NO324530B1 - Fremgangsmate for amplifisering og detektering av en malnukleinsyre - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for amplifisering og detektering av målnukleinsyrer. Særlig angår oppfinnelsen forbedrede metoder for detektering av amplifiserte nukleinsyreprodukter. Oppfinnelsen kan benyttes i forskjellige medisinske og forsknings-studier, rettsmedisinske undersøkelser og i diagnostiske prosedyrer, for eksempel for detektering av genetiske mangler eller infeksiøse sykdommer.

Teknologien for å detektere små mengder nukleinsyre har hatt stort fremskritt i løpet av de siste to dekader, inkludert utviklingen av meget sofistikerte hybridiseringsanalyser ved bruk av prober i ampliflseringsteknikker som polymerasekjedereaksjonen, PCR. Forskere har erkjent verdien av en slik teknologi for å detektere sykdommer og genetiske trekk i humane og animalske prøver. Bruken av primere og prober ved amplifisering og detektering av nukleinsyrer er basert på konseptet med komplementaritet, det vil si bindingen av to strenger av en nukleinsyre ved hydrogenbindinger mellom komplementære nukleotider (som er kjent som nukleotidpar).

Mye forskning er gjennomført for å finne måter for amplifisering og detektering av små mengder DNA. Forskjellige prosedyrer er kjent og har vært benyttet for å amplifisere eller vesentlig å mangfoldiggjøre antallet nukleinsyrer i en prøve for detektering. Slike ampliflseringsteknikker inkluderer PCR, ligasekjedereaksjon, LCR, og forgrenet DNA.

PCR er den mest kjente av disse amplifiseringsmetoder. Detaljer ved PCR er godt beskrevet i teknikken inkludert for eksempel US 4 638 195,4 683 202 og 4 965 188. Uten å gå i detalj involverer PCR hybridisering av primere til strenger av en målnukleinsyre i nærvær av et polymeriseirngsmiddel (for eksempel DNA-polymerase) og deoksyribonukleosid-tri fosfater under egnede betingelser. Resultatet er dannelsen av primerforlengelsesprodukter langs templatene, der produktene har addert til seg nukleotider som er komplementære til templatene.

Når først primerforlengelsesproduktene er denaturert og en kopi av templatene er fremstilt, kan syklusen med priming, forlengelse og denaturering gjennomføres så mange ganger man ønsker for å tilveiebringe en eksepsjonell økning i mengden nukleinsyre som har samme sekvens som målnukleinsyren. Således blir målnukleinsyren duplisert, eller amplifisert, mange ganger slik at den lettere detekteres. Når først målnukleinsyren er tilstrekkelig amplifisert, kan forskjellige detekteringsprosedyrer benyttes for kvalitativ og/eller kvantitativ

detektering av nærværet av målet.

Når først målnukleinsyren er tilstrekkelig amplifisert, kan forskjellige detekteringsprosedyrer benyttes for detektering av dens nærvær. En standard detekteringsmetode som benyttes for å detektere PCR-produkter har vært etidiumbromid-merket agarosegel. Bruken av etidiumbromid-merket gel har imidlertid flere mangler inkludert for eksempel relativt dårlig sensitivitet og spesifisitet.

Forbedrede metoder for detektering av PCR-produkter som eliminerer bruken av radiomer-king og elektroforese, har vært utviklet. Disse ikke-isotopiske oligonukleotid-oppfangings-detekteringsmetoder er basert på spesifikk hybridisering til prober og enzymatisk signalge-nerering. Slike ikke-isotopiske oligonukleotid-innfangingsdetekteirngsmetoder, også kjent som revers-dot-blot-detektering, er beskrevet i US 5 229 297, 5 328 825 og 5 422 271. En slik metode er også beskrevet av Findlay et al. i "Clinical Chemistry", 39:1927-1933

(1993).

Disse ikke-isotopiske detekteringsmetoder har høyere sensitivitet og spesifisitet enn etidiumbromid-merkingsdetektering og unngår bruken av radioaktivitet. Metodene medfører enten gjennomføring av amplifiseringen med en eller flere biotinylerte primere eller ved bruk av en biotinylert probe for å detektere de amplifiserte nukleinsyrer. Biotinylerte produkter eller prober omsettes deretter med et avidin- eller streptavidin-konjugert enzym som pepperrotperoksydase, HRP. En fargestoff-forløper (eller lysgenererende signalreagens) kan så bringes i kontakt med enzymet og omdannes til et fargestoff (luminescens) og derved generere et detekterbart signal.

Ikke-isotopiske oligonukleotid-innfangsdetekteirngsmetoder er imidlertid heller ikke helt uten mangler. Hvis ikke-isotopiske oligonukleotid-innfangingsdetektering gjennomføres ved bruk av standard PCR-denatureringsbetingelser (95°C) for å denaturere konsentrerte eller minimalt fortynnede, amplifiserte nukleinsyreprodukter, vil enzymene som benyttes for å gjennomføre amplifiseringsreaksjonen, for eksempel termostabile polymeraser eller DNA-ligaser, fremdeles være til stede og aktive. Nærværet av slike aktive enzymer under detekteringen resulterer i bindingskonkurranse mellom enzymet og proben for amplifisering av produktet. Slik konkurranse kan redusere mengden av amplifiserte nukleinsyreprodukter som er bundet til proben og derfor også detekteringssignalet.

En løsning på dette problem har vært å tilsette høye nivåer av etylendiamintetraeddiksyre, EDTA (se for eksempel WO 9606190), en chelator for Mg"<1>-<1>", til PCR-amplifiseringsblandingen etter at amplifiseringen er gjennomført, men før detektering. EDTA er i stand til å inhibere mange enzymer som krever Mg<++> for aktivitet inkludert DNA-polymeraser og DNA-ligaser. Bruken av EDTA føyer imidlertid et ytterligere trinn til PCR-amplifiserings-og -detekteringsprosessen. I tillegg krever bruken av EDTA en åpning av reaksjonsbeholderen for å tilsette EDTA. Som fagmannen vil vite, bør en åpning av reaksjonsbeholderen unngås på grunn av mulig kontaminering.

Således er en blokkering av amplifiseringsprosessen under detekteringen ved tilsetning av EDTA eller andre slike enzyminhibitorer ikke ønskelig. I stedet er det ønskelig å ha en metode for inaktivering av amplifiseringsenzymene før detektering uten øket risiko for kontaminering.

I EP 511 712 er det beskrevet en fremgangsmåte for amplifisering av nukelinsyrer ved bruk av en termostabil DNA-polymerase, hvor de amplifiserte produktene innkuberes i 5 minutter ved 95°C før detektering.

Fra WO 9403635 er det videre kjent en fremgangsmåte for amplifisering av nukelinsyrer hvor de amplifiserte produktene denatureres ved å innkubere disse ved en temperatur opp til 96°C.

En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er å overvinne problemet som angitt ovenfor ved bruk av et etteramplifiserings-innkubeirngstrinn før detektering for å inaktivere amplifiseringen av enzymene.

I en utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for amplifisering og detektering av en målnukleinsyre, kjennetegnet ved at den omfatter: (i) å bringe en prøve man antar inneholder nevnte målnukleinsyre i kontakt med minst to oligonukleotider og et termostabilt amplifiseirngsenzym, der nevnte minst to oligonukleotider er i det vesentlige komplementære til en del av målnukleinsyren, under betingelser slik at målnukleinsyren kan amplifiseres; (ii) å amplifisere nevnte målnukleinsyre; (iii) å innkubere prøven i en tidsperiode på mellom 1 sekund og 30 minutter ved en temperatur på mellom 105 °C og 120 °C, som et post-amplifiserings-innkuberingstrinn, for å inaktivere nevnte termostabile amplifiseringsenzym; og (iv) å detektere nærværet eller fraværet av nevnte amplifiserte målnukleinsyre.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for amplifisering og detektering av en målnukleinsyre, kjennetegnet ved at den omfatter: (i) å bringe en prøve man antar inneholder nevnte målnukleinsyre i kontakt med fire ulike nukleosidtirfosfater, en termostabil DNA polymerase og to primere, hvori nevnte primere er i det vesentlige komplementære med målnukleinsyren under betingelser slik at målnukleinsyren kan amplifiseres; (ii) å amplifisere nevnte målnukleinsyre; (iii) å innkubere prøven i en tidsperiode på mellom 1 sekund og 30 minutter ved en temperatur på mellom 105 °C og 120 °C, som et post-ampliifserings-innkuberingstrinn, for å inaktivere polymeriseringsmiddelet; og

(iv) å detektere nærværet eller fraværet av nevnte amplifiserte målnukleinsyre.

I nok en utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for amplifisering og detektering av en målnukleinsyre, kjennetegnet ved at den omfatter: (i) å bringe en prøve man antar inneholder nevnte målnukleinsyre i kontakt med fire ulike nukleosidtrifosfater, en termostabil DNA polymerase og to primere, hvori minst en av primerne er merket med biotin og samtlige primere er i det vesentlige komplementære med målnukleinsyren under betingelser slik at målnukleinsyren kan amplifiseres; (ii) å amplifisere nevnte målnukleinsyre; (iii) å innkubere prøven i en tidsperiode på mellom 0,5 minutter og 5 minutter ved en temperatur på omtrent 105 °C, som et post-amplifiserings-innkubeirngstrinn, for å inaktivere polymerasen; og (iv) å detektere nærværet eller fråværet av de biotinylerte amplifiserte målnukleinsyrer ved å bringe dem i kontakt med et streptavidin-enzym konjugat, etterfulgt av en reaksjon med nevnte enzym og et substrat reagens for å gi et detekterbart, kolorimetrisk eller kjemi - luminescent signal.

Forskjellige andre gjenstander og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende

beskrivelse.

De generelle prinsipper og betingelser for amplifisering og detektering av nukleinsyrer ved bruk av polymerasekjedereaksjon er godt kjent og detaljer tilveiebringes i tallrike referanser inkludert US 4 638 195, 4 683 202 og 4 965 188.1 lys av læren i den kjente teknikk og den her gitte spesifikke lære, vil fagmannen ikke ha noen vanskelighet ved gjennomføring av oppfinnelsen ved å føye til et post-amplifiserings-innkuberingstrinn for å inaktivere amplifiseringsenzymene før produktdetektering slik det her beskrives, for å øke detekteringssensitiviteten.

Andre amplifiserings- og detekteringsprosedyrer som benytter termostabile enzymer kan også benyttes ved gjennomføring av oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer et etteramplifiserings-før-detekteirngs-innkuberingstrinn som inaktiverer det eller de termostabile enzymer som benyttes under amplifiseringen. Således er oppfinnelsen velegnet for bruk med en hvilken som helst amplifiseirngsmetode som benytter et termostabilt enzym. Andre termostabile amplifiseirngsmetoder inkluderer ligasekjedereaksjon, LCR, som for eksempel beskrevet i EP-A-0 320 308 og EP-A-0 439 182, som benytter en termostabil DNA-ligase for å ligere tilstøtende prober og derved danne en komplementær nukleinsyresekvens. Ved LCR blir målnukleinsyrer amplifisert ved bruk av fire oligonukleotidprober og en termostabil DNA-ligase. To av oligonukleotidprobene er komplementære til ved siden av hver-andre liggende seter på en streng av DNA-templatet som skal amplifiseres. Disse prober hybridiserer til denne DNA-streng slik at det dannes et "hakk" mellom de to prober. Dette hakk fylles så med en termostabil DNA-ligase og danner derved en ny streng av DNA som er komplementær til målet. De tredje og fjerde prober er komplementære til den andre streng av DNA-templatet og virker på samme måte som det første par av prober for å generere en komplementær DNA. De amplifiserte produkter fra LCR kan detekteres ved bruk av standard detekteringsmetoder. Etter amplifiserings-før-detekterings-innkuberingstrinnet ifølge oppfinnelsen kan benyttes sammen med LCR for å inaktivere DNA-ligasen før detektering. Således vil den her tilveiebrakte lære tillate fagmannen å tilpasse etter-amplifiseirngsenzymdenatureringstrinnet som vist for PCR til disse andre kjente amplifiserings- og detekteringsprosedyrer. Resten av foreliggende beskrivelse er for illustrasjonens skyld rettet mot gjennomføring av oppfinnelsen ved bruk av PCR.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en modifikasjon av kjente PCR metoder for å for-bedre detekterings sensitiviteten. Det er ifølge oppfinnelsen overraskende funnet at et etteramplifiserings-før-detekterings-innkuberingstrinn kan benyttes for å inaktivere polymeriseringsmidlet og redusere bindingskonkurransen mellom proben og midlet for amplifisering av målnukleinsyrene. Denne reduserte konkurranse øker detekteringssensitiviteten.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot amplifisering og detektering av en eller flere målnukleinsyrer som er til stede i en prøve. Prøvene kan inkludere cellulært eller viralt materiale, kroppsvæsker eller annet cellulært materiale inneholdende genetisk DNA eller RNA som kan detekteres.

Nukleinsyrer som skal amplifiseres og detekteres kan oppnås fra forskjellige kilder inkludert plasmider og naturlig forekommende DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde (som bakterier, gjær, vimser, planter, høyere dyr eller mennesker). Prøvene kan hentes fra forskjellige vev inkludert, men ikke begrenset til blod, perifer blodmononukleære celler

(PBMC), vevmateriale eller andre kilder som er kjent i teknikken som benytter slike prosedyrer. Oppfinnelsen er særlig brukbar for amplifisering og detektering av en eller flere nukleinsyresekvenser som funnet i genomisk DNA, bakterielt DNA, fungalt DNA, viralt DNA eller DNA eller RNA som finnes i bakterielt eller viralt infiserte celler.

Metoden som her beskrevet kan benyttes for å amplifisere og detektere målnukleinsyrer forbundet med infeksiøse sykdommer, genetiske mangler og cellulære mangler som cancer. Metoden kan også benyttes for rettmedisinske undersøkelser og DNA-typing. Metoden er særlig brukbar for detektering av infeksiøse midler som bakterier og viruser, ved detektering av nukleinsyrer forbundet med disse. Metoden har særlig brukbarhet når det kreves meget høy sensitivitet og/eller kvantitering.

Bakterier som kan detekteres ved hjelp av foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, bakterier som finnes i humanblod som Salmonella specier, Streptococcus specier, Chlamydia specier, Gonococcal specier, Mycobacteria specier (som Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium avium complex), Mycoplasma specier (som Mycoplasma Hemophilus influenzae og Mycoplasma pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferei, Pneumocystis carinii, Clostridium difficile, Camplyobacterie specier, Yersi-nia specier, Shigella specier og Listeria specier. Viruser som er detekterbare inkluderer, men er ikke begrenset til cytomegalovirus, herpes simpleks-virus, Epstein Barr-virus, human papillom-viruser, influensaviruser, hepatittviruser og retroviruser (som HTLV-I, HTLV-II, HIV-I og HIV-II). Protozo-parasitter, gjær og mugg kan også detekteres ved opp-finnelsens teknikk. Andre detekterbare specier vil være åpenbare for fagmannen.

Et "PCR-reagens" henviser til en hvilken som helst av de reagenser som ansees vesentlige for PCR, nemlig et sett av primere for hver målnukleinsyre, en DNA-polymerase, en DNA-polymerase-kofaktor og en eller flere deoksyribunukleosid-5'-trifosfater (dNTP'er). Andre eventuelle reagenser og materialer som benyttes ved PCR er beskrevet nedenfor.

Uttrykket "primer" henviser til et oligonukleotid, enten naturlig forekommende eller synte-tisk produsert, som er i stand til å virke som et initieringspunkt for syntese når den anbring-es under betingelser der syntese av et primerforlengelsesprodukt som er komplementær til en nukleinsyrestreng (det vil si templat) induseres, idet slike betingelser inkluderer nærværet av andre PCR-reagenser, og videre egnet temperatur og pH-verdi.

Primerne ifølge oppfinnelsen velges til å være "i det vesentlige komplementære" til den spesifikke nukleinsyresekvens som skal primes og amplifiseres. Dette betyr at de må være tilstrekkelig komplementære til å hybridisere med de respektive nukleinsyresekvenser for å danne de ønskede, hybridiserte produkter og så være forlengbare med en DNA-polymerase. Karakteristisk vil en "i det vesentlige komplementær" primer inneholde minst 70% eller flere baser som er komplementære til målsekvensen. Fortrinnsvis er 80% av basene komplementære og ennå mer foretrukket er 90% av basene komplementære. I det mest foretrukne situasjoner har mellom 90% og 100% nøyaktig komplementaritet til målnukleinsyre-sekvensen.

Primeren er fortrinnsvis enkeltstrenget for maksimal effektivitet ved amplifisering, men kan inneholde et dobbeltstrenget område hvis dette er ønskelig. Den må være lang nok til å prime syntesen av forlengelsesproduktene i nærværet av DNA-polymerase. Den nøyaktige størrelse for hver primer vil variere avhengig av den tilsiktede bruk, konsentrasjonen og sekvensen for primeren, kompleksiteten for målsekvensen samt reaksjonstemperaturen og primerkilden. Generelt vil primerne som benyttes ifølge oppfinnelsen ha fra 12 til 60 nukleotider og fortrinnsvis har de fra 16 til 40 nukleotider. Aller helst har hver primer fra 18 til 35 nukleotider.

Primere som kan benyttes her kan fremstilles ved bruk av kjente teknikker og utstyr inkludert for eksempel en ABI DNA syntesizer (tilgjengelig fra Applied Biosystems) eller en Biosearch serie 8600 eller serie 8800 syntesizer (tilgjengelig fra Milligen-Biosearch, Inc.). Prosedyrer for bruk av dette utstyr er velkjent og beskrevet for eksempel i US 4 965 188. Naturlig forekommende primere som er isolert fra biologiske kilder kan også være brukbare (for eksempel restriksjonsendonuklease-fermentorer). Et sett på minst to primere benyttes generelt for hver målnukleinsyre. Således kan et antall sett av primere benyttes samtidig for åamplifisere et stort antall målnukleinsyrer.

Som brukt her er en "probe" et oligonukleotid som i det vesentlige er komplementært til en nukleinsyresekvens av målnukleinsyren og som benyttes for detektering eller innfanging av den amplifiserte målnukleinsyre.

Primerne og/eller probene som benyttes ifølge oppfinnelsen kan eventuelt være merket.

Ved bruk av kjente metoder i denne teknikk kan primerne og/eller probene merkes med en spesifikk bindingsligand (som biotin), et enzym (som glukoseoksydase, peroksydaser, uri-cae og alkalisk fosfatase), radioisotoper, elektron-tette reagenser, kromogener, fluorogener, fosforescente deler eller ferritin. Fortrinnsvis er merkelappen er en spesifikk bindingsligand. Aller helst er merkelappen biotin eller et derivat derav, streptavidin eller et derivat derav eller et hapten.

Ytterligere PCR-reagenser som er nødvendige for PCR inkluderer en DNA-polymerase (fortrinnsvis en termostabil DNA-polymerase), en DNA-polymerase-kofaktor og egnede dNTP'er. Disse reagenser kan tilveiebringes individuelt, som del av en testkitt eller i rea-genskammere i testinnretninger.

En DNA-polymerase er et enzym som vil addere deoksynukleosidmonofosfatmolekyler til 3'-hydroksy-enden av primeren i et kompleks av primer og templat, men denne addisjon skjer på templat-avhengig måte.

Generelt skjer syntesen av forlengelsesproduktene i 5'_3'-retning av den nysyntetiserte streng inntil syntesen er avsluttet. Brukbare DNA-polymeraser inkluderer for eksempel E. coli DNA-polymerase I, T4 DNA-polymerase, Klenow-polymerase, reverstranskriptase og andre som er kjente i teknikken. Fortrinnsvis er DNA-polymerasen termostabil, noe som betyr at den er stabil overfor varme og fortrinnsvis aktiv ved høyere temperaturer og særlig de høyere temperaturer som benyttes for priming og forlengelse av DNA-strenger. Mere spesielt er de termostabile DNA-polymeraser ikke i det vesentlige inaktive ved de høye temperaturer som benyttes i polymerasekjedereaksjoner som her beskrevet. Slike temperaturer vil variere avhengig av et antall av reaksjonsbetingelser inkludert pH-verdi, nukleotid-sammensetning, primerlengde, saltkonsentrasjon og andre betingelser som kjent i teknikken.

Det er i teknikken angitt et antall termostabile DNA-polymeraser inkludert de som er nevnt i detalj i US 4 965 188 og 4 889 818. Særlig brukbare polymeraser er de som oppnås fra forskjellige Thermus-bakterielle specier som Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis og Thermus flavus. Andre brukbare termostabile polymeraser oppnås fra forskjellige mikrobielle kilder inkludert Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. og de som er beskrevet i WO-A-89/06691. Noen brukbare, termostabile polymeraser er kommersielt tilgjengelige som AppliTaq_, Tth og UlTma™ fra Perkin Eimer, Pfu fra Stratagene og Vent og Deep-Vent fra New England Biolabs. Et antall teknikker er også kjent for isolering av naturlig forekommende polymeraser fra organismer, og for produksjon av genetisk konstruerte enzymer ved bruk av rekombinante teknikker.

En DNA-polymerase-kofaktor henviser til en ikke-proteinforbindelse av hvilken enzymet avhenger for aktivitet. Således er enzymet katalytisk inaktivt uten nærvær av en kofaktor. Et antall stoffer er kjente kofaktorer, inkludert men ikke begrenset til mangan- og magnesi-umsalter, som klorider, sulfater, acetater og fettsyresalter. Magnesiumklorider og —sulfater er foretrukket.

Også nødvendig for PCR er to eller flere deoksyribonukleosid-5'-trifosfater som to eller flere av dATP, dCTP, dGTP, dTTP og dUTP. Analoger som dITP og 7-deaza-dGTP kan også benyttes. Fortrinnsvis blir de fire vanlige trifosfater (dATP, dCTP, dGTP og dTTP) benyttet sammen.

PCR-reagensene som er beskrevet tilveiebringes og benyttes i PCR i egnede konsentrasjoner for å tilveiebringe amplifisering av målnukleinsyren. De minimale mengder av primere, DNA-polymerase, kofaktorer og deoksyribonukleosid-5'-tirfosfater som er nødvendig for amplifisering og egnede områder for hver av disse, er velkjente i teknikken. Den minimale mengder DNA-polymerase er generelt ca. 0,5 enheter/100 ul oppløsning og 2 til 25 enheter/100 ul oppløsning er foretrukket, mens fra 7 til 20 enheter/100 ul er mest foretrukket. Andre mengder kan benyttes for et gitt amplifiseringssystem. En "enhet" er definert her som den mengde av enzymaktivitet som er nødvendig for å innarbeide 10 nmol totale nukleotider, dNTP'er, i en nukleinsyrekjede under forlengelse i løpet av 30 minutter ved 74°C. Den minimale mengde primer er minst ca. 0,075 umolar, mens 0,1 til 2 umolar er foretrukket, andre mengder er imidlertid også kjente i teknikken. Kofaktoren er generelt til stede i en mengde fra 2 til 15 mmolar. Mengden av hver dNTP er generelt fra 0,25 til 3,5 mmolar.

PCR-reagensene kan tilføres individuelt eller i forskjellige kombinasjoner eller alle i en bufret oppløsning med en pH-verdi i området fra 7 til 9, ved bruk av en hvilken som helst egnet buffer av hvilke mange er kjente i teknikken.

Andre reagenser som kan benyttes ved PCR inkluderer for eksempel antistoffer som er spesifikke for den termostabile DNA-polymerase, eksonukleaser og/eller glykosylaser. Antistoffer kan benyttes for å inhibere polymerasen før amplifisering. Antistoffer som kan benyttes ifølge oppfinnelsen er spesifikke for den termostabile DNA-polymerase, inhiberer enzymatisk aktivitet for DNA-polymerasen ved temperaturer under ca. 50°C, og deaktive-res ved høyere temperaturer. Brukbare antistoffer inkluderer monoklonale antistoffer, po-lyklonale antistoffer og antistoff-fragmenter. Fortrinnsvis er antistoffet monoklonalt. Anti-stoffene som kan benyttes ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved bruk av kjente metoder som beskrevet av Harlow et al. i "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY (1988).

Representative, monoklonale antistoffer er beskrevet i US 5 338 671. To slike monoklonale antistoffer oppnås lett av fagmannen ved bruk av konvensjonelle prosedyrer og utgangs-materialer inkluderer en av hybridomcellelinjene HB 11126 eller 11127, deponert hos American Type Culture Collection, ATCC, (Rockville, MD). Det monoklonale antistoff er til stede i en mengde fra 5:1 til 500:1 molforhold til DNA-polymerasen.

Antistoffer som er spesifikke mot den termostabile DNA-polymerase kan benyttes ifølge oppfinnelsen alene eller i kombinasjon med en eksonuklease og/eller en glykosylase som beskrevet i US-SN 08/385 019 med tittelen "Anvendelsen av eksonuklease og/eller glykosylase som supplement til anti-polymerase antistoff for å øke spesifisiteten ved polymerasekjedereaksjon". Den kombinerte bruk av et antistoff, en eksonuklease og en glykosylase reduserer dannelsen av null-syklus-artifakter. Egnede eksonukleaser for bruk i PCR inkluderer, men er ikke begrenset til, eksonuklease III, eksonuklease I, eksonuklease, T7 eksonuklease, ribonuklease II, polynukleotidfosforylase og BAL 31 nuklease. Slike eksonukleaser er kommersielt tilgjengelige eller kan oppnås på i og for seg kjent måte. Glykosylaser som kan benyttes ifølge oppfinnelsen er de som spesifikt spalter ikke-konvensjonelle baser, det vil si baser andre enn A, G, C eller T i DNA og A, G, C og U i RNA. Foretrukne glykosylaser omfatter uracil-N-glykosylase, UNG, hypoxantin-DNA-glykosylase og 3-metyadenin-DNA-glykosylaser I og II. I en foretrukken utførelsesform benyttes Taq-polymerase, et monoklonalt antistoff mot Taq-polymerase, eksonuklease III og uracil-N-glykosylase.

En målnukleinsyre (enten DNA eller RNA) kan oppnås fra en hvilken som helst av et antall kilder som angitt ovenfor. Generelt blir prøven behandlet på en eller annen måte for ågjøre DNA tilgjengelig for kontakt med primerne og andre PCR-reagenser. Dette betyr vanligvis fjerning av uønskede proteiner og cellulært materiale fra prøven ved bruk av en de forskjellige prosedyrer som er kjente i denne teknikk.

Fordi nukleinsyre som skal amplifiseres og detekteres ofte foreligger i dobbeltstrenget form, må de to strenger separeres (det vil si denatureres) før priming og amplifisering kan gjennomføres. Denatureringen kan gjennomføres ved bruk av varmebehandling alene eller i kombinasjon med hvilke som helst andre egnede fysikalske, kjemiske eller enzymatiske midler for separering av strengene som beskrevet i teknikken. Initial denaturering gjennom-føres vanligvis ved oppvarming av prøven som antas å inneholde målnukleinsyren ved en første temperatur fra 85°C til 100°C i et egnet tidsrom, for eksempel fra 1 sekund til 3 minutter.

De denaturerte strenger blir så avkjølt til en temperatur som generelt ligger i området 55°C til 70°C for priming av strengene. Den tid som er nødvendig for avkjøling av strengene etter initialdenatureringen vil variere avhengig av typen av apparatur som benyttes for PCR-prosessen.

Når første de denaturerte strenger er avkjølt til den andre temperatur, blir de denaturerte strenger innkubert sammen med reaksjonsblandingen inneholdende PCR-reagenser ved en egnet temperatur for å bevirke annelering (hybridisering) av primerne til strengene og forlengelse av primerne for å danne primerforlengelsesprodukter. Generelt er denne temperatur minst 50°C og fortrinnsvis i området 62°C til 75°C. Tiden for innkubering kan varierer innen vide grenser avhengig av innkuberingstemperatur og den ønskede lengde av forlengelsesproduktene, men i foretrukne utførelsesformer er tidsrommet fra 1 til 120 sekunder. Hver PCR-syklus kan gjennomføres ved bruk av en av to eller tre forskjellige temperaturer, en for denaturering og en andre eller tredje temperatur for priming og/eller primerforlengel-sesproduktdannelse.

På et hvilket som helst tidspunkt etter generering av minst et primerforlengelsesprodukt, kan amplifiseringen stanses og målprimerforlengelsesproduktet (det "amplifiserte" mål) detekteres. Hvis imidlertid de hybridiserte primerforlengelsesprodukter så denatureres, kan PCR gjennomføres videre i så mange sykler av priming, forlengelse og denaturering, som ønskelig. Antallet PCR-sykler som gjennomføres vil delvis avhenge av mengden amplifisert mål som ønskes og kan lett bestemmes av fagmannen. Generelt vil det gjennomføres minst 20 sykler, mens 20 til 50 sykler er foretrukket.

Ved amplifisering av multippel målnukleinsyrer, særlig der et av målene er et lavere kopi-antall mål og et er et høykopiantall mål, kan et andre renatureringstrinn gjennomføres etter at primær PCR-sykler er gjennomført, som beskrevet i US-SN 08/264 102 med tittelen "Fremgangsmåte for amplifisering ved bruk av mellomliggende renatureringstrinn." Etter minst 15 primæramplifiseringssykler (en primær amplifiseirngssyklus omfatter denaturering, priming og forlengelse), gjennomføres sekundær amplifiseirngssykler med de samme trinnene bortsett fra at det innarbeides et renatureirngstrinn etter hvert denatureirngstrinn og før primerannelering. Renaturering gjennomføres ved avkjøling av reaksjonsblandingen til en fjerde temperatur som beskrevet i US-SN 08/264 102.

Ifølge oppfinnelsen blir, etter at målnukleinsyren er amplifisert ved bruk av det ønskede antallet PCR-sykler, et etteramplifiserings-før-detekterings-innkuberingstrinn gjennomført for å inaktivere DNA-polymerasen og derved øke detekteringssensitiviteten. Betingelsene under hvilke etteramplifiserings-innkuberingstrinnet gjennomføres vil avhenge av det termostabile enzym som benyttes, men den kombinerte temperatur- og innkuberingsperiode vil være slik at enzymet inaktiveres. Fortrinnsvis blir dette etteramplifiserings-innkuberingstrinnet gjennomført ved innkubering av PCR-amplifiseringsblandingen inneholdende det amplifiserte mål ved en temperatur mellom 95°C og 120°C i mellom 1 sekund og 30 minutter. Fortrinnsvis involverer etteramplifiserings-innkuberingen oppvarming til en temperatur mellom 100°C og 110°C i 15 sekunder til 10 minutter, aller helst til en temperatur rundt 105°C i opptil 5 minutter.

Når først etteramplifiserings-innkuberingen er gjennomført, kan de amplifiserte nukleinsy-remål detekteres. Detekteringen kan gjennomføres på et antall måter, for eksempel som beskrevet i US 4 965 188. For eksempel kan de amplifiserte nukleinsyrer detekteres ved bruk av Southern-blot, dot-blot-teknikker eller ikke-isotopiske oligonukleotidinnfangsde-tektering med en merket probe. Alternativt kan amplifiseringen gjennomføres ved bruk av primere som er hensiktsmessige merket og de amplifiserte primerlengelsesprodukter kan detekteres ved bruk av prosedyrer og utstyr for detektering av merkelappen.

I en foretrukket utførelsesform blir den amplifiserte målnukleinsyre detektert ved bruk av en oligonukleotidprobe som er merket for detektering og direkte eller indirekte kan hybridiseres med det amplifiserte mål. Proben kan være oppløselig eller festet til en fast bærer. I en annen foretrukket utførelsesform blir en eller flere av primerne som benyttes for å amplifisere målnukleinsyren, merket, for eksempel med en spesifikk bindedel. Det resulterende primer-forlengelsesprodukt i hvilket den merkede primer er innarbeidet, kan fanges ved hjelp av probe. Detektering av det amplifiserte mål, hybridisert til proben, kan oppnås ved detektering av nærværet av den merkede probe eller merket, amplifisert mål ved bruk av egnet detekteringsutstyr og prosedyrer som velkjente i teknikken. Visse merkelapper kan være synlige for øyet uten bruk av detekteringsutstyr.

I ytterligere en utførelsesform blir en eller flere av primerne som benyttes for å amplifisere målnukleinsyren, merket med biotin, hvoretter de biotinylerte, amplifiserte målnukleinsyrer hybridiseres til prober som er festet til en fast bærer. De bundne mål detekteres så ved å bringe dem i kontakt med et streptavidin-peroksydase-konjugat i nærvær av et oksy-dasjonsmiddel, for eksempel hydrogenperoksyd, og et egnet, fargedannende preparat. For eksempel omfatter brukbare farge-givende reagenser tetrametylbenzidin og derivater derav, samt leuco-fargestoffer som triarylimidazol-leuco-fargestoffer som beskrevet i US 4 089 747.

Som her benyttet, angir uttrykket "ca." når det er snakk om tid ± 10% av denne tidsgrense. Når uttrykket benyttes i forbindelse med temperaturer, henviser uttrykket "ca." til ± 5°C.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen. Alle prosentandeler er på vektbasis, hvis ikke annet er sagt.

Materialer

Rekombinant DNA-polymerase fra Thermus aquaticus ble fremstilt ved bruk av kjente prosedyrer som beskrevet for eksempel i EP-A-0 482 714, og hadde en aktivitet på ca. 250 000 enheter/mg protein.

Primerne som ble benyttet i det følgende eksempel hadde de følgende sekvenser:

Innfangingsproben hadde følgende sekvens:

Primerne og probene som ble benyttet i de følgende eksempler ble fremstilt ved bruk av kjente utgangsstoffer og prosedyrer under anvendelse av en Applied Biosystems, modell 380B, tre-kolonne DNA-syntesizer ved bruk av standard fosforamidittkjemi og ABI \\ i molar skala, hurtig syklusprotokoll. Nuldeosid-3'-fosforarniditter og nukleosid-derivatiserte, kontrollert poreglassbærer, ble oppnådd fra Applied Biosystems.

Primerne hadde de ovenfor angitte sekvenser. De var funksjonalisert i 5-enden med to aminotetraetylenglykolspacere i henhold til US 4 962 029, fulgt av et enkelt, kommersielt tilgjengelig DuPont biotinfosforamiditt. Probene var funksjonalisert i 3'-enden med to tetraetylenglykolspacere fulgt av en enkelt aminodiol-forbindende gruppe i henhold til US 4 914 210. Alle rensinger ble gjennomført ved bruk av en nukleinsyre-rensekolonne, fulgt av reversfase-HPLC-teknikker. Deoksyribonukleotider, dNTPer, ble oppnådd fra Sigma Chemical Co.

En streptavidin-peroksydase-konjugatoppløsning ble benyttet og omfattet et kommersielt tilgjengelig (Sigma Chemical Co.) konjugat av streptavidin og pepperrotperoksydase, ka-sein (0,5%) og mertiolat (0,5%) i en fosfatbufret saltoppløsning (25 mmolar natriumfosfat og 75 mmolar natriumklorid). 10 mmolar 4'-hydroksyacetanilid ble satt til som konjugat-stabilisator. I eksemplene 1 og 2 var den endelig konjugatkonsentrasjon 1,1 nM. I eksempel 3 var den endelig konjugatkonsentrasjon 0,28 nM.

Cytomegalovirus, stamme AD 169 DNA, ble mottatt fra Applied Biotechnology Inc. Kort sagt ble DNA ekstrahert fra human forhudfibroblastcellelinjer ved bruk av konvensjonelle prosedyrer:

Leuco-fargestoffdispersjonene inneholdt agarose (0,5%), 4,5-bis(4-dimetylaminofenyl)-2-(4-hydroksy-3-metoksyfenyl)imidazol-leuco-fargestoff (250 umolar), dietylentriaminpenta-eddiksyre (100 umolar), 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid (5 mmolar), polyvinylpyrrolidon (112 mmolar) og natriumfosfat, monobasisk, 1-hydrat (10 mmolar) og hydrogenperoksyd (H2°2) (8.82 mmolar).

Vaskeoppløsningen (pH 7,4) inneholdt natriumklorid (373 mmolar), (etylendinitri-lo)tetraeddiksyredinatriumsalt (2,5 mmolar), decylnatriumsulfat (38 mmolar) og etylceritio-salicylsyre.natriumsalt (25 umolar) i natriumfosfat, monobasisk 1-hydratbuffer (25 mmolar).

Monoklonale antistoffer ble benyttet i reaksjonsblandingen. Disse antistoffer "TP1-12.2" og "TP4-9.2" er spesifikke mot DNA-polymerase fra Thermus acquaticus og er beskrevet i større detalj i US-SN 08/385 019 av 7. februar 1995 med tittelen "Use of Exonuclease and/or Glycosylase as Supplements to Anti-Polymerase Antibody to Increase Specificity in Polymerase Chain Reaction".

Polymerasekjedereaksjonsblandingen (75 ml) inneholdt tris(hydroksymetyl)aminometan-buffer (10 mmolar, pH 8), kaliumklorid (50 mmolar), magnesiumklorid (4 mmolar), dATP, dCTP, dGTP og dTTP (0,3 mM hver), primerne SEQ ID nr. 1 og SED ID nr. 2 (0,4 umolar hver), type IV gelatin (100 mg/ml), Taq-polymerase (16 enheter/100 ul) og glycerol (9,5%). Et femti ganger molart overskudd (over polymerase) av TP1-12.2 og et 5X overskudd av TP4-9.2 ble benyttet.

PCR-amplifisering ble gjennomført ved bruk av en automatisk PCR-prosessor som beskrevet i US 5 089 233.

For å danne innfangingsreagenser ble probene kovalent festet til polymerpartikler (midlere diameter 1 um), fremstilt ved bruk av konvensjonelle emulsjonspolymeriseringsteknikker, fra poly[styren-co-3-(p.-vinylbenzyltio)propionsyre] (vektforhold 95:5,1 um midlere diameter). En suspensjon av partiklene i vann ble vasket med 2-(N-morfolino)etansulfonsyre-buffer (0,1 molar, pH 6) og suspendert til ca. 10% faststoffer. 3,3 ml av en prøve av de vas-kede partikler, fortynnet til 3,33% faststoffer i bufferen (0,1 molar, ble blandet med 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (2,1 ml av 85 mg/ml vann) og proben 983 ul av 44,44 OD/ml nanorent vann). Den resulterende suspensjonen ble oppvarmet til 50°C i et vannbad i ca. 2 timer med intermittent blanding og så sentrifugert. Partiklene ble så vasket tre ganger med tris(hydroksymetyl)aminometanbuffer (0,01 molar, pH 8) inneholdende (etylenchnitrilo)tetraeddiksyredinatriumsalt (0,001 molar) og resuspendert i denne til 4% faststoffer. Partiklene ble så immobilisert i diskrete lokasjoner i Clinical Diagnostic's PCR-pose ved 2% faststoffer pluss lim. PCR-produktene ble detektert ved bruk av Clinical Diagnostic's Pouch detection system.

Andre reagenser og materialer ble oppnådd enten fra kommersielle kilder eller fremstilt ved bruk av lett tilgjengelige utgangsstoffer og konvensjonelle prosedyrer.

Etteramplifiserings- innkuberingstrinn før produktdetektering for øket detekteringssensitivi-tet

Eksempel 1

Dette eksempel viser oppfinnelsen med henblikk på å detektere nukleinsyreprodukter som er fremstilt ved bruk av PCR under anvendelse av etteramplifiserings-innkuberingstrinnet for å denaturere polymerasen.

Positive mengder ble oppnådd ved å amplifisere CMV-mål ved bruk av 40-45 sykler av den følgende PCR-protokoll:

1. Denaturering ved oppvarming til 95°C i 15 sekunder, og

2. Sykler av priming og forlengelse ved 70°C i 30 sekunder.

Produktkonsentrasjonen ble kvantifisert ved gelelektroforese med kjente konsentrasjoner av DNA-standarder. Den resulterende PCR-reaksjonsblanding ble så benyttet som beskrevet ovenfor.

I tillegg til å generere etter-PCR-reaksjonsblandingen, ble det fremstilt et CMV-negativt produktforråd ved å gjennomføre PCR-amplifisering på PCR-reaksjonsblandingen uten tilsetning av CMV DNA-mål ved bruk av den ovenfor angitte PCR-protokoll.

Etteramplifiserings-PCR-reaksjonsblandingen (10"<?> til 10~<8>m) ble fortynnet 1:100 til 1:5000 med CMV-negativt produktforråd for å oppnå en slutt-CMV DNA-konsentrasjon på 1 x 10'<10>M, 2,5 x 10-Hm eller 5 x lO-^M. Den fortynnede etteramplifiserings-PCR-reaksjonsblanding ble så underkastet en etteramplifiseirngs-innkubering for å deaktivere polymerasen. Etteramplifiserings-innkuberingstrinnet ble gjennomført i 2 minutter ved 97°C eller 100°C, eller i 5 minutter ved 100°C.

Etter etteramplifiserings-innkuberingen ble det amplifiserte produkt detektert ved å fange inn målnukleinsyren med innfangingsreagenser ved 58°C i 5 minutter i en Clinical Diag-nostic's PCR pouch. De fangede produkter ble så bragt i kontakt og innkubert sammen med streptavidinperoksydase-konjugatoppløsningen ved 55°C i 1 minutt. En vasking ble gjen-nomført ved bruk av vaskeoppløsningen i 1 minutt ved 55°C, hvoretter det farge-bringende preparat ble tilsatt og tillatt innkubering i 4 minutter ved 40°C. Det resulterende signal ble avlest med en linjemønsterscanner. Scanneren bestemte endringen i reflektansdensitet (ADr). ADr er differansen i reflektansdensitet mellom en første avlesning før initiering av fargestoff-fremkalling og en siste avlesning etter 4 minutters fargefremkalling. Scanner-bakgrunnen på visuelt negativt innfangskuler lå fra 0,05 til 0,1 Dr-enheter.

De følgende resultater viser at en etteramplifiseirngs-innkubering øker detekteringssensiti-vi teten:

Disse resultater viser at et 5-minutters etteramplifiserings-innkubeirngstrinn ved 100°C øker den effektive detekteringsgrense over bakgrunnen med en faktor 4 og sannsynligvis med en faktor minst 5. Basert på disse resultater og særlig forbedringen ved å øke inkuba-sjonsperioden ved 100°C fra 2 til 5 minutter, ble det gjennomført et andre forsøk med en 15 minutter etteramplifiserings-innkubering ved 100°C.

Eksempel 2

I dette andre forsøk ble amplifiseringen av CMV DNA gjennomført som beskrevet i eksempel 1. Den resulterende etteramplifiserings-PCR-reaksjonsblanding ble fortynnet med et CMV-negativt produktforråd og underkastet en etteramplifiserings-innkubering for å inaktivere polymerasen som beskrevet i eksempel 1. Etteramplifiserings-innkuberingstrinnet ble gjennomført i 15 minutter ved 100°C. Etter etteramplifiserings-innkuberingen ble det amplifiserte produkt detektert som beskrevet i eksempel 1.

De følgende resultater viser at et etteramplifiserings-innkuberingstrinn øker detekteringssensitiviteten:

Disse resultater antyder at økningen av etteramplifiserings-innkuberingstiden ved 100°C gir ytterligere fordeler.

Eksempel 3

For å bestemme hvorvidt den ytterligere detekteringssensitivitetsfordel kunne oppnås ved å øke innkuberingstemperaturen, ble amplifisering av CMV DNA gjennomført som beskrevet i eksempel 1 og underkastet etteramplifiserings-innkubering ved 100°C eller 103°C. Forskjellige innkuberingstider ble undersøkt ved 103°C. I tillegg ble dette forsøk gjennom-ført med en mindre sensitiv detekteringskjemi som hadde en slutt-konjugatkonsentrasjon på 028 nM. Resultatene av dette forsøk var:

Disse resultater viser at minst en ytterligere økning med en faktor 2 og muligens en faktor 3, kan oppnås ved å øke etteramplifiserings-innkuberingstrinntemperaturen fra 100°C til 103°C og å beholde en innkuberingsperiode på 5 minutter.

Claims (22)

1. Fremgangsmåte for amplifisering og detektering av en målnukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter: (v) å bringe en prøve man antar inneholder nevnte målnukleinsyre i kontakt med minst to oligonukleotider og et termostabilt amplifiseringsenzym, der nevnte minst to oligonukleotider er i det vesentlige komplementære til en del av målnukleinsyren, under betingelser slik at målnukleinsyren kan amplifiseres; (vi) å amplifisere nevnte målnukleinsyre; (vii) å innkubere prøven i en tidsperiode på mellom 1 sekund og 30 minutter ved en temperatur på mellom 105 °C og 120 °C, som et post-amplifiserings-innkuberingstrinn, for å inaktivere nevnte termostabile amplifiseirngsenzym; og (viii) å detektere nærværet eller fraværet av nevnte amplifiserte målnukleinsyre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det benyttes fire oligonukleotider og en termostabil DNA ligase.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinn (i) omfatter å bringe en prøve man antar inneholder nevnte målnukleinsyre i kontakt med fire ulike nukleosidtirfosfater, en termostabil DNA polymerase og to primere, hvori nevnte primere er i det vesentlige komplementære med målnukleinsyren under betingelser slik at målnukleinsyren kan amplifiseres;

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at nevnte post-amplifisermgs-innkubeirngstrinn utføres i en tidsperiode på mellom 15 sekunder og 10 minutter, foretrukket i en periode på mellom 0.5 minutter og 5 minutter, ved en temperatur på mellom 105 °C og 120 °C.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at nevnte post-amplifiserings-innkuberingstrinn utføres ved en temperatur på mellom 110 °C og 120 °C

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at nevnte post-amplifiserings-innkuberingstrinn utføres i en tidsperiode på mellom 15 sekunder og 10 minutter, foretrukket i en periode på mellom 0.5 minutter og 5 minutter, ved en temperatur på omtrent 105 °C.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at målnukleinsyren er DNA eller RNA.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at målnukleinsyren er DNA.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at målnukleinsyren er RNA.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nukleosidtrifosfatene er deoksyribonukleosidtrifosfa-ter.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nukleosidtirfosfatene er dATP, dCTP, dGTP og dTTP.

12. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den termostabile DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av thermus aquaticus polymerase, thermus thermophilus polymerase og thermococcus litoralis polymerase.

13. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at minst en av nevnte primere er merket.

14. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte primere er merket.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13 eller 14, karakterisert ved at minst en av nevnte primere er merket med en spesifikk bindingsligand.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at den spesifikke bindingsligand er biotin.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte amplifiserte målnukleinsyrer detekteres ved bruk av en merket probe som kan hybridisere med en av den ene eller de flere målnukleinsyrene.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at den merkede probe er festet til en fast bærer.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst en av nevnte primere er merket med en spesifikk bindingsdel og at nevnte amplifiserte målnukleinsyrer detekteres ved bruk av en probe som kan hybridisere med en av den ene eller de flere målnukleinsyrene.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at proben er festet til en fast bærer.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven man antar inneholder en målnukleinsyre bringes i kontakt med fire forskjellige nukleosidtrifosfater, en termostabil DNA polymerase, og to primere, der minst en av nevnte primere er merket med biotin og nevnte primere i det vesentlige er komplementære til målnukleinsyren, og at prøven innkuberes i en tidsperiode på mellom 0.5 minutter og 5 minutter ved en temperatur på omkring 105 °C, og tilstedeværelse eller fravær av biotinylerte amplifiserte målnukleinsyrer detekteres ved å reagere nevnte biotinylerte amplifiserte målnukleinsyrer med et avidin-enzym konjugat etterfulgt av en reaksjon med nevnte enzym og et substrat reagens for å gi et detekterbart, kolorimetrisk eller kjerniluminescent signal.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at de biotinylerte, amplifiserte målnukleinsyrer detekteres ved å bringe dem i kontakt med et avidinperoksidasekonjugat, etterfulgt av reaksjon mellom peroksydase, i nærvær av en ok-sidant, med enten: luminol for å gi et detekterbart kjerniluminescent signal, eller et leuko-fargestoff for å gi et detekterbart, kolorimetrisk signal.