CN110846724B - 构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种构建mRNA链特异文库的方法，其包括：将mRNA片段、放线菌素D、第一混合酶液和第一缓冲液混合成第一反应体系，使第一反应体系进行第一热处理，获得第一反应液；将第一反应液与第二混合酶液和第二缓冲液混合成第二反应体系，使第二反应体系进行第二热处理，获得第二反应液；将第二反应液与T4DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头混合成第三反应体系，使第三反应体系进行第三热处理，第三热处理后纯化获得第三反应液；并且在第三反应液中添加预混液、扩增引物和UDG酶混合成第四反应体系，使第四反应体系进行第四热处理，第四热处理后纯化获得mRNA链特异文库。根据本公开能够提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。
Description
技术领域
本公开特别涉及一种构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。
背景技术
mRNA链特异文库是能够保留转录本的方向信息的测序文库，测序得到的转录本序列信息均来源于一条链，能够用于确定转录本来源于正义链还是反义链，因此，与普通的转录组测序文库相比，mRNA链特异文库的准确性更高。
目前，构建mRNA链特异文库的流程为mRNA的富集，然后将mRNA进行片段化处理，反转录合成第一链，加入dUTP进行第二链合成，再对cDNA产物进行纯化，之后依次是双链cDNA末端修复和加A反应，接头连接，连接产物纯化和片段化筛选，USER酶处理、PCR扩增和纯化等步骤，然而，该构建流程存在步骤繁杂且耗时长，文库构建效率低等问题。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。
为此，本公开一方面提供了一种构建mRNA链特异文库的方法，其包括：准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物；将所述第一反应液与具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物；将所述第二反应液与T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。
在本公开中，在第一反应体系中，放线菌素D在合成cDNA第一链的过程中能够抑制cDNA第二链的合成，从而有助于提高mRNA链特异文库的链特异性，RNA酶抑制剂能够避免mRNA被降解，核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶能够提高cDNA第一链合成的产量，由此能够提高cDNA第一链合成的效率。另外，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A均在第二反应体系中进行，而且在第二反应体系中，DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶以及缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的Klenow片段能够协同作用，并且能够提高cDNA第二链合成、末端修复和末端加A的效率，由此能够有助于提高mRNA链特异文库构建的效率，而且使用含dUTP的第二dNTP作为原料能够标记cDNA第二链，便于后续利用尿嘧啶DNA糖基酶降解cDNA第二链，以形成mRNA链特异文库。此外，在接头连接反应中使用Y字型接头能够提高连接效率，从而有助于提高mRNA文库构建的效率。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0U/μL至1.5U/μL。由此，能够有效提高cDNA第一链合成的效率。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，在所述第二反应体系中，所述DNA聚合酶I的工作浓度为0.6U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1U/μL至0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL至0.5U/μL，所述Taq-B DNA聚合酶的工作浓度为0.04U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08U/μL至0.12U/μL。由此，能够有效提高第二反应体系内的反应效率。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。在这种情况下，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP；在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。在这种情况下，第二缓冲液能够保持第二反应体系的pH以及酶的稳定性。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述mRNA片段经片段化处理，并且所述片段化处理于片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行，所述片段化缓冲液包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物。由此，能够获得合适长度的mRNA片段，并且能够提供后续合成cDNA第一链所需的随机六聚体引物。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述第三缓冲液还包括ATP，Tris-HCl，氯化镁，二硫苏糖醇和聚乙二醇8000，在所述第三反应体系中，所述T4 DNA连接酶的工作浓度为10U/μL至30U/μL；所述Y字型接头的工作浓度为1×10- 7M至3×10-7M；所述二甲基亚砜的工作浓度为1％至1.5％，所述ATP的工作浓度为1.5mM至3mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.04M至0.08M，所述氯化镁的工作浓度为0.03M至0.05M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为1mM至3mM，所述聚乙二醇8000的工作浓度为5wt％至8wt％。在这种情况下，第三缓冲液能够保持第三反应体系的pH以及酶的稳定性，并且能够增强接头连接反应。
另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述Y字型接头的第一序列为5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3'，第二序列为5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'，其中，所述第一序列的3'端经硫代修饰，所述第二序列的5'端经磷酸化修饰，NNNNNNNN为分子标签序列，XXXXXXXX为样本标签序列。由此，既能够提高Y字型接头的连接效率，也能够提高后续测序的准确性。
本公开另一方面提供了一种构建mRNA链特异文库的试剂盒，其包括：放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液，以及具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液和具有第二dNTP的第二缓冲液，其中，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述放线菌素D、所述第一混合酶液和所述第一缓冲液用于形成cDNA第一链合成用的第一反应体系，所述第二混合酶液和所述第二缓冲液用于形成cDNA第二链合成、末端修复和末端加A用的第二反应体系。
在本公开中，放线菌素D在合成cDNA第一链的过程中能够抑制cDNA第二链的合成，从而有助于提高mRNA链特异文库的链特异性，RNA酶抑制剂能够避免mRNA被降解，核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶能够提高cDNA第一链合成的产量，由此能够提高cDNA第一链合成的效率。另外，DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-BDNA聚合酶以及缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的Klenow片段之间能够具有协同作用，并能够提高cDNA第二链合成、末端修复和末端加A的效率，因此能够有助于提高mRNA链特异文库构建的效率。
另外，在本公开另一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的试剂盒中，可选地，在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0U/μL至1.5U/μL；在所述第二反应体系中，所述DNA聚合酶I的工作浓度为0.6U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1U/μL至0.2U/μL，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL至0.5U/μL，所述Taq-B DNA聚合酶的工作浓度为0.04U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08U/μL至0.12U/μL。由此，能够有效提高各反应的反应效率。
另外，在本公开另一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的试剂盒中，可选地，所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。在这种情况下，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性。
另外，在本公开另一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的试剂盒中，可选地，所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP，在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。在这种情况下，第二缓冲液能够保持第二反应体系的pH以及酶的稳定性。
另外，在本公开另一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的试剂盒中，可选地，还包括用于片段化处理的片段化缓冲液，T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头，以及具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶，其中所述T4 DNA连接酶、所述第三缓冲液和所述Y字型接头用于形成连接接头用的第三反应体系，所述预混液、所述扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶用于形成用于降解含尿嘧啶的cDNA第二链以及对cDNA第一链进行扩增反应的第四反应体系。由此，能够降解含尿嘧啶的cDNA第二链，并且能够对cDNA第一链进行扩增，由此能够扩增出mRNA链特异文库。
根据本公开能够提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。
附图说明
图1是示出了本公开的示例所涉及的构建mRNA链特异文库的方法的流程示意图。
图2是示出了本公开的对比例中构建mRNA链特异文库的方法的流程示意图。
具体实施方式
以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
在本公开中，单位“M”可以为mol/L的缩写，单位“mM”可以为mmol/L的缩写，单位“μM”可以为μmol/L的缩写。
图1是示出了本公开的示例所涉及的构建mRNA链特异文库的方法的流程示意图。
如图1所示，在本实施方式所涉及的构建mRNA链特异文库的方法，其可以包括：cDNA第一链合成(步骤S10)，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A(步骤S20)，接头连接(步骤S30)和文库扩增(步骤S40)。在一些示例中，步骤S40中可以包括含尿嘧啶的cDNA第二链的降解。
在一些示例中，步骤S10可以包括准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使第一反应体系进行第一热处理，在第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。
在一些示例中，步骤S20可以包括将第一反应液与具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使第二反应体系进行第二热处理，在第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由cDNA第一链和cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物。
在一些示例中，步骤S30可以包括将第二反应液与T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使第三反应体系进行第三热处理，在第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液。
在一些示例中，步骤S40可以包括在第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使第四反应体系进行第四热处理，在第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。
在本实施方式中，放线菌素D在合成cDNA第一链的过程中能够抑制cDNA第二链的合成，从而有助于提高mRNA链特异文库的链特异性，RNA酶抑制剂能够避免mRNA被降解，核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶能够提高cDNA第一链合成的产量，由此能够提高cDNA第一链合成的效率。
另外，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A均在第二反应体系中进行，而且在第二反应体系中，DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶以及缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的Klenow片段能够协同作用，并且能够提高cDNA第二链合成、末端修复和末端加A的效率，由此能够有助于提高mRNA链特异文库构建的效率，而且使用含dUTP的第二dNTP作为原料能够标记cDNA第二链，便于后续利用尿嘧啶DNA糖基酶降解cDNA第二链，以形成mRNA链特异文库。
此外，在接头连接反应中使用Y字型接头能够提高连接效率，从而有助于提高mRNA文库构建的效率。另外，在第四反应体系中，尿嘧啶DNA糖基酶能够降解含尿嘧啶的cDNA第二链，从而使得能够仅对两端连接有不同接头序列的cDNA第一链进行扩增，由此能够扩增出mRNA链特异文库。
另外，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A均在第二反应体系中进行，能够减少末端修复和末端加A时的操作步骤(例如加样、关盖、上机反应、开盖等)，并且能够省略cDNA第二链合成形成cDNA后的纯化过程，由此能够简化反应步骤并且缩短建库的时间，并且步骤省略能够减少试剂的使用，从而能够降低成本。
在一些示例中，构建mRNA链特异文库的方法可以包括前置步骤。其中，前置步骤可以用于准备mRNA片段。另外，在一些示例中，前置步骤可以包括提取RNA和分离mRNA。
在一些示例中，提取RNA的样本来源可以是真核生物。另外，在一些示例中，真菌、血液、石蜡包埋组织、动物组织、植物组织、培养细胞、细胞系等。例如，人类肾皮质组织、小鼠肝脏、幼叶、成熟根、茎、酵母、人口腔上皮细胞等。
在一些示例中，可以利用沉淀法、过柱吸附法或者RNA提取试剂盒提取RNA，并纯化获得RNA样本。另外，在一些示例中，优选地，RNA样本的RNA完整值(RIN)可以大于7。换言之，优选高质量的RNA样本。
在一些示例中，可以从RNA样本中分离纯化获得mRNA样本。另外，在一些示例中，可以通过捕获ploy A的方式获得mRNA样本。由此，能够将具有多聚腺苷酸尾(ploy A尾)的mRNA样本从RNA样本中分离。
在一些示例中，可以利用寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA。
在一些示例中，可以利用表面修饰有多聚胸腺核苷酸(polyT)的磁珠(即Oligo(dT)磁珠)获得mRNA样本。在这种情况下，磁珠表面的Poly T能够通过氢键与mRNA的3'端的Poly A结合，从而能够特异性捕获mRNA。
在一些示例中，通过mRNA捕获试剂盒可以获得mRNA样本。另外，在一些示例中，mRNA捕获试剂盒可以包括mRNA捕获磁珠(例如Oligo(dT)磁珠)、磁珠结合缓冲液、磁珠洗涤液和Tris缓冲液。
在一些示例中，前置步骤还可以片段化处理。另外，在一些示例中，可以对mRNA样本进行片段化处理以获得mRNA片段(片段化反应液)。换言之，mRNA片段可以经片段化处理。由此，能够获得合适长度的mRNA片段，进而能够有利于后续对mRNA链特异文库的测序。
在一些示例中，片段化处理可以在片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行。另外，在一些示例中，片段化缓冲液可以包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物。在这种情况下，Tris-HCl能够用于维持片段化反应体系的PH的稳定性，镁离子能够用于打断mRNA，并且能够提供后续合成cDNA第一链所需的随机六聚体引物。另外，加入随机六聚体引物形成片段化缓冲液，并与mRNA样本混合成的片段化反应体系进行片段化处理，使得随机六聚体引物能够更好地与mRNA片段结合。
在一些示例中，在片段化反应体系中，Tris-HCl的工作浓度可以为5mM至20mM。例如，Tris-HCl的工作浓度可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。
在一些示例中，在片段化反应体系中，镁离子的工作浓度可以为0.3mM至1.0mM。例如，例如，镁离子的工作浓度可以为0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1.0mM。
在一些示例中，随机六聚体引物可以为含有6个碱基的随机序列引物的混合物(有4 6种可能序列)。另外，在一些示例中，随机六聚体引物的5'末端可以具有磷酸化修饰。
在一些示例中，在片段化反应体系中，随机六聚体引物的工作浓度为30μM至60μM。例如，随机六聚体引物的工作浓度可以为30μM、33μM、35μM、38μM、40μM、43μM、45μM、48μM、50μM、53μM、55μM、58μM或60μM。
在一些示例中，片段化反应体系可以在80℃至95℃下进行片段化反应。由此，能够在高温下利用镁离子打断mRNA。另外，在一些示例中，片段化反应体系可以在80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃下进行片段化反应。在另一些示例中，片段化处理可以置于PCR仪中进行。
在一些示例中，在步骤S10中，mRNA片段可以与第一混合酶液和第一缓冲液混合成用于合成cDNA第一链的第一反应体系。具体而言，可以将片段化反应液与第一混合酶液和第一缓冲液混合成用于合成cDNA第一链的第一反应体系。
在一些示例中，第一混合酶液可以包括RNA酶抑制剂和逆转录酶。由此，RNA酶抑制剂能够抑制mRNA降解，逆转录酶能够合成cDNA第一链。另外，在一些示例中，逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶。由此，能够更好地合成cDNA第一链。
在一些示例中，在第一反应体系中，MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，RNA酶抑制剂的工作浓度为1U/μL至1.5U/μL。由此，能够有效提高cDNA第一链合成的效率。
在一些示例中，在第一反应体系中，MMLV逆转录酶的工作浓度可以为8U/μL、8.5U/μL、9U/μL、9.5U/μL、10U/μL、10.5U/μL、11U/μL、11.5U/μL或12U/μL。另外，在一些示例中，在第一反应体系中，RNA酶抑制剂的工作浓度可以为1U/μL、1.1U/μL、1.2U/μL、1.3U/μL、1.4U/μL、或1.5U/μL。
在一些示例中，第一缓冲液可以包括第一dNTP。由此，能够提供cDNA第一链合成的原料。在另一些示例中，第一dNTP可以是指dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。另外，在一些示例中，第一dNTP可以是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等量混合物。
在一些示例中，第一缓冲液还可以包括Tris-HCl、氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)和二硫苏糖醇(DTT)。在这种情况下，Tris-HCl用于维持第一反应体系的pH的稳定性，氯化镁能够提供镁离子以提高酶的活性，氯化钾用于调节离子强度，二硫苏糖醇能够维持酶的稳定性，换言之，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性，并且能够提供反应所需物质(例如第一dNTP、镁离子)和条件(例如pH、离子强度)。
在一些示例中，在第一反应体系中，第一dNTP的工作浓度可以为0.3mM至0.7mM，Tris-HCl的工作浓度可以为0.03M至0.06M，氯化镁的工作浓度可以为2.0mM至2.5mM，氯化钾的工作浓度可以为0.03M至0.08M，二硫苏糖醇的工作浓度可以为6mM至10mM。由此，能够提供有利于cDNA第一链合成的环境，从而能够有助于提高cDNA第一链合成的效率。
在一些示例中，在第一反应体系中，第一dNTP的工作浓度可以为0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM或0.7mM。另外，在一些示例中，在第一反应体系中，Tris-HCl的工作浓度可以为0.03M、0.035M、0.04M、0.045M、0.05M、0.055M或0.06M。
在一些示例中，在第一反应体系中，氯化镁的工作浓度可以为2.0mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM或2.5mM。另外，在一些示例中，在第一反应体系中，氯化钾的工作浓度可以为0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M。
在一些示例中，在第一反应体系中，二硫苏糖醇的工作浓度可以为6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM。
在一些示例中，第一反应体系还可以包括放线菌素D。在这种情况下，放线菌素D能够在合成cDNA第一链的过程中抑制cDNA第二链的合成，有助于提高mRNA链特异文库的链特异性。
在一些示例中，在第一反应体系中，放线菌素D的工作浓度可以为0.01g/L至0.05g/L。由此，能够更好地提高mRNA链特异文库的链特异性。
在一些示例中，在第一反应体系中，放线菌素D的工作浓度可以为0.01g/L、0.015g/L、0.02g/L、0.025g/L、0.03g/L、0.035g/L、0.04g/L、0.045g/L或0.05g/L。
在一些示例中，片段化反应液与第一混合酶液和第一缓冲液混合第一反应体系，其中片段化反应液可以包含随机六聚体引物。另外，在一些示例中，在第一反应体系中，随机六聚体引物的工作浓度为15μM至30μM。例如，随机六聚体引物的工作浓度可以为15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、21μM、22μM、23μM、24μM、25μM、26μM、27μM、28μM、29μM或30μM。
在一些示例中，在步骤S10中，第一反应体系可以进行第一热处理。由此，第一反应体系内能够发生cDNA第一链合成反应。在另一些示例中，在第一热处理中，可以以mRNA片段为模板合成cDNA第一链并获得第一反应液。在另一些示例中，第一反应液可以包含cDNA第一链和mRNA杂交的双链(cDNA-mRNA双链)。
在一些示例中，第一热处理可以按照第一预定程序进行。在另一些示例中，第一热处理可以在PCR仪中进行。另外，在一些示例中，第一预定程序可以为：加热至25℃持续10min进行随机六聚体引物的结合，然后加热至42℃持续15min进行cDNA第一链的合成，接着加热至70℃持续15min进行酶失活。
在一些示例中，在步骤S20中，第一反应液可以与第二混合酶液和第二缓冲液混合成用于合成cDNA第二链、末端修复和末端加A的第二反应体系。
在一些示例中，第二混合酶液可以包括DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段。在这种情况下，核糖核酸酶H能够在cDNA第二链合成前去除mRNA，DNA聚合酶I和Klenow片段能够用于合成cDNA第二链，T4 DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶能够用于末端修复，Taq-B DNA聚合酶能够用于末端加A，且DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段之间能够具有协同作用，能够提高第二反应体系中各反应的反应效率。
在一些示例中，Klenow片段可以缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性。
在一些示例中，在第二反应体系中，DNA聚合酶I的工作浓度可以为0.6U/μL至1U/μL，糖核酸酶H的工作浓度可以为0.1U/μL至0.2U/μL，T4 DNA聚合酶的工作浓度可以为0.05U/μL至0.1U/μL，T4多聚核苷酸激酶的工作浓度可以为0.3U/μL至0.5U/μL，Taq-BDNA聚合酶的工作浓度可以为0.04U/μL至0.08U/μL，Klenow片段的工作浓度可以为0.08U/μL至0.12U/μL。由此，能够有效提高第二反应体系内的反应效率。
在一些示例中，在第二反应体系中，DNA聚合酶I的工作浓度可以为0.6U/μL、0.65U/μL、0.7U/μL、0.75U/μL、0.8U/μL、0.85U/μL、0.9U/μL、0.95U/μL或1U/μL。
在一些示例中，在第二反应体系中，糖核酸酶H的工作浓度可以为0.1U/μL、0.11U/μL、0.12U/μL、0.13U/μL、0.14U/μL、0.15U/μL、0.16U/μL、0.17U/μL、0.18U/μL、0.19U/μL或0.2U/μL。
在一些示例中，在第二反应体系中，T4DNA聚合酶的工作浓度可以为0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL或0.1U/μL。另外，在一些示例中，在第二反应体系中，T4多聚核苷酸激酶的工作浓度可以为0.3U/μL、0.35U/μL、0.4U/μL、0.45U/μL或0.5U/μL。
在一些示例中，在第二反应体系中，Taq-BDNA聚合酶的工作浓度可以为0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL或0.08U/μL。另外，在一些示例中，在第二反应体系中，Klenow片段的工作浓度可以为0.08U/μL、0.09U/μL、0.10U/μL、0.11U/μL或0.12U/μL。
在一些示例中，第二缓冲液可以包括第二dNTP。由此，能够提供cDNA第二链合成的原料。在另一些示例中，第二dNTP可以是指dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物。另外，在一些示例中，第二dNTP可以是dATP、dUTP、dCTP和dGTP的等量混合物。
特别地，以第二dNTP为原料合成的cDNA第二链以尿嘧啶与腺嘌呤进行碱基配对，而在cDNA第一链中则是以胸腺嘧啶与腺嘌呤进行碱基配对，由此能够区分cDNA第二链和cDNA第一链。
在一些示例中，第二缓冲液还可以包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP。在这种情况下，Tris-HCl用于维持第二反应体系的pH的稳定性，氯化镁能够提供镁离子以提高酶的活性，氯化钠用于调节离子强度，二硫苏糖醇能够维持酶的稳定性，dATP能够提供末端加A的原料，ATP用于为第二反应体系内的反应提供能量，换言之，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性，并且能够提供反应所需物质(例如第二dNTP、镁离子、dATP、ATP)和条件(例如pH、离子强度)。
在一些示例中，在第二反应体系中，第二dNTP的工作浓度可以为0.3mM至0.6mM，Tris-HCl的工作浓度可以为6mM至10mM，氯化镁的工作浓度可以为0.2mM至0.5mM，氯化钠的工作浓度可以为0.03M至0.06M，二硫苏糖醇的工作浓度可以为3mM至6mM，dATP的工作浓度可以为1.2mM至1.4mM，ATP的工作浓度可以为0.7mM至1mM。由此，能够提供有利于第二反应体系内的反应发生的环境，从而能够有助于提高第二反应体系内的各个反应的反应效率。在另一些示例中，dATP的工作浓度可以是包含第二dNTP中的dATP的总dATP的工作浓度。
在一些示例中，在第二反应体系中，第二dNTP的工作浓度可以为0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM、0.5mM、0.55mM或0.6mM。另外，在一些示例中，在第二反应体系中，Tris-HCl的工作浓度可以为6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM。
在一些示例中，在第二反应体系中，氯化镁的工作浓度可以为0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM。在一些示例中，在第二反应体系中，氯化钠的工作浓度可以为0.03M、0.035M、0.04M、0.045M、0.05M、0.055M、0.06M。
在一些示例中，在第二反应体系中，二硫苏糖醇的工作浓度可以为3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM或6mM。另外，在一些示例中，在第二反应体系中，dATP的工作浓度可以为1.2mM、1.25mM、1.3mM、1.35mM或1.4mM。在另一些示例中，在第二反应体系中，ATP的工作浓度可以为0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM。
在一些示例中，在步骤S20中，第二反应体系可以进行第二热处理。由此，在第二反应体系内进行cDNA第二链的合成、末端修复和末端加A。
在一些示例中，在第二热处理中，可选地，以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链，接着对由cDNA第一链和cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液。在另一些示例中，第二反应液可以包含由cDNA第一链和cDNA第二链组成且经末端修复和末端加A的cDNA片段。
在一些示例中，第二热处理可以按照第二预定程序进行。在另一些示例中，第二热处理可以在PCR仪中进行。另外，在一些示例中，第二预定程序可以为加热至16℃持续30min进行cDNA第二链的合成、末端修复和末端加A。
在一些示例中，在步骤S30中，第二反应液可以与T4 DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头混合成第三反应体系。
在一些示例中，在第三反应体系中，T4 DNA连接酶的工作浓度可以为10U/μL至30U/μL。例如T4 DNA连接酶的工作浓度可以为10U/μL、12U/μL、14U/μL、15U/μL、18U/μL、20U/μL、22U/μL、24U/μL、25U/μL、26U/μL、28U/μL或30U/μL
在一些示例中，在第三反应体系中，Y字型接头的工作浓度可以为1×10-7M至3×10-7M。例如，Y字型接头的工作浓度可以为1×10-7M、1.2×10-7M、1.4×10-7M、1.5×10-7M、1.7×10-7M、2×10-7M、2.5×10-7M、2.7×10-7M或3×10-7M。
在一些示例中，第三缓冲液可以包括二甲基亚砜(DMSO)。由此能够增强Y字型接头和cDNA的连接反应。在一些示例中，第三缓冲液还可以包括ATP，Tris-HCl，氯化镁，二硫苏糖醇和聚乙二醇8000(PEG 8000)。在这种情况下，Tris-HCl能够维持第三反应体系的pH的稳定性，ATP和氯化镁中的镁离子用于催化T4DNA连接酶，二硫苏糖醇能够维持T4 DNA连接酶的稳定性，聚乙二醇8000能够增稠第三反应体系促进Y字型接头与cDNA连接，换言之，第三缓冲液能够保持第三反应体系的pH以及酶的稳定性，并且能够增强接头连接反应。
在一些示例中，在第三反应体系中，二甲基亚砜的工作浓度可以为1％至1.5％，ATP的工作浓度可以为1.5mM至3mM，Tris-HCl的工作浓度可以为0.04M至0.08M，氯化镁的工作浓度可以为0.03M至0.05M，二硫苏糖醇的工作浓度可以为1mM至3mM，聚乙二醇8000的工作浓度可以为5wt％至8wt％。由此，能够提供有利于接头连接反应的环境，提高接头连接反应的反应效率。
在一些示例中，在第三反应体系中，二甲基亚砜的工作浓度可以为1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％。另外，二甲基亚砜在第三反应体系中的工作浓度用体积百分浓度％表示。
在一些示例中，在第三反应体系中，ATP的工作浓度可以为1.5mM、1.8mM、2mM、2.3mM、2.5mM、2.8mM或3mM。
在一些示例中，在第三反应体系中，Tris-HCl的工作浓度可以为0.04M、0.045M、0.05M、0.055M、0.06M、0.065M、0.07M、0.075M或0.08M。在另一些示例中，在第三反应体系中，氯化镁的工作浓度可以为0.03M、0.035M、0.04M、0.045M或0.05M。
在一些示例中，在第三反应体系中，二硫苏糖醇的工作浓度可以为1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.2mM、2.5mM、2.8mM或3mM。
在一些示例中，在第三反应体系中，聚乙二醇8000的工作浓度可以为5wt％、5.5wt％、6wt％、6.5wt％、7wt％、7.5wt％或8wt％。另外，聚乙二醇8000在第三反应体系中的工作浓度用质量百分浓度wt％表示。
在一些示例中，Y字型接头的第一序列可以为5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3'，第二序列为5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'，由此，能够提高Y字型接头与cDNA的连接效率。
在一些示例中，NNNNNNNN可以为分子标签序列，XXXXXXXX可以为样本标签序列。在这种情况下，分子标签序列能够用于识别cDNA片段，样本标签序列能够用于识别样本，由此能够有助于提高后续测序的准确性。
在一些示例中，NNNNNNNN可以为随机的碱基序列。在另一些示例中，XXXXXXXX可以为随机的碱基序列。另外，NNNNNNNN的碱基序列可以和XXXXXXXX的碱基序列不相同。
在一些示例中，第一序列的3'端经硫代修饰，第二序列的5'端经磷酸化修饰。由此，能够进一步提高Y字型接头与cDNA的连接效率。
在一些示例中，在步骤S30中，第三反应体系可以进行第三热处理。由此，第三反应体系内能够发生接头连接反应。在另一些示例中，在第三热处理中，cDNA可以与Y字型接头连接。
在一些示例中，第三热处理可以按照第三预定程序进行。在另一些示例中，第三热处理可以在PCR仪中进行。另外，在一些示例中，第三预定程序可以为加热至22℃持续15min进行接头连接。
在一些示例中，在第三热处理之后，对第三反应体系进行纯化处理可以获得第三反应液。另外，在一些示例中，利用磁珠对第三热处理后的第三反应体系进行纯化。在另一些示例中，第三反应液包含连接有Y字型接头的cDNA。
在一些示例中，在步骤S40中，第三反应液可以与预混液和扩增引物混合成第四反应体系。在另一些示例中，预混液可以包括扩增酶。另外，在一些示例中，预混液可以包括除模板和引物外的所有进行PCR所需的成分。
在一些示例中，预混液可以为Taq PCR Mix预混液、KAPA HiFi PCR Mix预混液或Q5 HotStart PCR Mix预混液。例如，预混液可以为1×的KAPA HiFi PCR Mix预混液。在另一些示例中，在第四反应体系中，预混液的工作浓度为1×。
在一些示例中，扩增引物可以为正向引物和反向引物的组合。在另一些示例中，正向引物的序列可以为5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'，反向引物可以为5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'。
在一些示例中，扩增引物的工作浓度可以2×10-7M至6×10-7M。例如，扩增引物的工作浓度可以为。2×10-7M、2.5×10-7M、2.8×10-7M、3×10-7M、3.5×10-7M、4.0×10-7M、4.5×10-7M、5.0×10-7M、5.5×10-7M、6×10-7M。
在一些示例中，第四反应体系还可以包括尿嘧啶DNA糖基酶(UNG)。由此，能够降解含尿嘧啶的cDNA第二链，从而有利于构建mRNA链特异文库。
在一些示例中，在第四反应体系中，尿嘧啶DNA糖基酶的工作浓度可以为0.02U至0.08U。由此，能够有效降解含尿嘧啶的cDNA第二链，从而能够进一步提高mRNA链特异文库的链特异性。
在一些示例中，在第一反应体系中，尿嘧啶DNA糖基酶的工作浓度可以为0.02U/μL、0.025U/μL、0.03U/μL、0.035U/μL、0.04U/μL、0.045U/μL、0.05U/μL、0.055U/μL、0.06U/μL、0.065U/μL、0.07U/μL、0.075U/μL或0.08U/μL。
在一些示例中，在步骤S40中，第四反应体系可以进行第四热处理。由此，在第四反应体系内能够降解含尿嘧啶的cDNA第二链以及进行扩增反应。在另一些示例中，在第四热处理中，可以使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着可以以cDNA第一链为模板进行扩增反应。
在一些示例中，第四热处理可以按照第四预定程序进行。在另一些示例中，第四热处理可以在PCR仪中进行。另外，在一些示例中，第四预定程序可以包括降解程序和PCR扩增反应程序。
在一些示例中，降解程序可以为加热至98℃持续10min。L另外，在一些示例中，PCR扩增反应程序可以为：首先加热至98℃持续30秒进行预变性，然后维持98℃持续10秒进行变性程序，接着降温至60℃持续30秒进行退火程序，然后升温至72℃持续30秒进行延伸程序，并且以“变性→退火→延伸”的方式循环9至15次，接着在72℃下进行5min延伸，以确保反应物完全延伸。。
在一些示例中，在第四热处理之后，对第四反应体系进行纯化处理可以获得mRNA链特异文库。另外，在一些示例中，利用磁珠对第四热处理后的第四反应体系进行纯化。在另一些示例中，可以利用PCR产物试剂盒进行纯化。
在一些示例中，第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系可以在一个反应容器(例如反应管)内形成。由此，能够使操作过程更加简单化。具体而言，在第一反应体系在反应管内经第一热处理形成为第一反应液后，向该反应管继续添加第二混合酶液和第二缓冲液形成第二反应体系，并且第二反应体系在该反应管内进行第二热处理形成为第二反应液，然后向该反应管继续添加T4 DNA连接酶、Y字型接头和第三缓冲液形成第三反应体系，接着第三反应体系在该反应管内进行第三热处理形成为第三反应液。
在本实施方式所涉及的构建mRNA链特异文库的试剂盒，其可以包括：放线菌素D、第一混合酶液、第一缓冲液、第二混合酶液和第二缓冲液。在一些示例中，第一混合酶液可以具有RNA酶抑制剂和逆转录酶。其中，逆转录酶可以为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶。在另一些示例中，第二混合酶液可以具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段。另外，Klenow片段可以缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性。另外，试剂盒可以包括放线菌素D。
在一些示例中，放线菌素D、第一混合酶液和第一缓冲液可以用于形成cDNA第一链合成用的第一反应体系。在另一些示例中，第二混合酶液和第二缓冲液可以用于形成cDNA第二链合成、末端修复和末端加A用的第二反应体系。
在一些示例中，第一缓冲液可以包括第一dNTP，第二缓冲液可以包括第二dNTP。其中，第一dNTP可以为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物，第二dNTP可以为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物。
在本实施方式中，RNA酶抑制剂能够避免mRNA被降解，核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶能够提高cDNA第一链合成的产量，由此能够提高cDNA第一链合成的效率。另外，DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶以及缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的Klenow片段之间能够具有协同作用，并能够提高cDNA第二链合成、末端修复和末端加A的效率，因此能够有助于提高mRNA链特异文库构建的效率
另外，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A均在第二反应体系中进行，能够减少末端修复和末端加A时的操作步骤(例如加样、关盖、上机反应、开盖等)，并且能够省略cDNA第二链合成形成cDNA后的纯化过程，由此能够简化反应步骤并且缩短建库的时间，并且步骤省略能够减少试剂的使用，从而能够降低成本。
在一些示例中，可选地，在第一反应体系中，放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0U/μL至1.5U/μL；在第二反应体系中，DNA聚合酶I的工作浓度为0.6U/μL至1U/μL，糖核酸酶H的工作浓度为0.1U/μL至0.2U/μL，T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL至0.5U/μL，Taq-B DNA聚合酶的工作浓度为0.04U/μL至0.08U/μL，Klenow片段的工作浓度为0.08U/μL至0.12U/μL。由此，既能够有效提高各反应的反应效率。
在一些示例中，第一缓冲液还可以包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，在第一反应体系中，dNTP的工作浓度可以为0.3mM至0.7mM，Tris-HCl的工作浓度可以为0.03M至0.06M，氯化镁的工作浓度可以为2.0mM至2.5mM，氯化钾的工作浓度可以为0.03M至0.08M，二硫苏糖醇的工作浓度可以为6mM至10mM。在这种情况下，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性，并且能够提供反应所需物质和条件。
在一些示例中，第二缓冲液还可以包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP，在第二反应体系中，dNTP的工作浓度可以为0.3mM至0.6mM，Tris-HCl的工作浓度可以为6mM至10mM，氯化镁的工作浓度可以为0.2mM至0.5mM，氯化钠的工作浓度可以为0.03M至0.06M，二硫苏糖醇的工作浓度可以为3mM至6mM，dATP的工作浓度可以为1.2mM至1.4mM，ATP的工作浓度可以为0.7mM至1mM。在这种情况下，第二缓冲液能够保持第二反应体系的pH以及酶的稳定性，并且能够提供反应所需物质和条件。
在一些示例中，第一混合酶液、第一缓冲液和第一反应体系可以如上述构建mRNA链特异文库的方法中的描述。在另一些示例中，第二混合酶液、第二缓冲液和第二反应体系可以如上述构建mRNA链特异文库的方法中的描述。
在一些示例中，试剂盒可以包括片段化缓冲液。其中，片段化缓冲液可以用于片段化处理。另外，在一些示例中，片段化缓冲液可以用于形成片段化反应体系。由此，利用试剂盒能够进行mRNA片段化处理。在另一些示例中，片段化缓冲液可以如上述构建mRNA链特异文库的方法中的描述。
在一些示例中，试剂盒可以包括T4 DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头。另外，在一些示例中，T4 DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头可以用于形成第三反应体系。其中，第三反应体系可以用于连接接头反应。在另一些示例中，T4 DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头可以如上述构建mRNA链特异文库的方法中的描述。
在一些示例中，试剂盒可以包括预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶。在另一些示例中，预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶可以用于形成第四反应体系。在另一些示例中预混液、扩增引物、尿嘧啶DNA糖基酶和第四反应体系可以如上述构建mRNA链特异文库的方法中的描述。
在一些示例中，试剂盒可以包括用于片段化处理的片段化缓冲液，T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头，以及具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶，其中T4 DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头可以用于形成连接接头用的第三反应体系，预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶可以用于形成用于降解含尿嘧啶的cDNA第二链以及对cDNA第一链进行扩增反应的第四反应体系。由此，能够降解含尿嘧啶的cDNA第二链，并且能够对cDNA第一链进行扩增，由此能够扩增出mRNA链特异文库。
在一些示例中，试剂盒还可以包括mRNA捕获磁珠(例如Oligo(dT)磁珠)、磁珠结合缓冲液、磁珠洗涤液和Tris缓冲液。由此，能够利用试剂盒捕获mRNA。
在一些示例中，利用试剂盒构建mRNA链特异文库的流程可以与上述任一构建mRNA链特异文库的方法的流程相同。换言之，利用试剂盒构建mRNA链特异文库的方法可以与上述任一构建mRNA链特异文库的方法相同。
根据本公开能够提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。
为了进一步说明本公开，以下结合实施例对本公开提供的构建mRNA链特异文库的方法进行详细描述，并结合对比例对本公开实现的有益效果进行充分说明。
[实施例1]
在本实施例中，利用商用试剂盒提取纯化人白细胞样本的总RNA作为RNA样本，接着利用Qubit3.0荧光定量仪对RNA样本进行定量，Agilent 4200生物分析仪检测样本完成情况，最后选取浓度216ng/μL且RIN为10的RNA样本作为待处理的RNA样本。
在本实施例中，第一缓冲液、第一混合酶液、第二缓冲液和第三缓冲液的配方如下表1所示。其中，第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等量混合物，第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的等量混合物。另外，Y字型接头的第一序列为5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3'，第二序列为5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTGATCGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'。
表1
(mRNA分离与片段化)
(1)根据RNA样本的浓度216ng/μL，取1000ng的RNA样本到0.2ml PCR管A中，然后加入无核酸酶水至总体积为50μL，并置于冰上备用，接着加入50μL已平衡至室温的mRNA捕获磁珠，再用移液器轻轻吸打10次充分混匀，并且按照如下表2所示的捕获程序在PCR仪中进行mRNA捕获。
表2捕获程序
(2)程序运行结束后，取下PCR管A并置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清液。
(3)将PCR管A从磁力架上取出，加入200μL磁珠洗涤液重悬磁珠，接着使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，再置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清。
(4)将PCR管A从磁力架上取出，加入50μL的Tris缓冲液重悬磁珠，接着使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后按照表3所示的洗脱程序在PCR仪中进行mRNA洗脱。
表3洗脱程序
(5)程序运行结束后，取下PCR管A并加入50μL的磁珠结合缓冲液，接着使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。
(6)将PCR管A置于磁力架上，使mRNA与总RNA分离，待溶液澄清后，小心移除上清。
(7)将PCR管A从磁力架上取出，加入200μL磁珠洗涤液重悬磁珠，接着使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后后置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清。
(8)将PCR管A从磁力架上取出，加入12μL片段化缓冲液重悬磁珠，接着使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，按照表4所示的片段化程序在PCR仪中进行mRNA片段化处理。
表4片段化程序
(9)程序运行结束，立即将PCR管A置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取10μL上清(mRNA片段)至新的PCR管(即PCR管B)中，并立刻进行第一链cDNA合成反应。
(cDNA合成、末修修复及加A)
(一)在PCR管B中，根据表5配制用于合成cDNA第一链的第一反应体系，并使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后按照表6所示的第一预定程序在PCR仪中进行第一链cDNA合成反应，其中PCR热盖温度设置为105度，待第一预定程序运行结束，立即将PCR管B取出。
表5第一反应体系
表6第一预定程序
(二)根据表7在PCR管B配制用于合成cDNA第二链(含尿嘧啶)、末端修复以及末端加A的第二反应体系，并使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后按照表8所示的第二预定程序在PCR仪中进行反应，其中PCR热盖温度设置为105度，待第二预定程序运行结束，立即将PCR管B取出。
表7第二反应体系
表8第二预定程序
(接头连接和纯化)
(a)根据表9在PCR管B配制用于合成连接接头的第三反应体系，并使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后按照表10所示的第三预定程序在PCR仪中进行接头连接反应，其中PCR热盖温度设置为105度，待第三预定程序运行结束，立即将PCR管B取出。
表9第三反应体系
表10第三预定程序
(b)取35μL水加入PCR管B中补足100μL，然后吸取90μL混匀的磁珠(0.9×)加入PCR管B，并使用移液器轻轻吸打混匀，然后室温孵育5min后将PCR管B置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清。
(c)在PCR管B中加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温下孵育30sec，小心移除上清。
(d)重复1次步骤(c)。
(e)保持PCR管B始终处于磁力架上，并在室温下开盖干燥磁珠约8min。
(f)在PCR管B中加入22μL无核酸酶水，并使用移液器轻轻吸打充分混匀，然后室温静置2min再置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取20μL纯化产物到新的PCR管(即PCR管C)中。
(cDNA第二链降解、文库扩增及文库质检)
(i)在PCR管C中，根据表11配制用于扩增反应的第四反应体系，并使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，然后按照表12所示的第四预定程序在PCR仪中进行含尿嘧啶的cDNA第二链的降解和一cDNA第一链为模板的PCR扩增反应，其中PCR热盖温度设置为105℃，待第四预定程序运行结束，立即将PCR管C取出。
表11第四反应体系
表12第四预定程序
(ii)吸取40μL混匀的磁珠(0.8序)加入到PCR管C中，接着使用移液器轻轻吸打混匀，然后室温孵育5min，再将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清。
(iii)在PCR管C中加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温下孵育30sec，小心移除上清。
(iv)重复1次步骤(iii)。
(v)保持PCR管C始终处于磁力架上，并在室温下开盖干燥磁珠约8min。
(vi)在PCR管C中加入20μL无核酸酶水，并使用移液器轻轻吸打充分混匀，然后室温静置2min再置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取全部上清液到新的PCR管(即PCR管D)中，即获得mRNA链特异文库。
(vii)利用Qubit3.0荧光定量仪对PCR管D中的mRNA链特异文库进行浓度测定，Agilent 4200生物分析仪检测大小，文库质检结果如表14所示。
[实施例2至实施例4]
实施例2至实施例4与实施例1相比，分别使用按照表13所示的配方制得的第二混合酶液，其余均以实施例1相同的方式进行处理至获得mRNA链特异文库及文库质检，文库质检结果如表14所示。
表13第二混合酶液
[对比例]
在本对比例中，使用
Ultra II Directional RNA Library PrepKit for
试剂盒按照说明书对与实施例1至实施例4相同的样本构建mRNA链特异文库(建库流程如图2所示)，并以实施例1相同的方式进行文库质检，文库质检结果如表14所示。
表14文库质检结果
| 成本(元) | 用时(h) | 片段大小(bp) | 出库浓度(ng/ul) | 扩增效率 | |
| 实施例1 | 38.5 | 3.75 | 412 | 44.6 | 137％ |
| 实施例2 | 39.93 | 3.75 | 396 | 33.7 | 103％ |
| 实施例3 | 40.29 | 3.75 | 421 | 43.5 | 133％ |
| 实施例4 | 40.76 | 3.75 | 408 | 35.3 | 108％ |
| 对比例 | 299.02 | 6.35 | 398 | 32.6 | 100％ |
从表14可以看出，实施例1至实施例4与对比例相比，实施例1至实施例4的成本降低、扩增效率提高、用时减少2.6h，特别地，在上述实施例中，实施例1相较于对比例建库成本降低87％左右，扩增效率提高37％，由此可见，实施例中所使用的构建mRNA链特异文库的方法有利于提高建库效率。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (12)
1.一种构建mRNA链特异文库的方法，其特征在于：
包括：
准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物，所述mRNA片段经片段化处理，并且所述片段化处理于片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行，所述片段化缓冲液包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物，在所述片段化反应体系中，所述镁离子的工作浓度为0.3mM至1.0mM；
将所述第一反应液与具有DNA 聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物；
将所述第二反应液与T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且
在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8 U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0 U/μL至1.5U/μL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
在所述第二反应体系中，所述DNA 聚合酶I的工作浓度为0.6 U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1 U/μL至0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.05 U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3 U/μL至0.5U/μL，所述Taq-B DNA聚合酶的工作浓度为0.04 U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08 U/μL至0.12U/μL。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，
在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。
5.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于：
所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP；
在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述第三缓冲液还包括ATP，Tris-HCl，氯化镁，二硫苏糖醇和聚乙二醇8000，
在所述第三反应体系中，所述T4 DNA连接酶的工作浓度为10U/μL至30U/μL；所述Y字型接头的工作浓度为1×10-7 M至3×10-7M；所述二甲基亚砜的工作浓度为1%至1.5%，所述ATP的工作浓度为1.5mM至3mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.04M至0.08M，所述氯化镁的工作浓度为0.03M至0.05M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为1mM至3mM，所述聚乙二醇8000的工作浓度为5wt%至8wt%。
7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于：
所述Y字型接头的第一序列为5'-AATGATACGGCGACCACCG AGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3'，第二序列为5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCC AGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'，
其中，所述第一序列的3'端经硫代修饰，所述第二序列的5'端经磷酸化修饰，NNNNNNNN为分子标签序列，XXXXXXXX为样本标签序列。
8.一种采用如权利要求1至7任一项所述的方法构建mRNA链特异文库的试剂盒，其特征在于：
包括：用于进行mRNA片段化处理的片段化缓冲液、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液，以及具有DNA 聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液和具有第二dNTP的第二缓冲液，
其中，所述片段化缓冲液包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物，在所述片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中，所述镁离子的工作浓度为0.3mM至1.0mM，
所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物，
所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，
所述放线菌素D、所述第一混合酶液和所述第一缓冲液用于形成cDNA第一链合成用的第一反应体系，所述第二混合酶液和所述第二缓冲液用于形成cDNA第二链合成、末端修复和末端加A用的第二反应体系。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：
在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8 U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0 U/μL至1.5U/μL；
在所述第二反应体系中，所述DNA 聚合酶I的工作浓度为0.6 U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1 U/μL至0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.05 U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3 U/μL至0.5U/μL，所述Taq-B DNA聚合酶的工作浓度为0.04 U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08 U/μL至0.12U/μL。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：
所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，
在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。
11.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：
所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP，
在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。
12.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：
还包括T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头，以及具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶，其中
所述T4 DNA连接酶、所述第三缓冲液和所述Y字型接头用于形成连接接头用的第三反应体系，所述预混液、所述扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶用于形成用于降解含尿嘧啶的cDNA第二链以及对cDNA第一链进行扩增反应的第四反应体系。
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