KR20230026431A - 항-trop2 항체 - Google Patents

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Abstract

1가 및 다가 항-TROP2 항체를 제공한다. 이러한 항체는 TROP2 단백질에 특이적으로 결합하고, 강한 상대적 친화도와 높은 엔도시토시스 효율을 갖는다. 특이적 항체는 ADC 약물 개발에서 광범위한 적용 가능성을 갖는다.
본 발명은 또한 뮤린 모노클로날 항체, 인간-뮤린 키메라 항체, 인간화 항체, 및 종양의 진단 및 치료에서의 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

항-TROP2 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 2021년 6월 18일에 "항-TROP2 항체"라는 제목으로 출원된 국제 출원 번호 제PCT/CN2021/100903호의 국내 단계 출원이고, 2020년 6월 22일에 출원된 중국 특허 출원 제202010573040.0호의 우선권의 이익을 주장하고, 이는 참조에 의해 전체 내용이 본 명세서에 편입된다.
기술 분야
본 개시는, 인간 TROP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 뮤린, 키메라 및 인간화 기원의 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 및 이들 항체를 코딩하는(encoding) 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 본 개시는 또한, 상기 수용체의 과발현과 관련된 악성 종양 또는 임의의 병리학적 변화의 진단 및/또는 치료적 처치에서 진단 시약 또는 약물로서의 이들 항체의 용도를 포함한다.
영양아세포 항원 2 또는 종양 관련 칼슘 신호 변환기 2로도 공지된 Trop2 단백질은 염색체 1p32의 단일-카피 유전자 TACSTD2에 의해 코딩된다. 상응하는 mRNA는 36kDa 신생 폴리펩티드를 합성하며, 이는, N-말단 글리코실화 후, 단일 막관통 도메인을 갖는 단량체 막 단백질을 형성한다[참조: Annie R.A. et al., 2015].
TROP2의 세포내 영역인 26개 아미노산 길이 내에서, 303 위치에 세린 부위가 있고, 이는 종들 사이에서 고도로 보존되어 있고[참조: Basu et al., 1995; Annie RA et al., 2015], PKC 키나제에 의해 인산될 수 있으며, 세포질 칼슘 농도의 증가를 자극하는 하류 신호 전달 분자 PIP2에 대한 결합 부위로 된다[참조: Sewedy et al., 1998; Alberti. et al., 1999]. 시험관내 세포주에서 과발현되면, 세포질 영역을 결여하는 Trop2 단백질은 이의 성장-자극 기능이 박탈되고, 이는 다른 신호 경로에 대한 Trop2 세포질 영역의 자극 효과를 나타낸다[참조: Guerra. et al. 2013]. Trop2의 세포외 영역은 EGF 성장 인자에 결합할 수 있는 구조적 도메인을 포함하며, 이는 잠재적으로 EGF를 차단하여 IGF-1R/Akt 신호전달 경로의 활성을 하향-조절할 수 있다. 따라서, Trop2 발현의 감소는 IGF-1R/Akt 신호전달 경로를 역으로 활성화할 수 있다[참조: Lin. et al., 2011; Annie RA et al., 2015].
Trop2는 종양형성을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. Trop2의 과발현은 NIH3T3 세포의 종양형성성을 현저히 증강시킬 수 있다[참조: Wang. et al., 2008]. Trop2는 또한 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition; EMT)에 영향을 미치고, 암 세포의 이동 및 침입 능력을 증강시킬 수 있다[참조: Trerotola. et al., 2013; Li.et al., 2017]. 이 프로세스는 PI3K/Akt 신호전달 경로에 영향을 미침으로써 달성될 수 있고; Trop2를 과발현하는 담낭암 세포에서는, Akt 인산화의 활성화가 현저히 증가하고, 역으로, Trop2의 발현을 녹-다운하면, 이 신호전달 경로의 활성을 억제할 수 있다[참조: Li. et al., 2017]. 또한, Trop2의 과발현은 MAPK/ERK 신호전달 경로의 활성을 자극할 수도 있고, 이는 췌장암 세포의 증식을 상향-조절하고, 종양-보유 마우스에서 종양 진행을 증가시킨다[참조: Cubas. et al., 2010].
Trop2 단백질의 발현은, 배아 발생 및 성인기의 유방, 신장 및 췌장 등의 일련의 표피-유래 조직에서 발견된다[참조: Annie RA et al., 2015]. 그러나, 이들 상응하는 정상 조직의 종양에서, Trop2 단백질의 발현은 현저히 증가하고, 동물 모델에서 종양 성장의 진행과 양의 상관관계가 있다[참조: Trerotola. et al., 2013]. Trop2 유전자 서열 자체는 돌연변이 또는 증폭되지 않기 때문에, 암에서 Trop2 발현의 상향-조절은 전사 조절의 수준에서의 자극에 의해 유발되는 것으로 생각된다[참조: Trerotola. et al., 2013]. 다양한 유형의 실질 종양을 갖는 환자에서, 이 단백질의 과발현은 통상 종양의 불량한 예후를 예측한다[참조: Zeng. et al., 2016]. 담낭암[참조: Chen. et al., 2014], 위장관암[참조: Muhlmann. et al., 2009], 폐문 담관암종[참조: Ning. et al., 2013] 및 췌장암[참조: Fong. et al., 2008]에서, Trop2 고발현 질환을 갖는 환자의 생존율은 현저히 감소한다. 다양한 암에서 Trop2의 높은 수준의 발현과 환자의 생존율에 미치는 중요한 영향을 고려하여, 이 단백질은 암 요법의 잠재적 표적으로 간주된다.
공지된 항체 약물 중에는, Trop2 표적: IMMU-132에 대한 독소 결합 항체(항체-접합된 약물, ADC)가 있다[참조: Goldenberg. et al., 2015]. 이 ADC의 항체 RS7은 조 폐암 세포막 추출물 및 마우스 골수종 세포로 면역화된 마우스 비장 림프구의 하이브리도마 제조 및 융합 스크리닝에 의해 수득되었다[참조: Stein. et al., 1990]. 조 추출물에서, RS7에 의해 결합된 항원은 나중에 Trop2인 것이 입증되었다[참조: Stein. et al., 1994]. RS7 항체 자체는 다양한 암 세포에 의해 세포내이입될 수 있고, 따라서 RS7 항체는 ADC로서 제조될 가능성이 있다[참조: Stein. et al., 1993]. 뮤린-유래 RS7의 연속적 인간화 후, RS7의 인간화 버전을 사용하여, 항체-접합된 약물을 제조하고, 쇄간 설프하이드릴 커플링에 의해 SN-38 약물, 토포이소머라제 억제제를 로딩했다[참조: Moon, et al., 2008; Sahota. et al., 2017]. 최근 임상 1상 데이터에서, IMMU-132는 다발성 암, 특히 삼중-음성 유방암의 치료에서 임상적으로 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: Starodub. et al., 2015; Sahota and Vahdat., 2017].
본 출원에 개시된 정보는 치료의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원에 기재된 키메라 항체 또는 인간화 항체는 인간 유형 II 영양아세포 항원 단백질(Trop2)에 결합할 수 있고, 항체-결합 약물 요법에서 표적 항체로서 기능할 수 있다.
본 발명은 천연 형태의 항체를 포함하지 않는다. 본 개시에 관련된 항체는 모두 마우스의 면역화, 동정 및 단리 또는 유전자 재조합 방법을 통해 수득된다. 본 개시에 따르면, 보호의 대상은 항체 또는 기능적 단편 또는 유도체이고, 상기 항체는 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 12 중 어느 하나에 상응하는 적어도 하나의 상보성-결정 영역(complementarity-determining region, CDR)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
임의의 항체 단편 또는 유도체가 적어도 하나의 CDR을 함유하고, CDR이 서열번호 1 내지 서열번호 12의 서열과 비교하여 최적화된 후에, 적어도 80%의 동일성, 또는 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성을 갖는 경우, 항체 단편 또는 유도체는 본 출원의 등가물(equivalent)로 이해되어야 하고, 따라서 또한 본 출원의 일부로서 이해되어야 한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체는 중쇄를 포함하고, 중쇄는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, CDR은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로부터의 아미노산 서열을 함유한다.
추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체는 경쇄를 포함하고, 경쇄는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, CDR은 서열번호 7 내지 서열번호 12로부터의 아미노산 서열을 함유한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄를 포함하고, 여기서 CDR-H1은 서열번호 1로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 3으로부터의 아미노산 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 중쇄를 포함하고, 중쇄에서 키메라 항체는 서열번호 13을 포함하고, 인간화 항체는 서열번호 17을 포함한다.
따라서, 추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 CDR-L1은 서열번호 7로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 8로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 9로부터의 아미노산 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 경쇄를 포함하고, 경쇄에서 키메라 항체는 서열번호 14를 포함하고, 인간화 항체는 서열번호 18을 포함한다.
따라서, 추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄를 포함하고, 여기서 CDR-H1은 서열번호 4로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 5로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 6으로부터의 아미노산 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 추가 실시형태에서, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 중쇄를 포함하고, 중쇄에서 키메라 항체는 서열번호 15를 포함하고, 인간화 항체는 서열번호 19를 함유한다.
따라서, 추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 CDR-L1은 서열번호 10으로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 11로부터의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 12로부터의 아미노산 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 추가 실시형태에서, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나는 경쇄를 포함하고, 경쇄에서 키메라 항체는 서열번호 16을 포함하고, 인간화 항체는 서열번호 20을 함유한다.
본 출원의 또 다른 측면에서, 본 출원은 하기 DNA 서열로부터 선택된 핵산: 서열번호 1 내지 서열번호 20의 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 특징으로 하는 단리된 DNA를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 출원은 하기 DNA 서열로부터 선택된 핵산을 제공한다:
일 실시형태는 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29의 핵산 서열을 포함한다.
추가의 실시형태는 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 또는 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 32의 핵산 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 일 실시형태에서, 키메라 항체는 서열번호 33 및 서열번호 34의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 항체는 서열번호 37 및 서열번호 38의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 키메라 항체는 서열번호 35 및 서열번호 36의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 항체는 서열번호 39 및 서열번호 40의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
도 1은 4D3 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR 영역 인식 및 2차원 구조 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 7F11 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR 영역 인식 및 2차원 구조 다이어그램을 나타낸다.
도 3은 ch4D3 및 ch7F11의 ELISA 결합 곡선을 나타낸다.
도 4는 ch4D3 및 ch7F11의 세포 표면 결합 활성을 나타내는 그래프를 내타낸다.
도 5는 BXPC-3 살아있는 세포에 대한 ch4D3 및 ch7F11 항체의 세포내이입 활성을 나타내는 다이어그램을 나타낸다.
도 6은 4D3 뮤린 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 인간화 전후의 인간성(Z-스코어) 변화를 나타낸다.
도 7은 7F11 뮤린 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 인간화 전후의 인간성(Z-스코어) 변화를 나타낸다.
도 8은 동일한 희석 농도에서 4D3 인간화 항체 및 키메라 항체의 결합 곡선을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 9는 4D3 인간화 항체의 7일차(A), 14일차(B) 및 21일차(C)의 SEC 검출 결과의 그래프를 나타낸다.
도 10은 동일한 희석 농도에서 7F11 인간화 항체 및 키메라 항체의 결합 곡선을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 11은 7F11 인간화 항체의 7일차(A), 14일차(B) 및 21일차(C)의 SEC 검출 결과의 그래프를 나타낸다.
도 12는 0.02-50ug/ml ch4D3에 대한 4D3-인간화-비오틴 항체와 hu4D3 항체 사이의 결합 경쟁 결과를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 13은 0.02-50ug/ml ch7F11에 대한 7F11-인간화-비오틴 항체와 hu7F11 항체 간의 결합 경쟁의 결과를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 14는 3개 유형의 세포에서 hu7F11 항체의 결합 데이터를 나타낸다.
도 15는 3개 유형의 세포에서 Hu4D3 항체의 결합 데이터를 나타낸다.
도 16은 3개 유형의 세포에서 hu7F11 항체의 세포내이입 데이터를 나타낸다.
도 17은 3개 유형의 세포에서 Hu4D3 항체의 세포내이입 데이터를 나타낸다.
실시예 1: TROP2 항원으로 6-8주령의 Balb/c 마우스의 면역화
TROP2의 세포외 영역에 대한 발현 벡터(expression vector)를 작제하고, 현탁 세포 293F를 사용하여 밀리그램 수준의 TROP2 단백질을 일시적으로 발현시킨다. 6-8주령 마우스를 선택하고, 하기 표에 제시된 면역화 용량 및 시점에 따라 TROP2 항원으로 피하 면역화를 수행하고, 3회 면역화 후에 최고 혈장 역가를 갖는 마우스를 선택한다. 면역화 프로세스는 표 1에 제시되어 있다.
절차 면역화 진행
(일수)　 		경로 및 용량
1차 면역화 0 100ug/0.25ml/각 마우스, 완전 애주번트, 피하 면역화
2차 면역화 14 100ug/0.25ml/각 마우스, 불완전 애주번트, 피하 면역화
3차 면역화 35 100ug/0.25ml/각 마우스, 불완전 애주번트, 피하 면역화
혈액 수집 42 TROP2 항원-코팅된 플레이트로 ELISA에 의한 꼬리 정맥 혈장 역가의 검출
최종 면역화 56 50ug/0.25ml/각 마우스, 인산염 완충 생리식염수, 복강내 면역화
실시예 2: 면역화된 마우스의 비장 세포의 시험관내 융합
DMEM+FBS 10% 완전 배지에서 마우스 골수종 세포 SP2/0를 사전-배양한다. 융합 전에, 파스퇴르 피펫을 사용하여 5×107 SP2/0 세포를 불어내고, 1000g에서 5분 동안 원심분리하고, 37℃ 예열된 무혈청 DMEM으로 잔류 혈청을 고온 세정하고, 복강내 KM 마우스 피더 세포를 수집하고, 피더 세포를 96 웰 플레이트에 5×103 세포/100ul/웰로 플레이팅한다. 최종 면역화 후 3일차에, 안구로부터 혈액을 채취하고, 최종 면역화된 마우스를 희생시켰다. 75% 알코올에 침지한 후, 비장 조직을 회수하기 위해 마우스를 멸균 수술대에 위치시켰다. 사전-가온된 무혈청 DMEM을 사용하여 비장 세포를 불어내고, 비장 세포의 1/2을 취하여 계수하고, 비장 세포:SP2/0 세포를 1:1 내지 10:1의 비율로 혼합하고, 원심분리 후에 잔류 DMEM을 흡인한다. 예열된 PEG-1450 1ml 용적을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 3분 후에 예열된 DMEM 배지 35ml를 첨가하여 희석을 종료한다. 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 이어서 HAT 스크리닝 배지에 재현탁하고, 10개의 96-웰 플레이트에 플레이팅했다.
실시예 3: 하이브리도마 세포 상청액의 양성 검출
융합 7 내지 10일 후에, 클론을 형성하는 세포의 상태를 관찰한다. 배지는 상청액 시험 1일 전에 DMEM+10% FBS 배지로 교환했다. 동시에, ELISA 플레이트는 TROP2 항원으로 2ug/ml 농도로 코팅했다. 시험 당일, 멸균 작업 테이블에서 다중-채널 전기 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트로부터 배지 상청액을 흡인하고, 상응하는 ELISA 플레이트 웰에 첨가한다. ELISA 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 이어서 웰 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 1:5000으로 희석된 HRP-표지 염소 항-마우스 항체를 첨가한다. 37℃에서 1시간 인큐베이팅한 후, PBST로 3회 세척한다. TMB 기질 발색 용액을 구성하고, 각 홀에 50ul를 첨가하고, 실온에서 5-10분 동안 반응시킨다. 이어서, 발색을 중지시키기 위해 2M 황산 용액 50ul/웰을 첨가한다. 마이크로티터 플레이트의 OD450 판독치에 따라 양성 클론을 스크리닝한다.
실시예 4: 양성 세포주의 서브클론 스크리닝
융합 세포 플레이트의 웰에 더 높은 OD450 값을 표지하고, 2일 이하 동안 배양을 계속한다. 피더 세포를 실시형태 2의 방법에 따라 플레이팅하고, 양성 세포를 200ul 피펫 팁으로 균일하게 불어주었다. 서브클로닝을 위해 5ul 이하의 세포 현탁액을 취하고, 이를 100ul로 희석하고, 사전에 100ul/웰의 피더 세포 현탁액을 함유하는 96-웰 플레이트의 제1 웰에 첨가한다. A1 방향에서 H1 방향까지, 100ul의 용적을 최후 행까지 균일하게 피펫팅하고, 이어서 다중-채널 전동 피펫을 사용하여 A1으로부터 A12 방향으로 최후 행까지 100ul을 균일하게 피펫팅한다. 웰 플레이트를 7-10일 동안 배양하고, 단일 클론에 의해 형성된 웰을 표시하고, 상청액 양성 검출은 실시형태 3의 방법을 참조하여 수행한다.
실시예 5: 복수로부터 모노클로날 항체의 제조
복수 제조의 7일 전에, Balb/c 마우스에게 마우스당 1ml의 파라핀 오일을 복강내 주사했다. 이어서, 1차 서브클로닝 후에 안정한 양성 속도를 갖는 모노클로날 세포를 배양용으로 선별하고 증식시켰다. 6-웰 플레이트의 적어도 1개의 웰 크기로 성장한 때에 세포를 수집하고, 1000g에서 인산염 완충액으로 3분간 원심분리하여 세포를 3회 세정한다. 제조는 마우스당 1~2×106/마우스를 주사하여 수행했다. 마우스에게 7-10일 동안 공급하고, 마우스의 복강을 관찰한다. 복수는 18게이지의 멸균 니들로 채취하고, 복수액은 5분의 회전 속도로 14000g으로 수집했다. 수득된 상청액을 proteinA/G 친화성 컬럼으로 정제하여, 4D3 및 7F11 세포주에 대한 모노클로날 항체를 수득했다.
실시예 6: 4D3 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 코딩 서열의 획득
모노클로날 세포주를 6-웰 플레이트로 배양하고, 컨플루언스 속도가 90-100%에 도달했을 때에 트리졸로 세포를 수집한다. RNase-비함유 환경에서 전체 RNA를 추출하고, 올리고 dT는 cDNA 라이브러리를 합성하기 위한 역전사 프라이머로서 사용했다. 이 cDNA 라이브러리는 말단 트랜스퍼라제 TdT + dGTP의 5' 말단 이후 PCR 주형으로서 사용된다. 상류 프라이머는 올리고 dC이고, 하류 프라이머는, 가변 영역 유전자의 고충실도 효소 프라이머 STAR 실시 5'-RACE 증폭의 보조에 의해, 항체 경쇄 및 중쇄의 5'-말단 CH1 불변 영역의 프라이머 정합에 상응한다. PCR 산물은 DNA 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하고, 약 750bp 길이의 DNA 단편은 하류 TA 클로닝을 위해 회수했다. 콜로니 PCR에 의해 양성으로 동정된 균주를 서열분석했다. 수득된 서열은 서열 정렬 및 가변 영역 서열의 2차원 맵핑을 위해 온라인 IMGT 데이터베이스에 의해 동정되었다.
실시예 7: 7F11 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 코딩 서열의 획득
도 2에 도시된 바와 같이, 7F11 클론의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 수득하기 위해 실시형태 6의 작업 프로세스를 참조한다.
실시예 8: 항체의 발현 및 정제
FreestyleTM 293-F(Invitrogen) 현탁 세포를 사용하여 항체를 발현시켰다. 형질감염 1일 전에, 300mL F17 완전 배지(FreestyleTM F17 발현 배지, Gibco), 37℃, 5% CO2, 베드 중의 120rpm 세포 배양 진탕 인큐베이트를 함유하는 1L 진탕 플라스크에 6×105 세포/mL의 밀도로 세포를 밤새 접종한다. 다음날, 항체 발현 플라스미드에 PEI를 형질감염시켰고, 이때 플라스미드:PEI의 비율은 2:1이었다. 형질감염 1일 후, TN1 피드 배지를 2.5%(v/v) 첨가하고, 4일 동안 배양을 계속하고, 상청액을 원심분리하여 수집했다. 수득된 발현 상청액을 수집하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼(Mabselect Sure LX, GE)에 통과시키고, 0.1M 시트르산(pH 3.0)으로 용출시킨 후, 포획된 항체를 1M Tris-HCl(pH 9.0)로 세척했다. 1/10(v/v) × pH 7.0으로 조절하고, 겔 여과 크로마토그래피 컬럼 SEC(Superdex 200, GE)에 통과시켜 폴리머 및 엔도톡신 등의 불순물을 제거하고, 동시에 항체 완충액을 PBS(pH 7.4)로 교환한다. 이 방법으로 수득된 항체는 표적 항체 단량체(POI%)가 99% 이상이고, 후속 실험에 사용된다.
실시예 9: 항체 친화성을 평가하기 위한 ELISA 방법
가변 영역 유전자를 인간 항체의 불변 영역을 함유하는 발현 플라스미드에 클로닝하고, 실시형태 8의 프로토콜에 따라 진핵세포 293F를 일시적으로 형질감염시키고, 분비된 4D3 및 7F11 키메라 항체를 정제했다. 키메라 항체를 50ug/ml의 농도로 희석하고, 이를 TROP2-코팅된 ELISA 플레이트 상의 웰 A1 내지 H1에 첨가하고, 이어서 A1으로부터 A12까지 3배 수평 희석을 실시하고; 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 이어서 세정하고, 마우스 항-인간 Fc HRP-표지된 항체를 첨가하고, 발색을 위해 37℃에서 인큐베이팅했다.
도 3은 4D3 및 7F11이 양호한 상대 친화성을 갖는 것을 나타낸다. EC50(B4): 0.047ug/ml; EC50(B7): 0.071ug/ml.
실시예 10: 세포 면역형광 방법에 의한 항체 생물학적 활성의 평가
BXPC-3 세포를 플레이팅하고 24 내지 48시간 동안 성장시켜, 96-웰 세포 배양 플레이트에서의 세포 컨플루언스 비율이 40 내지 50%에 도달하도록 했다. 실험 당일, 상청액을 흡인하여 2회 세척했다. 3% BSA 함량의 PBS 용액을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 차단한다. 키메라 항체 및 hRS7 항체를 10ug/ml로 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 1차 항체 용액을 흡인하고, 4회 세척하고, 4% 파라포름알데히드 용액, 100μL/웰을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 방치하고, 2회 세척을 반복하고, 1:800의 비율에 따라, 1% BSA 용액, 100ul/웰로 2차 항체를 희석한다. 2차 항체 현탁액을 흡인하여 폐기하고, 세척을 4회 반복하고, 2μg/ml의 농도로 100μL/웰의 DAPI 염료 용액을 첨가하고, 암소에서 실온에서 5분 동안 인큐베이팅한다. DAPI 염색 용액을 흡인하여 폐기하고, 4회 반복 세척한 후, 1×DPBS 용액, 100μL/웰을 첨가하고, 형광 현미경으로 관찰하고, 사진을 찍어 실험 결과를 기록한다.
도 4: 동일한 항체 농도 및 치료 조건하에서 ch4D3 및 ch7F11의 세포 표면 결합 활성.
실시예 11: 항체 생물학적 활성을 평가하기 위한 세포 세포내이입 방법
실시형태 10의 방법에 따라, BXPC-3 세포를 플레이팅한다. 실험 당일, 세포 배양 용액을 흡인하고, PBS 용액을 첨가하고, 세척을 2회 반복한다. 키메라 항체와 hRS7 항체를, 1% FBS를 함유하는 배지에 10ug/ml로 희석하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 1차 항체 용액을 흡인하고, 시험하는 세포 배양을 위한 완전 배지를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 세포 배양액을 흡인하여 폐기하고, 4회 반복 세척한 후, 4% 파라포름알데히드 용액을 100μL/웰로 첨가하고, 20분 동안 방치한다. 2회 반복 세척 후, 0.5% Triton-X100을 함유하는 3% BSA 차단 용액을 100μL/웰로 첨가하고, 실온에서 1시간 방치했다. 펀칭 용액을 흡인하여 폐기하고, 세척을 2회 반복한다. 항-인간 IgG 형광 2차 항체를 1:800의 비율; 100μL/웰로 희석하고; 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 형광 2차 항체 용액을 흡인하여 폐기하고, 세척을 4회 반복하고, 이어서 DAPI 염색을 수행하고, 암소에서 실온에서 15분간 방치한다. 세척을 4회 반복하고, 1×DPBS 용액, 100μL/웰을 첨가하고, 도 4 및 5에 도시된 바와 같이 형광 현미경으로 형광 염색 결과를 관찰한다.
실시예 12: 4D3 인간화 서열(humanized sequence)의 형질전환
4D3 가변 영역의 핵산 서열 분석 결과를 수득하고, IMGT 웹사이트(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)에서 제공하는 V-QUEST 서열 체크 윈도우에 입력한다. 3개의 CDR 영역 서열 및 4개의 FR 영역 서열, 뿐만 아니라 가장 밀접하게 관련된 생식계열 유전자 패밀리 서열을 포함하는, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열 특성을 수득하기 위해. IMGT-DomainGapAlign 아미노산 체크 윈도우에서, 서열 유사성이 가장 높은 인간 생식계열 유전자 패밀리 서열을 검색한다. 4D3 경쇄는 인간 IGKV1-27*01+IGKJ2*02 패밀리 서열에 상응하고, 4D3 중쇄는 인간 IGHV1-3*01+IGHJ4*01 패밀리 서열에 상응한다. 인간 생식계열 유전자 서열의 CDR 영역을 4D3 경쇄 및 중쇄의 CDR로 치환하고, 이어서 IMGT-구조 쿼리를 사용하여 항체의 구조를 확인한다. 마지막으로, 경쇄 및 중쇄의 인간화 서열의 4D3-Hum 버전을 수득했다. 4D3 마우스 서열과 인간화 서열을 온라인 웹사이트에 입력하여 인간 항체의 유사성 스코어를 평가한다.
도 6에서, 청색 라인은 마우스 항체 라이브러리의 Z-스코어 분포 범위 및 빈도를 나타내고, 녹색 라인은 인간 항체 라이브러리의 Z-스코어 분포 범위 및 빈도를 나타낸다. 적색 직선은 4D3 경쇄 및 중쇄에 의해 수득된 Z-스코어를 나타낸다. 인간화 후, 4D3의 Z-스코어는 현저히 증가했다.
실시예 13: 7F11 인간화 서열 변형
실시형태 12의 작업 절차를 참조하여, 7F11 마우스 항체의 경쇄 및 중쇄의 인간화 서열을 수득한다. 7F11 마우스 서열과 인간화 서열을 온라인 웹사이트에 입력하여, 인간 항체의 유사성 스코어를 평가한다.
도 7의 청색 라인은 마우스 항체 라이브러리의 Z-스코어 분포 범위 및 빈도를 나타내고, 녹색 라인은 인간 항체 라이브러리의 Z-스코어 분포 범위 및 빈도를 나타낸다. 적색 직선은 4D3 경쇄 및 중쇄에 의해 수득된 Z-스코어를 나타낸다. 인간화 후, 7F11의 Z-스코어는 현저히 증가했다.
실시예 14: 4D3 인간화 항체의 상대적 친화성 분석
4D3 인간화 항체 서열을 진핵생물 발현 벡터에 클로닝하고, 실시형태 8의 프로토콜에 따라 진핵생물 세포 293F를 일시적으로 형질감염시켰다. 정제된 항체를 2ug/ml로 균일하게 희석하고, 마우스 항체와 함께 TROP2-코팅된 ELISA 플레이트의 웰 A1~H1에 첨가하고, 이어서 A1~A12의 방향으로부터 3배 희석하고; 37℃에서 1시간 인큐베이팅한 후, 세정하고, 이어서 항-인간 Fc HRP-표지 항체를 첨가하고, 발색을 위해 37℃에서 인큐베이팅한다. 마지막으로, ch4D3 및 hum4D3 항체 사이의 상대적 친화성을 EC50 및 곡선 형상에 의해 비교했다.
도 8, EC50(4D3-키메라): 0.056ug/ml; EC50(4D3-인간화): 0.0502ug/ml.
실시예 15: 4D3 인간화 항체의 열 안정성 분석
정제된 hum4D3 항체를 투석하고, PBS 완충액으로 투석하고, 최종 농도 2mg/ml로 보정하고, 70ul/튜브의 2개의 배치, 각 배치에 3개의 튜브로 분할했다. 샘플의 2개 배치를 4℃와 37℃에 배치하고, 0일차, 7일차, 14일차에 따라 샘플 튜브를 꺼냈다. 샘플은 항체의 분해 및 응집을 평가하기 위해 SEC 분석에 사용되었다.
도 9: 7일차(도 A), 14일차(도 B) 및 21일차(도 C)에 인간화 4D3 항체의 SEC 검출 결과. 37℃의 조건하에서 각 시점에서 4D3-인간화 항체의 단량체 및 응집체 및 4D3-인간화 항체에서 검출 분자의 비율(%)은 도 D의 표에 제시되어 있다.
실시예 16: 7F11 인간화 항체의 상대적 친화성 및 결합 에피토프 일관성의 분석
7F11 인간화 항체의 상대적 친화성을 평가하기 위해, 실시형태 14의 작업 절차를 참조한다.
도 10: 동일한 희석 농도, EC50(7F11-키메라): 0.061㎍/ml; EC50(7F11-인간화): 0.0601ug/ml에서 7F11 인간화 항체 및 키메라 항체의 결합 곡선.
실시예 17: 7F11 인간화 항체의 열 안정성 분석
7F11 인간화 항체의 열 안정성 분석은 실시형태 15의 작업 절차를 참조하여 수행했다.
도 11은 7일차(도 A), 14일차(도 B) 및 21일차(도 C)에 7F11 인간화 항체의 SEC 검출 결과를 나타낸다. 37℃ 조건하에서 각 시점에서 7F11-인간화 항체의 단량체 및 응집체, 및 7F11-인간화 항체에서 검출 분자의 비율(%)은 도 D의 표에 제시되어 있다.
실시예 18: 인간화 항체 및 모 항체의 항원 친화성 분석
폴 포르테바이오 옥테트(Pall ForteBio Octet) 광학 분석 기술 플랫폼은 항체-항원 결합의 절대 친화성을 평가하기 위해 사용된다. 이 방법에서, 비오틴-표지된 항원은 스트렙트아비딘 바이오센서 칩의 표면에 고정화되고, 기준선은 180초 동안 평형시키고, 이어서 용액 농도 구배로 30초 동안 희석된 항체와 결합시키고, 칩의 광학적 두께를 증가시켜, 파장 쉬프트(Δλ)를 제공하고, 이어서 30초의 해리 단계에 도입시킨다. Trop2 항원과 상응하는 항체 사이의 상호작용을 실시간으로 측정하고, 각 농도에서 결합의 특이성, 결합 속도, 해리 속도 또는 샘플 농도를 정밀하고 정확하게 측정한다. 적어도 5개의 농도 구배에서 k-on 및 k-off 값을 요약한 후, KD 결합 상수를 수득한다.
Figure pct00001
실시예 19: 4D3 인간화 항체 및 키메라 항체의 활성 분석 및 결합 에피토프 일관성 분석
4D3-인간화 항체를 비오틴으로 표지하고, 결합 곡선의 변곡점 값은 ELISA에 의해 0.5ng/ml인 것으로 측정되었다. 0.5ng/ml 4D3 비오틴-표지 항체를 함유하는 ELISA 차단 용액을 제조하고, 이 용액을 기준으로 50ug/ml의 경쟁 항체 4D3-키메라 및 4D3-인간화를 구성한다. 비오틴-표지 항체 및 경쟁 항체를 함유하는 용액을 A1~A12에 웰당 150ul 첨가하고, 이어서 50ul을 흡인하여 B2~B12에 첨가하고, 사전 첨가된 비오틴 항체 용액과 100ul 용적으로 충분히 혼합하고, 이어서 H1~H12에 순차로 3회 희석하고, 37℃에서 1시간 인큐베이팅하고, 이어서 항-인간 IgG Fc 2차 항체를 세척 및 인큐베이팅하고, 37℃에서 1시간 인큐베이팅하고, 이어서 3회 세척하고, 25분간 발색을 수행하고, 그 값을 판독한다.
도 12: 4D3-인간화-비오틴 항체는 각각 0.02-50ug/ml에서 ch4D3 및 hum4D3 항체와 경쟁한다. 2개의 경쟁 항체는 동일한 정도의 경쟁 활성을 나타내고, 동일한 에피토프에 결합한다. EC50(ch4D3): 0.336ug/ml. EC50(hum4D3): 0.326ug/ml
실시예 20: 7F11 인간화 항체, 인간화 항체 및 키메라 항체의 활성 분석 및 결합 에피토프 일관성 분석
실시형태 19의 작업 절차를 참조하여, 7F11의 에피토프 경쟁 활성 및 결합 에피토프 일관성을 분석했다.
도 13: 7F11-인간화-비오틴 항체는 각각 0.02-50ug/ml ch7F11 및 hum7F11 항체와 경쟁한다. 2개의 경쟁 항체는 동일한 정도의 경쟁 활성을 나타내고, 동일한 에피토프에 결합한다. EC50(ch7F11): 0.732ug/ml. EC50(hum7F11): 0.856ug/ml.
실시예 21: 인간화 항체 hu7F11 및 hu4D3의 세포 결합 및 세포내이입
HEK293 세포를 음성 세포로 사용하고 BXPC-3 및 MCF-7 세포를 양성 세포로 사용하여, 구배 농도에서 각 항체의 결합 및 세포내이입을 시험한다. 세포 결합 시험을 위해, 4℃에서 1시간 동안 결합시키고, 이어서 종래의 FITC-표지 형광 2차 항체를 첨가하고, 유세포 분석법에 의해 데이터를 수집한다.
세포내이입 시험은 산-민감성 소분자 염료 프로도-레드(Phrodo-Red) 염소 항-인간 2차 항체를 사용하는데, 이는 1차 항체의 각 농도에서 인큐베이팅하여 복합체를 형성하고, 이어서 각 세포주와 16시간 동안 인큐베이팅한다. 샘플링 후, 각 96-웰 플레이트의 세포 웰에 적어도 10,000개 세포를 놓고, 유세포 분석기에 의해 데이터를 수집 및 분석한다. 원적외선 광 채널의 다양한 농도에서 세포의 평균 형광 강도 값을 계산하고, 횡좌표로서 항체 농도를 사용하여 세포내이입 곡선의 정도를 플로팅한다.
3개 유형의 세포에서 hu7F11 및 Hu4D3 항체의 결합 수준을 비교하면, BxPC-3 세포는 최고의 결합 수준을 갖는다. 3개 유형의 세포에서 hu7F11 및 Hu4D3 항체의 세포내이입 정도의 비교. BxPC-3 세포는 최고 수준의 세포내이입을 갖는다.
서열 목록
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SEQUENCE LISTING <120> 一?抗TROP2抗? <160> 40 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Asp 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 2 Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asn 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 3 Val Arg Gly Glu Ala Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Val 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 5 Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Asn Ser 1 5 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 6 Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Val Gly Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 7 Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 1 5 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 8 Ser Thr Ser 1 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 9 Leu Gln Tyr Asp Asp Leu Phe Thr 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 10 Gln Ser Val Ser Asn Asp 1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 11 Tyr Ala Ser 1 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 12 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 13 <211> 137 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 13 Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Phe Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Ser Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Arg Gly Glu Ala Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Pro Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 14 <211> 126 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 14 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Pro Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile His Ser Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 15 <211> 143 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 15 Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val 1 5 10 15 His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Asp His Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Asn Ser Tyr Tyr Ser Glu 65 70 75 80 Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Val Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Val Gly Tyr 115 120 125 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 16 <211> 127 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 16 Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu 20 25 30 Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr 100 105 110 Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 17 <211> 137 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 17 Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Phe Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Glu Ala Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 18 <211> 126 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 18 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 19 <211> 143 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 19 Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val 1 5 10 15 His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Asp His Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Met Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Asn Ser Tyr Tyr Ala Gln 65 70 75 80 Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Val Gly Tyr 115 120 125 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 20 <211> 127 <212> PRT <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 20 Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala His Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr 100 105 110 Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 21 ggctacacct tcacaagctt tgat 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 22 atttttcctg gagatggtaa t 21 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 23 gtaagagggg aggccctgta ttactttgac tac 33 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 24 ggatacacat tcactgacca tgtc 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 25 atttatcctg gaagtgataa tagt 24 <210> 26 <211> 54 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 26 gcaagagagg gctatggtta tggaaaaaac ggagttggct atgctatgga ctac 54 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 27 caagacatta ataagtat 18 <210> 28 <211> 9 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 28 tccacatct 9 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 29 ctgcagtatg atgatctatt cacg 24 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 30 cagagtgtga gtaatgat 18 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 31 tatgcatcc 9 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 32 cagcaggatt attcctctcc gtggacg 27 <210> 33 <211> 411 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 33 atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agctgaactg gtaaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcacaagc tttgatataa actgggtgag gcagaggcct 180 gaacagggac ttgagtggat tggatggatt tttcctggag atggtaatac taagtccaat 240 gagaaattta agggcaaggc cacactgact acagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca ggctgacatc tgaggactct gctgtctatt tctgtgtaag aggggaggcc 360 ctgtattact ttgactactg gggcccaggc accactctca cagtctcctc a 411 <210> 34 <211> 379 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 34 atgagaccgt ctattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg tgctcagtgt 60 gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 120 atcacttgca agccaagcca agacattaat aagtatatag cttggtacca acacaagcct 180 ggaaaaggtc ctaggctgct catacattcc acatctacat tacagccagg catcccatca 240 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca ccatcagcaa cctggaacct 300 gaagatattg caacttatta ttgtctgcag tatgatgatc tattcacgtt cggctcgggg 360 acaaagttgg aaataaaac 379 <210> 35 <211> 429 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 35 atggaatgga ggatctttct cttcatcctg tcaggaactg caggtgtcca ctcccaggtt 60 cagctgcagc agtctggacc tgaggtggtg aagcctgggg cttcagtgaa gatgtcctgc 120 aaggcttctg gatacacatt cactgaccat gtcataagct gggtgaagca gagaactgga 180 cagggccttg agtggattgg acagatttat cctggaagtg ataatagtta ctacagtgag 240 aagttgaagg acaaggccac actgactgca gacaaatcct ccaacacagc ctacatgcag 300 ctcgtcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaga gggctatggt 360 tatggaaaaa acggagttgg ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 420 gtctcctca 429 <210> 36 <211> 382 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 36 atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt ctactgctct gtgtgtctgg tgctcatggg 60 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 120 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag tttggtacca acagaagcca 180 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 240 cgcttcaccg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgcgcaggct 300 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattattcct ctccgtggac gttcggtggg 360 ggcaccaagc tggaaatcaa ac 382 <210> 37 <211> 412 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 37 atgggctggt cctgggtgtt cctgttcctg ctgagcgtga ccgccggcgt gcactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgaggtg aagaagcccg gcgcctccgt gaagctgagc 120 tgtaaggcct ccggctacac cttcacctcc ttcgacatta actgggtgcg gcaggccccc 180 gagcagcgcc tggagtggat gggctggatc ttccccggcg acggcaacac caagtactcc 240 cagaagttcc agggaagagc taccatcacc agagatacat ccgcttctac agcttacatg 300 gagctgtcta gcctgagatc tgaggataca gctgtgtatt actgtgtgag aggagaggct 360 ctgtactatt ttgattattg gggccagggc accctggtga cagtgtcttc tg 412 <210> 38 <211> 379 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 38 atgagacctt ctatccagtt tctgggcctg ctgctgtttt ggctgcatgg cgcccagtgc 60 gatatccaga tgacccagtc tccatctagc ctgtccgctt ctgtgggcga tagagtgacc 120 atcacatgca gagcttctca ggatatcaat aagtatctgg cttggtatca gcagaagcct 180 ggaaaggtgc ctaagctgct gatctactct acatctaccc tgcagtctgg agtgccttct 240 agattttctg gatctggctc tggcaccgat tttacactga caatctcttc tctgcagcct 300 gaggatgtgg ctacatatta ttgtctgcag tatgatgatc tgttcacctt tggccagggc 360 accaagctgg agatcaagc 379 <210> 39 <211> 430 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 39 atggagtgga gaatctttct gtttatcctg tctggcacag ctggagtgca ttctcaggtg 60 cagctggtgc agtctggggc cgaggtgaaa aagccaggcg cttctgtgaa ggtgtcttgc 120 aaggcctccg gctacacctt caccgaccac gtgatctcct gggtgcgcca ggccaccggc 180 cagggcctgg agtggatggg ccagatctac cccggctccg acaactccta ctacgcccag 240 aagttccagg gcagggtgac tctgaccgcc gacaagtcca tcaacaccgc ctacatggag 300 ctgtcctccc tgaggtccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga gggctacggc 360 tacggcaaga acggcgtggg ctacgccatg gattattggg gccagggcac cctggtgaca 420 gtgtcttctg 430 <210> 40 <211> 382 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <400> 40 atgaagtctc agacccaggt gtttgtgttt ctgctgctgt gtgtgtctgg cgctcatggc 60 gatatcgtga tgacacagtc tcctgattct ctggccgtgt ctctgggcga aagagctaca 120 atcaactgta aggcttctca gtctgtgtct aatgatgtgg tgtggtacca gcagaagcct 180 gggcagcccc ccaagctgct gatctactac gcctccaaca ggtacaccgg cgtgcccgac 240 aggttctccg gctccggcta cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaggcc 300 gaggacgtgg ccgtgtacta ctgccagcag gactactcct ccccctggac cttcggcggc 360 ggcaccaagg tggagatcaa gc 382

Claims (19)

  1. 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항-TROP2 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편으로서,
    중쇄가 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖거나, 중쇄가 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는, 항-TROP2 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편.
  2. 제1항에 있어서, 이의 중쇄가 서열번호 17 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편.
  3. 제1항에 있어서, 이의 중쇄가 서열번호 19 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편.
  4. 제1항에 있어서, 95% 이상의 상동성(homology)을 갖는 이의 아미노산 서열이 본 출원의 등가물(equivalent) 및 따라서 본 출원의 일부로서 이해되어야 하는, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편.
  5. 제1항에 있어서, 중쇄가 서열번호 1, 2 및 3으로부터의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3, 또는 서열번호 4, 5 및 6으로부터의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하고, 경쇄가 서열번호 7, 8 및 9로부터의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 또는 서열번호 10, 11 및 12로부터의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편.
  6. 적어도 하나의 CDR을 갖는 항체 단편 또는 이의 유도체로서,
    서열번호 1 내지 12에 대해 적어도 80%의 동일성, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성을 갖는 CDR의 아미노산 서열이 본 출원의 등가물 및 따라서 본 출원의 일부로서 이해되어야 하는, 항체 단편 또는 이의 유도체.
    [청구항 5]
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 이의 유도체인, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', 또는 scFv-Fc 단편.
    [청구항 6]
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFc-Fc 단편이 뮤린 기원(murine origin)의 것인, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab' 또는 scFc-Fc 단편.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFc-Fc 단편이 제1항에서와 같이 인간화 서열(humanized sequence)을 포함하는, 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFc-Fc 단편.
  8. 내용 없음
  9. 제1항, 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFc-Fc 단편을 코딩하는(encoding) 핵산 서열을 포함하는, 제1항의 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFc-Fc 단편을 코딩하는 핵산 서열.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 21, 22 및 23, 또는 서열번호 24, 25 또는 26을 갖는 중쇄를 코딩하는 핵산 서열, 및 서열번호 27, 28 및 29, 또는 서열번호 30, 31 및 32를 갖는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 서열.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 35 및 36을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열.
  12. 제10항에 있어서, 서열번호 37 및 38, 또는 서열번호 39 및 34를 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
  13. 제10항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 핵산 서열에 상응하거나 상보성인 RNA.
  14. 제10항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
  15. 제14항의 발현 벡터를 위한 숙주(host).
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항의 아미노산 서열을 생산하도록 구성된, 발현 벡터 또는 숙주.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편, 또는 제16항에 따라 생성된 아미노산 서열을 사용하여 TROP2-관련 악성 종양(TROP2-related malignant tumor)을 진단 또는 치료하기 위한 방법.
  18. 제17항의 항체 또는 이의 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편, 및 세포독성 화합물 또는 방사성 원소를 포함하는, 면역-접합체(immune-conjugate).
  19. 알킬화제, 항-대사산물, 항-종양 약물, 유사분열 억제제, 크로마틴 기능 억제제, 항-혈관신생제, 항-안드로겐, 항-에스트로겐, 면역조절제(immunoregulator) 또는 이의 조합을 포함하는, 제18항의 세포독성 화합물.
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