干上清；添加1ml的Trizol试剂并反复吹打数次后室温放置5min用于裂解细胞；

紧接着，向每个离心管中加入0.2ml的氯仿溶液，剧烈震荡15s后室温放置3min；将离心管于4℃、12000×g的条件下离心10min，取出离心管，吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇用于从水相中沉淀RNA；

手动混匀离心管并放置室温10min后，于4℃、12000×g的条件下离心10min，弃上清；向离心管中加入1ml 75％的乙醇，再次于4℃、7500rpm的条件下离心5min，弃上清；离心管底RNA沉淀于室温干燥10min后，加入30-50ul的无菌DEPC处理水溶解RNA样品，获得总RNA。

(2)总RNA→cDNA

用逆转录cDNA试剂盒把总RNA变为cDNA。

实验体系配制如下：

5μl的总RNA+0.5μl Oligo(dT)+8.5μl RNase-free水(共14ul)先置于65℃、5min预变性，而后置于冰上2min；

进一步加入4μl的5×缓冲液+1μl dNTP混合物+0.5μl RNase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5ul体系)，配好后混匀，使用PCR仪运行40℃、50min，70℃、10min，完成cDNA合成。

(3)在cDNA的3’端加Poly G

反应体系配制如下：

5μl cDNA样品+33.5μl ddH₂O+5μl 10×TdT缓冲液+5μl CoCl₂+1μldGTP+0.5μl·末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul)，配好后混匀，使用PCR仪运行37℃、30min，70℃、10min，完成Poly G加尾。

(4)抗体可变区的基因扩增

以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。

对于扩增抗体重链可变区序列，配制PCR反应体系：

10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG1反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA 1μl+ddH2O 41μl。

对于扩增抗体轻链可变区序列，配制PCR反应体系：

10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG kappa链反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1ul+cDNA 1μl+ddH2O 41μl。

抗体重链可变区和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2-4，重复25个循环)：

1-预变性95℃.5min；

2-变性95℃.20s；

3-退火56℃.20s；

4-延伸72℃.30s；

5-保存25℃.60min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH约600bp，Vkappa轻链约500bp)，用DNA回收试剂盒进行DNA的抽提。纯化的PCR产物送到上海生工生物工程技术服务有限公司测序获得抗体的可变区序列。

(4)测序结果

A.重链可变区序列信息

1)重链可变区CDR1

核苷酸序列：ggctacaacttcaccagccactgg(SEQ ID NO.5)

蛋白序列：GYNFTSHW(SEQ ID NO.6)

2)重链可变区CDR2

核苷酸序列：atttatcctggtcgtggaagtact(SEQ ID NO.7)

蛋白序列：IYPGRGST(SEQ ID NO.8)

3)重链可变区CDR3

核苷酸序列：gcaagaggggttttttatgctatggactac(SEQ ID NO.9)

蛋白序列：ARGVFYAMDY(SEQ ID NO.10)

4)重链可变区完整核苷酸序列信息(SEQ ID NO.1)：

CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAACTTCACCAGCCACTGGATAAACTGGGTGAAGCTGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTCGTGGAAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAGGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCTTCCAGTTCCGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGGCATCTGAGGACTCTGCTCTCTATTACTGTGCAAGAGGGGTTTTTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCTCA

5)重链可变区完整蛋白序列信息(SEQ ID NO.3)：

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYNFTSHWINWVKLRPGQGLEWIGDIYPGRGSTNYNEKFRNKATLTVDTSSSSAYMQLSSLASEDSALYYCARGVFYAMDYWGQGTSVS

B.轻链可变区序列信息

1)轻链可变区CDR1

核苷酸序列：cagagtgtggataatgat(SEQ ID NO.11)

蛋白序列：QSVDND(SEQ ID NO.12)

2)轻链可变区CDR2

核苷酸序列：tctgcatcc(SEQ ID NO.13)

蛋白序列：SAS(SEQ ID NO.14)

3)轻链可变区CDR3

核苷酸序列：cagcagtattatagctctccgtggacg(SEQ ID NO.15)

蛋白序列：QQYYSSPWT(SEQ ID NO.16)

4)轻链可变区完整核苷酸序列信息(SEQ ID NO.2)：

AGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCGGGAGACAGGGTTACCATGACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGGATAATGATGTGGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGACAGTCTCCTAAATTGCTGATATACTCTGCATCCAATCGCTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATTTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTTCTGTCAGCAGTATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAATCTGAAATCAAAC

5)轻链可变区完整蛋白序列信息(SEQ ID NO.4)：

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTMTCKASQSVDNDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGFGTDFTFTISTVQAEDLALYFCQQYYSSPWTFGGGTNLKSN

实施例2

本实施例为单克隆抗体1C4的纯化，以制备例2筛选出的杂交瘤细胞1C4和8-10周龄的BALB/C小鼠为试验对象。具体包括以下步骤：

(1)杂交瘤细胞1C4腹水的制备，

以8-10周龄的BALB/C小鼠为试验对象，向BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油；注射10天后，将杂交瘤细胞1C4(1x10⁶个细胞/只)注射到BALB/C小鼠腹腔，12天后利用医用注射器收集BALB/C小鼠腹水，获得BALB/C小鼠腹水。

(2)单克隆抗体1C4的纯化

将步骤(1)获得的BALB/C小鼠腹水移入离心管中，12500rpm离心20min，收集上清液；然后用0.22μm滤膜过滤，获得待纯化溶液。

用Protein A柱亲和层析纯化待纯化溶液，具体步骤如下：

装柱：取5ml Protein A Resin介质加入层析柱静置，使用10个柱体积的超纯水冲洗层析柱；

平衡：使用10个柱体积的、预冷的Protein A柱平衡液(50mM Tris-HCl，100mMNaCl，溶剂为水，pH 8.0)平衡层析柱；

上样：将待纯化溶液上样，流速为60-70rpm；

洗涤：用10个柱体积的、预冷的Protein A柱平衡液清洗层析柱；

洗脱：用10个柱体积的洗脱缓冲液(100mM Glycine，150mM NaCl，溶剂为水，pH3.0)洗脱单克隆抗体1C4，洗脱后立即将中和缓冲液(2MTris-HCl，溶剂为水，pH 9.0)加入洗脱缓冲液至溶液为中性pH；

透析：洗脱得到的单克隆抗体1C4在1000倍洗脱体积的PBS pH7.4溶液中透析三次，用紫外可见分光光度计(UV-5500PC，上海元析仪器)测量单克隆抗体1C4的浓度，最终测得单克隆抗体1C4的浓度为2mg/ml.。

性能检测试验

以实施例2纯化获得的单克隆抗体1C4为检测对象，以构建的包含HIV-1POL基因的质粒作为模板，检测单克隆抗体1C4对PCR扩增的影响。

(1)引物序列

上游引物序列为5’-CTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGT-3’。

下游引物序列为5’-GCACTGTACCCCCCAATCC-3’。

(2)配置PCR反应体系

使用Ex Taq DNA聚合酶中的10×Reaction Buffer作为反应液，在PCR管中按照表2所示体系配制50μl的PCR反应体系。

表2PCR反应体系(二)

体系	体积(μl)
		封闭或者未封闭的Takara Ex Taq(5U/μl)	0.4
10×Ex Taq buffer	5
		dNTP Mixture(各2.5mM)	4
模板质粒	1
		上游引物(10μΜ)	1
下游引物(10μΜ)	1
		无菌水补充至总体积为	50

(3)单克隆抗体1C4封闭的Taq DNA聚合酶的制备

单克隆抗体1C4与Ex Taq DNA聚合酶按1.5：1的摩尔比，提前混合作为单克隆抗体1C4封闭的Taq DNA聚合酶。

(4)PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2-4，重复40个循环)：

1-预变性95℃，3min；

2-变性95℃，15s；

3-退火56℃，20s；

4-延伸72℃，30s。

PCR反应结束后，用1％琼脂糖电泳分析PCR产物。

(5)检测结果

PCR产物分析结果如图2所示。

图2为单克隆抗体1C4封闭和未封闭的Ex Taq DNA聚合酶在不同模板质粒浓度下的PCR产物的电泳结果。如图2所示，未封闭的Ex Taq DNA聚合酶图中以“未封闭的Taq酶”表示；而封闭后的Ex Taq DNA聚合酶图中以“抗体1C4封闭的Taq酶”表示。

由图2可知，与未封闭的Ex Taq DNA聚合酶的检测结果相比，单克隆抗体1C4能够有效封闭Ex Taq DNA聚合酶的活性。同时，针对不同浓度的模板质粒，封闭抗体均能有效抑制引物二聚体的产生，并能够有效增加目的产物的产量。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 厦门同仁心生物技术有限公司

<120> 一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用

<130> 案件号

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctgggacttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caacttcacc agccactgga taaactgggt gaagctgagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagat atttatcctg gtcgtggaag tactaactac 180

aatgagaagt tcaggaacaa ggccacactg actgtagaca catcttccag ttccgcctac 240

atgcaactca gcagcctggc atctgaggac tctgctctct attactgtgc aagaggggtt 300

ttttatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtct ca 342

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcgggaga cagggttacc 60

atgacctgca aggccagtca gagtgtggat aatgatgtgg cttggtacca acagaagcca 120

ggacagtctc ctaaattgct gatatactct gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatt tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cactttattt ctgtcagcag tattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaatc tgaaatcaaa c 321

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser His

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Arg Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Ser

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Lys Ser Asn

100 105

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctacaact tcaccagcca ctgg 24

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Tyr Asn Phe Thr Ser His Trp

1 5

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atttatcctg gtcgtggaag tact 24

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Ser Thr

1 5

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaagagggg ttttttatgc tatggactac 30

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Arg Gly Val Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagagtgtgg ataatgat 18

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Ser Val Asp Asn Asp

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tctgcatcc 9

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ser Ala Ser

1

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagcagtatt atagctctcc gtggacg 27

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

Claims

1.一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体，其特征在于：所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体为单克隆抗体1C4；

所述单克隆抗体1C4包括重链可变区和轻链可变区；

2.根据权利要求1所述的一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体1C4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

3.权利要求1-2任一所述的一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

4.权利要求1-2任一所述的一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体在降低Taq DNA聚合酶的突变体的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

5.权利要求1-2任一所述的一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体在制备Taq DNA聚合酶及其突变体的热启动酶中的应用。

6.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含编码权利要求1-2任一所述的TaqDNA聚合酶单克隆抗体的核酸或包含所述核酸的载体。

7.一种反应体系，其特征在于：所述反应体系包括权利要求1-2任一所述的Taq聚合酶单克隆抗体和Taq DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的一种反应体系，其特征在于：所述反应体系中，单克隆抗体1C4和Taq DNA聚合酶的摩尔比为（1.0-1.5）：1。

9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-2任一所述的Taq DNA聚合酶单克隆抗体。

10.权利要求7或8所述的反应体系或权利要求9所述的试剂盒在DNA扩增中的应用。