CN117843796A - 一种Pfu DNA聚合酶抗体F10G6及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6及其应用，其重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示；其轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。该F10G6抗体在60℃封闭Pfu DNA聚合酶5’‑3’聚合酶活性，且封闭效率均98％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种Pfu DNA聚合酶抗体F10G6及其应用，属于Pfu DNA聚合酶技术领域。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。它具有特异性强、灵敏℃高、快速、简便及重复性好等特点，是分子生物学研究最基础、最重要的工具之一。其原理是在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以引物为起点通过变性、退火和延伸等循环步骤，在体外对DNA分子进行扩增，从而实现DNA的复制。
Pfu DNA聚合酶(简称，Pfu酶)是科学家从激烈火球菌(Pyrococcus furiosus,Pfu)分离出的一种DNA聚合酶，该酶分子量为90kda，具有出色的热稳定性。同时该酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，而3’-5’外切酶活性的主要功能是校正作用，这让Pfu酶拥有极高的保真性。由于高保真性和高稳定性让Pfu酶成为最广泛应用的DNA聚合酶之一。
在PCR的过程中，Pfu酶通常与其他DNA聚合酶一样，在低温条件下，仍然具有一定聚合酶活性，从而产生非特异性扩增以及形成引物二聚体。目前可以通过很多途径以达到热启动的目的，如对酶进行基因突变、物理隔绝、化学修饰、核酸引物修饰等。但是这些方法均有不利的因素，如酶活封闭不完全、影响PCR的复杂性、影响酶的续进性、忠实性或方法比较繁琐等。
针对上述中的相关技术的缺点，采用单克隆抗体修饰Pfu酶是一种相对更好的方法。Pfu酶抗体是热启动PCR抗Pfu酶的抗体，其与Pfu酶结合后抑制DNA聚合酶活性。在PCR扩增时，高温变性前Pfu酶抗体与Pfu酶结合抑制DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，提高扩增的特异性及目的DNA产量。但是，现有的Pfu DNA聚合酶抗体在60℃以上时对Pfu DNA聚合酶的封闭效率较低，导致仍然有一些非特异性扩增。
发明内容
本发明提供了一种Pfu DNA聚合酶抗体F10G6及其应用，可以有效解决上述问题
本发明是这样实现的：
一种Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6，其重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示；其轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施例中，所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6的重链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2序列如SEQ ID NO:4所示，CDR3序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施例中，所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6的轻链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2序列如SEQ ID NO:7所示，CDR3序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施例中，所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6的重链序列如SEQ IDNO:9所示。
在一些实施例中，所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6的轻链序列如SEQ IDNO:10所示。
一种降低Pfu DNA聚合酶非特异性扩增的方法，应用上述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6。
一种细胞，其产生上述的单克隆抗体F10G6。
本发明的有益效果是：
本发明的F10G6抗体在60℃封闭Pfu DNA聚合酶5’-3’聚合酶活性，且封闭效率均98％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例3提供的F10G6抗体封闭Pfu DNA聚合酶5’-3’聚合酶活性的效果图。
图2是本发明实施例4提供的F10G6抗体酶的PCR核酸电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
Pfu DNA聚合酶制备
1、Pfu DNA聚合酶的基因的获取、合成及载体构建
本发明根据NCBI查找到的Pfu DNA聚合酶的序列(NCBI:NC_003413.1)，在此基因的N端引入Nde I酶切位点，C端引入终止密码子与Xho I酶切位点，合成基因(上海生工生物合成)。分别用Nde I及Xho I限制性内切酶双酶切基因与pET28a载体，再用T4 DNA连接酶构建到pET28a-Pfu载体。
2、Pfu DNA聚合酶重组菌的构建及表达
将带有构建的pET28a-Pfu载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购于上海生工生物)，并涂布于LB平板，过夜培养，挑取单菌落。接种于10mL LB液体培养基中，加Kan抗生素至终浓度1mM，37℃，250rpm培养过夜，次日按1:100的比例转接于200mL LB培养基中，加Kan抗生素至终浓度1mM，37℃，250rpm培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mM/L-0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在25℃诱导表达6-8h。取菌液离心收集菌体，离心条件：4℃，8000rmp离心10min。
3、Pfu DNA聚合酶的纯化
(1)按照菌体与BufferA(Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，10mM，调pH至7.4)质量比为1：10混合，冰浴超声破碎，破碎条件：功率300W，超声3S，暂停8S，破碎15min；
(2)4℃，12000rpm离心30min，收集上清，用0.22μm过滤膜过滤上清，上样至Ni层析柱；
(3)用BufferB(Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，20mM，调pH至7.4)洗杂蛋白；
(4)用BufferC(Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，200mM，DTT 8mM，调pH至7.4)洗脱Pfu DNA聚合酶；
(5)将纯化的Pfu DNA聚合酶超滤换液、浓缩，保存到储存Buffer(Tris-HCl(pH7.4)20mM，KCl 100mM，DTT 1mM，0.5％Tween 20，0.1mM EDTA，glycerol50％(v/v)。
实施例2
单克隆抗体制备
本发明制备了1个Pfu DNA聚合酶的单克隆抗体F10G6。
抗体制备过程如下：
本申请涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：
弗氏完全佐剂Freund'sAdjuvant，Complete(货号为77140，Thermo Fisher)；弗氏不完全佐剂Freund'sAdjuvant，Incomplete(货号为77145,Thermo Fisher)；HATMediaSupplement(50×)(货号：21060017，Thermo Fisher)；HT MediaSup plement(50×)(货号为H0111067030，Thermo Fisher)；PEG(货号为P7181，sigma公司)；RPMI 1640(货号为L210KJ，上海源培生物)；胎牛血清FBS(C04001-500，上海逍鹏生物)；DMEM(货号为L310KJ，上海源培生物)；Penicillin-St reptomycin(货号15140122，gibco)；HRP标记羊抗鼠抗体(货号为D110087，上海生工生物)；ProteinAResin(货号为SA023010，常州天地人和生物科技有限公司)。
1、小鼠免疫：
使用Pfu DNA聚合酶多次免疫8-10周龄，重约20g，健康的Balb/c的雌性小鼠，第一次免疫为小鼠背部皮下注射50μg Pfu DNA聚合酶与弗氏完全佐剂等体积混合后得到的免疫原；两周后进行二次免疫，每只小鼠背部皮下注射50μg Pfu DNA聚合酶与弗氏不完全佐剂等体积混合后得到的免疫原；两周后进行三次免疫，每只小鼠背部皮下注射50μg PfuDNA聚合酶与弗氏不完全佐剂等体积混合后得到的免疫原；两周后加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg Pfu DNA聚合酶与生理盐水等体积混合后得到的免疫原。
2、细胞融合：小鼠最后一次免疫后第三天开始。取最后一次免疫后第三天的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离小鼠血清作为抗体检测时的阳性对照，同时颈脱位致死小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。提前两周复苏骨髓瘤细胞(保证使用时细胞处于对数生长期)，得到骨髓瘤细胞。融合前一天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养，得到含饲养层细胞的细胞板。采用PEG介导融合方法，取脾细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液按照细胞数比为5:1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1200rpm离心5min，去掉上清，用手指轻弹离心管底部，使两种细胞松散混匀，放于装有37℃水的烧杯中保温，在1分钟内加入1mL 50％PEG(pH8.0)融合细胞，边加边摇动，加完后静置30秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合，1000rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养层细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。其中，配制500mL HAT培养基需100mL FBS，5mL青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)，10mL HAT培养基添加剂(HAT Media Sup plement)，385mLDMEM。
3、杂交瘤细胞筛选：细胞培养箱中培养至第7天，融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。用Pfu DNA聚合酶包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标记羊抗鼠抗体，步骤2分离的小鼠血清作为阳性对照，筛选出抗体效价较高的阳性杂交瘤细胞。
4、杂交瘤细胞克隆化：克隆化的前一天按照步骤2制备饲养层细胞并铺板；用移液器将待克隆的孔内阳性杂交瘤细胞吹打混匀，用HT培养基将孔内细胞稀释至每个孔内1个细胞；37℃、5％CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，最终初步筛选获得单抗杂交瘤细胞株。
5、制备单克隆抗体腹水：腹腔注射Balb/c小鼠0.5ml液体石蜡，10天后将筛选出来的杂交瘤细胞株接种1×106到Balb/c小鼠腹腔内。待10天左右小鼠腹部会开始肿胀，小鼠脱颈椎处死，于75％酒精浸泡消毒5min，进行一次性腹水的提取。
6、单克隆抗体纯化：3000rpm，10min离心，无色透明的中间层即为腹水。用饱和(NH4)2SO4与腹水按照1：1混合，充分混匀后，10000rpm，离心10min，弃上清，将沉淀用pH7.0，浓度20mM的PB溶液重溶，过蛋白A柱，以pH2.7，浓度为100mM的Gly-HCl洗脱，洗脱液立马用pH9.0，浓度为1M的Tris-HCl中和。后续4℃，透析6h将保存液换成PBS溶液，即得到纯化的Pfu DNA聚合酶的单克隆抗体F10G6。
经测序，具体信息如下：
F10G6的氨基酸序列如下：
重链CDR1序列：YTMH(SEQ ID NO:1)
重链CDR2序列：WAPSINTNYEKFKD(SEQ ID NO:2)
重链CDR3序列：HGRKTFDY(SEQ ID NO:3)
轻链CDR1序列：ASQTDSYL(SEQ ID NO:4)
轻链CDR2序列：YSYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR3序列：QQKENPT(SEQ ID NO:6)
重链可变区序列为：QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKMSAYNFT YTMHWVKQRPGQGLEWIGWAPSINTNYEKFKDKATLSVDTSSNTAYMQLSS LTSEDSALYYCARHGRKTFDYWGQGTTLTVSA(SEQ ID NO:7)
轻链可变区序列为：
DIVMTQTTASLAVSLGDRATISCASQTDSYLWYQQKPGQPPKLLIKYSY LEGVPSRFSGSGSGTDYSLTIHPVEQEDIATYYCQQKENPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:8)
重链序列为：
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKMSAYNFTYTMHWVKQRPGQGLEWIGWAPSINTNYEKFKDKATLSVDTSSNTAYMQLSSLTSEDSALYYCARHGRKTFDYWGQGTTLTVSASTPPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ IDNO:9)
轻链序列为：
DIVMTQTTASLAVSLGDRATISCASQTDSYLWYQQKPGQPPKLLIKYSYLEGVPSRFSGSGSGTDYSLTIHPVEQEDIATYYCQQKENPTFGGGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:10)
实施例3
取抗体F10G6，浓度为5mg/mL，分别与浓度为0.5mg/mL的Pfu DNA聚合酶按照2：1的质量比混合均匀，37℃孵育30min，即为F10G6抗体酶。
5’-3’聚合酶活性封闭性检测
取发夹型寡核苷酸
TAGCGAAGGATGTGAACCTAATCCCTGCTCCCGCGGCCGATCTGCCGGC CGCGG(SEQ ID NO:11)，稀释至100μmol/L。
配制10×Pfubuffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/LdNTP。
按照下表1配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复：
表1
| 反应液组分 | 用量(μL) |
| 10×Pfubuffer | 2.5 |
| PicoGreen | 0.5 |
| 发夹型寡核苷酸 | 0.1 |
| Pfu酶、抗体F10G6酶 | 0.5 |
| 纯化水 | 21.4 |
| 总计 | 25 |
在荧光定量PCR仪上设置温度程序：
扩增温度为37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃；扩增时间为16s；120个循环；荧光采集通道；FAM。
按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪，开始聚合反应。
反应结束后，根据荧光定量PCR数据，计算第120cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’聚合酶活性封闭效果＝1-测试抗体酶的前后荧光差异/Pfu酶的前后荧光值差异。
结果如图1所示，F10G6抗体在60℃封闭Pfu DNA聚合酶5’-3’聚合酶活性，且封闭效率均98％以上。
实施例4
PCR检测样本扩增效果
合成引物pCDNA3.1-F，序列为CTAGAGAACCCACTGCTTAC(SEQ ID NO:12)，引物pCDNA3.1-R，序列为TAGAAGGCACAGTCGAGG(SEQ ID NO:13)，稀释至10μmol/L。
样本为载体pCDNA3.1质粒(购于生物风)加入到50倍稀释的阴性血清中。
配制10×Pfu buffer 2：200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L(NH4)·SO4，100mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，1mg/mL BSA，20mmol/LMgSO4，pH8.7(25℃)。
实验分成两组，分别为：F10G6抗体酶组、Pfu酶。
F10G6抗体酶组：取F10G6抗体，浓度为5mg/mL，分别与浓度为0.5mg/mL的Pfu DNA聚合酶按照2：1的质量比混合均匀，37℃孵育30min，即为抗体酶。
Pfu酶组：另取浓度为0.5mg/mL的Pfu DNA聚合酶加相同体积的抗体储存缓冲液混合均匀，37℃孵育30min。
按照以下表2配方配制
表2
在PCR仪上设置温度程序如表3所示：
表3
称取1.0g琼脂粉加入100mL TAE配制1.0％电泳胶。取以上PCR管，加6μL的Loadingbuffer，混匀离心取20μL上样至电泳胶。在120V下电泳30min，观察电泳条带并拍照。
结果如图2所示，F10G6抗体酶PCR效果明显好于无抗体封闭的Pfu酶，其扩增条带更亮、产物更多。
综上所述，本发明公开的F10G6抗体酶，可特异结合Pfu DNA聚合酶，可以在70℃内完全封闭其5’-3’聚合酶活性，Pfu DNA聚合酶混合的抗体组酶在扩增样本时效果明显好于不加抗体的Pfu DNA聚合酶。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6，其特征在于，其重链可变区序列如SEQ IDNO:1所示；其轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6，其特征在于，其重链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2序列如SEQ ID NO:4所示，CDR3序列如SEQ IDNO:5所示。
3.根据权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6，其特征在于，其轻链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2序列如SEQ ID NO:7所示，CDR3序列如SEQ IDNO:8所示。
4.根据权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6，其特征在于，其重链序列如SEQ ID NO:9所示。
5.根据权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6，其特征在于，其轻链序列如SEQ ID NO:10所示。
6.一种降低Pfu DNA聚合酶非特异性扩增的方法，其特征在于，应用权利要求1至5任一项所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6与Pfu DNA聚合酶的质量比为1.5-2.5：1。
8.一种细胞，其特征在于，其产生权利要求1至5任一项所述的单克隆抗体F10G6。
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