KR101039521B1

KR101039521B1 - 금속 이온에 의해 발생하는 ｐｃｒ 저해 및 비특이 증폭을완화시키거나 막을 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산을킬레이트제로 포함하는 ｐｃｒ 반응용 조성물

Info

Publication number: KR101039521B1
Application number: KR1020080010501A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 강상현; 강정옥
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2011-06-08
Also published as: KR20090084364A

Abstract

본 발명은 PCR의 증폭 효율성을 높이면서 비특이 증폭을 감소시키기 위하여, PCR 반응에 위해한 2가 양이온을 포함한 금속 이온을 선택적으로 킬레이트할 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(EGTA)을 킬레이트제로 포함하는 PCR 반응 조성에 관한 것이다. 본 발명의 PCR 반응액 조성은 PCR 반응에 필수적인 마그네슘 이온의 농도에는 최소한의 영향을 주면서 PCR 반응액을 구성하는 여러 성분으로부터 혼입되거나 PCR용 시료로부터 혼입되는 금속 이온에 의한 PCR 반응의 저해 현상과 PCR 반응에서의 비특이 증폭을 막거나 완화시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 PCR 반응액의 구성 성분 자체의 변동성에 의해 초래되는 PCR 반응액의 변동성과 PCR용 시료의 기원의 다양성에 의해 초래되는 PCR 반응액의 변동성에 의해서 PCR 반응 자체가 크게 훼손되지 않게 하고 결과적으로 소망한 PCR 결과를 얻게끔 해 준다.

PCR, 2가 양이온, 금속, 증폭효율, 비특이 증폭, 저해, 킬레이트제

Description

금속 이온에 의해 발생하는 ＰＣＲ 저해 및 비특이 증폭을 완화시키거나 막을 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산을 킬레이트제로 포함하는 ＰＣＲ 반응용 조성물 {PCR composition comprising ethylene glycol tetraacetic acid as a chelating agent for reducing or preventing PCR inhibition and non-specific amplification caused by metal ion}

본 발명은 PCR(polymerase chain reaction)의 증폭(amplification) 효율(efficiency) 개선과 비특이 증폭(non-specific amplification)의 완화 및 방지 방법에 관한 것이다. 구체적으로, PCR 반응에 필수적인 마그네슘(magnesium)이온의 농도에는 최소한의 영향을 주면서도 PCR 반응을 저해(inhibition)하거나 PCR 반응에서의 비특이 증폭을 야기하는 2가 양이온(divalent cation)을 포함한 금속 이온을 선택적으로 킬레이팅(chelating)할 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA)을 킬레이트제(chelating agent)로 포함하는 PCR 반응용 조성액에 관한 것이다.

PCR은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안되었으며 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 현재까지도 널리 이용되고 있는 기법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 기법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 복제를 시작하기 위해서는 시작 부위가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합(annealing)하여 두 가닥 형태의 DNA가 되어야 한다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제가 개시될 수 있다. 주형 DNA 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머(primer) 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반하기 때문에 PCR 주기(cycle)는

1) 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계,

2) 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합하는 결합 단계, 및

3) DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 되는 신장 단계

의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형 DNA와 PCR에 의해 새로 합성된 DNA 모두가 DNA 주형이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 DNA 주형의 수는 계속 늘어나게 된다. 따라서 n번의 PCR 주기 후에는 이론적으로 2ⁿ 개의 두 가닥 DNA가 존재하게 된다. 즉, 1 개의 주형 DNA로부터 (2ⁿ -1) 개의 복사본이 합성된 꼴이다. PCR은 그 반복되는 주기마다 첫 단계로 90℃ 이상의 높은 온도에서 DNA를 변성시키는 단계가 있는데, 이 단계에서 DNA 중합효소 (PCR 개발 초기 단계에서 사용하던 상기 중합효소는 열적 안정성이 낮은데 이 중합효소를 mesophilic DNA polymerase라 함)도 함께 변성될 수 있다. 이런 이유로 인하여 개발 초기의 PCR에서는 DNA 중합효소를 매 주기마다 반응액에 새로이 첨가해 주어야 했다. 그러나 Thermus aquaticus라는 온천에 사는 호열성 세균(thermophile)에서 열에 비교적 안정한 DNA 중합효소가 새롭게 발견되면서 이 문제는 해결되어 PCR의 매 주기마다 DNA 중합효소를 다시 넣어 주지 않고 PCR 반응 시작 때만 DNA 중합효소를 한번 넣어주면 되게 되었다. 이 DNA 중합효소(Taq DNA polymerase라 함)는 72℃가 최적온도이며, 94℃에서도 안정하다. 이 Taq DNA 중합효소의 발견은 PCR을 보다 손쉽게 실시할 수 있게 하였으며, 결과적으로 PCR이 다양한 연구 분야에서 활용되게 한 계기가 되었다(Science 252: 1643-1651, 1991). 이제 PCR 기법은 대부분의 연구 분야 에서 활용되고 있는 매우 강력한 실험 기법이 되었다.

Taq DNA 중합효소 발견 이후 PCR 관련 기술은 획기적으로 발전하였으며 주로 이러한 발전은 새로운 DNA 중합효소의 탐색 및 새로운 PCR 기법의 개발에 의해서였다. 새로이 개발 또는 발견된 DNA 중합효소로는 Thermus thermophilus 유래의 Tth DNA 중합효소, Thermus flavus 유래의 Tfl DNA 중합효소, Thermus ubiquitos 유래의 Hot Tub DNA 중합효소, Thermotoga maritima 유래의 Ultma DNA 중합효소, Pyrococcus furiosus 유래의 Pfu DNA 중합효소, Thermococcus litoralis 유래의 Vent DNA 중합효소 및 Tli DNA 중합효소, Pyrococcus woesei 유래의 Pwo DNA 중합효소 등이 있다(이상 제품명). 이 DNA 중합효소들은 각기 구별되는 특징을 가지고 있어 서로 구별되게 다양한 PCR에 활용되고 있다. 즉, 이들 DNA 중합효소 간에는 DNA 합성속도, 중합효소가 주형 DNA에 결합했다가 분리될 때까지 합성하는 뉴클레오티드(nucleotide)의 수, 주형-프라이머 종류에 대한 선호성, 및 저해제에 대한 감수성에서 차이가 있다. 또한 최근에는 이들 DNA 중합효소를 서로 혼합하여 사용하는 방법도 개발되었다. 이러한 DNA 중합효소의 혼합사용은 서로의 PCR에서의 장점을 활용할 수도 있게 하면서 또한 저해제에 의한 저해 효과를 분산시키는 이점도 제공한다.

최근까지 개발된 PCR 기법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시 켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 매우 많은 기법들과 관련 기술들이 개발 되었다. 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

이런 새로운 DNA 중합효소의 개발 및 새로운 PCR 기법의 개발과 병행하여 자연스럽게 PCR 반응 자체의 효율성을 개선하려는 시도들이 있어 왔다. PCR 반응의 효율성을 높이려는 시도는 다양한 방법으로 시도되었는데, 그 예로 PCR 장치(machine)의 개량, 기존 DNA 중합효소의 단백질 공학(protein engineering)적 개량, PCR 반응 성분(component)들의 고순도화, PCR 반응을 증진시킬 수 있는 PCR 반응 증진제(enhancer)의 적용, 및 DNA 중합효소 등 PCR 반응의 필수 성분들의 안정성(stability)을 높여줄 수 있는 안정화제(stabilizer)의 적용 등의 방법이 있었다. PCR 장치의 개선의 예로는 가열 및 냉각 블록(block)의 열전달 효율을 개선한다거나 열전달 속도를 빠르게 한다는 등의 PCR 반응 온도의 효율적 제어 장치의 고안을 들 수 있고, DNA 중합효소의 개량의 예로는 엑소뉴클리에이즈(exonuclease) 제거형의 새로운 DNA 중합효소의 개발을 들 수 있고, PCR 반응 성분들의 고순도화의 예로는 PCR 반응에 필요한 뉴클레오티드의 순도를 높여 PCR 반응을 저해할 수 있는 무기 피로인산(inorganic pyrophosphate; PPi) 등의 포함을 최대한 낮추는 시도 등을 들 수 있고, PCR 증진제의 사용 예로는 삼투농도(osmolarity)를 변화시켜 PCR 반응의 효율을 높일 수 있는 슈크로즈(sucrose) 및 트레할로즈(trehalose) 등의 탄수화물(carbohydrate) 성분을 PCR 반응에 첨가해 주는 것을 들 수 있으며 이 러한 PCR 증진제의 또 다른 예로는 상기 탄수화물 외에 젤라틴(gelatin)이나 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 등이 있으며, 안정화제를 첨가해 주어 PCR 반응을 개선한 예로는 DNA 중합효소의 안정성 증진을 목적으로 트윈 20(Tween 20)이나 NP-40 등의 비이온성 계면활성제(non-ionic detergent)를 PCR 반응에 첨가해 주는 것을 들 수 있다. 상기 내용과 관련된 내용은 매우 방대하며 이를 본 명세서에 다 제시하는 것은 불가하여 생략한다.

상기에 제시한 것과 같이 다양한 PCR 관련 기술이 개발된 것과는 달리 PCR 반응을 저해하는 물질에 대한 해결책은 매우 적다. 비록 PCR 저해 물질에 대한 많은 규명은 있었지만(Appl. Environ. Microbiol. 63: 3741-3751, 1997) 그것에 대한 극복 방안의 제시는 매우 미흡한 실정이다. 이는 그 만큼 해결책의 확보가 어렵다는 것을 의미하기도 한다 할 수 있다. 분명한 것은 PCR 반응을 저해하는 물질에 의한 저해현상을 극복할 수 있는 방안의 개발이 PCR 반응의 효율성 개선에 크게 도움이 될 수 있다는 것이다. 또한 PCR 저해제가 PCR 반응 자체를 망쳐 잘못된 부정 결과(false-negative result)를 초래하기도 한다는 점을 고려하면 PCR 결과의 신뢰성을 높이는데도 크게 도움이 될 수 있다. 이는 PCR에 기반한 진단(diagnosis)에 있어 매우 중요하다. 이런 잘못된 부정 결과의 초래는 내재 기준(internal control)을 PCR에 도입하여 극복할 수는 있지만 PCR 효율성 제고라는 측면에서 PCR 저해 물질에 관련된 문제의 극복은 반드시 해결되어야 할 것이다.

PCR에서 저해 물질에 의한 문제의 심각성은 PCR 반응의 고유한 높은 민감도(sensitivity)로부터 기인한다. PCR 반응은 매우 민감하기 때문에 매우 소량의 유전자로부터 증폭이 가능하다. 이러한 민감한 특성은 소량의 유전자의 존재 여부를 판별해야 하는 진단에서는 매우 유용하다. 그래서 PCR은 진단 분야에서 활용되는 많은 기법들 중에서 최고의 민감도를 제공한다. 이러한 높은 민감도는 PCR의 강점이기도 하지만 한편으로 PCR 반응을 매우 조심스럽게 잘 준비해야 한다는 부담을 발생시킨다.

현재까지의 PCR 저해 물질에 관련되어 제시된 해결책으로는 특별한 것이 거의 없다. 가급적 고순도의 시약을 사용하고 PCR 반응액 구성에 사용되는 물도 초순수(ultra pure water)를 사용하여 저해 물질 자체가 PCR 반응액에 포함되지 않게 하라는 정도이다. 이는 매우 소극적 방안이며 좀더 기술적인 해결책이 필요하다 할 것이다. 물론 이러한 방법은 어느 정도의 효과를 보장한다. 이러한 방법은 PCR 반응을 구성하는 성분에 의한 저해 물질의 오염은 상당 수준 낮출 수 있으나 전체 PCR 관련 비용의 증가를 초래한다. 또 아무리 노력한다 해도 일정 수준 저해 물질이 혼입된다. 또한 상기의 소극적 방법은 증폭할 유전자(target gene)를 포함하고 있는 PCR용 시료(sample) 자체에 의한 저해 물질의 오염은 전혀 막을 수 없다. 최근 연구 분야가 다양해지면서 PCR용 시료의 원천(sources; origins)도 매우 다양해지고 있어 PCR 시료 자체에 의한 저해 물질의 혼입 가능성은 매우 높다. 특히 토양 시료, 식품 시료, 임상 시료에서 이러한 가능성은 높다. 이런 다양한 PCR용 시료의 사용으로 인하여 초래될 수 있는 저해 물질의 오염에 의한 PCR 반응의 저해 현상을 극복할 수 있는 새로운 방안의 확보가 필요하다. 이는 안정적 PCR을 수행하기 위해 반드시 해결되어야 한다.

PCR용 시료에 의한 저해 물질의 오염을 피하기 위해 다양한 방법들이 시도되었다. PCR용 시료를 투석(dialysis) 한다거나 염화세슘(CsCl) 농도 구배(gradient)를 이용한 원심분리를 실시하기도 하나 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, 2001) 이는 시료 전처리(pre-treatment) 단계를 생성시켜 속도(speed)를 중시하는 최근의 요구에 부합하지 않는다. 따라서 시료 전처리가 필수적 과정으로 요구되지 않는 새로운 극복 방안의 고안이 필요하다. 참고로 PCR용 시료 제조를 위해서 대부분의 경우에서 실시하는 주형 DNA의 추출 단계에서 특정 단계를 도입하여 PCR용 시료에 저해 물질이 적게 혼입되게 하는 방안도 이용되고 있다. 즉, DNA 추출 시에 이온-교환 컬럼(ion-exchange column)을 사용한다거나, 유리구슬(glass bead)을 이용한 DNA 추출(extraction)법을 활용한다거나, DNA 추출에 면역자성 분리(immunomagnetic separation)법을 이용한다거나, 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 활용하여 DNA를 추출한다거나, 음이온-결합 수지(anion-binding resins)를 이용한 DNA의 추출을 실시한다거나, 또는 스핀 칼럼(spin column)을 이용한 DNA 추출을 적용하는 것 등이 그 예들이다. 이러한 시도들 중 일부 방법은 시간소요를 증가시키거나 비용을 증가시킨다. 또 이러한 추가 단계(additional manipulation)의 적용은 상호 오염의 위험(cross-contamination risk)을 증가시키고 잘못된 결과(false-positive result)를 초래하기도 한다(J. Med. Microbiol. 72: 112-118, 1997). 결론적으로 아직 완벽한 방법들은 아니다. 또한 이들 방법들은 일부 저해 물질에 관련된 문제에는 다소 효과적이나 모든 저해 물질에 효과적인 것은 아니다. 특히 금속 이온성 저해 물질에 관련 된 문제 해결에는 그다지 효과적이지 못하다. 왜냐하면 금속 이온성 저해 물질의 저해 효과는 극히 낮은 농도에서도 발생되고 상기 방법에서 사용하는 물을 포함한 용매나 완충액(buffer)에도 대부분 낮은 농도로 저해성 이온 물질이 존재하고 있기 때문이다. 따라서 PCR 반응액 자체에 낮은 농도로 존재하는 이온성 저해 물질에 의한 저해 효과를 억제할 수 있는 방법의 고안이 필요하다. 즉, 이온성 저해 물질이 PCR 반응액 구성에 적게 혼입되게 하는 상기 방법과 더불어 피할 수 없이 혼입된 이들 낮은 농도로 존재하는 이온성 저해 물질에 의한 저해 효과를 억제하는 데에 효과적인 방법의 개발이 필요하다. 특히 이러한 방법의 고안은 아직 완벽한 기술로 자리를 잡지는 못했지만 곧 실용화될 기술로 인정받고 있는 “직접 PCR(시료를 전처리 없이 직접 PCR 반응에 첨가하여 실시하는 PCR. 매우 편리할 수 있는 잠재력을 가졌지만 시료에 포함한 저해 물질이 직접 PCR 반응에 걸러지지 않고 첨가되므로 PCR 결과가 시료 자체의 품질에 크게 영향을 받음)”의 발전 및 향후 응용에 매우 유용할 것이다.

종래기술에서 저해 물질의 혼입을 차단하고자 하는 상기의 방안과는 달리 이미 PCR 반응 용액에 혼입되어 있는 저해 물질에 의한 PCR 저해 현상을 극복하고자 하는 방안으로는 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)을 PCR 반응액에 첨가해 주어 저해 물질을 흡착하여 저해 물질에 의한 PCR 저해 현상을 극복하고자 하는 방안이 있다. BSA를 이용하는 방법은 주로 저해성 고분자 물질에 효과적이다. BSA에 기반한 방안은 흡착 기작(mechanism)에 의하여 달성된다. 따라서 특이성이 없다. 매우 비특이적이다. 통상 시료에 자주 혼입되어 PCR 반응에 나쁜 영향을 주는 금속 이온에 의한 저해 현상 방지에는 전혀 효과적이지 못하다. 따라서 이런 이온성 저해 물질, 특히 금속 이온에 의한 저해 현상을 해결하기 위해서는 흡착 기작 같은 비특이적인 기작이 아닌 이온에 특이적인 방법(specific method)에 기반한 방안이 고안되어야만 한다. 특히 상기 금속 이온에 의한 저해 현상은 매우 낮은 농도로 존재할 때도 나타난다는 점을 고려하면 특이성뿐만 아니라 그 효율성도 매우 높아야 한다. 또 PCR 반응에는 꼭 필요한 금속 및 양이온들이 있으므로 이들 꼭 필요한 금속 및 양이온들의 농도에는 크게 영향을 주지 않으면서도 이들 이온에 비해 상대적으로 낮은 농도로 존재하는 그 외의 금속 이온들에 의한 PCR 저해 현상을 억제하는 데에 효과적인 방안의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 이러한 금속 이온에 의한 PCR 저해 현상은 전기적 성질에 기반한 킬레이팅 기작을 활용한다면 해결 가능할 것으로 확신하고 PCR 반응에 필수적인 이온들에는 최소한의 영향을 주면서 그 외의 저해성 금속이온을 선택적으로 킬레이트할 수 있는 킬레이트제를 선별하여 이를 이용한 PCR 반응 조성을 고안함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 PCR 반응을 구성하는 성분 및 PCR 반응용 시료로부터 혼입될 수 있는 2가 양이온을 포함한 금속 이온에 의한 PCR 저해 현상 및 이들에 의해서 증진되는 비특이 증폭을 효과적으로 억제하면서도 PCR 반응에 필수적인 이온 성분들의 농도에는 최소한의 영향을 주는 신규한 PCR 반응용 조성물을 제안하는 것이다.

즉, 본 발명은 PCR 반응에 필수적인 이온 성분에는 최소한의 영향을 주면서도 PCR 반응을 구성하는 성분 및 PCR 반응용 시료로부터 혼입될 수 있는 2 가 양이온을 포함한 금속 이온에 의한 PCR 저해 현상 또는 이들로부터 증진되는 비특이 증폭을 완화 또는 막을 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 이를 위해 PCR 반응에 좋은 영향을 주거나 반드시 필요하다고 공지된 마그네슘 이온, 칼륨(potassium) 이온, 암모늄(ammonium) 이온, 나트륨(sodium) 이온에 비해 이들을 제외한 다른 금속 이온들과 킬레이트(chelate)를 잘 형성할 수 있는 킬레이트제를 선별하고자 노력하였다. 특히 필수 이온을 제외한 가급적 많은 종류의 금속 이온에 작용할 수 있는 킬레이트제를 선별하고자 하였다.

이러한 시도의 근거로는 통상 PCR 반응에 꼭 필요한 금속 이온 이외의 전이 금속(transition metal) 이온을 포함한 대부분의 금속 이온이 PCR 반응액에 존재할 때 이것이 PCR 반응에 유해한 작용을 하기 때문이다. PCR 반응은 전과정이 비교적 고온에서 진행되는데, 이 때 반응액 속에 녹아 있던 산소로부터 과산화수소(H2O2)가 만들어지며 이것이 DNA 및 DNA 중합효소의 변성을 초래하는 직접적인 원인인 것으로 알려져 있다(Nucleic Acids Research 30: 1354-1363, 2002). 구체적으로는 열에 의해 생성된 과산화수소는 금속 이온과의 전자전달 작용(electron transfer mechanism)에 의하여 단일 가닥 절단(single strand breaks), 이중 가닥 절단(double strand breaks), 염기의 탈퓨린화(base depurination), 염기의 탈아민화(base deamination), 및 8-옥소구아닌화(8-oxoguanine) 등의 염기 변이(modified bases), 및 DNA와 단백질의 결합(DNA-protein closslink)을 초래한다(Free Radical Biol. Med. 10: 225-242, 1991; FEBS Lett. 281: 9-19, 1991; Mutat. Res. 275: 331-342, 1992). 이러한 반응은 DNA 손상을 초래하고 초래된 DNA 손상은 결국 PCR 반응에 나쁜 영향을 주게 된다. 그리고 금속 이온은 극미량으로도 존재하면서도 DNA 손상을 유발할 수 있다. 그런데 PCR용 시료의 준비과정 및 PCR 반응액의 제조에 있어 불가피하게 포함될 수밖에 없기 때문에 이들 금속 이온의 오염에 의한 PCR 반응에의 유해작용을 피하기란 쉽지 않은 일이다. 따라서 반응액에 포함되어 있는 금속 이온에 의한 피해를 막기 위해서는 금속 이온의 작용을 선택적으로 막을 수 있는 방법이 마련되어야 한다. DNA 손상을 유발할 수 있는 금속 이온은 망간(manganese) 이온, 철(iron) 이온, 크롬(chromium) 이온, 구리(copper) 이온, 니 켈(nickel) 이온, 코발트(cobalt) 이온, 수은(mercury) 이온 및 아연(zinc) 이온과 같은 전이 금속 이온 및 칼슘 이온과 같은 2가 양이온들로서 이들은 아주 낮은 농도로 존재하면서도 PCR 반응에서 저해 효과를 나타낼 수 있다.

킬레이트제 선별에 있어 본 발명자들은 특히 PCR에서 위해성이 잘 알려진 2 가 양이온, 그 중에서도 칼슘 이온이나 망간 이온을 선택적으로 킬레이트하는데 효과적인 킬레이트제를 찾고자 노력하였다. 본 발명자들은 이러한 목적에 부합할 수 있는 킬레이트제로 에틸렌글리콜테트라아세틱 산을 선별하여 이를 적용하여 PCR 반응액 조성을 구성함으로써 PCR용 시료의 변동성 등에 의한 PCR 반응액 조성의 변동에도 안정된 성능을 제공해 줄 수 있는 신규 PCR용 반응 조성을 고안하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 PCR 반응의 킬레이트제로서, 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA) 또는 이의 유도체를 유효 성분으로 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공한다.

2가 양이온 중 칼슘 이온이 PCR 반응을 저해한다는 점은 이미 잘 알려져 있다(Appl. Environ. Microbiol. 63: 3741-3751, 1997). 칼슘 이온은 아주 낮은 농도로 존재하면서도 PCR 반응에서 저해 효과를 나타낼 수 있다. 우유(milk) 시료가 좋은 PCR용 시료가 되지 못하는 것도 바로 이 칼슘 이온이 많기 때문이다. 또한 망간 이온은 DNA 중합효소의 주형 특이성도 낮추어 결국 PCR에서 비특이 증폭을 증가시킨다고 알려져 있다(Biochemistry 24: 5810-5817, 1985).

그러나 상기 이온들에 의해 초래되는 문제를 극복할 수 있는 방안이 PCR에 적용된 사례는 지금까지 없었다. 본 발명자들은 이들 2가 양이온을 포함한 금속 이온에 의한 문제는 이들과 선택적 결합이 가능한 물질을 탐색하면 극복될 수 있다고 생각했고 이 선택적 결합에는 킬레이팅(chelating) 반응이 이용 가능하겠다고 생각했다. 킬레이팅에 의해 형성되는 킬레이트는 금속 이온과 결합 물질(complexing agent; 이것이 바로 킬레이트제임)이 결합하여 생성된 수용성 복합체(water soluble complex)이다. 킬레이트는 용액(solution)에서 쉽게 해리(dissociate)되지 않는 불활성 복합체(inert complex)이다. 이러한 킬레이팅에 참여하는 킬레이트제는 금속 이온에 한 쌍(a pair)의 전자(electron)를 제공(donate)할 수 있는 작용기(functional group)를 적어도 두 개 이상 가지고 있어야 한다. 또한 이 작용기들은 금속 이온과 환형 구조 형성(ring formation)이 가능하게 위치하고 있어야 한다.

그런데 PCR 반응 구성에는 다양한 이온 성분이 포함되어 있고 그 중에는 양이온, 특히 2가 이온도 있다. PCR 반응 구성에 존재하는 2가 양이온으로 필수적인 이온은 마그네슘 이온이다. 이 마그네슘 이온은 사용하는 DNA 중합효소나 PCR 방법에 따라 적합한 농도가 존재하며 여기에서 벗어나면 PCR 반응의 효율이 나빠지며 심한 경우는 PCR 반응이 완전히 일어나지 않기도 한다.

본 발명자들은 공지된 다양한 킬레이트제 중 PCR 반응에 꼭 필요한 마그네슘 이온을 포함한 유용 이온에는 거의 영향을 주지 않으면서도 칼슘 이온이나 망간 이온을 포함한 금속 이온들을 선택적으로 킬레이트할 수 있는 더 나아가 매우 낮은 농도로 존재하더라도 킬레이트할 수 있는 킬레이트제를 PCR 반응을 구성하는 주요 성분으로 채택함으로써 PCR 반응 성분으로부터 혼입되거나 PCR용 시료에서부터 혼입되는 금속 이온, 그 중에서도 2가 양이온에 의한, 특히 칼슘 이온과 망간 이온에 의한 PCR 저해 및 PCR에서의 비특이 증폭을 방지할 수 있는 방법을 고안하여 PCR 반응 성분 및 다양한 PCR용 시료에 기인한 PCR 조건의 변동성을 극복할 수 있는 매우 안정된 PCR 반응을 제공할 수 있는 PCR 반응 조성을 개발하였다.

본 발명자들에 의해 선별된 킬레이트제는 EGTA이다. EGTA는 킬레이트제의 하나로 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)과 관련되어 널리 알려져 있다. 그러나 EGTA는 통상 EDTA 같은 킬레이트제와는 달리 마그네슘 이온보다 칼슘 이온 및 망간 이온에 대한 친화력(affinity)이 훨씬 크다. 이러한 이유로 EGTA는 살아 있는 세포(living cell) 내 환경(environment)과 유사한 조건을 가진 완충 용액(buffer solution)을 만들 때 사용되기도 한다. 살아 있는 세포 내 환경은 마그네슘 이온에 비해 천배이상 낮은 농도로 칼슘 이온이 있는 환경이다. 결론적으로 EGTA는 마그네슘 이온에는 거의 영향을 주지 않으면서 PCR 반응액에 존재하는 칼슘 이온이나 망간 이온의 선택적 킬레이팅에 매우 효과적이다. 마그네슘 이온은 PCR 반응에서 아주 중요한 이온(vital cofactor)이다. 이것의 농도가 변하게 되면 PCR 반응을 망치게 된다. 따라서 이것까지도 킬레이팅할 수 있는 EDTA 같은 킬레이트제를 사용하면 PCR 반응을 망치게 된다. 이런 이유로 통상의 킬레이트제는 PCR 반응에서 저해제로 작용한다. 아주 악명 높은 PCR 저해 물질 중 하나인 휴믹 물질(humic compounds)의 저해 기작이 바로 마그네슘 이온을 킬레이 션(chelation)하는 것이다(Appl. Environ. Microbiol. 58: 754-757, 1992). 이런 점에 비추어 EGTA는 PCR에 적용하기에 안성맞춤이다. EGTA가 마그네슘 이온에 비해 더 안정한 킬레이트를 형성할 수 있는 대표적 이온으로는 Ag⁺, Ca² ⁺, Cd² ⁺, Co² ⁺, Cu²⁺, Fe² ⁺, Fe³ ⁺, Hg⁺, Mn² ⁺, Ni² ⁺, Pb² ⁺, Sn² ⁺, Zn² ⁺ 등이다(알파벳 순). EGTA의 화학구조식은 다음 화학식 1과 같다.

EGTA를 PCR 반응에 적용하고자 함에 있어 반드시 EGTA만을 사용해야 할 필요는 없다. EGTA 외에 EGTA의 유도체(EGTA derivative) 형태도 문제없이 사용할 수 있다. EGTA의 유도체로는 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세틱 산(1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraactic acid; BAPTA)과 니트로페닐-EGTA(nitropheny-EGTA) 등이 있다.

상기 EGTA나 EGTA 유도체는 시약회사에 의해서 염(salt) 형태로 제조되어 판매되거나 일반 산(free acid) 형태로 판매되고 있다. 이때 EGTA-염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태가 일반적이나 그 종류에 따른 효과에서는 큰 차이가 없다. 이런 염 형태로 판매되고 있는 것은 구입한 뒤 그냥 물 같은 적당한 용매에 녹여 사용하면 된다. 그러나 일반 산 형태로 판매되고 있는 것은 물 같은 용매에 녹이면서 pH를 조정해 주어야만 완전히 녹일 수 있다. 이 pH 조정에는 알칼리 용액이 사용되며 통상 사용되는 알칼리 용액으로는 수산화나트륨(NaOH) 및 수산화칼륨(KOH) 등이 있다. 이에 대한 상세한 과정은 당업자에게는 일반적이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

PCR 반응액 구성에 첨가되는 EGTA의 양은 너무 낮으면 효과를 기대할 수 없고 너무 높으면 마그네슘 이온의 농도까지 영향을 줄 수 있어 바람직하지 않다. 통상 0.001-10 mM이 바람직하며, 더 바람직하게는 0.01-5 mM, 가장 바람직하게는 0.1-1.5 mM이다. 참고로 시료를 전처리 과정 없이 직접 PCR 반응에 첨가하여 PCR을 수행하려는 "직접-PCR" 등에서는 매우 많은 양의 금속 이온이 혼입될 수 있다. 이런 특이한 경우에는 상기의 EGTA 농도보다 상당히 높은 EGTA의 농도를 필요로 한다. 따라서 이런 특이한 경우에 본 발명을 이용하고자 할 때에는 직접 시료에 적합한 EGTA 농도를 실험을 통하여 결정하여야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 작업에 속하므로 특별히 설명하지는 않겠다.

EGTA가 적용된 PCR 조성은 대부분의 PCR에 효과적으로 사용될 수 있다. 그러나 인위적 돌연변이 유발을 목적으로 하는 돌연변이 PCR(mutagenic PCR)에는 적합하지 않다. 이 돌연변이 PCR에서는 돌연변이 유발을 증진시키기 위해 높은 망간 이온의 존재를 필요로 하고 잘 맞지 않는 주형-프라이머 결합의 안정성을 제공하기 위해 아주 높은 마그네슘 이온의 존재를 필요로 한다. 이런 경우에 EGTA의 첨가는 상기 조건 형성에 방해가 될 수 있다. 이런 특별한 경우를 제외하고는 대부분의 PCR의 경우 EGTA의 첨가는 효과적이다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 제공하는 PCR 반응용 조성물을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 PCR 방법을 제공한다.

본 발명의 PCR 방법은 당업자가 통상적으로 사용하는 모든 PCR 방법과 동일하며, 단지 PCR 반응용액으로서, 본 발명의 PCR 반응용 조성물을 사용하는 점만 다르다.

또한, 본 발명은 본 발명의 PCR 반응용 조성물을 포함하는 유전자 증폭용 키트 및 질병 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 본 발명의 PCR 반응용 조성물을 구성성분으로 포함하는 것을 제외하고, 나머지 구성성분은 당업계에 공지된 모든 키트 구성성분을 사용하여도 무방하다.

본 발명의 키트는 기존의 유전자 증폭키트 및 질병 진단용 키트에 비해 비특이 증폭이 훨씬 저해되며, 높은 진단 특이성을 갖는다.

본 발명의 방법에 따르면, PCR 반응을 구성하는 성분이나 PCR용 시료로부터 혼입되는 칼슘 이온이나 망간 이온을 포함한 금속 이온에 의한 PCR의 나쁜 영향을 완화시키거나 막을 수 있다. 따라서 PCR 반응을 구성하는 성분 물질 자체 및 다양 한 PCR용 시료로부터 기인한 금속 이온 측면에서의 PCR 조건의 변동성을 극복할 수 있는 안정성이 개선된 PCR 반응용 조성물을 제공한다. 특히 이러한 PCR 반응용 조성물은 다양한 PCR용 시료를 갖고 PCR을 수행하는 분야에 유용하다. 이러한 분야의 예로는 동물 체액(animal fluids), 식품(food), 유기토양(organic soils), 및 높은 박테리아(bacteria) 농도를 가진 시료를 사용하는 PCR이 해당된다. 질병진단 분야를 포함한 임상(clinical) 분야 및 환경 관련 분야가 여기에 속한다. 임상 분야는 동물 및 식물 유래의 다양한 시료가 취급되고 있으며 시료 형태로도 분변(feces), 침, 혈액, 조직 추출물 등 매우 다양하다. 환경 관련 분야 또한 금속 이온의 함유가 많은 시료의 취급 빈도가 높다. 기타 분야로서 머리카락에서의 유전자 분석처럼 소량의 시료로부터 PCR 반응을 실시해야 할 필요가 있는 경우나 PCR 타이핑(typing) 같이 높은 민감도, 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)을 필요로 하는 분야에 있어 본 발명은 효과적으로 활용될 수 있다. 또한 아직 완벽한 기술로 자리를 잡지는 못했지만 곧 실용화될 기술로 인정받고 있는 “직접 PCR”의 발전 및 향후 응용에 활용될 수도 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PCR 반응의 증폭 효율 개선 효과 조사

PCR 반응에서의 증폭 효율 개선에 미치는 EGTA의 적용 효과를 먼저 조사하였다. 이는 다음과 같이 실시하였다. 이를 위하여 다음의 조성에 EGTA를 첨가한 PCR 반응액과 첨가하지 않은 PCR 반응액을 준비하였다. EGTA를 첨가한 경우는 첨가된 EGTA 농도는 1 mM이었다. EGTA는 수산화칼륨을 사용하여 pH를 8.0으로 맞추어 사용하였다. PCR 반응액의 기본 조성은 다음과 같다. 35 mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH 10.0), 12.5 mM 황산암모늄((NH4)2SO4), 12.5 mM 염화칼륨(KCl), 3.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.1% 트윈 20, 0.25% PEG 8,000, 0.1 mg/ml BSA. 이렇게 준비된 기본 PCR 반응액은 0.2 μm 필터(filter)로 여과한 후 사용하였다. 이 여과액에 EGTA의 첨가 효과를 조사하기 위해 EGTA를 넣어주지 않거나 넣어 주었다. PCR 반응에 사용한 DNA 중합효소는 인트론바이오테크놀로지사의 i-TaqTM DNA polymerase를 사용했으며 첨가량은 제품에 제공되는 매뉴얼의 지시에 따랐다. 본실시예의 PCR에 사용한 주형은 인간세포(Human cell-line) K562로부터 추출한 인간 gDNA(genomic DNA)였다. 이것이 바로 전술한 PCR용 시료에 해당한다. gDNA 추출은 EGTA 첨가 효과를 명확히 보기 위해 상용화되어 있는 gDNA 추출 제품을 사용하지 않고 프로틴에이즈 K(proteinase K)와 페놀(phenol)을 사용하는 표준 방법에 따라 실시했다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, 2001). 별도의 실험으로 확인된바 상용화되어 있는 gDNA 추출 제품을 사용하여 추출한 PCR용 시료를 사용하여 PCR을 실시하면 EGTA의 첨가 효과는 다소 감소된다. 이는 상용화된 gDNA 추출 제품을 사용하여 gDNA를 추출하면 표준 방법에 따른 추출 경우에 비하여 조금 개선된 순도를 갖는 PCR용 시료가 얻어지기 때문으로 추정된다.

표준 방법에 따른 gDNA 추출을 간략히 설명하면 다음과 같다. K562 세포가 배양 중인 배양접시(culture dish)로부터 K562 세포 배양액을 조심스럽게 회수한 다음 1,500× g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻는다. 상등액을 제거한 세포 침전물에 세포 침전물 부피의 5배 정도의 차가운 TBS(Tris-buffered saline; 20 mM 트리스-염산, 137 mM 염화나트륨, pH 7.6)를 가하여 세포 침전물을 단일(single) 세포로 푼다. 세포 침전물을 푼 다음 앞서 실시한 원심분리와 같은 조건으로 원심분리를 한번 더 실시한다. 이 단계는 세포를 세척하기 위한 단계이다. 얻어진 세포 침전물에 TE 완충액(10 mM 트리스-염산, 1 mM EDTA, pH 7.5)을 1 ml 가하여 다시 세포를 부유시킨다. 이 부유액 1 ml당 10 ml의 세포파쇄 완충액(lysis buffer; 10 mM 트리스-염산, 0.1 M EDTA, 0.5%(w/v) 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS), 20 μg/ml의 DNase-free pancreatic RNase, pH 8.0)을 가한다. 이것을 37℃에서 1시간 정치시켜 세포파쇄를 유도하였다. 얻어진 세포파쇄액은 깨끗한 원심분리용 용기로 옮긴 다음 최종 농도가 100 μg/ml이 되게 프로틴에이즈 K를 첨가해 준다. 그 다음 유리 막대로 잘 섞어 준 후 50℃에서 3시간 정치시켰다. 정해진 시간이 지난 후 반응액을 상온까지 식힌 다음 여기에 0.1 M 트리스-염산 (pH 8.0)에 미리 평형화(equilibration)되어 있던 페놀을 같은 부피 첨가하였다. 두 용액이 잘 섞이게 10분 정도 계속적으로 흔들어 준 후 상온에서 5,000× g로 15분간 원심분리하여 두 개의 층으로 분리되게 하였다. 분리된 두 개의 층 중 수용액 층을 회수하였고 이 회수된 층을 같은 조건으로 다시 한번 더 원 심분리하여 좀 더 깨끗해진 수용액층을 얻는다. 이 얻어진 수용액 층은 새로운 원심분리용 용기에 옮기고 여기에 0.2 부피의 10 M 초산암모늄(ammonium acetate)을 가한 다음 마지막으로 2 부피의 상온의 에탄올을 가한다. 이를 잘 섞어 준 후 상온에서 5,000× g로 5분간 원심분리하여 DNA 침전을 얻었다. 이 얻어진 DNA 침전은 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 가볍게 2번 세척을 해 준 후 DNA를 건조시켰다. 충분히 DNA가 건조되었을 때 분자생물학 수준의 물을 가하여 DNA를 녹였다. 본 실시예에서 실시한 PCR의 증폭 대상 유전자(target gene)는 1.8 kbp 크기를 가진 베타-글로빈(beta-globin) 단편(fragment)이었다. 베타-글로빈 유전자의 NCBI accession number는 NW925006.1이다. 주형 DNA는 10 ng을 사용하였다. 이 PCR에서 사용한 프라이머로 정방향(forward) 프라이머는 5‘-GAA GGC TCA TGG CAA GAA AG-3'(서열번호 1)이었고 역방향 프라이머는 5’-GAT TCC GGC TCA CTG TGA GT-3'(서열번호 2)이었다. PCR은 써멀 사이클러(thermal cycler)를 이용하여 실시했으며 사용한 PCR 조건은 94℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 20초 가온, 60℃에서 20초 가온, 72℃에서 2분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 더 가온한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다. 이렇게 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 이용한 1% 아가로즈 젤 전기영동을 통하여 PCR 산물(product)을 분석하였다. 그 결과가 도 1에 제시되어 있다. 도 1을 보면 약 1.8 kbp 크기의 PCR 산물이 확인되며 EGTA의 첨가에 의한 PCR 증폭 효율이 개선됨을 확인할 수 있다. 즉 EGTA를 첨가한 쪽이 그렇게 하지 않은 쪽에 비해 최종 얻어진 PCR 산물의 양이 많다.

실시예 2: PCR 반응에서의 비특이 증폭 억제 효과 조사

PCR 반응에서의 비특이 증폭 억제에 미치는 EGTA의 적용 효과를 조사하기 위해 PCR을 실시예 1과 유사하게 실시하였다. PCR 반응 조성은 실시예 1과 동일하게 하였다. 실시예 2에서 실시한 PCR에 사용한 주형은 인간세포 K562에서 추출한 인간 gDNA로 실시예 1과 같다. 그러나 PCR 증폭 대상 유전자는 실시예 1과 다르게 했는데, 실시예 2에서는 2.1 kbp의 P53 유전자 단편이었다. P53 유전자의 NCBI accession number는 NW926584.1이다. 주형 DNA는 20 ng을 사용하였다. 이 PCR에 사용한 프라이머로 정방향 프라이머는 5‘-TGC CGT CCC AAG CAA TGG AT-3'(서열번호 3)이었고 역방향 프라이머는 5’-TGT GCA GGG TGG CAA GTG GC-3'(서열번호 4)이었다. PCR은 실시예 1과 같이 써멀 사이클러를 이용하여 실시했으며 사용한 조건은 94℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 20초 가온, 64℃에서 20초 가온, 72℃에서 2분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 추가 가온한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다. 이렇게 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 이용한 1% 아가로즈 젤 전기영동을 통하여 PCR 산물을 분석하였다. 그 결과가 도 2에 제시되어 있다. 도 2를 보면 약 2.1 kbp 크기의 PCR 산물이 확인되며 EGTA의 첨가에 의한 PCR에서의 비특이 증폭 억제 효과를 확인할 수 있다. 즉 EGTA를 첨가한 쪽이 그렇게 하지 않은 쪽에 비해 최종 얻어진 PCR 산물이 보다 일정하였다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 PCR 반응 효율 증진에의 EGTA 효과를 조사하기 위해 실시한 베타-글로빈 단편에 대한 PCR 결과를 보여주는 그림이다. 5 μl의 PCR 반응액을 아가로즈 젤에 적하(loading)하였으며 각 경우 두 번씩 반복하였다. M은 크기 마커이고, (-)로 표시된 결과는 EGTA를 첨가하지 않고 실시한 PCR 경우의 결과이고, (+)로 표시된 결과는 EGTA를 첨가하여 실시한 PCR 경우의 결과이다.

도 2는 PCR 반응에서의 비특이 증폭 억제에의 EGTA 효과를 조사하기 위해 실시한 p53 유전자에 대한 PCR 결과를 보여주는 그림이다. 5 μl의 PCR 반응액을 아가로즈 젤에 적하하였으며 각 경우 두 번씩 반복하였다. M은 크기 마커이고, (-)로 표시된 결과는 EGTA를 첨가하지 않고 실시한 PCR 경우의 결과이고, (+)로 표시된 결과는 EGTA를 첨가하여 실시한 PCR 경우의 결과이다.

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> PCR composition comprising ethylene glycol tetraacetic acid as a chelating agent for reducing or preventing PCR inhibition and non-specific amplification caused by metal ion <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for beta-globin fragment <400> 1 gaaggctcat ggcaagaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for beta-globin fragment <400> 2 gattccggct cactgtgagt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for p53 fragment <400> 3 tgccgtccca agcaatggat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for p53 fragment <400> 4 tgtgcagggt ggcaagtggc 20

Claims

시료에 포함된 특정 gDNA 서열을 증폭하고자 실시하는 PCR 반응계에 비-의도적으로 불가피하게 혼입되어 미량으로 존재하는 Ca2+ 이온을 특이적으로 킬레이트 시키기 위하여, 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세틱 산(1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid), 및 니트로페닐-EGTA(nitrophenyl-EGTA)로 구성된 군에서 선택되어진 킬레이트제를 gDNA를 주형으로 하는 PCR 반응의 유효 성분으로 포함하는 조건을 PCR 반응 조건으로 이용하는 PCR 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 최종 구성되는 gDNA를 주형으로 하는 PCR 반응에서 0.001-10mM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
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시료에 포함된 특정 gDNA 서열을 증폭하고자 실시하는 PCR 반응계에 비-의도적으로 불가피하게 혼입되어 미량으로 존재하는 Ca2+ 이온을 특이적으로 킬레이트 시키기 위하여, 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세틱 산(1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid), 및 니트로페닐-EGTA(nitrophenyl-EGTA)로 구성된 군에서 선택되어진 킬레이트제를 gDNA를 주형으로 하는 PCR 반응의 유효 성분으로 포함하는, 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항의 PCR 방법이 적용될 수 있는 유전자증폭용 키트.
시료에 포함된 특정 gDNA 서열을 증폭하고자 실시하는 PCR 반응계에 비-의도적으로 불가피하게 혼입되어 미량으로 존재하는 Ca2+ 이온을 특이적으로 킬레이트 시키기 위하여, 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세틱 산(1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid), 및 니트로페닐-EGTA(nitrophenyl-EGTA)로 구성된 군에서 선택되어진 킬레이트제를 gDNA를 주형으로 하는 PCR 반응의 유효 성분으로 포함하는, 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항의 PCR 방법이 적용될 수 있는 질병진단용 키트.
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