JP2005511096A - アニーリング調節プライマーおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基残基群の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングする条件下で、プライマーアニーリング部分を3'末端部分に限定するため、プライマーのアニーリング配列は正確に調節され、これによって所望の長さのアニーリング配列を有するプライマーの設計が可能になる。このような特性は、プライマーのアニーリング部分が限定されなければならない場合(例えば、一塩基多型(SNP)の遺伝子型決定、DNAマイクロアレイスクリーニング、および示差的に発現される遺伝子の検出)、特に有用である。
(b) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基残基群の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングする条件下で5'末端部分が鋳型にアニーリングするのを妨害し、結局、アニーリングに関与しない5'末端部分は、3'末端部分にアニーリング特異性を提供する。
(c) プライマーアニーリングの特異性は、一塩基のミスマッチさえ検出できるほど非常に高感度である。従って、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異、例えば、一塩基多型および点突然変異を同定するのに非常に有用である。
(d) ACPは、プライマーデザインのための“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長、アニーリング温度、GC含量およびPCR産物の長さ)における高い許容性をプライマーに付与することができる。
(e) ACPシステムは、二段階PCR増幅(two-stage PCR amplifications)を提供し、提供する産物について非特異的増幅を排除する。
(f) PCR増幅の効率が増大し、微量のmRNAの検出を容易にする。
(g) PCR産物の再現性を増大させて、時間および費用を大きく節減する。
本発明の一様態によると、本発明は、(a)それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分;(b)予め選択されたアービトラリ(arbitrary)ヌクレオチド配列を有する5'末端部分;および(c)前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含み、アニーリング温度により前記プライマーのアニーリング部分を調節することができる調節部分を含む、核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーを提供する。
(1) ACPの調節部分は、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含み、塩基対での弱い水素結合相互作用によりACPで他の部位より低いTmを有するため、第1のアニーリング温度で鋳型の一位置にACPの3'末端部分がアニーリングする条件下で、ACPの調節部分は、鋳型核酸にアニーリングされる傾向が低い。従って、ACPの3'末端部分と5'末端部分の間に少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分の存在は、第1のアニーリング温度でプライマーアニーリング部位を3'末端部分に限定し、
(2) 第1のアニーリング温度でアニーリングに関与しない5'末端部分は、3'末端部分が鋳型にアニーリングするのを妨害する作用をし、
(3) 従って、第1のアニーリング温度の条件下で、3'末端部分配列の特異的アニーリングが生じる強度は、非特異的アニーリングが生じる強度より強く、それにより3'末端部分でのプライマーアニーリング特異性が改善され、
(4) 5'末端部分配列が予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む場合、3'末端部分配列のアニーリングおよび伸長により生成された反応産物のその後の増幅で、前記5'末端部分が、第1のアニーリング温度より高い第2のアニーリング温度、即ち、高ストリンジェンシー条件で、プライミング部位として作用し;
(5) それにより、第2のアニーリング温度で各々のPCRサイクルについて、反応産物が2倍に増加する理論上の最適値に近接した水準で、3'末端部分配列のアニーリングおよび伸長により生成された反応産物だけが増幅される。
I. 核酸配列の増幅;
II. ターゲット核酸配列の増幅;
III. マルチプレックスDNAの増幅;
IV. 示差的発現される遺伝子の同定;
V. cDNA末端の迅速増幅(RACE);
VI. 完全長cDNAの増幅;
VII. 5'富化したcDNAの増幅;
VIII. DNAまたはRNAフィンガープリンティング
IX. 多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片の同定;
X. ヌクレオチド配列変異の同定;
XI. 突然変異誘発;および
XII. 他の用途
本発明のまた他の様態によると、本発明は、DNAまたは核酸混合物の核酸配列を増幅する方法において、前記方法は、プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACPの構造によるプライマーの3'末端部分は、それとハイブリダイズする核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する。
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ本工程は、各々のプライマーが前記核酸配列の前記領域とアニーリングする条件で行って、それにより前記核酸配列の増幅産物が生成される、第1のアニーリング温度で前記核酸配列の第1段階の増幅を行う工程;および、
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(a)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する工程。
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲット核酸配列とアニーリングされる条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物が生成される、第1のアニーリング温度で前記ターゲット核酸配列の第1段階の増幅を行う工程;および、
(b) 前記工程(a)の増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(a)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物が再増幅される工程。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドdTプライマーに前記mRNAを接触させる工程;
(b) 前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAを逆転写して、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAに相補的な第1のDNA鎖を生成する工程;
(c) 工程(b)の第1のDNA鎖の前記ターゲット核酸配列の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、上述したACPのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲット核酸配列とアニーリングされる条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物を生成させる工程;および
(d) 工程(c)の増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(c)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'−および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する工程。
本発明のACPは、同一反応で2種以上のプライマー対を用いた2種以上のターゲット配列を増幅する、改良法を提供する。一般に、10種以上のターゲットを増幅するためのPCR条件を設定することは非常に難しいが、その理由は、非特異的副産物無しに一つの特定ターゲットを増幅するのに最適のPCR反応が必要となるからである。従って、マルチプレックスPCRを行う研究者らは、そのシステムの最適化のために非常に苦労する。完全なDNA-DNAマッチができるぐらいの十分高い温度でのアニーリングが要求されるが、本発明のACPは、増幅特異性を改善する能力を有しているため、マルチプレックスDNA増幅の最適化に非常に理想的である。用語“マルチプレックスPCR”は、単一のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)混合物内のマルチプレックスDNAターゲットを同時に増幅することを意味する。
(a) 第1のアニーリング温度で二つ以上のターゲットヌクレオチド配列の第1段階の増幅を行う工程であって、上述のACPのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲット核酸配列とアニーリングされる条件で行って、それによりターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成する工程;および、
(b) 工程(a)の増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー対または工程(a)で利用されたプライマー対の各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記工程(a)の増幅産物の3'−および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物を同一反応で再増幅する工程。
本発明のACPを用いた本用途は、二つまたはそれ以上の核酸試料中の示差的に発現されるmRNAに相補的なcDNAを検出してクローニングする、改良された方法を提供する。
(a) mRNA転写物の第1の集団を代表する第1の核酸試料およびmRNA転写物の第2の集団を代表する第2の核酸試料を提供する工程;
(b) 前記第1の核酸試料および第2の核酸試料の各々を上述したACPの第1のプライマーに接触させる工程であって、前記第1のプライマーの3'末端部分は、前記示差的に発現されるmRNAの第1の位置に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記接触は、鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で行う工程;
(c) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記示差的に発現されるmRNAを逆転写することによって、前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記第1の核酸試料中の前記示差的に発現されるmRNAに相補的な第1のcDNA鎖の第1の集団を生成させ、前記第1のプライマーがハイブリダイズされる前記示差的に発現されるmRNAを逆転写して前記第1のプライマーがハイブリダイズされる前記示差的に発現されるmRNAに相補的な第1のcDNA鎖の第2の集団を生成させる工程;
(d) 前記第1のcDNA鎖の第1および第2の集団の各々を精製して定量する工程;
(e) 第1のアニーリング温度で工程(d)の第1のDNA鎖の第1および第2の集団の各々の第1段階の増幅を行う工程であって、上述のACPの第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に第1のcDNA鎖の第1および第2の集団の第2の位置に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが第1のcDNA鎖の各々の集団の第2の位置にアニーリングされる条件で行って、それにより第2のcDNA鎖の第1および第2の集団を生成させる工程;
(f) 工程(e)の第2のcDNA鎖の各々の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)および(e)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)および(e)で利用された第1および第2のプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが第2のcDNA鎖の3'−および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記第2のcDNA鎖の増幅産物を再増幅させる工程;および、
(g) 工程(f)から得た増幅産物の第1および第2の集団で、個々の増幅産物の存在またはレベルを比較する工程。
第2のDNA鎖をストリンジェンシー条件下で、アニーリング、伸長および変性を含む第1段階の増幅の1サイクルにより合成し;第1のcDNA、PCR反応バッファー(例えば、Roche社から購入可能なもの)、dNTP、第1のACP(dT15−ACP)および第2のACP(AR−ACP)を含む反応混合物を約94℃で予熱した後、前記反応混合物を含む反応チューブの温度を約94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(例えば、Roche社から購入可能なもの)を反応混合物に添加し;PCR反応を次の条件で行う:94℃で1分、50℃で3分および72℃で1分の1サイクル、その後、アニーリング、伸長および変性を含む第2の段階のPCR増幅を次の条件で行う:94℃で40秒、65℃で40秒および72℃で40秒を40サイクル、次いで72℃で5分間の最終伸長。
本発明のACPを利用する本用途は、cDNA末端を迅速に増幅する方法、所謂RACE技術の改良された方法を提供する。より詳細には、本発明のACPは、3'末端および5'末端に対するRACE技術に適用され、従来のRACE技術で利用されたプライマーから招来されるバックグラウンド問題点を解決する。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を3'末端部分に含む上述のACPのいずれか一つの第1のプライマーに前記mRNAを接触させる工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAを逆転写して前記第1のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成する工程;
(c) 前記第1のcDNA鎖の第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、上述のACPのいずれか一つの第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記第1のcDNA鎖の一つの一位置に実質的に相補的な遺伝子特異的ハイブリダイズヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが前記第1のcDNA鎖の一つの遺伝子特異的位置とアニーリングされる条件で行って、それにより遺伝子特異的な第2のcDNA鎖を生成させる工程;および
(d) 前記工程(c)の遺伝子特異的な第2のcDNA鎖の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)で利用された第1または第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが遺伝子特異的第2のcDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより遺伝子特異的なcDNA鎖の増幅産物が生成される工程。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、mRNAの一部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むcDNA合成プライマーとしてオリゴヌクレオチドdTプライマーまたはランダムプライマーにmRNAを接触させる工程;
(b) 前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を利用し逆転写して、前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズされる前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成する工程;
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応を通じて前記mRNA−cDNA中間体の前記第1のcDNA鎖の3'末端にシトシン残基をテイリング(tailing)させる工程;
(d) ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分は、前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズされる少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに工程(c)から形成された前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルを接触させて、前記オリゴヌクレオチドの3'末端部分を前記シトシンテイルにハイブリダイズさせる工程;
(e) 逆転写酵素を利用し前記第1のcDNA鎖の3'末端を伸長させることにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドは、伸長反応で鋳型として働き、それにより完全長の第1のcDNA鎖を伸長させる工程;
(f) 下記工程を含み、第1のアニーリング温度で工程(e)から得た前記完全長の第1のcDNA鎖の第1段階の増幅を行う工程:
(i) 第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、前記完全長の第1のcDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記サイクルは、前記第1のプライマーが前記完全長の第1のcDNA鎖の3'末端とアニーリングされる条件で行う第2の完全長cDNA鎖を生成させる工程;
(ii) 上述のACPのいずれか一つの第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記第2の完全長のcDNA鎖の一つの一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的ハイブリダイズ配列を有し、前記サイクルは、前記第2のプライマーが前記第2の完全長cDNA鎖の一つの遺伝子特異的位置にアニーリングされる条件で行う遺伝子特異的cDNA鎖を生成させる工程;および
(g) 工程(f)−(i)および(f)−(ii)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(f)−(i)および(f)−(ii)で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが遺伝子特異的cDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖の増幅産物が生成される、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で前記遺伝子特異的cDNA鎖の第2段階の増幅を行う工程。
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNAに相補的な完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACPの構造を有するプライマーは、mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を有する。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を3'末端部分に含む前述のACPのいずれか一つの第1のプライマーに前記mRNAを接触させる工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を利用し逆転写することにより、前記プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成する工程;
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応によって前記mRNA−cDNA中間体の前記第1のcDNA鎖の3'末端にシトシン残基をテイリング(tailing)させる工程;
(d) ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分は、前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに工程(c)から形成された前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルを接触させて、前記オリゴヌクレオチドの3'末端部分を前記シトシンテイルにハイブリダイズさせる工程;
(e) 逆転写酵素を利用し前記第1のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより完全長の第1のcDNA鎖を伸長させる工程;および、
(f) 工程(e)で生成された前記完全長の第1のcDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(d)で使用した第1のプライマーおよびオリゴヌクレオチドと同一のプライマーに相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対、または工程(a)および(d)で使用した第1のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記完全長の第1のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記mRNAに相補的な完全長cDNA鎖の増幅産物を生成させる工程。
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNAの5'末端部分に相当するcDNA部分を含む5'富化した(5'−enriched)二本鎖cDNAの集団を増幅する方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、cDNA合成に利用されてACPの構造を有するプライマーは、その3'末端部分に少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、3'末端部分に少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する上述のACPのいずれか一つの第1のプライマーに前記mRNAを接触させる工程;
(b) 上述した完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法の工程(b)〜(e)を実施し、5'富化した第1のcDNAを伸長させる工程;および、
(c) 工程(a)および(b)で使用した第1のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが前記5'富化した第1のcDNA鎖の3'−および5'末端配列に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより5'富化したcDNA鎖の増幅産物が生成される、工程(b)から生成された前記5'富化した第1のcDNA鎖の増幅を行う工程。
ACPを用いた本応用は、ゲノムDNA内の多型検出(DNAフィンガープリンティング)またはmRNA水準での示差的に発現される遺伝子の検出(RNAフィンガープリンティング)方法に対する改良を提供する。
(a) ゲノムの特徴的な別個のDNA断片のセットであるDNAフィンガープリントの第1段階の増幅を、gDNAから第1のアニーリング温度で行う工程であって、上述のACPのいずれか一つのプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記gDNA上の位置に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、前記サイクルは、前記プライマーまたはプライマー対が前記gDNAにアニーリングされる条件で行って、それによりDNAフィンガープリントで特徴付けられる別個のDNA断片のセットが生成される工程;および、
(b) 工程(a)で生成された別個のDNA断片のセットの第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で利用されたプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ本工程を、各々のプライマーが工程(a)で生成された別個のDNA断片のセットの3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記別個のDNA断片のセットを再増幅する工程。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、ハイブリダイズされる前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を有する上述のACPのいずれか一つの第1のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNA試料を逆転写して、前記第1のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNA試料に相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させる工程;
(c) 工程(b)で生成された第1のcDNA鎖の集団の第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、上述のACPのいずれか一つの第2のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記第1のcDNA鎖の位置と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ本工程を、各々のプライマーが前記mRNA試料にアニーリングされる条件で行って、それによりRNAフィンガープリントで特徴付けられる別個のcDNA断片のセットが生成される工程、および
(d) 工程(c)で生成された別個のcDNA断片のセットの第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーまたはプライマー対、または工程(c)で利用されたプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが工程(c)で生成された別個のcDNA断片のセットの3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記別個のcDNA断片のセットを再増幅する工程。
ACPを用いた本応用は、多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片(conserved homology segments)を同定する方法に対する改良を提供する。
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する請求項1〜29のいずれか1項に記載の第1のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させる工程;
(c) 工程(b)で生成された第1のcDNA鎖の集団の第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第1のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが第1のcDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングされる条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する3'末端cDNA断片を生成させる工程;および、
(d) 工程(c)から生成された3'末端cDNA断片の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記3'末端cDNA断片の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記3'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する工程。
(a) 上述の完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法の工程(a)〜(e)を実施し、完全長cDNA鎖を生成する工程;
(b) 次の工程を含み、第1のアニーリング温度で工程(a)から得た前記完全長の第1のcDNA鎖の第1段階の増幅を行う工程:
(i) 第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、前記完全長の第1のcDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、本工程を、前記第1のプライマーが前記完全長の第1のcDNA鎖の3'末端とアニーリングされる条件で行って、第2の完全長cDNA鎖を生成させる工程;
(ii) 請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記第2のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが第2の完全長cDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングされる条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する5'末端cDNA断片を生成させる工程;および
(c) 工程(b)で生成された5'末端cDNA断片の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)−(i)および(b)−(ii)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)−(i)および(b)−(ii)で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'末端cDNA断片の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記5'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する工程。
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、前記gDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーが前記gDNAのコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングされる条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有するゲノムDNA断片を生成させる工程;および
(b) 工程(a)から生成されたゲノムDNA断片の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で利用されるプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが工程(a)から生成されたゲノムDNA断片の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記保存性ホモロジーゲノムDNA断片を増幅する工程。
ACPを用いた本応用は、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法に対する改良を提供する。
(a) 上述のACPのいずれか一つの第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、第1のアニーリング温度で前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な第1のDNA鎖を生成させる第1段階の増幅を行う工程であって、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸の第1の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記第1のプライマーおよび第1の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に対応する疑問位置を含み、それにより前記疑問位置が前記第1の部位のそれに相当するヌクレオチドに相補的な第1のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められることにより、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第1のDNA鎖を生成させる工程;
(b) 次の工程を含み、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で工程(a)で得た前記第1のDNA鎖の第2段階の増幅を行う工程:
(i) 上述のACPのいずれか一つの第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸の第2の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが前記ターゲット核酸の前記第2の部位にアニーリングされる条件で行って、それにより前記ヌクレオチド変異を含む前記第1のDNA鎖に相補的な第2のDNA鎖を生成させる工程;および
(ii) 工程(a)および(b)−(i)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)−(i)から生成された前記第2のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたは相当するハイブリダイズ配列を有するプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが前記第2のDNA鎖の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記3'末端および5'末端に前記ターゲット核酸の前記第1の部位および第2の部位を含む前記第2のDNA鎖を増幅して、前記ヌクレオチド変異を含む前記第2のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
(a) プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含む、両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む短いDNA鎖断片を生成させるための第1の増幅過程を行う工程であって、前記プライマー対の各々は、前記ターゲット核酸の一部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を含み、前記ヌクレオチド変異は、前記予め選択された配列の間に位置しており、前記プライマー対の少なくとも一つは、3'末端部分に前記ハイブリダイズ配列を有する上述のACPのいずれか一つのプライマーであって、それにより両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖の断片を生成させる工程;
(b) 上述のACPのいずれか一つの第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、第1のアニーリング温度で前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖の断片に相補的な第1のDNA鎖を生成するための第2の増幅過程の第1段階の増幅を行う工程であって、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸の第1の位置の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記第1のプライマーおよび第1の位置の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含み、それにより前記疑問位置が前記第1の位置のそれに相当するヌクレオチドに相補的な第1のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められることにより、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第1のDNA鎖を生成させる工程;および、
(c) プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、第2のアニーリング温度で工程(a)の前記第1のDNA鎖の第2段階の増幅を行う工程であって、前記プライマー対の一つのプライマーは、工程(a)で利用された上述のACPのいずれか一つのプライマーと同一であり、他のプライマーは、工程(b)で利用された前記第1のプライマーと同一であって、また前記プライマー対の各々のプライマーは、前記第1のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたは相当するハイブリダイズする配列を有し、前記サイクルは、各々のプライマーが前記第1のDNA鎖の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記第1のDNA鎖が増幅されることにより、前記ヌクレオチド変異を含む前記第1のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
ACPを用いた本応用は、突然変異誘発する方法に対する改良を提供する。ACPベースのPCRは、突然変異誘発に対する最上のツールを提供し、前記突然変異誘発は、配列の欠失または付加、一つまたは数個の特定ヌクレオチドの置換、そしてヌクレオチド配列のランダム変異を含む。
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記ハイブリダイズ配列は、位置指定変異を生じさせるために少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有し、かつ、本工程を、プライマーまたはプライマー対が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより位置指定変異位置を含む増幅産物が生成される、第1のアニーリング温度で前記ターゲット核酸配列の第1段階の増幅を行う工程;および、
(b) 工程(a)の増幅産物の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(a)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより位置指定変異位置を含む増幅産物を再増幅する工程。
本発明のACPは、核酸増幅、特にPCRを含む多様な技術に有用である。例えば、cDNAの混合オリゴヌクレオチド−プライミング増幅、長範囲PCR、線形PCR、逆PCR、定量PCR、タッチダウンPCR、シーケンシング、in situ PCR、vectorette PCRおよび熱非対称交差PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)に有用である。上記の方法の一般的な過程は、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) and M.J. McPherson, et al., PCR, Springer-Verlag New York Inc., N.Y.(2000)に開示されている。
(a) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置した調節部分の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングされる条件下で、プライマーアニーリング部位を3'末端部分に限定することから、プライマーのアニーリング配列が正確に調節されて、これにより所望の長さのアニーリング配列を有するプライマーの製作が可能になる(または、アニーリング部位を調節できるプライマーの製作が可能になる)。このような特性は、プライマーのアニーリング部位が制限的でなければならない場合(例えば、SNPゲノムタイピング、DNAマイクロアレイスクリーニング、および示差的に発現される遺伝子の検出)、特に有用である。
(b) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置する調節部分の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングされる条件下で、5'末端部分が鋳型にアニーリングされるのを妨害し、それによりアニーリングに関与しない5'末端部分が、3'末端部分にアニーリング特異性を提供する。
(c) プライマーアニーリングの特異性は、単一塩基ミスマッチが検出できるほど非常に高い。従って、一塩基多型(SNP)ゲノムタイピングに対し特に有用である。
(d) ACPは、プライマーデザインにおける“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長さ、アニーリング温度、GC量およびPCR産物の長さ)に対する高い許容性(tolerance)を付与する。
(e) ACPは、二段階核酸増幅を提供し、提供される産物における非特異性増幅を排除する。
(f) 核酸増幅の効率が増加し、微量のmRNAの検出を容易にする。
(g) 核酸増幅産物の再現性を増加させて、時間および費用を非常に節減する。
ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するユニバーサル塩基残基の影響は、マウス受胎産物組織を利用しRT-PCRにより評価した。
(i) ユニバーサル塩基残基(塩基対におけるそれらのより弱い水素結合相互作用のため、ACPでは他の部分より低いTmを有する)の存在は、第1のアニーリング温度で鋳型の一位置にACPの3'末端部分がアニーリングする条件下で、鋳型核酸へのアニーリングに関与しない。
(ii) ACPの3'末端部分と5'末端部分との間の少なくとも一つのユニバーサル塩基残基の存在は、5'末端部分のアニーリングを妨害し、プライマーアニーリング部分を3'末端に制限している。
(iii) ACPの3'末端部分は、PCRの際、鋳型に対するアニーリング部分としてのみ機能する。
(iv) 10個のTヌクレオチドを含むdT10であるdT-ACPの3'末端部分は、鋳型核酸に結合するには低すぎるTmを有する。
(v) 結果として、dT10-ACPは、高いアニーリング温度でPCR産物を生成しない。
(a)第一鎖cDNAの合成
dT10-JYC2 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTT-3'(配列番号29)またはdT10-ACP1 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTT-3'(配列番号30)をcDNA合成プライマーとして用いた。
3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン群のPCRにおける影響を、dT10-ACP1を用いて調べた。デオキシイノシン群を含まないdT10-JYC2を、対照群として用いた。
(a)第1鎖cDNAの合成
cDNA合成プライマーとしてdT10-JYC2を用い、マウス受胎産物の全RNAから第1鎖cDNAを上述の方法により合成した。
デオキシイノシンの数の変化と関連した3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響を調べるために、それぞれ異なる数のデオキシイノシン残基を含む以下の4種のACPを用いて、特定のストリンジェンシー条件下で本実験を行った。
ACP17 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号21);
ACP18 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号22);
ACP19 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号23);および
デオキシイノシン群を含まないCRP2I0 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATGCCATCGACC-3'(配列番号19)を対照群として用いた。
マウス胎盤特異的ホメオボックス遺伝子Esx1 cDNAのターゲットヌクレオチド配列を増幅するために、本発明のACPを用いた。ACPを用いたEsx1 cDNAのターゲットヌクレオチド配列の増幅工程およびその結果は、次のようである。18.5日齢マウスの胎盤から得た全RNA(3μg)を出発物質として用いた。第1鎖cDNAを実施例1のcDNA合成と同一の条件下で調製したが、この際、オリゴdT15を第1鎖cDNA合成プライマーとして用いた。
ACPを用いてEsx1のターゲットcDNA断片を増幅するために、生成された第1鎖cDNAを鋳型として用いた。これらの実験では、本発明のユニークな特徴の一つである二段階PCR増幅を実施した。
EsxN7 5'-GCCGGTTGCAGAAGCACC-3'(配列番号44);
EsxC6 5'-GAACCATGTTTCTGAATGCC-3'(配列番号45);
EsxN1 5'-GAATCTGAAACAACTTTCTA-3'(配列番号48);
EsxC2 5'-GATGCATGGGACGAGGCACC-3'(配列番号49);
EsxN3 5'-CGCCGCAACCCCTGCCCGCA-3'(配列番号51);および
EsxC5 5'-GATGCATGGGACGAGGCA-3'(配列番号52)。
EsxN7-ACP 5'プライマー 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCGGTTGCAGAAGCACC-3'(配列番号46);
EsxC6-ACP 3'プライマー 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGAACCATGTTTCTGAATGCC-3'(配列番号47);
EsxN1-ACP 5'プライマー 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGAATCTGAAACAACTTTCTA-3'(配列番号50);
EsxC2-ACP 3'プライマー 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCATGGGACGAGGCACC-3'(配列番号55);
EsxN3-ACP 5'プライマー 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGCCGCAACCCCTGCCCGCA-3'(配列番号53);および
EsxC5-ACP 3'プライマー 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCATGGGACGAGGCA-3'(配列番号56)。
(A)第1段階のPCR増幅
第1段階のPCR増幅は、ホットスタートPCR法、すなわち、DNAポリメラーゼを加えないこと以外は完全な反応物を用意し、その反応チューブをサーマルサイクラー内でインキュベートして90℃を超える温度で最初の変性工程を完了させる方法により、実施した。次いで、前記チューブを70℃を超える温度に維持しながら、その反応物中にDNAポリメラーゼを適量ピペッティングで加える。
Esx1遺伝子特異的ACPを用いて第1段階のPCR増幅により生成されたcDNA産物を、次いで、より高いアニーリング温度下で次の第2段階のPCR増幅により増幅した。第1段階のPCR増幅を完了させた後、10μMの予め選択されたアービトラリプライマーJYC4およびJYC2の各々1μlを、第1段階のPCR増幅から得た反応混合物に94℃のような変性温度下で添加した。第2段階のPCR反応は、次の通りに実施した:94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒のサイクルを35サイクル、次いで72℃で5分間の最終伸長。
別法として、JYC4とJYC2のような予め選択されたアービトラリプライマーを利用する代わりに、ACPの完全配列を、高ストリンジェンシー条件下の第2段階のPCR増幅でプライマーとして用いることができる。この場合、第1段階のPCR反応のときまたはその後に、反応混合物に予め選択されたアービトラリプライマーを添加する必要はない。
本発明のACPを利用し、胚発生段階で示差的に発現されるmRNAを検出した。具体的には、出発物質として異なる発生段階の受胎産物の全RNAを用いて、三つの異なる方法によって得た結果が、後述の通りである。本発明で使用したプライマーは、表1に記載されている。
工程(1):第1鎖cDNAの合成
cDNA合成プライマーとしてdT10-ACP1またはJYC5-T15-ACPを用いて、実施例1のcDNA合成で使用される条件と同一の条件下で第1鎖cDNAを製造した。製造されたcDNAをスピンカラム(PCR精製キット、QIAGEN)で精製し、プライマー、dNTPおよび前記試薬類を除去した。260nmの吸光度でUV分光光度計を用いてcDNA濃度を決定する前に、この精製工程を行うことが必要である。各々の試料から得られた同量のcDNAを、本発明のACPシステムを用いた増幅パターンとの比較に用いた。
第1のPCR増幅のために、次のACPをアービトラリACP(AR-ACP)として用いた:
ACP3 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACS-3'(配列番号3);
ACP5 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCS-3'(配列番号5);
ACP8 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCS-3'(配列番号8);
ACP10 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号13);
ACP13 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCG-3'(配列番号16);および
ACP14 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCC-3'(配列番号17)。
AR-ACPおよびdT10-ACP1の5'末端部分の配列にそれぞれ相当する2つの予め選択されたアービトラリプライマーJYC4およびJYC2を用いて、続いての第2段階のPCR増幅により、工程(2)で生成されたcDNA増幅産物を再増幅した。第1のcDNA増幅産物(50μl)のうちの5μl、10×PCR反応バッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 3μl、2mM dNTP 5μl、5'プライマー(10μM) 1μl、3'プライマー(10μM) 1μlおよびTaqポリメラーゼ(5 units/μl) 0.5μlを含む50μl容量で第2段階のPCR増幅を実施した。PCR反応は、次の条件で実施した:94℃で5分、次いで94℃で1分、65℃で1分および72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
別の本発明の方法は、次の工程を含む:
(a) mRNA転写物の第1の集団である第1の核酸試料およびmRNA転写物の第2の集団である第2の核酸試料を提供する工程;
(b) 前記第1の核酸試料および第2の核酸試料の各々を第1のACPに接触させる段階であって、前記第1のACPは、それとハイブリダイズするmRNA転写物の第1の集団および第2の集団の一領域に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、
(c) 前記第1のACPがハイブリダイズするmRNAを逆転写して、第1のACPがハイブリダイズする前記第1の核酸試料中のmRNAに相補的なDNA鎖の第1の集団、および第1のACPがハイブリダイズする前記第2の核酸試料中のmRNAに相補的なDNA鎖の第2の集団を、生成させる工程;
(d) 逆転写工程(c)の結果として生成された相補DNA鎖を精製し定量する工程;
(e) DNA鎖の第1および第2の集団に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する第2のACPを用いて、変性、アニーリング、プライマー伸長を含む少なくとも一回のPCRサイクルにより、低ストリンジェンシー条件下で、DNA鎖の第1および第2の集団の各々に相補的な第2のDNA鎖を合成する工程;
(f) 第1および第2のアニーリング調節プライマーの各々の5'末端部分に相当する配列を各々が含む2種の予め選択されたアービトラリプライマーを用いて、高ストリンジェンシー条件下で、変性、アニーリング、およびプライマー伸長を含むPCRサイクルを少なくとも1回行うことにより、工程(e)で得られた第2のDNA鎖の各々を増幅し、増幅産物の第1の集団および第2の集団を生成させる工程;および、
(g) 増幅産物の第1および第2の集団に含まれる個々の増幅産物の量を比較する工程。
JYC5 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3'(配列番号60)。
1.滅菌された0.2ml微量遠心分離チューブ中に、全RNA 3μgおよび10μM JYC5-T15-ACP 2μlを混合する。
2.最終容量が9.5μlになるように滅菌H2Oを添加する。内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.チューブを80℃で3分間インキュベートするか、または同一目的でサーマルサイクラーを利用する。
4.チューブを氷上で2分間冷却する。チューブを微量遠心分離機にかけて簡単に内容物を沈殿させる。
5.同一の反応チューブに次の試薬を添加する:5×第1鎖バッファー(Promega) 4μl、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP各々2mM) 5μl、RNasinインヒビター(40 units/μl, Promega) 0.5μlおよびM-MLV逆転写酵素(200 U/μl) 1μl。
6.内容物を混合して、チューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
7.チューブを42℃で90分間インキュベートする。
8.チューブを94℃で2分間インキュベートして第1鎖の合成を終結させる。
9.チューブを氷上に2分間静置する。
10.プライマー、dNTPおよび上述の試薬類を除去するために、スピンカラム(PCR精製キット、QIAGEN)によって、生成されたcDNAを精製する。
11.次いで、260nmの吸光度でUV分光光度計を利用し、cDNAの濃度を測定する。
12.工程2へ進む。
本発明のACPを用いた増幅パターンを比較するために、各々の試料から得たcDNAを同量で使用した。第2鎖cDNAを、アービトラリACP10を用いて、ホットスタートPCR法により合成した。この方法では、DNAポリメラーゼを含まずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃を超える温度でインキュベートして最初の変性工程を完了させる。次いで、前記チューブを90℃を超える温度に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量、その反応物中にピペットで加える。
2.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
4.チューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl;Roche) 0.5μlを反応物に添加する。
5.次の条件下でPCR反応を行う:94℃で5分、50℃で3分および72℃で1分を1サイクル、その後、94℃での第1の増幅産物の変性。
1.第1段階のPCR増幅が完了した後、チューブを94℃を上回る温度に維持しながら、5'および3'ACPの5'末端部分の配列に各々が相当する10μM JYC4 2μlおよび10μM JYC5 2μlを、工程(2)で用いた反応混合物中に添加する。
2.次の条件で第2段階のPCR反応を行う:94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒を1サイクルとして40サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
本発明の変法として、方法2の工程(f)において、第1および第2のACPの5'末端部分の予め選択されたアービトラリ配列の代わりに、方法2の工程(b)および(e)で使用した第1および第2のACPの全体配列をそれぞれ3'および5'プライマーとして利用して、高ストリンジェンシー条件下で、方法2の工程(e)から得られた第2のDNA鎖の各々を増幅した。ここで、第2のACPを利用し最初に合成された第2のDNA鎖の3'末端および5'末端は、第1のACPの配列と第2のACPの相補配列を各々含み、第1および第2のACPに対して完璧に塩基対形成する部位として機能する。このような場合、第1段階のPCR反応の際またはその後に、予め選択されたアービトラリプライマーを反応混合物に添加する必要がない。
cDNA合成プライマーとしてJYC5-T15-ACPを利用し、方法2のcDNA合成で用いた条件と同一の条件下で第1鎖cDNAを調製した。
本発明のACPを用いた増幅パターンを比較するために、各々の試料から得たcDNAを同量ずつ使用した。第2鎖cDNAを、アービトラリACP10を用いて、ホットスタートPCR法により合成した。この方法では、DNAポリメラーゼを含めずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃を超える温度でインキュベートして最初の変性工程を完了させる。次いで、前記チューブを90℃を超える温度に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量、反応物中にピペットで添加することができる。
2.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
4.チューブを94℃の温度で維持しながらTaqポリメラーゼ(5 units/μl;Roche) 0.5μlを反応物に添加する。
5.次の条件でPCRを行う:94℃で1分、50℃で3分および72℃で1分を1サイクル;次いで、94℃で40秒、65℃で40秒および72℃で40秒のサイクルを40サイクル、続いて72℃で5分間の最終伸長。
増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動することにより分析して、エチジウムブロマイド染色により検出した。胚発生段階(E4.5、E11.5およびE18.5)で示差的に発現された数個の主なバンドを選択し、それを切り出し、GENECLEAN IIキット(BIO 101)を利用してゲルから抽出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの利用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
方法1、2および3で使用した同一の予め選択されたアービトラリプライマーおよびPCR条件を用いて、工程Bで得られたバンドを再増幅した。
各々の増幅産物をpGEM-T Easyベクター(Promega)中にクローニングして、BigDye Terminatorサイクルシーケンシングキット(Perkin Elmer)を利用してABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer Biosystem)を使用してシーケンシングした。BLAST検索プログラム(Basic Local Alignment Search Tool)を用いてコンピューター支援配列解析を実施した。
受胎産物組織から得た全RNA 20μgをホルムアルデヒドを含む変性1%アガロースゲルで分離して、ナイロン膜(Hybond-N, Amersham、アメリカ)に転写させた後、QuikHyb溶液(Stratagene、アメリカ)で32P-標識したサブクローン化PCR産物とともに58℃で一晩中ハイブリダイズさせた(Chun et al., 1999; Hwang et al., 2000)。ブロット(blots)を2×SSC、0.1% SDSで20分間65℃で2回洗浄した後、1×SSC、0.1% SDSで20分間2回洗浄して、0.1×SSC、0.1% SDSで20分間2回洗浄した。膜を、Fuji増感紙とともにKodak X-Omat XK-1フィルムに−80℃で露出させた。
cDNA合成で利用される従来のオリゴdTプライマーから引き起こされるバックグラウンド問題を、本発明のACPが排除することができることを証明するために、本実施例は、ACPベースの3'-RACEと従来の3'-RACEとを比較した。
CDS III/3'5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30-VN-3'(配列番号35)(Vは、A、CまたはGであり;Nは、A、C、TまたはGである)。
本発明のACPは、cDNA断片の5'末端を増幅するのに利用できる。第1鎖cDNAは、次のオリゴVdT15-ACPまたはランダムdN6-ACPを用いて製造した。
オリゴVdT15-ACP 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTTTTTTTV-3'(配列番号57)、Vは、A、CまたはGである;
ランダムdN6-ACP 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIINNNNNN-3'(配列番号58)、Nは、A、C、GまたはTである。
rG3-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GGG)-3'(配列番号36);
rG2-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GG)-dG-3'(配列番号37);
rG1-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(G)-d(GG) -3'(配列番号59);または
dG3-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGd(GGG) -3'(配列番号38)(rおよびdは、各々リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを示す)。
プロトコルA:ACPを用いた第1のcDNA鎖の製造
1.滅菌された0.2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:全RNA 3μgおよび10μM オリゴVdT15-ACPまたはランダムdN6-ACP 2μl。
2.最終容量が10μlになるように滅菌H2Oを添加する。内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.チューブを水浴で60℃、15分間インキュベートするか、または同一目的でサーマルサイクラーを利用する。
4.チューブを氷上で少なくとも2分間冷却する。チューブを微量遠心分離機で簡単にスピンして内容物を沈殿させる。
5.同一の反応チューブに次の試薬を添加する:5×第1鎖バッファー(Invitrogen) 4μl、0.1M DTT 1μl、BSA(1mg/ml) 2μl、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各々10mM) 2μl、100mM MnCl2 0.4μlおよびRnasinインヒビター(40units/μl、Promega)。
6.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
7.チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで42℃、2分間インキュベートする。
8.SuperScript II逆転写酵素(200units/μl;Invitrogen) 1μlを添加する。
9.チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで42℃、1時間インキュベートする。
10.10μMの第1のcDNA 3'末端伸長ACP(rG3-ACP、rG2-ACPまたはdG3-ACP) 1μlを添加する。
11.SuperScript II逆転写酵素(200units/μl;Invitrogen) 0.3μlを添加する。
12.チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで42℃、30分間インキュベートする。
13.チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで70℃インキュベートして第1鎖の合成を終結させる。
14.チューブを氷上で静置させるか、−20℃で保管する。
CapFinder方法(Clontech)では、次のプライマーを用いた:
SMART IVTM オリゴヌクレオチド5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACG GCCr(GGG)-3'(配列番号33);および
5'PCRプライマー5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(配列番号34)、およびCDS III/3'PCRプライマー。
2.最終容量が5μlになるように滅菌H2Oを添加する。内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.チューブを水浴で72℃、2分間インキュベートする。
4.チューブを氷上で2分間冷却する。チューブを微量遠心分離機で簡単にスピンして内容物を沈殿させる。
5.同一の反応チューブに次の試薬を添加する:5×第1鎖バッファー(Clontech) 2μl、20mM DTT 1μl、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各々10mM) 1μlおよびPowerScript逆転写酵素(Clontech) 1μlを含む10μlの反応物。
6.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
7.チューブを42℃で1時間インキュベートする。
8.チューブを氷上で静置させるか、−20℃で保管する。
プロトコルC:ACPシステムまたは従来の5'−RACE方法を用いたターゲット5'末端cDNA断片の増幅
本実施例は、従来のCapFinder 5'−RACE技術およびACPベースの5'−RACE技術を比較する。従来のCapFinder 5'−RACE技術では、その過程におけるプライマーの残余量のため、高いバックグラウンドを除去することができない。cDNA合成に利用されるCapFinderプライマー、SMART IV オリゴヌクレオチド(Clontech)とcDNA合成プライマー、CDS III/3'PCRプライマー(Clontech)のようなプライマーから引き起こされるバックグラウンド問題点を本発明のACPが除去できるかどうかを確認するために、マウスJnuBおよびβ−アクチンcDNAのCapFinder 5'-RACEおよびACPベースの5'−RACEを同一条件で実施した。マウスJunB mRNAは、18.5日齢のマウス胎盤のRNA中では比較的微量の転写物であり、マウスβ−アクチンは、比較的豊富な転写物である。
2.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.次の条件でPCR反応を行う:94℃で5分、次いで94℃で40秒、58℃で40秒および72℃で1分の30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
4.増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、続いてエチジウムブロマイド染色して分析する。
プロトコルAのランダムdN6-ACPを用いて第1鎖cDNAを製造した。PCR増幅は、ホットスタートPCR法により実施した。この方法では、DNAポリメラーゼを含めずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃以上でインキュベートして最初の変性工程を行う。次いで、前記チューブを70℃以上に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量、反応物にピペットで添加すればよい。
2.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
4.チューブの温度を94℃に維持しながらTaqポリメラーゼ(5units/μl、Promega) 0.5μlを反応物に添加する。
5.次の条件でPCR反応を実施した:94℃で5分、次いで94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で1分の30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
6.増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、次いでエチジウムブロマイド染色して分析する。
プロトコルAのオリゴVdT15-ACPを用いて第1鎖cDNAを製造した。PCR増幅は、プロトコルDのように、ホットスタートPCR法により実施した。
2.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
4.チューブの温度を94℃に維持しながらTaqポリメラーゼ(5units/μl;Promega) 0.5μlを反応物に添加する。
5.次の条件でPCR反応を実施した:94℃で5分、次いで94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で1分の30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
6.増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイド染色して分析する。
マウスの多型を検出するのに本発明のACPを用いた。マウス系統C57BL/6J、CBA、BALB/cJ、NOR、SPRETUS、PANCEVO、および韓国野生マウスのゲノムDNAを出発物質として用いた。QIAamp組織キット(QIAGEN、Hilden、ドイツ)ゲノムDNAを用いて、マウスの肝臓からゲノムDNAを調製した。使用したアービトラリACPは、次のようである:
ACP101 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCGGAGGATC-3'(配列番号64);
ACP109 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTGCAGGACG-3'(配列番号65);および
ACP116 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGGAGCATCC-3'(配列番号66)。
ACPをマルチプレックスPCRに利用できるかどうかを確認するために、従来のプライマーまたはACPを用いて、ヒト白血球接着分子I(ELAM1)とヒトp53(TP53)遺伝子との一塩基多型を含む部位を増幅した。ACPを用いたマルチプレックスPCR増幅に対する方法および結果を下記に示した。DNA鋳型は、ヒト胎盤から得た。
ELAM1N1 5'-TTGCACACTGTTGATTCTAA-3'(配列番号67);および
ELAM1C1 5'-TTATTGATGGTCTCTACACA-3'(配列番号68)。
ELAM1N2 5'-CCACTGAGTCCAACATTC-3'(配列番号69);および
ELAM1C2 5'-CTGAAACACTTCCCACAC-3'(配列番号70)。
P53N1 5'-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3'(配列番号71);および
P53C1 5'-ATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3'(配列番号72)。
P53N2 5'-TGCTTGCCACAGGTCTC-3'(配列番号73);および
P53C2 5'-GCAGTGCTAGGAAAGAGG-3'(配列番号74)。
ELAM1C1-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIITTATTGATGGTCTCTACACA-3'(配列番号76);
ELAM1N2-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCACTGAGTCCAACATTC-3'(配列番号77);
ELAM1C2-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICTGAAACACTTCCCACAC-3'(配列番号78);
P53N1-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3'(配列番号79);
P53C1-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3'(配列番号80);
P53N2-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITGCTTGCCACAGGTCTC-3'(配列番号81);および
P53C2-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIGCAGTGCTAGGAAAGAGG-3'(配列番号82)。
JYC3 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3'(配列番号11)および
JYC4 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3'(配列番号12)。
(A)第1段階のPCR増幅
アニーリング、伸長および変性を含む第1段階のPCRを2サイクル実施し、第1段階のPCR増幅を実施した。ヒトゲノムDNA 50ng、10×PCRバッファー(Promega) 8μl、25mM MgCl2 7μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各々2mM) 5μlおよび5'ACP(10μM)と3'ACP(10μM)の各々0.5μlを含む最終容量49.5μlの反応混合物を94℃で予熱した後、反応混合物を含むチューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl、Promega) 0.5μlを添加して、PCR反応を次のように実施した:94℃で40秒、60℃で40秒および72℃で40秒の2サイクル、その後94℃で増幅産物を変性させる。
ACPのマルチプルセットを用いた第1段階のPCR増幅から生成された産物を、高いアニーリング温度で、次のように第2段階のPCR増幅により増幅した。第1段階のPCRが完了した後、10μMの予め選択されたアービトラリプライマーJYC3とJYC4の各々2μlを、94℃のような変性温度で第1段階の増幅の反応混合物に添加した。第2段階のPCRを次のように実施した:94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で1分の40サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
本発明の変形例として、JYC3とJYC4のような予め選択されたアービトラリプライマーを利用する代わりに、各々のACPセットの全体配列を、高ストリンジェンシー条件下の第2段階のPCR増幅でプライマーとして用いた。この方法では、第1段階のPCR反応の際またはその後に、反応混合物に予め選択されたアービトラリプライマーを添加する必要がない。
多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を検出してクローニングするのに、本発明のACPを適用した。本実施例で、ホメオボックス配列を検出するために縮重プライマーをデザインした。ホメオボックス遺伝子は、60アミノ酸DNA結合ホメオドメインをコードする180 bpの保存性ホメオボックスにより特徴づけられる。マウス胚発生に関与するホメオボックス遺伝子を単離するために、受胎産物発生の三つの異なる段階、即ちマウス4.5、11.5および18.5日齢の受胎産物から得られた全RNAを出発物質として用いた。実施例3のcDNA合成と同一の条件で第1鎖cDNAを製造して、この場合、第1鎖cDNA合成プライマーとしてJYC5-T15-ACPを用いた。
JYC2-HD1 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTGTGGTT-3'(配列番号83);
JYC2-HD2 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTCTGGTT-3'(配列番号84);および
JYC2-HD3 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTTTGGTT-3'(配列番号85)。
2.内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
3.94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
4.チューブの温度を94℃に維持しながらTaqポリメラーゼ(5units/μl;Roche) 0.5μlを反応物に添加する。
5.次の条件でPCR反応を行う:94℃で1分、52℃で3分および72℃で1分の1サイクル、次いで、94℃で40秒、65℃で40秒および72℃で40秒の40サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
一塩基多型ゲノムタイピングにACPが適用できるかどうかを確認するために、従来のプライマーまたはACPを利用し、ヒトp53(TP53)遺伝子の一塩基多型(SNP)を含む部分を増幅した。ACPを用いたSNPゲノムタイピングに対する過程および結果は、下記に示した。TP53遺伝子のエキソン4にSNPを有するヒト血液試料からDNA鋳型を得た。前記多型は、GがCに置換され、アミノ酸位置72でArgがProに置換されたものである。次のプライマーセットを用いて各々の鋳型からヌクレオチド11991〜12339の349nt配列を増幅した:
P53N 5'-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3'(配列番号86)および
P53C-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3'(配列番号87)。
P53N1A-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCGCGTGG-3'(配列番号88)、
P53N1B-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCCCGTGG-3'(配列番号89)、
P53N2A-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCGCGTG-3'(配列番号90)、
P53N2B-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCCCGTG-3'(配列番号91)、
P53N3A-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCGCGT-3'(配列番号92)、
P53N3B-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCCCGT-3'(配列番号93)、
P53N4A-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCGCG-3'(配列番号94)、
P53N4B-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCCCG-3'(配列番号95)、
P53N5A-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCG-3'(配列番号96)、および
P53N5B-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCC-3'(配列番号97)。
JYC3 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3'(配列番号11)、および
JYC4 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3'(配列番号12)。
アニーリング、伸長および変性を含むPCRを1サイクル実施して、第1段階のPCR増幅を実施した。TP53遺伝子のエキソン4でSNPを含むターゲットゲノム増幅断片1μl、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 5μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各々2mM) 5μlおよびアレル特異的ACP(10μM) 1μlを含む最終濃度49.5μlの反応混合物を94℃で予熱した後、反応混合物を含むチューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl;Promega) 0.5μlを添加して、3'末端部分に10個のヌクレオチドを有するアレル特異的ACPに対し、次のようにPCR反応を実施した:94℃で40秒、55℃で40秒および72℃で40秒の1サイクル、その後94℃で増幅産物を変性させる。
第1の段階のPCRにより生成された産物を、第1のアニーリング温度より高いアニーリング温度で、第2の段階のPCR増幅により増幅した。第1の段階のPCRが完了した後、10μM予め選択されたアービトラリプライマーJYC3 1μlを、94℃のような変性温度で第1段階の増幅過程の反応混合物に添加した。第2の段階のPCRを次のように実施した:94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒の30サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
β−2アドレナリン作動性受容体(ADRB2)
703N 5'- ATTCTGATGGTGTGGATTGTG-3'(配列番号98)および
SM703C 5'- TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIACCCTGGAGTAGACGAAGA-3'(配列番号99)
ケモカイン(c-cモチーフ)受容体5(CCR5)
028N 5'- CCTTCTGTGCTTGATGCTTTT-3'(配列番号102)および
SM028C 5'- TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICAGGAAGGATGAGCATTTAG-3'(配列番号103)
インターロイキン13受容体
695N : 5'- AGAAAAACCAGAGGCAGCTT-3'(配列番号106)および
SM695C 5'- TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIAGCACAAACCAAAGACACAGT-3'(配列番号107)
白血球接着分子-1(LAM-1)
679N 5'- CTAGCTGCAAGTGACATCTCT-3'(配列番号110)および
SM679C 5'- TCACAGAGTATCCAAGCGIIIIITCAGTAAGAAGCCAGGAGAG-3'(配列番号111)
タキキニン受容体3(TACR3)
832N 5'- TTTTGGGTGGAGGCTAACAT-3'(配列番号114)および
SM832C 5'- TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIAACGATGCAGACACCACCA-3'(配列番号115)
インターロイキン1、β(IL1B)
880N 5'- CTTCCACCAATACTCTTTTCC-3'(配列番号118)および
SM880C 5'- TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIGCATACACACAAGAGGCAGA-3'(配列番号119)。
β-2アドレナリン作動性受容体(ADRB2)
SM703-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTACAGGGC-3'(配列番号100)および
SM703-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTACCGGGC-3'(配列番号101)
ケモカイン(c-cモチーフ)受容体5(CCR5)
SM028-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAAACCAA-3'(配列番号104)および
SM028-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAACCCAA-3'(配列番号105)
インターロイキン13受容体
SM695-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII CCATTTTAGG-3'(配列番号108)および
SM695-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII CCATTGTAGG-3'(配列番号109)
白血球接着分子-1(LAM-1)
SM679-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGAACTTT-3'(配列番号112)および
SM679-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGACCTTT-3'(配列番号113)
タキキニン受容体3(TACR3)
SM832-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGGTAAA-3'(配列番号116)および
SM832-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGATAAA-3'(配列番号117)
インターロイキン1、β(IL1B)
SM880-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGCCATAA-3'(配列番号120)および
SM880-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGCTATAA-3'(配列番号121)。
Anonymous (1992) Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction. A multicenter study. JAMA 267, 2609-2615.
Bauer, D., Muller, H., Reich, J., Ahrenkiel, V., Warthoe, P., Strauss, M. (1993) Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR). Nucleic Acids Res. 21, 4272-4280.
Bauer, D., Warthoe, P., Rohde, M., Struss, M. (1994) PCR Methods & App: Manual Supplement., pp. S97-S108. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Carninci, P., Westover, A., Nishiyama, Y., Ohsumi, T., Itoh, M., Nagaoka, S., Sasaki, N., Okazaki, Y., Muramatsu, M., Hayashizaki, Y. (1997) High efficiency selection of full-length cDNA by improved biotinylated cap trapper. DNA Res. 4, 61-66.
Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., Nguyen, P.N., Caskey, C.T. (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16, 11141-11156.
Chenchik, A., Zhu, Y., Diatchenko, L., Li, R., Hill, J., Siebert, P. (1998) Generation and use of high-quality cDNA from small amounts of total RNA by SmartTM PCR. In Siebert, P. and Larrick, J. (eds), Gene Cloning and analysis by RT-PCR. Biotechniques Books, Natick, MA, pp. 305-319.
Chenchik, A., Zhu, Y., Diatchenko, L., Siebert, P. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end. U.S. Pat. No. 5,962,271. Date of Patent: Oct. 5, 1999.
Chenchik, A., Zhu, Y., Diatchenko, L., Siebert, P. Methods and compositions for full-length cDNA cloning using a template-switching oligonucleotide. U.S. Pat. No. 5,962,272. Date of Patent: Oct. 5, 1999.
Chun, J.Y., Han, Y.J., Ahn, K.Y. (1999) Psx homeobox gene is X-linked and specifically expressed in trophoblast cells o mouse placenta. Dev. Dyn. 216, 257-266
Clark, J.M. (1988) Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 16, 9677-9686.
Combates, N., Pardinas, J.R., Parimoo, S., Prouty, S.M., Stenn, K.S. Technique for differential display. U.S. Pat. No. 6,045,998. Date of Patent: Apr. 4, 2000.
D'Aquila, R.T., Bechtel, L.J., Videler, J.A., Eron, J.J., Gorczyca, P., Kaplan, J.C. (1991) Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. Nucleic Acids Res., 19, 3749.
Diachenko, L.B., Ledesma, J., Chenchik, A.A., Siebert, P.D. (1996) Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219, 824-828.
Dieffenbach, C.W., Lowe, T.M.J, Dveksler, G.S. (1995) General concepts for PCR primer design. PCR primer: a Laboratory Manual., pp. 133-142, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY.
Don, R.H., Cox, P.T., Wainwright, B.J., Baker, K., Mattick, J.S. (1991) 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008.
Franz, O., Bruchhaus, I., Roeder, T. (1999) Verification of differential gene transcription using virtual northern blotting. Nucleic Acids Res., 27, 1-3.
Frohman, M.A., Dush, M.K., Martin, G.R. (1988) Rapid production of full-length cDNA from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002.
Fromont-Racine, M., Bertrand, E., Pictet, R., Grange, T. (1993) A highly sensitive method for mapping the 5' termini of mRNA. Nucleic Acids Res., 21, 1683-1684.
Gottschlich, S., Goeoegh, t., Folz, B.J., Lippert, B.M., Werner, J.A. (1997) Optimized differential display and reamplification parameters for silver staining. Res. Commun. Mol. Path. Pharm. 97, 237-240.
Gromova, I., Gromov, P., Celis, J.E. (1999) Identification of true differentially expressed mRNA in a pair of human bladder transitional cell carcinomas sing an improved differential display procedure. Electrophoresis 20, 241-248.
Guegler, K., Tan, R., Rose, M.J. Methods and compositions for producing 5' enriched cDNA libraries. U.S. Pat. No. 6,083,727. Date of Patent: Jul. 4, 2000.
Guegler, K., Tan, R., Rose, M.J. Methods and compositions for producing full length cDNA libraries. U.S. Pat. No. 6,326,175. Date of Patent: Dec. 4, 2001.
Hogan, B., Bedding, R., Costantini, F., Lacy, E. (1994) Manipulating the moue embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Hwang, I.T., Lee, Y.H., Moon, B.C., Ahn, K.Y., Lee, S.W., Chun, J.Y. (2000) Identification and characterization of a new member of the placental prolactin-like protein-C (PLP-C) subfamily, PLP-Cβ. Endocrinology 141, 3343-3352.
Hayashizaki, Y. Method for forming full length cDNA libraries. U.S. Pat. No. 6,143,528. Date of Patent: Nov. 7, 2000.
Henegariu, O, Hirschmann, P., Killian, K., Kirch, S., Lengauer, C., Maiwald, R., Mielke, K., Vogt, P. (1994) Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis. Andrologia, 26, 97-106.
Ito, T., Kito, K., Adati, N., Mitsui, Y., Hagiwara, H., Sakaki, Y. (1994) Fluorescent differential display: arbitrarily primed RT-PCR fingerprinting on an automated DNA sequencer. FEBS Lett. 351, 231-236.
Jefferies, D., Botman, M. F., Lester, D, Whitehead, C. C., Thorp, B. H. (1998) Cloning differentially regulate genes from chondrocytes using agarose gel differential display. Biochim. Biophys. Acta 1396, 237-241.
Kociok, N., Unfried, K., Eser, P., Krott, R., Schraermeyer, U., Heimann, K. (1998) The nonradioisotopic representation of differentially expressed mRNA by a combination of RNA fingerprinting and differential display. Mol. Biotechnol. 9, 25-33.
Korn, B., Sedlacek, Z., Manca, A., Kioschis, P., Konecki, D., Lehrach, H., Poutska, A. (1992) A strategy for the selection of transcribed sequences in the Xq28 region. Hum. Mol. Genet. 1, 235-242.
Kulpa, D., Topping, R., Telesnitskt, A. (1997) Determination of the site of first strand transfer during Moloney murine leukemia virus reverse transcription and identification of strand transfer-associated reverse transcriptase errors. EMBO J. 16, 856-865.
Landegren, U., Nilsson, M., Kwok, P.-Y. (1998) reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis. Genome Res. 8, 769-776.
Liang, P., Pardee, A.B. (1992) Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257, 967-971.
Ledbetter, S.A., Nelson, D.L., Warren, S.T., Ledbetter, D.H. (1990) Rapid isolation of DNA probes within specific chromosome regions by interspersed repetitive sequence polymerase chain reaction. Genomics 6,475-481.
Loakes, D., Brown, D.M. (1994) 5-Nitroindole as an universal base analog. Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043.
Loakes, D. The applications of universal DNA base analogues. Nucleic Acids Res. 29, 2437-2447.
Luehrsen, K.R., Marr, L.L., Van Der Knaap, E., Cumberledge, S. (1997) Analysis of differential display RT-PCR products using fluorescent primers and genescan software. BioTechniques 22, 168-174.
Matz, M.V., Lukyanov, S.A. (1998) Different strategies of differential display: areas of application. Nucleic Acids Res. 26, 5537-5543.
Matz, M., Shagin, D., Bogdanova, E., Britanova, O., Lukyanov, S., Diatchenko, L., Chenchik., A. (1999) Amplification of cDNA ends based on templateswitching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res. 27, 1558-1560.
McClelland, M., Chada, K., Welsh, J., Ralph, D. (1993). Arbitrary primed PCR fingerprinting of RNA applied to mapping differentially expressed genes. In Symposium on DNA fingerprinting: State of the science, November, 1992 (ed. S.D. Pena et al.). Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland.
McPherson, M.J., Moller, S.G. (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY.
Meunier, J.R., Grimont, PA.D. (1993) Factors affecting reproducibility of amplified polymorphic DNA fingerprints. Res. Microbiol. 144, 373-379.
Mullis, K.B., Faloona, F.A. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350.
Mullis, K.B., Erlich, H.A, Arnheim, N., Horn, G.T., Saiki, R.K., Scharf, S.J. Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences. U.S. Pat. No. 4,683,195. Date of Patent: Jul. 28, 1987.
Mullis, K.B. Process for amplifying nucleic acid sequences. U.S. Pat. No. 4,683,202. Date of Patent: Jul. 28, 1987.
Mullis, K.B., Erlich, H.A, Arnheim, N., Horn, G.T., Saiki, R.K., Scharf, S.J. Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences. U.S. Pat. No. 4,800,159. Date of Patent: Jan. 24, 1989.
Mutirangura, A., Greenberg, F., Butler, M.G., Malcolm, S., Nicholls, R.D., Chakravarti, A., Ledbetter, D.H. (1993) Multiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy. Hum. Mol. Genet., 2, 143-151.
Nichols, R., Andrews, P.C., Ahang, P., Bergstrom, D.E. (1994) A universal nucleoside for use at ambiguous sites in DNA primers. Nature 369, 492-493.
Ohtsuka, E., Matsuka, S., Ikehara M., Takahashi, Y., Matsubara K. (1985) An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions. J. Biol. Chem. 260, 2605-2608.
Ralph, D., Welsh, J., McClelland, M. (1993) RNA fingerprinting using arbitrary primed PCR identifies differentially regulated RNAs in Mink lung (Mv1Lu) cells growth arrested by TGF-β. Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 10710-10714.
Rompf, R., Kahl, G. (1997) mRNA differential display in agarose gels. BioTechniques 23, 28-32.
Roses, A.D. (2000) Pharmacogenetics and the practice of medicine. Nature, 405, 857-865.
Rosok, O., Odeberg, J., Rode, M., Stokke, T., Funderud, S., Smeland, E. (1996) solid-phase method for differentially display of genes expressed in hematopoietic stem cells. BioTechniques 21, 114-121.
Ruano, G., Fenton,W., Kidd, K.K. (1989) Biphasic amplification of very dilute DNA samples via "booster PCR". Nucleic Acids Res. 17, 5407.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A., Arnheim, N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354.
Sakanari, J.A., Staunton, C.E., Eakin, A.E., Craik, C.S. (1989) Serine proteases from nematode and protozoan parasites: Isolation of sequence homologs using generic molecular probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4863-4867.
Schaefer, B.C. (1995) Revolutions in rapid amplification of cDNA ends: New strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length cDNA ends. Anal. Biochem. 227, 255-273.
Schmidt W.M., Mueller, M.W. (1999) CapSelect: A highly sensitive method for 5' CAP-dependent rerichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNA. Nucleic Acids Res. 27, e31.
Schramm, G., Bruchhaus, I., Roeder, T. (2000) A simple and reliable 5'-RACE approach. Nucleic Acids Res. 28, e96.
Shuber, A.P., Skoletsky, J., Stern, R., Handelin, B.L. (1993) Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis. Hum. Mol. Genet., 2, 153-158.
Smith, N.R., Aldersley, M., Li, A., High, A.S., Moynihan, T.P., Markham, A.F., Robinson. P.A. (1997) Automated differential display using a fluorescently labeled universal primer. BioTechniques 23, 274-279.
Sompayrac, L., Jane, S., Burn, T.C., Tene, D.G., Danna, K.J. (1995) Overcoming limitations of the mRNA differential display technique. Nucleic Acids Res. 23, 4738-4739.
Stone, B., Wharton, W. (1994) Targeted RNA fingerprinting: the cloning of differentially-expressed cDNA fragments enriched for members of the zinc finger gene family. Nucleic Acids Res. 22, 2612-2618.
Suzuki, Y., Yoshitomo-Nakagawa, K., Maruyama, K., Suyama, A., Sugano, S. (1997) Construction and characterization of a full length-enriched and a 5'-end-enriched cDNA library. Gene 200, 149-156.
Tagle, D.A., Swaroop, M., Lovett, M., Collins, F.S. (1993) Magnetic bead capture of expressed sequences encoded within large genomic segments. Nature 361. 751-753.
Villeponteau, B., Feng, J., Funk, W., Linskens, M.H.K. Method and kit for enhanced differential display. U.S. Pat. No. 5,580,726. Date of Patent: Dec. 3, 1996.
Welsh, J., McClelland, M. (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18, 7213-7218.
Welsh, J., McClelland, M. (1991) Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers. Nucleic Acids Res. 19, 5275-5279.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalki, J.A., Tingey, S.V. (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18, 6531-6535.
Zimmermann, K., Schogl, D., Plaimauer, B., Mannhalter, J.W. (1996) Quantitative multiplex competitive PCR of HIV-1 DNA in a single reaction tube. BioTechniques 21, 480-484.
Zou, S., Stanfield, C., Bridge, J. (1998) Identification of new influenza B virus variants by multiplex reverse transcription-PCR and the heteroduplex mobility assay. J. Clin. Microbiol. 36, 1544-1548.
Claims (145)
- 核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーであって、以下の(a)〜(c):
(a) それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分;
(b) 予め選択されたアービトラリ(arbitrary)ヌクレオチド配列を有する5'末端部分;および
(c) 前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分;
を含み、それによって調節部分がアニーリング温度によりそのプライマーのアニーリング部分を調節することができる、前記アニーリング調節プライマー。 - 5'末端部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列が、前記鋳型核酸上のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではないことを特徴とする、請求項1に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記鋳型核酸が、gDNA、cDNAまたはmRNAであることを特徴とする、請求項1に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記gDNAまたはcDNAが、一本鎖または二本鎖DNAであることを特徴とする、請求項3に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記核酸増幅が、第1のアニーリング温度および第2のアニーリング温度下で行うことを特徴とする、請求項1に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記核酸増幅の第1のアニーリング温度が、前記第2のアニーリング温度と同一であるかまたはそれより低いことを特徴とする、請求項5に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記3'末端部分が、前記第1のアニーリング温度でのアニーリングに関与し、前記5'末端部分が、前記第2のアニーリング温度でのプライミング部位として機能することを特徴とする、請求項5に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記調節部分が、前記第1のアニーリング温度でのプライマーのアニーリング部位を3'末端部分に制限することを特徴とする、請求項5に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記第1のアニーリング温度が約30℃〜68℃であることを特徴とする、請求項5に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記第2のアニーリング温度が約50℃〜72℃であることを特徴とする、請求項5に記載のアニーリング調節プライマー。
- 次の一般式で表される、請求項1に記載のアニーリング調節プライマー。
5'-Xp-Yq-Zr-3'
[式中、Xpは、鋳型核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する5'末端部分を表し;Yqは、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し;Zrは、そのプライマーとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分を表し;p、qおよびrは、ヌクレオチドの数であり;X、YおよびZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。] - 前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、天然のDNA/RNA塩基との間で識別されることなく天然のDNA/RNA塩基の各々と塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2'-デオキシイノシン、2-アザ-2'-デオキシイノシン、2'-OMe イノシン、2'-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-F 3-ニトロピロール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2'-OMe 5-ニトロインドール、2'-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2'-F ネブラリン、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2'-0-メトキシエチルイノシン、2'-0-メトキシエチルネブラリン、2'-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2'-0-メトキシエチル 4-ニトロベンズイミダゾール、2'-0-メトキシエチル3-ニトロピロールおよびこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記調節部分が、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を有する連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記デオキシリボヌクレオチドが、天然のdNMP、修飾ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記pが、15〜60の整数であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記qが、少なくとも2であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記qが、少なくとも3であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記qが、2〜15の整数であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記rが、6〜50の整数であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記pが15〜60の整数であり、qが2〜15の整数であり、そしてrが6〜30の整数であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Xpが、ユニバーサルプライマー配列を含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Xpが、制限酵素によって認識される配列を含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Xpが、検出または分離のための標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、mRNAのポリアデノシン(ポリA)テイルとハイブリダイズするヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項26に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、3'末端に3'-Vを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項26に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、3'末端に3'-NVを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれ、そしてそのNがデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項26に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、鋳型核酸中のターゲット配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、ランダムヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、予め決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の複数の組合せから選択される縮重ヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、少なくとも一つのリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、アレル部位に相補的な少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 前記Zrが、ターゲット核酸に対してミスマッチである、突然変異誘発のための少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項11に記載のアニーリング調節プライマー。
- 請求項1〜36のいずれか1項に記載のプライマーまたはプライマーセットを含むキット。
- 請求項1〜36のいずれか1項に記載のアニーリング調節プライマーの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対をさらに含むことを特徴とする、請求項37に記載のキット。
- プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物から核酸配列を増幅する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項39に記載の方法:
(a) 核酸配列の第一段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を各々のプライマーが前記核酸配列の前記領域とアニーリングする条件で行って、それにより前記核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程;および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。 - プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項41に記載の方法:
(a) 第1のアニーリング温度でターゲット核酸配列の第1段階の増幅を行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程;および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅させる、前記工程。 - mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
- 以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項43に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドdTプライマーと前記mRNAとを接触させる工程;
(b) 前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第1のDNA鎖を生成させる工程;
(c) 工程(b)で得られる第1のDNA鎖からの前記ターゲット核酸配列の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程;および
(d) 工程(c)で生成された増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(c)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。 - mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、二つまたはそれ以上の核酸試料中で示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出する方法。
- 以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項45に記載の方法:
(a) mRNA転写物の第1の集団である第1の核酸試料およびmRNA転写物の第2の集団である第2の核酸試料を提供する工程;
(b) 前記第1の核酸試料および第2の核酸試料の各々を請求項1〜29のいずれか1項に記載の第1のプライマーと別々に接触させる工程であって、前記第1のプライマーの3'末端部分が、前記の示差的に発現されるmRNA中の第1の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、かつ、前記接触を、鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で行う、前記工程;
(c) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記の示差的に発現されるmRNAを逆転写して、前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記第1の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の第1の集団、および前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記第2の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の第2の集団を生成する工程;
(d) 前記第1のcDNA鎖の第1および第2の集団の各々を精製し定量する工程;
(e) 工程(d)から得られた第1のDNA鎖の第1および第2の集団の各々の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第2のプライマーが、その3'末端部分に、第1のcDNA鎖の第1および第2の集団における第2の部位に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが第1のcDNA鎖の各々の集団における第2の部位にアニーリングする条件下で行って、それにより第2のcDNA鎖の第1および第2の集団を生成させる、前記工程;
(f) 工程(e)で生成された第2のcDNA鎖の各々の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)および(e)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)および(e)で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが第2のcDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記第2のcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程;および
(g) 工程(f)から得られた増幅産物の第1および第2の集団において、個々の増幅産物の存在またはレベルを比較する工程。 - mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法。
- 以下の工程(a)〜(e)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項47に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項1〜29のいずれか1項に記載の第1のプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、そのプライマーの3'末端部分が、そのプライマーとハイブリダイズする前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させる工程;
(c) 前記第1のcDNA鎖の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第2のプライマーが、その3'末端部分に、前記第1のcDNA鎖の一つにおける一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが前記第1のcDNA鎖の一つの遺伝子特異的部位とアニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的な第2のcDNA鎖を生成させる、前記工程;および
(d) 工程(c)で生成された遺伝子特異的な第2のcDNA鎖の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)の各々で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的な第2のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的なcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。 - mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットDNA断片の迅速増幅方法。
- 以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項49に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、cDNA合成プライマーとしてのオリゴヌクレオチドdTプライマーまたはランダムプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、前記cDNA合成プライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNAの一領域に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程;
(b) 前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAを、逆転写酵素を用いて逆転写して、前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させ、それによってmRNA−cDNA中間体を生成させる工程;
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第1のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程;
(d) 工程(c)で生成された前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程;
(e) 逆転写酵素を用いて前記第1のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第1の完全長cDNA鎖を伸長させる工程;
(f) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(e)から得られた前記第1の完全長cDNA鎖の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程:
(i) 第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第1のプライマーが、前記第1の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第1のプライマーが前記第1の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第2の完全長cDNA鎖を生成させる工程;
(ii) 請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第2のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第2の完全長cDNA鎖の一つの一領域に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第2のプライマーが前記第2の完全長cDNA鎖の一つにおける遺伝子特異的部位にアニーリングする条件で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖を生成させる工程;および
(g) 前記遺伝子特異的cDNA鎖の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(f)-(i)および工程(f)-(ii)で各々使用した第1および第2のプライマーと同一のプライマー、または工程(f)-(i)および(f)-(ii)で各々使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的cDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。 - mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜29のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅する方法。
- 以下の工程(a)〜(f)を含むことを特徴とする、請求項51に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項1〜29のいずれか1項に記載の第1のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第1のプライマーの3'末端部分が、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を用いて逆転写して、前記プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成させる工程;
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第1のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程;
(d) 工程(c)で生成された前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第1のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程;
(e) 逆転写酵素を用いて前記第1のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第1の完全長cDNA鎖を伸長させる工程;および
(f) 工程(e)で生成された前記第1の完全長cDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(d)で各々使用したのと同一の第1のプライマーおよびオリゴヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対、または工程(a)および(d)で使用した第1のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第1の完全長cDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記mRNAに相補的な完全長cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。 - mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅する方法。
- 以下の工程(a)〜(c)を含むことを特徴とする、請求項53に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第1のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第1のプライマーの3'末端部分が、少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する、前記工程;
(b) 請求項52に記載の工程(b)〜(e)を行い、それにより5'富化した第1のcDNAを伸長させる工程;および、
(c) 工程(b)で生成された前記5'富化した第1のcDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(b)で各々使用した第1のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'富化した第1のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより5'富化したcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。 - プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、二組以上のプライマー対を用いて、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同一の反応で同時に増幅する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項55に記載の方法:
(a) 二つ以上のターゲットヌクレオチド配列の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記の各プライマー対の各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域と実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマー対の各々が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それによりターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程;および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第2段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー対、または工程(a)で使用したプライマー対の各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各プライマー対の各々が工程(a)で生成された増幅産物の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を同一反応で再増幅させる、前記工程。 - プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAのDNAフィンガープリントを作製する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項57に記載の方法:
(a) gDNAから、ゲノムに特徴的な独立したDNA断片のセットであるDNAフィンガープリントの第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の部位に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記gDNAにアニーリングする条件で行って、それによりDNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したDNA断片のセットを生成させる、前記工程;および
(b) 工程(a)で生成された独立したDNA断片のセットの第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対の各々が工程(a)で生成された前記の独立したDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の独立したDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。 - 逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜29のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料のRNAフィンガープリントを作製する方法。
- 以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項59に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項1〜29のいずれか1項に記載の第1のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、その第1のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させる工程;
(c) 工程(b)で生成された第1のcDNA鎖の集団の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第1のcDNA鎖上の部位と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記mRNA試料にアニーリングする条件で行って、それによりRNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したcDNA断片のセットを生成させる、前記工程;および
(d) 工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(c)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記のプライマーまたはプライマー対の各々が工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記独立したcDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。 - 逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料から多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
- 以下の(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項61に記載の方法:
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項1〜29のいずれか1項に記載の第1のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、前記第1のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程;
(b) 前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第1のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第1のcDNA鎖の集団を生成させる工程;
(c) 工程(b)で生成された第1のcDNA鎖の集団の第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第2のプライマーは、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第1のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第2のプライマーが第1のcDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する3'末端cDNA断片を生成させる、前記工程;および
(d) 工程(c)で生成された3'末端cDNA断片の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用したのと同一の第1および第2のプライマー、または工程(a)および(c)で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記3'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記3'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。 - 以下の工程(a)〜(c)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項61に記載の方法:
(a) 請求項52に記載の工程(a)〜(e)を行って、それにより完全長cDNA鎖を生成させる工程;
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)から得られた前記第1の完全長cDNA鎖の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程:
(i) 第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第1のプライマーが、前記第1の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第1のプライマーが前記第1の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第2の完全長cDNA鎖を生成させる工程;
(ii) 請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第2のプライマーが、その3'末端部分に、前記第2の完全長cDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第2のプライマーが第2の完全長cDNA鎖の前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記のコンセンサス配列または縮重配列を有する5'末端cDNA断片を生成させる工程;および
(c) 工程(b)で生成された5'末端cDNA断片の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用したのと同一の第1および第2のプライマー、または工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用した第1および第2のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の5'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。 - プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAから多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項64に記載の方法:
(a) 前記gDNAからの保存性ホモロジー断片の第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対がgDNAの前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有するゲノムDNA断片を生成させる工程;および
(b) 工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対の各々が工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の3'末端配列および5'末端配列の各々にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の保存性ホモロジーゲノムDNA断片を増幅する、前記工程。 - プライマーを用いた増幅反応を行う段階を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項66に記載の方法:
(a) 前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な第1のDNA鎖を生成させる第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第1の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第1のプライマーおよび第1の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置(interrogation position)を含み、それにより、前記疑問位置が、前記第1の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第1のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第1のDNA鎖を生成させる工程;
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)で生成された前記第1のDNA鎖の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程:
(i) 請求項1〜25のいずれか1項に記載の第2のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第2のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第2の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第2のプライマーが前記ターゲット核酸の前記第2の部位にアニーリングする条件で行って、それにより前記ヌクレオチド変異を含む前記第1のDNA鎖に相補的な第2のDNA鎖を生成させる工程;および
(ii) 工程(a)および工程(b)-(i)で使用したのと同一の第1および第2のプライマー、または工程(b)-(i)で生成された前記第2のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なもしくはそれに相当するハイブリダイズする配列を各々が有するプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、前記サイクルを、各々のプライマーが前記第2のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記ターゲット核酸の前記第1の部位および第2の部位を3'末端および5'末端に含む前記第2のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第2のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。 - 以下の工程(a)〜(c)を含む、第1の増幅および第2の増幅の二つの別個の増幅過程を用いて行い、前記第2の増幅を二段階増幅を用いて行うことを特徴とする、請求項66に記載の方法:
(a) 両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む短いDNA鎖断片を生成させる第1の増幅を行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、前記ターゲット核酸の一部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記ヌクレオチド変異は、前記予め選択された配列の間に位置しており、前記プライマー対の少なくとも一つが、3'末端部分に前記ハイブリダイズする配列を有する請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであり、それにより両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片を生成させる工程;
(b) 前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片に相補的な第1のDNA鎖を生成する第2の増幅における第1段階の増幅を、第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の第1のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第1のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第1の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第1のプライマーおよび第1の部位の各々が、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含み、それにより、前記疑問位置が前記第1の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第1のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第1のDNA鎖を生成させる工程;および
(c) 工程(a)で生成された前記第1のDNA鎖の第2の増幅における第2段階の増幅を、第2のアニーリング温度で行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマー対の一方が、工程(a)で使用した請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーと同一のものであり、他方のプライマーが、工程(b)で使用した前記第1のプライマーと同一のものであるか、またはそのプライマー対の各々が、それとハイブリダイズする工程(b)で生成された前記第1のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたはそれに相当するハイブリダイズする配列を有しており、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第1のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより、前記第1のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第1のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。 - プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸において突然変異誘発する方法。
- 以下の工程(a)および(b)を含む、前記突然変異誘発が位置指定突然変異誘発であり、二段階増幅を用いることを特徴とする、請求項69に記載の方法:
(a) 前記ターゲット核酸配列の第1段階の増幅を第1のアニーリング温度で行う工程であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記ハイブリダイズする配列が、位置指定突然変異を生じさせるための少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有し、かつ、本工程を、プライマーまたはプライマー対が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングされる条件で行って、それにより位置指定当然変異部位を含む増幅産物を生成させる、前記工程;および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第2段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第2のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより位置指定突然変異部位を含む増幅産物が再増幅される、前記工程。 - 前記第2段階の増幅が、少なくとも5回繰り返されることを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応により行うことを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸が二本鎖であり、その鎖は変性により分離することを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸が一本鎖であることを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のアニーリング温度が、約30℃〜68℃であることを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のアニーリング温度が、約50℃〜72℃であることを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のアニーリング温度が、前記第2のアニーリング温度と同じであるかまたはそれより低いことを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1段階の増幅を行う際、請求項1〜36のいずれか1項に記載のプライマー対の3'末端部分が、前記第1のアニーリング温度でアニーリングに関与し、前記第2段階の増幅を行う際、前記プライマー対の5'末端部分が、プライミング部位として作用することを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜36のいずれか1項に記載のプライマーの調節部分が、前記第1のアニーリング温度での前記プライマーのアニーリング部位を、3'末端部分に制限することができることを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2段階の増幅の後、増幅されたDNA産物を単離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項40〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 単離されたDNA産物をベクター中にクローニングする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項80に記載の方法。
- 前記第1段階の増幅で使用した前記プライマー対が、請求項1〜25のいずれか1項に記載のプライマーから選択されるアニーリング調節プライマーと従来のプライマーとの組合せであることを特徴とする、請求項40、42、44、48、50、56、58、60、62、63または65に記載の方法。
- 前記プライマーが、検出または単離のための標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項45〜46および55〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の核酸試料が、第1の細胞中で発現されたmRNAを含み、前記第2の核酸試料が、第2の細胞中で発現されたmRNAを含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 前記第1の核酸試料が、第1の発生段階の細胞中で発現されたmRNAを含み、前記第2の核酸試料が、第2の発生段階の細胞中で発現されたmRNAを含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 前記第1の核酸試料が、腫瘍化細胞中で発現されたmRNAを含み、前記第2の核酸試料が、正常細胞中で発現されたmRNAを含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 前記mRNAの前記第1の部位が、ポリAを含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 前記第1のプライマーが次の一般式で表される、請求項46に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつmRNAに実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含み;dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し;dTは、前記mRNAの第1の集団および第2の集団における前記第1の部位にアニーリングできる連続したデオキシチミジンを表す。] - 前記第1のプライマーが次の一般式で表される、請求項48、52、60または62に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、mRNAに実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含み;dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し;dTは、前記mRNAのポリAテイルにアニーリングできる連続したデオキシチミジンを表す。] - 前記dTが、その3'末端に3'-Vをさらに含み、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項88または89に記載の方法。
- 前記dTが、その3'末端に3'-NVをさらに含み、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれて、前記Nは、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項88または89に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが次の一般式で表される、請求項46に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dZ8-15-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつ、前記第1のcDNA鎖の第1の集団および第2の集団に実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含み;dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し;dZは、DNA鎖の前記の第1の集団および第2の集団における前記第2の部位にアニーリングできるハイブリダイズするアービトラリヌクレオチド配列を表す。] - 前記第1のプライマーおよび第2のプライマーが、制限酵素によって認識される配列を含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 工程(g)が、アガロースゲルでの電気泳動により増幅産物の第1の集団および第2の集団の各々を分離する工程、および特定の大きさのバンドの存在またはレベルを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 工程(g)が、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により増幅産物の第1の集団および第2の集団の各々を分離する工程、および特定の大きさのバンドの存在またはレベルを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 前記のシトシン残基をテイリングさせる工程を、マンガンイオンの存在下で行うことを特徴とする、請求項50、52、54および63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シトシンテイルとの塩基対を形成する前記オリゴヌクレオチドが、次の一般式で表される、請求項50、52、54および63のいずれか1項に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dZ1-10-G3-5-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつ、予め選択されたアービトラリ配列を含み;dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し;dZは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつ、予め選択されたアービトラリ配列を含み;G3-5は、3〜5個のグアニンを表す。] - 前記G3-5が、3〜5個のリボグアニンであることを特徴とする、請求項97に記載の方法。
- 前記G3-5が、3〜5個のデオキシリボグアニンであることを特徴とする、請求項97に記載の方法。
- 前記G3-5が、リボグアニンとデオキシリボグアニンとの組合せであることを特徴とする、請求項97に記載の方法。
- 前記増幅産物のサイズ分離によって増幅産物を比較する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項55〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サイズ分離比較を、ポリアクリルアミドゲルマトリックスまたはアガロースゲルマトリックスでの電気泳動により行うことを特徴とする、請求項101に記載の方法。
- 前記サイズ分離比較を、自動DNAシーケンサーにより行うことを特徴とする、請求項101に記載の方法。
- 工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の3'末端部分が、8〜15ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項58に記載の方法。
- 工程(c)で使用した前記第2のプライマーまたは第2のプライマー対の3'末端部分が、8〜15ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項60に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAまたはmRNA試料が、異なる別個の生物体に由来するものであることを特徴とする、請求項58または60に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAまたはmRNA試料の供給源が、植物、動物および微生物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項58または60に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAまたはmRNA試料の供給源が、ヒトであることを特徴とする、請求項58または60に記載の方法。
- 請求項62または63で使用した前記第2のプライマー、または請求項65の工程(a)で使用した前記のプライマーまたはプライマー対が、保存性配列のアミノ酸配列をコードする複数のヌクレオチドから選択される縮重配列を各々含むプライマーのプールであることを特徴とする、請求項62、63または65に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸が、ゲノムDNAであることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸が、ヌクレオチド変異を含む短いヌクレオチド断片であることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸が、二つ以上の短いターゲットヌクレオチド断片を含み、前記ヌクレオチド断片の各々が、ヌクレオチド変異を含み、マルチプレックス核酸増幅にて製造されることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド変異が、一塩基多型または点突然変異であることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド変異が、ヒト核酸中に含まれることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド変異が、感染性疾患を引き起こす生物の核酸中に含まれることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- ヌクレオチド変異を含む前記第1のDNA鎖が、1サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により生成されることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの3'末端部分が、ヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドにより占められた疑問位置を含むことを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの前記疑問位置が、その3'末端部分の中間に位置することを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの3'末端部分が、8〜20ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの前記疑問位置が、前記第1のプライマーの3'末端ヌクレオチドから約10塩基以内にあることを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの疑問位置が、前記第1のプライマーの3'末端ヌクレオチドから約6塩基以内にあることを特徴とする、請求項120に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの前記疑問位置が、前記第1のプライマーの3'末端ヌクレオチドから4〜6塩基以内に位置することを特徴とする、請求項121に記載の方法。
- 前記第1のプライマーの前記疑問位置が、前記第1のプライマーの3'末端ヌクレオチドから5塩基以内に位置することを特徴とする、請求項122に記載の方法。
- 前記第1のプライマーが、その3'末端部分に、第1のプライマーの前記疑問位置に実質的に隣接した少なくとも一つの人為的ミスマッチヌクレオチドを有し、前記ミスマッチヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含むことを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 工程(b)-(i)におけるヌクレオチド変異を含む前記第2のDNA鎖が、1サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により生成されることを特徴とする、請求項67に記載の方法。
- 工程(b)-(ii)におけるヌクレオチド変異を含む前記第2のDNA鎖を、少なくとも5サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により増幅することを特徴とする、請求項67に記載の方法。
- 工程(c)におけるヌクレオチド変異を含む前記第1のDNA鎖を、少なくとも5サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により増幅することを特徴とする、請求項68に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド変異を含む短いターゲットヌクレオチド断片を、検出用標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含む前記第1のプライマーまたは第2のプライマーにより検出することを特徴とする、請求項67または68に記載の方法。
- 請求項39または40に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む核酸増幅用キット。
- 請求項41または42に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、DNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
- 請求項43または44に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
- 請求項45〜46、82、87および89〜92のいずれか1項に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出するためのキット。
- 請求項47または48に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットcDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
- 請求項49または50に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
- 請求項51または52に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅するためのキット。
- 請求項53または54に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅するためのキット。
- 請求項55または56に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同時に増幅するためのキット。
- 請求項57または58に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いたDNAフィンガープリントを作製するためのキット。
- 請求項59または60に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いたRNAフィンガープリントを作製するためのキット。
- 請求項61、62または63に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いて多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
- 前記キットは、請求項98〜101のいずれか1項に記載の前記オリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項134、135または140に記載のキット。
- 請求項64または65に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いた多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
- 請求項66、67または68に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸におけるヌクレオチド変異を同定するためのキット。
- 請求項69または70に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸において突然変異誘発するためのキット。
- 核酸増幅を含むプロセスのための、請求項1〜36のいずれか1項に記載のプライマーの使用。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009535054A (ja) * | 2006-05-04 | 2009-10-01 | シージーン アイエヌシー | 既知の配列に隣接した未知のdna配列を増幅する方法 |
JP2010246492A (ja) * | 2009-04-20 | 2010-11-04 | Olympus Corp | 多型の識別方法 |
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JP2012523821A (ja) * | 2009-03-27 | 2012-10-11 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット |
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Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8211899B2 (en) | 2005-08-30 | 2012-07-03 | Inter-University Research Institute Corporation National Institute Of Natural Sciences | Artificial nucleic acid bases and their use in base pairing natural nucleic acid bases |
JP2009535054A (ja) * | 2006-05-04 | 2009-10-01 | シージーン アイエヌシー | 既知の配列に隣接した未知のdna配列を増幅する方法 |
JP2013153766A (ja) * | 2006-12-21 | 2013-08-15 | Gen-Probe Inc | 核酸増幅のための方法および組成物 |
JP2017225460A (ja) * | 2006-12-21 | 2017-12-28 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 核酸増幅のための方法および組成物 |
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