JP2968585B2 - 高温度逆転写酵素 - Google Patents

高温度逆転写酵素

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分子生物学の分野に関連し、リボ核酸（RN
A）配列の複写および増幅のための改良された方法を提
供するものである。好ましい実施態様において、本発明
は、熱活性（thermoactive）DNAポリメラーゼを使用す
るRANテンプレートからの相補的複写物の合成方法を提
供する。別の側面において、本発明は、熱活性DNAポリ
メラーゼを使用するRNAテンプレートからのDNA分節の増
幅方法を提供する。
「逆転写酵素」なる用語は、RNA−依存性DNAポリメラ
ーゼとして特徴付けられるポリメラーゼの種類を記述す
るものである。公知のすべての逆転写酵素は、RNAテン
プレートからDNA転写物を合成するためにプライマを必
要とする。歴史的には、逆転写酵素は、初期においてmR
NAをcDNAに転写するために使用され、このcDNAは、更に
操作するためのベクター中にクローン化され得る。
トリ筋芽細胞腫ウイルス（AMV）逆転写酵素が、最初
に広く使用されたRNA−依存性DNAポリメラーゼであった
（Verma、1977、Biochem.Biophys.Acta 473:1）。核酵
素は、５′−３′RNA−方向性DNAポリメラーゼ活性、
５′−３′DNA−方向性DNAポリメラーゼ活性、およびRN
aseH活性を有している。RNaseHは、RNA−DNAハイブリッ
ドのRNA鎖に対して特異的な前進的５′および３′リボ
ヌクレアーゼである（Perbal、1984、Ａ Practical G
uide to Molecular Cloning,Wiley ＆ Sons New
York）。公知のウイルス性逆転写酵素は、校正に必要
な３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠いているため
に、転写における誤りを逆転写酵素により正すことはで
きない（SaundersおよびSaunders、1987、Microbial G
enetics Applied toBiotechnalogy、Croom Helm、Lo
ndon）。AMV逆転写酵素の活性およびそれに伴われるRNa
seH活性の詳細な研究は、Bergerらの、1983、Biochemis
try 22:2365−2372によって示されている。
Bergerらは、RNA転写における律速段階が、付加的ヌ
クレチオド類の連続する重合よりむしろ転写反応の開始
にあることを見出した。この制限を克服するために、触
媒量よりむしろ化学量論的量の逆転写酵素の使用がしば
しば推奨されている（Buellらの、1978、J.Biol.Chem．
253:2471−2482;Wickenらの、1978、J.Bio.Chem．253:2
483−2495;Yooらの、1982、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
0:1194−1198;ならびにOkayamaおよびBergの、1982、Mo
l.Cell.Biol．２:161−170）。しかしながら、化学量論
的量の逆転写酵素を使用した場合、低水準のRNaseH活性
が有意なものとなって、断片化cDNAの原因となり制限さ
れたcDNA収率をもたらすであろう。Christopherらの198
0、Eur.J.Biochem．111:4190−4231、およびMichelson
らの、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:472−476
は、cDNA反応物中にRNase阻害剤を含めることで、この
問題が緩和されることを示唆した。
E.cali等の中温微生物から単離されたDNAポリメラー
ゼは、広く研究されている（例えば、Bessmanらの、195
7、J.Biol.Chem．233:171−177;ならびにButtinおよびK
ornbergの1966、J.Biol.Chem．241:5419−5427参照）。
E.coli DNAポリメラーゼＩ（Pol I）は、ニック−ト
ランスレーション反応、DNA配列決定、インビトロ変異
生成、第２鎖cDNA合成、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
およびリンカ連結のための平滑末端形成等を含む数多く
の応用に有用である（Maniatisらの、1982、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Har
bor,New York）。
いくつかの研究室は、ある種のDNAポリメラーゼはイ
ンビトロにおけるRNAの逆転写が可能であることを示し
ている（Karkasの、1973、Proc.Nat.Acad.Sci.USA，71:
1035−1039;ならびにWittigおよびWittigの、1978、Nu
c.Acid Res．５:1165−1178）。Gulatiらは、E.coli
Pol Iが、オリゴ（dT）10をプライマとして使用してＱ
βウイルス性RNAを転写するために使用され得ることを
見出した。WittigおよびWittigは、E.coli Pol Iが、
オリゴ（dA）を用いて酵素的に延長されたtRNAを逆転写
するために使用され得ることを示した。しかしながら、
Gulatiらが示したように、必要な酵素量および小さいcD
NA生成物は、E.coli Pol Iの逆転写酵素活性が実際的
な価値をほとんど持たないことを示唆している。
存在する核酸配列を、その最初に存在する量に比べ大
量に増幅するための熱安定性酵素の使用は、ポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）工程が記述されている米国特許第4,6
83,195号および第4,683,202号に記載されている。これ
らの特許を、ここに参考として組入れる。プライマ類、
テンプレート、ヌクレオシドトリホスフェート類、適当
な緩衝液および反応条件、ならびにポリメラーゼが、PC
R工程においては使用され、これは標的DNAの変性、プラ
イマ類のハイブリッド形成、および相補鎖の合成を含
む。各プライマの伸長生成物は、所望の核酸配列の生成
のためのテンプレートになる。これらの特許には、使用
されるポリメラーザが熱安定性酵素である場合に、熱に
よって該ポリメラーゼ活性が破壊されないことから、各
変性工程の後にポリメラーゼを追加する必要がないこと
が開示されている。
熱安定性DNAポリメラーゼは、例えばPCRによるDNA増
幅の実施におけるような短時間について、93−95℃に加
熱された場合にも恒久的に不活性化されることはない。
これと対照的に、この昇温下では、E.coli DNA Pol I
および従来記述されている逆転写酵素は、不活性化され
る。
Thermus aquaticus（Taq）由来の熱安定性DNAポリメ
ラーゼは、ここに参考として組入れるLawyerらの1989、
J.Biol.Chem．246:6427−6437ならびに米国特許第4,88
9,818号および同時に係属する1988年１月12日出願の出
願番号第143,441号に記述されているように、クローン
化され、発現され、組換え細胞から精製されている。T.
aquaticusから単離された粗製のDNAポリメラーゼ活性調
製物は、他にも記述がある（Chienらの、1976、J.Bacte
riol．127:1550−1557およびKaledinらの、1980、Bioky
miya45:644−651）。
Thermus thermophilus（Tth）由来の熱安定性DNAポ
リメラーゼも精製され、ここに参考として組入れる1989
年12月20日出願の、本願と共通して譲渡された係属中の
出願番号第455,967号に記述されている。該′967特許出
願には、Thermus thermophilis由来のTth DNAポリメ
ラーゼ酵素をコードする遺伝子が同定され、クローン化
されたことも記述されている。組換えTthは、熱安定性
酵素の調製について別法を提供する。Thermotoga mari
tima由来の熱安定性DNAポリメラーゼは、ここに参考と
して組入れる1990年８月13日出願の同時係属中の代理人
整理番号第2570号に記述されている。
PCRは、増幅のために核酸テンプレートおよび適当な
プライマ類を必要とする。増幅されるべきDNAは、プラ
スミド中に含まれるか、または不均質試料中に含まれる
合成的または遺伝子的なものであってもよい。増幅され
るべきヌクレオチド配列がRNAである場合には、該核酸
分子は最初にプライマの存在下で逆転写酵素により処理
され、増幅のためのcDNAテンプレートが与えられる。本
発明以前においては、RNAの増幅は、例えばモロニーネ
ズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Mo MuLV RT）または
AMV−RT等を用いた逆転写工程を必要とし、次いで得ら
れた単鎖cDNAのDNAポリメラーゼを用いた処理が行われ
た。RNAの増幅は、単一の酵素を用いたRNAの逆転写およ
びDNAの増幅のための方法が利用可能であることにより
かなり単純化され得る。
本発明は、この要求に向けられたもので、熱活性DNA
ポリメラーゼによる高温度cDNA合成を提供する。本発明
は、また唯一つの酵素である熱安定性DNAポリメラーゼ
のみを必要とするRNA配列の効率的増幅方法を提供す
る。これらの方法は、現在知られている方法より単純か
つ増大した特異性をもたらす。
一側面において、本発明は、RNAテンプレートの逆転
写方法を提供するもので、該方法は、前記RNAテンプレ
ートを含む試料を、前記RNAテンプレートに対してこれ
にハイブリッドするために充分に相補的であるオリゴヌ
クレオチドプライマ、および熱活性DNAポリメラーゼと
共に、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
ト類の存在下、適切な緩衝溶液中において、前記プライ
マが前記RNAテンプレートにハイブリッドし、かつ前記
熱活性DNAポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシ
ドトリホスフェートの重合反応に対して触媒作用して前
記RNAテンプレートの配列に対して相補的なcDNA配列を
形成するために充分な温度にて処理することを含んでい
る。
別の面において、本発明は、RNAテンプレートの増幅
方法を提供するもので、該方法は、（ａ）試料を、標的
RNAに対してこれにハイブリッドするために充分に相補
的である第１のプライマ、および熱活性DNAポリメラー
ゼと共に、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェート類の存在下、適切な緩衝溶液中において、前記第
１のプライマが前記標的RNAにハイブリッドし、かつ前
記熱活性DNAポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートの重合反応に対して触媒作用して
前記標的RNAの配列に対して相補的なcDNA配列を形成す
るために充分な温度にて処理し；（ｂ）工程（ａ）で形
成された前記cDNAを処理して単鎖cDNAを与え；（ｃ）工
程（ｂ）で形成された前記単鎖cDNAを、少なくとも一つ
の単鎖cDNA分子にハイブリッド可能であり、かつ熱安定
性DNAポリメラーゼの存在下、二重鎖cDNA分子の生成に
適切な条件のもとに伸長生成物の合成開始を可能とする
第２のプライマと共に処理し；ならびに（ｄ）工程
（ｃ）の二重鎖cDNA分子をポリメラーゼ連鎖反応により
増幅することを含んでなる。
また別の面において、本発明は、生物学的試料中の特
定の標的RNA配列の検出方法を提供するもので、該方法
は、（ａ）前記試料を、前記標的RNAに対してこれにハ
イブリッドするために充分相補的であるプライマ、およ
び熱活性DNAポリメラーゼと共に、４種のデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、適切な緩衝
溶液中において、前記プライマが前記標的RNAにハイブ
リッドし、かつ前記熱活性DNAポリメラーゼが前記デオ
キシリボヌクレオシドトリホスフェートの重合反応に対
して触媒作用して前記標的RNA配列に対して相補的なcDN
A配列を形成するために充分な温度にて処理し；（ｂ）
工程（ａ）で形成されたcDNAを処理して単鎖cDNAおよび
RNAテンプレートを与え；ならびに（ｃ）前記cDNAの存
在を検出することを含んでなる。
本発明の別の側面において、Tth DNAポリメラーゼ
が、組換え宿主細胞から精製される。該精製蛋白質は、
一般的にはDNAポリメラーゼとして機能し、また好まし
い実施態様において逆転写酵素として機能する。
図１は、MgCl2およびMnCl2緩衝溶液中における、E.co
li Pol I、TaqおよびMoMuLV逆転写酵素の逆転写酵素活
性の比較を示すグラフである。
図２は、Tthポリメラーゼ、94kDa rTaqDNAポリメラ
ーゼ、およびAmpliTaqTMDNAポリメラーゼ、Stottel断片
（62kDa rTaqとも称される）により触媒作用を受け
る、種々のMn2+濃度におけるRNAテンプレートの逆転写
を比較するグラフである。
図３は、例Ｖに記述される結合RT/PCRアッセイの結果
を示す図である。
図４は、種々の量の全細胞RNAを使用した例VIに記述
される結合RT/PCRアッセイの結果を示す図である。
図５は、RTおよびPCRアッセイに別の熱安定性酵素を
使用したRT/PCRアッセイの結果を示す図である。
本発明は、RNAを効率的に転写し、増幅する改良され
た方法を提供するものである。これらの改良は、熱活性
DNAポリメラーゼの従来未知であった性質の発見および
応用によって達成される。該方法は、任意の所望のRNA
標的の逆転写および増幅について単一酵素法を提供する
もので、一種より多い酵素を必要とする従来方法に取っ
て替わるものである。
該方法は、前記RNAテンプレートを含む試料を、前記R
NAテンプレートに対してこれにハイブリッドするために
充分相補的であるプライマ、および熱活性DNAポリメラ
ーゼと共に、４種すべてのデオキシリボヌクレオキシド
トリホスフェート類の存在下、適切な緩衝溶液中におい
て、前記プライマが前記RNAテンプレートにハイブリッ
ドし、かつ前記熱活性DNAポリメラーゼが前記デオキシ
リボヌクレオシドトリホスフェートの重合反応に対して
触媒作用して前記RNAテンプレートの配列に対して相補
的なcDNA配列を形成するために充分な温度にて処理する
ことを含んでなる。本発明に従うと、該DNAポリメラー
ゼは、熱活性であると共に熱安定性であることができ
る。
別の面において、RNAテンプレートへのアニール化に
適したプライマは、PCRによる増幅にも好適である。PCR
のために、逆転写されたcDNA鎖に相補的な第２のプライ
マは、伸長生成物の合成の開始部位を与える。周知のよ
うに、熱安定性DNAポリメラーゼは、DNAテンプレート上
にてこの伸長反応に対して触媒作用可能である。しかし
ながら、本発明以前においては、該酵素がRNA依存性逆
転写反応にも触媒作用をし得ることを何人も認識しなか
った。
熱活性DNAポリメラーゼによるRNA分子の増幅において
は、最初の伸長反応はRNAテンプレートを使用する逆転
写であって、DNA鎖が生成される。DNAテンプレートを使
用する第２の伸長反応は、二重鎖DNA分子を生成する。
かくして、熱活性DNAポリメラーゼによるRNAテンプレー
トからの相補的DNA鎖の合成は、増幅のための出発材料
を与える。
本発明の別の面において、熱安定性DNAポリメラーゼ
は、結合された、一酵素の逆転写／増幅反応において使
用され得る。
本発明は、試料中のRAN標的分子検出のための単純化
され、かつ改良された方法を提供する。これらの方法
は、逆転写、第２鎖cDNA合成、および所望によりPCRに
より増幅について触媒作用されるために熱安定性DNAポ
リメラーゼを使用する。かくして本発明は、従来方法が
２種類必要としていた酵素を１種類のみ必要とする方法
を提供する。従来方法は、各工程に異なった酵素を使用
することにより必要とされる２組の熟成条件をも要し
た。本発明の方法は、従来のRNAクローニングおよび診
断方法に比べ、特異性が有意に増大し、かつ工程がより
少ないRNAの転写および増幅方法を提供する。これらの
方法は、研究室または臨床分析のためのキットにおける
使用にも適用できる。
本発明は、多くの供給源由来のRNAの転写および増幅
に好適である。RNAテンプレートは、例えばウイルスま
たは細菌核酸調製物等の生物由来の核酸調製物中に含ま
れてもよい。該調製物は、細胞破砕物、およびその他の
成分、精製全RNAまたは精製mRNAを含んでもよい。RNAテ
ンプレートは、試料中の異種RNA分子の母集団または特
定の標的RNA分子であってよい。
本発明方法における使用に適したRNAは、特定の標的R
NAを含むと予想される生物学的試料に含まれていてもよ
い。該生物学的試料は、例えば血液試料または生組織試
料等のRNAが試料の微少部分であるような異種的試料で
あってもよい。従って、該方法は、臨床的検出および診
断のために有用である。該RNA標的は、特定の疾患また
は感染性物質の指示物質であってもよい。
RNAは、種々の方法により調製され、その選択は試料
供給源および利用可能性に依存するであろう。RNAの調
製方法は、Davisらの、1986、Basic Methods in Mol
ecular Biology、Elsevier、NY、第11章;Ausubelら
の、1987、Current Protocolsin Molecular Bialog
y、第４章、John Wiley and Sons、NY;Kawasakiおよ
びWangの1989、PCR Technology、Erlich編、Stockton
Press NY;Kawasakiの1990、PRC Protocols:A Guid
e to Methods and Applications、Innisら編、Acad
emicPress、San Diego;ならびにWangおよびMarkの、19
90、PCR Protocols:A Guide to Methods and App
lications、Innisら編,Academic Press、San Diegoに
記述されており、これらをここに参考として組入れる。
例示的実施態様において、RNAテンプレートは、イン
ビトロでT7RNAポリメラーゼ転写によりDNAテンプレート
から合成された。cRNAと称される得られたRNAテンプレ
ートは、ゲル電気泳動またはオリゴ（dT）クロマトグラ
フィー等を含む種々の手段により精製され得る（ここに
参考として組入れる、Wangらの、1989、Proc.Natl.Aca
d.Sci.86:9717、および共通して譲渡されている係属中
の米国特許出願第413,623号（1989年９月28日出願）を
参照）。
本発明方法の第１の工程は、RNAテンプレートが適切
なプライマと結合することを必要とする。ここで使用さ
れているように、「プライマ」なる用語は、プライマ伸
長生成物の合成が開始される条件下、すなわち、４種の
異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび熱安定性酵
素の存在下で適切な緩衝溶液（「緩衝溶液」は、pH、イ
オン強度、補因子等を含む）中、適切な温度において、
核酸テンプレートにアニール化した場合にDNA合成の開
始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。開示
される方法の工程（ａ）において好適なプライマは、RN
Aテンプレートにハイブリッドし得る。特定のRNA標的分
子に対して充分に相補的な配列を有するプライマは、も
し存在する場合には、特定の標的RNA分節に対して相補
的な第１のcDNA鎖の合成開始のために使用され得る。該
プライマは、熱安定性酵素の存在下、伸長生成物の合成
を開始するために充分な長さを有する。該プライマは、
オリゴ（dT）等のオリゴデオキシリボヌクレオチドであ
ってもよい。
オリゴ（dT）は、mRNA類のポリアデニル化（ポリＡ）
配列にハイブリッドし、mRNA類の異種的母集団からのcD
NA合成のプライマを提供する。ほとんどの真核性mRNA
は、３′末端にポリＡ配列を含むため、オリゴ（dT）プ
ライマは、本発明方法において一般的な用途、例えばcD
NAライブラリの調製等における用途を有している。
該プライマは、典型的には10−35個のヌクレオチドを
含むが、厳密な個数は、本方法の成功裏の応用について
臨界的なものではない。短いプライマ分子は、テンプレ
ートと充分安定なハイブリッド複合体を形成するために
はより低温度を必要とする。オリゴ（dT）プライマにつ
いては、開示された方法に従うと、高温度cDNA調製のた
めには長さ16−21個のヌクレオチドのものが好適である
が、プライマ−テンプレート二重体に増大した安定性を
与えてオリゴ（dT）プライマを伸長するために、準至適
温度において初期熟成に付すことが好ましいであろう。
例えば、高温度に対して好ましい方法においては、オリ
ゴ（dT）16-21を用いる逆転写は、室温での10分間の熟
成、続いて42℃での10分間、最終的に70℃の2.5分間の
熟成を含む。別法として、低温度の熟成を、鎖長を増大
したオリゴ（dT）（すなわちオリゴ（dT）35-45）を使
用することにより避けることができる。本発明の例にお
いて、プライマ類は、ヒトサイトカイン類インターロイ
キン−１−アフルァ（IL−１α）またはインターロイキ
ン−２−ベータ（IL−１β）をコードするmRNA分子の一
部分に相補的なDNAである。いくつかの例において、該c
DNAプライマは、合成RNAテンプレート（cRNA）にハイブ
リッドする。
合成オリゴヌクレオチドは、Matteucciらの1981、J.A
m.Chem.Soc.103:3185−3191のトリエステル法を使用し
て調製され得る。別法として、例えばシアノエチルホス
ホラミダイト化学を用いるBiosearch 8700 DNA合成装
置による自動合成が好ましい。
プライマ伸長が起こるためには、このプライマがRNA
テンプレートにアニールしなければならない。逆転写が
起こるために、該プライマのすべてのヌクレオチドがテ
ンプレートにアニールする必要はない。該プライマ配列
は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。
例えば、非相補的断片をプライマの５′末端に結合し、
該プライマの残部がRNAに相補的であるようにしてもよ
い。別法として、該プライマ配列が、ハイブリッドが起
こり、かつ相補的DNA鎖の合成を許容するために充分にR
NAテンプレートに相補的である限り、該プライマ中に非
相補的塩基を散在させることができる。
cDNA調製の従来方法は、プレアニール化工程を必要と
した。該RNAテンプレートの２次および３次構造の不安
定化が、該プライマのRNAへのハイブリッドを許容する
ために必要であろう。一般にアニール化は、種種の手段
により達成され、アニール緩衝溶液の存在下で常法によ
り行われる。Maniatisら（前出文献）は、アニール緩衝
溶液の例を与えている。アニール化方法は、限定される
ものではないが、高温度で短時間、RNA/プライマ混合物
を熟成し、次いで段階的に冷却するか、またはドライア
イス／エタノール浴中で該混合物を急冷することを含
む。鎖の２次構造相互作用がcDNA合成またはプライマの
アニール化に干渉することを防止するために、逆転写に
先立って使用される低温度において、ある研究者らは、
RNAテンプレートをメチル水銀ヒドロキシド等の化学変
性剤により処理することにより修飾した（BailyおよびD
avidsonの、1976、Anal.Biochem．70:75）。しかしなが
ら、このような変性剤は一般に極めて有毒な発癌性化合
物であり、また酵素阻毒を避けるために注意深く除去し
なければならない。
本発明によれば、逆転写を起こさせるために該プライ
マはテンプレートにアニール化しなければならないが、
別個のアニール化工程は必要でない。熱活性逆転写酵素
活性は、厳密なアニール化に好適な高温度においても不
可逆的に変性されることがないため、該ポリメラーゼ酵
素の添加に先立って、変性されたテンプレートの急冷ま
たは段階的冷却を行なう必要がない。従来方法は、加熱
され、変性されたRNAを酵素活性と両立する条件、通常3
7℃−42℃を与えるために、温度低域中にアニール化プ
ライマ−テンプレート構造が維持されるように冷却する
必要があった。本発明は、RNAの高温度逆転写方法を提
供し、プレ−アニール化工程および化学的変性剤の使用
を除くものである。本発明のこの側面は、例Ｖ−VIIに
例示される。
本発明方法では、アニール化プライマ−RNAテンプレ
ートの逆転写が、熱活性または熱安定性DNAポリメラー
ゼにより触媒作用を受ける。ここにおいて使用される
「熱安定性ポリメラーゼ」なる用語は、熱安定性または
熱耐性であり、デオキシリボヌクレオチドの重合化に触
媒作用して、核酸鎖に相補的なプライマ伸長生成物を形
成する酵素を指す。ここで有用な熱安定性DNAポリメラ
ーゼ類は、PCR増幅において単鎖核酸の不安定化または
二重鎖核酸の変性を生じさせるために必要な時間、上昇
温度に付した場合にも不可逆的に不活性化されない。酵
素の不可逆的変性とは、酵素活性の実質的欠損を指す。
熱安定性DNAポリメラーゼは、好ましくは重合条件下、
約90−100℃において不可逆的に変性しないであろう。
本発明の別の面において、高温逆転写のためのDNAポ
リメラーゼが熱活性であることのみが本質的である。こ
こにおいて使用される「熱活性ポリメラーゼ」なる用語
は、60℃以上の温度においてデオキシリボヌクレオチド
の重合反応に触媒作用して、核酸テンプレート鎖に相補
的なプライマ伸長生成物を形成することができる酵素を
指す。本発明によると、逆転写について熱活性ポリメラ
ーゼは50℃以上で最大活性を有する。該熱活性DNAポリ
メラーゼは、RNA不安定化およびプライマアニール化の
条件下で、50℃−80℃の温度において不可逆的に変性し
ない。示される例において、熱活性DNAポリメラーゼは
熱安定性でもある。しかしながら、熱活性の非熱安定性
酵素も本発明の実施のために適している。RNAテンプレ
ートからのcDNAの調製は、上昇された温度における反復
する変性サイクルを含まないため、該方法に有用な酵素
が熱活性であることに加えて熱安定性であることは本質
的でない。
開示される方法は、一つのRNAテンプレートから多く
のcDNA転写物を調製するために有用である。このような
用途のためには、熱安定性DNAポリメラーゼが好まし
い。加えて、高温度逆転写のための開示される方法が、
PCRと結合される場合には、熱安定性DNAポリメラーゼ類
が好ましい。
加熱条件は、緩衝溶液、塩濃度、および変性される核
酸に依存するであろう。当然であるが、mRNAの逆転写に
ついては、該テンプレート分子が一般に単鎖であり、従
って高温度変性工程が不要であることが認識されるであ
ろう。しかしながら、二重鎖RNAも記述される逆転写／
増幅方法のために好適なテンプレートを提供する。二重
鎖RNAテンプレートは、例えばレオウイルス、ブルータ
ングウイルス、コロラドチック熱ウイルス、および殺酵
母因子を含む。
RNA不安定化の温度は、典型的には50−80℃の範囲に
ある。プライマ伸長の第１サイクルは、前述した変性お
よび増幅のために好適な二重鎖テンプレートを与える。
核酸変性のための温度は、核酸長、塩基成分および試料
中に存在する単鎖配列間の相補性に依存し、典型的には
0.5−４分間である変性が起こるために充分な時間につ
いて、典型的には約90−約105℃の範囲にある。
熱安定性または熱活性NDAポリメラーゼは、約40℃以
上、例えば60−80℃の温度に至適活性を有することが好
ましい。42℃よりかなり高温度においては、熱安定性ま
たは熱活性DNAポリメラーゼ以外のDNAおよびRNA−依存
性ポリメラーゼは、不活性化される。ShimomaveおよびS
alvatoの、1989、Gene Anal.Techn．６;25−28は、AMV
−RTが42℃で最高の活性を有することを記述している。
該酵素は、50℃において50％の活性を有し、また55℃に
てAMV−RTは活性の至適水準のわずか10％を維持する。
かくして、AMV−RTは、RNAテンプレートを使用する高温
度重合反応の触媒には不適当である。本発明方法のみが
熱活性DNAポリメラーゼを用いる高温度逆転写方法を提
供する。
プライマのテンプレートへのハイブリッド形成は、プ
ライマの成分および長さに加え、塩濃度に依存する。熱
安定性または熱活性ポリメラーゼを使用する場合、ハイ
ブリッド形成は、プライミングの増大した選択性および
／またはより高い厳格性のために好ましい高温度（例え
ば45−70℃）にて起こり得る。該ポリメラーゼ酵素に対
する高温度の至適条件は、RNA転写および引続く増幅
が、プライマハイブリッド形成の選択性のためより高い
選択性をもって進行することを可能とする。好ましく
は、RNA逆転写の至適温度は、約55−75℃、更に好まし
くは65−70℃の範囲にある。
本発明は、増大したプライマ依存特異性を有する、熱
安定性DNAポリメラーゼにより触媒作用を受けるRNAテン
プレートの逆転写方法に提供する。開示されるこの方法
は、従来方法に対してRNAの逆転写について改良されて
いる。これらの方法は、RNA/cDNAハイブリッド中間体分
子を介してRNA分節の増幅を与える。該ハイブリッド分
子は、PCRによる増幅のためのテンプレートとして好適
である。かくして逆転写と増幅反応とが結合される。従
来のRNA増幅方法は、増幅反応開始に先立って、逆転写
酵素の存在下、37℃−42℃においてRNA/プライマ混合物
の熟成を必要とする。本発明によってのみRNA増幅の酵
素的工程のすべてが、熱安定性DNAポリメラーゼにより
触媒作用を受ける。Taqポリメラーゼの商業的入手可能
性、および開示されたTthポリメラーゼの調製方法によ
ってPCRにもたらされた優位点は、ここに開示される方
法によって、逆転写、RNA検出、cDNA調製および結合さ
れたRNAの逆転写/cDNA増幅に適用可能である。
PCRによるDNA増幅方法は、知られており、また米国特
許第4,683,202号に記述されている。本発明により与え
られる優位点の理解を容易にするために、PCRの要点を
示す。PCRは、増幅すべき二重鎖標的核酸配列にハイブ
リッドする２つのプライマを要する。PCRにおいて、こ
の二重鎖標的配列は変性され、一つのプライマが変性標
的の各鎖にアニール化される。該プライマ類は、標的核
酸の互いに離れた部位に、プライマの伸長生成物がその
相補体から分離された場合に他方のプライマとハイブリ
ダイズ可能となる配向をもってアニール化する。一旦、
所定のプライマが標的配列にハイブリッドした後は、該
プライマがDNAポリメラーゼの作用により伸長される。
次いで、該伸長生成物が、標的配列から変性され、そし
て工程が反復される。
この工程の継続サイクルにおいて、先のサイクルで生
成された伸長生成物は、DNA合成のプライマとして作用
する。第２サイクルの開始において、増幅生成物の対数
的速度での蓄積が始まる。増幅生成物は、第１のプライ
マの配列を含み、最終的に第２のプライマに相補的な配
列となる第１の鎖、および該第１の鎖に相補的な第２の
鎖とを含んでなる。
PCR工程によって莫大な増幅が可能であることから、
高いDNA水準の試料由来の少量水準のDNA、正の対照テン
プレートまたは先行する増幅由来のDNAは、合目的的に
添加されるテンプレートDNAが存在しない場合にも、PCR
生成物を生じ得る。可能であれば、すべての反応混合物
は、PCR生成物分析および試料調製から隔離された領域
に設定される。専用の、または使い捨ての容器、溶液お
よびピペット（好ましくは正の置換ピペット）のRNA/DN
A調製、反応物混合および試料分析における使用は、交
差的夾雑を最小にするであろう。HiguchiおよびKwok
の、1989、Nature、339:237−238;ならびにKwokおよびO
rregoのInnisら編、1990、PCR Protocols;A Guide t
o Methods and Application、Academic Press、In
c.San Diego、CAも参考となり、これらをここに参考と
して組入れる。
核酸増幅の交差的夾雑効果の最小化方法は、ここに参
考として組入れる米国特許出願番号第609,157号に記述
されている。該方法は、増幅生成物へのdUTP等の非慣用
的塩基の導入を含み、残留生成物を酵素的および／また
は物理的−化学的処理に付して該生成DNAを継続する増
幅のテンプレートとして機能し得ないようにすることを
含む。例えば、ウラシル−DNAグリコシラーゼは、この
塩基を含むPCR生成物からウラシル残基を除去するであ
ろう。該酵素処理は、夾雑する残留PCR生成物の分解を
生じ、増幅反応の「滅菌」作用をする。
増幅の標的は、RNA/DNAハイブリッド分子であること
もできる。該標的は、単鎖または二重鎖核酸であり得
る。上述したPCR処理は、二重鎖標的を仮定したが、こ
れは必須ではない。単鎖DNA標的の最初の増幅サイクル
後、該反応混合物は、単鎖標的および新たに合成された
相補鎖からなる二重鎖DNA分子を含む。同様にして、RNA
/cDNA標的の第１の増幅サイクル後、該反応混合物は、
二重鎖cDNA分子および元のRNA/cDNA標的の複製物を含
む。この点において、増幅の継続するサイクルは、上述
のようにして進行する。本発明方法において、増幅の標
的は、単鎖RNAであり、第１の増幅サイクルは逆転写工
程である。別法として、出発テンプレートが二重鎖RNA
である場合、初期の高温度変性工程が単鎖RNAテンプレ
ート調製のために使用されてもよい。
ここにおいて使用される「cDNA」なる用語は、リボ核
酸鎖（RNA）をテンプレートとして使用して合成される
相補的DNA分子を指す。該RNAは、mRNA、tRNA、rRNA、ま
たは他のウイルス性RNA等の形態であってよい。該cDNA
は、単鎖もしくは二重鎖、またはRNA/cDNAハイブリッド
のように相補的RNAに水素結合していてもよい。
本発明の方法は、所望のRNAテンプレートからのcDNA
の入手手段を提供し、これにおいては、所望の最終生成
物は従来方法より高い特異性をもって生成される。更
に、本発明は、cDNA合成をPCRによる増幅と結合するこ
とを可能とする。これらの方法は、熱活性DNAポリメラ
ーゼの従来未知であった性質を取入れる。開示される実
施態様において、TaqおよびTthポリメラーゼを逆転写に
使用する方法が提供される。これらの実施態様は、本発
明を限定すると解釈されるべきものではない。
熱安定性ポリメラーゼは、多くの供給源から入手可能
である。該酵素は、天然または組換え蛋白質のいずれで
あってもよい。好適な熱安定性酵素は、Thermusthermop
hilusから精製されるTthポリメラーゼである（同時係属
中の米国特許出願第455,967号参照。これを、ここに参
考として組入れる）。別法として、Tthは、ここに記述
されrTthと称されるように組換え宿主細胞から精製され
る。同様に本発明の実施に好適なものは、Taqポリメラ
ーゼである。Taqは、組換え生成物として、またはTherm
usaquaticus由来の天然のTaqとして精製されて商業的に
入手可能である（Perkin Elmer−Cetus）。ここにおい
て使用されるように、組換えTaqは、rTaqと称され、天
然のTaqはnTaqと称される。
本発明の重要な一側面は、核酸の逆転写および増幅の
ためのTthDNAポリメラーゼに関する。この酵素をコード
する遺伝子は、T.thermophilusのゲノムDNAからクロー
ン化されている。Tthポリメラーゼは、推定されたアミ
ノ酸配列に基づき、予想された約94kDaの分子量を有し
ている。Tthポリメラーゼの完全コード配列（〜2.5kb）
は、プラスミドpBSM:Tthの〜3.7キロ塩基（kb）のHind
III−BstE II制限断片として容易に得ることができ、但
しこの〜3.7kb断片は内部にHind III制限酵素部位を含
んでいる。E.coli K12 DG101株中のpBSM:Tthの特定単
離物は、単離され、pBSM:Tth10と称されている。このプ
ラスミドは、アメリカンタイプカルチャコレクション
（ATCC）に、E.coli K12 DG101株中において1989年12
月21日にATCC受託番号68195のもとに寄託されている。T
thDNAポリメラーゼ遺伝子配列の入手可能性は、当業者
に組換えTthDNAポリメラーゼを調製するための種々の宿
主系に適用可能な任意の数の発現ベクターの調製用の出
発材料を提供する。同様にして、DNAポリメラーゼ活性
を維持するポリメラーゼの変異形態を調製してもよい。
多くのTthDNAポリメラーゼ発現ベクターが、同時係属
中の出願番号455,967に記述され、これらは本発明で使
用するための組換え精製Tthの製造に好適であり、この
出願をここに参考として組入れる。これらの発現ベクタ
ーのうち、プラスミドpLSG33 E.coli K12 DG116株を
組換えTthの供給源として使用した。プラスミドpLSG33
において、Tthポリメラーゼをコードする遺伝子の発現
は、λPLプロモータにより制御される。pLSG33の構築
は、同時係属中の出願番号455,967に詳細に記述され、
これをここに参考として組入れる。その記述中、pBSM:T
thはTth遺伝子の供給源として使用されている。
一旦TthDNAポリメラーゼが組換え宿主細胞中に発現さ
れた後は、該酵素は、ここに開示される方法にて精製さ
れ、使用され得る。精製方法は、1989年12月22日出願の
出願番号455,611および1988年１月12日出願の出願番号1
43,441に、天然のTthならびに天然および組換えTaqにつ
いて記述されており、これらの開示をここに参考として
組入れる。組換えTthポリメラーゼの精製は、一般的に
同様であって、先に記述された方法が適している。しか
しながら、組換えTthの好ましい精製方法は、この明細
書の例Ｉに与えられる。組換えTthの精製方法は、天然T
th精製スキームより単純である。非天然宿主細胞は、天
然Tthポリメラーゼと共溶出するTthHB8エンドヌクアー
ゼＩを産生しないため、このTthHB8エンドヌクレアーゼ
除去の工程を必要としない。
本発明は、TaqおよびTthDNAポリメラーゼによって例
示されているが、本発明はこの記述に限定されるもので
はない。文献中に報告されている他の熱安定性ポリメラ
ーゼも、ここに記述される方法の実施に有用性が見出さ
れるであろう。これらの例は、好熱性細菌であるBacill
us stearothermophilus、Thermosipho africanus、Th
ermotoga maritima、Thermus SPS17種、T.flavus、T.
lacteus、T.rubens、T.ruberおよびT.Z05種から抽出さ
れるポリメラーゼを含む。加えて、好熱性古細菌から単
離される熱安定性ポリメラーゼは、例えば、Desulfuroc
occus mobilis、Methanobacterium thermoautrophicu
m、Metfhanothermus fervidus、Pyrococcus furiou
s、Pyrodictium occltum、Sulfolobus acidocaldariu
s、S.solfataricus、Thermococcus litoralisおよびTh
ermoplasma acidophilumを含む。
修飾された熱安定性ポリメラーゼは、蛋白質分解によ
り、または切断された遺伝子から産生されてもよい。こ
れらの蛋白質類は、それらがRNAテンプレートを使用し
てデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの重合に
機能する限り、本発明の実施にも有用である。
Taqポリメラーゼは、94kDaおよび61kDa酵素の両者と
して調製され得る。該61kDa酵素は、従来62kDa酵素と称
されており（例えば米国特許第4,889,818号参照）、Sto
ffel断片とも称される。しかしながら、Taq61kDa、62kD
a、およびStoffel断片酵素は、すべて同じ実体を指して
いる。該Stoffel断片は、94kDa酵素のＮ−末端領域を蛋
白質分解的に切断した結果生じる一処理形態である。別
法として、該Stoffel断片酵素は、組換え蛋白質として
直接的に生成し得る。該Stoffel断片酵素は、完全長蛋
白質のカルボキシ末端部分のおよそ３分の２からなる。
酵素のいずれの形態も、ここに記述したようにRNAの逆
転写に作用するであろう。Ｎ−末端除去に加えて、個々
のアミノ酸残基を酸化、還元または他の誘導方法により
修飾してもよく、また該蛋白質を切断して活性を保持し
た断片を得てもよい。
従って、翻訳の間に配列に組入れられるアミノ酸の削
除、付加、または変更によるその一次構造の修飾は、該
蛋白質の高温度DNAポリメラーゼ活性を破壊することな
く行ない得る。このような置換または他の変更は、本発
明の方法に有用な蛋白質を生じる。これらの配列をコー
ドするDNAの入手可能性は、コドン配列を修飾して、や
はり逆転写活性を有している変異蛋白質形態を生成する
機会を提供する。
ここに例示されるように、Tth DNAポリメラーゼは、
高い逆転写酵素活性を有している。しかしながら、Taq
ポリメラーゼに加えて、Tthポリメラーゼは、３′−
５′エキソヌクレアーゼ様の校正活性を欠いている。こ
の３′−５′エキソヌクレアーゼ活性は、新たに合成さ
れた核酸配列中の誤って組込まれ、合致しない塩基の除
去が可能であるため、一般に望ましいものである。校正
活性の欠如は、酵素の正確さに影響を与えることから、
校正エキソヌクレアーゼの存在は、逆転写酵素の新規か
つ可能性ある有用性を与える。
Thermotoga maritima DNAポリメラーゼＩ（Tma pa
l）は、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有してい
る。ここに参考として組入れる1990年８月13日出願の米
国特許出願567,244は、Tmaポリメラーゼの単離および産
生方法を提供する。その特許出願は、Tma DNAポリメラ
ーゼのアミノ酸および核酸配列を与え、５′−３′エキ
ソヌクレアーゼ活性に加えて３′−５′エキソヌクレア
ーゼ活性を含む種々の酵素活性についてアミノ酸領域を
記述している。
従って、領域の位置変更またはキメラDNAポリメラー
ゼの構築は、新規な性質を有する熱安定性DNAポリメラ
ーゼを与えるために使用され得る。例えば、Tthポリメ
ラーゼに組込まれたTmaポリメラーゼの３′−５′エキ
ソヌクレアーゼ領域を有する熱安定性キメラDNAポリメ
ラーゼは、「重複」PCR（Higuchiの1989、PCR Technol
ogy、前出文献）を使用して構築され得る。この方法に
おいて、所望の連結配列は、PCRプライマ（それらの
５′末端）中に設計される。各個別の領域の最初の増幅
後、種々の生成物が希釈され（約100−1,000倍）、合せ
られ、変性され、アニール化され、伸長され、次いで最
終的な前進および逆行プライマが標準的PCRに添加され
る。
特定的には、Tthポリメラーゼのポリメラーゼ領域
（アミノ酸415−834）が、Tmaポリメラーゼの５′−
３′および３′−５′エキソヌクレアーゼ領域（アミノ
酸１−475）に連結される。例えば、Tthポリメラーゼ発
現ベクターおよびTmaポリメラーゼをコードする遺伝子
の一部は、次のように結合される。発現ベクターpLSG33
は、同時係属中の特許出願455,967に記述されており、T
thをコードする遺伝子を含んでいる。プラスミドpTMA
5′ΔNde＃３（以下、pTma06と称す）は、ここに参考と
して組入れる1990年８月13日出願の特許出願567,244に
記述され、Tmaポリメラーゼをコードする遺伝子の５′
部分を含んでいる。重複PCRのためのプラスミドを調製
するために、pLSG33およびpTma06をNde Iにより線形化
し、そしてTmaポリメラーゼに対してプライマＡおよび
Ｂを、またTthポリメラーゼに対してプライマＣおよび
Ｄを用いた２つの別個のPCR増幅に使用した。プライマ
の配列は： である。
プライマＢおよびＣ中に設計された相補領域に加え、
プライマＡは５′−末端に組込まれたNde I部位を有す
る。プライマＤは、Tthのポリメラーゼ領域の部分に対
応し、Tth遺伝子の３′領域内のBamH I部位に直接的に
隔離する。PCRの第１回目は、AB（1441bp）生成物およ
びCD（586bp）生成物を生成する。各領域の最初の増幅
に続いて、反応物をおよそ100〜1000倍に希釈し、合
せ、変性し、アニール化させ、そして最終的な進行およ
び逆行プライマ（それぞれプライマＡおよびＤ）を使用
して伸長させる。最終生成物ADを、Nde IおよびBamH I
にて消化して2006bpの生成物を与える。次いでこの生成
物を、発現ベクター（ベクターpLSG33をNde IとBamH I
とで消化した後）に連結して戻し、適当な宿主中に形質
転換する。該キメラ蛋白質は、895個のアミノ酸残基を
含むであろう。
Tth、Taq、およびTma DNAポリメラーゼは、RNaseH活
性を発現し得る５′−３′エキソヌクレアーゼ活性をも
有している。５′−３′エキソヌクレアーゼ活性の、例
えば部位特異的変異生成による除去または低減は、cDNA
合成に好ましい熱安定性ポリメラーゼを提供するであろ
う。E.coliのpolA遺伝子のアミノ酸番号103のグリシン
残基をグルタミン酸に置換することで、５′−３′エキ
ソヌクレアーゼ活性を欠いたポリペプチドが生成するこ
とが示されている（KingsburyおよびHelinskiの1973、
J.Bacteriol.144:1116−1124;OliveraおよびBonhotter
の、1974、Nature 250:513−514;ならびにJoyceらの、
1985、J.Mol.Biol.186:283−293）。同類のアミノ酸
が、Tthポリメラーゼ中に保持されている（アミノ酸番
号108）。正常コドンGGGが、PCRによってGAAコドンに変
異され、RNAの逆転写について改善された特性をもった
新規な熱安定性DNAポリメラーゼが提供される。別法と
して、Tthのアミノ酸番号46をグリシンからアスパラギ
ン酸に変更することで、新規酵素を与える５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性に影響を与え得る。
AMV−RTおよびMoMuLV−RT等のウイルス性逆転写酵素
の正確さが、直接アッセイ方法によって熱活性逆転写酵
素と比較される。プラスミドBS＋（Stratagene）が、こ
のようなアッセイに使用される。該プラスミドは、α−
相補β−ガラクトシダーゼ活性をコードし、Nde Iによ
って線形化され得る。T3RNAポリメラーゼが、αドナー
領域のcRNA転写物の調製に使用される。RNase−非含有D
NaseによるcRNAの処理およびcRNAの単離後、該cRNAは、
逆転写／増幅反応のためのテンプレートとして使用され
る。その５′末端に、Nde I配列を含むcDNAの３′末端
に相補的な逆転写プライマ、および５′末端にPat I配
列を含む上流PCRプライマは、752bpPCR生成物を与え
る。次いで、該PCR生成物およびpBS＋ベクターは、Nde
IおよびPst Iにより消化され、引続き該PCR生成物が、
ベクター中に連結され、適当な宿主中に形質転換され
る。白色コロニーの存在は、RTまたはPCR増幅の間に変
異が起きたことを示している。該アッセイは、種々の逆
転写酵素活性の正確さの相対値を与える手段を提供す
る。特定の変異は、配列分析により検出され得る。
高温度逆転写方法は、試料中の特定RNAの検出の新規
手段を提供する。この方法は、例えばAIDS被害者として
生まれた子供のレトロウイルス感染の監視、または診断
的蛋白質の発現の監視のための臨床的状況に有用であ
る。逆転写、または増幅生成物の検出は、多くの公知の
手段のいずれによっても行ない得る。このような手段
は、限定されるものではないが、ドットブロットまたは
電気泳動的様式において、同位体的もしくは非同位体的
に標識されたプローブによるハイブリッド形成を含む。
検出様式は、固体担体およびアビジン−ビオチン標識等
の捕捉工程を含んでもよい。ここに参考として組入れる
同時係属中の1990年８月６日の出願の特許出願563,758
は、核酸ポリメラーゼの５′−３′ヌクレアーゼ活性の
使用方法を記述している。該方法に従うと、標識オリゴ
ヌクレオチドおよひ標的オリゴヌクレオチドからなるハ
イブリッド二重体中の標識核酸プローブが分解される。
次いで、標識断片が検出される。検出は、例えば、感染
または治療法に対する応答の進展を監視するために定量
分析を含んでもよい。別法として、検出は細胞型特定の
目的であってもよい。
プライマは、その５′末端またはその近傍に都合良い
制限酵素認識部位を有して設計され得る。cDNA転写物の
形成において、３′末端プライマが標的配列に水素結合
している限り、得られた二重鎖cDNA分子は、特定の制限
酵素認識配列を含む。cDNAをテンプレートとして使用す
る増幅に続いて、制限部位は、例えばクローニング等の
他の処理を容易にするために使用することができる。
RNAの熱活性または熱安定性DNAポリメラーゼによる転
写に続いて、該RNAはRNA/cDNAハイブリッドから熱変性
または、アルカリ、熱もしくは酵素処理等の他の多くの
公知方法により除去され得る。酵素処理は、例えばRNA/
cDNAハイブリッドのRNaseH処理からなるものでもよい。
RNaseHは、RNA/DNA二重鎖分子においてRNA鎖に特異的で
ある。TthおよびTaqポリメラーゼは、共にRNaseH活性を
含んでおり、従って、第２のDNA鎖のmRNA依存的cDNA合
成およびmRNA配列増幅のためのプライマ伸長に加えて、
RNAテンプレートの加水分解を促進し得る。
RNAテンプレート鎖の除去または融解に続いて、残留
するcDNA鎖は、自己相補鎖の重合のためのテンプレート
として機能し、更なる増幅、検出または他の操作に好適
な二重鎖cDNA分子を与える。第２鎖の合成もプライマを
必要とする。配列特異的なプライマを、第２鎖合成を開
始させるために反応混合物に導入し得る。別法として、
二重鎖アダプターリンカをcDNAに連結してもよく、また
はcDNAを末端トランスフェラーゼ活性により延長しても
よい。該第２鎖プライマは、特定のcDNA配列よりむしろ
尾部末端にハイブリッドすることのみを必要とする（例
えば、FrohmanのInnlsらの前出文献中の記述参照）。開
示される方法の実施において、プライマの第１の組を特
定cDNAの合成に使用し、プライマの第２のはまり込む組
を所望のcDNA分節の増幅に使用することが望ましい。こ
れらの反応すべてが、同じ熱安定性DNAポリメラーゼに
より触媒作用を受けてもよい。
DNAポリメラーゼは、触媒活性のために２価陽イオン
を必要とする。TaborとRichardsonの、1989、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:4076−4080は、DNA配列決定方法に
おいてMg2+をMn2+に代え得ることが報告されている。こ
れらの方法は、DNAテンプレートおよびT7DNAポリメラー
ゼまたはDNAポリメラーゼＩを必要とする。
Mn2+、Mg2+またはCo2+のいずれもがTaq、TthおよびTm
aDNAポリメラーゼを活性化し得る。しかしながら、本発
明方法ではMn2+が好ましい。本発明の開示される実施態
様において、緩衝溶液は、RNAテンプレートからの核酸
逆転写のためにMn2+を含んで与えられる。これらの緩衝
溶液は、従来の逆転写緩衝溶液より改善され、増大した
cDNA収率を生じる。
本発明に従うと、逆転写について、プライマ−テンプ
レート混合物は、適切な重合条件下で熱活性または熱安
定性ポリメラーゼと共にインキュベートされる。これら
の条件は、２価陽イオン、１価陽イオン、４種すべての
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）お
よび緩衝剤を含む緩衝溶液によって与えられる。本願実
施態様において、逆転写のために供給される２価陽イオ
ンは、MgCl2、MgOAc、またはMnCl2であって、MnCl2につ
いて0.5mM−2.5mM、またMgCl2niついて0.5−10mMの範囲
で供給される。好ましくは、２価陽イオンは、0.8−2mM
の間の濃度におけるMnCl2である。１価陽イオンは、KOA
c、NaCl、またはKClによって供給され得る。KClについ
ては、濃度は１−200mMであり、好ましくは50−100mMの
間である。至適逆転写酵素活性は、50−75mM KClの間
で観察される。しかしながら増大した「完全長」cDNA生
成は、KCl濃度を100mMまで増大した場合に観察される。
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートは、dATP、
dCTP、dGTPおよびdTTP（dNTP）の、ジナトリウムまたは
リチウム塩等の塩の溶液として添加される。本願方法に
おいて、各々１−800μＭの範囲の最終濃度が好適であ
り、100−600μＭが好ましい。より長い生成物、すなわ
ち1500bp程度については、各dNTP500μＭおよび2mMのMn
Cl2が好ましい。
好適な緩衝剤は、トリス−HCl、pH8.3であるが、pHは
8.0−8.8の範囲でもよい。トリス−HClの濃度は、５−5
0mMであるが、10−20mMが最も好ましい。加えて、0.5mM
未満のEDTAが、逆転写反応混合物中に存在してもよい。
Tween−20TMおよびNoにdetTMP−０等の洗浄剤が酵素希
釈緩衝溶液中に存在する。約0.1％またはそれ以下の非
イオン性洗浄剤の最終濃度が適当であるが、0.05％−0.
01％が好ましく、ポリメラーゼ活性を妨害しないであろ
う。同様に、グリセロールがしばしば酵素調製物中に存
在し、一般的には反応混合物中で１−10％の濃度に希釈
される。鉱油の被覆を、蒸発防止のために加えてもよ
い。
本願方法は、試料中にRNAが存在することのみを必要
とする。例において、T7プロモータを含むプラスミドを
用いて調製された合成RNAが、本発明の方法により逆転
写され、増幅される。別の例において、全細胞RNAの異
種的母集団が、特定のmRNAの逆転写および増幅のために
使用される。試料中に存在するRNAの量は、好ましくは8
0pg−１μｇの範囲内である。必要量および結果は、試
料RNAの複雑さに依存して変化するであろう。高温度逆
転写反応の特異性故に、マイクログラム量のPCR生成物
を与えるために100分子程度の少量の標的RNAで充分であ
る。開示される例のいくつかにおいて、増幅生成物は、
全反応混合物の５％のゲル電気泳動後に、エチジウムブ
ロマイド染色による視認可能である。従って、必要な標
的の量は、生成物アッセイの別法を使用した場合に、実
質的に減少するであろう。例えば、電気泳動PCR生成物
の検出に適した同位体的標識DNAプローブは、検出感度
を増大させ、従って、必要な出発材料の量が減少する。
好ましくは、逆転写反応中に存在するRNAの量は、0.1
−500ng、最も好ましくは0.4−300ngである。この好ま
しい範囲において、１−10単位の熱活性DNAポリメラー
ゼは、完全長cDNA生成物を与えるために充分である。試
料が300ng以上のRNAを含む場合には、RNAテンプレート
からの完全量cDNA生成物の転写を確実にするために、追
加の酵素を含ませることが好ましいであろう。しかしな
がら、逆転写反応がPCRと結合される場合、PCR反応にお
ける高い酵素濃度の影響を考慮する必要がある。例え
ば、熱活性ポリメラーゼとしてTaqが使用される場合、
高い酵素濃度は、非特異的PCR生成物および低減した収
率を生じる可能性がある（SaikiのPCR Technology、Er
lich編、1989、Stockton Press参照）。高い酵素濃度
から起こり得る問題は、しかしながら、熱活性DNAポリ
メラーゼを、逆転写反応と増幅反応との間に失活させる
ことにより容易に回避できる。不活性化は、cDNA合成反
応混合物を、99℃にて３〜10分間インキュベートするこ
とにより達成される。次いで適切な量の熱安定性DNAポ
リメラーゼを反応混合物に再度添加し、PCRを通常どお
り行なう。この方法は、例VIIに例示したように異なる
熱安定性DNAポリメラーゼを２つの反応についてそれぞ
れ使用する場合にも適している。
RNAを含む試料が一旦調製され、適当なプライマおよ
び塩類が添加されたならば、該反応物は、熱活性DNAポ
リメラーゼと共に１−60分間インキュベートされる。し
かしながら、通常は反応時間２〜30分間が適当である。
比較的短い（〜300ヌクレオチド）標的分子について
は、逆転写反応物は、好ましくは約２−５分間インキュ
ベートされる。標的分子が長い場合、または標的RNAに
対する全RNAの比が、例えば標的RNAの100個のコピーが2
50ngの全RNAの存在下にある場合等のように高い場合に
は、10−30分間のインキュベート時間が好ましい。
本質的ではないが、プライマおよびRNAテンプレート
の両者が添加された後に、該逆転写反応混合物に熱活性
DNAポリメラーゼを添加することが好ましい。別法とし
て、例えば、酵素およびプライマを最後に添加するか、
または、MnCl2、あるいはテンプレートとMnCl2とを最後
に添加する。一般に、重合に必須の少なくとも１成分
を、プライマとテンプレートが両者共に存在し、また所
望のプライマ／テンプレート基質に酵素が結合して伸長
し得るまで、存在させないことが望ましい（ここに参考
として組入れる1990年２月16日出願の米国特許出願481,
501参照）。
本願方法の実施において、該反応物は40℃以上でイン
キュベートされるが、好ましい温度は、55℃−75℃であ
る。この温度において、プライマ−テンプレートアニー
ル化の特異性は、低温度のアニール化特異性より向上
し、また熱活性酵素は上昇された温度で高い活性を有す
る。上昇された温度は、切断された天然の核酸、および
誤まったプライマ−テンプレートハイブリッド化は、非
特異的開始を減少させる。
逆転写に続いて、RNAテンプレートは、cDNA生成物か
ら変性され、しかして続く逆転写のためのテンプレート
を与え、過剰量の単鎖cDNA分子を生じる。この過剰の単
鎖cDNAは、標準的プローブハイブリッド化技術により検
出可能である。従って、本発明は、標的分節の直接検出
手段を提供する。生じた核酸生成物は、多くの電気泳動
的またはクロマトグラフ的手段により検出可能である。
放射標識トリホスフェートの使用は、反応の程度、形成
される生成物の大きさ等の監視のために有用であるが、
このことは本発明の本質的な部分ではない。
逆転写反応生成物は、PRCによる増幅のためのテンプ
レートとして好適である。高温度の逆転写インキュベー
ションに続いて、逆転写酵素反応物をPCR緩衝溶液条件
に調節し、第２のプライマの添加に引き続いて増幅反応
が開始される。PCR緩衝溶液が、適切な緩衝容量、pH、
１価陽イオン濃度、およびdNTP類の濃度を各dNTPについ
て20−200μＭの範囲に希釈するために添加される。MgC
l2は、最終濃度１−3mMまで添加される。好ましくは、
逆転写酵素およびPCR反応混合物の両者におけるdNTPの
濃度は、衡合いをとられる。Mn2+は、RNAおよび多分DNA
の加水分解を誘導するため、本発明の好ましい実施態様
においてはMn2+はPCR増幅の前にキレート化される。多
量のMn2+の存在は、増幅の正確さを低減するが、Mn2+の
キレート化がこの問題を回避させる。従って、逆転写反
応に続いて、Mn2+をキレート化するために、Mn2+のモル
濃度の約１−10倍の濃度でEGTAを添加することが好まし
い。Mg+2およびMn+2の両者の存在において、EGTAはMn+2
に優先的に結合する。グリセロールおよび非イオン性洗
浄剤（例えばTween−20TM）を、酵素の安定性増大のた
めにそれぞれ最終濃度１−10％、および0.05％−0.01％
まで添加してもよい。
ここに提供される方法は、特に分子生物学および医学
的診断の分野において多くの応用を有している。記述さ
れる逆転写酵素活性は、RNAテンプレートからcDNA転写
物を与える。RNA分子からのDNA分節の生成および増幅方
法は、RNA分子が全RNA母集団の一構成物、または生物学
的試料中に少量存在する場合に好適である。試料中に存
在する特定のRNA分子の検出は、ここに記述される方法
で使用される熱活性または熱安定性DNAポリメラーゼに
よって高度に促進される。特定のRNA分子またはRNA分子
の全母集団は、ここに記述されるように熱活性または熱
安定性酵素を使用して増幅され、定量され、単離され、
また所望によりクローン化され、そして配列決定され
る。
本発明の方法および組成物は、RNAをDNA生成物に逆転
写する従来方法に比べて大きい改善である。
RNAテンプレートから出発する場合、これらの方法は
向上された特異性を有し、従来利用可能であった方法に
よるよりも効率的に生成されるPCR増幅のためのテンプ
レートを提供する。本発明は、感染性疾患、遺伝子的異
常または細胞異常等に関連する特異的リボ核酸配列の検
出および特徴付けのために、より特異的であり、従って
より正確である手段を提供する。
当業者は、本発明の組成物がキット中に組込まれ得る
ことを認識するであろう。従って、本発明は、熱活性DN
Aポリメラーゼ、ならびにこれをRNAの逆転写に使用する
方法を記述する指示書を含んでなるキットに関するもの
である。一実施態様において、このようなキットは、試
料中の少なくとも１種の特定標的RNA配列の検出に関連
する。このようなキットは、上記の要素に加えて特定標
的RNA配列に対し、これにハイブリッドするに充分相補
的な配列を含むプライマを含んでなる。試料中の少なく
とも１種の特定RNA配列の増幅および検出用診断キット
は、第２のcDNA鎖合成のために、合成された第１のcDNA
鎖とハイブリッドするRNA標的に充分に同等な配列を有
するプライマを含んでもよい。キットは、示した成分に
加えて、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ート、ここに記述されるような好適な緩衝溶液、オリゴ
（dT）、RNaseH,クローン化のためのリンカ、ならびに
１種以上の制限酵素を含んでもよい。
以下の例は、単に例示のために提供されるもので、い
かなる方法においても本発明を限定することを意図する
ものと解釈されるべきではない。
例１ 材料および方法 I.基質 A.RNA RNAは、インビトロにおいてT7 RNAポリメラーゼおよ
び合成テンプレートpAW106を使用して合成された。該テ
ンプレートpAW106は、合成的に調製されたDNA分節に隣
接してT7プロモータを含み、ポリアデニル化配列に続
く。生成された該RNAは、ここにおいてcRNAと称され、
オリゴ（dT）クロマトグラフィにより精製された。長さ
1060塩基の該精製物は、インターロイキン１β（1L−１
β）mRNA配列の部分を含んでいる。該RNA濃度は、0.1μ
g/μであり、〜0.286mpole/μに等価であった。別
法として、pAW109（ATCC No.68152）を、長さ963塩基の
cRNAの調製のためにテンプレートとして使用した。pAW1
06またはpAW109cRNAのいずれを使用した場合にも、該cR
NAはWangらの前出文献に従って調製され、定量された。
いくつかの例においては、pAW109cRNAはテンプレート分
子数を限定するために希釈され、そしてE.coliリポソー
ムRNA（Boehringer Mannheim）を、反応物あたり全RNA
を60ngとした。
Philadelphia−クロモゾーム正細胞株であるK562（Lo
zzioおよびLozzioの、1975、Blood45:321−334、ならび
にKawasakiらの、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5
697−5702）を、全細胞RNAの供給源として使用した。該
RNAを、Kawasakiらの、1985、Science 235:85−88およ
びSchwartzらの、1981、J.Immunol.126:2104−2108に従
って精製した。
B.DNA DNAテンプレートを、DNAポリメラーゼ活性の監視のた
めの対照として提供した。活性化サケ精子DNAを、10mM
トリス−HCl、pH8.3、5mM KClおよび50μＭ EDTA中
に、2.5μg/μの濃度で調製した。１反応物は、6.25
μｇのサケ精子DNAテンプレート（2.5μ）を含んでい
た。ある例においては、pAW109を、テンプレート分子の
数を制限するために希釈し、E.coliリボソームRNA（Boe
hringer Mannheim）を全RNA60ng/反応物となるように
添加した。
II.オリゴヌクレオチドプライマ DM156を、pAW106cRNAテンプレートを使用するcDNA合
成の開始に使用した。該プライマ配列は、ヒトIL−１β
遺伝子の部分に対応し、ヒトIL−１βmRNAに相補的であ
る。該プライマ濃度は100pmol/μであった。
DM152およびDM151は、ヒトIL−１α遺伝子の部分に対
応し、1L−１αmRNA（例えば、K562細胞由来）をテンプ
レートとして使用した場合に420塩基対分節を増幅す
る。308塩基対分節が、pAW109cRNAから生成される。DM1
52は、pAW109cRNAまたはIL−１αmRNAにハイブリッド
し、cDNA合成のプライマとして機能する。DM151は、該
単鎖cDNAに「上流」増幅プライマとしてハイブリッドす
る。
TM01は、pAW109cRNAテンプレートからcDNA分子を合成
するための「下流」プライマして使用され、ヒトIL−１
αmRNAの３′非翻訳領域にハイブリッドし得る。DM151
およびTM01は、pAW109の736塩基対分節を増幅する。
III.デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート 形成される逆転写（RT）生成物の量を、α32P dCTP
の取込みにより監視した。従って、dNTPマイナスＣ保存
物を、2mM dATP、2mM dTTP、および2mM dGTPを含ん
で調製した。330μの1mM dCTP溶液を、100μCiα32P
dCTP（New England Nuclear）を含めて調製した。
従って、約6.6×105cpmは、103pmoleのdCTP取込を表わ
す。dNTPマイナスＣおよびdCTP溶液を合せて、1mM dAT
P、1mM dTTP、1mM dGTPおよび250μＭα32P dCTPを
含む５×dNTP保存混合物を調製した。別法として、放射
標識トリホスフェートを使用しない場合には、４種すべ
てのdNTPを、逆転写反応物に200μＭにて含有させた。
便宜のため、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの各2mMをH
2O、pH7.0に含む溶液を、10×保存溶液として調製し
た。別に、逆転写/PCR生成物を、アガロースゲル電気泳
動およびエチジウムブロマイド染色により監視した。
IV.緩衝溶液 A.アニール緩衝溶液 10×保存アニール緩衝溶液を、100mMトリス−HCl、pH
8.3、500mM KClおよび1mM EDTAを含有させて調製し
た。
B.修飾Pol I 10×緩衝溶液 10×Pol I緩衝溶液を、MgCl2を含め、または含めず
に、100mMトリス−HCl、pH8.3、500mM KCl、10mM DT
T、および存在する場合に60mMのMgCl2を含有させて調製
した。
C.Taqポリメラーゼ／逆転写10×緩衝溶液（HSB） 10×Taq緩衝溶液を、100mMトリス−HCl pH8.3および5
00mM KClを含有させて調製した。
D.10×低塩緩衝溶液（LSB） 10×LSBを、100mMトリス−HCl、pH8.3および50mM KC
lを含有させて調製した。
E.10×RT反応緩衝溶液 10×RT緩衝溶液を、100mMトリス−HCl（pH8.3）およ
び900mM KClを含有させて調製した。
F.MoMuLV−RT10×緩衝溶液 10×MoMuLV−RT緩衝溶液を、60mM MgCl2を添加して
上記Ｃと同様に調製した。
G.10×PCR緩衝溶液 10×PCR緩衝溶液を、100mMトリス−HCl pH8.3、1M K
Cl、18.75mM MgCl2、7.5mM EGTAおよび50％グリセロ
ール（v/v）を含有させて調製した。
H.10×Taq PCR緩衝溶液 10×Taq PCR緩衝溶液は、100mMトリス−HCl、（pH8.
3）、300mM KClおよび25mM MgCl2を含む。
I.Taq希釈剤 Taq希釈緩衝溶液を、25mMトリス−HCl、pH8.8、100mM
KCl、0.1mM EDTA、0.5％Tween−20TM、0.5％Nonidet
TMP−40および500μg/μゼラチンを含有させて調製し
た。
V.酵素 A.逆転写酵素（MoMuLV−RT）は、200u/μの濃度をも
ってBethesda Research Labs,Bethesda、Marylandか
ら入手した。該酵素を、1/5の濃度のTween−20TMおよび
NonidetTMP−40を含むTaq希釈剤中に希釈して、４、0.
4、0.04、および0.004u/μ調製物を与えた。
B.E.coli Pol Iは、濃度10単位／μのものをNew En
glannd Biolabsから購入した。
C.天然Taq（94kDa）は、48単位／μの濃度をもってPe
rkin−Elmer/Cetusから提供された。比活性は、約240,0
00単位/mgであった。濃度を10単位／μに低下させる
ためにTaq希釈剤を使用した。
D.rTaqDNAポリメラーゼ、Stoffel断片 TaqポリメラーゼのStoffel断片は、32kDaのアミノ末
端配列が除去された94kDa Taqの切断形態である。該酵
素は、61kDaの大きさを有するが、従来62kDa Taqと称
されていたものである。該酵素は、ここに参考として組
入れる同時係属中の出願番号143,441に記述されている
ように組換え宿主細胞中に産生され、それから精製され
得る。Stoffel断片は、Perkin Elmer Cetus Instrum
entsからAmpliTagTMDNAポリメラーゼ、Stoffel断片とし
て商業的に入手可能である。
E.Tthポリメラーゼ 天然Tthポリメラーゼは、Finnzyme Co.,フィンラン
ドおよびToyobo Co.日本から商業的に入手可能であ
る。94kDa天然TthDNAポリメラーゼの精製、ならびに組
換え94kDaTthの産生および精製方法は、ここに参考とし
て組入れる1989年12月22日出願の共通して譲渡され同時
係属中の出願番号455,967中に、発明者David Gelfan
d、Susan StoffelおよびFtances Lawyerによって記述
されている。本願の例において使用するために、組換え
Tth（rTth）は下記のように精製された。
Tthは、プラスミドpLSG33を含むE.coliDG116株から精
製された。米国特許出願455,967の明細書第46頁に記述
されているように、pLSG33は、pLSG24のNde I−BamH I
制限断片を、発現ベクターpDG178中に連結することによ
り調製された。得られたプラスミドはアンピシリン耐性
であり、また完全長のTth遺伝子を発現可能である。10
リットル培養のための接種フラスコは、トリプトン（20
g/）、酵母抽出物（10g/）、NaCl（10g/）および
0.005％のアンピシリンを入れてある。該接種フラスコ
に、寒天プレートからのコロニーを接種したが、あるい
は連結グリセロール培養保存物も使用し得る。該接種物
を0.5〜1.0 O.D.（A680）の間まで育生した。該培養中
に接種される種培養物の体積は、細菌の最終濃度が、1m
g乾燥重量／リットルとなるように計算した。10リット
ルの育生培地は、25mM KH2PO4、28mM（NH4）2SO4、4mM
クエン酸ナトリウム、0.4mM FeCl2、0.04mM ZnC
l2、0.03mM CoCl2、0.03mM CuCl2および0.03mM H3BO
3を含有していた。以下の滅菌成分が添加された:41mM
MgSO4、7.5g/グルコースおよび20mg/チアミン−HC
l。pHは、NaOHにより６−８に調節され、培養の間、添
加されるNH4OHにより調節された。発泡は、必要に応じ
て、消泡剤としてプロピレングリコールの添加により調
節した。溶解酸素濃度は、40％に維持した。
該培養物は上述のように接種され、30℃にて光学密度
21（A680）に達するまで育生された。次いで、温度を37
℃に上昇させ、rTthポリメラーゼ合成を誘発させた。誘
発後、育生を８時間継続し、次いで、細胞を交差流濾過
を用いて濃縮し、続いて遠心分離して採取した。得られ
た細胞ペーストを−70℃にて凍結し、約500gの細胞ペー
ストを得た。別途示さない限り、すべての精製工程は、
４℃にて行なわれた。
約280グラムの冷凍（−70℃）E.coliK12 DG116株
（プラスミドpLSG33を保有する）を−20℃にて一夜温め
た。該細胞ペレットの次の試薬を添加した:1体積の２×
TE（100mMトリス−HCl、pH7.5、2mM EDTA）、5mg/mlロ
イペプチンおよび50mg/ml PMSF。最終濃度は、ロイペプ
チンについて0.5μg/ml、PMSFについて0.625μg/mlであ
った。好ましくは、TE中に最終濃度5mM2−Meを与えるよ
うにベーターメルカプトエタノール（２−Me）が含まれ
る。該混合物を、ブレンタ中、低速度でホモジナイズし
た。すべてのガラス器具は、使用前に焼成し、また可能
であれば、精製に使用される溶液は使用前にオートクレ
ーブにかけた。細胞を、10,000psiにおいてMicrofluidi
zerを２回通して溶菌させた。
該溶菌物を、5mMの２−Meを含む１×TEよって、5.5×
細胞湿重量の最終体積となるように希釈した。ロイペプ
チンを0.5μg/mlまで添加し、またPMSFを0.625μg/mlま
で添加した。最終体積（分画Ｉ）は、約1540mlであっ
た。
硫酸アンモニウムを、0.2M（26.4g/）まで徐々に加
え、溶菌物を攪拌した。硫酸アンモニウムの添加により
形成された沈澱は、ポリエチレンイミン（PEI）沈澱工
程の前に下記のように除去した。硫酸アンモニウム沈澱
を、JA−14ロータ中で15,000−20,000×ｇにて20分間、
懸濁物を遠心分離することにより除去した。上澄をデカ
ントして保持した。次いで硫酸アンモニウム上澄を加熱
プレート上で、該上澄が75℃になるまで攪拌し、次いで
77℃浴中に置き、時々攪拌しつつ15分間保持した。次い
で該上澄を氷浴中で20℃まで冷却し、PEI滴定のために1
0mlの分別量を取出した。
PEI滴定およびアガロースゲル電気泳動を、0.3％PEI
（BDHからPolyminPとして商業的に入手可能）が、巨大
分子DNAおよびRNAの≧90％を沈澱させること、すなわち
PEIによる処理後、エチジウムブロマイド染色したアガ
ロースゲルにDNAバンドが見られないことを示すために
使用した。PEIを攪拌しつつ徐々に0.3％−10％まで保存
溶液に加えた。PEI処理した上澄を、JA−14ロータ中で1
0,000RPM（17,000×ｇ）にて20分間遠心分離した。上澄
をデカントして保存した。体積（分画II）は、約1340ml
であった。
分画IIを、カラム体積の６−10倍の、0.2M硫酸アンモ
ニウムを含むTEにより平衡化した2.6×13.3cm（71ml）
のフェニルセファロースCL−4B（Pharmacia−LKB）カラ
ムに負荷した。次いで、分画IIを10cm/時の直線的流速
にて負荷した。流速は、0.9ml/分であった。該カラム
を、カラム体積の３倍の平衡化緩衝溶液、次いでカラム
体積の２倍のTEにより洗浄し、非−Tth DNAポリメラー
ゼ蛋白質を除去した。次いでカラムを、カラム体積の２
倍のTE中の20％エチレングリコールにより洗浄して更に
夾雑蛋白質を除去した。組換えTthを、20％エチレング
リコールを含むTE中の2.5M尿素のカラム体積の４倍量を
用いて溶出させた。DNAポリメラーゼを含む画分を、光
学的吸収（A280）およびSDS−PAGEにより標準的方法に
従って同定した。ピーク画分を集め、0.2ミクロン滅菌
減圧濾過装置で濾過した。体積（分画III）は約195mlで
あった。樹脂は、製造者の推奨に従って平衡化し再使用
した。
2.6×1.75cm（93ml）のヘパリンセファロースCL−6B
カラム（Pharmacia−LKB）を、カラム体積の６−10倍の
0.15M KCl、50mMトリス−HCl、pH7.5、0.1mM EDTAお
よび0.2％Tween20TMを用いて、１時間あたり１カラム体
積の流速で平衡化した。該緩衝溶液は、好ましくは5mM
の２−Meを含む。該カラムを、カラム体積の３倍の平衡
化緩衝溶液で洗浄した。Tthポリメラーゼを、カラム体
積の10倍の同緩衝溶液中の150−750mM KClの直線勾配
を用いて溶出させた。画分（カラム体積の10分の１）を
滅菌試験管に集め、ピークを画分IIIについて測定し
た。組換えTthポリメラーゼは、0.33M KClにピークを
もって溶出した。ピーク画分を集めて貯留した（分画I
V、177ml）。
分画IVを、Amicon YM30膜上で10mlまで濃縮した。緩
衝溶液交換のために、2.5×保存緩衝溶液（50mMトリス
−HCl、pH7.5、250mM KCl、0.25mM EDTA、2.5mM DTT
および0.5％Tween−20TM）を用いて、濃縮器を20mlで満
たし、各回とも10mlまで濃縮することを５回行なうダイ
アフィルトレーションを行なった。濃縮器を空にし、10
mlの2.5×保存緩衝溶液ですすぎ、これを濃縮分と合わ
せ分画Ｖとした。
残留DNAを除去するために陰イオン交換クロマトグラ
フィを使用した。該処理は、生物学的に安全なフード内
にて滅菌技術を用いて行なわれた。0.2ミクロン滅菌使
い捨てシリンジチップフィルタユニットを備えたWater
Sep−Pak plus QMAカートリッジを、30mlの2.5×保
存緩衝溶液により、シリンジを用いて毎秒約５滴の速度
で平衡化した。使い捨てシリンジを用いて分画Ｖを約１
滴／秒でカートリッジを通し、滅菌試験管に集めた。該
カートリッジを、5mlの2.5×保存緩衝溶液により洗い出
し、空気で押し出し乾燥させた。溶出液を、80％グリセ
ロールによって1.5×に希釈し、−20℃にて保存した。
得られた最終分画IV貯留物は、16.1×106単位の活性を
含んでいた。
VI.アニール化処理 例II、IIIおよびIVにおいて、cRNAテンプレートおよ
びDM156プライマは、10mMトリス−HCl、pH8.3、50mM K
Cl、0.1mM EDTAアニール化緩衝溶液中において、20:1
のプライマ：テンプレート比でアニール化された。ピペ
ット誤差の低減および試験管変位の除去のために、80反
応のための材料を与える主混合物を作製した。
アニール化は次のように実施した:80反応主混合物を8
5−87℃にて４分間加熱し、次いで70℃の水浴中に５分
間置き、続いて60℃の水浴に５分間置き、最後に室温に
平衡させた。アニール化混合物を、次いで４℃（または
別法として−20℃）にて後の使用のために保存した。各
反応について、0.5pmol（0.175μｇ）のcRNAテンプレー
トおよび10pmolのプライマを含む2.5μの主混合物を
使用した。別法として、アニール化をRT反応のインキュ
ベーションの間に70℃にて行なった。
VII.α32PdCTP取込みの測定 逆転写生成物中の同位体取込み量は、トリクロロ酢酸
（TCA）による核酸沈澱にて測定した。この方法は、Man
iatisらの、1982、Molecular Cloning、Cold Spring
Harbor Laboratory、473頁に記述されている。
例II 逆転写に好適なテンプレートとしてのAW106cRNAの分析 アニール化AW106cRNA:DM156混合物を、商業的に入手
可能な逆転写酵素を用いて、逆転写のためのテンプレー
トとして使用し、AW106cRNAがテンプレートとして適当
であるか試験した。
６×反応混合物を、MgCl2を加えた１×PolIRT緩衝溶
液、１×dNTP保存溶液、および60pmolプライマにアニー
ル化さた3pmolのテンプレートを含有させて調製した。
この混合物を、６本の試験管に分別した。すべての反応
を０℃にて設定した。対照として、１反応物をテンプレ
ートを含まず、10単位のMoMuLV−RTを含めて設定した。
他の一つの反応物は、酵素を含めなかった。他の反応物
については、MoMuLV−RTを次のとおり添加した:10単
位、１単位、0.1単位および0.01単位。
すべての反応物を、37℃にて20分間インキュベートし
た。反応を、０℃の氷水浴中に置き、EDTAを最終濃度10
mMをもって添加することにより停止させた。α23PdCTP
の取込みを、TCA沈澱可能な計数により測定した。
結果は、AW106cRNAが、MoMuLV−RTを用いたcDNA合成
に適したテンプレートであることを示した。
例III E.coli Pol IおよびTaqの逆転写酵素活性の比較 例IIの結果を標準として使用し、E.coli Pol Iおよ
びnTaqポリメラーゼを、逆転写酵素活性についてAW106c
RNAをテンプレートとしてアッセイした。正の対照とし
て、１組の反応物においてcRNAテンプレートをDNAテン
プレートに置換した。結果は、例IIと同様にα32PdCTP
の取込み測定により定量化した。
12×Pol I主混合物を、MgCl2を含まないPol IRT緩衝
溶液、dNTP保存溶液および12単位のPol I酵素を含有さ
せて調製した。同様に、12×Taq主混合物を、Taq緩衝溶
液、dNTP保存溶液、および12単位の天然Taq酵素とTaq希
釈剤を含有させて調製した。該Pol IおよびTaq主混合物
を、RNAテンプレート（0.5pmole cRNA/10pmole DM15
6）に対して６つの反応物、DNAテンプレート（6.25μ
ｇ）について２つの反応物、およびテンプレートを含ま
ない２つの対照反応物を与えるように分割した。
RNAテンプレートについては、cRNA/DM156を加えたPol
I主混合物を含む６つの分別量にMnCl2またはMgCl2を加
え、塩濃度０、0.5mM MnCl2、0.7mM MnCl2、1.0mM M
nCl2、2.0mM MnCl2および6mM MgCl2とした。cRNA/DM1
56を加えたTaq主混合物を含む６つの分別量に、MnCl2ま
たはMgCl2を供給して、最終塩濃度が０、0.5mM MnC
l2、0.7mM MnCl2、1.0mM MnCl2、2.0mM MnCl2または
2mM MnCl2となるようにした。
DNAテンプレートについては、２つの分別量はPol I混
合物から取出し、一つの反応物については最終濃度0.7m
M MnCl2を与え、他方については6mM MgCl2を与えるよ
うに塩を添加した。２つの分別量をTaq混合物から取出
し、一つの反応物については最終濃度0.7mM MnCl2を与
え、他方については2mM MgCl2を与えるように塩を添加
した。負の対照として、Pol IおよびTaqの各々について
テンプレートを欠いている２つの反応混合物を調製し
た。これらの反応物は、12×Pol Iおよび12×Taq主混合
物の分別量を用いて集められ、テンプレートに代えて１
×アニール化緩衝溶液を加えた。
Pol Iについては、0.7mM MnCl2または6mM MgCl2の
いずれかを与えるように塩を加えた。Taqについては、
0.7mM MnCl2または2mM MgCl2のいずれかを与えるよう
に塩を加えた。
すべての反応物は、氷上にて混合され、次いでPol I
を37℃、Taqを65℃にてインキュベートした。20分後に
反応物を氷上（０℃）で急冷し、EDTAを各反応物に最終
濃度10mMまで添加した。α32PdCTP取込みを測定するた
めに各反応物から試料を取出した。
この実験結果は表Ｉに示されている。すべての値は、
背景について補正して示されている。
表Ｉに示されたデータは、図１にグラフ的に示されて
いる。
この実験は、Taqが逆転写酵素活性を有することを示
している。１単位のTaqは、RNAテンプレートからのDNA
転写物へのα32PdCTPの取込量について、１単位のMoMuL
V逆転写酵素と等価である。
E.coliPol Iも逆転写酵素活性を示した。
Taq反応は、37℃ではなく65℃にて行なわれるため、
該Taq反応はPol IまたはMoMuLV逆転写酵素のいずれと比
べても特異性が向上している。
例IV 94kDarTaq、62KDarTaqおよびTthポリメラーゼの逆転写
酵素活性の比較 例IIIにおいて観察された逆転写酵素活性が他の熱安
定性ポリメラーゼに共通するものであるか決定するため
に、94kDarTaqポリメラーゼ、Stoffel断片（従来62kDar
Taqと称されていた）、および天然Tthの逆転写活性を比
較した。Tagのいずれの形態も組換え手段により製造さ
れた。
94kDaTaqの２μＭ希釈物を、94μg/nmoleと仮定して2
3.4μＭ保存溶液から調製した。Stoffel断片の希釈物
も、Taq希釈物を使用して同様に調製した。
94kDaおよびStoffel断片希釈物は、両者ともに.36pmo
le/.18μを含んでいた。Tthポリメラーゼは、比活性8
0,000単位/mgをもって27単位／μの溶液として精製さ
れた。従って、0.1μは、0.36pmole（2.7単位の酵
素）を含んでいた。反応物を、最終塩濃度60mMKCl（HS
B）または15mMKCl（LSB）をもって設定した。
０℃において、３つの15×主混合物を、dNTP保存溶
液、酵素希釈溶液、5.4pmale酵素（Tth、94kDaTaq、ま
たはStoffel断片）を含有させて調製した。各15×主混
合物から６つの分別量をHSBまたはLSBのいずれかと合わ
せ、６つの反応混合物を、それぞれTth/HSB、Tth/LSB、
94kDa Taq/HSB、94kDa Taq/LBS、Stoffel断片/HBSお
よびStoffel断片/LSBとして与えた。
６つの反応混合物の各々について、２つの別個の分別
量を、負のテンプレート、正の酵素の対照反応物のため
に１×アニール緩衝溶液を容れた試験管に取出した。
反応混合物として有用な残る５つの反応物に、cRNA/D
M156アニール化混合物（3pmoleのテンプレートおよび60
pmoleのプライマ）を添加した。該６系列の各々から４
つの分別量を個々の試験管に取出した。なおも０℃のま
ま、MnCl2を表IIに示される最終塩濃度を与えるように
添加した。
背景水準を測定するために、負−酵素、負−テンプレ
ート対照を、１×dNTP保存溶液、１×アニール化緩衝溶
液、および0.1×Taq希釈溶液を含有させて調製した。塩
は、次のように調節した:HSBおよび0.6mMまたは1.2mMの
最終MnCl2濃度、ならびにLSBおよび0.6mMまたは1.2mMの
最終MnCl2濃度。
すべての反応混合物を、65℃にて15分間インキュベー
トした。次いで試験管を氷浴中で急冷し、EDTAを各試験
管に10mMの最終濃をもって加えた。α32PdCTP取込量はT
CA沈澱により測定した。結果を表IIに示す。
各反応物への32Pの入力は、1.23×106cpmであった。
すべての数値は、37cpmの平均背景について補正してあ
る。数値は、12.5μの各反応物あたりに組込まれたcp
mを反映している。取込みの全pmoleは、α32P−dCTP保
存溶液から32Pの計数により測定された984cpm/pmoleに
基づいて計算された。
これらの結果は、図２にグラフ的に示され、また試験
したすべての熱安定性DNAポリメラーゼが逆転写酵素活
性を有していることを示している。
例Ｖ 高温度逆転写／増幅方法 例IIIおよびIVは、熱安定性DNAポリメラーゼが、上昇
された温度においてRNAテンプレートを使用しcDNA分子
を生成する能力を有することを示している。この実験に
おいては、逆転写反応が、PCRによるcDNA増幅に結合さ
れる。組換えTthが、逆転写反応およびPCRの両者に対す
る熱安定性ポリメラーゼとして使用された。プラスミド
pAW109から調製されたcRNAテンプレートは、例Ｉ（Ａ）
に記述されている。本発明のこの実施態様は、例IIに記
述され、例IIIおよびIVで使用された前駆−アニール化
工程は除いてある。cRT反応のための成分は、以下の順
序をもって室温にて合された:9.4μ、H2O;2μ、10
×RT反応緩衝溶液（100mMトリス−HCl、（pH8.3）、900
mM、KCl）;2μ、10mM MnCl2;1.6μ、dNTP溶液（2.
5mMの各dATP、dCTP、dGTP、dTTPのH2O中の溶液pH7.
0）；および２μ、rTthDNAポリメラーゼ（20mMトリス
−HCl〔pH7.5〕、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DT
T、0.2％Tween20TM〔Pierce Surfactamps〕および50％
グリセロール〔v/v〕を含む１×酵素保存緩衝溶液中に
2.5単位／μ）。示された体積は、反応物あたりにつ
いてであるが、一貫性およびピペット誤差を回避するた
めに、RT反応混合物を25×主混合物として調製した。該
25×反応主混合物は、425μ（17μ／反応）を含
む。
RT−プライマ混合物は、各々以下のように調製され
た。187μのRT混合物を、25×RT主混合物から取立
し、「下流」プライマと合わせた。この量は、11のRT反
応について充分であった。２つのRT−プライマ混合物
を、それぞれ、187μRT反応混合物および、15μMDM15
2（水中）；または15μMTM01（水中）のいずれかの11μ
（反応物あたり１μ）を含有させて調製した。18μ
のDM152RT−プライマ混合物を含む分別量を、１−８
の番号を付した試験管に取出した。同様に、TM01 RT−
プライマ混合物の18μの分別量を、９−16の番号を付
した試験管に取出した。
テンプレートAW109cRNAを、例Ｉに記述したように調
製し、希釈し、下記のようにTE（10mMトリス−HCl、1mM
EDTA）中の２μテンプレート溶液として添加した。
該テンプレート溶液は、担体として30ng/μのrRNAを
含んでいた。
試験管番号 AW109cRNAのコピー 1,9 108（−RT反応） 2,10 108 3,11 106 4,12 104 5,13 103 6,14 500 7,15 100 8,16 0 反応試験管２−８および10−16を、DM152については
2.5分間、またTM01試料については7.5分間、70℃にてイ
ンキュベートした。試験管１および９を、氷上に保持し
てRT反応が負の対照とし、後にPCRテンプレートとして
作用する夾雑プラスミドDNAの存在を検出するために用
意した。70℃でのインキュベートした後、反応を、試験
管を氷上に置くことによって停止させた。
PCRアッセイ混合物を、19×主混合物として室温にて
調製した。示された体積は、反応あたりの体積を意図す
るものである:71μ H2O;8μ 10×PCR反応緩衝溶
液（100mMトリス−HCl［pH8.3］;1M KCl;18.75mM MgC
l2;7.5mM EGTA;50％グリセロール［v/v］）および１μ
、15μMDM151（「PCR上流プライマ」）。全体積は、
反応あたり80μであった。
PCR増幅を、80μPCRアッセイ混合物を20μの逆転
写酵素反応物に添加することにより開始させた。鉱油の
覆（75μ）を蒸発防止のために加え、次いで微量遠心
装置で約20秒間遠心して油層を反応混合物と分離した。
PCRを、Perkin Elmer Cetus Instruments Thermal
Cyclerおよび以下の４種の連結したファイルを使用し
て行なった： ファイル１−ステップサイクル 95℃にて２分間を１サイクル ファイル２−ステップサイクル 95℃にて１分間、および60℃にて１分間を35サイクル ファイル３−ステップサイクル 60℃にて７分間を１サイクル ファイル４−浸漬４℃ PCRに続いて、各試料から５μの分別量を取り出
し、５μの試料染料（30％ w/v ショ糖、0.1％ w/
v ブロモフェノールブルー、10mM EDTA）と合せ、ア
ガロースゲル（２％ Nu SieveTM GTG アガロース
［FMC］、１％ SeakenTM ME アガロース［FMC］）に
て分析した。電気泳動に続いて、該ゲルをエチジウムブ
ロマイドにより染色し、写真撮影した（図３参照）。す
べての生成物の長さを、1kb BRL 分子量標準（レーン
は示していない）に対して相対的に決定した。図中、レ
ーン番号は試験管番号に対応している。期待された308b
pの長さの生成物は、反応物あたり100コピーのAW109 c
RNAの位置に見られた。TM01を730塩基対の転写／増幅生
成物の生成のために使用した場合には、反応物あたり10
0分子のテンプレートの位置に正しい大きさのバンドが
見られた。負の対照反応物にはPCR生成物が検出されな
かった。
例VI 全細胞RNAを使用する結合逆転写／増幅 K562細胞株を、全細胞RNAの供給源として使用した。
該RNAを、例Ｉに記載したと同様に精製した。この実験
の目的は、天然に生じる異種的RNA組成物を使用して、
結合RT/PCR方法の感度を試験することであった。一般
に、反応物あたりの250ngの全RNAは、約25,000個の細胞
を表わすと推定され得る。各細胞は、およそ１−10個の
IL−１α mRNAのコピーを含む。従って、250ngのK562
の全RNAは、概略25,000〜250,000個のIL−１α標的mRNA
を含む。かくして、PCR生成物の特異性および量は、例
Ｖの合成cRNAテンプレートを使用して生成させた生成物
の特異性および量と比較され得る。
反応条件は、例Ｖに記述したDM151およびDM152を使用
するものと同様であるが、以下の若干の変更を伴う。こ
の実験においては１種類の下流プライマのみ使用するた
め、DM152をRT反応混合物に直接に添加した。10×RT反
応主混合物を、各反応物について９μ H2O;2μ 1
0×RT反応緩衝溶液;2μ 10mM MnCl2;2μ dNTP
（水中に、dATP、dCTP:dGTPおよびdTTP各々の2mM、pH7.
0）および１μ DM152（水中に15μＭ）を含有させて
調製した。該RT主混合物を室温で調製し、16μの分別
量を１−９の番号を付して下記のRNAを容れた試験管に
分配した。
試験管番号 K562全RAN １ 250ng（−RT対照） ２ 250ng ３ 50ng ４ 10ng ５ 2ng ６ 0.4ng ７ 0.08ng ８ 0ng 全テンプレート溶液は、TE（10mM トリス−HCl、1mM
EDTA）中に調製した。２μのテンプレート溶液およ
び２μのTthポリメラーゼ（１×酵素保存緩衝溶液
中、2.5単位／μ）を各試験管に加えた。
すべての試料を、70℃にて2.5分間インキュベートし
たが、例外として試験管１は、後にPCRテンプレートと
して作用するのであろう夾雑DNAの存在を試験するため
に、負のRT対照として氷上に保持した。反応を、氷上に
置くことにより停止させた。
PCRアッセイ混合物を調製し、反応を例Ｖに記述され
ると全く同様に行なった。RT/PCRの結果を、例Ｖと同様
にして分析し、結合を図４に示してある。PCR生成物の
バンドは、レーン２−７に見られる。結果は、図４に示
されるように、本発明に従うと、80ピコグラムほどの少
量の全細胞RNA（RNAの８−80個の細胞当量に対応する）
でも特異的かつ効率的な高温度逆転写および増幅のため
の優れたテンプレートとして作用することを示してい
る。
例VII ポリメラーゼを交換する高温度逆転写／増幅方法 例IVは、cDNA調製についてはTthポリメラーゼがTaqポ
リメラーゼより優れているであろうことを示唆してい
る。しかしながら、Taqポリメラーゼは、PCRにおいてし
ばしば使用されている。従って、TthポリメラーゼがRT
反応にて触媒作用し、TaqポリメラーゼがPCRにて触媒作
用する方法を開発した。以下の方法は、２つの反応が異
なる熱安定性DNAポリメラーゼにより触媒作用される場
合、またはRT反応におけるポリメラーゼ量が、PCRのた
めに減少される場合に適している。
例示のため、以下の実験を行なった。全般に、RT反応
は例Ｖと同様に行なわれるが、反応試験管の半数につい
ては、Tthを加熱して失活させ、PCRのためにTaqで置換
した。
特定のプロトコールは次のとおりであった。RT主混合
物を、DM152を使用して例VIに記述されるのと全く同様
にして調製した、該RT主混合物を、９×混合物として作
成した。16μの分別量を、下記のようにAW109cRNAま
たはpAW109DNAを含む１−８の番号を付した試験管に取
った。
テンプレート溶液は、例Ｖと同様にすべてTE中の２μ
の試料として調製した。２μのrTthを各試験管１−
８（１×酵素保存緩衝溶液中に2.5単位／μ）に加
え、該RT反応物を試験管１、２、５および６を別として
70℃にて2.5分間インキュベートした。他の試験管は、R
T反応の負の対照として氷上に保持した。反応を、試験
管を氷上に置くことにより停止させた。下記表は、各試
験管について反応条件を要約している。
レーン 試料 反応 酵素 １ 104コピーDNA −RT −Taq ２ 104コピーcRNA −RT −Taq ３ 104コピーcRNA ＋RT −Taq ４ − ＋RT −Taq ５ 104コピーDNA −RT ＋Taq ６ 104コピーcRNA −RT ＋Taq ７ 104コピーcRNA ＋RT ＋Taq ８ − ＋RT ＋Taq 室温において２つのPCR主混合物を調製した。
RCRマイナスTaqは、反応物あたり、71μ H2O、８
μ 10×PCR反応緩衝溶液（100mMトリス−HCl、pH8.
3;1M KCl;18.75mM MgCl2;7.5mM EGTA;50％グリセロ
ール［w/v］）および１μ DM151（水中に15μＭ）を
含んでいた。該PCRマイナスTaq混合物は、５×溶液とし
て調製された。PCRプラスTaq主混合物を、５×溶液とし
て、反応物あたり68.5μ H2O;8μ 10×Taq−PCR
反応緩衝溶液（100mMトリス−HCl、pH8.3;300mM KCl;2
5mM MgCl2）、１μDM151、および0.5μ Ampli T
aqTM（５単位／μ）含有させて調製した。
80μのPCRマイナスTaq主混合物を、試験管１−４に
加えた。EGTA（２μの30mM保存溶液）を試験管５−８
に加えた。次いで鉱油をすべての試験管に入れた（75μ
／試験管）。試験管５−８を99℃にて４分間加熱し、
78μのPCRプラスTaq反応混合物をこれらの試験管のみ
に加えた（油の下側）。すべての試験管を微量遠心装置
にて20秒間遠心し、例Ｖに記述されている４つの結合フ
ァイルを使用してサーモサイクル中でインキュベートし
た。該RT/PCR増幅物を、例Ｖに記述されているように電
気泳動により分析し、ゲルを写真撮影した（図Ｖ）。図
Ｖは、PCR工程におけるrTthのAmpli TaqTMによる置換
が、生成物の収率に影響しないことを示している。
例VIII 好ましい逆転写/PCRプロトコール A.逆転写反応 0.5mlのポリプロピレン微量遠心試験管に、9.4μ滅
菌蒸留水;2μ 10×rTth逆転写酵素緩衝溶液;2μ
MnCl2（10mM）;0.4μのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTP
のそれぞれ（各10mM）;2μ rTthポリメラーゼ2.5U/
μ;1μのプライマDM152（15μＭ）（または、別の
「下流」プライマ）；および２μの正の対照RNAまた
は≦250ng全RNAを含む実験試料を合せる。この実施態様
におて正の対照RNAは、DM152のテンプレートとして機能
する。対照RNA濃度は、好ましくは〜104コピー/20μ
である。例えば、対照RNAは、10mMトリス−HCl、pH8.
0、1mM EDTAおよび10mM NaCl中において、30μg/mlの
E.coli rRNA中でpAW109から転写されたRNAであっても
よい。
全逆転写反応体積は、試料あたり20μとすべきであ
る。
蒸発または還流を低減するために、混合物を50−100
μの鉱油で覆う。
該試験管を、浸漬ファイル:70℃にて５−15分間、を
使用してPerkin−Elmer Cetus DNAサーモサイクラー
中でインキュベートする。反応を、必要となるまで試験
管を氷上に置くことにより停止する。
B.PCR反応 各試料について、次のように最小80μのRCR主混合
物を調製する:8μ 10×キレート化緩衝溶液、６−10
μの25mM MgCl2、１μのプライマDM151（15μＭ）
または実験的な「上流」プライマおよび滅菌蒸留水。
水、MgCl2および「上流」プライマ体積の任意の組合せ
を、該主混合物の全体積が試料あたり80μである限り
使用できる。
至適MgCl2濃度は、全dNTP濃度、および使用するプラ
イマとテンプレートに依存して変化するであろう。ほと
んどの場合において、反応混合物中1.5−2.5mMの範囲の
MgCl2の最終濃度は優れた結果を与えるであろう。使用
されるテンプレートが正の対照pAW109である場合、６μ
（1.5mM）のMgCl2が好ましい。
80μのPCR主混合物を、各逆転写反応試験管に分配
する。試料の持越しを避けるために、添加間でピペット
チップを交換する。試験管を微量遠心装置で〜30秒間遠
心する。
pAW109RNA正対照の増幅のために、Perkin Elmer Ce
tus DNAサーモサイクラは、次のように４つの結合ファ
イルにてプログラムされる： ステップサイクル:95℃にて２分間を１サイクル、 ステップサイクル:95℃にて１分間および60℃にて１
分間を35サイクル、 ステップサイクル:60℃にて７分間を１サイクル 浸漬 :4℃ PCR増幅試料は、次の分析まで凍結保存することができ
る。
アニール−伸長温度について60℃の選択は、正対照cD
NAの増幅に対して至適である。他のプライマ−テンプレ
ート対に対しては、該アニール−伸長温度の低下または
上昇が必要でありうる。より高いアニール−伸長温度
は、一般に特異的生成物を生じる（Saikiらの、1988、S
cience 239:487−491参照）。至適状態は、５℃にて試
験を行なうか、あるいはより小さい増大分について、最
大の特異性および生成物の収率が達成されるまで試験し
て経験的に決定し得る。
PCR増幅のための至適塩化マグネシウム濃度は、各プ
ライマの組について1.5〜2.5mM塩化マグネシウムの濃度
を試験することにより経験的に決定し得る。過少または
過多の塩化マグネシウムは、増幅効率に影響するであろ
う。塩化マグネシウム濃度を、試料RNA、dNTP、cDNAお
よびDNAの濃度の実質的変化に並行して調節することが
好ましい。
多量の２次構造を含むことが知られているテンプレー
トについては、「ホットスタート」プロトコールが好ま
しい。逆転写反応のために２種類の反応混合物が調製さ
れる。混合物A:9.4μ滅菌蒸留水、２μ 10×rTth
逆転写酵素緩衝溶液、１μ「下流プライマ」、２μ
試料RNA（＜250mgの全RNA）。混合物B:2μの10mM Mn
Cl2溶液;0.4μ dGTP;0.4μ dATP;0.4μ dCTP;
0.4μ dTTP;2μ rTthポリメラーゼ。
両反応混合物を室温にて調製する。混合物Ａを70℃に
て５分間インキュベートし、反応物に混合物Ｂを加え
（反応混合物Ａを70℃に保ったまま）、先に「逆転写反
応」の節で記述されているように70℃にて５−15分間イ
ンキュベートする。PCR反応は、上述のように行なわれ
る。
C:試薬 好ましいプロトコールは、以下の試薬類を使用する： rTthポリメラーゼ 2.5単位／μ プライマDM152 15μＭ プライマDM151 15μＭ 正対照RNA ５×103コピー／μ dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各10mM 10×逆転写酵素緩衝溶液 100mMトリス−HCl、pH8.
3、900mM KCl 10×キレート緩衝溶液 50％グリセロール（v/v）1
00mMトリス−HCl pH8.3、1M KCl、7.5mM EGTA、0.5
％Tween20 MnCl2溶液 10mM MgCl2溶液 25mM これらの成分は、高温度逆転写用キットとして組合され
てもよい。キットの変形も本発明の開示の範囲内にあ
る。例えば、MnCl2は、逆転写酵素緩衝溶液中に含ま
れ、また、MgCl2はキレート緩衝溶液中に含まれてもよ
い。しかしながら、反応の至適化のために、MnCl2およ
びMgCl2は、別個の試薬として提供される。本質的では
ないが、正の対照の使用は、発明の商業的実施には好ま
しい。
培養物の寄託 培養物は、Cetus Master Culture Collection（CM
CC）1400,Fifty−Third Street、Emeryuille、CA9460
8、USAに寄託され、また、American Type Culture C
ollection（ATCC）、12301、Parklawn Drive、Rockvil
le、Maryland、USAに受託された。CMCCおよびATCCに受
託番号、およびATCC寄託日を下記に示す。
培養物 ATCC番号 寄託日 pBSM:Tth10 68195 12/21/89 pAW109 68152 10/27/89 これらの寄託は、ブダペスト条約に基づいてブダペス
ト条約の国際寄託当局に行なわれている。このことは、
寄託日から30年間の生きた培養の維持が保証される。該
寄託は、ブダペスト条約の規定に基づいてATCCにより、
入手可能とされ、また関連する米国特許の発行によって
永久的かつ無制限の入手可能性を保証する出願人とATCC
との間の契約を与える。譲渡者は、ここに、寄託培養物
が適切な条件で培養された場合に死滅し、失なわれ、破
壊された場合には、それが通知のもとに直ちに同じ培養
物の生きた試料に置換されることに同意するものであ
る。寄託の入手可能性は、特許法に基づいて政府の権限
のもとに与えられた権利に反して、発明の実施許諾と解
釈されるべきではない。
これらの寄託は、関連する公衆の便宜のためになされ
たもので、記述が発明の実施を可能とするに充分でない
ことを認めるものではなく、また発明をこれらの特定の
構築物に限定することを意図するものでもない。ここに
与えられたものは、当業者が寄託された構築物を複製
し、請求された発明の実施を可能とするDNAの別の形態
またはそれを含む生物を構築することを可能ならしめる
完全なる記述である。
本発明が詳細に記述されたが、ここに添付する請求の
範囲の精神および範囲内にて変更および修飾が可能であ
ることは理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ５８５，４７１ (32)優先日 1990年９月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．17，Ｎｏ．20，Ｐ．8387 −8388（1989) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．70，Ｎｏ．12，Ｐ ａｒｔ▲ＩＩ▼，Ｐ．3834−3838 （1973) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．149，Ｐ．41−46（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (48)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】RNAテンプレートの逆転写に際し： 前記RNAテンプレートを含む試料を、前記RNAテンプレー
    トに対してこれにハイブリダイズするために充分に相補
    的であるオリゴヌクレオチドプライマ、および熱活性DN
    Aポリメラーゼと共に、４種のデオキシリボヌクレオシ
    ドトリホスフェート類の存在下、二価陽イオンとしてMn
    2+を含有する適切な緩衝溶液中において、前記プライマ
    が前記RNAテンプレートにハイブリダイズし、かつ前記
    熱活性DNAポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシ
    ドトリホスフェートの重合反応に対して触媒作用して前
    記RNAテンプレートの配列に対して相補的なcDNA配列を
    形成するために充分な40℃より高い温度にて処理するこ
    とを含んでなる逆転写方法。
  2. 【請求項２】前記熱活性DNAポリメラーゼが、熱安定性D
    NAポリメラーゼである請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】インキュベーション温度が、50℃および80
    ℃の間である請求の範囲第１項又は第２項に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】前記インキュベーション温度が55℃および
    75℃の間である請求の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記インキュベーション温度が65℃および
    70℃の間である請求の範囲第４項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記試料がヒトの生物学的試料である請求
    の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記熱安定性DNAポリメラーゼが、生来の
    テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）ポリメ
    ラーゼ、生来のテルムス・テルモフィルス（Thermus th
    ermophilus）ポリメラーゼ、94kDaの分子量を有する組
    換えテルムス・アクアチクスポリメラーゼ、テルムス・
    アクアチクスポリメラーゼのカルボキシ末端断片である
    ストッフェル（Stoffel）断片、及び組換えテルムス・
    テルモフィルスポリメラーゼから成る群から選択され
    る、請求の範囲第２項に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記二価陽イオンMn2+が、約0.5mMおよび
    約2.5mMの間の濃度である、請求の範囲第１項〜第７項
    のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記二価陽イオンMn2+が、約0.8mMおよび
    約2.0mMの間の濃度である、請求の範囲第８項に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】前記プライマが、特定のRNA標的分子に
    相補的である請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記二価陽イオンMn2+がMnCl2により供
    給される、請求の範囲第１項〜第10項のいずれか１項に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記特定のRNA標的分子が、遺伝子性疾
    患または感染性疾患の診断用である請求の範囲第10項に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記cDNAの形成後に前記試料に更にキレ
    ート化剤を添加することを含む請求の範囲第１項〜第12
    項のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記キレート化剤がEGTAである、請求の
    範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記キレート化剤が、Mn2+のモル濃度の
    約１〜10倍の間の濃度で存在する請求の範囲第13項又は
    第14項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記重合反応が、約2.5分間および約15
    分間の間の時間をもって行なわれる請求の範囲第１項〜
    第15項のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記緩衝溶液が、該反応混合物に約50mM
    〜約125mMの間の濃度を与えるKClを更に含んでなる請求
    の範囲第１項〜第16項のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】特定の標的RNA分子を含むと予想される
    試料中の前記特定の標的RNA分子の検出に際し： （ａ）前記試料を、前記RNAテンプレートに対してこれ
    にハイブリダイズするために充分相補的であるプライ
    マ、および熱活性DNAポリメラーゼと共に、４種のデオ
    キシリボヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、二
    価陽イオンとしてMn2+を含有する適切な緩衝溶液中にお
    いて、前記プライマが前記標的RNAにハイブリダイズ
    し、かつ前記熱活性DNAポリメラーゼが前記デオキシリ
    ボヌクレオシドトリホスフェートの重合反応に対して触
    媒作用して前記標的RNAの配列に対して相補的なcDNA配
    列を形成するために充分な40℃より高い温度にて処理
    し； （ｂ）工程（ａ）にて形成された前記cDNAを処理して、
    単鎖cDNAおよびRNAテンプレートを与え；そして （ｃ）前記cDNAの存否を検出する； 工程を含んでなる特定の標的RNA分子の検出方法。
  19. 【請求項１９】工程（ｃ）に先立って、工程（ａ）およ
    び（ｂ）を少なくとも１回反復することを更に含む請求
    の範囲第18項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記特定のRNA標的分子が、遺伝子性疾
    患または感染性疾患の診断用である請求の範囲第18項又
    は第19項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】試料中に存在することが予想される標的
    RNA分子の増幅に際し： （ａ）前記試料を、前記標的RNAに対してこれにハイブ
    リダイズするために充分相補的である第１のプライマ、
    および熱活性DNAポリメラーゼと共に、４種のデオキシ
    リボヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、二価陽
    イオンとしてMn2+を含有する適切な緩衝溶液中におい
    て、前記第１のプライマが前記標的RNAにハイブリダイ
    ズし、かつ前記熱活性DNAポリメラーゼが前記デオキシ
    リボヌクレオシドトリホスフェートの重合反応に対して
    触媒作用して前記標的RNAの配列に対して相補的なcDNA
    配列を形成するために充分な40℃より高い温度にて処理
    し； （ｂ）工程（ａ）にて形成された前記cDNAを処理して単
    鎖cDNAを与え； （ｃ）工程（ｂ）にて形成された前記単鎖cDNAを、少な
    くとも一つの単鎖cDNA分子にハイブリダイズ可能であ
    り、かつ熱安定性DNAポリメラーゼの存在下、二重鎖cDN
    Aの生成に適切な条件下で伸長生成物の合成開始を可能
    とする第２のプライマと共に処理し；そして （ｄ）工程（ｃ）の二重鎖cDNAをポリメラーゼ連鎖反応
    により増幅する； 工程を含んでなる標的RNA分子の増幅方法。
  22. 【請求項２２】前記熱活性DNAポリメラーゼが熱安定性
    である請求の範囲第21項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】工程（ａ）の温度が、50℃および80℃の
    間にある請求の範囲第21項又は第22項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記標的RNA分子が、遺伝子性または感
    染性疾患の診断用である請求の範囲第21項〜第23項のい
    ずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】工程（ａ）および工程（ｃ）が、同じ熱
    安定性DNAポリメラーゼにより触媒される請求の範囲第2
    2項〜第24項のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記熱安定性DNAポリメラーゼが、生来
    のテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）ポリ
    メラーゼ、生来のテルムス・テルモフィルス（Thermus
    thermophilus）ポリメラーゼ、94kDaの分子量を有する
    組換えテルムス・アクアチクスポリメラーゼ、テルムス
    ・アクアチクスポリメラーゼのカルボキシ末端断片であ
    るストッフェル（Stoffel）断片、及び組換えテルムス
    ・テルモフィルスポリメラーゼから成る群から選択され
    る、請求の範囲第22項〜第25項のいずれか１項に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】前記二価陽イオンMn2+が、約0.5mMおよ
    び約2.5mMの間の濃度である、請求の範囲第21項〜第26
    項のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記二価陽イオンMn2+が、約0.8mMおよ
    び約2.0mMの間の濃度である、請求の範囲第27項に記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】工程（ｃ）における前記適切な条件が、
    Mg2+である二価陽イオンを含む緩衝溶液を有してなる請
    求の範囲第21項〜第28項のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】工程（ａ）の後で工程（ｂ）の前に、キ
    レート化剤が前記試料に添加される請求の範囲第21項〜
    第29項のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記キレート化剤がEGTAである、請求の
    範囲第30項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】工程（ｃ）における前記適切な条件が、
    EGTAを含むPCR緩衝溶液を有してなる請求の範囲第27項
    に記載の方法。
  33. 【請求項３３】工程（ａ）が、2.5分間および15分間の
    間の時間をもって行なわれる請求の範囲第21項〜第32項
    のいずれか１項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記PCR緩衝溶液が、PCRにおいて約５％
    〜約10％の濃度で与えられるためのグリセロールを含ん
    でなる請求の範囲第21項〜第33項のいずれか１項に記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】前記キレート化剤が、前記PCR緩衝溶液
    中に、Mn2+濃度の１〜10倍の間の最終EGTA濃度を与える
    べく存在する請求の範囲第30項〜第34項のいずれか１項
    に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記PCR緩衝溶液が、約50mM〜約125mMの
    間の濃度においてKClを更に含む請求の範囲第32項〜第3
    5項のいずれか１項に記載の方法。
  37. 【請求項３７】パッケージされた形態において： （ａ）逆転写反応における熱活性ポリメラーゼの使用の
    ための指示書； （ｂ）熱活性ポリメラーゼ； （ｃ）逆転写酵素用緩衝溶液；および （ｄ）MnCl2溶液 を含んでなるキット。
  38. 【請求項３８】４種の異なるデオキシリボヌクレオシド
    トリホスフェートの各々を更に含んでなる請求の範囲第
    37項に記載のキット。
  39. 【請求項３９】前記熱安定性DNAポリメラーゼが、生来
    のテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）ポリ
    メラーゼ、生来のテルムス・テルモフィルス（Thermus
    thermophilus）ポリメラーゼ、94kDaの分子量を有する
    組換えテルムス・アクアチクスポリメラーゼ、テルムス
    ・アクアチクスポリメラーゼのカルボキシ末端断片であ
    るストッフェル（Stoffel）断片、及び組換えテルムス
    ・テルモフィルスポリメラーゼから成る群から選択され
    る、請求の範囲第37項又は第38項に記載のキット。
  40. 【請求項４０】前記MnCl2が、約0.5mMおよび約2.5mM Mn
    Cl2の間の最終濃度を与えるべく、逆転写反応において
    使用するために好適な量をもって存在する請求の範囲第
    37項〜第39項のいずれか１項に記載のキット。
  41. 【請求項４１】前記MnCl2が、約0.8mMおよび約1.4mM Mn
    Cl2の間の最終濃度を与えるべく、逆転写反応において
    使用するために好適な量をもって存在する請求の範囲第
    40項に記載のキット。
  42. 【請求項４２】PCR実施のための緩衝溶液を更に含んで
    なる請求の範囲第37項〜第41項のいずれか１項に記載の
    キット。
  43. 【請求項４３】正の対照RNAおよび正の対照RNA逆転写用
    プライマを更に含んでなる請求の範囲第37項〜第42項の
    いずれか１項に記載のキット。
  44. 【請求項４４】前記逆転写緩衝溶液が、約50mMおよび約
    100mM KClの間の最終濃度を与えるべく逆転写反応にお
    いて使用するために好適な量をもってKClを更に含有し
    てなる請求の範囲第37項〜第43項のいずれか１項に記載
    のキット。
  45. 【請求項４５】PCR実施のための前記緩衝溶液が、キレ
    ート化剤を含むキレート形成緩衝溶液として好適なもの
    である請求の範囲第42項〜第44項のいずれか１項に記載
    のキット。
  46. 【請求項４６】前記キレート化剤がEGTAである、請求の
    範囲第45項に記載のキット。
  47. 【請求項４７】溶液中にMgCl2を更に含んでなる請求の
    範囲第45項に記載のキット。
  48. 【請求項４８】前記成分が、下記の最終濃度： 0.2〜2mM EGTA １〜10％グリセロール 50〜125mM KCl １〜3mM MgCl2 を与えるべくPCR反応における使用に適した量をもって
    存在する請求の範囲第44項に記載のキット。
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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5466591A (en) * 1986-08-22 1995-11-14 Hoffmann-La Roche Inc. 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
US5795762A (en) * 1986-08-22 1998-08-18 Roche Molecular Systems, Inc. 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
US5561058A (en) * 1986-08-22 1996-10-01 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for coupled high temperatures reverse transcription and polymerase chain reactions
US5374553A (en) * 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5693517A (en) * 1987-06-17 1997-12-02 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reactions
JP2709311B2 (ja) * 1990-09-28 1998-02-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト 熱安定性ｄｎａポリメラーゼの５→３′のエキソヌクレアーゼ突然変異
EP0553264A4 (en) * 1990-10-05 1994-07-13 Wayne M Barnes Thermostable dna polymerase
CA2038839A1 (en) * 1991-03-22 1992-09-23 Jiang J. Liu Method for detection of viral rna
AU662906B2 (en) * 1991-06-26 1995-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for detection of carcinoma metastases by nucleic acid amplification
DK0787807T3 (da) * 1991-08-27 2003-08-11 Hoffmann La Roche Primere og prober til detektion af hepatitis C
USRE39031E1 (en) * 1992-04-29 2006-03-21 Biomerieux RNA amplification method requiring only one manipulation step
FR2690691B1 (fr) * 1992-04-29 1999-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'arn necessitant une seule etape de manipulation.
DE69428167T2 (de) * 1993-07-01 2002-05-29 F. Hoffmann-La Roche Ag, Basel Reagenz und Verfahren für reverse Transkription bei hoher Temperatur, verbunden mit einer Polymerase-Kettenreaktion
US5474920A (en) * 1993-11-23 1995-12-12 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Modified thermo-resistant DNA polymerases
WO1995015399A1 (fr) * 1993-12-01 1995-06-08 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Procede d'amplification et de detection d'une sequence nucleotidique au moyen d'enzymes thermostables
US5648211A (en) * 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
EP0736609A3 (de) * 1995-04-08 1998-07-29 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung und zum Nachweis von DNA bzw. RNA
JP3966555B2 (ja) * 1995-05-31 2007-08-29 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション 熱耐性ｄｎａポリメラーゼ
US6001645A (en) * 1995-06-07 1999-12-14 Promega Corporation Thermophilic DNA polymerases from thermotoga neapolitana
US6077664A (en) * 1995-06-07 2000-06-20 Promega Corporation Thermophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
WO1997021821A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-19 Amersham Life Science, Inc. Thermostable dna polymerase from thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus and mutant enzymes thereof with exonuclease activity removed
CA2199213C (en) * 1996-03-11 2007-04-17 John Wesley Backus Amplifying and detecting target nucleic acids using a post amplification incubation step
US6013488A (en) 1996-07-25 2000-01-11 The Institute Of Physical And Chemical Research Method for reverse transcription
ES2121698B1 (es) * 1996-12-02 1999-07-01 Inia Procedimiento para la obtencionn de fragmentos amplificados de acido nucleico de particulas virales y subvirales que contienen rna.
US6030814A (en) * 1997-04-21 2000-02-29 Epicentre Technologies Corporation Reverse transcription method
DE69801749T2 (de) * 1997-05-13 2002-07-04 Azign Bioscience A/S, Kopenhagen/Koebenhavn Eine methode zum klonieren von mrna und darstellung von differentiell exprimierten transcripten (dodet)
EP0921196A1 (en) * 1997-12-02 1999-06-09 Roche Diagnostics GmbH Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction
EP0922765B1 (en) * 1997-12-02 2005-11-23 Roche Diagnostics GmbH Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction
ATE307137T1 (de) * 1998-03-18 2005-11-15 Amersham Biosciences Corp Temperaturstabile dna polymerase aus thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
AT410218B (de) 1999-08-20 2003-03-25 Baxter Ag Verfahren zur herstellung eines qualitätsgesicherten pools biologischer proben
US6436677B1 (en) 2000-03-02 2002-08-20 Promega Corporation Method of reverse transcription
US6632645B1 (en) 2000-03-02 2003-10-14 Promega Corporation Thermophilic DNA polymerases from Thermoactinomyces vulgaris
KR20000072141A (ko) * 2000-08-04 2000-12-05 김유삼 신규한 호열성 단백질 분해효소의 ｄｎａ 서열 및그로부터 유래된 단백질
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
US7575864B2 (en) * 2004-05-27 2009-08-18 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the direct detection of diagnostic RNA
US7504240B2 (en) * 2005-03-10 2009-03-17 Masanori Hirano Methods for synthesizing polynucleotides using a single primer
JP5191041B2 (ja) 2007-04-05 2013-04-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 急速ワンステップｒｔ−ｐｃｒ
KR101039521B1 (ko) * 2008-02-01 2011-06-08 주식회사 인트론바이오테크놀로지 금속 이온에 의해 발생하는 ｐｃｒ 저해 및 비특이 증폭을완화시키거나 막을 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산을킬레이트제로 포함하는 ｐｃｒ 반응용 조성물
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
US9364532B2 (en) 2011-06-08 2016-06-14 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
CA2876159C (en) * 2012-06-08 2022-09-06 Ionian Technologies, Inc. Nucleic acid amplifications
WO2014127478A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Vaccine composition
JP2017504336A (ja) 2014-01-31 2017-02-09 キアゲン ゲーエムベーハー カチオンキレーターホットスタート
WO2016160965A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Rubicon Genomics, Inc. Methods and compositions for repair of dna ends by multiple enzymatic activities
WO2018136404A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 Asuragen, Inc. Methods of rna amplification
GB201812192D0 (en) 2018-07-26 2018-09-12 Ttp Plc Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same
CN110846724B (zh) * 2019-12-03 2023-04-28 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒
CN113045410A (zh) * 2021-03-29 2021-06-29 华东理工大学 一种双环降二萜类化合物及其合成基因及制备方法
EP4074839A1 (en) 2021-04-16 2022-10-19 Biotype GmbH Optimized oligonucleotide tx probe for a multiplexing analysis of nucleic acids and a multiplexing method
EP4350002A1 (en) 2022-10-07 2024-04-10 Biotype GmbH Nachweis von molekularen analyten auf der grundlage massgeschneiderter sondenkonkurrenz

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338457C (en) * 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１４９，Ｐ．４１−４６（１９８５）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２０，Ｐ．８３８７−８３８８（１９８９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７０，Ｎｏ．１２，Ｐａｒｔ▲ＩＩ▼，Ｐ．３８３４−３８３８（１９７３）

Also Published As

Publication number Publication date
DE69030386D1 (de) 1997-05-07
JPH05505105A (ja) 1993-08-05
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DK0506889T3 (da) 1997-09-22
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CA2071213C (en) 2000-05-02
EP0506889B1 (en) 1997-04-02
DE69030386T2 (de) 1997-10-09
WO1991009944A2 (en) 1991-07-11
CA2071213A1 (en) 1991-06-23
AU656315B2 (en) 1995-02-02
ATE151112T1 (de) 1997-04-15

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