BRPI0214741B1

BRPI0214741B1 - Iniciador de controle de anelamento para melhorar a especificidade de anelamento na amplificação de ácido nucléico, Kit, Métodos para amplificar seqüências de ácido nucléico de um DNA e seqüência de ácido nucléico alvo ou uma mistura de ácidos nucléicos, para detectar a complementaridade de DNA ao mRNA diferencialmente expresso em duas ou mais amostras de ácido nucléico, para amplificar rapidamente um fragmento de CDNA alvo, para amplificar uma população de CDNAs de filamento duplo de comprimento completo complementar aos mRNAS, e CDNAs de filamento duplo enriquecidos em 5 complementares aos mRNAS, para amplificar mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo simultaneamente, para produzir uma impressão digital de DNA de gDNA, e de RNA de uma amostra de mRNA, para identificar segmentos de homologia conservada em uma família de multigene a partir de uma amostra de mRNA, para identificar uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo, para a mutagênese em um ácido nucléico alvo, e, uso do iniciador

Info

Publication number: BRPI0214741B1
Authority: BR
Inventors: Jong-Yoon Chun
Original assignee: Seegene Inc
Priority date: 2001-12-08
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2015-05-12
Also published as: AU2002329104A1; RU2004120771A; US20050164184A1; KR20040070206A; EP1448795A1; DE60228750D1; WO2003050305A1; CN1578841A; CA2468754C; AU2002329104B2; IL162317A; EP1448793A1; ES2314093T3; WO2003050306A1; ATE407224T1; AU2002348612A1; EP1448793B1; KR100557329B1; NZ532531A; CN1602361A

Description

“INICIADOR DE CONTROLE DE ANELAMENTO PARA MELHORAR A ESPECIFICIDADE DE ANELAMENTO NA AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, KIT, MÉTODOS PARA AMPLIFICAR SEQÜÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLÉICO DE UM DNA E SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO ALVO OU UMA MISTURA DE ÁCIDOS NUCLÉICOS, PARA DETECTAR A COMPLEMENTARIDADE DE DNA AO MRNA DIFERENCIALMENTE EXPRESSO EM DUAS OU MAIS AMOSTRAS DE ÁCIDO NUCLÉICO, PARA AMPLIFICAR RAPIDAMENTE UM FRAGMENTO DE CDNA ALVO, PARA AMPLIFICAR UMA POPULAÇÃO DE CDNAS DE FILAMENTO DUPLO DE COMPRIMENTO COMPLETO COMPLEMENTAR AOS MRNAS, E CDNAS DE FILAMENTO DUPLO ENRIQUECIDOS EM 5’ COMPLEMENTARES AOS MRNAS, PARA AMPLIFICAR MAIS DO QUE UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO ALVO SIMULTANEAMENTE, PARA PRODUZIR UMA IMPRESSÃO DIGITAL DE DNA DE GDNA, E DE RNA DE UMA AMOSTRA DE MRNA, PARA IDENTIFICAR SEGMENTOS DE HOMOLOGIA CONSERVADA EM UMA FAMÍLIA DE MULTIGENE A PARTIR DE UMA AMOSTRA DE MRNA, PARA IDENTIFICAR UMA VARIAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO EM UM ÁCIDO NUCLÉICO ALVO, PARA A MUTAGÊNESE EM UM ÁCIDO NUCLÉICO ALVO, E, USO DO INICIADOR” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um iniciador de controle de anelamento e suas aplicações. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a um iniciador de controle de anelamento para melhorar a especificidade de anelamento na amplificação de ácido nucléico e suas aplicações a todos os campos da tecnologia envolvida na amplificação de ácido nucléico. aplicações a todos os campos da tecnologia envolvida na amplificação de ácido nucléico.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA A amplificação de ácido nucléico é um processo central para uma ampla variedade de métodos em biologia molecular, de modo que vários métodos de amplificação foram propostos. Por exemplo, Miller, Η. I. et al. (WO 89/06700) divulgam uma amplificação de seqüência de ácido nucléico com base na hibridização de uma seqüência promotora/iniciadora para um DNA de filamento único alvo (“ssDNA”) seguida pela transcrição de muitas cópias de RNA da seqüência. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucléico conhecidos incluem os sistemas de amplificação com base na transcrição (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86: 1173 (1989); e Gingeras T. R. et al., WO 88/10315).

Os esquemas com base na ligação de dois ou mais oligonucleotídeos na presença de ácido nucléico tendo a seqüência do “di-oligonucleotídeo” resultante, amplificando deste modo o di-oligonucleotídeo, também são conhecidos (Wu, D. Y. et al., Genomics 4: 560 (1989)), que são chamados de “Reação em cadeia de Ligação” (LCR).

Davey, C. et al. (European Pat. Appln. Publication N° 329.822) divulgam um processo de amplificação de ácido nucléico que envolve sintetizar ciclicamente RNA de filamento único (“ssRNA”), ssDNA, e DNA de filamento duplo (dsDNA). O ssRNA é um primeiro padrão para um primeiro oligonucleotídeo iniciador, que é alongado pela transcriptase reversa (polimerase de DNA dependente de RNA). O RNA é depois removido do duplex DNA:RNA resultante pela ação da ribonuclease Η. O ssDNA resultante é um segundo padrão para um segundo iniciador, que também inclui as seqüências de um promotor da RNA polimerase. Este iniciador é depois prolongado pela DNA polimerase, resultando como uma molécula de DNA de filamento duplo (“dsDNA”), tendo uma seqüência idêntica àquela do RNA original entre os iniciadores e tendo adicionalmente, em uma extremidade, uma seqüência promotora. Esta seqüência promotora pode ser usada pela RNA polimerase apropriada para produzir muitas cópias de RNA do DNA. Estas cópias podem depois re-entrar no ciclo que leva à amplificação muito rápida. O processo mais predominante para a amplificação de ácido nucléico conhecido como reação em cadeia da polimerase (daqui em diante aludida como “PCR”), está fundamentado em ciclos repetidos de desnaturação de DNA de filamento duplo, seguidos pelo anelamento do iniciador de oligonucleotídeo ao DNA padrão e extensão do iniciador por uma DNA polimerase (Mullis et al. Patentes U.S. N°s 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159; Saiki et al. 1985). Os iniciadores de oligonucleotídeo usados na PCR são planejados para anelarem aos filamentos opostos do DNA e são posicionados de modo que o produto de extensão catalisado pela DNA polimerase de um iniciador possa servir como o filamento padrão para o outro iniciador. O processo de amplificação pela PCR resulta no aumento exponencial de fragmentos de DNA separados cujo comprimento é definido pelas extremidades 5’ dos iniciadores de oligonucleotídeo.

O sucesso nas amplificações de ácido nucléico, em particular a amplificação pela PCR, reside na especificidade com que um iniciador anela apenas às suas sequências alvo (e não às não alvo) e portanto é importante otimizar esta interação molecular. Se um iniciador pode anelar apenas ao seu complemento perfeito ou também às seqüências que têm um ou mais desacordos, depende criticamente da temperatura de anelamento. No geral, quanto mais alta a temperatura de anelamento, mais específico o anelamento do iniciador ao seu padrão combinado perfeito e assim maior a probabilidade de que apenas a amplificação da seqüência alvo possa ser realizada. Quanto mais baixa a temperatura, mais desacordos entre o padrão e o iniciador podem ser tolerados, o que leva à amplificação aumentada de seqüências não alvo. O ajuste da temperatura de anelamento pode alterar a especificidade de emparelhamento entre o padrão e o iniciador. Por exemplo, se não existe nenhum produto, a temperatura pode ser muito alta e pode ser reduzida. Se existem produtos no controle onde apenas um iniciador está presente, isto indica que o iniciador único é anelado a mais do que uma região do padrão. Neste caso, a temperatura de anelamento deve ser aumentada. Considerando tal efeito da temperatura de anelamento sobre a especificidade de anelamento do iniciador, permanece uma forte necessidade para um sistema de iniciador de controle de anelamento que seja capaz de controlar o anelamento do iniciador de acordo com a temperatura de anelamento para realçar a especificidade de anelamento do iniciador independente do projeto do iniciador.

Além da temperatura de anelamento, diversos “parâmetros de procura de iniciador” tais como comprimento do iniciador, teor de GC e comprimento de produto de PCR (Dieffenbach et al., 1995) devem ser considerados para a especificidade de anelamento de iniciador. Se um iniciador, que satisfaça todos de tais parâmetros, foi utilizado, o anelamento do iniciador pode ser específico, resultando no realce significante da especificidade de anelamento do iniciador durante a amplificação do DNA alvo e o desembaraço dos problemas tais como produtos secundários e não específicos que surgem de iniciadores usados nos experimentos. É usual que iniciadores bem planejados possam ajudar a evitar o anelamento não específico e produtos secundários assim como distinguir entre cDNAs ou padrões genômicos na PCR de RNA.

Muitos métodos foram desenvolvidos para melhorar a especificidade de anelamento do iniciador e portanto realizar a amplificação do produto desejado. Os exemplos são PCR de contato (Don et al., 1991), PCR de início quente (D’Aquila et al., 1991), PCR abrigada (Mullis e Faloona, 1987) e PCR de reforço (Ruano et al., 1989). Outros métodos alternativos também reportaram que vários compostos ‘realçadores’ podem melhorar a especificidade da PCR. Os compostos realçadores incluem produtos químicos que aumentam a temperatura de anelamento eficaz da reação, proteínas de ligação de DNA e reagentes comercialmente disponíveis. Entretanto, não existe nenhum aditivo ‘mágico’ que garantirá o sucesso em toda PCR e é muito tedioso testar aditivos diferentes sob condições diferentes tais como a temperatura de anelamento. Embora estes métodos tenham contribuído para a melhora da especificidade de anelamento do iniciador em alguns casos, eles não têm facilitado fimdamentalmente o acesso a uma solução para os problemas que surgem dos iniciadores usados na amplificação pela PCR, tais como produtos não específicos e produtos secundários altos.

Em muitos casos, a seqüência iniciadora não precisa ser um complemento perfeito para a seqüência padrão. A região do iniciador que deve ser perfeitamente emparelhada com o padrão é a extremidade 3’ por que esta extremidade é a região do iniciador prolongado pela DNA polimerase e é portanto a mais importante para garantir a especificidade de anelamento à seqüência alvo correta. A extremidade 5’ do iniciador é menos importante na determinação da especificidade de anelamento à seqüência alvo e pode ser modificada para carregar seqüência adicional tal como sítios de restrição e seqüência promotoras que não sejam complementares com o padrão (McPherson e Moller 2000). Esta noção é adaptada para o planejamento dos iniciadores de controle de anelamento desta invenção como descrito abaixo.

As técnicas com base na PCR foram amplamente usadas não apenas para a amplificação de uma seqüência de DNA alvo mas também para aplicações ou métodos científicos nos campos da pesquisa biológica e médica tais como a PCR de transcriptase reversa (RT-PCR), PCR de Demonstração Diferencial (DD-PCR), Clonagem de genes conhecidos ou desconhecidos pela PCR, Amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) e análise genômica com base na PCR (McPherson e Moller, 2000). Os seguintes são apenas representativos de aplicações da PCR.

As técnicas planejadas para identificar genes que são diferencialmente regulados pelas células sob várias condições fisiológicas ou experimentais (por exemplo, diferenciação, carcinogênese, tratamento farmacológico) têm se tomado central na biologia moderna. Um tal método para triar diferenças na expressão de gene entre vários tipos de célula ou entre estágios diferentes do desenvolvimento celular com a disponibilidade da PCR é conhecido como PCR de Demonstração Diferencial (DD-PCR), descrito por Liang e Pardee em 1992. Este método usa combinações de iniciadores arbitrários de 10 mer com iniciadores de cDNA fixados e gera fragmentos que se originam na maior parte da terminação poli(A) e se estendem a cerca de 50 a 600 nucleotídeos a montante. Combinando-se iniciadores Oligo(dT) fixados em 3’ e iniciadores arbitrários 5’ curtos, os subconjuntos do transcriptoma são amplificados, os fragmentos de cDNA resultantes são no geral separados em gel de poliacrilamida desnaturante e autorradiograficamente visualizados.

Embora este método seja simples e rápido e apenas requeira quantidades pequenas de RNA total, existem várias desvantagens nos métodos de DD-PCR convencionais. Os padrões de bandeamento diferencial são muitas vezes apenas deficientemente reprodutíveis devido ao uso de iniciador arbitrário curto de modo que muitos laboratórios têm tido dificuldade em obter resultados reprodutíveis com estes métodos. Foi mostrado que pelo menos 40 % das faixas diferencialmente demonstradas não são reprodutíveis entre os experimentos mesmo em mãos bem treinadas (Bauer et al., 1994). Além disso, o padrão de expressão diferencial muitas vezes não pode ser reprodutível nas Northern blots e a porcentagem destes positivos falsos podem surgir em até 90 % (Sompayrac et al., 1995). Como uma modificação usada para uma alternativa, o uso de iniciadores aleatórios mais longos, por exemplo de 20 bases no comprimento não soluciona satisfatoriamente o problema de reprodutibilidade (Ito et al., 1994). Existem outros fatores responsáveis pela reprodutibilidade relativamente baixa da DD-PCR tais como uma quantidade insuficiente de material de partida e concentração muito baixa de dNTP (2 a 5 μΜ) utilizada para preparar os padrões de bandeamento diferentes (Matz e Lukyanov, 1998). Também é difícil detectar transcritos raros com estes métodos (Matz e Lukyanov, 1998). Além disso, por que os fragmentos de cDNA obtidos a partir da DD-PCR são curtos (tipicamente de 100 a 500 pares de base) e correspondem à extremidade 3’ do gene que representa principalmente a região não traduzida 3’, eles usualmente não contém uma porção grande da região codificadora. Portanto, a triagem de cDNA de comprimento completo de trabalho intensivo é necessária a menos que homologia de seqüência significante, informação para a classificação de gene e prognóstico de função sejam obtidos (Matz e Lukyanov, 1998).

Os Métodos de Demonstração Diferencial no geral usam técnicas de detecção radioativa usando géis de poliacrilamida desnaturantes. A detecção radioativa de produtos de reação restringem o uso desta técnica aos laboratórios com o equipamento apropriado. Tempos de exposição relativamente longos e problemas com a isolação de faixas de interesse a partir dos géis de poliacrilamida são desvantagens adicionais da técnica de Demonstração Diferencial. Embora modificados métodos de Demonstração Diferencial não radioativos foram recentemente descritos, que incluem o tingimento com prata (Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998), oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997), pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996) e géis de agarose tingidos com brometo de etídio (Rompf e Kahl, 1997; Jefferies et al., 1998; Gromova et al., 1999), estes métodos atingiram apenas sucesso limitado. Se os produtos de reação pudessem ser simplesmente detectados em géis de agarose tingidos com brometo de etídio e os resultados fossem reprodutíveis e confiáveis, aumentar-se-ia enormemente a velocidade da análise de DD-PCR e evitar-se-ia o uso de radioatividade.

Um outro método com base na PCR chamado de Demonstração Diferencial alvejada usa um iniciador de oligonucleotídeo que direciona a amplificação de membros da família de multigene com domínios de proteína conservada. As famílias de gene são grupos de genes que são muitas vezes funcionalmente caracterizados por um tipo particular de função empreendido pelos produtos de gene em uma célula e que estruturalmente têm uma ou mais regiões conservadas (domínios) em comum. Os exemplos de famílias de gene incluem o MADS-box e a família de homeogene assim como outras famílias de fator de transcrição. As famílias de gene da ciclina, citocina e globina são exemplos de interesse médico. O Banco de Dados Prosite fornece uma lista de proteínas que têm domínios e motivos de seqüência comuns. O oligonucleotídeo usado na PCR pode ser um iniciador específico que é usado em uma temperatura de anelamento baixa ou, como é mais freqüentemente o caso, uma mistura de iniciador degenerado para o uso em severidades mais altas (Stone e Wharton, 1994). Entretanto, as amplificações que usam iniciadores degenerados podem ser algumas vezes problemáticas e podem requerer otimização. É importante manter a temperatura de anelamento tão alta quanto possível para se evitar a amplificação não específica extensiva e uma boa regra prática é usar 55 ° C como uma temperatura de partida. No geral, é difícil manter esta regra por que os iniciadores degenerados devem ser planejados com base nas seqüências de aminoácido ou seqüências de domínio conservado como uma pré condição. De modo a gerar uma relação que satisfaça entre o iniciador degenerado e a temperatura de anelamento neste método, é requerido usar um iniciador de controle de anelamento que possa tolerar a alternância de temperatura de anelamento, particularmente temperatura alta tal como 68 ° C independente do projeto do iniciador.

Ainda uma outra técnica com base na PCR é a PCR imprimada arbitrária (AP-PCR) para a impressão digital de RNA. Uma eficácia excelente dos métodos de AP-PCR é a sua simplicidade (Welsh e McClelland, 1991; Williams et al., 1990). A AP-PCR usa um único iniciador ou um par de iniciadores, em que os iniciadores são 10 mers ou 18 mers como o iniciador mais longo. Este método foi anteriormente usado para fornecer impressões digitais de DNA de linhagens de célula híbrida (Ledbetter et al., 1990) e de regiões genômicas particulares (Welsh e McClelland, 1990; Williams et al., 1990). Ele fornece uma ferramenta muito útil para a análise genômica na identificação e em estudos populacionais de bactérias, fungos e plantas, onde isolados individuais podem ser rapidamente comparados. Por exemplo, eles podem ser usados como uma ferramenta para identificar patógenos ou a ocorrência de cepas particulares ou patótipos. Habitualmente, a AP-PCR usa um único iniciador para iniciar a síntese de DNA de regiões de um padrão onde o iniciador emparelha imperfeitamente. De modo a que isto funcione, os ciclos iniciais devem ser realizados em severidade baixa (37 a 50 0 C), normalmente para os primeiros cinco ciclos, que permite o anelamento do iniciador aos sítios imperfeitos por todo o genoma. A severidade é depois aumentada (55° C) como para a amplificação padrão pela PCR e a reação é permitida por um adicional de 30 a 35 ciclos. A AP-PCR não é recomendada para o uso em aplicações tais como teste de paternidade onde resultados inequívocos são exigidos, por que produtos não precursores são ocasionalmente produzidos. Embora métodos de AP-PCR alternativos que incluem a AP-PCR abrigada fossem desenvolvidos (McClelland et al., 1993; Ralph et al., 1993), o problema da reprodutibilidade é ainda de interesse principal. Uma preocupação é que os padrões podem variar de dia para dia ou de laboratório para laboratório (ver, por exemplo, Meunier e Grimont, 1993).

Ainda uma outra aplicação com base na PCR é a tecnologia RACE (amplificação rápida de extremidade de cDNA). RACE é um procedimento para a amplificação de regiões de cDNA que correspondem às extremidades 5’ ou 3’ de mRNA (Frohman et ai, 1988) e foi usado para isolar transcritos raros com sucesso. O iniciador específico de gene pode ser derivado a partir de dados de seqüência de um cDNA parcial, exon genômico ou peptídeo. Em 3’ RACE, a terminação poliA de moléculas de mRNA é explorada como um sítio de iniciação para a amplificação pela PCR. Os mRNAs são convertidos em cDNAs que usam a transcriptase reversa e um iniciador Oligo-dT como conhecido na técnica. Os cDNAs gerados podem ser depois diretamente amplificados pela PCR usando um iniciador específico de gene e um iniciador que anela à região poliA. O mesmo princípio como para 3’ RACE se aplicam a 5’ RACE mas não existe nenhuma terminação poliA. Assim, 5’ RACE é fabricado alvejando-se a extremidade 5’ de um cDNA por meio de métodos diferentes (Fromont-Racine et ai, 1993; Schaefer, 1995; Franz et ai, 1999). A maioria dos métodos para o 5’ RACE tal como a formação de terminação homopolimérica e a formação de terminação fixada por ligação requer um conjunto de reações enzimáticas depois da conclusão da síntese do primeiro filamento do cDNA (Schaefer, 1995). Cada etapa enzimática tem o potencial para introduzir falhas e destruir a integridade do cDNA. Recentemente, uma alternativa foi introduzida, o chamado método CapFinder (Chenchik et ai, 1998; Chenchik et ai Patentes U.S. N°s 5.962.271 e 5.962.272). A técnica conta com as funções duplas das transcriptases reversas: uma é a atividade de transferase terminal para adicionar nucleotídeos não padronizados à extremidade 3’ de um cDNA e a outra é a atividade de mudança de padrão para mudar um padrão para um segundo padrão. Esta propriedade é utilizada durante o ciclo de vida retroviral (Clark, 1988; Kulpa et ai, 1997). A transcriptase reversa (RT) do vírus da leucemia de murino Moloney (M-MLV) muitas vezes adiciona de três a quatro resíduos de citosina derivada de não padrão à extremidade 3’ de cDNAs recém sintetizados na presença de manganês ou magnésio alto (Schmidt e Mueller, 1999). Este método permite a amplificação de cDNAs de comprimento completo por que a RT de M-MLV adiciona resíduos C preferencialmente ao cDNA se completo (encapusado) o mRNA serve como padrão.

Entretanto, o método CapFinder para os experimentos 5’ -RACE podem não ser livres de problemas secundários tais como sujidade de DNA que surge da contaminação dos iniciadores de CapFinder e Oligo-dT, que são usados na síntese de cDNA (Chenchik et al., 1998). Mesmo quantidades residuais destes iniciadores resultam em um alto teor de produtos secundários por que ambos idealmente se adaptam a todos os cDNAs presentes na mistura de reação. Além disso, 3’-RACE e a amplificação de cDNA de comprimento completo têm os mesmos problemas secundários devido à contaminação de iniciadores usados para a síntese de cDNA em que eles geram produtos não específicos na reação de PCR (Chenchik et al., 1998). Novos métodos para superar os problemas acima foram recentemente introduzidos. Um método é a PCR sem etapas para suprimir produtos de PCR não desejados (Matz et al., 1999) mas tem sido salientado que este método ainda deixa uma sujidade de DNA ao invés de um único DNA (Schramm et al., 2000). Um outro método que foi introduzido mais recentemente é usar a síntese de fase sólida de cDNA e procedimentos para remover todos os contaminantes usados na síntese de cDNA (Schramm et al., 2000), mas a principal desvantagem desta técnica é ser cara e consumidora de tempo requerendo a síntese de fase sólida de cDNA e os procedimentos que a acompanham. Portanto, estratégias mais eficazes, simples, rápidas e baratas são requeridas para eliminar completamente os problemas que surgem da contaminação dos iniciadores tais como iniciadores Oligo-dT ou CapFinder usados para a síntese de cDNA.

Além das tecnologias RACE, nas tecnologias correntes para a construção de biblioteca de cDNA, as extremidades 5’ dos genes tendem a ser sub-representadas em populações de cDNA, especialmente onde um iniciador poli(dT) é usado durante a síntese do primeiro filamento do cDNA e o material de partida é limitado. Embora vários métodos diferentes foram desenvolvidos para superar este problema, a maioria sofre de limitações comuns que produzem cDNAs de comprimento completo ou cDNAs enriquecidos em 5’ com vários problemas inerentes. Estes métodos são complexos ou caros ou consumidores de tempo requerendo-se etapas enzimáticas múltiplas e/ou não são pronunciadamente sensíveis (Caminci et al., 1997; Suzuki et al., 1997; Guegler et al. Patentes U.S. Nos 6.083.727 e 6.326.175; Hayashizaki. Patente U.S. N° 6.143.528). Portanto, existe interesse continuado no desenvolvimento de métodos melhorados para gerar cDNAs de comprimento completo ou enriquecidos em 5’, particularmente com o material de partida limitado. A PCR multiplex é uma outra variante de PCR em que mais do que uma seqüência alvo pode ser simultaneamente amplificada com mais do que um par de iniciadores na mesma reação. Desde a sua primeira descrição em 1988 (Chamberlain et al., 1988), este método tem sido aplicado com sucesso em muitas áreas de teste de DNA, incluindo as análises de supressão de gene (Anônimo, 1992; Henegariu, et al., 1994), a análise de mutação e polimorfismo (Shuber et al., 1993; Mutirangura et al., 1993), a análise quantitativa (Zimmermann et al., 1996) e detecção de RNA (Zou et al., 1998). No campo das doenças infecciosas, a técnica mostrou ser um método valioso para a identificação de vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas.

Entretanto, os resultados obtidos com a PCR multiplex são ffeqüentemente complicados pelos artefatos do procedimento de amplificação. Estes incluem resultados “negativos falsos” devido à falha de reação e resultados “positivos falsos” tais como a amplificação de produtos ilegítimos, que podem ser causados pelo anelamento dos iniciadores para seqüências que são relacionadas mas distintas das seqüências de reconhecimento verdadeiras. Para o uso na PCR multiplex, um iniciador deve ser planejado de modo que as suas cinéticas de hibridização prognosticadas sejam similares àquelas dos outros iniciadores usados na reação multiplex da amostra. Embora a temperatura de anelamento e as concentrações de iniciador possam ser calculadas em algum grau, as condições no geral devem ser empiricamente determinadas para cada reação multiplex. Visto que a possibilidade de iniciação não específica aumenta com cada par de iniciador adicional, as condições devem ser modificadas como necessário conforme conjuntos de iniciador individuais são adicionados. Além disso, os artefatos que resultam da competição quanto aos recursos (por exemplo, o esgotamento de iniciadores) são aumentados na PCR multiplex, visto que as diferenças nos rendimentos de fragmentos inadequadamente amplificados são realçadas com cada ciclo. Assim, a otimização das condições de reação para a PCR multiplex pode tomar-se trabalho intensivo e consumidor de tempo. Visto que as PCRs multiplex diferentes podem ter condições de reação únicas, o desenvolvimento de novos testes de diagnóstico pode tomar-se muito caro.

Portanto, existe uma necessidade na técnica para iniciadores que permitam que reações de PCR multiplex sejam planejadas e realizadas sem etapas de otimização elaboradas, independente das propriedades potencialmente divergentes dos diferentes iniciadores usados. Além disso, existe uma necessidade na técnica para iniciadores que permitam reações de PCR multiplex que, sob as mesmas condições de reação, simultaneamente produzam quantidades equivalentes de cada um dos muitos produtos de amplificação.

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), as variações genéticas mais comuns encontradas no genoma humano, são marcadores importantes para identificar locais associados com doença e para estudos fármaco-genéticos (Landegren et al., 1998; Roses, 2000). As SNPs aparecem no genoma humano com uma média de uma vez a cada 1000 pares de base e totalizando >3 milhões. Uma variedade de métodos foi usada para detectar SNPs. Entretanto, um dos gargalos chave é a amplificação de DNA. Os ensaios mais correntes incluem uma etapa que produz muitas cópias de um segmento curto do DNA de amostra que transpõe cada SNP alvo. Esta amplificação é usualmente necessária por que apenas quantidades pequenas de DNA podem ser colhidas de amostras clínicas típicas. Também, a amplificação melhora a relação de sinal para ruído dos ensaios, aumentando a confiabilidade de detecção. As maioria das técnicas de genotipagem realizam esta amplificação que usa a PCR. O mais importante, a especificidade de amplificação pela PCR é crítica na aplicação da PCR na genotipagem de SNP. Portanto, seria benéfico se os métodos para melhorar a especificidade da PCR estivessem disponíveis e aplicados no desenvolvimento do ensaio de genotipagem de SNP. Também seria benéfico se tais métodos fossem capazes de fornecer análises múltiplas em um único ensaio (ensaios multiplex).

Como descrito acima, todos estes métodos e técnicas que envolvem a amplificação de ácido nucléico, em particular a amplificação pela PCR, podem não ser completamente livres das limitações e problemas que resultam da não especificidade de iniciadores usados em cada método, tais como positivos falsos, reprodutibilidade deficiente, produtos secundários altos e assim por diante, embora caminhos melhorados para cada método tenham sido continuamente introduzidos. Portanto, permanece uma necessidade de iniciador novo para melhorar a especificidade de anelamento e métodos, que possam dar origem a resultados verdadeiros.

Por todo este pedido, várias patentes e publicações são dadas como referência e citações são fornecidas em parênteses. A divulgação destas patentes e publicações em suas entidades são aqui incorporadas por referência neste pedido de modo a descrever mais completamente esta invenção e o estado da técnica à qual esta invenção pertence.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esforços para solucionar os problemas de tais iniciador convencionais e vários métodos que envolvem a amplificação de ácido nucléico, o presente inventor desenvolveu um novo iniciador de controle de anelamento que pode permitir a amplificação de ácido nucléico com especificidade muito maior e suas aplicações ilimitadas em todos os campos da tecnologia com base na amplificação de ácido nucléico.

Conseqüentemente, é um objetivo desta invenção fornecer um iniciador de controle de anelamento para melhorar a especificidade de anelamento na amplificação de ácido nucléico. r E um outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar uma seqüência de ácido nucléico a partir de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos como padrão. E ainda um outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos como padrão. E outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um mRNA. E ainda outro objetivo desta invenção fornecer um método para detectar a complementaridade de DNA a um mRNA diferencialmente expresso em duas ou mais amostras de ácido nucléico. r E um outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar rapidamente um fragmento de cDNA alvo que compreende uma região de cDNA que corresponde à região da extremidade 3’ de um mRNA. E ainda um outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar um fragmento de cDNA alvo que compreende uma região de cDNA que corresponde à região de extremidade 5’ de um mRNA. E outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar uma população de cDNAs de filamento duplo de comprimento completo complementares aos mRNAs. É ainda outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar cDNAs de filamento duplo enriquecidos em 5’ complementares aos mRNAs. É um outro objetivo desta invenção fornecer um método para amplificar mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo simultaneamente. É ainda um outro objetivo desta invenção fornecer um método para produzir uma impressão digital de DNA de gDNA. É ainda um outro objetivo desta invenção fornecer um método para produzir uma impressão digital de RNA de uma amostra de mRNA. É outro objetivo desta invenção fornecer um método para identificar um segmento de homologia conservada em uma família de multigene. É ainda outro objetivo desta invenção fornecer um método para identificar uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo. É um outro objetivo desta invenção fornecer um método para a mutagênese em um ácido nucléico alvo. É ainda um outro objetivo desta invenção fornecer um kit que compreende um iniciador de controle de anelamento. É outro objetivo desta invenção fornecer kits para uma variedade de métodos que envolvem a amplificação de ácido nucléico. E ainda outro objetivo desta invenção fornecer um uso de um iniciador de controle de anelamento para um processo que envolve a amplificação de ácido nucléico.

Outros objetivos e vantagens da presente invenção tomar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada acompanhadas em conjugação com as reivindicações e desenhos anexos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

As FIGs. IA e 1B mostram representações esquemáticas para amplificar seletivamente um ácido nucléico alvo do DNA de filamento duplo (IA) ou mRNA (1B) usando o ACP da presente invenção.

As FIGs. 2A e 2B mostram representações esquemáticas para identificar diferencialmente genes expressos usando o ACP da presente invenção. A FIG. 3 mostra uma representação esquemática para amplificar um fragmento de cDNA alvo que compreende a região da extremidade 3’ que corresponde à extremidade 3’ de mRNA usando o ACP da presente invenção.

As FIGs. 4A e 4B mostram as representações esquemáticas para amplificar um fragmento de cDNA alvo que compreende a região de extremidade 5’ que corresponde à extremidade 5’ de mRNA usando o ACP da presente invenção. O Oligo dT (4A) ou iniciador aleatório (4B) é usado como uma síntese de primeiro cDNA de filamento iniciador. A FIG. 5 mostra uma representação esquemática para amplificar moléculas de cDNA de comprimento completo complementares às moléculas de mRNA usando o ACP da presente invenção. A FIG. 6 mostra uma representação esquemática para amplificar moléculas de cDNA enriquecidas em 5’ complementares às moléculas de mRNA que compreendem a informação da extremidade 5’ usando o ACP da presente invenção. A FIG. 7A mostra uma representação esquemática para detectar polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) usando o ACP da presente invenção. A FIG. 7B mostra uma outra representação esquemática para detectar polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) usando o ACP da presente invenção. A FIG. 8 é uma fotografia em gel de agarose para mostrar o efeito de um grupo de desoxiinosina posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ de ACP. 0 cDNA foi amplificado usando RNA total isolado de tecidos de concepto em E4.5 (linhas 1 e 4), El 1.5 (linhas 2 e 5) e E18.5 (linhas 3 e 6), com um conjunto dos dTi0-JYC2 (SEG ID NO. 29) e ACP 10 (linhas 1 a 3) (SEG ID NO. 13) e um conjunto do dTio-ACPl (SEG ID NO. 30) e ACP 10 (linhas 4 a 6), respectivamente. A FIG. 9 é uma fotografia de gel de agarose para mostrar o efeito de resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ de ACP em associação com a alteração do número de desoxiinosina durante a PCR. As linhas 0, 2, 4, 6 e 8 representa o número de resíduos desoxiinosina, respectivamente. A FIG. 10A é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os resultados de amplificações de PCR de estágio duplo para Esxl usando um conjunto de iniciadores EsxN7 e EsxCó (linha 1) e um conjunto de iniciadores EsxN7-ACP e EsxC6-ACP (linha 2). A FIG. 10B é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os resultados de amplificações de PCR de estágio duplo para Esxl usando EsxNl (linha 1), EsxC2 (linha 2), um conjunto de EsxNl-ACP e EsxC2 (linha 3) e um conjunto de EsxNl-ACP e EsxC2-ACP (linha 4). A FIG. 10C é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os resultados de amplificações de PCR de estágio duplo para Esxl usando um conjunto de EsxN3 e EsxC5 (linhas 1 e 2) e um conjunto de EsxN3-ACP e EsxC5-ACP (linha 3). A FIG. 10D é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os resultados de amplificações de PCR de estágio duplo não interrompida para Esxl usando o iniciador EsxNl (linha 1), EsxC2 (linha 2), um par de EsxNl e EsxC2 (linha 3) e um par de EsxNl-ACP e EsxC2-ACP (linha 4). A FIG. 11A é uma fotografia de géis de agarose para mostrar exemplos do ACP usado para detectar mRNAs diferencialmente expressos durante o desenvolvimento embriônico usando estágios diferentes de tecidos de concepto de camundongo. Os cDNAs foram amplificados usando RNA total isolado de tecidos de concepto em E4.5 (linha 1), El 1.5 (linha 2) e El8.5 (linha 3), com um conjunto de ACP3 (SEGID NO. 3) e dTi0-ACPl. As faixas indicadas pelas setas representam os fragmentos de cDNA amplificados de mRNAs diferencialmente expressos. Os números das setas indicam os fragmentos de cDNA usados como sondas na análise de Northern blot da FIG. 13. A FIG. 11B é uma fotografia de géis de agarose para mostrar exemplos do ACP usados para detectar mRNAs diferencialmente expressos durante o desenvolvimento embriônico usando estágios diferentes de tecidos de concepto de camundongo. Os cDNAs foram amplificados usando RNA total isolado de tecidos de concepto em E4.5 (linhas 1-2 e 7-8), El 1.5 (linhas 3-4 e 9-10) e El8.5 (linhas 5-6 e 11-12), com um conjunto de ACP5 (SEG ID NO. 5) e dTio-ACPl (as linhas 1-6) e um conjunto de ACP8 (SEG ID NO. 8) e dTio-ACPl (linhas 7-12), respectivamente. As faixas indicadas pelas setas representam os fragmentos de cDNA amplificados de mRNAs diferencialmente expressos. Os números das setas indicam os fragmentos de cDNA usados como sondas na análise de Northern blot da FIG. 13. A FIG. 11C é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os produtos de cDNA amplificados obtidos de estágios diferentes de amostras de concepto de camundongo (E4.5: linhas 1 e 2; El 1.5: linhas 3 e 4; E18.5: linhas 5 e 6) usando um conjunto de iniciadores ACP 10 e dTjo-ACP. A FIG. 1 ID é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os produtos de cDNA amplificados obtidos de estágios diferentes de amostras de concepto de camundongo (E4.5: linhas 1 e 2; El 1.5: linhas 3 e 4; El8.5: linhas 5 e 6) usando um conjunto de iniciadores ACP 14 e Ti0-ACPl. A FIG. 12A é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os produtos de cDNA amplificados obtidos de estágios diferentes de amostras de concepto de camundongo (E4.5: linha 1; El 1.5: linha 2; El8.5: linha 3) por uma amplificação de estágio duplo de interrupção única pela PCR usando um conjunto de iniciadores ACP10 e JYC5-Ti5-ACP. A FIG. 12B é uma fotografia de gel de agarose para mostrar os produtos de cDNA amplificados obtidos de estágios diferentes de amostras de concepto de camundongo (E4.5: linha 1; El 1.5: linha 2; El8.5: linha 3) pela amplificação de estágio duplo não interrompida pela PCR usando um conjunto de iniciadores ACP10 e JYC5-Ti5-ACP. A FIG. 13 mostra a análise de Northern blot de seis fragmentos de cDNA amplificados de mRNAs diferencialmente expressos durante o desenvolvimento embriônico. Os seis fragmentos rotulados com P indicados pelas setas na FIG. 11 foram usados como sondas para a análise de Northern blot. As setas 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são DEG1 (FIG. 13A), DEG3 (FIG. 13B), DEG2 (FIG. 13C), DEG8 (FIG. 13D), DEG5 (FIG. 13E) e DEG7 (FIG. 13F), respectivamente, em que os resultados das análise de seqüência DEG são mostrados na Tabela 1. DEG2 (SEG ID NO. 31) e DEG5 (SEG ID NO. 32) são fornecidos como genes novos (Tabela 2). Os painéis de controle (a parte inferior de cada painel) mostram cada gel antes do manchamento, tingido com brometo de etídio e fotografado sob luz UV, demonstrando níveis similares de rRNA 18S e 28S como um controle de carregamento. A FIG. 14 mostra os padrões de expressão de um novo gene, DEG5, em um estágio completo de conceptos de camundongo. A análise de Northern blot foi realizada usando o fragmento de cDNA DEG5 radio-rotulado como uma sonda. O RNA total (20 pg/linha) foi preparado a partir de conceptos de camundongo nos tempos de gestação como indicados. O painel de controle na parte inferior mostra um gel antes do manchamento, tingido com brometo de etídio e fotografado sob luz UV, demonstrando níveis similares de rRNA 18S e 28S como um controle de carga. A FIG. 15 é uma fotografia de gel de agarose para mostrar a diferença entre o 3’-RACE convencional (linha 1) e o 3’-RACE com base no ACP (linha 2) com respeito ao 3’-RACE com beta-actina. A FIG. 16 é uma fotografia de gel de agarose para mostrar a diferença entre métodos CapFinder e métodos com base em ACP para JunB (linhas 1 e 2) e beta-actina 5’ - RACE (linhas 3 e 4) de camundongo usando o iniciador convencional (linhas 1 e 3) e ACP (linhas 2 e 4), respectivamente. A FIG. 17 é uma fotografia de gel de agarose para mostrar a diferença entre métodos CapFinder e métodos com base em ACP para PLP-C alfa 5’ - RACE de camundongo usando o iniciador convencional (linha 1) e ACP (linhas 2, 3 e 4), respectivamente. A FIG. 18 mostra os resultados da análise de Northern virtual pelos métodos CapFinder ou métodos com base em ACP para a amplificação de cDNA GAPDH de comprimento completo de camundongo. A FIG. 19 mostra fotografias de gel de agarose para mostrar os resultados de impressões digitais genômicas de 7 manchas de camundongo usando dois conjuntos diferentes de ACPs arbitrárias. A FIG. 20 mostra fotografias de gel de agarose para mostrar os produtos amplificados de PCR multiplex pelos métodos convencionais (A) ou métodos com base em ACP (B) para a amplificação de três ácidos nucléicos alvos. A FIG. 21 mostra fotografias de gel de agarose para mostrar os produtos amplificados de PCR multiplex pelos métodos convencionais (A) ou métodos com base em ACP (B e C) para a amplificação de quatro ácidos nucléicos alvos. O multiplex com base em ACP foi conduzido pela amplificação pela PCR de estágio duplo de interrupção única (B) ou isenta de interrupção (C). A FIG. 22 mostra uma fotografia de gel de agarose para mostrar os resultados da amplificação específica de alelo para um SNP no exon 4 do gene TP53 humano usando ACP. A FIG. 23 mostra seis fotografias de gel de agarose que mostram os resultados das amplificações específicas de alelo usando ACPs para seis SNPs adicionais cada uma presente em gene diferente tal como o receptor beta adrenérgico Beta-2 (ADRB2) (A), Quimiocina (motivo c-c) receptor 5 (CCR5) (B), Interleucina 13 receptor (C), molécula de adesão de leucócito 1 (LAM-1) (D), receptor 3 de taquicinina (TACR3) (E) e Interleucina 1, beta (IL1B) (F).

DESCRIÇÃO DETALHADA DESTA INVENÇÃO A presente invenção está no geral direcionada a (a) um iniciador de controle de anelamento para a especificidade de amplificação de ácido nucléico e (b) suas aplicações. Os iniciadores de controle de anelamento desta invenção (daqui em diante aludidos como “ACP”) permitem que o anelamento do iniciador seja controlado em associação com a temperatura de anelamento, tal que a especificidade de amplificação de ácido nucléico (em particular, PCR) possa ser significantemente melhorada. O princípio do ACP está fundamentado na composição de um iniciador de oligonucleotídeo tendo porções distintas das extremidades 3’ e 5’ separadas por pelo menos uma base universal ou base não discriminatória. O presente inventor descobriu que o grupo de base universal ou base não discriminatória posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ desempenha como um regulador no controle do anelamento do iniciador a um ácido nucléico padrão em associação com a temperatura de anelamento durante a amplificação de ácido nucléico. A presença de grupo residual da base universal ou base não discriminatória posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ interrompe o anelamento da porção de extremidade 5’ assim como limita o anelamento do iniciador à porção da extremidade 3’ em certa temperatura de anelamento, que resulta na melhora dramática da especificidade de anelamento. Um grupo de base universal posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP é planejado para definir cada porção. Por estas razões, o ACP é fundamentalmente diferente dos iniciadores convencionais em termos da função de melhorar a especificidade de anelamento do iniciador sob uma condição de severidade particular durante a amplificação de ácido nucléico. O ACP desta invenção é significantemente eficaz e amplamente acessível para aplicações com base na amplificação de ácido nucléico. Também, vários problemas relacionados com a especificidade de anelamento do iniciador nas técnicas de PCR convencionais podem ser fundamentalmente resolvidos pelo ACP. Os benefícios principais a serem obtidos do uso do ACP durante a amplificação de ácido nucléico (particularmente PCR) são como segue: (a) visto que a presença de um grupo de resíduo de base universal posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ restringe o anelamento da porção iniciadora à porção da extremidade 3' sob condições tais que a porção de extremidade 3' anela com o padrão, a seqüência de anelamento de um iniciador pode ser precisamente controlada, o que toma possível planejar um iniciador com um número desejado de seqüência de r anelamento. E particularmente útil quando uma porção de anelamento de um iniciador deve ser limitada (por exemplo, na genotipagem de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), triagem de microssérie de DNA e detecção de genes diferencialmente expressos); (b) visto que a presença de um grupo de resíduo de base universal posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ interrompe o anelamento da porção de extremidade 5’ com o padrão sob condições tais que a porção de extremidade 3’ anele com o padrão, eventualmente a porção de extremidade 5’ não envolvida no anelamento fornece a porção de extremidade 3’ com a especificidade de anelamento do iniciador; (c) a especificidade de anelamento do iniciador é altamente sensível o bastante para detectar mesmo uma má combinação de base única. Assim, é particularmente útil para a identificação de uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo, incluir, por exemplo, polimorfismos de nucleotídeo único e mutações pontuais; (d) o ACP é capaz de fornecer um iniciador com uma tolerância alta em “parâmetros de procura de iniciador” para planejar o iniciador tal como o comprimento do iniciador, temperatura de anelamento, teor de GC e comprimento de produto de PCR; (e) o sistema ACP fornece amplificações pela PCR de estágio duplo que permitem que os produtos sejam excluídos da amplificação não específica; (f) a eficiência de amplificação pela PCR é aumentada, o que toma mais fácil detectar mRNAs raros; e (g) a reprodutibilidade de produtos de PCR é aumentada, o que economiza uma enorme quantidade de tempo e custo.

Princípio do ACP

Em um aspecto desta invenção, é fornecido um iniciador de controle de anelamento para melhorar a especificidade de anelamento na amplificação de ácido nucléico, que compreende: (a) uma porção de extremidade 3' tendo uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a um sítio em um ácido nucléico padrão para hibridizar com ela; (b) uma porção de extremidade 5’ tendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária; e (c) uma porção reguladora posicionada entre a dita porção de extremidade 3’ e a dita porção de extremidade 5’ que compreende pelo menos uma base universal ou base não discriminatória análoga, por meio da qual a dita porção reguladora é capaz de regular uma porção de anelamento do dito iniciador em associação com a temperatura de anelamento. O princípio do ACP está fundamentado na composição de um iniciador de oligonucleotídeo tendo porções de extremidade 3’ e 5’ distintas separadas por uma porção reguladora que compreende pelo menos uma base universal ou base não discriminatória e no efeito da porção reguladora sobre as porções de extremidade 3’ e 5’ no iniciador de oligonucleotídeo. A presença da porção reguladora que compreende pelo menos uma base universal ou base não discriminatória entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP atua como um fator principal que é responsável pela melhora de > especificidade de anelamento do iniciador. O termo “padrão” refere-se ao ácido nucléico. O termo “ácido nucléico” é um polímero de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos na forma de filamento único ou duplo, incluindo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais a menos que de outro modo indicado. Portanto, o ACP ) desta invenção pode ser utilizado na amplificação de ácido nucléico usando gDNA, cDNA ou mRNA de filamento único ou duplo como padrão. O termo “porção” aqui usada em conjunção com o iniciador desta invenção refere-se a uma seqüência de nucleotídeo separada pela porção reguladora. O termo “porção de extremidade 3”’ ou “porção de extremidade 5”’ refere-se a uma > seqüência de nucleotídeo na extremidade 3’ ou extremidade 5’ do iniciador desta invenção, respectivamente, que é separada pela porção reguladora. O termo “iniciador” como aqui usado refere-se a um oligonucleotídeo, seja de ocorrência natural ou sinteticamente produzido, que é capaz de atuar como um ponto de início de síntese quando colocado sob ) condições em que a síntese de extensão do produto iniciador que é complementar a um filamento de ácido nucléico (padrão) é induzida, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente para a polimerização tal como DNA polimerase e em uma temperatura e pH adequados. O iniciador é preferivelmente de filamento único para a eficiência máxima na amplificação. 5 Preferivelmente, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo. O iniciador desta invenção pode ser compreendido de dNMP que ocorre naturalmente (isto é, dAMP, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeos modificados ou nucleotídeos não naturais. O iniciador também pode incluir ribonucleotídeos. O iniciador deve ser suficientemente longo para preparar a síntese de produtos Preferivelmente, taxas de vazamento menores do que 10 cm3/min, mais preferivelmente menores do que 5 cmVmin, podem ser obtidas. As válvulas de exalação que foram produzidas de acordo com a presente invenção podem demonstrar uma taxa de vazamento na faixa de cerca de 1 a 10 cmVmin. A queda de pressão de abertura da válvula mede a resistência ao levantamento inicial da aba da superfície de selagem da válvula. Este parâmetro pode ser determinado como descrita abaixo no Teste de Queda de Pressão. Tipicamente, a queda de pressão de abertura de válvula a 10 1/min é menor do que 30 Pa, preferivelmente menor do que 25 Pa e, mais preferivelmente, menor do que 20 Pa, quando testando uma válvula de acordo com o Teste de Queda de Pressão descrita abaixo. Tipicamente, a queda de pressão de abertura de válvula é de cerca de 5 a 30 Pa a 10 1/min, quando testando uma válvula de acordo com o Teste de Queda de Pressão descrita abaixo.

Exemplos de materiais de que a primeira camada da aba flexível pode ser produzido incluem aqueles que promoveríam uma boa selagem entre a aba flexível e a sede de válvula. Estes materiais podem geralmente incluir elastômeros, tanto termocurados como termoplásticos, e termoplásticos/plastômeros.

Os elastômeros, que podem ser elastômeros termoplásticos ou borrachas reticuladas, podem incluir materiais borrachosos, tais como poliisopreno, borracha de poli (estireno-butadieno), polibutadieno, borracha butílica, borracha de etileno-propileno-dieno, borracha de etileno-propileno, borracha de nitrila, borracha de policloropreno, borracha de polietileno clorado, borracha de polietileno clorossulfonada, elastômero de poliacrilato, borracha de etileno-acrílico, elastômeros contendo flúor, borracha de silicone, poliuretano, borracha de epicloroidrina, borrada de óxido de propileno, borracha de polissulfeto, borracha de polifosfazeno e borracha de látex, elastômero de copolímero em bloco de estireno-butadieno-estireno, elastômero de copolímero preferivelmente pelo menos 8 nucleotídeos de desoxitimidina, mais preferivelmente pelo menos 10 nucleotídeos de desoxitimidina e o mais preferivelmente, pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de desoxitimidina. Para o processo que envolve a transcrição reversa como acima, em uma forma de realização, a porção de extremidade 3’ da ACP tem pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de desoxitimidina tendo 3’-V na sua extremidade 3’; em que V é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxicitidina e desoxiguanosina, em uma outra forma de realização, pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de desoxitimidina tendo 3’-NV na sua extremidade 3’; em que V é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxicitidina e desoxiguanosina e N é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina e desoxiguanosina.

Além disso, onde o ACP é utilizado na amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo, a sua porção de extremidade 3’ compreende uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma seqüência alvo; na PCR de Demonstração Diferencial, uma seqüência arbitrária substancialmente complementar a um sítio em um cDNA de um mRNA; no RACE, uma seqüência específica de gene substancialmente complementar a um sítio em um cDNA de um mRNA; na amplificação de cDNAs enriquecidos em 5’, uma seqüência aleatória de pelo menos seis nucleotídeos substancialmente complementares aos sítios em mRNAs; na identificação de segmento de homologia conservada, uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma seqüência de consenso encontrada em uma família de gene ou seqüência degenerada selecionada de uma pluralidade de combinações de nucleotídeos que codificam uma seqüência de aminoácido predeterminada; na identificação de uma variação de nucleotídeo (por exemplo, sítio alélico) em um ácido nucléico alvo, uma seqüência de nucleotídeo que compreende um nucleotídeo complementar ao nucleotídeo correspondente de uma variação de nucleotídeo; e na mutagênese, uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos um nucleotídeo de ligação inespecífica a um ácido nucléico alvo. O termo seqüência de nucleotídeo “arbitrária” é aqui usado para significar a seqüência de nucleotídeo que é escolhida sem o conhecimento da seqüência dos ácidos nucléicos alvos a serem amplificados. O termo arbitrária não deve ser confundido com “aleatória” em referência ao iniciador que significa um iniciador composto de uma população aleatória de iniciadores cada um de seqüência diferente e aleatória. O termo seqüência “degenerada” em conjunção com ACP para a identificação de segmento de homologia conservada refere-se à seqüência de nucleotídeo que é deduzida da seqüência de aminoácido, de modo que a seqüência degenerada possa formar um agrupamento das seqüências de nucleotídeo de uma seqüência de aminoácido devido à degenerescência do códon genético.

De acordo com uma forma de realização preferida do ACP, a seqüência de nucleotídeo arbitrária pré selecionada da porção de extremidade 5’ não é substancialmente complementar a nenhum sítio no ácido nucléico padrão.

De acordo com uma forma de realização preferida, os iniciadores de controle de anelamento desta invenção podem ser representados por uma fórmula geral (1) de 5’ - Xp-Yq-Zr - 3’, em que Xp representa a porção de extremidade 5’ tendo a seqüência de nucleotídeo arbitrária pré selecionada substancialmente não complementar a nenhum sítio no ácido nucléico padrão; Yq representa a porção reguladora que compreende pelo menos uma base universal ou base não discriminatória análoga; Z, representa a porção de extremidade 3’ tendo uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar a um sítio no ácido nucléico padrão; em que p, q e r representam o número de nucleotídeos; e em que X, Y e Z são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos. A porção reguladora que compreende pelo menos uma base universal ou base não discriminatória análoga é responsável pela função principal do ACP em associação com a alteração da temperatura de anelamento durante a amplificação de ácido nucléico. O termo “base universal ou base não discriminatória análoga” aqui usado refere-se a um capaz de formar pares de base com cada uma das bases de DNA/RNA naturais com pouca discriminação entre elas.

Foi amplamente conhecido que nucleotídeos em algumas posições ambíguas de iniciadores degenerados foram substituídos pela base universal ou um análogo não discriminatório tal como desoxiinosina (Ohtsuka et al, 1985; Sakanari et al1989), l-(2’-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol (Nichols et al., 1994) e 5-nitroindol (Loakes e Brown, 1994) para solucionar os problemas de planejamento associados com os iniciadores degenerados por que tais bases universais são capazes de emparelhar base de modo não específico com todas as quatro bases convencionais. Entretanto, não há qualquer relato de que esta base universal ou um análogo não discriminatório tal como desoxiinosina, l-(2’-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol e 5-nitroindol sejam usadas para aumentar a especificidade de anelamento do iniciador durante a PCR. A presença da base universal tal como desoxiinosina, l-(2’-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol e 5-nitroindol em um iniciador gera temperaturas de anelamento baixas devido às suas interações de ligação de hidrogênio mais fracas no emparelhamento de base. Como uma extensão desta teoria, o presente inventor induziu que a presença das bases universais contíguas entre a extremidade 3’ e a extremidade 5’ de um iniciador podería gerar uma região que tivesse temperatura de fusão mais baixa, forma um limite para cada uma das porções de extremidade 3’ e 5’ do iniciador e afeta o anelamento de cada porção, respectivamente. Esta teoria fornece a base dos iniciadores de controle de anelamento desta invenção.

Em uma forma de realização preferida, o ACP contém pelo menos 2 resíduos de base universal ou base não discriminatória análoga entre as seqüências das porções de extremidade 3’ e 5’, mais preferivelmente, pelo menos 3 bases universais ou bases não discriminatórias análogas. Vantajosamente, os resíduos de base universal entre as seqüências das porções de extremidade 3’ e 5’ podem ser de até 15 resíduos no comprimento. De acordo com uma forma de realização, o ACP contém de 2 a 15 resíduos de base universal ou base não discriminatória análoga. O mais preferivelmente, as bases universais entre as seqüências das porções de extremidade 3’ e 5’ são de cerca de 5 resíduos no comprimento.

Com referência ao número ótimo de base universal, isto é, 5 resíduos, o número mínimo de resíduos de base universal entre as porções de extremidade 3’ e 5’ de ACP é preferido de modo a interromper o anelamento da porção de extremidade 5’ com o padrão durante a amplificação de ácido nucléico em certa temperatura de anelamento. É muito provável que o comprimento da base universal na seqüência (8 a 10 bases) não faça uma diferença significante na sua própria função no ACP. O uso de resíduos de base universal entre as seqüências das porções de extremidade 3’ e 5’ é considerado como uma característica chave na presente invenção por que ele fornece cada porção (extremidades 3’ e 5’) com uma especificidade de anelamento distinta em associação com uma temperatura de anelamento durante a amplificação de ácido nucléico, por exemplo PCR.

De acordo com uma forma de realização preferida, a base universal ou base não discriminatória análoga na porção reguladora inclui desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2’-desoxiinosina, 2-aza-2’-desoxiinosina, 2’-OMe inosina, 2’-F inosina, desóxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2’-OMe 3-nitropirrol, 2’-F 3-nitropirrol, l-(2’-desóxi-beta-D-ribofiiranosil)-3-nitropirrol, desóxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2’-OMe 5-nitroindol, 2’-F 5-nitroindol, desóxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitro-benzimidazol, desóxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, desóxi nebularina, 2’-F nebularina, 2’-F 4-nitrobenzimidazol, ΡΝΑ-5-nitroindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitrobenzimidazol, ΡΝΑ-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2’-0-metoxietil inosina, 2Ό-metoxietil nebularina, 2’-0-metoxietil 5-nitroindol, 2’-0-metoxietil 4-nitrobenzimidazol, 2’-0-metoxietil 3-nitropirrol e combinações destes, mas não a eles limitadas. Mais preferivelmente, a base universal ou base não discriminatória análoga é desoxiinosina, l-(2’-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol ou 5-nitroindol, o mais preferivelmente, desoxiinosina. O comprimento preferido de um iniciador de oligonucleotídeo, como aqui usado, é determinado a partir da especificidade desejada de anelamento e do número de oligonucleotídeos tendo a especificidade desejada que são requeridos para hibridizar com o padrão. Por exemplo, um iniciador de oligonucleotídeo de 20 nucleotídeos é mais específico do que um iniciador de oligonucleotídeo de 10 nucleotídeos por que a adição de cada nucleotídeo a um oligonucleotídeo aumenta a temperatura de anelamento do iniciador com o padrão.

Os comprimentos das seqüências das porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP podem variar e dependem em parte do objetivo de cada aplicação que usa o ACP. Em uma forma de realização preferida, a porção de extremidade 3’ do ACP é de pelo menos 6 nucleotídeos no comprimento, que é considerado uma exigência mínima de comprimento para o anelamento do iniciador. Mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ é de 10 a 25 nucleotídeos e pode ser de até 60 nucleotídeos no comprimento. Em uma outra forma de realização, a porção de extremidade 3’ do ACP pode incluir ribonucleotídeos assim como desoxirribonucleotídeos.

Em uma outra forma de realização preferida, a porção de extremidade 5’ do ACP contém pelo menos 15 nucleotídeos no comprimento, que é considerado uma exigência mínima de comprimento para anelamento sob condições de alta severidade. Preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 5’ pode ser de até 60 nucleotídeos no comprimento. Mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 5’ é de 6 a 50 nucleotídeos, o mais preferivelmente, de 20 a 25 nucleotídeos no comprimento. O ACP inteiro é preferivelmente de 35 a 50 nucleotídeos no comprimento e pode ser de até 100 nucleotídeos no comprimento. A porção de extremidade 5’ do ACP tem uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária substancialmente não complementar a nenhum sítio no ácido nucléico padrão e esta seqüência de nucleotídeo pode servir como um sítio de iniciação para a amplificação subsequente. O termo seqüência de nucleotídeo “arbitrária pré selecionada” aqui usada refere-se como qualquer seqüência de desoxirribonucleotídeo, ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo misto definida ou pré selecionada contendo uma seqüência particular de nucleotídeos naturais ou modificados. Em alguma forma de realização, a seqüência de nucleotídeo arbitrária pré selecionada da porção de extremidade 5’ pode ser composta de uma seqüência iniciadora universal tal como a seqüência promotora T3, seqüência promotora T7, seqüência promotora SP6 e seqüência universal avançada ou reversa Ml3. Usando uma seqüência arbitrária mais longa (cerca de 25 a 60 bases) na porção de extremidade 5’ do ACP reduz a eficiência do ACP, seqüências mais curtas (cerca de 15 a 17 bases) reduzem a eficiência de anelamento em condições de alta severidade do ACP. Também é uma característica chave da presente invenção usar uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária na porção de extremidade 5’ do ACP como um sítio de iniciação para a amplificação subsequente.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, algumas modificações na porção de extremidade 5’ do ACP podem ser feitas a menos que as modificações anulem as vantagens do ACP, isto é, a melhora na especificidade de anelamento. Por exemplo, a porção de extremidade 5’ pode compreender uma seqüência ou sequências reconhecidas por uma endonuclease ou endonucleases de restrição, o que toma praticável clonar o produto amplificado no vetor adequado. Além disso, a porção de extremidade 5’ pode compreender pelo menos um nucleotídeo com um rótulo para a detecção ou isolação de produto amplificado. Os rótulos adequados incluem, mas não são limitados aos, fluoroforos, cromoforos, quimioluminescedores, partículas magnéticas, radioisótopos, rótulos de massa, partículas de elétron denso, enzimas, cofatores, substratos para enzimas e haptenos tendo parceiros de ligação específicos, por exemplo, um anticorpo, estreptavidina, biotina, digoxigenina e grupo quelante. A porção de extremidade 5’ também compreende promotor de bacteriófago da região da RNA polimerase.

De acordo com a forma de realização preferida desta invenção, o ACP é aplicado à PCR. Mais preferivelmente, a PCR é realizada sob uma primeira e uma segunda temperatura de anelamento, isto é, sob condições severas diferentes. A primeira temperatura de anelamento pode ser igual ou mais baixa do que a segunda temperatura de anelamento e preferivelmente, a segunda temperatura de anelamento é mais alta do que a primeira temperatura de anelamento. No processo da PCR realizado sob duas temperaturas de anelamento diferentes, isto é, a PCR de estágio duplo, a extremidade 3’ do ACP está envolvida no anelamento na primeira temperatura de anelamento e a extremidade 5’ do ACP incorporada no produto amplificado do primeiro estágio de amplificação serve como um sítio de iniciação na segunda temperatura de anelamento. Neste caso, as vantagens do ACP serão demonstradas de acordo com as seguintes hipóteses: (1) visto que uma porção reguladora do ACP é composta de pelo menos uma base universal ou análogo não discriminatório que tem Tm mais baixa do que a outra porção no ACP devido às suas interações de ligação de hidrogênio mais fracas no emparelhamento de base, a porção reguladora do ACP não é favorável no anelamento com o ácido nucléico padrão sob as condições em que a porção de extremidade 3’ do ACP anela a um sítio do padrão em uma primeira temperatura de anelamento. Conseqüentemente, a presença de uma porção reguladora que compreende pelo menos uma base universal ou análogo não discriminatório entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP restringe a porção de anelamento do iniciador à porção de extremidade 3’ na primeira temperatura de anelamento; (2) a porção de extremidade 5’ que não está envolvida no anelamento sob a primeira temperatura de anelamento mantém a perturbação do anelamento da porção de extremidade 3’ com o padrão; (3) assim, a força em que o anelamento da seqüência da porção de extremidade 3’ específica ocorre é relativamente mais forte do que a força em que o anelamento não específico ocorre, sob a primeira temperatura de anelamento, o que resulta na melhora de especificidade de anelamento do iniciador na porção de extremidade 3’; (4) onde a porção de extremidade 5’ compreende uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária, a porção serve como um sítio de iniciação em uma segunda temperatura de anelamento, que são condições de alta severidade e também deve ser mais alta do que a primeira temperatura de anelamento, para a amplificação subsequente do produto de reação gerado a partir do anelamento e extensão da seqüência da porção de extremidade 3’; e (5) conseqüentemente, apenas o produto de reação gerado a partir do anelamento e extensão da seqüência da porção de extremidade 3’ pode ser amplificado próximo ao ótimo teórico de um aumento de duas vezes do produto para cada ciclo de PCR sob a segunda temperatura de anelamento.

Portanto, a porção de extremidade 3’ do ACP atua apenas como sítio de anelamento com o padrão na primeira temperatura de anelamento e a porção de extremidade 5’ do ACP é usada como um sítio de iniciação na segunda temperatura de anelamento para a amplificação subsequente do produto gerado contactando-se e estendendo-se a porção de extremidade 3’ do ACP com o padrão.

Pode ser avaliado que o ACP da presente invenção é muito útil em uma variedade de métodos de amplificação de ácido nucléico com base no iniciador incluindo os métodos de Miller, Η. I. (WO 89/06700) e Davey, C. et al. (EP 329.822), Reação em cadeia de Ligase (LCR, Wu, D. Y. et al., Genomics 4: 560 (1989)), Reação em cadeia de Ligase da Polimerease (Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5 a 16 (1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), Reação em cadeia de Reparo (EP 439.182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86: 1173 (1989)) e NASBA (Patente U.S. N° 5.130.238), mas não a estes limitado.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento de acordo com a presente invenção. De acordo com uma forma de realização desta invenção, este kit ainda compreende um iniciador ou um par de iniciadores tendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde à porção de extremidade 5’ do ACP; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar as reações de PCR tais como tampões, DNA polimerase, cofatores da DNA polimerase e desoxirribonucleotídeo-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade de DNA polimerase. Os kits também podem incluir os reagentes necessários para realizar as reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usadas em uma dada reação podem ser facilmente determinadas pelo técnico habilitado tendo o benefício da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos. O ACP da invenção objeto pode ser aplicado a uma variedade de tecnologias com base na amplificação de ácido nucléico. Os exemplos representativos para comprovar o efeito do ACP são: I. Aplicação para amplificar uma seqüência de ácido nucléico; II. Aplicação para amplificar uma seqüência de ácido nucléico alvo; III. Aplicação para a amplificação de DNA multiplex; IV. Aplicação para a identificação de genes diferencialmente expressos; V. Aplicação para a amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE); VI. Aplicação para amplificar cDNA de comprimento completo; VII. Aplicação para amplificar cDNA enriquecido em 5’; VIII. Aplicação para a impressão digital de DNA ou RNA; IX. Aplicação para a identificação de segmentos de homologia conservada em famílias de multigene; X. Aplicação para a identificação de uma variação de seqüência de nucleotídeo; XI. Aplicação para mutagênese; e XII. Outras aplicações. I. Aplicação para Amplificar uma Seqüência de Ácido Nucléico (alvo) Ainda em uma outra desta invenção, é fornecido um método para amplificar uma seqüência de ácido nucléico de um DNA ou uma mistura de ácido nucléicos, que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico para hibridizar com ela.

Em uma forma de realização específica deste método, é fornecido um método que usa amplificações de estágio duplo para amplificar uma seqüência de ácido nucléico de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da seqüência de ácido nucléico em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o par de iniciadores de qualquer um dos ACPs descritos acima cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela à região da seqüência de ácido nucléico, por meio das quais o produto de amplificação da seqüência de ácido nucléico é gerado; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do produto de amplificação gerado da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (a) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o produto de amplificação é re-amplificado.

Onde o método é aplicado à amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo, o par de iniciadores usado tem na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela. Portanto, em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos, em que o método compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado do ACP descrito acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela.

Em uma forma de realização específica deste método, é fornecido um método que usa amplificações de estágio duplo para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da seqüência de ácido nucléico alvo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o par de iniciadores de qualquer um dos ACPs descritos acima cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela à sua seqüência de nucleotídeo alvo, por meio das quais o produto de amplificação da seqüência de nucleotídeo alvo é gerado; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do produto de amplificação gerado da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (a) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o produto de amplificação é re-amplificado.

Onde o padrão para a amplificação é o mRNA, a produção de cDNA é requerida antes da amplificação. Portanto, ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um mRNA, em que o método compreende transcrever de modo reverso o mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado do ACP descrito acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido um método que usa amplificações de estágio duplo para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um mRNA que compreende: (a) contactar o mRNA com um iniciador de oligonucleotídeo dT que é hibridizado à terminação poliA do mRNA sob condições suficientes para que o direcionamento padrão da síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática ocorra; (b) transcrever de modo reverso o mRNA ao qual o iniciador de oligonucleotídeo dT hibridiza para produzir um primeiro filamento de DNA que é complementar ao mRNA ao qual o iniciador de oligonucleotídeo dT hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio da seqüência de ácido nucléico alvo do primeiro filamento de DNA obtido da etapa (b) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o par de iniciadores do ACP descrito acima tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela à sua seqüência de nucleotídeo alvo, por meio das quais o produto de amplificação da seqüência de nucleotídeo alvo é gerado; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio do produto de amplificação gerado da etapa (c) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (c) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos iniciadores usados na etapa (c), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o produto de amplificação é re-amplificado.

Visto que os métodos de amplificação desta invenção utiliza o ACP desta invenção, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida.

Esta aplicação que usa o ACP da invenção objeto pode fornecer um método melhorado para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um ácido nucléico ou uma mistura de ácidos nucléicos (DNA ou mRNA) realizando-se amplificações de ácido nucléico, preferivelmente, PCR. Visto que o efeito do ACP fornece iniciadores convencionais com especificidade de anelamento do iniciador independente de “parâmetros de procura de iniciador” para planejar o iniciador tal como o comprimento do iniciador, temperatura de anelamento, teor de GC e comprimento do produto, é particularmente recomendado usar o ACP quando os iniciadores convencionais usados para amplificar um fragmento de ácido nucléico alvo são muito sensíveis a tais parâmetros para gerar produtos de amplificação de ácido nucléico específicos.

Uma representação esquemática para amplificar seletivamente um ácido nucléico alvo de DNA de filamento duplo usando o novo sistema ACP como descrito acima é ilustrada na FIG. IA. A FIG. 1B ilustra uma representação esquemática para amplificar seletivamente um ácido nucléico alvo de mRNA usando o novo sistema de ACP. Referindo-se às FIGs. IA e 1B, os presentes métodos serão descritos em mais detalhes.

Os presentes métodos para amplificar uma seqüência de ácido nucléico podem ser realizados de acordo com várias amplificações de ácido nucléico com base em iniciador conhecidas na técnica. Preferivelmente, os métodos são realizados de acordo com as amplificações de estágio duplo desenvolvidas pelo presente inventor, mais preferivelmente, a amplificação é realizada pela reação em cadeia da polimerase conhecida na técnica e o mais preferivelmente, o método de PCR de início quente.

Os métodos da presente invenção, para amplificar uma seqüência de ácido nucléico podem ser usados para amplificar qualquer molécula de ácido nucléico desejada. Tais moléculas pode ser DNA ou RNA. A molécula pode estar em um forma de filamento duplo ou de filamento único, preferivelmente, de filamento duplo. Onde o ácido nucléico como material de partida é de filamento duplo, é preferido para tomar a forma de filamento duplo em uma de filamento único ou parcialmente de filamento único. Os métodos conhecidos para separar filamentos incluem, mas não são limitados ao tratamento térmico, com álcali, formamida, uréia e glicoxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicase) e proteínas de ligação.

Por exemplo, a separação de filamento pode ser obtida pelo aquecimento a uma temperatura variando de 80° C a 105° C. Os métodos gerais para realizar este tratamento são fornecidos por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001).

Onde um mRNA é utilizado como material de partida para a amplificação, uma etapa de transcrição reversa é necessária antes da amplificação, os detalhes da qual são encontrados em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16: 10366 (1988)). Para a transcrição reversa, um iniciador de oligonucleotídeo dT hibridizável à terminação poliA do mRNA é usado. O iniciador de oligonucleotídeo dT é compreendido de dTMPs, um ou mais dos quais podem ser substituídos com outros dNMPs contanto que o iniciador de dT possa servir como iniciador. A transcrição reversa pode ser feita com uma transcriptase reversa que tenha atividade de RNase H. Se um usa uma enzima tendo atividade de RNase H, pode ser possível omitir uma etapa de digestão com RNase H separada, escolhendo-se cuidadosamente as condições de reação.

Os presentes métodos não requerem que as moléculas a serem amplificadas tenham qualquer seqüência ou comprimento particulares. Em particular, as moléculas que pode ser amplificadas incluem qualquer ácido nucléico que ocorra naturalmente procariótico, eucariótico (por exemplo, protozoários e parasitas, fungos, leveduras, vegetais superiores, animais inferiores ou superiores, incluindo mamíferos e seres humanos) ou viral (por exemplo, vírus do herpes, HIV, vírus da influenza, vírus de Epstein-Barr, vírus da hepatite, vírus da pólio vírus, etc.) ou ácido nucléico viróide. A molécula de ácido nucléico também pode ser qualquer molécula de ácido nucléico que foi ou pode ser quimicamente sintetizada. Assim, a seqüência de ácido nucléico pode ou não ser encontrada na natureza. O ACP usado para a presente invenção é hibridizado ou anelado a uma região no padrão de modo que a estrutura de filamento duplo seja formada. As condições de hibridização de ácido nucléico adequadas para formar tais estruturas de filamento duplo são descritas por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Method, IRL Press, Washington, D.C. (1985). A seqüência da porção de extremidade 3’ do ACP não precisa exibir complementaridade exata, mas precisa ser apenas substancialmente complementar na seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável. Assim, partidas de complementaridade completa são permissíveis, contanto que tais partidas não sejam suficientes para impedir completamente a hibridização para formar uma estrutura de filamento duplo. A hibridização do ACP a uma região no ácido nucléico padrão é um pré requisito para a sua polimerização dependente de padrão com polimerases. Fatores (ver Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); e Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Method, IRL Press, Washington, D.C. (1985)) que afetam o emparelhamento de base do ACP aos seus ácidos nucléicos complementares subsequentemente afetam a eficiência de iniciação. A composição de nucleotídeo do ACP pode afetar a temperatura na qual o anelamento é ótimo e portanto pode afetar a sua eficiência de iniciação.

Uma variedade de DNA polimerases podem ser usadas na etapa de amplificação dos presentes métodos, incluindo o fragmento “Klenow” da DNA polimerase I da E. coli, uma DNA polimerase termoestável e bacteriófago T7 DNA polimerase. Preferivelmente, a polimerase é uma DNA polimerase termoestável tal como pode ser obtido a partir de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis e Pyrococcus furiosus (Pfu). Muitas destas polimerases podem ser isoladas da própria bactéria ou comercialmente obtidas. A polimerase a ser usada com a invenção objeto também pode ser obtida a partir de células que expressam altos níveis dos genes clonados que codificam a polimerase. Quando uma reação de polimerização está sendo conduzida, é preferível fornecer os componentes requeridos para tal reação em excesso no vaso de reação. O excesso em referência aos componentes da reação de amplificação refere-se a uma quantidade de cada componente tal que a capacidade para se obter a amplificação desejada não seja substancialmente limitada pela concentração daquele componente. É desejável fornecer à mistura de reação uma quantidade de cofatores requeridos tais como Mg2+ e dATP, dCTP, dGTP e dTTP em quantidades suficientes para sustentar o grau de amplificação desejado.

Todas as enzimas usadas nesta reação de amplificação podem ser ativas sob as mesmas condições de reação. Na verdade, tampões existem em que todas as enzimas estão próximas às suas condições de reação ótimas. Portanto, o processo de amplificação da presente invenção pode ser feito em um único volume de reação sem qualquer mudança de condições tais como a adição de reagentes.

Deve ser entendido que as porções da extremidade 5’ de um conjunto de ACPs usado na etapa da amplificação de primeiro estágio pode compreender seqüências idênticas ou diferentes; se elas são idêntica, um iniciador que corresponde à sequência da porção de extremidade 5’ será usado na etapa da amplificação de segundo estágio, ao passo que se elas são diferentes, dois iniciadores cada um correspondendo à seqüência de cada porção de extremidade 5’ do ACPs serão usados na etapa da amplificação de segundo estágio. A presente invenção inclui um processo alternativo para amplificar seletivamente um fragmento de ácido nucléico alvo a partir de um ácido nucléico ou uma mistura que usa ACP, em que um conjunto de iniciadores que compreende um ACP e um iniciador convencional pode ser usado na primeira etapa de amplificação, ao invés de um conjunto de ACP. O termo “iniciador convencional” aqui usado refere-se a qualquer iniciador tendo uma estrutura diferente da ACP, especialmente, em termos da presença da porção reguladora contendo a base universal. Neste caso, o iniciador convencional é adicionado apenas na primeira etapa de amplificação com o ACP e apenas um iniciador pré selecionado arbitrário que corresponde à seqüência da porção de extremidade 5’ do ACP é adicionado na segunda etapa de amplificação. Em uma forma de realização preferida, o processo alternativo pode ser usado quando cada porção 3’ de um par do ACP a ser usado na primeira etapa de amplificação tem temperatura de fusão diferente (Tm). “Tm” refere-se à temperatura na qual metade dos iniciadores são anelados à região alvo.

Duas etapas de amplificação dos presentes métodos (no caso de amplificação a partir do mRNA, incluindo a transcrição reversa) são separadas apenas no tempo. A amplificação do primeiro estágio deve ser seguida pela amplificação do segundo estágio. Deve ser entendido que a mistura de reação de amplificação do primeiro estágio pode incluir os iniciadores que correspondem à porção de extremidade 5’ que será usada para anelar às seqüências das porções da extremidade 5’ dos ACPs na amplificação do segundo estágio, o que significa que os iniciadores que correspondem à porção de extremidade 5’ podem ser adicionados à mistura de reação no momento ou depois da etapa de amplificação do primeiro estágio.

Como um processo alternativo, na etapa de amplificação do segundo estágio as seqüências completas dos ACPs usados na etapa de amplificação do primeiro estágio, ao invés dos iniciadores que correspondem às porções da extremidade 5’ dos ACPs, podem ser usadas como iniciadores nas condições de alta severidade para re-amplificar o produto gerado da etapa de amplificação do primeiro estágio, em que as extremidades 3’ e 5’ do produto da primeira etapa de amplificação que é gerado do anelamento e extensão da seqüência da porção de extremidade 3’ do conjunto de ACP com o ácido nucléico padrão nas condições de severidade baixa compreende a seqüência ou seqüência complementar do ACP e também serve como sítios de emparelhamento perfeitos para o conjunto de ACP. Neste ponto de vista, este processo alternativo é preferido por que não é necessário adicionar os iniciadores que correspondem às porções da extremidade 5’ dos ACPs à mistura de reação no momento ou depois da etapa de amplificação do primeiro estágio. A FIG. IA também ilustra uma representação esquemática para amplificar seletivamente um ácido nucléico alvo pelo processo alternativo estabelecido acima. O anelamento ou hibridização nos presentes métodos são realizados sob condições severas que permitem a ligação específica entre uma seqüência de nucleotídeo e o ACP. Tais condições severas para o anelamento será dependente da seqüência e variado dependendo de parâmetros ambientais. Nos presentes métodos, a amplificação do segundo estágio é no geral realizada sob condições severas mais altas do que a amplificação do primeiro estágio.

Em uma forma de realização preferida, a primeira temperatura de anelamento varia de cerca de 30° C a 68° C para a etapa de amplificação do primeiro estágio, mais preferivelmente, de 40° C a 65° C. É preferido que a segunda temperatura de anelamento varie de cerca de 50° C a 72° C para a amplificação do segundo estágio. De acordo com uma forma de realização mais preferida, a primeira temperatura de anelamento é igual ou mais baixa do que a segunda temperatura de anelamento. O comprimento ou a temperatura de fusão (Tm) da seqüência da porção de extremidade 3’ do ACP determinará a temperatura de anelamento para a amplificação do primeiro estágio. Por exemplo, no caso em que o ACP compreende 10 nucleotídeos arbitrários na porção de extremidade 3’, preferivelmente, a temperatura de anelamento estará entre cerca de 45° C e 55° C para a amplificação do primeiro estágio.

De acordo com os presentes métodos, a amplificação do primeiro estágio sob condições de severidade baixa é realizada por pelo menos 2 ciclos de anelamento, estendendo e desnaturando para melhorar a especificidade de anelamento do iniciador durante a amplificação do primeiro estágio e através dos ciclos subseqüentes, a amplificação do segundo estágio é processada mais eficazmente sob condições de alta severidade. A amplificação do primeiro estágio pode ser realizada em até 30 ciclos. Em uma forma de realização preferida, a amplificação do primeiro estágio é realizada por 2 ciclos. Em uma outra forma de realização, a amplificação do segundo estágio sob condições de alta severidade é realizada por pelo menos um ciclo (preferivelmente, pelo menos 5 ciclos) e até 45 ciclos para amplificar o produto do primeiro estágio. Em uma forma de realização mais preferida, a amplificação do segundo estágio é realizada por 25 a 35 ciclos. As condições de severidade alta e baixa podem ser facilmente determinadas a partir dos padrões conhecidos na técnica. “Ciclo” refere-se ao processo que resulta na produção de uma cópia de ácido nucléico alvo. Um ciclo inclui uma etapa de desnaturação, uma etapa de anelamento e uma etapa de extensão.

Na forma de realização mais preferível, a amplificação é realizada de acordo com a PCR que é divulgada nas Patentes U.S. N~ 4.683.195,4.683.202 e 4.800.159.

De acordo com uma forma de realização preferida, quando a amplificação do primeiro estágio é realizada, a porção de extremidade 3’ do par de iniciadores do ACP está envolvida no anelamento na primeira temperatura de anelamento e quando a amplificação do segundo estágio é realizada, a porção de extremidade 5’ do par de iniciadores serve como um sítio de iniciação, tal alteração da porção a envolver no anelamento é principalmente atribuída ao próprio ACP, em particular, à porção reguladora do ACP. Nos presentes métodos, a porção reguladora do ACP é capaz de restringir a porção de anelamento do ACP à sua porção de extremidade 3’ na primeira temperatura de anelamento, responsável por melhorar a especificidade de anelamento a uma seqüência alvo.

Os presentes métodos podem ser combinados com muitos outros processos conhecidos na técnica para se obter um objetivo específico. Por exemplo, a isolação (ou purificação) de produto amplificado pode seguir a amplificação do segundo estágio. Esta pode ser realizada pela eletroforese em gel, cromatografia de coluna, cromatografia de afinidade ou hibridização. Além disso, o produto amplificado desta invenção pode ser inserido em um veículo adequado para a clonagem. Além disso, o produto amplificado desta invenção pode ser expresso em um hospedeiro adequado que abriga o vetor de expressão. De modo a expressar o produto amplificado, poder-se-ia preparar um vetor de expressão que carregasse o produto amplificado sob o controle de um promotor ou operativamente ligado a um promotor. O promotor é originado do próprio vetor ou da porção de extremidade do produto amplificado, que pode corresponder à porção de extremidade 5’ do ACP. Muitas técnicas padrão estão disponíveis para construir vetores de expressão que contenham o produto amplificado e seqüências transcricionais/translacionais/de controle de modo a obter a expressão da proteína ou peptídeo em uma variedade de sistemas de expressão hospedeiros. O promotor usado para hospedeiro procariótico inclui, mas não é limitado ao promotor pIA, promotor trp, promotor lac e promotor T7. O promotor usado para hospedeiro eucariótico inclui, mas não é limitado ao promotor da metalotioneína, promotor tardio de adenovírus, promotor de 7,5 K do vírus da vacínia e os promotores derivados de polioma, adenovírus 2, vírus símio 40 e citomegalovírus. Certos exemplos de hospedeiros procarióticos são E. coli, Bacillus subtilis e outras Enterobacteriaceae tais como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens e várias espécies Pseudomonas. Além de microorganismos, culturas de células derivadas de organismos multicelulares também podem ser usados como hospedeiros. Em princípio, qualquer de tais culturas celulares é trabalhável, sejam culturas de vertebrado ou invertebrado. Além de células de mamífero, estas incluem sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de víms recombinante (por exemplo, baculovírus); e sistemas de célula vegetal infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosaico da couve-flor, vírus mosaico do tabaco) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo uma ou mais seqüências codificadoras. O polipeptídeo expresso a partir do produto amplificado pode ser no geral purificado com uma variedade de propósitos de acordo com o método conhecido na técnica.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para a amplificação do ácido nucléico da presente invenção anteriormente descrito, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento indicados acima.

Ainda em uma outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para a amplificação seletiva de uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de DNA anteriormente descrito, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento indicados acima.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para a amplificação seletiva de uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir do mRNA anteriormente descrito, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento indicados acima.

De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreendem um iniciador ou um par de iniciadores cada um tendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde à porção de extremidade 5’ do ACP; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar as reações de PCR tais como tampões, DNA polimerase, cofatores da DNA polimerase e desoxirribonucleotídeos-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade de DNA polimerase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usados em uma dada reação podem ser facilmente determinadas pelo técnico habilitado tendo o benefício da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos. II. Aplicação para a amplificação de DNA multiplex Esta aplicação que usa o ACP da invenção objeto também pode fornecer um método melhorado para amplificar mais do que uma seqüência alvo usando mais do que um par de iniciadores na mesma reação. No geral, é extremamente difícil ajustar as condições de PCR para amplificar mais do que 10 alvos em paralelo por que uma reação de PCR ótima é requerida para amplificar mesmo um local específico sem qualquer subproduto não específico, de modo que aqueles pesquisadores que obtiveram a PCR multiplex tiveram que trabalhar duro para otimizar os seus sistemas. Visto que o anelamento precisa ocorrer em uma temperatura suficientemente alta para permitir que o emparelhamento de DNA-DNA perfeito ocorra na reação, o ACP da invenção objeto é ideal na otimização da amplificação de DNA multiplex devido à sua função de melhorar a especificidade de amplificação. A “PCR multiplex” como aqui usada refere-se à amplificação simultânea de alvos de DNA multiplex em uma única mistura de reação em cadeia da polimerase (PCR).

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo simultaneamente usando mais do que um par de iniciadores na mesma reação, em que o método compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio de mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo em uma primeira temperatura de anelamento compreendendo pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os pares de iniciadores de qualquer um dos ACPs acima em que cada uma de sua porção de extremidade 3’ do pares de iniciadores tem uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, sob condições em que cada um de cada par de iniciadores anela à sua seqüência de nucleotídeo alvo, por meio das quais os produtos de amplificação de seqüências de nucleotídeo alvos são gerados; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio dos produtos de amplificação gerados da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, compreendendo pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos pares de iniciadores como usados na etapa (a) ou pares de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos pares de iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada um de cada par de iniciadores anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ dos produtos de amplificação gerados da etapa (a), respectivamente, por meio das quais os produtos de amplificação são re-amplificados na mesma reação.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção é realizada de acordo com os presentes métodos para a amplificação de seqüência de ácido nucléico anteriormente debatidos, exceto para o uso de mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo e pares de iniciadores, as descrições comuns entre eles são omitidos de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida.

Por exemplo, a composição e a estrutura do ACP usado e das condições para a amplificação, são comuns entre este processo e os presentes métodos para a amplificação de seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida.

Em uma forma de realização preferida, os produtos amplificados de cada uma das seqüências de nucleotídeo alvos são diferentes em tamanho em relação à análise subsequente.

De acordo com uma forma de realização preferida, os produtos de amplificação de seqüências de nucleotídeo alvos multiplex podem ser analisados através da separação por tamanho. A comparação de separação por tamanho é realizada usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como eletroforese através de uma matriz de gel de poliacrilamida ou matriz de gel de agarose e seqüenciamento de nucleotídeo. O seqüenciamento de nucleotídeo pode ser rapidamente realizado com um seqüenciador automático disponível de vários fabricantes.

Como exemplificado no Exemplo abaixo, o ACP desta invenção permite que o produto final amplificado seja livre dos problemas secundários assim como da não especificidade que surge a partir dos iniciadores convencionais usados nos métodos de amplificação de ácido nucléico multiplex conhecidos na técnica. A vantagem da amplificação multiplex é que numerosas doenças ou alterações de seqüência de nucleotídeo específicas (por exemplo, polimorfismo de nucleotídeo único ou mutação de ponto) podem ser ensaiadas na mesma reação. O número de análises que pode ser rodado simultaneamente é ilimitado; entretanto, o limite superior é provavelmente de cerca de 20 e é provável seja dependente da diferença de tamanho requerida para a resolução e métodos que estão disponíveis para resolver o produto amplificado.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para amplificar mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo simultaneamente na mesma reação, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima. De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreendem um iniciador ou um par de iniciadores tendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde à porção de extremidade 5’ do ACP; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar as reações de PCR tais como tampões, DNA polimerase, cofatores da DNA polimerase e desoxirribonucleotídeos-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade da DNA polimerase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usados em uma dada reação podem ser facilmente determinadas pelo técnico habilitado tendo o benefício da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos. O método e kit da presente invenção podem ser aplicados ao diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, determinação de gênero, análise de ligação genética e estudos forenses. III. Aplicação para a Identificação de Genes Diferencialmente Expressos Esta aplicação usando o ACP da invenção objeto também pode fornecer um método melhorado para detectar e clonar cDNAs complementares aos mRNAs diferencialmente expressos em duas ou mais amostras de ácido nucléico.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para detectar complementaridade de DNA ao mRNA diferencialmente expresso em duas ou mais amostras de ácido nucléico, em que o método compreende transcrever de modo reverso o mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora (mais preferivelmente, seqüência arbitrária) substancialmente complementar a uma região de filamentos de cDNA gerados a partir da transcrição reversa.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) fornecer uma primeira amostra de ácidos nucléicos representando uma primeira população de transcritos de mRNA e uma segunda amostra de ácidos nucléicos representando uma segunda população de transcritos de mRNA; (b) separadamente contactar cada uma da primeira amostra de ácido nucléico e da segunda amostra de ácido nucléico com um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que a porção de extremidade 3’ do primeiro iniciador compreende uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a um primeiro sítio no mRNA diferencialmente expresso para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (c) transcrever de modo reverso o mRNA diferencialmente expresso ao qual o primeiro iniciador hibridiza para produzir uma primeira população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares ao mRNA diferencialmente expresso na primeira amostra de ácido nucléico à qual o primeiro iniciador hibridiza e uma segundo população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares ao mRNA diferencialmente expresso na segunda amostra de ácido nucléico à qual o primeiro iniciador hibridiza; (d) purificar e quantificar cada uma da primeira e segunda populações dos primeiros filamentos de cDNA; (e) realizar uma amplificação de primeiro estágio de cada uma da primeira e segunda populações dos primeiros filamentos de DNA obtidas da etapa (d) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a um segundo sítio na primeira e segunda populações de primeiros filamentos de cDNA, sob condições em que o segundo iniciador anele ao segundo sítio em cada população dos primeiros filamentos de cDNA, por meio da qual a primeira e segunda populações de segundos filamentos de DNA são geradas; (f) realizar uma amplificação de segundo estágio de cada síntese do segundo cDNA de filamento gerado da etapa (e) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, compreendendo pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (b) e (e), respectivamente ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária correspondendo a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (b) e (e), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências das extremidades 3’ e 5’ de cada síntese do segundo cDNA de filamento, respectivamente, por meio da qual os produtos de amplificação dos segundos filamentos de DNA são gerados, e (g) comparar a presença ou nível de produtos de amplificação individuais na primeira e segunda populações de produtos de amplificação obtidos da etapa (f).

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza os presentes métodos para a amplificação da seqüência de ácido nucléico anteriormente debatidos, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida.

Uma representação esquemática para identificar genes diferencialmente expressos que usam os novos ACP é ilustrada na FIG. 2A.

No presente método, a amostra de ácido nucléico que representa uma população de transcritos de mRNA pode ser obtida a partir de uma ampla variedade de materiais biológicos. No geral, a primeira amostra de ácido nucléico compreende mRNA expresso em uma primeira célula e a segunda amostra de ácido nucléico compreende mRNA expresso em uma segunda célula. Em particular, a primeira amostra de ácido nucléico compreende mRNA expresso em uma célula em um primeiro estágio de desenvolvimento e a segunda amostra de ácido nucléico compreende mRNA expresso em uma célula em um segundo estágio de desenvolvimento. Além disso, a primeira amostra de ácido nucléico compreende mRNA expresso em uma célula tumorigênica e a segunda amostra de ácido nucléico compreende mRNA expresso em um célula normal.

As etapas (e) e (f) da aplicação objeto podem ocorrer em um único tubo usando a mesma mistura de reação exceto para os iniciadores, o que significa que as etapas (e) e (f) são separadas apenas em tempo. Deve ser entendido que os iniciadores que correspondem à porção de extremidade 5’ podem ser adicionados à mistura de reação no momento ou depois da síntese do síntese do segundo cDNA de filamento. Em uma forma de realização preferida, os iniciadores que correspondem à porção de extremidade 5’ são adicionados à mistura de reação exatamente depois que a etapa (e) é completada, seguidos pela amplificação subsequente pela PCR dos segundos filamentos de DNA.

Também deve ser entendido que as seqüências da porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs usados nas etapas (b) e (e), respectivamente, podem ser seqüências idênticas ou diferentes; se elas são idênticas, um iniciador que corresponde à seqüência da porção de extremidade 5’ será usado na etapa (f), ao passo que se eles são diferentes, dois iniciadores cada um correspondendo à seqüência de cada porção de extremidade 5’ do ACPs serão usados na etapa (f). Em uma forma de realização preferida, a seqüência da porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs usados nas etapas (b) e (e) são diferentes e assim, dois iniciadores cada um correspondendo à seqüência de cada porção de extremidade 5’ dos ACPs são usados na etapa (f).

Como um processo alternativo, na etapa (f) as seqüências completas do primeiro e segundo ACPs usados nas etapas (b) e (e), respectivamente, ao invés dos iniciadores que correspondem às porções da extremidade 5’ dos ACPs, podem ser usadas como iniciadores nas condições de alta severidade para amplificar cada segundo filamento de DNA obtido da etapa (e), em que as extremidades 3’ e 5’ dos segundos filamentos de DNA que são inicialmente sintetizados usando o segundo ACP compreende a seqüência do primeiro ACP e a seqüência complementar do segundo ACP, respectivamente e também serve como sítios de emparelhamento perfeito para o primeiro e segundo ACPs. Neste ponto de vista, este processo alternativo é preferido por que não existe nenhuma necessidade para adicionar os iniciadores que correspondem às porções da extremidade 5’ dos ACPs à mistura de reação no momento ou depois da reação de PCR de primeiro estágio. A FIG. 2B ilustra uma representação esquemática para identificar genes diferencialmente expressos pelo processo alternativo estabelecido acima. O método da aplicação objeto para detectar diferenças na expressão de gene usa apenas um único iniciador de síntese de cDNA (o primeiro ACP) para reagir com o mRNA, diferente da PCR de Demonstração Diferencial convencional que requer iniciadores de fixação de síntese de cDNA múltiplos. No método da Demonstração Diferencial original esboçado por Liang e Pardee em 1992, doze iniciadores de fixação foram introduzidos. Os iniciadores de fixação por exemplo, tendo uma seqüência de T]2 mn> onde M é A, C ou G e N é A, C, G ou T, produziram doze populações de cDNA separadas. Recentemente, iniciadores de fixação modificados foram propostos alterando-se o número de nucleotídeos tal como um ou três ao invés de dois na extremidade 3’ que pode hibridizar a uma seqüência que esteja imediatamente a 5’ em relação à terminação poli A de mRNAs ou estendendo-se nucleotídeos adicionais na extremidade 5’ enquanto retém a terminação Oligo (dT)9_i2 mn que resulta em pelo menos 21 nucleotídeos no comprimento (Villeponteau et al., 1996, Combates et al., 2000).

A invenção objeto diz respeito às formas de realização do ACP usadas neste método para a identificação de genes diferencialmente expressos, em que o primeiro ACP usado na etapa (b) é representado pela seguinte fórmula geral (2): 5’ - dXp-dYq-dTr- 3’ em que dX é um dos quatro desoxirribonucleotídeos, A, C, G ou T; dY é uma porção reguladora que compreende bases universais responsáveis pela função principal do ACP associada com a alteração da temperatura de anelamento durante a PCR; dT é um desoxirribonucleotídeo T; p, q e r representam um número inteiro, respectivamente; dXp representa a porção de extremidade 5’ e contém uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária; dYq contém pelo menos 2 bases universais; dTr representa a porção de extremidade 3’; a seqüência de nucleotídeo da porção de extremidade 3’ deve ter Tm mais baixa do que aquela da porção de extremidade 5’. A fórmula (2) basicamente segue a regra da fórmula (1). A porção de extremidade 3’ da fórmula (2) consiste das seqüências capazes de anelamento à terminação poli A do mRNA e serve como um iniciador da síntese de cDNA para a transcrição reversa de mRNA.

Em uma forma de realização preferida, a porção de extremidade 3’ do primeiro ACP usado na etapa (b) contém pelo menos 6 nucleotídeos T no comprimento, o que é considerado uma exigência mínima de comprimento para anelamento do iniciador. Mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ é de 10 a 20 nucleotídeos T e pode ser de até 30 nucleotídeos T no comprimento. O mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ é de cerca de 15 nucleotídeos T no comprimento. Este iniciador é denominado iniciador de controle de anelamento dTis (dTi5-ACP). Em uma forma de realização preferida, o primeiro iniciador tem uma fórmula geral de 5’ - dX15.30-dY2-10-dT10.20 - 3’, em que dX representa um desoxirribonucleotídeo e compreende uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária não substancialmente complementar à primeira e segunda populações de mRNA; dY representa a porção reguladora que compreende 2 a 10 bases universais ou bases não discriminatórias análogas; e dT representa uma desoxitimidina contígua capaz de anelamento ao primeiro sítio na primeira e segunda populações de mRNA.

Em uma forma de realização, a porção de extremidade 3’ do primeiro ACP usado na etapa (b) pode conter pelo menos um nucleotídeo adicional na extremidade 3’ que pode hibridizar a uma seqüência de mRNA que está imediatamente a montante da terminação poliA. Os nucleotídeos adicionais na extremidade 3’ do primeiro ACP pode ser de até 3 no comprimento. Por exemplo, dT pode ainda compreender 3’-V na sua extremidade 3’; em que V é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxicitidina e desoxiguanosina. Além disso, dT pode ainda compreender 3’-NV na sua extremidade 3’; em que V é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxicitidina e desoxiguanosina e N é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina e desoxiguanosina. O mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ do primeiro ACP usado na etapa (b) contém apenas dTjs.

Em uma forma de realização preferida, o primeiro ACP inteiro é de cerca de 40 a 45 nucleotídeos no comprimento e compreende dT)5 na porção de extremidade 3’, dX2o-25 na porção de extremidade 5’ e dY5 entre as porções de extremidade 3’ e 5’. O primeiro ACP inteiro pode ser de até 100 nucleotídeos no comprimento. O primeiro iniciador é exemplificado pelas SEQID NOs: 30, 39,57 e 61 a 63. O primeiro ACP aqui descrito é hibridizado à terminação poli A do mRNA, que está presente em todos os mRNAs, exceto para uma pequena minoria de mRNA. O uso do primeiro ACP usado nesta invenção resulta em apenas uma reação e produz apenas uma população de cDNA, ao contrário de pelo menos 3 a 64 populações de cDNA separadas geradas pelos iniciadores de fixação convencionais da técnica de Demonstração Diferencial. Isto aumenta enormemente a eficiência do método pela geração de um agrupamento substancialmente padrão de cDNA de filamento único de cada população de mRNA experimental.

Na etapa (d), os agrupamentos padrão de cDNAs sintetizados pelo primeiro ACP devem ser purificados e depois quantificados pelas técnicas bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica tais como espectrofotometria. Esta etapa é necessária para controlar precisamente as suas entradas na etapa de amplificação e depois comparar os produtos finais amplificados entre duas ou mais amostras. Preferivelmente, a quantidade de cDNA produzida neste ponto no método é medida. É mais preferido que esta determinação seja feita usando a espectroscopia de ultravioleta, embora qualquer procedimento padrão conhecido para quantificar o cDNA conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica é aceitável para o uso para este propósito. Quando do uso do procedimento de espectroscopia de UV, uma absorbância de cerca de 260 nm de luz UV é vantajosamente usada. Pela medição da quantidade de cDNA nesta etapa, portanto, a quantidade de cDNA pode ser padronizada entre ou comparada às amostras na seguinte reação de amplificação.

Depois da síntese dos primeiros filamentos de cDNA que usam o primeiro ACP, os segundos filamentos de DNA são sintetizados usando o segundo ACP iniciador sob condições de severidade baixa, pelo menos por um ciclo que compreende desnaturação, anelamento e extensão do iniciador, em que os primeiros filamentos de cDNA resultantes são usados como padrão. O segundo ACP basicamente segue a regra da fórmula (1) e a sua porção de extremidade 3’ compreende uma seqüência arbitrária curta, que preferivelmente tem Tm mais baixa do que aquela da porção de extremidade 5’. Este iniciador é denominado de um iniciador de controle de anelamento arbitrário (AR-ACP). Em uma forma de realização preferida, a porção de extremidade 3’ do segundo ACP pode ter de 8 a 15 nucleotídeos no comprimento. O mais preferivelmente, a porção de extremidade 3’ do segundo ACP contém cerca de 10 nucleotídeos no comprimento.

De acordo com uma forma de realização preferida, o segundo ACP tem a fórmula geral de 5’ - dX15.30-dY2-10-dZg.15 - 3’, em que dX representa um desoxirribonucleotídeo e compreende uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária não substancialmente complementar à primeira e segunda populações dos primeiros filamentos de cDNA; dY representa a porção reguladora que compreende 2 a 10 bases universais ou bases não discriminatórias análogas; dZ representa uma seqüência hibridizadora de nucleotídeo arbitrária capaz de anelamento ao segundo sítio na primeira e segunda populações de filamentos de DNA. Mais preferivelmente, 0 segundo ACP inteiro é de cerca de 40 a 45 nucleotídeos no comprimento que compreende dZJ0 na porção de extremidade 3’, dX2o-25 na porção de extremidade 5’ e dYs entre as porções de extremidade 3’ e 5’. O segundo ACP inteiro pode ser de até 100 nucleotídeos no comprimento. O segundo iniciador é exemplificado pelas SEQ ID NOs: la9, 13al8e20a 23. O segundo ACP aqui descrito é diferente de um chamado iniciador arbitrário longo, como usado na técnica de Demonstração Diferencial modificada conhecida. Por exemplo, os iniciadores arbitrários longos convencionais como descrito por Villeponteau et al. (1996) e Diachenko et al. (1996), tendo pelo menos 21 ou 25 nucleotídeos no comprimento, compreendidos apenas de nucleotídeos arbitrários nas seqüências inteiras. Estes iniciadores arbitrários longos convencionais hibridizarão em uma maneira não prognosticável sob a temperatura de anelamento baixa (cerca de 40° C) que é requerida para se obter a iniciação arbitrária no ciclo de PCR precoce, tal que seja impossível planejar um conjunto representativo de iniciadores racionalmente. Além disso, muitas das faixas representam 0 mesmo mRNA devido à “Viscosidade” dos iniciadores longos quando usados sob uma tal severidade baixa.

As vantagens do presente método para detectar genes diferencialmente expressos são predominantemente atribuídos ao uso do segundo ACP. Visto que o segundo ACP é planejado para limitar o anelamento do segundo ACP à sua seqüência da porção de extremidade 3’, não à sua seqüência de porção de extremidade 5’, em associação com a temperatura de anelamento, o anelamento resultante ocorrerá em uma maneira prognosticável, tal que é possível planejar um conjunto de iniciadores representativos racionalmente. Além disso, o uso do segundo ACP permite evitar problemas de falso positivo causados pela “Viscosidade” dos iniciadores longos convencionais sob condições de severidade baixa como usado na técnica de Demonstração Diferencial anterior. A temperatura de anelamento usada para a síntese dos segundos filamentos de DNA sob condições de severidade baixa usados na etapa (e) está preferivelmente entre cerca de 40° C a 65° C, mais preferivelmente, entre cerca de 45° C e 55° Ceo mais preferivelmente, de cerca de 50° C. Entretanto, diferente da Demonstração Diferencial, que usa as temperaturas de anelamento entre 35° C e 45° C, a temperatura de anelamento de condições de severidade baixa usadas na aplicação objeto é relativamente mais alta do que aquela usada nas técnicas de Demonstração Diferencial clássica ou realçada conhecidas com iniciadores arbitrários.

Outras características únicas e significantes da aplicação objeto para detectar genes diferencialmente expressos é amplificar apenas os segundos filamentos de DNA inicialmente sintetizados pela amplificação subsequente, em que as extremidades 3’ e 5’ dos segundos filamentos de DNA que foram inicialmente sintetizados usando o segundo ACP compreende a seqüência complementar do primeiro ACP e a seqüência do segundo ACP, respectivamente e assim, as seqüências inteiras do primeiro e segundo ACPs ou apenas as suas seqüências da porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs, são usadas como seqüências iniciadoras 3’ e 5’ para a amplificação dos segundos filamentos de DNA.

Visto que o ACP na aplicação objeto leva à amplificação de produtos específicos, pode ser possível eliminar fundamentalmente a causa de problemas de gargalo principais, tais como produtos falsos e reprodutibilidade deficiente, que resultam do anelamento não específico dos iniciadores arbitrários e dT convencionais para primeiro e segundo filamentos de DNA assim como para os produtos amplificados durante a PCR nos métodos de Demonstração Diferencial conhecidos.

Em uma forma de realização preferida, a síntese de segundos filamentos de DNA na etapa (e) é realizada em pelo menos 1 ciclo de amplificação sob condições de severidade baixa para se obter a iniciação arbitrária e através dos ciclos subseqüentes, a amplificação é processada mais eficazmente para a amplificação dos segundos filamentos de DNA resultantes sob condições de alta severidade usadas na etapa (f). O mais preferivelmente, a síntese de segundos filamentos de DNA na etapa (e) é realizada por um ciclo de amplificação sob condições de severidade baixa.

Em uma forma de realização preferida, a amplificação dos segundos filamentos de DNA resultantes sintetizados pela etapa (e) é realizada sob condições de alta severidade usando as seqüências completas do primeiro e segundo ACPs usados nas etapas (b) e (e), respectivamente, como seqüências iniciadoras, em que as extremidades 3’ e 5’ dos segundos filamentos de DNA resultantes fornecem sítios de emparelhamento perfeito ao primeiro e segundo ACPs. Entretanto, é interessante que o primeiro e segundo ACPs não estejam envolvidos em qualquer outro anelamento com o ácido nucléico padrão, exceto o anelamento e extensão das extremidades 3’ e 5’ dos segundos filamentos de DNA como uma unidade de reação em uma tal condição de severidade alta por que as suas porções de extremidade 3’ requerem temperatura de anelamento relativamente baixa e as condições de alta severidade não permitem que elas anelem a nenhum sítio do padrão, exceto às extremidades 3’ e 5’ dos segundos filamentos de DNA. Conseqüentemente, devido a esta função do ACP, que é capaz de anelar seletivamente com o padrão em associação com a temperatura de anelamento, os produtos amplificados podem ser isentos dos problemas da taxa de falso positivo alta, reprodutibilidade deficiente e possível sub-representação de frações de mRNA menores na análise que são os problemas principais da Demonstração Diferencial conhecida. Neste ponto de vista, existe uma diferença significante entre este método objeto e os métodos de Demonstração Diferencial convencionais a despeito do fato de que eles terem em comum o uso dos mesmos iniciadores para condições de alta severidade assim como para condições de severidade baixa.

Em uma forma de realização preferida, a temperatura de anelamento da amplificação para condições de alta severidade usadas na etapa (f) é preferivelmente de cerca de entre 55° C e 72° C. O mais preferivelmente, a temperatura de anelamento usada para as condições de alta severidade é de cerca de 65 a 68° C

Em uma forma de realização preferida, a amplificação sob condições de alta severidade usada na etapa (f) é realizada em pelo menos 10 ciclos e até 50 ciclos para amplificar os segundos filamentos de DNA resultantes sintetizados pela etapa (e) durante a PCR. O mais preferivelmente, a amplificação pela PCR é realizada em 40 a 45 ciclos. O síntese do segundo cDNA de filamento é preferivelmente sintetizado pela PCR, mais preferivelmente, o método de PCR de início quente em que o procedimento é ajustar as reações completas sem a DNA polimerase e incubar os tubos no ciclador térmico para completar a etapa de desnaturação inicial a > 90° C. Depois, enquanto mantém os tubos a uma temperatura acima de 70° C, a quantidade apropriada de DNA polimerase pode ser pipetada na reação. Em uma forma de realização preferida, a adição dos iniciadores para a amplificação do segundo estágio na mistura de reação depois da reação completa da síntese do síntese do segundo cDNA de filamento é também realizada sob a temperatura de desnaturação tal como > 90° C. Depois, enquanto mantém os tubos a uma temperatura de cerca de 90 ° C, a quantidade apropriada dos iniciadores para a amplificação do segundo estágio pode ser pipetada na reação.

Um exemplo da síntese do segundo filamento de DNA e a amplificação subsequente dos segundos filamentos de DNA resultantes em um único tubo usando a seqüência arbitrária pré selecionada das porções da extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs é conduzido sob as seguintes condições: os segundos filamentos de DNA são sintetizados sob condições de severidade baixa por um ciclo da amplificação do primeiro estágio que compreende reação de anelamento, extensão e desnaturação; a mistura de reação contendo o primeiro filamento do cDNA, o tampão de reação de PCR (por exemplo, disponível da Roche), dNTP e o segundo ACP é pré aquecida a cerca de 94° C, enquanto mantém o tubo contendo a mistura de reação a cerca de 94° C, a Taq polimerase (por exemplo, disponível da Roche) é adicionada na mistura de reação; as reações de PCR são como segue: um ciclo de 94° C durante 1 min, 50° C durante 3 min e 72° C durante 1 min; seguido pela desnaturação do produto de amplificação a 94° C; depois da reação completa da síntese do segundo filamento de DNA na etapa (e), o iniciador 5’ pré selecionado arbitrário e o iniciador 3’ pré selecionado arbitrário são adicionados à mistura de reação e depois o segundo estágio de amplificação é conduzido como segue: 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguido por uma extensão final de 5 minutos a 72° C.

Um exemplo alternativo da síntese do segundo filamento de DNA e a amplificação subsequente dos segundos filamentos de DNA resultantes em um único tubo usando as seqüências completas do primeiro e segundo ACPs usados nas etapas (b) e (e), respectivamente, ao invés das sequências arbitrárias pré selecionadas das porções da extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs, é conduzido sob as seguintes condições: os segundos filamentos de DNA são sintetizados sob condições de severidade baixa por um ciclo da amplificação do primeiro estágio que compreende reação de anelamento, extensão e desnaturação; a mistura de reação contendo o primeiro cDNA de filamento, o tampão de reação de PCR (por exemplo, disponível da Roche), dNTP, o primeiro ACP (dTi5-ACP) e o segundo ACP (AR-ACP) é pré aquecida a cerca de 94° C, enquanto mantém o tubo contendo a mistura de reação a cerca de 94° C, a Taq polimerase (por exemplo, disponível da Roche) é adicionada na mistura de reação; as reações de PCR são como segue: um ciclo de 94° C durante 1 minuto, 50° C durante 3 minutos e 72° C durante 1 minuto; seguida pela amplificação pela PCR de segundo estágio que compreende a reação de anelamento, extensão e desnaturação; as reações de PCR são como segue: 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 65° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguido por uma extensão final de 5 minutos a 72° C.

Deve ser mencionado que uma concentração apropriada de ACP arbitrário (o segundo ACP) é usada para sintetizar os segundos cDNAs de filamento por um ciclo da amplificação do primeiro estágio. Se a quantidade do segundo ACP usado na etapa (e) é muito baixa, os produtos amplificados resultantes não são reprodutíveis. Ao contrário, a quantidade em excesso do segundo ACP usado na etapa (e) gera produtos secundários tais como sujidade de DNA durante a PCR. Em uma forma de realização preferida, a concentração do segundo ACP usado na etapa (e) está entre cerca de 0,1 μΜ e 1,0 μΜ. O mais preferivelmente, a concentração do segundo ACP assim como o primeiro ACP é de cerca de 0,2 μΜ. Em uma forma de realização preferida, a concentração dos iniciadores usados na etapa (f) está entre cerca de 0,1 μΜ e 1 μΜ, o mais preferivelmente, de cerca de 0,4 μΜ.

Uma outra característica significante da aplicação objeto para a identificação de diferenças na expressão de gene é o uso de alta temperatura de anelamento em um método. A alta temperatura de anelamento usada na etapa (f) aumenta a especificidade de anelamento do iniciador durante a PCR, o que resulta na eliminação de produtos falso positivos completamente e no aumento da reprodutibilidade. A liberação de positivos falsos que é um gargalo principal que permanece na técnica de Demonstração Diferencial anterior é especialmente importante na etapa de triagem para a verificação dos fragmentos de cDNA identificados pela Demonstração Diferencial. A etapa de comparar a presença ou nível de produtos de amplificação obtidos da etapa (f) pode ser realizada de acordo com vários métodos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização preferida, cada uma da primeira e segunda populações de produtos de amplificação da etapa (f) são separados pela eletroforese para identificar mRNA diferencialmente expresso. Mais preferivelmente, os fragmentos de PCR resultantes de cDNA são detectados em um gel de agarose tingido com brometo de etídio. Uma outra característica proeminente desta aplicação objeto é o uso de gel de agarose tingido com brometo de etídio para identificar mRNA diferencialmente expresso. No geral, os métodos de Demonstração Diferencial convencionais usam técnicas de detecção radioativa que usam géis de poliacrilamida desnaturantes. Entretanto, de acordo com o presente método, a quantidade significante dos fragmentos de cDNA amplificados obtidos através das amplificações de estágio duplo permite usar um gel de agarose tingido com brometo de etídio para detectar os cDNAs amplificados, o que resulta em aumento da velocidade e evita o uso de radioatividade.

Altemativamente, os fragmentos de cDNA resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como o fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996).

Em uma outra forma de realização, seria útil para os propósitos de diagnóstico usar um sistema automático tal como um seqüenciador de DNA automático junto com qualquer rotulação distinta dos ACPs para detectar ou analisar os produtos amplificados (Bauer, et al., 1993).

Considerando as características do ACP nesta aplicação objeto, o presente método para detectar e clonar genes diferencialmente expressos difere fundamentalmente das técnicas de Demonstração Diferencial anteriores como descritas acima.

Em conclusão, o uso do ACP neste método toma possível permitir a amplificação apenas de segundos filamentos de DNA e o uso da quantidade suficiente de materiais de partida assim como a alta concentração de dNTP, que resultam nos seguintes benefícios: a) aumento da especificidade de anelamento do iniciador, b) eliminação do problema de positivos falsos que requer o trabalho intensivo subsequente para verificar os positivos verdadeiros, c) melhora na confiabilidade e reprodutibilidade, d) detecção de mRNAs raros, e) geração de produtos de PCR de distância longa variando no tamanho de 150 pares de base a 2,0 kb, f) permitir o uso de géis de agarose tingidos com brometo de etídio para detectar os produtos, g) aumento da velocidade de análise, h) particularmente, não requer mãos bem treinadas para conduzir este método e i) permite o planejamento racional de um conjunto representativo de iniciadores.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para detectar a complementaridade de DNA ao mRNA diferencialmente expresso, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima (o primeiro e segundo iniciador). De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreendem um iniciador ou um par de iniciadores tendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde à porção de extremidade 5’ dos ACPs; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreenda a seqüência iniciadora universal, ela é mais preferida que o kit que compreende os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar reações de PCR tais como tampões, DNA polimerase, cofatores da DNA polimerase e desoxirribonucleotídeo-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade da DNA polimerase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usadas em uma dada reação podem ser facilmente determinadas pelo técnico habilitado tendo o benefício da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos. IV. Aplicação para a amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) Esta aplicação usando o ACP da invenção objeto pode fornecer um método melhorado para amplificar rapidamente extremidades de cDNA, chamada tecnologias RACE. Para ser específico, o ACP da aplicação objeto é adaptada às tecnologias RACE relacionadas com cada uma das extremidades 3’ e 5’ e elimina os problemas secundários que resultam dos iniciadores usados nas tecnologias RACE convencionais.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar rapidamente um fragmento de cDNA alvo que compreende uma região de cDNA que corresponde à região da extremidade 3’ de um mRNA, em que o método compreende transcrever de modo reverso o dito mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora específica de gene substancialmente complementar a um sítio no cDNA gerado a partir da transcrição reversa e/ou um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA dos mRNAs.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) contactar mRNAs com um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que a porção de extremidade 3’ do iniciador compreende uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA dos mRNAs para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso os mRNAs aos quais o primeiro iniciador hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares aos mRNAs aos quais o primeiro iniciador hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos primeiros filamentos de cDNA em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora específica de gene substancialmente complementar a um sítio em um dos primeiros filamentos de cDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o segundo iniciador anela a um sítio específico de gene em um dos primeiros filamentos de cDNA, por meio das quais um síntese do segundo cDNA de filamento específico de gene é gerado; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio do síntese do segundo cDNA de filamento específico de gene gerado da etapa (c) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (a) e (c), respectivamente ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (a) e (c), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências das extremidades 3’ e 5’ de um síntese do segundo cDNA de filamento específico de gene, respectivamente, por meio das quais um produto de amplificação de um filamento de cDNA específico de gene é gerado.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza os presentes métodos para a amplificação de seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida.

Uma representação esquemática para amplificar um fragmento de cDNA alvo que compreende a região da extremidade 3’ que corresponde à extremidade 3’ de mRNA usando o novo sistema ACP, chamado como 3’ RACE com base em ACP, é ilustrada na FIG. 3.

As etapas (c) e (d) da aplicação objeto podem ocorrer em um único tubo usando a mesma mistura de reação exceto para os iniciadores, o que significa que as etapas (c) e (d) são separadas apenas no tempo. Deve ser entendido que os iniciadores que correspondem à porção de extremidade 5’ podem ser adicionados à mistura de reação no momento ou depois da síntese do síntese do segundo cDNA de filamento. Em uma forma de realização preferida, os iniciadores que correspondem à porção de extremidade 5’ são adicionados à mistura de reação exatamente depois da etapa (2) estar completa, seguidos pela amplificação subsequente de segundos filamentos de DNA.

Como um processo alternativo, na etapa (d) as seqüências completas do primeiro e segundo ACPs, ao invés dos iniciadores que correspondem às porções da extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs, podem ser usados como iniciadores 3’ e 5’ para amplificar o segundo cDNA de filamento obtidos da etapa (c), em que as extremidades 3’ e 5’ do segundo cDNA de filamento que são inicialmente sintetizados usando o segundo ACP compreende a seqüência complementar do primeiro ACP e a seqüência do segundo ACP, respectivamente e também serve como sítios de emparelhamento perfeito para o primeiro e segundo ACPs. A FIG. 3 também ilustra uma representação esquemática para amplificar um fragmento de cDNA alvo que compreende a região da extremidade 3’ que corresponde à extremidade 3’ do mRNA pelo processo alternativo estabelecido acima.

Uma das características significantes da presente invenção durante 3’-RACE é que o primeiro ACP que compreende a seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar à terminação poliA do mRNA é usado como um iniciador da síntese de cDNA e depois os cDNAs resultantes são diretamente usados como padrão para a amplificação subsequente sem qualquer etapa de purificação adicional para remover o iniciador de síntese de cDNA. O anelamento do primeiro ACP com os padrões será interrompido durante subsequente pelo efeito da porção reguladora sobre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP sob condições de severidade relativamente altas como descrito no princípio do ACP. Como um resultado, a aplicação objeto à 3’-RACE simplifica os métodos RACE convencionais reduzindo-se a etapa de purificação e também, o ACP usado na aplicação objeto não envolve os problemas secundários por que o anelamento da porção de extremidade 3’ é especificado pela presença da porção reguladora posicionada entre as porções da extremidade 3’ e 5’ nos ACPs, ao passo que os iniciadores da síntese de cDNA convencionais tais como iniciadores Oligo-dT durante 3’-RACE geram produtos secundários durante a PCR, que são produtos não específicos. De acordo com uma forma de realização preferida, a fórmula do primeiro ACP para a síntese de cDNA pode ser idêntica à fórmula (2).

Quando um iniciador específico de gene é usado como iniciador 5’, a primeira amplificação de um fragmento de cDNA alvo contendo uma seqüência de extremidade 3’ na etapa (c) é realizada de acordo com métodos de PCR convencionais como conhecido na técnica. O termo “específico de gene” na seqüência de referência aqui usada refere-se a uma seqüência parcial de um gene específico ou complemento deste que foi no geral conhecido ou disponível a uma pessoa habilitada na técnica. Portanto, o iniciador específico de gene significa um que compreende a seqüência específica de gene. O síntese do segundo cDNA de filamento gerado é amplificado pela amplificação do segundo estágio que é usada na aplicação da presente invenção para amplificar uma seqüência de ácido nucléico alvo acima. Visto que o ACP descrito nesta invenção pode gerar Tm estável em um iniciador e também tolera “parâmetros de procura de iniciador” para o planejamento de iniciador tal como o comprimento do iniciador, a temperatura de anelamento, o teor de GC e o comprimento de produto de PCR, ele é útil quando as sequências do iniciador específico de gene têm Tm baixo ou são muito sensíveis a tais parâmetros para gerar produtos específicos.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar rapidamente um fragmento de DNA alvo que compreende uma região de cDNA que corresponde à região de extremidade 5’ de um mRNA, em que o método compreende transcrever de modo reverso o mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora específica de gene substancialmente complementar a um sítio no cDNA gerado a partir da transcrição reversa.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) contactar mRNAs com um iniciador de oligonucleotídeo dT ou iniciador aleatório como um iniciador de síntese de cDNA sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra, em que o iniciador de síntese de cDNA compreende uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a uma região de um mRNA para hibridizar com ela; (b) transcrever de modo reverso os mRNAs, usando uma transcriptase reversa, com a qual o iniciador de síntese de cDNA hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares aos mRNAs aos quais o iniciador de síntese de cDNA hibridiza, por meio da qual intermediários de mRNA-cDNA são gerados; (c) permitir que resíduos de citosina sejam formem terminação nas extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA na forma dos intermediários de mRNA-cDNA pela reação de transferase terminal da transcriptase reversa; (d) contactar as terminações de citosina nas extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA gerados a partir da etapa (c) com um oligonucleotídeo que compreende uma porção de extremidade 3’ e uma porção de extremidade 5’ separadas por um grupo de base universal ou base não discriminatória análoga, em que a porção de extremidade 3’ compreende pelo menos três resíduos de guaiiina na sua extremidade 3’ para hibridizar com as terminações de citosina nas extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA e a porção de extremidade 5’ compreende uma sequência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária, sob condições em que a porção de extremidade 3’ do oligonucleotídeo é hibridizada às terminações de citosina; (e) estender as extremidades 3’ formadas em terminação dos primeiros filamentos de cDNA para gerar uma seqüência adicional complementar ao oligonucleotídeo usando a transcriptase reversa, em que o oligonucleotídeo serve como um padrão na reação de extensão, por meio da qual os primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo são prolongados; (f) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo obtidos a partir da etapa (e) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende (i) e (ii) como segue: (i) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um primeiro iniciador que compreende uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar às seqüências da extremidade 3 ’ dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo sob condições em que o primeiro iniciador anela aos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, sob condições em que o primeiro iniciador anela às extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, por meio da qual os segundos filamentos de DNA de comprimento completo são gerados; (ii) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um segundo iniciador de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora específica de gene substancialmente complementar a uma região em um dos segundos filamentos de DNA de comprimento completo para hibridizar com ela, sob condições em que o segundo iniciador anela a um sítio específico de gene em um dos segundos filamentos de DNA de comprimento completo, por meio da qual um filamento de cDNA específico de gene é gerado; e (g) realizar uma amplificação de segundo estágio do filamento de cDNA específico de gene em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, compreendendo pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (f)-(i) e (f)-(ii), respectivamente ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (f)-(i) e (f)-(ii), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ de um filamento de cDNA específico de gene, respectivamente, por meio da qual um produto de amplificação de um filamento de cDNA específico de gene é gerado.

As representações esquemáticas para amplificar um fragmento de cDNA alvo que compreende a região de extremidade 5’ que corresponde à extremidade 5’ de mRNA usando o novo sistema ACP, chamado como 5’ RACE com base no ACP, é ilustrada nas FIGs. 4A (usando iniciador de oligonucleotídeo dT) e 4B (usando iniciador aleatório).

As descrições do iniciador de oligonucleotídeo dT usado na etapa (a) são idênticas as daqueles usados no presente método para a amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um mRNA. Altemativamente, quando o tamanho de um mRNA alvo é tão grande que a transcriptase reversa falha antes de atingir as seqüências 5’ completas, o iniciador aleatório é usado como iniciador de síntese de cDNA.

De acordo com uma forma de realização preferida, a etapa (c), que permite que resíduos de citosina seja formados em terminação é realizada na presença de íon manganês.

As etapas (f) e (g) da aplicação objeto podem ocorrer em um único tubo usando a mesma mistura de reação exceto para iniciadores, o que significa que as etapas (f) e (g) são separadas apenas no tempo. Deve ser entendido que o(s) iniciador(es) usado(s) em cada etapa (f) e (g) pode(m) ser adicionado(s) à mistura de reação no momento ou depois de cada etapa. Em uma forma de realização preferida, o(s) iniciador(es) é(são) adicionado(s) à mistura de reação exatamente depois que cada etapa é completada, seguido(s) pela amplificação subsequente pela PCR de segundos filamentos de DNA.

Quando um iniciador específico de gene é usado como iniciador 5’, a amplificação de um fragmento de cDNA alvo contendo uma seqüência de extremidade 5’ na etapa (f) é realizada sob condições de alta severidade de acordo com os métodos de PCR convencionais como conhecido na técnica.

Em uma forma de realização preferida, um fragmento de cDNA alvo contendo uma seqüência de extremidade 5’ na etapa (f) é amplificada usando um segundo ACP que compreende uma seqüência específica de gene na porção de extremidade 3’, pelas amplificações de PCR de estágio duplo que são usadas na aplicação da presente invenção para amplificar uma seqüência de ácido nucléico alvo acima. Visto que o ACP descrito nesta invenção pode gerar Tm estável em um iniciador e também tolera “parâmetros de procura de iniciador” tais como planejamento de iniciador, que compreende o comprimento do iniciador, a temperatura de anelamento, o teor de GC e o comprimento do produto de PCR, é particularmente útil quando as seqüências do iniciador específico de gene têm Tm baixa ou são muito sensíveis a tais parâmetros para gerar produtos específicos. A fórmula do segundo ACP é idêntica à fórmula (1) em que a porção de extremidade 3’ contém uma seqüência específica de gene. O oligonucleotídeo para a etapa (d) é similar ao iniciador CapFinder (Chenchik et al., 1998; Chenchik et al. Patentes U.S. N-5.962.271 e 5.962.272) no sentido de que ambos compreendem pelo menos três resíduos de guanina na sua extremidade 3’ e uso deles como um iniciador que muda o padrão para a extensão da extremidade 3’ do primeiro cDNA de filamento pela transcriptase reversa, ao passo que eles são claramente diferentes um do outro em termos da função de uma mudança no controle do anelamento do iniciador a um ácido nucléico padrão em associação com a temperatura de anelamento durante a PCR. O iniciador CapFinder não compreende grupo de resíduo de base universal que é responsável pela regulagem do anelamento do iniciador no ACP, de modo que o método de PCR com CapFinder durante a 5’ - RACE (Chenchik et al., 1998) não pode ser livre de um alto teor de produtos secundários tal como ramos de DNA que surgem da contaminação dos iniciadores tais como os iniciadores CapFinder e Oligo-dT usados na síntese de cDNA durante a PCR. Por outro lado, o grupo de resíduo de base universal do primeiro ACP desempenha um papel chave na regulagem do anelamento do iniciador, de modo que o método objeto não fornece qualquer causa para os problemas secundários durante a amplificação subsequente pela PCR; esta é uma característica chave da aplicação do ACP ao 5’ - RACE.

Além disso, quando o ACP da presente invenção é usado na tecnologia de 5’ - RACE, é desnecessário conduzir o processo de separação física tal como uma síntese de fase sólida de cDNA e procedimentos que tenham sido introduzidos como um método alternativo para remover todos os contaminantes usados na síntese de cDNA (Schramm et al., 2000).

Em uma forma de realização preferida, o oligonucleotídeo para formar um par ou pares de base com a terminação de citosina durante 5’ -RACE que tem uma estrutura similar ao ACP, em que o oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula geral (3): 5’ - dXi5-3o-dY2-io-dZi.]o-G3-5 -3’, em que dX representa um desoxiiribonucleotídeo e compreende uma seqüência arbitrária pré selecionada; dY representa uma porção reguladora que compreende 2 a 10 bases universais ou bases não discriminatórias análogas; dZ representa um desoxirribonucleotídeo e compreende uma seqüência arbitrária pré selecionada; e G3.5 representa três a cinco guaninas. O mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ dZ é de cerca de 2 a 3 nucleotídeos no comprimento. Além disso, em uma forma de realização, a porção de extremidade 5’ dX pode incluir uma seqüência que é reconhecida por uma endonuclease de restrição. O G3.5 pode ser de três a cinco riboguaninas ou desoxiguaninas ou uma combinação de riboguanina e desoxirriboguanina. Em uma forma de realização mais preferida, 0 G3.5 compreende duas riboguaninas e uma desoxirriboguanina (r(G)2-d(G) - 3’), 0 mais preferivelmente, três riboguaninas.

Quando 0 iniciador específico de gene na etapa (f) é usado como iniciador 3’ durante 5’ - RACE, um fragmento de cDNA alvo contendo uma seqüência de extremidade 5’ é amplificado sob condições de alta severidade pelos métodos de PCR convencionais como conhecido na técnica.

Em uma forma de realização preferida, um fragmento de cDNA alvo contendo uma seqüência de extremidade 5’ é amplificado usando um segundo ACP que compreende uma seqüência específica de gene na porção de extremidade 3’, pelas amplificações de PCR de estágio duplo que são conduzidas na aplicação para amplificar uma seqüência de ácido nucléico alvo na presente invenção. Visto que 0 ACP descrito nesta invenção pode fornecer Tm estável em um iniciador e também tolera “parâmetros de procura de iniciador” para 0 planejamento de iniciador tal como o comprimento do iniciador, a temperatura de anelamento, 0 teor de GC e o comprimento de produto de PCR, ele é útil quando as seqüências do iniciador específico de gene têm Tm baixo ou são muito sensíveis a tais parâmetros para gerar produtos específicos. A fórmula do segundo ACP é idêntica à fórmula (1) em que a porção de extremidade 3’ contém uma seqüência específica de gene. O uso de ACP na tecnologia RACE significantemente simplifica e melhora as tecnologias de RACE convencionais com respeito à amplificação de extremidades de cDNA como descrito acima. A característica vital do método objeto é ser livre dos problemas secundários que surgem dos iniciadores usados nos métodos RACE convencionais. Conseqüentemente este método aqui descrito pode ser mais eficaz, mais fácil, menos intensivo em trabalho e mais reprodutíveis do que os métodos de RACE convencionais.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para amplificar rapidamente um fragmento de cDNA alvo que compreende a região da extremidade 3’ de mRNA, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento anteriormente descritos (incluindo o primeiro e segundo iniciadores). De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreendem um iniciador ou um par de iniciadores tendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde à porção de extremidade 5’ dos ACPs; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar reações de PCR tais como tampões, DNA poiimerase, cofatores da DNA poiimerase e desoxirribonucleotídeo-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade da DNA poiimerase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usadas em uma dada reação pode ser facilmente determinada pelo técnico habilitado tendo o benefício da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para amplificar rapidamente um fragmento de cDNA alvo que compreende a região de extremidade 5’ de mRNA, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima (incluindo o iniciador de oligonucleotídeo dTe o iniciador aleatório para a síntese de cDNA, o oligonucleotídeo para formar um par ou pares de base com a terminação de citosina, o primeiro iniciador e o segundo iniciador). De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreende um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores como usado nas etapas (f)-(i) e (f)-(ii); no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. V. Aplicação para amplificar cDNA de comprimento completo Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar uma população de cDNAs de filamento duplo de comprimento completo complementar aos mRNAs, em que o método compreende transcrever de modo reverso o mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP é um tendo uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA dos mRNAs.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método que compreende: (a) contactar os mRNAs com um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que a porção de extremidade 3’ do primeiro iniciador tem uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliAs dos mRNAs para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso os mRNAs, usando uma transcriptase reversa, à qual o primeiro iniciador hibridiza para produzir a população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares aos mRNAs aos quais o iniciador hibridiza, por meio da qual intermediários de mRNA-cDNA são gerados; (c) permitir que resíduos de citosina sejam formados em terminação nas extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA na forma dos intermediários de mRNA-cDNA pela reação de transferase terminal da transcriptase reversa; (d) contactar as terminações de citosina nas extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA gerados a partir da etapa (c) com um oligonucleotídeo que compreende uma porção de extremidade 3’ e uma porção de extremidade 5’ separadas por um grupo de base universal ou base não discriminatória análoga, em que a porção de extremidade 3’ compreende pelo menos três resíduos de guanina na sua extremidade 3’ para hibridizar com as terminações de citosina nas extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA e a porção de extremidade 5’ compreende uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária, sob condições em que a porção de extremidade 3’ do oligonucleotídeo é hibridizada às terminações de citosina; (e) estender as extremidades 3’ formadas em terminação dos primeiros filamentos de cDNA para gerar uma seqüência adicional complementar ao oligonucleotídeo usando a transcriptase reversa, em que o oligonucleotídeo serve como um padrão na reação de extensão, por meio da qual os primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo são prolongados; e (f) realizar uma amplificação dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo gerados a partir da etapa (e) que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde ao mesmo primeiro iniciador e oligonucleotídeo como usados nas etapas (a) e (d), respectivamente ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponda a cada porção de extremidade 5’ do primeiro iniciador e oligonucleotídeo usados nas etapas (a) e (d), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, respectivamente, por meio das quais os produtos de amplificação dos filamentos de cDNA de comprimento completo complementares aos mRNAs são gerados.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza em princípio os presentes métodos para a amplificação da seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida. Além disso, o ACP descrito acima em que a porção de extremidade 3’ tem uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA é em princípio idêntico ao primeiro iniciador para o presente método durante a 3’-RACE. Além disso, o oligonucleotídeo para formar um par ou pares de base com a terminação de citosina e o par de iniciadores usados na etapa (f) são em princípio idênticos àqueles para a 5’ - RACE desta invenção debatida acima.

Uma representação esquemática para amplificar moléculas de cDNA de comprimento completo da presente invenção é ilustrada na FIG. 5. O uso de ACP significantemente simplifica e melhora as tecnologias convencionais com respeito à amplificação de cDNAs de comprimento completo como descrito acima. A característica vital do método objeto é ser livre dos problemas secundários que surgem dos iniciadores usados nos métodos convencionais. Conseqüentemente este método aqui descrito pode ser mais eficaz, mais fácil, menos intensivo em trabalho e mais reprodutível do que os métodos convencionais.

Ainda em um outro aspecto desta invénção, é fornecido um kit para amplificar um cDNA de filamento duplo de comprimento completo complementar ao mRNA, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima (incluindo o iniciador de oligonucleotídeo dT, o oligonucleotídeo para formar um par ou pares de base com a terminação de citosina, o(s) iniciador(es) usado(s) na etapa (f)). De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreendem um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do iniciador e oligonucleotídeo usados nas etapas (a) e (d), respectivamente; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar as reações de PCR tais como tampões, DNA polimerase, cofatores da DNA polimerase e desoxirribonucleotídeos-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a Atividade de DNA polimerase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usados em uma dada reação podem ser facilmente determinadas pelo técnico habilitado tendo o benefício da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos. VI. Aplicação para amplificar cDNA enriquecido em 5’ Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para amplificar uma população de cDNAs de filamento duplo enriquecidos em 5’ que compreende regiões de cDNA que corresponde às regiões de extremidade 5’ de mRNAs, em que o método compreende transcrever de modo reverso o mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP usada para a síntese de cDNA é um tendo na sua porção de extremidade 3’ pelo menos seis seqüências de nucleotídeo aleatórias.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método que compreende: (a) contactar os mRNAs com um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra, em que a porção de extremidade 3’ do primeiro iniciador tem pelo menos seis seqüências de nucleotídeo aleatórias; (b) realizar as etapas (b)-(e) do método para amplificar uma população de cDNAs de filamento duplo de comprimento completo, por meio das quais primeiros filamentos de cDNA enriquecidos em 5’ são prolongados; (c) realizar uma amplificação dos primeiros filamentos de cDNA enriquecidos em 5’ gerados a partir da etapa (b) que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponda a cada porção de extremidade 5’ do iniciador e o oligonucleotídeo usado nas etapas (a) e (b), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ dos primeiros filamentos de cDNA enriquecidos em 5’, respectivamente, por meio da qual os produtos de amplificação dos filamentos de cDNA enriquecidos em 5’ são gerados.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza em princípio os presentes métodos para a amplificação da seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida. Além disso, o oligonucleotídeo para formar um par ou pares de base com a terminação de citosina e o par de iniciadores usado na etapa (c) são em princípio idênticos àqueles para a 5’ - RACE desta invenção debatida acima.

Uma representação esquemática para o método para amplificar cDNAs de filamento duplo enriquecidos em 5’ complementares aos mRNAs é ilustrada na FIG. 6. “cDNAs enriquecidos em 5”’ refere-se a uma porção significante dos constituintes de cDNA que contém a informação de seqüência de nucleotídeo da extremidade 5’ dos mRNAs a partir da qual os cDNAs são derivados. A fórmula do primeiro iniciador é idêntica à fórmula (1) em que a porção de extremidade 3’ compreende uma seqüência aleatória de nucleotídeo. Em uma forma de realização preferida, a porção de extremidade 3’ do primeiro iniciador usado na etapa (a) contém pelo menos seis desoxirribonucleotídeos aleatórios. Em uma forma de realização preferida, a porção de extremidade 5’ do primeiro iniciador usada na etapa (a) pode incluir uma seqüência que é reconhecida por uma endonuclease de restrição.

Os métodos convencionais requerem mais etapas para amplificar as moléculas de cDNA enriquecidas em 5’ complementares às moléculas de mRNA do que o método objeto por que os métodos convencionais usam os iniciadores convencionais que não têm a função de controlar o anelamento do iniciador. Ao contrário, este método objeto é consideravelmente um método simples e eficaz devido à função de regular o anelamento do iniciador gerado pelo efeito de um grupo de resíduo de base universal no ACP.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para amplificar cDNAs de filamento duplo enriquecidos em 5’ complementares aos mRNAs, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima (o primeiro iniciador, o oligonucleotídeo para formar um par ou pares de base com a terminação de citosina). De acordo com uma forma de realização desta invenção, estes kits ainda compreendem um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do iniciador e oligonucleotídeo usados nas etapas (a) e (b), respectivamente; no caso em que a porção de extremidade 5’ compreende a seqüência iniciadora universal, é mais preferido que o kit compreenda os iniciadores universais. Os presentes kits podem opcionalmente incluir os reagentes requeridos para realizar as reações de PCR tais como tampões, DNA polimerase, cofatores da DNA polimerase e desoxirribonucleotídeo-5’-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade de DNA polimerase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar as reações de controle positiva e negativa. Quantidades ótimas de reagentes a serem usados em uma dada reação podem ser facilmente determinadas pelo técnico habilitado tendo o beneficio da divulgação atual. Os kits, tipicamente, são adaptados para conter em embalagens ou compartimentos separados os constituintes anteriormente descritos.

VII. Aplicação para a Impressão Digital de DNA ou RNA

Esta aplicação usando o ACP da invenção objeto pode fornecer um método melhorado para detectar polimorfismos no DNA genômico (impressão digital do DNA) ou para detectar a expressão de gene diferencial no mRNA (impressão digital do RNA).

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para produzir uma impressão digital de DNA do gDNA, em que o método compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência arbitrária de nucleotídeo substancialmente complementar aos sítios no gDNA.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da impressão digital do DNA, que é um conjunto de segmentos de DNA separados característicos do genoma, a partir do gDNA em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o iniciador ou o par de iniciadores de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que cada iniciador tem na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência arbitrária de nucleotídeo substancialmente complementar aos sítios no gDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o iniciador ou o par de iniciadores anela ao gDNA, por meio das quais o conjunto de segmentos de DNA separados caracterizados como uma impressão digital de DNA é produzido; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do conjunto de segmentos de DNA separados gerado a partir da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo iniciador ou par de iniciadores como usados na etapa (a) ou um iniciador ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponda a cada porção de extremidade 5’ do iniciador ou par de iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que o iniciador ou cada um dos pares de iniciadores anelem às seqüências de extremidades 3’ e 5’ do conjunto de segmentos de DNA separados gerado a partir da etapa (a), respectivamente, por meio da qual o conjunto de segmentos de DNA separado é re-amplificado.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para produzir uma impressão digital de RNA de uma amostra de mRNA, em que o método compreende transcrever de modo reverso e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs. Preferivelmente, o iniciador de acordo com a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência arbitrária de nucleotídeo substancialmente complementar aos sítios nos filamentos de cDNA gerados a partir da transcrição reversa e/ou um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA dos mRNAs.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) contactar a amostra de mRNA com um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que o primeiro iniciador tem uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA da amostra de mRNA para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso a amostra de mRNA à qual o primeiro iniciador hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares à amostra de mRNA à qual o primeiro iniciador hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio da população de primeiros filamentos de cDNA gerados a partir da etapa (b) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador ou par de iniciadores de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que cada iniciador tem na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência arbitrária de nucleotídeo substancialmente complementar aos sítios nos primeiros filamentos de cDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o iniciador ou par de iniciadores anela à amostra de mRNA, por meio da qual um conjunto de segmentos de cDNA separados caracterizados como uma impressão digital de RN A é produzido; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio do conjunto de segmentos de cDNA separados gerados a partir da etapa (c) em uma segunda temperatura de anelamento que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo iniciador ou par de iniciadores como usados na etapa (c) ou um iniciador ou par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponda a cada porção de extremidade 5’ do iniciador ou par de iniciadores usados na etapa (c), sob condições em que o iniciador ou cada um do par de iniciadores anele às seqüências de extremidades 3’ e 5’ do conjunto de segmentos de cDNA separados gerados a partir da etapa (c), respectivamente, por meio da qual o conjunto de segmentos de cDNA separado é re-amplificado.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza em princípio os presentes métodos para a amplificação da seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida. Além disso, a impressão digital do RNA em princípio segue o presente método para detectar a complementaridade do DNA ao mRNA diferencialmente expresso. O termo “DNA genômico” como aqui usado refere-se a uma população de DNA que compreende o componente genético completo de uma espécie. Assim, o DNA genômico compreende o conjunto completo de genes presentes em uma espécie pré selecionada. O conjunto completo de genes em uma espécie é também aludido como genoma. O termo “impressão digital” de DNA ou RNA como aqui usado refere-se a um conjunto de produtos de amplificação de DNA separados característicos de um genoma ou um conjunto de segmentos de cDNA separados característicos de uma amostra de mRNA, respectivamente.

Nas impressões digitais pela PCR arbitrariamente preparadas anteriores, chamadas de AP-PCR, iniciadores arbitrários curtos ou longos foram usados sob condições não severas para 2 a 5 ciclos iniciais de amplificação pela PCR por que uma temperatura de anelamento baixa é requerida para se obter a iniciação arbitrária, tal que uma porção significante de fragmentos isolados não seja ainda reprodutível embora a amplificação eficaz se processe nos ciclos seguintes sob condição de severidade alta.

Ao contrário da AP-PCR, a PCR com base no ACP para a impressão digital aumenta a especificidade de anelamento do iniciador durante a PCR devido à função de um grupo de resíduo de base universal posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP, em que o grupo de resíduo de base universal restringe o sítio de anelamento à porção de extremidade 3’ do ACP e também permite que esta porção de extremidade 3’ anele a uma temperatura de anelamento relativamente alta. Assim, a PCR com base no ACP para a impressão digital elimina completamente produtos positivos falsos e significantemente aumenta a reprodutibilidade.

Em uma forma de realização preferida, o ACP contém uma seqüência arbitrária na porção de extremidade 3’ com pelo menos 6 nucleotídeos no comprimento. Mais preferivelmente, a porção de extremidade 3’ contém de 8 a 15 nucleotídeos no comprimento, o mais preferivelmente, de cerca de 10 nucleotídeos no comprimento.

Um único ACP ou um par de ACPs podem ser usados para detectar polimorfismos na impressão digital do DNA. Preferivelmente, um par do ACP é usado para a impressão digital do DNA por que um par de ACPs produz mais produtos do que um único ACP arbitrário.

Um exemplo da impressão digital do DNA usando ACP é conduzido por dois estágios de amplificações pela PCR sob as seguintes condições: as reações de amplificação são realizadas sob condições de severidade baixa por dois ciclos da PCR do primeiro estágio que compreende anelamento, estender e desnaturar a reação; a mistura de reação contendo DNA genômico, o tampão de reação de PCR, MgCb, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), um par dos ACPs é pré aquecida, a Taq polimerase é adicionada na mistura de reação; as reações de PCR são realizadas, seguidas pela desnaturação do produto de amplificação; depois da reação completa da PCR do primeiro estágio, o iniciador pré selecionado arbitrário JYC4 que corresponde à porção de extremidade 5’ dos ACPs é adicionado à mistura de reação e depois a amplificação pela PCR de segundo estágio é conduzida.

Deve ser mencionado que uma concentração apropriada do ACP é usada para produzir a impressão digital do DNA. Se a quantidade do ACP é muito baixa, os produtos amplificados resultantes de PCR não são reprodutíveis. Ao contrário, a quantidade em excesso do ACP gera produtos secundários tais como sujidade de DNA durante a PCR. Em uma forma de realização preferida, a concentração do ACP está entre cerca de 0,1 μΜ e 2 μΜ. O mais preferivelmente, a concentração do ACP é de cerca de 1,4 μΜ.

Em uma forma de realização preferida, a concentração do iniciador que corresponde à porção de extremidade 5’ dos ACPs está entre cerca de 0,1 μΜ e 2 μΜ, o mais preferivelmente, cerca de 0,8 μΜ.

As amostras de DNA genômico e mRNA podem ser obtidas de uma ampla variedade de biomateriais e condições. Por exemplo, elas podem ser obtidas de plantas, animal (ser humano) e micróbios e de organismos individuais diferentes.

Os produtos amplificados podem ser analisados pela eletroforese em gel. Em uma forma de realização, os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografía ou métodos de detecção não radioativos tais como o fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et a/., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996).

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para produzir uma impressão digital de DNA pelo uso de gDNA ou mRNA, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima. As descrições dos kits para a amplificação de seqüência de ácido nucléico e para detectar a complementaridade de DNA para mRNA diferencialmente expresso desta invenção podem ser aplicadas ao presente kit. VIII. Aplicação para a Identificação de Segmento de Homologia Conservada em Famílias de Multigene Esta aplicação usando a ACP da invenção objeto também pode fornecer um método melhorado para a identificação de segmento de homologia conservada em famílias de multigene.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para identificar segmentos de homologia conservada em uma família de multigene a partir de uma amostra de mRNA, em que o método compreende transcrever de modo reverso e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso ou uma seqüência degenerada que codifica a seqüência de aminoácido de um segmento de homologia conservada nos filamentos de cDNA gerados a partir da transcrição reversa e/ou um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poli A dos mRNAs.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) contactar a amostra de mRNA com um primeiro iniciador de qualquer uma das reivindicações de 1 a 29, em que o primeiro iniciador tem uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às terminações poliA da amostra de mRNA para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso a amostra de mRNA à qual o primeiro iniciador hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares à amostra de mRNA à qual o primeiro iniciador hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio da população de primeiros filamentos de cDNA gerados a partir da etapa (b) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso ou uma seqüência degenerada que codifica a seqüência de aminoácido de um segmento de homologia conservada nos primeiros filamentos de cDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o segundo iniciador anela à seqüência de consenso ou seqüência degenerada de primeiros filamentos de cDNA, por meio da qual os segmentos de cDNA da extremidade 3’ tendo a seqüência de consenso ou seqüência degenerada são gerados; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio dos segmentos de cDNA da extremidade 3’ gerados a partir da etapa (c) em uma segunda temperatura de anelamento que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (a) e (c) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (a) e (c), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ de segmentos de cDNA da extremidade 3’, respectivamente, por meio das quais a os seguimentos de cDNA de homologia conservada da extremidade 3’ são amplificados.

Esta forma de realização específica segue em princípio, o presente método durante 3’ RACE como debatido anteriormente exceto para o segundo iniciador usado.

Em uma outra forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar as etapas de (a)-(e) do método para amplificar uma população cDNA de filamento duplo de comprimento completo, por meio das quais os filamentos de cDNA de comprimento completo são gerados; (b) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo obtidos a partir da etapa (a) em uma primeira temperatura de anelamento, que compreende as etapas de: (i) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um primeiro iniciador que compreende uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar às seqüências de extremidade 3’ dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo sob condições em que o primeiro iniciador anele aos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, sob condições em que o primeiro iniciador anele às extremidades 3’ dos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, por meio das quais segundos filamentos de DNA de comprimento completo são gerados; e (ii) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um segundo iniciador de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso ou uma seqüência degenerada que codifica a seqüência de aminoácido de um segmento de homologia conservada nos segundos filamentos de DNA de comprimento completo para hibridizar com ela, sob condições em que o segundo iniciador anela à seqüência de consenso ou seqüência degenerada de segundos filamentos de DNA de comprimento completo, por meio das quais os segmentos de cDNA da extremidade 5’ tendo a seqüência de consenso ou seqüência degenerada são gerados; e (c) realizar uma amplificação de segundo estágio dos segmentos de cDNA da extremidade 5’ gerados a partir da etapa (b) em uma segunda temperatura de anelamento que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (b)-(i) e (b)-(ii), respectivamente ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (b)-(i) e (b)-(ii), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ dos segmentos de cDNA da extremidade 5’, respectivamente, por meio das quais os segmentos de cDNA de homologia conservada da extremidade 5’ são amplificados.

Esta forma de realização específica segue em princípio, o presente método para a 5’ RACE como debatida anteriormente exceto para o segundo iniciador usado.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para identificar segmentos de homologia conservada em uma família de multigene a partir do gDNA, em que o método compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso ou uma seqüência degenerada que codifica a seqüência de aminoácido de um segmento de homologia conservada no gDNA.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos segmentos de homologia conservada do gDNA em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o iniciador ou o par de iniciadores de qualquer um dos ACPs descritos acima, em que cada iniciador tem na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso ou uma seqüência degenerada que codifica a seqüência de aminoácido de um segmento de homologia conservada no gDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o iniciador ou o par de iniciadores anela à seqüência de consenso ou seqüência degenerada de gDNA, por meio da qual os segmentos de DNA genômico tendo a seqüência de consenso ou a seqüência degenerada são gerados; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio dos segmentos de DNA genômico gerados a partir da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo iniciador ou par de iniciadores como usados na etapa (a) ou um iniciador ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do iniciador ou par de iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que o iniciador ou cada um do par de iniciadores anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ dos segmentos de DNA genômico gerados a partir da etapa (a), respectivamente, por meio da qual os segmentos de genômicos de homologia conservada são amplificados. O presente método segue em princípio, o presente método para amplificar uma seqüência de ácido nucléico alvo de um DNA como debatido anteriormente exceto para o iniciador usado.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza em princípio os presentes métodos para a amplificação de seqüência de ácido nucléico anteriormente debatidos, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida. Além disso, onde um mRNA é usado como material de partida, os presentes métodos para 3’ ou 5’ RACE são em princípio aplicados aos presentes métodos para a identificação de segmentos de homologia conservada em famílias de multigene. A fórmula do ACP para a identificação de segmentos de homologia conservada em famílias de multigene é idêntica à fórmula (1) em que a porção de extremidade 3’ do ACP tem uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso em uma família de gene ou uma seqüência degenerada que codifica a seqüência de aminoácido de uma homologia conservada.

Existem dois métodos principais para o planejamento do iniciador degenerado: (a) usando os dados da seqüência de peptídeo obtidos a partir de uma proteína purificada; e (b) usando dados da seqüência da proteína de consenso dos alinhamentos de famílias de gene. Se ortólogos do gene de interesse foram clonados a partir de outros organismos ou se o gene é um membro de uma família de gene, será possível gerar alinhamentos de seqüência de proteína.

Estes podem revelar regiões apropriadas para o planejamento de iniciadores degenerados, por exemplo, a partir de seqüência de consenso de regiões altamente conservadas. As amplificações usando iniciadores degenerados podem ser algumas vezes problemáticas e podem requerer otimização. O primeiro parâmetro é a temperatura de anelamento. É importante manter a temperatura de anelamento tão alta quanto possível para se evitar a amplificação não específica extensiva e uma boa regra prática é usar 55° C como uma temperatura de partida. No geral, é difícil manter esta regra por que os iniciadores degenerados devem ser planejados com base nas seqüências de aminoácidos como uma pré condição. Entretanto, o ACP da presente invenção não tem que satisfazer esta exigência por que ele permite uma temperatura de anelamento alta tal como 65° C no segundo estágio de amplificação pela PCR independente do planejamento do iniciador.

De acordo com uma forma de realização preferida, o segundo iniciador é uma reunião de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência degenerada selecionada de uma pluralidade dos nucleotídeos que codificam a seqüência de aminoácido da seqüência de consenso. O termo “região conservada” e mais especificamente “região conservada de um gene em uma família de multigene” como aqui usado refere-se a um segmento de seqüência de nucleotídeo de um gene ou seqüência de aminoácido de uma proteína que é significantemente similar entre membros de famílias de gene. O grau de similaridade pode variar. Em alguns casos as regiões conservadas serão idênticas entre os membros da família. Em alguns casos a seqüência de nucleotídeo pode variar significantemente mas ainda codifica segmentos de aminoácido que são conservados entre os membros da família. O termo “seqüência de consenso” como aqui usado refere-se às bases mais ffeqüentemente encontradas em qualquer posição dada quando da comparação de uma quantidade grande de seqüências de nucleotídeos similares.

Altemativamente, os presentes métodos para a identificação de segmentos de homologia conservada também podem ser combinados com aqueles para detectar mRNAs diferencialmente expressos.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para identificar um segmento de homologia conservada em uma família de multigene pelo uso de mRNA ou gDNA, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima. As descrições dos kits para a amplificação da seqüência de ácido nucléico, 3’ RACE e 5’ RACE desta invenção podem ser aplicadas ao presente kit. IX. Aplicação para a Identificação de uma Variação de Nucleotídeo Esta aplicação usando o sistema ACP da invenção objeto também pode fornecer um método melhorado para identificar uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para identificar uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo, em que o método compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP é (a) um primeiro iniciador tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada em um primeiro sítio de ácido nucléico alvo, em que cada um do primeiro iniciador e do primeiro sítio compreende uma posição de interrogação que corresponde à variação de nucleotídeo, e/ou (b) um segundo iniciador tendo uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada a um segundo sítio de ácido nucléico alvo.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio para produzir um primeiro filamento de DNA complementar ao ácido nucléico alvo incluindo a variação de nucleotídeo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada em um primeiro sítio do ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, em que cada um do primeiro iniciador e do primeiro sítio compreende uma posição de interrogação que corresponde à variação de nucleotídeo, por meio da qual o primeiro filamento de DNA complementar ao ácido nucléico alvo incluindo a variação de nucleotídeo é gerado quando a posição de interrogação é ocupada pelo nucleotídeo complementar do primeiro iniciador ao seu nucleotídeo correspondente do primeiro sítio; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do primeiro filamento de DNA gerado a partir da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende as etapas: (i) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um segundo iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada era um segundo sítio do ácido nucléico alvo para hibridizar com ela sob condições em que o segundo iniciador anela ao segundo sítio do ácido nucléico alvo, por meio das quais um segundo filamento de DNA complementar ao primeiro filamento de DNA incluindo a variação de nucleotídeo é gerado; e (ii) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (a) e (b)-(i) ou um par de iniciadores cada um tendo uma seqüência hibridizadora complementar ou que corresponde às extremidades 3’ e 5’ do segundo filamento de DNA gerado a partir da etapa (b)-(i) para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ do segundo filamento de DNA, respectivamente, por meio das quais o segundo filamento de DNA que compreende o primeiro e segundo sítios do ácido nucléico alvo nas suas extremidades 3’ e 5’ é amplificado de modo que um segmento de nucleotídeo alvo curto que corresponde ao segundo filamento de DNA contendo a variação de nucleotídeo é gerado.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza em princípio os presentes métodos para a amplificação da seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida, as descrições comuns entre eles são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida.

Uma representação esquemática desta forma de realização específica para genotipagem de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) usando o novo ACP é ilustrada na FIG. 7A. A fórmula do ACP para a detecção de uma variação de nucleotídeo, é idêntica à fórmula (1) em que a sua porção de extremidade 3’ compreende uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada em um sítio do ácido nucléico alvo para hibridizar com ela contendo a variação de nucleotídeo, em que os nucleotídeos que correspondem à variação de nucleotídeo e seus nucleotídeos complementares do ACP ocupam uma posição de interrogação. O processo para esta aplicação é realizada pelas amplificações de PCR de estágio duplo usando o DNA genômico obtido a partir de amostras tais como o sangue do paciente ou um segmento curto do DNA da amostra, que inclui uma variação de nucleotídeo alvo. A amostra de nucleotídeo de interesse pode ser obtida a partir de ácido nucléico humano e um organismo que possa causar uma doença infecciosa. O método usando amplificações pela PCR de estágio duplo para detectar a genotipagem de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) basicamente segue o processo usado para amplificar uma seqüência de ácido nucléico alvo usando DNA genômico como um material de partida. Além disso, o processo para a amplificação de DNA multiplex pode ser adaptado para esta aplicação.

Usar um segmento curto do DNA da amostra incluindo uma variação de nucleotídeo alvo como um material de partida para o processo acima, é preferível que o segmento curto alvo seja pré amplificado antes da etapa (a) usando um par de iniciadores em que cada um tem uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar ao DNA da amostra para hibridizar com ela. Além disso, mais do que um segmento de nucleotídeo alvo cada um incluindo um SNP pode ser preparado pela amplificação de DNA multiplex como descrito na Aplicação II a ser usado como um material de partida na invenção objeto para triar SNP múltiplo. O primeiro ACP usado na etapa (a) para a detecção de uma base polimórfica é um ACP específico de alelo que contém uma posição de interrogação dentro da sua porção de extremidade 3’ ocupada por um nucleotídeo complementar aos nucleotídeos correspondentes da variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo. Preferivelmente, a posição de interrogação do primeiro iniciador está no meio da sua porção de extremidade 3’. Em um forma de realização mais preferida, a posição de interrogação do ACP específico de alelo está dentro de cerca de 10 bases do nucleotídeo da extremidade 3’. Mais vantajosamente, a posição de interrogação do ACP específico de alelo está dentro de cerca de 6 bases do nucleotídeo da extremidade 3’ do ACP específico de alelo. Em uma outra forma de realização preferida, a posição de interrogação do ACP específico de alelo está localizada dentro das posições 4 e 6 a partir do nucleotídeo da extremidade 3’. O mais preferivelmente, a posição de interrogação do ACP específico de alelo está localizada na posição 5 a partir do nucleotídeo da extremidade 3’. O termo “nucleotídeo da extremidade 3”’ aqui usado refere-se a um nucleotídeo que está posicionado na extremidade 3’ do ACP.

Em uma outra forma de realização, a porção de extremidade 3’ do ACP específico de alelo usado na etapa (a) contém pelo menos 6 nucleotídeos no comprimento, que é uma exigência mínima de comprimento para o anelamento do iniciador. Preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ é de cerca de 8 a 20 nucleotídeos no comprimento. O mais preferivelmente, a seqüência da porção de extremidade 3’ é de cerca de 10 nucleotídeos no comprimento incluindo uma posição de interrogação.

Em uma forma de realização, pelo menos um desemparelhamento artificial também pode ser colocado dentro da porção de extremidade 3’ do ACP usando a base universal ou análogo não discriminatório que minimamente se liga por hidrogênio com todas as quatro bases sem o rompimento estérico do duplex DNA. Embora a posição do desemparelhamento artificial possa variar dependendo dos planejamentos experimentais, é preferido que o nucleotídeo de ligação inespecífica seja substancialmente adjacente à posição de interrogação do primeiro iniciador.

Em uma forma de realização preferida, o primeiro ou segundo iniciadores compreendem pelo menos um nucleotídeo com um rótulo para detecção ou isolação.

De acordo com uma forma de realização preferida, o primeiro filamento de DNA incluindo variação de nucleotídeo na etapa (a) é gerado por r um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador. E preferido que o segundo filamento de DNA incluindo a variação de nucleotídeo na etapa (b)-(i) seja gerado por um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador. Preferivelmente, o segundo filamento de DNA incluindo a variação de nucleotídeo na etapa (b)-(ii) é amplificado por pelo menos 5 ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador.

Em uma outra forma de realização específica desta invenção usando fragmento de filamento de DNA curto amplificado contendo a variação de nucleotídeo, é fornecido o método usando duas amplificações individuais de uma primeira e uma segunda amplificações em que a segunda amplificação é realizada usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar a primeira amplificação para produzir um fragmento de filamento de DNA curto contendo a variação de nucleotídeo entre as suas extremidades compreendendo pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores cada iniciador compreendendo uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada em um sítio do ácido nucléico alvo sob condições em que a variação de nucleotídeo é posicionada entre as seqüências pré selecionadas, em que pelo menos um iniciador do conjunto de iniciadores é qualquer um dos ACPs descritos acima tendo na sua porção de extremidade 3’ a seqüência hibridizadora, por meio da qual o fragmento de filamento de DNA curto contendo a variação de nucleotídeo entre as suas extremidades é amplificado; (b) realizar uma amplificação de primeiro estágio da segunda amplificação para produzir um primeiro filamento de DNA complementar ao fragmento de filamento de DNA curto incluindo a variação de nucleotídeo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um primeiro iniciador de qualquer um dos ACPs descritos acima tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada em um primeiro sítio do ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, em que cada um do primeiro iniciador e do primeiro sítio compreende uma posição de interrogação que corresponde à variação de nucleotídeo, por meio da qual o primeiro filamento de DNA complementar ao ácido nucléico alvo incluindo a variação de nucleotídeo é gerado quando a posição de interrogação é ocupada pelos nucleotídeos complementares do primeiro iniciador aos seus nucleotídeos correspondentes do primeiro sítio; e (c) realizar uma amplificação de segundo estágio da segunda amplificação do primeiro filamento de DNA gerado a partir da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um par de iniciadores em que entre o par de iniciadores um é o mesmo que o iniciador de qualquer um dos ACPs usados na etapa (a) o outro é o mesmo que o primeiro iniciador usado na etapa (b) ou um par de iniciadores cada um tendo uma seqüência hibridizadora complementar ou que corresponde às extremidades 3’ e 5’ do primeiro filamento de DNA gerado a partir da etapa (b) para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ do primeiro filamento de DNA, respectivamente, por meio das quais o primeiro filamento de DNA é amplificado de modo que um segmento de nucleotídeo alvo curto que corresponde ao primeiro filamento de DNA contendo a variação de nucleotídeo é gerado.

Uma representação esquemática de uma outra forma de realização específica para a genotipagem de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) usando o novo ACP é ilustrada na FIG. 7B. Visto que esta forma de realização específica é realizada em uma maneira similar à forma de realização acima, as descrições comuns entre elas são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida. O presente método pode ser aplicado a uma variedade de variações de nucleotídeos incluindo polimorfismo de nucleotídeo único e mutação pontual (substituição, supressão e inserção).

Os produtos amplificados podem ser analisados pela eletroforese em gel. Em uma forma de realização, os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et ai, 1997; Kociok et ai, 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et ai 1993; Ito et ai 1994; Luehrsen et ai, 1997; Smith et ai, 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et ai, 1992; Tagle et ai, 1993; Rosok et ai, 1996).

Os produtos amplificados gerados pela amplificação de DNA multiplex para a triagem de SNP múltipla pode ser comparada através da separação por tamanho dos produtos. A comparação da separação por tamanho é também realizada pela eletroforese através de uma matriz de gel de agarose ou matriz de gel de poliacrilamida ou seqüenciamento. Os produtos também podem ser detectados pelo uso de iniciadores de oligonucleotídeo fluorescentemente rotulados para a análise automática. O termo “posição de interrogação” como aqui usado refere-se à localização de uma base de nucleotídeo específica de interesse dentro de um ácido nucléico alvo. Por exemplo, na análise de SNPs, a “posição de interrogação” no ácido nucléico alvo está na posição que pode ser diferente do tipo selvagem. A posição de interrogação também inclui a localização da seqüência de nucleotídeo de um iniciador que é complementar a uma posição de interrogação do ácido nucléico alvo. A posição de interrogação do ácido nucléico alvo é oposta à posição de interrogação do iniciador, quando o iniciador é hibridizado com o ácido nucléico alvo. O termo “polimorfismo” como aqui usado refere-se à presença de duas ou mais seqüências genômicas alternativas ou alelos entre ou misturado com genomas ou indivíduos diferentes. “Polimórfico” refere-se à condição em que duas ou mais variantes de uma seqüência genômica específica podem ser encontradas em uma população. Um “sítio polimórfico” é o local em que a variação ocorre. Um polimorfismo de nucleotídeo único ou SNP, é uma variante de par de base única, tipicamente da substituição de um nucleotídeo por um outro nucleotídeo no sítio polimórfico. A supressão de um único nucleotídeo ou a inserção de um único nucleotídeo, também dá origem a polimorfismos de nucleotídeo único. Tipicamente, entre genomas diferentes ou entre indivíduos diferentes, o sítio polimórfico pode ser ocupado por dois nucleotídeos diferentes. O termo “alelo” como aqui usado refere-se a um membro específico de uma coleção de variantes de seqüência que ocorrem naturalmente (detectáveis dentro de uma população de indivíduos) em um local ou marcador genômico específico.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para identificar uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento (incluindo o primeiro e segundo iniciadores) descritos acima. As descrições dos kits para a amplificação da seqüência de ácido nucléico desta invenção podem ser aplicadas ao presente kit. X. Aplicação para Mutagênese Esta aplicação usando o ACP da invenção objeto também pode fornecer um método melhorado para a mutagênese. A PCR com base no ACP fornece uma ferramenta excelente para a mutagênese, incluindo a supressão ou inserção de seqüências, a alteração de um ou de uns poucos nucleotídeos específicos e a mutação aleatória de seqüência de nucleotídeo.

Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para a mutagênese em um ácido nucléico alvo, que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ser derivado de qualquer um dos ACPs descritos acima. Preferivelmente, o iniciador tendo a estrutura do ACP é um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo, em que a seqüência hibridizadora tem uma seqüência de nucleotídeo responsável pela mutagênese.

Em uma forma de realização específica desta invenção, é fornecido o método usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da seqüência de ácido nucléico alvo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores de qualquer um dos ACPs descritos acima cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, em que a seqüência hibridizadora tem pelo menos um nucleotídeo de ligação inespecífica para gerar a mutação direcionada a sítio, sob condições em que o iniciador ou par de iniciadores anela à sua seqüência de nucleotídeo alvo, por meio da qual um produto de amplificação contendo o sítio de mutação direcionada a sítio é gerado; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do produto de amplificação gerado a partir da etapa (a) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (a) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o produto de amplificação contendo o sítio de mutação direcionada a sítio é re-amplificado.

Esta forma de realização específica diz respeito à mutagênese direcionada a sítio.

Visto que esta aplicação usando o ACP desta invenção utiliza em princípio os presentes métodos para a amplificação de seqüência de ácido nucléico anteriormente debatida, as descrições comuns entre elas são omitidas de modo a se evitar a complexidade deste relatório descritivo que leva à multiplicidade indevida. A fórmula do ACP para a mutagênese por PCR é idêntica à fórmula (1) em que a porção de extremidade 3’ compreende uma seqüência para a mutagênese direcionada a sítio ou para a mutação aleatória.

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para a mutagênese em um ácido nucléico alvo, que compreende o iniciador de controle de anelamento ou o conjunto de iniciadores de controle de anelamento descritos acima. As descrições dos kits para a amplificação de seqüência de ácido nucléico desta invenção pode ser aplicado ao presente kit. XI. Outras Aplicações O ACP da invenção objeto também pode ser útil em uma variedade de processos que envolve amplificações de ácido nucléico, particularmente, a PCR. Por exemplo, os processos incluem a amplificação preparada por oligonucleotídeo misto de cDNA, PCR de faixa longa, PCR linear, PCR inversa, PCR quantitativa, PCR de contato, seqüenciamento, PCR in situ, PCR de vetorette e PCR entrelaçada assimétrica térmica. Os procedimentos gerais para estes métodos pode ser encontrados em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e M. J. McPherson, et al., PCR, Springer-Verlag Nova Iorque Inc., N.Y. (2000).

Portanto, a presente invenção abrange todos os usos do iniciador de acordo com o ACP para o processo que envolve a amplificação de ácido nucléico, particularmente a PCR. O ACP desta invenção é significantemente eficaz e amplamente acessível para a aplicações com base na amplificação de ácido nucléico. Também, vários problemas relacionados com a especificidade de anelamento do iniciador que permanece nas técnicas de amplificação de ácido nucléico anteriores podem ser fundamentalmente resolvidos pelo ACP e pelos métodos da presente invenção. Os benefícios principais a serem obtidos a partir do uso do ACP durante a amplificação de ácido nucléico são como segue: (a) visto que a presença de uma porção reguladora posicionada entre as porções de extremidade 3’ e 5’ restringe o anelamento da porção do iniciador à porção de extremidade 3’ sob condições tais que a porção de extremidade 3’ anela com o padrão, a seqüência de anelamento de um iniciador pode ser precisamente controlada, o que toma possível planejar um iniciador capaz de ter apenas um número desejado de seqüência anelada (ou possível planejar um iniciador capaz de controlar uma porção de anelamento r desta). E particularmente útil quando uma porção de anelamento de um iniciador deva ser limitada (por exemplo, genotipagem de SNP, triagem de microssérie de DNA e detecção de genes diferencialmente expressos); (b) visto que a presença da uma porção reguladora posicionada entre as porções de extremidade 3’ e 5’ interrompe o anelamento da porção de extremidade 5’ com o padrão sob condições tais que a porção de extremidade 3’ anela com o padrão, eventualmente a porção de extremidade 5’ não envolvida no anelamento fornece a porção de extremidade 3’ com a especificidade de anelamento do iniciador; (c) a especificidade de anelamento do iniciador é altamente sensível o bastante para detectar mesmo uma má combinação de base única. É particularmente útil para a genotipagem de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs); (d) o ACP é capaz de fornecer um iniciador com uma tolerância alta em “parâmetros de procura de iniciador” para o planejamento de iniciador tais como o comprimento do iniciador, a temperatura de anelamento, o teor de GC e o comprimento de produto de PCR; (e) o ACP fornece amplificações de ácido nucléico de estágio duplo que permitem que o produto amplificado seja excluído da amplificação não específica; (f) a eficiência de amplificação de ácido nucléico é aumentada, o que toma mais fácil detectar mRNAs raros; e (g) a reprodutibilidade da amplificação de produtos de ácido nucléico é aumentada, o que economiza uma enorme quantidade de tempo e custo.

Tanto quanto a tecnologia de amplificação de ácido nucléico tal como a PCR tem influenciado o campo biotecnológico, o uso de ACP fiindamentalmente altera os princípios dos métodos de amplificação de ácido nucléico correntemente existentes, como mencionado acima, pela exibição de aplicabilidade ilimitada e têm atualizado significantemente a mesma de uma vez. Em conseqüência, o ACP e suas várias aplicações aqui descritas fornecem um ponto decisivo para abrir uma era biotecnológica nova desde a introdução da tecnologia de amplificação de ácido nucléico.

Os seguintes exemplos específicos são intencionados a serem ilustrativos da invenção e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

Na divulgação experimental que segue, as seguintes abreviações se aplicam: M (molar), mM (milimolar), μΜ (micromolar), g (grama), pg (microgramas), ng (nanogramas), 1 (litros), ml (mililitros), μΐ (microlitros), °C (grau Centígrado); Promega (Promega Co., Madison, USA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Paio Alto, USA); Roche (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha); QIAGEN (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).

Os iniciadores usados na invenção objeto são apresentados na Tabela 1.

EXEMPLO 1: Avaliação do Efeito da Base Universal no ACP O efeito dos resíduos de base universal posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP foi avaliado pela RT-PCR usando tecidos de concepto de camundongo. O RNA total foi isolado dos conceptos inteiros de camundongo da cepa ICR nos dias de 4,5, 11,5 e 18,5 durante o período de gestação usando o Tri-reagent (Sigma) ou o método de LiCl/Uréia (Hogan et al., 1994) como anteriormente descrito (Chun et al., 1999; Hwang et al., 2000). Dois experimentos individuais de amplificações de cDNA usando ACP foram realizados para examinar o efeito da base universal, particularmente, resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP como segue: A. O efeito dos resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP em comparação com o ACP e o iniciador convencional não contendo um grupo desoxiinosina; B. O efeito de resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP em associação com a alteração do número de desoxiinosina.

Estes experimentos foram conduzidos com base nas seguintes hipóteses: (i) a presença dos resíduos de base universal que têm Tm mais baixa do que outras porções no ACP devido às suas interações de ligação de hidrogênio mais fracas no emparelhamento de base não estariam envolvidas no anelamento com o ácido nucléico padrão sob as condições em que a porção de extremidade 3’ do ACP anela a um sítio do padrão em uma primeira temperatura de anelamento. (ii) a presença da pelo menos um resíduo de base universal entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP seria capaz de interromper o anelamento da porção de extremidade 5’ e restringir um anelamento da porção iniciadora à extremidade 3’. (iii) a porção de extremidade 3’ do ACP atuaria apenas como uma porção de anelamento com o padrão durante a PCR. (iv) a porção de extremidade 3’ de dT-ACP que é dTi0 compreendendo 10 nucleotídeos T também tem Tm muito baixa para ligar o ácido nucléico padrão. (v) conseqüentemente, o dTi0-ACP não produz quaisquer produtos de PCR sob temperatura de anelamento alta. A. O efeito de resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP em comparação com o ACP com o iniciador não contendo um grupo desoxiinosina (a) Síntese de primeiro cDNA de filamento ID NO: 29) ou dT10-ACPl 5’ GCTTGACTACGATACTGTGCGAIfflITTTTTTTTTT - 3’ (SEQ ID NO: 30) foram usados como um iniciador de síntese de cDNA.

Três microgramas de RNA total e 2 μΐ de dTi0-JYC2 a 10 μΜ ou dTio-ACPl a 10 μΜ foram combinados em um volume final de 20 μΐ. A solução foi aquecida a 65° C durante 10 minutos, extinta em gelo e microcentrifugada para coletar o solvente no fundo. Os seguintes componentes foram seqüencialmente adicionados ao iniciador anelado/padrão em gelo: 0.5 μΐ (40 unidades/μΐ) de inibidor RNasin ribonuclease (Promega), 4 μΐ de tampão de reação 5x (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT; Promega), 5 μΐ de cada mistura de desoxinucleotídeos a 2 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e 1 μΐ da transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (M-MLV) (200 unidades/μΐ; Promega). Os 20 μΐ de mistura de reação foram incubados a 37° C durante 90 minutos, microcentrifugados e colocados em gelo durante 2 minutos. A reação foi interrompida pela incubação a 94° C durante 2 minutos. (b) Amplificação de cDNA usando ACPs O dT10-ACPl foi usado para examinar o efeito de um grupo desoxiinosina posicionado entre as porções de extremidade 3’ e 5’ durante a PCR. O dTi0-JYC2 não contendo um grupo desoxiinosina foi usado como um controle. O ACP10 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCC ATCGACC - 3’ (SEQ ID NO: 13) foi usado como o iniciador 5’ para este experimento. A amplificação pela PCR foi conduzida em um volume de 50 μΐ contendo 50 ng do primeiro cDNA de filamento, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x, 1 μΐ de iniciador 5’ a 10 μΜ (ACP10), 1 μΐ de iniciador 3’ a 10 μΜ (dTio-JYC2 ou dTjo-ACPl), 3 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ). As reações de PCR foram conduzidas sob as seguintes condições: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 1 minuto, 54° C durante 1 minuto e 72° C durante 1 minuto; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % seguida por tingimento com brometo de etídio.

Como um resultado, a FIG. 8 mostra que o dTi0-ACPl contendo um grupo desoxiinosina quase não produziu nenhum produto (linhas 4-6), ao passo que o dTi0-JYC2 não contendo um grupo desoxiinosina produziu uma pluralidade de produtos de cDNA amplificados (linhas 1-3). Compatível com a nossa hipótese, os resultados claramente indicam que o grupo desoxiinosina posicionado entre as porções da extremidade 3’ e 5’ afeta o anelamento das porções de extremidade 3’ e 5’ do dTi0-ACP com o cDNA padrão sob tal temperatura de anelamento alta, que resulta em nenhum produto como estabelecido na hipótese acima. B. O efeito de resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ do ACP em associação com a alteração do número de desoxiinosina (a) Síntese de primeiro cDNA de filamento O primeiro cDNA de filamento foi sintetizado a partir do RNA total de conceptos de camundongo usando dTio-JYC2 como um iniciador de síntese de cDNA como acima. (b) Amplificação de cDNA usando ACPs Este experimento usou quatro ACPs cada um compreendendo número diferente de resíduos de desoxiinosina como segue, para examinar o efeito de resíduos de desoxiinosina posicionados entre as porções de extremidade 3’ e 5’ em associação com a alteração do número de desoxiinosina, sob uma condição de severidade particular. ACP16 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATnGCCATCGACC - 3’ (SEQID NO: 20); ACPI7 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATTfflGCCATCGACC - 3’ (SEQ IDNO: 21); ACPI8 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATDIIIIGCCATCGACC - 3’ (SEQ IDNO: 22); ACPI9 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATnmmGCCATCGACC - 3’ (SEQIDNO: 23); e CRP2I0 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATGCCATCGACC - 3’ (SEQ ID NO: 19) não contendo um grupo desoxiinosina foram usadas como um controle. O primeiro cDNA de filamento resultante gerado a partir da etapa (a), compreendendo a seqüência arbitrária pré selecionada do dTio-ACP na sua extremidade 5’, foi usado como um padrão e o iniciador JYC2 5’ -GCTTGACTACGATACTGTGCGA - 3’ (SEQ ID NO: 10) que corresponde à porção de extremidade 5’ do dT]0-ACP foi usado como 3’ iniciador. A amplificação pela PCR foi conduzida em um volume de 50 μΐ contendo 50 ng do primeiro cDNA de filamento, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x, 1 μΐ de iniciador 5’ a 10 μΜ (ACPI6, 17, 18, 19 ou CRP2I0), 1 μΐ de iniciador 3’ a 10 μΜ (JYC2), 3 μΐ de MgCl2a25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ). As reações de PCR foram compreendidas de: 5 minutos a 94° C, seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 1 minuto, 57° C durante 1 minuto e 72° C durante 1 minuto; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. Os produto amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % seguido por fingimento com brometo de etídio.

Como um resultado, a FIG. 9 mostra que o CRP2I0 não contendo quaisquer resíduos de desoxiinosina produziu uma pluralidade de produtos de cDNA amplificados, ao passo que os ACPs contendo pelo menos dois resíduos de desoxiinosina geraram a redução significante de produtos de cDNA amplificados e ainda mais, o ACP contendo oito resíduos de desoxiinosina quase não produziu nenhum produto. Compatível com a nossa hipótese, os resultados claramente indicam que o anelamento da porção de extremidade 3’ do ACP com o padrão pode ser separada da porção 5’ visto que um grupo de resíduos de desoxiinosina contíguos separam o anelamento das porções de extremidade 3’ e extremidade 5’ sob condições de alta severidade devido à propriedade da desoxiinosina tal como a sua interação de ligação de hidrogênio mais fraca no emparelhamento de base.

EXEMPLO 2: Método para Amplificar uma Seqüência de Ácido Nucléico Alvo Usando ACP O ACP da invenção objeto foi aplicado para amplificar as seqüências de nucleotídeo alvo do cDNA do gene Esxl homeobox específico da placenta de camundongo. O processo e os resultados para a amplificação das seqüências de nucleotídeo alvo do cDNA de Esxl usando ACPs são aqui descritos. O RNA total (3 μg) obtido da placenta de 18,5 dias de idade de camundongo foi usado como um material de partida. Os primeiros cDNAs de filamento foram preparados sob as mesmas condições como usadas na síntese de cDNA do Exemplo 1, exceto que 01igo-dT15 foi usado como o iniciador na síntese de primeiro cDNA de filamento. 01igo-dT15 5’ - TTTTTTTTXTTTXXX - 3’ (SEQID NO: 54) Os primeiros cDNAs de filamento resultantes foram usados como padrão para amplificar fragmentos de cDNA alvo de Esxl usando ACPs. Estes experimentos conduziram amplificações de PCR de estágio duplo, que é uma das características únicas da presente invenção.

Os iniciadores convencionais de Esxl usados no Exemplo são: EsxN7 5’ - GCCGGTTGCAGAAGCACC - 3’ (SEQ ID NO: 44);

EsxCó 5’ - GAACCAPGTTICTGAATGCC - 3’ (SEQ ID NO: 45);

EsxNl 5’ - GAATCTGAAACAACTTTCIA - 3’ (SEQ ID NO: 48);

EsxC2 5’ - GAPGCAPGGGACGAGGCACC - 3’ (SEQ ID NO: 49);

EsxN3 5’ - CGCCGCAACCCCTCCCCGCA - 3’ (SEQ ID NO: 51); e EsxC5 5’ - GATCCAPGGGACGAGGCA - 3’ (SEQ ID NO: 52).

Xrês conjuntos de iniciador, EsxN7 e EsxCó, EsxNl e EsxC2, e EsxN3 e EsxC5, foram usados no Exemplo por que eles são conhecidos como os conjuntos de iniciador que geram produtos secundários altos assim como produtos não específicos nos métodos de PCR convencionais como conhecido na técnica.

De acordo com os sistemas de PCR de alvo único, os iniciadores com temperaturas de fusão similares (Tm) devem ser escolhidos. Entretanto, um conjunto de iniciador de EsxNl (Tm 50,7° C) e EsxC2 (Tm 71,9° C) mostra cerca de 20° C de temperatura de fusão diferente entre eles e um conjunto de iniciador de EsxN3 (Tm 86,9° C) e EsxC5 (Tm 66,2° C) ambos tem temperaturas de fusão altas. Também, um conjunto de iniciador de EsxN7 (Tm 68,2° C) e EsxC6 (Tm 61,2° C), que tem temperaturas de fusão relativamente similares, são selecionados para observar o efeito do ACP. O ACP da invenção objeto foi aplicado a estes três conjuntos de iniciador convencional para demonstrar se o sistema ACP pode superar os problemas principais que surgem a partir destes conjuntos de iniciador convencionais, tais como produtos secundários e produtos não específicos.

Os seguintes ACPs compreendem as seqüências dos iniciadores convencionais acima em suas porções de extremidade 3’ e foram usados como iniciadores específicos de gene Esxl para a amplificação pela PCR de primeiro estágio: Iniciador EsxN7-ACP 5’ 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII GCCGGTTGCAGAAGCACC - 3’ (SEQID NO: 46);

Iniciador EsxC6-ACP 3’ 5’ - GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIII GAACCATGTTTCTGAATGCC - 3’ (SEQ ID NO: 47);

Iniciador EsxNl-ACP 5’ 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII GAATCTGAAACAACTTTCTA - 3’ (SEQ ID NO: 50);

Iniciador EsxC2-ACP 3’ 5’ - GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIII GATGCATGGGACGAGGCACC - 3’ (SEQ ID NO: 55);

Iniciador EsxN3-ACP 5’ 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII CGCCGCAACCCCTGCCCGCA - 3’ (SEQ IDNO: 53); e Iniciador EsxC5-ACP 3’ 5’ - GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIII GATGCATGGGACGAGGCA - 3’ (SEQID NO: 56). A seqüência da porção de extremidade 5’ dos ACPs foram servidos como seqüências iniciadoras arbitrárias pré selecionadas apenas para a amplificação pela PCR de segundo estágio: JYC2 e JYC4 5’ -GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT - 3’ (SEQ ID NO: 12).

Durante a amplificação pela PCR de primeiro estágio, o conjunto de iniciador de EsxN7-ACP e EsxC6-ACP foi usado como iniciadores 5’ e 3’, respectivamente, para gerar o fragmento de 520 pares de base do cDNA de Esxl, o conjunto de iniciador de EsxNl-ACP e EsxC2-ACP foi usado como iniciadores 5’ e 3’, respectivamente, para gerar o fragmento de 784 pares de base do cDNA de Esxl e o conjunto de iniciador de EsxN3-ACP e EsxC5-ACP foi usado como iniciadores 5’ e 3’, respectivamente, para gerar o fragmento de 483 pares de base do cDNA de Esxl.

Durante a amplificação pela PCR de segundo estágio, JYC4 e JYC2 foram usados como iniciadores 5’ e 3’ arbitrários pré selecionados, respectivamente (PROTOCOLO A). Como uma alternativa, as seqüências completas dos ACPs, ao invés dos iniciadores arbitrários pré selecionados tais como JYC4 e JYC2, podem ser usadas como iniciadores 5’ e 3’ para a amplificação pela PCR de segundo estágio nas condições de alta severidade. Neste caso, não é necessário adicionar os iniciadores arbitrários pré selecionados à mistura de reação no momento ou depois da reação de PCR do primeiro estágio (PROTOCOLO B). PROTOCOLO A: a Amplificações de PCR de estágio duplo de parada única (a) Amplificação de PCR de primeiro estágio A amplificação pela PCR de primeiro estágio foi realizada pelo método de PCR de início quente em que o procedimento é ajustar as reações completas sem a DNA polimerase e incubar os tubos no ciclador térmico para completar a etapa de desnaturação inicial a >90° C. Depois, enquanto se mantém os tubos a uma temperatura acima de 70° C, a quantidade apropriada de DNA polimerase pode ser pipetada na reação. A amplificação pela PCR de primeiro estágio foi conduzido por dois ciclos de PCR que consistem da reação de anelamento, extensão e desnaturação; a mistura de reação em um volume final de 49,5 μΐ contendo 50 ng do primeiro cDNA de filamento, 5 μΐ de tampão de reação de PCR 10 x (Promega), 5 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1,35 μΐ de 5’ ACP (1 μΜ) e 1,35 μΐ de 3’ ACP (1 μΜ) é pré aquecida a 94° C, enquanto se mantém o tubo contendo a mistura de reação a 94° C, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega) é adicionado à mistura de reação; as reações de PCR compreendem dois ciclos de 94° C durante 40 segundos, 60° C durante 40 segundos e 72° Ç durante 40 segundos; seguida pela desnaturação do produto de amplificação a 94° C. (B) Amplificação de PCR de Segundo Estágio O produto de cDNA resultante gerado pela amplificação pela PCR de primeiro estágio usando ACPs específicos de gene Esxl foi depois amplificado pelas seguintes amplificações do segundo estágio pela PCR sob temperatura de anelamento mais alta. Depois da conclusão da amplificação pela PCR de primeiro estágio, cada 1 μΐ de iniciadores arbitrários pré selecionados a 10 μΜ, JYC4 e JYC2, foi adicionado à mistura de reação obtida da amplificação pela PCR de primeiro estágio, sob temperatura desnaturante tal como a 94° C. A reação de PCR do segundo estágio foi como segue: 35 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C.

Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como tingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok etal., 1996).

Como mostrado nas FIGs. 10A-C, as amplificações pela PCR de estágio duplo de parada única para Esxl usando cada conjunto de iniciador de EsxN7-ACP e EsxC6-ACP, EsxNl-ACP e EsxC2-ACP, e EsxN3-ACP e EsxC5-ACP geraram uma faixa única que corresponde ao tamanho esperado, 520 pares de base (FIG. 10A, linha 2), 784 pares de base (FIG. 10B, linha 4) e 483 pares de base (FIG. 10C, linha 3) de fragmentos de cDNA de Esxl, respectivamente. A clonagem e a análise de sequência subseqüentes dos clones confirmam que as faixas são de fragmentos de cDNA de Esxl. Ao contrário, os conjuntos de iniciador convencionais, que contêm as seqüências que correspondem apenas às porções da extremidade 3’ de cada um dos conjuntos de ACP, produziram produtos não específicos assim como produtos secundários altos tais como sujidade de DNA (FIG. 10A, linha 1; FIG. 10B, linha 3; FIG. 10C, linhas 1 e 2). Visto que os produtos de PCR usando um conjunto de ACP compreenderam as seqüências arbitrárias pré selecionadas nas suas extremidades 5’ e 3’, seqüências de 54 pares de base adicionais que correspondem às seqüências arbitrárias pré selecionadas e resíduos de desoxiinosina foram encontrados. A FIG. 10A mostra os produtos de cDNA amplificados gerados pelos seguintes conjuntos de iniciadores; um conjunto de EsxN7 e EsxCó (linha 1) e um conjunto de EsxN7-ACP e EsxC6-ACP (linha 2). As reações de PCR usando o conjunto de iniciador convencional EsxN7 e EsxCó foram como segue: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 60° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. A FIG. 10B mostra os produtos de cDNA amplificados gerados por um iniciador único ou um par de iniciadores como segue: os iniciadores, EsxNl e EsxC2, foram usados nas linhas 1 e 2, respectivamente; uma combinação de EsxNl-ACP e iniciador convencional EsxC2 foi usada na linha 3; dois ACPs EsxNl-ACP e EsxC2-ACP foram usados na linha 4. Quando um conjunto de iniciador convencional, EsxNl e EsxC2, foi usado sob temperatura de anelamento alta de 60° C, nenhum produto alvo específico foi produzido. Quando um conjunto de iniciador que compreende um ACP EsxNl-ACP e um iniciador convencional de EsxC2 foi usado, um produto específico alvo assim como produtos não específicos foram amplificados devido à ligação não específica do iniciador convencional EsxC2 (linha 3). Entretanto, quando um conjunto de ACP foi usado, apenas um único produto específico alvo foi amplificado (linha 4), o que indica que o ACP da invenção objeto fornece iniciadores com tolerância ao “parâmetro de planejamento de iniciador” relacionado com as temperaturas de fusão de iniciadores gerais requisitados para sistemas de PCR de alvo único. A FIG. 10C mostra os produtos de cDNA amplificados gerados usando-se os seguintes conjuntos de iniciadores: um conjunto de EsxN3 e EsxC5 foi usado na linhas 1 e 2 e um conjunto de EsxN3-ACP e EsxC5-ACP foi usado na linha 3. As reações de PCR usando o conjunto de iniciador convencional de EsxN3 e EsxC5 foram como segue: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 58° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C (linha 1). O conjunto de iniciador convencional também foi comparado com o conjunto de ACP conduzindo-se as mesmas amplificações de PCR de estágio duplo como usadas no ACP, tal que a sua temperatura de anelamento fosse aumentada de 60° C para 68° C (linha 2). Estes resultados também indicam que embora os iniciadores convencionais incluindo aqueles tendo Tm alta fossem usados na mesma amplificação pela PCR de estágio duplo, eles podem não estar livres dos problemas de produtos não específicos e produtos secundários, ao passo que o ACP da invenção objeto pode ajudar a superar tais problemas que surgem destes iniciadores convencionais. PROTOCOLO B: Amplificações pela PCR de Estágio Duplo sem Parada Altemativamente, as seqüências completas dos ACPs, ao invés dos iniciadores arbitrários pré selecionados tais como JYC4 e JYC2, podem ser usadas como iniciadores para a amplificação pela PCR de segundo estágio nas condições de alta severidade. Neste caso, não é necessário adicionar os iniciadores arbitrários pré selecionados à mistura de reação no momento ou depois da reação de PCR de primeiro estágio. O processo das amplificações pela PCR de estágio duplo sem parada é basicamente idêntico ao Protocolo A, exceto que os ACPs, 1 μΐ de 5’ ACP (10 μΜ) e 1 μΐ de 3’ ACP (10 μΜ), são adicionados ao amplificação pela PCR de primeiro estágio e a amplificação pela PCR de segundo estágio imediatamente segue a amplificação pela PCR de primeiro estágio sem qualquer demora por que não existe nenhuma etapa de adicionar iniciadores arbitrários pré selecionados.

Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996). A FIG. 10D mostra os produtos de cDNA amplificados gerados pelas amplificações pela PCR de estágio duplo sem parada usando os seguintes iniciadores únicos ou um pares de iniciadores; os iniciadores EsxNl e EsxC2 foram usados na linha 1 e 2, respectivamente; um par de EsxNl e EsxC2 foi usado na linha 3; e um par de EsxNl-ACP e EsxC2-ACP foi usado na linha 4. Quando um conjunto de iniciador convencional, EsxNl e EsxC2, foi usado, nenhum produto alvo específico foi produzido. Entretanto, quando um conjunto de ACP foi usado em amplificações pela PCR de estágio duplo sem parada, apenas um único produto específico alvo foi amplificado (linha 4), que é compatível com os resultados das amplificações pela PCR de estágio duplo de parada única (FIG. 10B).

Estes exemplos ilustram que o ACP permite que os produtos sejam livres dos problemas secundários assim como da não especificidade que surge a partir dos iniciadores convencionais usados nos métodos de PCR como descrito na técnica. Também deve ser entendido que o ACP permite a geração dos produtos independentes específico do planejamento de iniciadores específicos de gene.

EXEMPLO 3: Identificação e Caracterização de mRNAs Diferencialmente Expressos Durante o Desenvolvimento Embriônico de Camundongo Usando o ACP O ACP da invenção objeto foi aplicado para detectar mRNAs diferencialmente expressos em desenvolvimentos embriônicos. Especificamente, três procedimentos e resultados diferentes usando estágios diferente de RNAs totais de concepto como materiais de partida são aqui descritos. Os iniciadores usados na invenção objeto são mostrados na Tabela 1.

Al. PROCEDIMENTO 1 Etapa (1): Síntese do primeiro cDNA de filamento Os primeiros cDNAs de filamento foram preparados sob as mesmas condições como usadas na síntese de cDNA do Exemplo 1 usando o dTio-ACPl ou JYC5-Ti5-ACP como um iniciador de síntese de cDNA. Os cDNAs resultantes foram purificados por uma coluna giratória (Kit de purificação de PCR, QIAGEN) para remover os iniciadores, dNTP e os r reagentes acima. E necessário realizar a etapa de purificação antes da determinação da concentração de cDNAs usando a espectroscopia de UV a uma absorbância de 260 nm. A mesma quantidade de cDNAs de cada amostra foi usada para comparar os seus padrões de amplificação usando o sistema ACP aqui descrito.

Etapa (2): Amplificação pela PCR de primeiro estágio usando ACP

Os seguintes ACPs foram usados como ACPs arbitrários (AR-ACPs) para a primeira amplificação pela PCR: ACP3 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACS - 3’ (SEQ ID NO: 3); ACP5 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCS - 3’ (SEQ ID NO: 5); ACP8 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCS - 3’ (SEQ ID NO: 8); ACP 10 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC - 3’ (SEQ ID NO: 13); ACP 13 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATG CG - 3’ (SEQ ID NO: 16); e ACP 14 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATG CC - 3’ (SEQ ID NO: 17).

As seqüências da porção de extremidade 5’ do dTi0-ACPl e AR-ACPs servem como seqüências iniciadoras pré selecionadas arbitrárias apenas para a amplificação pela PCR secundária. Os iniciadores arbitrários pré selecionados são JYC2 e JYC4.

Os primeiros cDNAs de filamento produzidos a partir da etapa (1) foram amplificados pela seguinte amplificação pela PCR de primeiro estágio usando um dos AR-ACPs (ACP3, ACP5, ACP8, ACP10, ACPI3 ou ACPI4) e o dTio-ACPl como iniciadores 5’ e 3’, respectivamente. A amplificação pela PCR de primeiro estágio foi conduzida em um volume de 50 μΐ contendo 50 ng do primeiro cDNA de filamento, 5 μΐ de tampão de reação de PCR 10 x (Promega), 3 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP (0,2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 5 μΐ de iniciador 5’ (1 μΜ), 5 μΐ de iniciador 3’ (1 μΜ) e 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega). As reações de PCR foram como segue: 5 minutos a 94° C seguidos por 20 ciclos de 94° C durante 1 minuto, 50° C durante 1 minuto e 72° C durante 1 minuto; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. O ciclo da amplificação pela PCR de primeiro estágio pode ser variado dependendo dos tipos de amostras. Por exemplo, os 20 ciclos da amplificação pela PCR primária foram usados para as amostras de concepto de camundongo.

Etapa (3): Amplificação pela PCR de segundo estágio usando iniciadores arbitrários pré selecionados que correspondem às seqüências da porção de extremidade 5’ dos ACPs Os produtos de cDNA amplificados produzidos a partir da etapa (2) são re-amplificados pela seguinte amplificação pela PCR de segundo estágio usando dois iniciadores arbitrários pré selecionados, JYC4 e JYC2, cada um correspondendo à seqüência da porção de extremidade 5’ de AR-ACP e dTio-ACPl, respectivamente. A amplificação pela PCR de segundo estágio foi conduzida em um volume de 50 μΐ contendo 5 μΐ dos produtos de cDNA amplificados primeiro (50 μΐ), 5 μΐ de tampão de reação de PCR 10 x (Promega), 3 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de iniciador 5’ (10 μΜ), 1 μΐ de iniciador 3’ (10 μΜ) e 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ). As reações de PCR foram como segue: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 1 minuto, 65° C durante 1 minuto e 72° C durante 1 minuto; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. A2. PROCEDIMENTO 2 O procedimento alternativo compreende as seguintes etapas de: (a) fornecer uma primeira amostra de ácidos nucléicos que representem uma primeira população de transcritos de mRNA e uma segundo amostra de ácidos nucléicos que representem uma segunda população de transcritos de mRNA; (b) contactar cada uma da primeira amostra de ácido nucléico e da segunda amostra de áçido nucléico com um primeiro ACP, em que o primeiro ACP tem uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da primeira e segunda população de transcritos de mRNA para hibridizar com ela; (c) transcrever de modo reverso o mRNA ao qual o primeiro ACP hibridiza para produzir uma primeira população de filamentos de DNA que são complementares aos mRNAs na primeira amostra de ácido nucléico aos quais o primeiro ACP hibridiza e uma segunda população de filamentos de DNA que são complementares ao mRNA na segunda amostra de ácido nucléico ao qual o primeiro ACP hibridiza; (d) purificar e quantificar os filamentos de DNA complementares produzidos como um resultado da etapa de transcrição reversa (c); (e) sintetizar um segundo filamento de DNA complementar a cada uma da primeira e segunda populações de filamentos de DNA usando um segundo ACP sob condições de severidade baixa, em pelo menos um ciclo de PCR que compreende a desnaturação, anelamento e extensão do iniciador, em que o segundo ACP tem uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar à primeira e segunda populações de filamentos de DNA; (f) amplificar cada segundo filamento de DNA obtido a partir da etapa (e) sob condições de alta severidade, em pelo menos um ciclo de PCR que compreende a desnaturação, anelamento e extensão do iniciador para gerar a primeira e segunda populações de produtos de amplificação usando dois iniciadores arbitrários pré selecionados cada um compreendendo uma seqüência que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do primeiro e segundo iniciadores de controle de anelamento; e (g) comparar a quantidade de produtos de amplificação individuais na primeira e segunda populações de produtos de amplificação.

Os primeiros cDNAs de filamento são sintetizados usando JYC5-T15-ACP 5’ - CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIIITTTTTTT TTTTTTTT - 3’ (SEQID NO: 61). A seqüência da porção de extremidade 5’ do JYC5-Ti5-ACP serve como uma seqüência de iniciador 3’ pré selecionado arbitrário a ser usada apenas para o segundo estágio de amplificação pela PCR: JYC5 5’ - CTGTGAATGCTGCGACTACGAT - 3’ (SEQ ID NO: 60).

Etapa (1): Síntese de primeiro cDNA de filamento 1. Combina 3 pg de RNA total e 2 μΐ de JYC5-Ti5-ACP a 10 μΜ em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml. 2. Adicionar H20 estéril a um volume final de 9,5 μΐ. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Incubar o tubo a 80° C durante 3 minutos ou usar um termociclador para o mesmo propósito. 4. Esfriar o tubo em gelo durante 2 minutos. Girar os conteúdos do tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 5. Ao mesmo tubo de reação adicionar os seguintes reagentes: 4 μΐ de tampão Filamento primário 5x (Promega), 5 μΐ de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,5 μΐ de inibidor RNasin (40 unidades/μΐ, Promega) e 1 μΐ de transcriptase reversa M-MLV (200 U/μΙ). 6. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 7. Incubar o tubo a 42 0 C durante 90 minutos. 8. Incubar o tubo a 94 ° C durante 2 minutos para terminar a síntese de filamento primário. 9. Colocar o tubo em gelo durante 2 minutos. 10. Purificar os cDNAs resultantes em uma coluna giratória (Kit de purificação de PCR, QIAGEN) para remover os iniciadores, dNTP e os reagentes acima. 11. Em seguida, medir a concentração dos cDNAs usando a espectroscopia de UV a uma absorbância de 260 nm. 12. Processo para a etapa 2.

Etapa (2): Síntese do síntese do segundo cDNA de filamento usando ACP A mesma quantidade de cDNAs de cada amostra foi usada para a comparação de seus padrões usando os ACPs aqui descritos. O segundo cDNA de filamento foi sintetizado usando o ACP 10 arbitrário pelo método de PCR de início quente em que o procedimento é ajustar as reações completas sem a DNA polimerase e incubar os tubos no ciclador térmico para completar a etapa de desnaturação inicial a >90° C. Depois, enquanto se mantém os tubos a uma temperatura acima de 90° C, a quantidade apropriada de DNA polimerase pode ser pipetada na reação. 1. Combinar os seguintes reagentes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 49,5 μΐ do volume total contendo 1 μΐ de primeiro cDNA de filamento (50 ng/μΐ) preparado pela etapa 1, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x (Roche), 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de ACP arbitrário a 10 μΜ (iniciador 5’) e 37,5 μΐ de dH20 estéril. 2. Misturar conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Colocar o tubo no ciclador térmico pré aquecido a 94° C. 4. Adicionar o 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Roche) na reação, enquanto se mantém o tubo na temperatura de 94° C. 5. Conduzir a reação de PCR sob as seguintes condições: um ciclo de 94° C durante 5 minutos, 50 ° C durante 3 minutos e 72° C durante 1 minuto; seguidos pela desnaturação do primeiro produto de amplificação a 94° C.

Etapa (3): Amplificação pela PCR dos segundos cDNAs de filamento usando iniciadores arbitrários pré selecionados que correspondem às seqüências da porção de extremidade 5’ dos ACPs 1. Depois da conclusão da amplificação pela PCR de primeiro estágio, enquanto se mantém os tubos a uma temperatura acima de 94° C, adicionar 2 μΐ de JYC4 a 10 μΜ e 2 μΐ de JYC5 a 10 μΜ, em que cada um corresponde à seqüência da porção de extremidade 5’ tanto do ACP 5’ quanto 3’, respectivamente, à mistura de reação usada na etapa (2). 2. Conduzir as reações de PCR de segundo estágio sob as seguintes condições: 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. A3. PROCEDIMENTO 3 Como um processo alternativo, na etapa (f) do PROCEDIMENTO 2 as seqüências completas do primeiro e segundo ACPs usados nas etapas (b) e (e) do PROCEDIMENTO 2, ao invés das seqüências arbitrárias pré selecionadas das porções da extremidade 5’ do primeiro e segundo ACPs, podem ser usadas como iniciadores 3’ e 5’, respectivamente, nas condições de alta severidade para amplificar cada segundo filamento de DNA obtido da etapa (e) do PROCEDIMENTO 2, em que a extremidades 3’ e 5’ dos segundos filamentos de DNA que foram inicialmente sintetizados usando o segundo ACP compreendem a seqüência do primeiro ACP e a seqüência complementar do segundo ACP, respectivamente e também servem como sítios de emparelhamento perfeito para o primeiro e segundo ACPs. Neste caso, não é necessário para adicionar os iniciadores arbitrários pré selecionados à mistura de reação no momento ou depois da reação de PCR de primeiro estágio.

Etapa (1): Síntese de primeiro cDNA de filamento Os primeiros cDNAs de filamento foram preparados sob as mesmas condições como usadas na síntese de cDNA do PROCEDIMENTO 2 usando o JYC5-Ti5-ACP como um iniciador de síntese de cDNA.

Etapa (2): Síntese do síntese do segundo cDNA de filamento e amplificação usando a PCR de estágio duplo sem parada A mesma quantidade de cDNAs de cada amostra foi usada para a comparação de seus padrões usando os ACPs aqui descritos. O segundo cDNA de filamento foi sintetizado usando ACP 10 arbitrário pelo método de PCR de início quente em que o procedimento é ajustar as reações completas sem a DNA polimerase e incubar os tubos no ciclador térmico para completar a etapa de desnaturação inicial a >90° C. Depois, enquanto se mantém os tubos a uma temperatura acima de 90° C, a quantidade apropriada de DNA polimerase pode ser pipetada na reação. 1. Combinar os seguintes reagentes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 49,5 μΐ do volume total contendo 1 μΐ de primeiro cDNA de filamento (50 ng/μΐ) preparado pela etapa 1, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x (Roche), 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de ACP 10 arbitrário a 10 μΜ (iniciador 5’), 1 μΐ de JYC5-Ti5-ACP a 10 μΜ (iniciador 3’) e 36,5 μΐ de dH20 estéril. 2. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Colocar o tubo no ciclador térmico pré aquecido a 94° C. 4. Adicionar o 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΙ; Roche) na reação, enquanto se mantém o tubo à temperatura de 94° C. 5. Conduzir a reação de PCR sob as seguintes condições: um ciclo de 94° C durante 1 minuto, 50° C durante 3 minutos e 72° C durante 1 minuto; seguidos por 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 65° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; e seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. B. Separação de produtos amplificados de PCR pela análise de eletroforese e recuperação das faixas diferencialmente demonstradas Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. Diversas faixas maiores diferencialmente expressas durante o desenvolvimento embriônico (E4.5, El 1.5 e E18.5) foram selecionadas, excisadas e extraídas dos géis usando o Kit GENECLEAN II (BIO 101). Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como tingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et ai, 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosoke/a/., 1996). C. Re-amplificação das Faixas Recuperadas As faixas obtidas a partir da etapa B foram re-amplificadas usando os mesmos iniciadores arbitrários pré selecionados e condições de PCR como usados nos PROCEDIMENTOS 1,2 e 3. D. Clonagem e seqüenciamento dos fragmentos re- amplificados Cada fragmento amplificado foi clonado no vetor pGEM-T Easy (Promega) e seqüenciado com o Analisador Genético ABI PRISM 310 (Perkin Elmer Biosystem) usando o kit de seqüenciamento de ciclo BigDye Terminator (Perkin Elmer). A análise de seqüência auxiliada por computador foi realizada usando o programa de procura BLAST (Ferramenta de Procura de Alinhamento Local Básico). E. Análise de Northern Vinte microgramas de RNA total de tecidos de concepto foram separadas em géis de agarose a 1 % desnaturantes contendo formaldeído, transferidas sobre membranas de náilon (Hybond-N, Amersham, USA) e hibridizadas com um produto de PCR subclonado rotulado com P em solução QuikHyb (Stratagene, USA) durante a noite a 58° C como anteriormente descrito (Chun et al., 1999; Hwang et al., 2000). As manchas foram lavadas a 65° C duas vezes durante 20 minutos em 2 x SSC, 0,1 % SDS, duas vezes durante 20 minutos em 1 x SSC, 0,1 % SDS e duas vezes durante 20 minutos em 0,1 x SSC, 0,1 % SDS. As membranas foram expostas à película Kodak X-Omat XK-1 com uma tela intensificadora Fuji a -80° C.

As FIGs. 11A-D mostram os produtos de cDNA amplificados, em que as amostras de concepto de camundongo obtidas de estágios diferentes foram amplificadas pelo PROCEDIMENTO 1 usando os conjuntos de iniciadores como segue; um conjunto de ACP3 e dTi0-ACPl para as linhas 1-3 da FIG. 11 A; um conjunto de ACP5 e dTi0-ACPl para as linhas 1-6 e da FIG. 11B e um conjunto de ACP8 e dT10-ACPl para as linhas 7-12 da FIG. 10B, respectivamente. A FIG. 11B também mostra resultados adicionais dos produtos de cDNA amplificados gerados usando-se um outro conjunto de ACP. FIGs. 11C-D mostram os produtos amplificados gerados usando-se dois conjuntos de iniciadores do ACP10 e dTi0-ACPl (FIG. 11C) e ACP14 e dTi0-ACP1 (FIG. 11 D), respectivamente. Muitas faixas diferencialmente expressas em um estágio específico foram obtidas, subclonadas no vetor pGEM-T Easy (Promega) e seqüenciadas. A análise de seqüência revela que todos os clones são genes conhecidos exceto os dois genes novos (Tabela 2). Os padrões de expressão foram confirmados pela análise de Northern blot usando mancha de estágio concepto de camundongo (Seegene, Inc., Seoul, Coréia). A FIG. 12A mostra os produtos de cDNA amplificados, em que as amostras de concepto de camundongo (E4.5: linha 1; El 1.5: linha 2; El8.5: linha 3) obtidos de estágios diferentes foram amplificados pelo PROCEDIMENTO 2 usando um conjunto de ACP10 e JYC5-Ti5-ACP. Muitas faixas diferencialmente expressas em um estágio específico foram obtidas, subclonadas no vetor pGEM-T Easy (Promega) e seqüenciadas. A análise de seqüência revela que todos os clones são genes conhecidos exceto um DEG 2 (Tabela 2). Os padrões de expressão foram confirmados pela análise de Northern blot usando mancha de estágio de concepto de camundongo (Seegene, Inc., Seoul, Coréia). A FIG. 12B mostra os produtos de cDNA amplificados, em que amostras de concepto de camundongo em estágios diferentes (E4.5: linha 3; El 1.5: linha 4; E18.5: linha 5) foram amplificados pelas amplificações pela PCR de estágio duplo sem parada usando um conjunto de ACP10 e JYC5-Ti5-ACP como mencionado acima no PROCEDIMENTO 3. Quando um conjunto de ACP10 e JYC5-Ti5-ACP (linhas 3-5) foi usado, as faixas resultantes foram idênticas às faixas que foram obtidas pelo PROCEDIMENTO 2 que compreende amplificações pela PCR de estágio duplo de parada única (FIG. 12A). Entretanto, nenhum produto foi gerado quando um único iniciador, ACP10 (linha 1) ou JYC5-Ti5-ACP (linha 2) foi usado, o que indica que os produtos amplificados foram gerados apenas quando tanto ACP10 quanto JYC5-Ti5-ACP como um conjunto foram usados para as suas ligações específicas. A FIG. 13 mostra os resultados da hibridização de Northern blot para representar seis clones diferentes usando DEG1 (A; seta 1 da FIG. 10A, FIG. 11 e FIG. 12), DEG2 (C), DEG3 (B; seta 2 da FIG. 10A, FIG. 11 e FIG. 12), DEG5 (E), DEG7 (F) e DEG8 (D; seta 4 da FIG. 10A, FIG. 11 e FIG. 12) como sondas. A sonda DEG1 também foi hibridizada à isoforma alternativa de Tropomiosina 2 (seta Γ da FIG. 11 e FIG. 12), que foi descoberta por esta presente invenção. Compatível com os resultados da análise em gel de agarose, a análise de Northern blot mostrou que os padrões de expressão dos clones são idênticos às faixas originais nos géis de agarose, indicando que todos os clones são produtos positivos verdadeiros. Assim, o ACP produz apenas produtos positivos sem quaisquer positivos falsos, o que significa que o ACP elimina o problema de positivos falsos. A FIG. 14 mostra os resultados da hibridização de Northern blot para a expressão de DEG5 durante o desenvolvimento embriônico de camundongo. DEG5, que é apresentado como um novo gene pela análise de seqüência, mostra um padrão de expressão interessante: depois de uma expressão forte apareceu no estágio de gravidez inicial (E4.5), a sua expressão foi gradualmente reduzida nos estágios intermediários e gradualmente aumentada mais uma vez no estágio de desenvolvimento final (El7.5 e E18.5).

Estes resultados indicam que o método usando o ACP para isolar genes diferencialmente expressos produz apenas produtos de PCR reais e elimina completamente produtos positivos falsos. A independência de positivos falsos que foram um gargalo principal que permanece para a técnica anterior de Demonstração Diferencial permite evitar o trabalho intensivo subsequente requerido para a verificação dos fragmentos de cDNA identificados pela Demonstração Diferencial. EXEMPLO 5: Método para a Amplificação Rápida de Extremidades 3’ de cDNA (3’-RACE) Usando ACP O presente exemplo compara a 3’-RACE com base no ACP e a 3’-RACE convencional de modo a demonstrar se o ACP da presente invenção pode excluir tais problemas secundários que surgem de iniciadores oligo-dT convencionais usados na síntese de cDNA.

Na 3’-RACE convencional, a terminação poli(a) de moléculas de mRNA é explorada como um sítio de iniciação para a amplificação pela PCR e assim o iniciador oligo-dT é usado como um iniciador 3’ para a 3’-RACE convencional. Ao contrário, o ACP da presente invenção usa a terminação poli(a) de mRNA como um sítio de iniciação apenas para a síntese de cDNA mas não para a amplificação subsequente pela PCR. primeiros cDNAs de filamento de camundongo foram preparados sob as mesmas condições como usadas na síntese de cDNA do Exemplo 1 usando Oligo VdT15-ACP 5’ - GCTTGACTACGATACT GTGCGAIIIIITTTTTTTTTTTTTTTV - 3’ (SEQ ID NO: 57) (V é A, C ou G) como um iniciador de síntese de cDNA e depois, diretamente usados como padrão para a amplificação subsequente pela PCR sem a etapa de purificação para a remoção do iniciador de síntese de cDNA.

Para a 3’-RACE convencional, os primeiros cDNAs de filamento foram sintetizados usando os seguintes iniciadores de síntese de cDNA; CDS 111/3’ 5’ - ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30-VN - 3’ (SEQ ID NO: 35) (V é A, C ou G; e N é A, C, T ou G).

Este iniciador de síntese de cDNA, CDS III/3’, foi usado como iniciador 3’ para a amplificação subsequente pela PCR. A amplificação pela PCR foi conduzida em um volume de 50 μΐ contendo 50 ng do primeiro cDNA de filamento, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x (Promega), 1 μΐ de um iniciador 5’ específico de gene (10 μΜ), 1 μΐ de iniciador 3’ JYC2 arbitrário pré selecionado (10 μΜ) ou CDS III/3’ (10 μΜ), 3 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega). As reações de PCR foram conduzidas sob as seguintes condições: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 1 minuto, 65° C durante 1 minuto e 72° C durante 1 minuto; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. Os produto amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % seguida por fingimento com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996). A FIG. 15 mostra os resultados da beta-actina 3’-RACE. A 3’-RACE convencional (linha 1) foi comparada com a 3’-RACE com base no ACP (linha 2). O método 3’-RACE convencional produziu produtos não específicos assim como sujidade de DNA secundário, ao passo que a 3’-RACE com base em ACP produziu apenas uma única faixa, que é o tamanho esperado de 348 pares de base. Estes resultados indicam que o 3’-RACE com base em ACP pode excluir os problemas secundários tais como a sujidade de DNA e produtos não específicos.

EXEMPLO 6: Método para a Amplificação Rápida de Extremidade 5’ (5’ - RACE) e cDNAs de comprimento completo Usando ACP O ACP da invenção objeto também foi usado para amplificar a extremidade 5’ de fragmentos de cDNA. Os primeiros cDNAs de filamento foram sintetizados usando Oligo VdTi5-ACP ou dN6-ACP aleatório: Oligo VdT15-ACP 5’ GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTT TTTTTTTTTTV - 3’ (SEQ ID NO: 57), em que V pode ser A, C ou G; dN6-ACP Aleatório 5’ GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIINNNN NN - 3’ (SEQ ID NO: 58), em que N pode ser A, C, G ou T.

Depois da síntese completa das seqüências de primeiro cDNA de filamento presentes na forma de intermediários de mRNA-cDNA, resíduos de citosina são formados em terminação na extremidade 3’ das seqüências de primeiro cDNA de filamento pela reação de transferase terminal da transcriptase reversa na presença de manganês. As extremidades 3’ dos primeiros cDNAs de filamento foram prolongadas usando o ACP extensor de extremidade 3’ de primeiro cDNA de filamento (rG3-ACP, rG2-ACP ou dG3-ACP) e depois, diretamente usadas como padrão para a amplificação subsequente pela PCR sem uma etapa de purificação para a remoção do ACP extensor de extremidade 3’ de primeiro cDNA de filamento assim como o iniciador de síntese de cDNA.

As seqüências dos ACPs extensores de extremidade 3’ de primeiro cDNA de filamento são: rG3-ACP 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GGG) - 3’ (SEQ ID NO: 36); rG2-ACP 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GG)-dG - 3’ (SEQ ID NO: 37); rGl-ACP 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(G)-d(GG) - 3’ (SEQ ID NO: 59); ou dG3-ACP 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGd(GGG) - 3’ (SEQ ID NO: 38) (em que r e d representam ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, respectivamente). A. Síntese de cDNA de comprimento completo de primeiro filamento PROTOCOLO A: Síntese de primeiro cDNA de filamento usando o ACP da invenção objeto 1. Combinar os seguintes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 3 pg de RNA total e 2 μΐ de 10 μΜ de Oligo VdT^-ACP ou dN6-ACP aleatório. 2. Adicionar H20 estéril a um volume final de 10 μΐ. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Incubar o tubo em um banho de água a 65° C durante 15 minutos ou usar um termociclador para o mesmo propósito. 4. Esfriar o tubo em gelo por pelo menos 2 minutos. Girar os conteúdos do tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 5. Adicionar os seguintes reagentes ao mesmo tubo de reação: 4 μΐ de tampão de primeiro filamento 5x (Invitrogen), 1 μΐ de DTT a 0,1 M, 2 μΐ de BSA (1 mg/ml), 2 μΐ de dNTP (10 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,4 μΐ de MnCl2 a 100 mM e 0,5 μΐ de inibidor RNasin (40 unidades/μΐ, Promega). 6. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 7. Incubar o tubo a 42° C durante 2 minutos em um incubador ou termociclador. 8. Adicionar 1 μΐ de transcriptase reversa SuperScript II (200 unidades/μΐ; Invitrogen). 9. Incubar o tubo a 42° C durante 1 hora em um incubador ou termociclador. 10. Adicionar 1 μΐ de ACP extensor de extremidade 3’ de primeiro cDNA de filamento a 10 μΜ (rG3-ACP, rG2-ACP ou dG3-ACP). 11. Adicionar 0,3 μΐ de transcriptase reversa SuperScript II (200 unidades/μΐ; Invitrogen). 12. Incubar o tubo a 42° C durante 30 minutos em um incubador ou termociclador. 13. Incubar o tubo a 70° C durante 15 minutos em um incubador ou termociclador para terminar a síntese de primeiro filamento. 14. Colocar o tubo em gelo ou pode ser armazenado a -20° C. PROTOCOLO B: Síntese de cDNA de comprimento completo de primeiro filamento pelo método CapFinder Os seguintes iniciadores são usados no método CapFinder (Clontech): Oligonucleotídeo SMART IV™ 5’ AAGCAGTGGTATCAACGCAG AGTGGCCATTACGGCCr(GGG) - 3’ (SEQIDNO: 33); e Iniciador 5’ PCR 5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT -3’ (SEQID NO: 34) e iniciador de PCR CDS HI/3\ 1. Combinar os seguintes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 3 pg de RNA total, 1 μΐ de iniciador de PCR CDS III/3’ a 10 μΜ (Clontech) e 1 μΐ de Oligonucleotídeo SMART IV a 10 μΜ (Clontech). 2. Adicionar H2O estéril a um volume final de 5 μΐ. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Incubar o tubo a 72° C durante 2 minutos. 4. Esfriar 0 tubo em gelo durante 2 minutos. Girar os conteúdos do tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 5. Adicionar os seguintes reagentes ao mesmo tubo de reação: 10 μΐ do volume total contendo 2 μΐ de tampão de primeiro filamento 5x (Clontech), 1 μΐ de DTT a 20 mM, 1 μΐ de dNTP (10 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e 1 μΐ de Transcriptase reversa PowerScript (Clontech). 6. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 7. Incubar o tubo a 42° C durante 1 hora. 8. Colocar o tubo em gelo ou pode ser armazenado a -20° C.

B. Amplificação pela PCR PROTOCOLO C: Amplificação de um fragmento de cDNA de extremidade 5’ alvo usando o sistema ACP ou o método 5’ - RACE convencional O presente exemplo compara a tecnologia de CapFinder 5’ -RACE corrente e método de 5’ RACE com base no ACP, em que a tecnologia de CapFinder 5’ - RACE corrente não pode excluir o alto teor de produto secundário devido à quantidade residual dos iniciadores durante o processo. De modo a demonstrar se o ACP da presente invenção pode eliminar tais problemas de produto secundário que surgem de iniciadores tais como o iniciador CapFinder, Oligonucleotídeo SMART IV (Clontech) e iniciador de síntese de cDNA, iniciador de PCR CDS III/3’ (Clontech), usados na síntese de cDNA, tanto o 5’ - RACE com base em ACP quanto o CapFinder 5’ -RACE para a amplificação de extremidade 5’ de cDNAs JunB e beta-actina de camundongo foram conduzidos nas mesmas condições. O mRNA JunB de camundongo é um transcrito relativamente raro no RNA de placenta de 18,5 dias de idade de camundongo, ao passo que a beta-actina de camundongo é um relativamente abundante. 1. Combinar os seguintes reagentes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 50 μΐ do volume total contendo 1 μΐ de primeiro cDNA de filamento preparado a partir do Protocolo A ou B, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x (Promega), 5 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de iniciador 5’ - RACE específico de gene a 10 μΜ, 1 μΐ de iniciador JYC2 ou 5’ PCR a 10 μΜ (Clontech), 0,5 μΐ de Taq Polimerase (5 unidades/μΐ; Promega) e 31,5 μΐ de dH20 estéril. 2. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Conduzir a reação de PCR sob as seguintes condições: 5 minutos a 94° C, seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 58° C durante 40 segundos e 72° C durante 1 minuto 30 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. 4. Analisar os produtos amplificados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % seguido por fingimento com brometo de etídio.

Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996).

Como mostrado na FIG. 16, os métodos CapFinder para JunB e beta-actina 5’ - RACE de camundongo usando o iniciador 5’ PCR (Clontech) e o iniciador específico de gene produziram altos teores de produtos secundários tais como sujidade de DNA (linhas 1 e 3) como descrito por muitos pesquisadores (Chenchik et al., 1998; Matz et al., 1999; Schramm et al., 2000), ao passo que o 5’ - RACE com base no ACP da presente invenção gerou apenas uma única faixa que corresponde a cada um dos tamanhos esperados de 155 pares de base ou 319 pares de base de fragmento de cDNA de extremidade 5’ de JunB de camundongo (linha 2) ou beta-actina de camundongo (linha 4), respectivamente. Estes exemplos ilustram que o ACP pode ser usado para eliminar fundamentalmente tais problemas de produtos secundários que surgem da contaminação de iniciadores usados durante a síntese de cDNA, sem a etapa de purificação para a remoção dos iniciadores usados na síntese de cDNA. A FIG. 17 também mostra que o ACP da invenção objeto não permite que os produtos não específicos sejam formados, que são gerados pelo método CapFinder (linha 1). O primeiro cDNA de filamento foi sintetizado pelo método CapFinder (linha 1) ou método do ACP (linhas 2, 3 e 4) e depois, diretamente usado como padrão na amplificação pela PCR subsequente para a proteína semelhante à prolactina de camundongo PLP-C alfa 5’ - RACE. O iniciador de 5’ - RACE específico de PLP-C alfa é: PLP-C alfa 5’ - GAGAGGATAGTT TCAGGGAC - 3’ (SEQ ID NO: 40). Os ACPs extensores da extremidade 3’ de primeiro cDNA de filamento que compreende as três riboguaninas (rG3-ACP; linha 2), três desoxirriboguaninas (dG3-ACP; linha 4) ou uma combinação das duas riboguaninas e uma desoxirriboguanina (rG2-ACP; linha 3) na extremidade 3’ geraram cDNAs de extremidade 5’ de modo que uma única faixa que corresponde ao fragmento de cDNA de extremidade 5’ de tamanho esperado de 506 pares de base de PLP-C alfa de camundongo foi produzido a partir da PCR com base no ACP para PLP-C alfa 5’ - RACE.

PROTOCOLO D: Amplificação de fragmentos de cDNA enriquecidos em 5’ usando ACP

Os primeiros cDNAs de filamento são sintetizados usando dNe-ACP aleatório no Protocolo A. A amplificação pela PCR foi realizada pelo método de PCR de início quente em que o procedimento é ajustar as reações completas sem a DNA polimerase e incubar os tubos no ciclador térmico para completar a etapa de desnaturação inicial a >90° C Depois, enquanto se mantém os tubos a uma temperatura acima de 70° C, a quantidade apropriada de DNA polimerase pode ser pipetada na reação. 1. Combinar os seguintes reagentes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 49,5 μΐ do volume total contendo 1 μΐ de primeiro cDNA de filamento preparado pelo dN6-ACP aleatório no Protocolo A, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x (Promega), 5 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de JYC2 a 10 μΜ (iniciador 3’), 1 μΐ de JYC4 a 10 μΜ (iniciador 5’) e 31,5 μΐ de dH2Q estéril. 2. Misturar conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Colocar o tubo no ciclador térmico pré aquecido a 94° C. 4. Adicionar o 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega) na reação, enquanto se mantém o tubo na temperatura de 94° C.

5. Conduzir a reação de PCR sob as seguintes condições: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 1 minuto 30 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C 6. Analisar os produtos amplificados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % seguido por tingimento com brometo de etídio.

Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como tingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996).

PROTOCOLO E: Amplificação de cDNAs enriquecidos de comprimento completo usando ACP

Os primeiros cDNAs de filamento são sintetizados usando Oligo VdTi5-ACP no Protocolo A. A amplificação pela PCR foi realizada pelo método de PCR de início quente como no Protocolo D. 1. Combinar os seguintes reagentes em um tubo de microcentrifuga estéril de 0,2 ml: 49,5 μΐ do volume total contendo 1 μΐ de primeiro cDNA de filamento preparado pelo Oligo VdT)5-ACP no Protocolo A, 5 μΐ de tampão de PCR 10 x (Promega), 5 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de JYC2 a 10 μΜ (iniciador 3’), 1 μΐ de JYC4 a 10 μΜ (iniciador 5’) e 31,5 μΐ de dH20 estéril. 2. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma microcentrifuga. 3. Colocar o tubo no ciclador térmico pré aquecido a 94° C. 4. Adicionar o 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega, Madison, USA) na reação, enquanto se mantém o tubo na temperatura de 94° C. 5. Conduzir a reação de PCR sob as seguintes condições: 5 minutos a 94° C seguidos por 30 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 1 minuto 30 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C. 6. Analisar os produtos amplificados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % seguido por fingimento com brometo de etídio.

Para avaliar a eficiência do método usando ACP na amplificação de cDNAs de comprimento completo, os cDNAs de comprimento completo amplificados pelos procedimentos acima do método do ACP ou o método CapFinder corrente foram manchados em uma membrana Hybond-N (Amersham/United States Biochemical). O cDNA da glyceraldeído-3-fosfato desidrogenase de camundongo (GAPDH) foi rotulado com [alfa-32P]dCTP usando um kit de rotulação aleatória (Roche Diagnostics Co, Indianapolis, USA) e usado como uma sonda.

Como mostrado na FIG. 18, a sonda de cDNA GAPDH detectou uma única faixa que corresponde ao tamanho esperado de 1,3-kb de cDNA de GAPDH de comprimento completo. Como esperado, os sinais dos produtos de PCR gerados pelo método do ACP acima (linha 2) foram diversas vezes mais fortes do que aqueles pelo método CapFinder (linha 1). Este exemplo ilustra que o método do ACP da presente invenção muito mais eficazmente amplifica os cDNAs de comprimento completo do que o método CapFinder.

EXEMPLO 7: Impressão Digital Genômica Usando PCR Arbitrariamente Preparada com base no ACP O ACP da invenção objeto foi aplicado para detectar polimorfismos em camundongo. Os DNAs genômicos das cepas de camundongo C57BL/6J, CBA, BALB/cJ, NOR, SPRETUS, PANCEVO e Korean Wild Mouse foram usados como materiais de partida. O DNA genômico foi preparado a partir do fígado de camundongos usando o Kit QIAamp Tissue (QIAGEN, Hilden, Alemanha). As ACPs arbitrárias usadas na invenção objeto são: ACP 101 5’- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCGGAGGATC-3’ (SEQ ID NO: 64) ; ACP 109 5’- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTGCAGGACG-3’ (SEQ ID NO: 65) ; e ACPI 16 5’- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGGAGCATCC-3’ (SEQ ID NO: 66) .

Um conjunto de ACPs arbitrários, ACPI01 e ACP 109 (FIG. 19A) ou ACPI01 e ACPI 16 (FIG. 19B), foi usado como iniciadores para a impressão digital genômica de camundongo. A amplificação pela PCR foi realizada pelo método de PCR de início quente como descrito no Exemplo 2. A impressão digital genômica usando ACP é conduzida por dois estágios de amplificações pela PCR sob as seguintes condições: as reações de amplificação são realizadas sob condições de severidade baixa em dois ciclos da PCR de primeiro estágio que compreende reação de anelamento, extensão e desnaturação; a mistura de reação no volume final de 49,5 μΐ contendo 50 ng do DNA genômico, 5 μΐ de tampão de reação de PCR lOx (Promega), 5 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), cada 7 μΐ de um par dos ACPs (cada 10 μΜ) é pré aquecida a 94° C, enquanto se mantém o tubo contendo a mistura de reação a 94° C, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega) é adicionado à mistura de reação; as reações de PCR são como segue: dois ciclos de 94° C durante 40 segundos, 52° C durante 3 minutos e 72° C durante 1 minuto; seguida pela desnaturação do produto de amplificação a 94° C; depois da reação completa da PCR de primeiro estágio, 4 μΐ do iniciador pré selecionado arbitrário JYC4 (10 μΜ) que corresponde à porção de extremidade 5’ dos ACPs são adicionados à mistura de reação e depois a amplificação pela PCR de segundo estágio é conduzida como segue: 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C.

Os produtos de amplificação foram separados e analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2,0 que foi tingido com brometo de etídio e fotografado. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como tingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996).

A FIG. 19 mostra os resultados de um experimento em que um par de ACPs arbitrários foram usados para amplificar segmentos de DNA genômico de uma variedade de cepas de camundongo. Para examinar a reprodutibilidade da impressão digital genômica, a impressão digital de cada cepa de camundongo foi duplicada usando dois conjuntos diferentes dos ACPs. A amplificação pela PCR com base no ACP produziu diversos segmentos de DNA de cada conjunto de iniciadores e os resultados foram reprodutíveis. Os polimorfismos foram evidentes entre cepas de camundongos, indicando que as cepas de camundongos podem ser distinguidas através de polimorfismos nas impressões digitais genômicas geradas pela PCR arbitrariamente preparada com base no ACP. Assim, o ACP da invenção objeto é útil para detectar polimorfismos e construir mapas genéticos. EXEMPLO 8: PCR multiplex Usando a PCR com Base no ACP

Para demonstrar a aplicação do ACP na PCR multiplex, as porções contendo polimorfismos de nucleotídeo único da molécula de adesão de leucócito humana I (ELAM1) e genes p53 humanos (TP53) foram amplificados com iniciadores convencionais ou ACP. O processo e resultados para a amplificação pela PCR multiplex usando ACPs são aqui descritos. O DNA padrão foi obtido a partir da placenta humana.

Os iniciadores convencionais para o exon3 de ELAM1 (155 pares de base) usados no Exemplo são: ELAM1N1 5’ - TTGCACACTGTTGATTCTAA - 3’ (SEQ ID NO: 67); e ELAM1C1 5’ - TTATTGATGGTCTCTACACA - 3’ (SEQ ID NO: 68).

Os iniciadores convencionais para o exonlO de ELAM1 (287 pares de base) usados no Exemplo são: ELAM1N2 5’ - CCACTGAGTCCAACATTC - 3’ (SEQ ID NO: 69); e ELAM1C2 5’ - CTGAAACACTTCCCACAC - 3’ (SEQ ID NO: 70).

Os iniciadores convencionais para o exon4 de TP53 (349 pares de base) usados no Exemplo são: Ρ53Ν1 5’ - CCTCTGACTGCTCTTTTCAC - 3’ (SEQID NO: 71); e P53C1 5’ - ATTGAAGTCTCATGGAAGCC - 3’ (SEQ ID NO: 72).

Os iniciadores convencionais para os exons7-8 de TP53 (750 pares de base) usados no Exemplo são: P53N2 5’ - TGCTTGCCACAGGTCTC - 3’ (SEQ ID NO: 73); e P53C2 5’ - GCAGTGCTAGGAAAGAGG - 3’ (SEQ ID NO: 74).

Estes iniciadores convencionais usados no Exemplo são conhecidos como os iniciadores que geram produtos não específicos nos métodos de PCR mutiplex convencional como conhecido na técnica.

Os ACPs da invenção objeto foram aplicados a estes quatro conjuntos de iniciadores convencionais para demonstrar se o ACP pode superar os problemas tais como produtos não específicos que resultam do uso destes conjuntos de iniciadores convencionais para a PCR multiplex.

As porções de extremidade 3’ dos ACPs compreendem as seqüências dos iniciadores convencionais acima como segue e assim o tamanho dos ACPs é de 26 pares de base ou 27 pares de base maiores do que aquele dos iniciadores convencionais: ELAM1N1-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITTGCAC ACTGTTGATTCTAA - 3’ (SEQ ID NO: 75);

ELAM1C1-ACP 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIITTATTG ATGGTCTCTACACA - 3’ (SEQ ID NO: 76); ELAM1N2-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCACTG AGTCCAACATTC - 3’ (SEQ ID NO: 77); ELAM1C2-ACP 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICTGAAA CACTTCCCACAC - 3’ (SEQ ID NO: 78); P53N1-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCTCTGACT GCTCTTTTCAC - 3’ (SEQ ID NO: 79); P53C1-ACP 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTC TCATGGAAGCC - 3 ’ (SEQ ID NO: 80); P53N2-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITGCTTGCCA CAGGTCTC - 3’ (SEQID NO: 81); e P53C2-ACP 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAffllIGCAGTGCTA GGAAAGAGG - 3’ (SEQ ID NO: 82).

As seqüências da porção de extremidade 5’ dos ACPs compreendem e servem como seqüências iniciadoras arbitrárias pré selecionadas apenas para a amplificação pela PCR de segundo estágio: JYC3 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGA - 3’ (SEQ ID NO: 11) e JYC4 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT - 3’ (SEQ ID NO: 12).

As amplificações pela PCR multiplex foram conduzidas pelas amplificações pela PCR de estágio duplo de parada única ou sem parada, que é uma característica única da presente invenção. A amplificação pela PCR foi realizada pelo método de PCR de início quente como descrito no Exemplo 2. PROTOCOLO A: Amplificações pela PCR de estágio duplo de parada única (a) Amplificação pela PCR de primeiro estágio A amplificação pela PCR de primeiro estágio foi conduzida por dois ciclos de PCR que compreendem da reação de anelamento, extensão e desnaturação; a mistura de reação no volume final de 49,5 μΐ contendo 50 ng de DNA genômico humano, 8 μΐ de tampão de reação de PCR 10 x (Promega), 7 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), cada 0,5 μΐ de cada 5’ ACP (10 μΜ) e 3’ ACP (10 μΜ) ajustada é pré aquecida a 94° C, enquanto se mantém o tubo contendo a mistura de reação em 94° C, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega) é adicionado à mistura de reação; as reações de PCR são como segue: dois ciclos de 94° C durante 40 segundos, 60° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida pela desnaturação do produto de amplificação a 94° C. (B) Amplificação pela PCR de segundo estágio Os produtos resultantes gerados pela amplificação pela PCR de primeiro estágio usando conjuntos múltiplos dos ACPs foram depois amplificados pelas seguintes amplificações pela PCR de segundo estágio sob temperatura de anelamento mais alta. Depois da conclusão da amplificação pela PCR de primeiro estágio, cada 2 μΐ de iniciadores arbitrários pré selecionados a 10 μΜ, JYC3 e JYC4, foram adicionados à mistura de reação obtida da amplificação pela PCR de primeiro estágio, sob temperatura desnaturante tal como a 94° C. A reação de PCR do segundo estágio foi como segue: 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 1 minuto; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C.

Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996).

As FIGs. 20 e 21 mostram os resultados de experimentos em que três ou quatro conjuntos de iniciadores foram usados para amplificar segmentos mutiplex de DNA genômico em uma reação. O conjunto de iniciadores convencionais gerou produtos não específicos assim como produtos alvo específicos de três conjuntos (FIG. 20A) ou quatro conjuntos (FIG. 21 A) de iniciadores. Ao contrário, os três conjuntos (FIG. 20B) ou quatro conjuntos (FIG. 21B) dos ACPs produziram apenas produtos alvo mutiplex. Assim, o ACP da invenção objeto pode ser usado para a aplicação da PCR multiplex. PROTOCOLO B: Amplificações pela PCR de estágio duplo sem parada Altemativamente, as seqüências completas de cada conjunto de ACP, ao invés dos iniciadores arbitrários pré selecionados tais como JYC3 e JYC4, podem ser usados como iniciadores para a amplificação pela PCR de segundo estágio nas condições de alta severidade. Neste caso, não é necessário adicionar os iniciadores arbitrários pré selecionados à mistura de reação no momento ou depois da reação de PCR do primeiro estágio. O processo das amplificações pela PCR de estágio duplo sem parada é basicamente idêntico ao Protocolo A, exceto que a amplificação pela PCR de segundo estágio deve imediatamente seguir a amplificação pela PCR de primeiro estágio sem qualquer demora por que não existe nenhuma etapa de adicionar iniciadores arbitrários pré selecionados e que a concentração de cada conjunto de ACP, cada 1 μΐ de conjunto de 5’ ACP (10 μΜ) e 3’ ACP (10 μΜ), é adicionado à amplificação pela PCR de primeiro estágio.

Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et ai, 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et ai 1993; Ito et ai 1994; Luehrsen et ai, 1997; Smith et ai, 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et ai, 1992; Tagle et ai, 1993; Rosokeía/., 1996).

Compatível com os resultados de amplificações pela PCR de estágio duplo de parada única (FIG. 21B), a amplificação pela PCR de estágio duplo sem parada também produziu apenas produtos específicos de multiplex alvo (FIG. 21C). Estes exemplos ilustram que o ACP permite que os produtos sejam livres dos problemas de produtos secundários assim como da não especificidade que surge dos iniciadores convencionais usados nos métodos da PCR multiplex como conhecido na técnica.

EXEMPLO 9: Identificação de Segmentos de Homologia Conservada em Famílias de Multigene Usando ACP O ACP da invenção objeto foi aplicado para detectar e clonar segmentos de homologia conservada em famílias de multigene. No presente exemplo, iniciadores degenerados foram planejados para detectar seqüências de homeobox. Os genes de homeobox são caracterizados por uma seqüência de nucleotídeo de 180 pares de base conservadas conhecida como o homeobox, que codifica um homeodomínio de ligação de DNA de 60 aminoácidos. Para isolar os genes homeobox envolvidos no desenvolvimento de embrião de camundongo, o RNA total obtido de três estágios diferentes de desenvolvimento de concepto, conceptos de camundongo de 4,5, 11,5 e 18,5 dias de idade, foi usado como um material de partida. Os primeiros cDNAs de filamento foram preparados sob as mesmas condições como usadas na síntese de cDNA do Exemplo 3, em que JYC5-T15-ACP foi usado como o iniciador da síntese de primeiro cDNA de filamento.

Os seguintes ACPs compreendem as seqüências degeneradas para a seqüência homeobox em suas porções de extremidade 3’ e foram usados como iniciadores específicos de homeobox degenerados para a amplificação pela PCR de primeiro estágio: JYC2-HD1 5’ - GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTG TGGTT - 3’ (SEQID NO: 83); JYC2-HD2 5’ - GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTC TGGTT - 3’ (SEQ ID NO: 84); e JYC2-HD3 5’ - GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTT TGGTT - 3’ (SEQ ID NO: 85). A amplificação pela PCR foi realizada pelo método de PCR de licio quenie como uescmo no nxempio δ e conauziaa peias ampimcaçoes ela PCR de estágio duplo de parada única ou sem parada. O seguinte é um >cemplo do processo de amplificações pela PCR de estágio duplo de parada nica. 1. Combinar os seguintes reagentes em um tubo de licrocentrifuga estéril de 0,2 ml: 49,5 μΐ do volume total contendo 1 μΐ de rimeiro cDNA de filamento (50 ng/μΐ), 5 μΐ de tampão de PCR 10 x loche), 5 μΐ de dNTP a 2 mM, 1 μΐ de um de JYC2-HD1, JYC2-HD2 ou fC2-HD3 a 10 μΜ (iniciador 5’), 1 μΐ de JYC5-Ti5-ACP a 10 μΜ (iniciador ’) e 36,5 μΐ de dH20 estéril. 2. Misturar os conteúdos e girar o tubo ligeiramente em uma licrocentrifuga. 3. Colocar o tubo no ciclador térmico pré aquecido a 94° C. 4. Adicionar 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Roche) a reação enquanto se mantém o tubo na temperatura de 94° C. 5. Conduzir a reação de PCR sob as seguintes condições: um cio de 94° C durante 1 minuto, 52° C durante 3 minutos e 72° C durante 1 linuto; seguidos por 40 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 65° C durante 0 segundos e 72° C durante 40 segundos; e seguida por uma extensão final 2 5 minutos a 72° C.

Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese n um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. >s produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de oliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não idioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok f al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados 3auer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e elo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; osok etal., 1996).

Muitas faixas diferencialmente expressas em um estágio específico foram obtidas, subclonadas no vetor pGEM-T Easy (Promega) e seqüenciadas. A análise de sequência revela que alguns dos clones contém seqüências de homeobox. As análises de Northern blot ou RT-PCR mostram que os clones são idênticos aos resultados dos padrões de expressão observados pela eletroforese. Estes resultados indicam que o método usando o ACP da presente invenção para isolar segmentos de homologia conservada em famílias de multigene produz apenas produtos de PCR reais. A independência de positivos falsos, que é um gargalo principal que permanece nas técnicas com base na PCR anteriores para isolar segmentos de homologia conservada em famílias de multigene, permite evitar o trabalho intensivo subsequente requerido para a verificação dos fragmentos de cDNA amplificados.

EXEMPLO 10: Genotipagem de Polimorfismo de Nucleotídeo Único Usando a PCR com Base no ACP

Para demonstrar a aplicação do ACP na genotipagem de polimorfismo de nucleotídeo único, uma porção contendo um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) do gene p53 humano (TP53) foi amplificada com iniciador convencional ou ACP. O processo e os resultados para a genotipagem SNP usando ACPs são aqui descritos. Padrões de DNA foram obtidos a partir de amostras de sangue humano que têm um SNP no exon 4 do gene TP53. Este polimorfismo é expresso como uma substituição Arg -> Pro na posição de aminoácido 72 pela substituição de G com C. Uma seqüência de 349 nt entre os nucleotídeos 11991 e 12339 do gene TP53 foi amplificada a partir de cada tipo de padrão por um conjunto dos seguintes iniciadores: P53N 5’ - CCTCTGACTGCTCTTTTCAC - 3’ (SEQID NO: 86) e P53C-ACP 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCT CATGGAAGCC - 3’ (SEQ ID NO: 87).

Os produtos amplificados contendo o SNP entre as suas extremidades foram usados como padrão para detectar o SNP usando ACP específico de alelos como segue: P53N1A-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCGCG TGG - 3’ (SEQ ID NO: 88), P53N1B-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCCCG TGG - 3’ (SEQ ID NO: 89), P53N2A-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCGC GTG - 3’ (SEQ ID NO: 90), P53N2B-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCÇC GTG -3’ (SEQ ID NO: 91), P53N3A-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCG CGT - 3’ (SEQ ID NO: 92), P53N3B-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCÇ CGT - 3’ (SEQ ID NO: 93), P53N4A-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC GCG - 3’ (SEQ ID NO: 94), P53N4B-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC ÇCG - 3’ (SEQ ID NO: 95), P53N5A-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC G -3’ (SEQ ID NO: 96), e P53N5B-ACP 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC Ç - 3’ (SEQ ID NO: 97). A base polimórfica está sublinhada na porção de extremidade 3’ de cada ACP específico de alelo e a posição da base polimórfica é considerada uma posição de interrogação. A posição de interrogação é colocada em diversas posições diferentes a partir da extremidade 3’ dos ACPs específicos de alelo de modo a determinar a posição mais crítica na especificidade de anelamento para detectar o SNP.

Os ACPs específicos de alelo foram usados como iniciadores 5’. P53C-ACP e um de P53N1A-ACP, P53N2A-ACP, P53N3A-ACP, P53N4A-ACP e P53N5A-ACP foram usados para a genotipagem A do tipo selvagem. P53C-ACP e um de P53N1B-ACP, P53N2B-ACP, P53N3B-ACP, P53N4B-ACP e P53N5B-ACP foram usados para a genotipagem B do tipo variante. A seqüência da porção de extremidade 5’ dos ACPs foram servidos como seqüências iniciadoras pré selecionadas arbitrárias para a amplificação pela PCR de segundo estágio: JYC3 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGA - 3’ (SEQ ID NO: 11) e JYC4 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT - 3’(SEQ ID NO: 12). (a) Amplificação pela PCR de primeiro estágio A amplificação pela PCR de primeiro estágio foi conduzida por um ciclo de PCR que consiste de reação de anelamento, extensão e desnaturação; a mistura de reação em um volume final de 49,5 μΐ contendo 1 μΐ do segmento genômico alvo amplificado contendo o SNP no exon 4 do gene TP53, 5 μΐ de tampão de reação de PCR 10 x (Promega), 5 μΐ de MgCl2 a 25 mM, 5 μΐ de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e 1 μΐ de um dos ACPs específicos de alelo (10 μΜ) é pré aquecida a 94° C, enquanto se mantém o tubo contendo a mistura de reação a 94° C, 0,5 μΐ de Taq polimerase (5 unidades/μΐ; Promega) é adicionado à mistura de reação; para os ACPs específicos de alelo tendo 10 nucleotídeos na sua porção de extremidade 3’, as reações de PCR são como segue: um ciclo de 94° C durante 40 segundos, 55° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida pela desnaturação do produto de amplificação a 94° C; para os ACPs específicos de alelo tendo 8 nucleotídeos na sua porção de extremidade 3’, as reações de PCR são como segue: um ciclo de 94° C durante 40 segundos, 50° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida pela desnaturação do produto de amplificação a 94° C. O produto resultante é um primeiro filamento de DNA complementar ao segmento genômico alvo. (B) Amplificação pela PCR de Segundo estágio O produto resultante gerado pela amplificação pela PCR de primeiro estágio foi depois amplificado pela seguinte amplificação pela PCR de segundo estágio a uma temperatura de anelamento mais alta do que a primeira temperatura de anelamento. Depois da conclusão da amplificação pela PCR de primeiro estágio, 1 μΐ de iniciador pré selecionado arbitrário a 10 μΜ, JYC3, foi adicionado à mistura de reação obtida da amplificação pela PCR de primeiro estágio, sob temperatura desnaturante tal como a 94° C. A reação de PCR do segundo estágio foi realizada como segue: 30 ciclos de 94° C durante 40 segundos, 68° C durante 40 segundos e 72° C durante 40 segundos; seguida por uma extensão final de 5 minutos a 72° C.

Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 2 % e detectados tingindo-se com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também podem ser detectados em um gel de poliacrilamida desnaturante pela autorradiografia ou métodos de detecção não radioativos tais como fingimento com prata (Gottschlich et al., 1997; Kociok et al., 1998), pelo uso de oligonucleotídeos fluorescentemente rotulados (Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997) e pelo uso de iniciadores biotinilados (Kom et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996). A FIG. 22 mostra os resultados da amplificação específica de alelo usando ACP. O par de ACPs específicos de A do tipo selvagem (P53N2A-ACP e P53C-ACP) gerou um produto alvo específico apenas das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo selvagem A (linha 1) ou heterozigótica (linha 3), mas não das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo variante B (linha 5). O par de ACPs específicos de B do tipo variante (P53N2B-ACP e P53C-ACP) gerou um produto alvo específico apenas das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo variante B (linha 6) ou heterozigótica (linha 4), mas não das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo selvagem A (linha 2). Estes resultados indicam que o ACP da invenção objeto pode ser aplicado como um método fácil e econômico para detectar o genótipo de SNPs visto que o uso de sonda de DNA fluorescente nem o processamento pós PCR não são requeridos neste método. Os ACPs específicos de alelo cada um tendo uma posição de interrogação na sua porção de extremidade 3’ mostraram melhora de especificidade de anelamento. Além disso, quando o ACP específico de alelo tem uma posição de interrogação na posição 5 a partir da extremidade 3’ (por exemplo, P53N2A-ACP e P53N2B-ACP), a especificidade de anelamento é a mais criticamente realizada.

De modo a verificar se a posição 5 da extremidade 3’ real do ACP específico de alelo é a mais apropriado para a posição de interrogação, seis experimentos adicionais foram conduzidos usando o mesmo processo como usado na FIG. 22. Padrões de DNA foram obtidos a partir de amostras de sangue humano que têm um SNP. Seis fragmentos genômicos curtos contendo SNPs foram amplificados usando cada conjunto de iniciador diferente como segue: 703N 5’ - ATTCTGATGGTGTGGATTGTG - 3’ (SEQ ID NO: 98) e SM703C 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIACCCTGGAGT AGACGAAGA - 3’ (SEQ ID NO: 99) para o receptor adrenérgico Beta-2 (ADRB2), 028N 5’ - CCTTCTGTGCTTGATGCTTTT - 3’ (SEQ ID NO: 102) e SM028C 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICAGGAAGGAT GAGCATTTAG - 3’ (SEQ ID NO: 103) para o receptor 5 da Quimiocina (motivo c-c) (CCR5), 695N: 5’ - AGAAAAACCAGAGGCAGCTT - 3’ (SEQ ID NO: 106) e SM695C 5’ - TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIAGCACAAACC

AAAGACACAGT - 3’ (SEQ ID NO: 107) para o receptor da Interleucina 13, 679N 5’ - CTAGCTGCAAGTGACATCTCT - 3’ (SEQ ID NO: 110) e SM679C 5’ - TCACAGAGTATCCAAGCGIIIIITCAGTAAGAAGCCA GGAGAG- 3’ (SEQID NO: 111) para a molécula de adesão de leucócito -1 (LAM-1), 832N 5’ - TTTTGGGTGGAGGCTAACAT - 3’ (SEQ ID NO: 114) e SM832C: 5’ - TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIAACGATGCAGA CACCACCA - 3’(SEQ ID NO: 115) para o receptor 3 de Taquicinina (TACR3), e 880N 5’ - CTTCCACCAATACTCTTTTCC - 3’ (SEQ ID NO: 118) e SM880C: 5’ - TC AC AGAAGT ATGCC AGCGAIIIIIGC AT AC AC AC A AGAGGCAGA - 3’(SEQ ID NO: 119) para a Interleucina 1, beta (IL1B).

Os produtos amplificados contendo o SNP entre as suas extremidades foram usados como padrão para detectar os SNPs em que os ACPs específicos de alelo foram aplicados como segue: SM703-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTACAGGGC-3 ’ (SEQ ID NO: 100) e SM703-B 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTACCGGGC - 3’ (SEQ ID NO: 101) para o receptor Beta-2 adrenérgico (ADRB2), SM028-A 55 -GTCTACC AGGC ATTCGCTTC ATIIIIITCC AAACC AA-3 ’ (SEQ ID NO: 104) e SM028-B 5’ GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAACCCAA - 3’ (SEQ ID NO: 105) para receptor 5 da Quimiocina (motivo c-c) (CCR5), SM695-A 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCATTTTAGG -3’ (SEQIDNO: 108) e SM695-B 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCATTGTAGG - 3’ (SEQ ID NO: 109) para o receptor da Interleucina 13, SM679-A 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGAACTTT -3’ (SEQIDNO: 112) e SM679-B 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGACCTTT - 3’ (SEQ ID NO: 113) para a molécula de adesão de Leucócito - 1 (LAM-1), SM832-A 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGGTAAA -3’ (SEQIDNO: 116) e SM832-B 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGATAAA - 3’ (SEQID NO: 117) para o receptor 3 da Taquicinina (TACR3), e SM880-A 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGCCATAA -3’ (SEQIDNO: 120) e SM880-B 5’ - GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGCTATAA - 3’ (SEQ ID NO: 121) para a Interleucina 1, beta (IL1B). A FIG. 23 mostra os resultados de amplificações específicas de alelo para seis SNPs adicionais cada uma presente em gene diferente tal como o receptor Beta-2 adrenérgico (ADRB2) (A), receptor 5 da Quimiocina (motivo c-c) (CCR5) (B), receptor da Interleucina 13 (C), moléculas de adesão de Leucócito - 1 (LAM-1) (D), receptor 3 da Taquicinina (TACR3) (E) e Interleucina 1, beta (IL1B) (F). Compatível com os resultados da FIG. 22, a especificidade de anelamento é criticamente realizada quando o ACP específico de alelo tem uma posição de interrogação na posição 5 da extremidade 3’. O par de ACPs específico de A do tipo selvagem gerou um produto alvo específico apenas a partir das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo selvagem A (linha 1) ou heterozigótica (linha 3), mas não a partir das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo B variante (linha 5). O par de ACPs específicos de B do tipo variante gerou um produto alvo específico apenas das amostras tendo genotipagem homozigótica tipo B variante (linha 6) ou heterozigótica (linha 4), mas não das amostras tendo genotipagem homozigótica do tipo selvagem A (linha 2).

Tendo descrito uma forma de realização preferida da presente invenção, deve ser entendido que variantes e modificações destas que caem dentro do espírito da invenção pode tomar-se evidente para aqueles habilitados nesta técnica e o escopo desta invenção deve ser determinado pelas reivindicações anexas e seus equivalentes. «£-.T.T.I.U.I.T.T.T.U.T.T.T.T.OVD3X3V039W33DXVX9W9V3V3 -.S £3Af-IP PZ

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32 DEG5 AGGCGATGCGGGCTGTACTCTGGGTGGCTGCCACAGT

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continuação 58 dN6-ACP 5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAinnNNNNNN-3’ 59 rGl-ACP 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATmiIGGr(G)d(GG)-3 ’ 60 JYC5 5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3’ 61 JYCS-Tis-ACP 5 ’ -CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIITTTTTT TTTTTTTTT-3’ 62 JYC5-T15V-ACP 5,-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIITTTTTTT TÍTTTTTTV-3’ 63 JYC5-T15VN-ACP 5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGATilM]TTTTT ΊΤΤΤΓΤΤΤΤνΝ-3’ 64 ACP101 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATimiCCGGAGGATC-3’ 65 ACP109 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATmiICTGCAGGACG-3’ 66 ACPI 16 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGGAGCATCC-3 ’ 67 ELAM1N1 5’-TTGCACACTGTTGATTCTAA-3’ 68 ELAM1C1 5,-TTAΊTGATGGTCTCTACACA-3, 69 ELAM1N2 5 ’-CCACTGAGTCCAACATTC-3 ’ 70 ELAM1C2 5’-CTGAAACACTTCCCACAC-3’ 71 P53N1 5’-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’ 72 P53C1 5 ’ -ATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3 ’ 73 P53N2 5 ’-TGCTTGCCACAGGTCTC-3 ’ 74 P53C2 5 ’-GCAGTGCTAGGAAAGAGG-3 * 75 ELAM1N1-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATnmTTGCACACTGT TGATTCTAA-3’ 76 ELAM1C1-ACP 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAnmTTATTGATGGT CTCTACACA-3 ’ TABELA 1 - continuação 77 ELAM1N2-ACP 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCACTGAGTCC AACATTC-3’ 78 ELAM1C2-ACP 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAmiICTGAAACACTT CCCACAC-3’ 79 P53N1-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIimCCTCTGACTGC TCTTTTCAC-3’ 80 P53C1-ACP 5 ’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAimiATTGAAGTCTC ATGGAAGCC-3’ 81 P53N2-ACP 5 '-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATnniTGCTTGCC AC A GGTCTC-3’ 82 P53C2-ACP 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAimiGCAGTGCTAGG AAAGAGG-3’ 83 JYC2-HD1 5 ’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAimiGTNCRRGTGTG GTT-3’ 84 JYC2-HD2 5 ’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIimGTNCRRGTCTG GTT-3’ 85 JYC2-HD3 5 ’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAfflIIGTNCRRGTTTG GTT-3’ 86 P53N 5’-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’ 87 P53C-ACP 5’-TCACAGAAGTATGCCAAG€GAIIIIIATTGAAGTCTC ATGGAAGCC-3’ 88 P53N1A-ACP 5 ’-GTCTACC AGGC ATTCGCTTCATIimCCCCGCGTGG-3 ’ 89 P53N1B-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATmnCCCCCCGTGG-3’ 90 P53N2A-ACP 5 ’-GTCTACCAGGC ATTCGCTTCATinnTCCCCGCGTG-3 ’ 91 P53N2B-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATnmTCCCCCCGTG-3’ TABELA 1 - continuação 92 P53N3A-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATmnCTCCCCGCGT-3’ 93 P53N3B-ACP 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCITC ATnfflCTCCCCCCGT-3 ’ 94 P53N4A-ACP 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATiniIGCTCCCCGCG-3 ’ 95 P53N4B-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATniIIGCTCCCCCCG-3’ 96 P53N5A-ACP 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTC ATHIIIGCTCCCCG-3 ’ 97 P53N5B-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATmnGCTCCCCC-3’ 98 703N 5 ’-ATTCTGATGGTGTGGATTGTG-3 ’ 99 SM703C 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAimiACCCTGGAGTAG ACGAAGA-3’ 100 SM703-A 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIimGGTACAGGGC-3 ’ 101 SM703-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATimiGGTACCGGGC-3’ 102 028N 5 ’-CCTTCTGTGCTTGATGCTTTT-3 ’ 103 SM028C 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAimiCAGGAAGGATGA GCATTTAG-3’ 104 SM028-A 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATmnTCCAAACCAA-3 ’ 105 SM028-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIimTCCAACCCAA-3’ 106 695N 5’-AGAAAAACCAGAGGCAGCTT-3’ 107 SM695C 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAimiAGCACAAACCAA AGACACAGT-3’ 108 SM695-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIim CCATTTTAGG-3’ 109 SM695-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIim CCATTGTAGG-3’ 110 679N 5 ’ -CTAGCTGCAAGTGACATCTCT-3 ’ 111 SM679C 5’-TCACAGAGTATCCAAGCGimrrCAGTAAGAAG CCAGGAGAG-3’ 112 SM679-A 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCITCATIimCCAGAACnT-3 ’ TABELA 1 - continuação 113 SM679-B 5 ’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATnmCCAGACCTTT-3 ’ 114 832N 5’-TTTTGGGTGGAGGCTAACAT-3’ 115 SM832C 5 ’-TCACAGAAGTATGCCAGCGAIfflIAACGATGCAG ACACC ACCA-3 ’ 116 SM832-A S^GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGGTAAA-S’ 117 SM832-B 5 ’-GTCTACCAGGC ATTCGCTT CATmiIGACTGATAAA-3 ’ 118 880N 5 ’-CTTCC ACCAATACTCTTTTCC-3 ’ 119 SM880C 5’-TCACAGAAGTATGCCAGCGA]IinGCATACACACA AGAGGCAGA-3’ 120 SM880-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATimiAAAGCCATAA-3’ 121 SM880-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATDinAAAGCTATA__________ S = G ou C W = A ou T V = A, G ou C N = A, G, C ou T I é desoxiinosina r é ribose d é desoxirribose __________________________________TABELA 2____________________________________ Fragmentos de cDNA Diferencialmente Expressos Clonados pelo ACP da Presente Invenção Nomenclatura Identidade Homologia DEG1 Tropomiosina 2 (beta) Camundongo 92 % DEG 2 Novo Novo DEG 3 Proteína Hipotética (gene Tes) Camundongo 99 % DEG 4 Protease-6 Camundongo 92 % DEG 5 Novo Novo DEG 6 Citocromo c oxidase, subunidade Vb Camundongo 99 % DEG 7 Hidroxilacil-Coenzima A desidrogense (Hadh) Camundongo 98 % DEG 8 Troponina T2, cardíaca (Tnnt2) Camundongo 94 % DEG 9 Proteína do motivo de ligação de RNA, cromossoma X

Camundongo 96 % DEG 10 Peroxiredoxina 6 (Prdx6) Camundongo 89 % DEG 11 cDNA de embrião de 11 dias ou 13 dias Camundongo 98 % Referências Anônimo (1992) Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction. A multicenter study. JAMA 267, 2609 a 2615.

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Claims

1. Iniciador de controle de andamento para melhorar a especificidade de andamento na amplificação de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma porção de extremidade 3’ tendo uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a um sítio cm um ácido nucléico padrão para hibridizar com ela; (b) uma porção de extremidade 5’ tendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária; e (c) uma porção reguladora posicionada entre a dita porção de extremidade 3’ e a dita porção de extremidade 5’ que compreende pelo menos duas bases universais ou bases não discriminatórias análogas, por meio da qual a dita porção reguladora é capaz de regular uma porção de anelamento do dito iniciador em associação com a temperatura de andamento, em que os ditos inieiadores de controle de anelamento tem uma fórmula geral de 5’ - Xp-Yq-Zr - 3’, em que Xp representa a dita porção de extremidade 5’ tendo a dita sequência de nucleotídeo arbitrária pré selecionada substancial mente não complementar a nenhum sítio no ácido nucléico padrão; Yq representa a dita porção reguladora que compreende pelo menos duas bases universais ou bases não discriminatórias análogas; Zr representa a dita porção de extremidade 3' tendo uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a um sítio no ácido nucléico padrão para hibridizar com ela; em que p, q e r representam o número de nucleotídeos; e em que X, Y e Z são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos.

2. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita seqüência de nucleotídeo arbitrária pré selecionada da dita porção de extremidade 5' é substancialmente não complementar a nenhum sítio no dito ácido nucléico padrão.

3. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucléico padrão é gDNA, cDNA ou mRNA.

4. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os ditos gDNA ou cDNA são DNA de filamento único ou duplo.

5. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amplificação de ácido nucléico é realizada sob uma primeira e uma segunda temperaturas de anelamento.

6. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita primeira temperatura de anelamento na dita amplificação de ácido nucléico é idêntica ou mais baixa do que a dita segunda temperatura de anelamento.

7. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita porção de extremidade 3’ está envolvida no anelamento na dita primeira temperatura de anelamento e a dita porção de extremidade 5’ serve como um sítio de iniciação na dita segunda temperatura de anelamento.

8. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita porção reguladora é capaz de restringir a dita porção de anelamento do dito iniciador à dita porção de extremidade 3’ na dita primeira temperatura de anelamento.

9. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita primeira temperatura de anelamento está entre cerca de 30° C e 68° C.

10. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita segunda temperatura de anelamento está entre cerca de 50° C e 72° C.

11. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita base universal ou a dita base não discriminatória análoga são capazes de formar pares de base com cada uma das bases de DNA/RNA naturais com pouca discriminação entre as ditas bases de DNA/RNA naturais.

12. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita base universal ou a dita base não discriminatória análoga são selecionadas do grupo que consiste de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2’-desoxiinosina, 2-aza-2’-desoxiinosina, 2’-OMe inosina, 2’-F inosina, desóxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2’-OMe 3-nitropirrol, 2’-F 3-nitropirrol, l-(2’-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropim)l, desóxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2’-OMe 5-nitroindol, 2’-F 5-nitroindol, desóxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, desóxi 4-amino-benzimidazol, 4-aminobenzimidazol, desóxi nebularina, 2’-F nebularina, 2’-F 4-nitrobenzimidazol, ΡΝΑ-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA- 4- nitrobenzimidazol, ΡΝΑ-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4- nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2’-0-metoxietil inosina, 2’-0-metoxietil nebularina, 2’-0-metoxietil 5- nitroindol, 2’-0-metoxietil 4-nitro-benzimidazol, 2’-0-metoxietil 3-nitropirrol e combinações destas.

13. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita base universal ou a dita base não discriminatória análoga é desoxiinosina, l-(2’-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol ou 5-nitroindol.

14. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita porção reguladora compreende nucleotídeos contíguos tendo a base universal ou a base não discriminatória análoga.

15. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos desoxirribonucleotídeos são dNMPs que ocorrem naturalmente, nucleotídeos modificados e nucleotídeos não naturais.

16. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que p representa um número inteiro de 15 a 60.

17. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que q é pelo menos 3.

18. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que q é pelo menos 4.

19. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que q representa um número inteiro de 2 a 15.

20. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que r representa um número inteiro de 6 a 50.

21. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que p é um número inteiro de 15 a 60, q é um número inteiro de2al5eré um número inteiro de 6 a 30.

22. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xp compreende uma seqüência iniciadora universal.

23. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xp inclui uma sequência ou sequências reconhecidas por uma endonuclease de restrição ou endonucleases de restrição.

24. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xp compreende pelo menos um nucleotídeo com um rótulo para a detecção ou isolamento.

25. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Zr é uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza com a cauda de poliadenosina (poliA) de um mRNA.

26. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que Zr compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de desoxitimidina.

27. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que Zr compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de desoxitimidina tendo 3’-V na sua extremidade 3’; em que V é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxicitidina e desoxiguanosina.

28. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que Zr compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de desoxitimidina tendo 3’-NV na sua extremidade 3’; em que V é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxicitidina e desoxiguanosina e N é um selecionado do grupo que consiste de desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina e desoxiguanosina.

29. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Zr é uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma seqüência alvo no ácido nucléico padrão.

30. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Zr é uma seqüência aleatória de nucleotídeo.

31. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Zr é uma seqüência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma seqüência de consenso encontrada em uma família de gene.

32. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Z*ê uma seqüência degenerada de nucleotídeo selecionada de uma pluralidade de combinações de nucleotídeos que codificam uma seqüência de aminoácido predeterminada.

33. Iniciador de controle de anelamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Zr compreende pelo menos um ribonucleotídeo.

34. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o iniciador ou o conjunto de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 33.

35. Kit de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o kit ainda compreende um iniciador ou um par de iniciadores tendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde à dita porção de extremidade 5’ do dito iniciador de controle de anelamento como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 33.

36. Método para amplificar uma seqüência de ácido nucléico de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreendem: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita seqüência de ácido nucléico em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o par de iniciadores como definidos qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da dita seqüência de ácido nucléico para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela à dita região da dita seqüência de ácido nucléico, por meio das quais o produto de amplificação da dita seqüência de ácido nucléico é gerado; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito produto de amplificação gerado a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (a) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do dito produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o dito produto de amplificação é re-amplificado.

38. Método para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucléicos, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita seqüência de ácido nucléico alvo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o par de iniciadores de qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma sequência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da dita seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela à sua sequência de nucleotídeo alvo, por meio das quais o produto de amplificação da dita seqüência de nucleotídeo alvo é gerado; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito produto de amplificação gerado a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (a) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do dito produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o dito produto de amplificação é re-amplificado.

40. Método para amplificar seletivamente uma seqüência de ácido nucléico alvo a partir de um mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso o dito mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador que tem pelo menos a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) contactar o dito mRNA com um iniciador de oligonucleotídeo dT que é hibridizado à cauda poliA do dito mRNA sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso o dito mRNA ao qual o dito iniciador de oligonucleotídeo dT hibridiza para produzir um primeiro filamento de DNA que é complementar ao dito mRNA ao qual o dito iniciador de oligonucleotídeo dT hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita seqüência de ácido nucléico alvo a partir do dito primeiro filamento de DNA obtido a partir da etapa (b) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o par de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da dita seqüência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela à sua seqüência de nucleotídeo alvo, por meio das quais o produto de amplificação da dita seqüência de nucleotídeo alvo é gerado; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito produto de amplificação gerado a partir da etapa (c) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (c) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos iniciadores usados na etapa (c), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do dito produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o dito produto de amplificação é re-amplificado.

42. Método para detectar a complementaridade de DNA ao mRNA diferencialmente expresso em duas ou mais amostras de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso o dito mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) fornecer uma primeira amostra de ácidos nucléicos que representem uma primeira população de transcritos de mRNA e uma segunda amostra de ácidos nucléicos que representam uma segunda população de transcritos de mRNA; (b) separadamente contactar cada uma da dita primeira amostra de ácido nucléico e da dita segunda amostra de ácido nucléico com um primeiro iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, em que a porção de extremidade 3’ do dito primeiro iniciador compreende uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a um primeiro sítio no dito mRNA diferencialmente expresso para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (c) transcrever de modo reverso o dito mRNA diferencialmente expresso ao qual o dito primeiro iniciador hibridiza para produzir uma primeira população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares ao dito mRNA diferencialmente expresso na dita primeira amostra de ácido nucléico à qual o dito primeiro iniciador hibridiza e uma segunda população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares ao dito mRNA diferencialmente expresso na dita segunda amostra de ácido nucléico à qual o dito primeiro iniciador hibridiza; (d) purificar e quantificar cada um das ditas primeira e segunda populações de primeiros filamentos de cDNA; (e) realizar uma amplificação de primeiro estágio de cada uma das ditas primeira e segunda populações dos primeiros filamentos de DNA obtidos a partir da etapa (d) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a um segundo sítio nas ditas primeira e segunda populações de primeiros filamentos de cDNA, sob condições em que o dito segundo iniciador anela ao dito segundo sítio em cada população dos ditos primeiros filamentos de cDNA, por meio das quais a primeira e segunda populações de segundos filamentos de DNA são geradas; (f) realizar uma amplificação de segundo estágio de cada segundo filamento de DNA gerado a partir da etapa (e) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (b) e (e), respectivamente ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (b) e (e), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ de cada segundo filamento de DNA, respectivamente, por meio da qual os produtos de amplificação dos ditos segundos filamentos de cDNA são gerados, e (g) comparar a presença ou o nível de produtos de amplificação individuais nas ditas primeira e segunda populações de produtos de amplificação obtidos a partir da etapa (f).

44. Método para amplificar rapidamente um fragmento de cDNA alvo que compreende uma região de cDNA que corresponde à região da extremidade 3’ de um mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso o dito mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) contactar mRNAs com um primeiro iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, em que a porção de extremidade 3’ do dito iniciador compreende uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às caudas poliA dos ditos mRNAs para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso os ditos mRNAs aos quais o dito primeiro iniciador hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares aos ditos mRNAs aos quais o dito primeiro iniciador hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos ditos primeiros filamentos de cDNA em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência de nucleotídeo hibridizadora específica de gene substancialmente complementar a um sítio em um dos ditos primeiros filamentos de cDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o dito segundo iniciador anela a um sítio específico de gene em um dos ditos primeiros filamentos de cDNA, por meio das quais uma síntese do segundo cDNA de filamento específico de gene é gerado; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio da dita síntese do segundo filamento de cDNA específico de gene gerado a partir da etapa (c) em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (a) e (c), respectivamente, ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (a) e (c), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anele às seqüências de extremidades 3’ e 5’ de uma síntese do segundo filamento de cDNA específico de gene, respectivamente, por meio das quais um produto de amplificação de um filamento de cDNA específico de gene é gerado.

46. Método para amplificar rapidamente um fragmento de cDNA alvo, que compreende uma região de cDNA que corresponde à região de extremidade 5’ de um mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso o dito mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) contactar mRNAs com um iniciador de oligonucleotídeo dT ou iniciador aleatório como um iniciador de síntese de cDNA sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra, em que o dito iniciador de síntese de cDNA compreende uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a uma região de um mRNA para hibridizar com ela; (b) transcrever de modo reverso os ditos mRNAs, usando uma transcriptase reversa, à qual o dito iniciador de síntese de cDNA hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares aos ditos mRNAs aos quais o dito iniciador de síntese de cDNA hibridiza, por meio das quais os intermediários de mRNA-cDNA são gerados; (c) permitir que resíduos de citosina sejam formados em terminação nas extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA na forma dos ditos intermediários de mRNA-cDNA pela reação de transferase terminal de transcriptase reversa; (d) contactar as caudas de citosina nas extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA gerados a partir da etapa (c) com um oligonucleotídeo que compreende uma porção de extremidade 3’ e uma porção de extremidade 5’ separadas por um grupo de base universal ou base não discriminatória análoga, em que a porção de extremidade 3’ compreende pelo menos três resíduos de guanina na sua extremidade 3’ para hibridizar com as ditas caudas de citosina nas extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA e a porção de extremidade 5’ compreende uma seqüência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária, sob condições em que a dita porção de extremidade 3’ do dito oligonucleotídeo é hibridizada às ditas caudas de citosina; (e) estender as extremidades 3’ formadas em terminação dos ditos primeiros filamentos de cDNA para gerar uma seqüência adicional complementar ao dito oligonucleotídeo usando transcriptase reversa, em que o dito oligonucleotídeo serve como um padrão na reação de extensão, por meio da qual os primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo são prolongados; (f) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo obtidos a partir da etapa (e) em uma primeira temperatura de anelamento, que compreende as etapas de: (i) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um primeiro iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar às sequências da extremidade 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, sob condições em que o dito primeiro iniciador anela às extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, por meio das quais segundos filamentos de cDNA de comprimento completo são gerados; (ii) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um segundo iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora específica de gene substancialmente complementar a uma região em um dos ditos segundos filamentos de cDNA de comprimento completo para hibridizar com ela, sob condições em que o dito segundo iniciador anela a um sítio específico de gene em um dos ditos segundos filamentos de cDNA de comprimento completo, por meio das quais um filamento de cDNA específico de gene é gerado; e (g) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito filamento de cDNA específico de gene em uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (f)-(i) e (f)-(ii), respectivamente, ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (f)-(i) e (f)-(ii), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ de um filamento de cDNA específico de gene, respectivamente, por meio das quais um produto de amplificação de um filamento de cDNA específico de gene é gerado.

48. Método para amplificar uma população de cDNAs de filamento duplo de comprimento completo complementar aos mRNAs, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso o dito mRNA e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

49. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: (a) contactar os ditos mRNAs com um primeiro iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, em que a porção de extremidade 3’ do dito primeiro iniciador tem uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar às caudas poliA dos ditos mRNAs para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso os ditos mRNAs, usando uma transcriptase reversa, à qual o dito primeiro iniciador hibridiza para produzir a dita população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares aos ditos mRNAs aos quais o dito iniciador hibridiza, por meio da qual intermediários de mRNA-cDNA são gerados; (c) permitir que resíduos de citosina sejam formados em terminação nas extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA na forma dos ditos intermediários de mRNA-cDNA pela reação de transferase terminal de transcriptase reversa; (d) contactar as caudas de citosina nas extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA gerados a partir da etapa (c) com um oligonucleotídeo que compreende uma porção de extremidade 3’ e uma porção de extremidade 5’ separadas por um grupo de base universal ou base não discriminatória análoga, em que a porção de extremidade 3’ compreende pelo menos três resíduos de guanina na sua extremidade 3’ para hibridizar com as ditas caudas de citosina nas extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA e a porção de extremidade 5’ compreende uma sequência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária, sob condições em que a dita porção de extremidade 3’ do dito oligonucleotídeo é hibridizada às ditas caudas de citosina; (e) estender as extremidades 3’ formadas em terminação dos ditos primeiros filamentos de cDNA para gerar uma sequência adicional complementar ao dito oligonucleotídeo usando transcriptase reversa, em que o dito oligonucleotídeo serve como um padrão na reação de extensão, por meio da qual os primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo são prolongados; e (Γ) realizar uma amplificação dos ditos primeiros filamentos de cDNA dc comprimento completo gerados a partir da etapa (e) que compreende pelo menos dois ciclos de andamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo que corresponde ao mesmo primeiro iniciador e oligonucleotídeo como usados nas etapas (a) e (d), respectivamente, ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do dito primeiro iniciador e oligonucleotídeo usados nas etapas (a) e (d), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, respectivamente, por meio das quais os produtos de amplificação de filamentos de cDNA de comprimento completo complementares aos ditos mRNAs são gerados.

50. Método para amplificar cDNAs de filamento duplo enriquecidos em 5’ complementares aos mRNAs, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso os ditos mRNAs e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ler a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: (a) contactar os ditos mRNAs com um primeiro iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra, em que a porção de extremidade 3’ do dito primeiro iniciador tem pelo menos seis seqüências de nucleotídeo aleatórias; (b) realizar as etapas (b)-(e) de acordo com a reivindicação 49, por meio das quais primeiros filamentos de cDNA enriquecidos em 5’ são prolongados; (c) realizar um amplificação dos ditos primeiros filamentos de cDNA enriquecidos em 5’ gerados a partir da etapa (b) que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do dito iniciador e oligonucleotídeo usados nas etapas (a) e (b), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anele às sequências de extremidades 3’ e 5’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA enriquecidos em 5’, respectivamente, por meio das quais os produtos de amplificação de filamentos de cDNA enriquecido em 5’ são gerados.

52. Método para amplificar mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo simultaneamente usando mais do que um par de iniciadores na mesma reação, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio de mais do que uma seqüência de nucleotídeo alvo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os pares de iniciadores como definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 em que a sua porção de extremidade 3’ cada uma de cada par de iniciadores tem uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancialmente complementar a uma região da dita sequência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, sob condições em que cada um dos ditos pares de iniciadores anela à sua sequência de nucleotídeo alvo, por meio das quais os produtos de amplificação de sequências de nucleotídeo alvo são gerados; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio dos ditos produtos de amplificação gerados a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo par de iniciadores como usados na etapa (a) ou par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeos pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos pares de iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada um de cada par de iniciadores anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ dos ditos produtos de amplificação gerados a partir da etapa (a), respectivamente, por meio das quais os ditos produtos de amplificação são re-amplificados na mesma reação.

54. Método para produzir uma impressão digital de DNA de gDNA, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita impressão digital do DNA, que é um conjunto de segmentos de DNA separados característicos de genoma, a partir do dito gDNA em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o iniciador ou o par de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, em que cada iniciador tem na sua porção de extremidade 3’ uma sequência arbitrária de nucleotídeo substancialmente complementar aos sítios no dito gDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o dito iniciador ou o dito par de iniciadores anela ao dito gDNA, por meio das quais o dito conjunto de segmentos de DNA separados caracterizados como uma impressão digital de DNA é produzido; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito conjunto de segmentos de DNA separados gerado a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo iniciador ou par de iniciadores como usados na etapa (a) ou um iniciador ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do dito iniciador ou par de iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que o dito iniciador ou cada um do dito par de iniciadores anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ do dito conjunto de segmentos de DNA separados gerado a partir da etapa (a), respectivamente, por meio das quais o dito conjunto de segmentos de DNA separados é re-amplificado.

56. Método para produzir uma impressão digital de RNA de uma amostra de mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como d iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

57. ac0nj0 com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende; (a) contactar a dita amostra de mRNA com um primeiro iniciador como definido cm qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, em que o dito primeiro iniciador tem uma sequência de nucleotídeos hibridizadora substancialmente complementar às caudas poli A da dita amostra de mRNA para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirríbonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso a dita amostra de mRNA à qual o dito primeiro iniciador hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares à dita amostra de mRNA à qual o dito primeiro iniciador hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita população de primeiros filamentos de cDNA gerada a partir da etapa (b) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador ou par de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, em que cada iniciador tem na sua porção de extremidade 3’ uma sequência arbitrária de nucleotídeo substancialmente complementar aos sítios nos ditos primeiros filamentos de cDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o dito iniciador ou par de iniciadores anelam à dita amostra de mRNA, por meio da qual um conjunto de segmentos de cDNA separados caracterizados como uma impressão digital de RNA é produzido; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito conjunto de segmentos de cDNA separados gerado a partir da etapa (c) a uma segunda temperatura de aneiamento que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de aneiamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo iniciador ou par de iniciadores como usados na etapa (c) ou um iniciador ou par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nuclcotídcos que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do dito iniciador ou par de iniciadores usados na etapa (c), sob condições em que o dito iniciador ou cada um do dito par de iniciadores anela às seqüências de extremidades 3' e 5’ do dito conjunto de segmentos de cDNA separados gerado a partir da etapa (c), respectivamente, por meio das quais o dito conjunto de segmentos de cDNA separados é re-amplifícado.

58. Método para identificar segmentos de homologia conservada em uma família de multigene a partir de uma amostra de mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende transcrever de modo reverso e realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, disdnguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24,

59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) contactar a dita amostra de mRNA com um primeiro iniciador como definido cm qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, em que o dito primeiro iniciador tem uma sequência de nucleotídeo hibridizadora substancial mente complementar às caudas poli A da dita amostra de mRNA para hibridizar com ela, sob condições suficientes para que a síntese de ácido desoxirribonucléico enzimática direcionada pelo padrão ocorra; (b) transcrever de modo reverso a dita amostra de mRNA à qual o dito primeiro iniciador hibridiza para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNA que são complementares à dita amostra de mRNA à qual o dito primeiro iniciador hibridiza; (c) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita população de primeiros filamentos de cDNA gerada a partir da etapa (b) em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um segundo iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma sequência hibridizadora substancialmente complementar a uma sequência de consenso ou uma sequência degenerada que codifica a sequência de aminoácidos de um segmento de homologia conservada nos ditos primeiros filamentos de cDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o dito segundo iniciador anela à dita sequência de consenso ou sequência degenerada de primeiros filamentos de cDNA, por meio das quais segmentos de cDNA da extremidade 3’ tendo a dita sequência de consenso ou sequência degenerada são gerados; e (d) realizar uma amplificação de segundo estágio dos ditos segmentos de cDNA da extremidade 3’ gerados a partir da etapa (c) a uma segunda temperatura de anelamento que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (a) e (c) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (a) e (c), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ dos ditos segmentos de cDNA da extremidade 3’, respectivamente, por meio das quais os ditos segmentos de cDNA de homologia conservada da extremidade 3’ são amplificados.

60. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) realizar as etapas de (a)-(e) como definidas na reivindicação 49, por meio das quais os filamentos de cDNA de comprimento completo são gerados; (b) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo obtidos a partir da etapa (a) em uma primeira temperatura de anelamento, que compreende as etapas de: (i) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um primeiro iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos substancialmente complementar às seqüências da extremidade 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, sob condições em que o dito primeiro iniciador anela às extremidades 3’ dos ditos primeiros filamentos de cDNA de comprimento completo, por meio das quais os segundos filamentos de cDNA de comprimento completo são gerados; e (ii) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um segundo iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma sequência hibridizadora substancialmente complementar a uma sequência de consenso ou uma sequência degenerada que codifica a sequência de aminoácidos de um segmento de homologia conservada nos ditos segundos filamentos de cDNA de comprimento completo para hibridizar com ela, sob condições em que o dito segundo iniciador anela à dita seqüência de consenso ou seqüência degenerada de segundos filamentos de cDNA de comprimento completo, por meio das quais os segmentos de cDNA da extremidade 5’ tendo a dita seqüência de consenso ou seqüência degenerada são gerados; e (c) realizar uma amplificação de segundo estágio dos ditos segmentos de cDNA da extremidade 5’ gerados a partir da etapa (b) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (b)-(i) e (b)-(ii), respectivamente, ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeos que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos primeiro e segundo iniciadores usados nas etapas (b)-(i) e (b)-(ii), respectivamente, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ dos ditos segmentos de cDNA da extremidade 5’, respectivamente, por meio das quais os ditos segmentos de cDNA de homologia conservada da extremidade 5’ são amplificados.

61. Método para identificar segmentos de homologia conservada em uma família de multigene a partir de gDNA, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio dos ditos segmentos de homologia conservada a partir do dito gDNA em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o iniciador ou o par de iniciadores como definido nas reivindicações de 1 a 24, em que cada iniciador tem na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência de consenso ou uma seqüência degenerada que codificam a sequência de aminoácido de um segmento de homologia conservada no dito gDNA para hibridizar com ela, sob condições em que o dito iniciador ou o dito par de iniciadores anelam à dita seqüência de consenso ou seqüência degenerada de gDNA, por meio da qual os segmentos de DNA genômico tendo a dita sequência de consenso ou sequência degenerada são gerados; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio dos ditos segmentos de DNA genômico gerados a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando o mesmo iniciador ou par de iniciadores como usados na etapa (a) ou um iniciador ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a cada porção de extremidade 5’ do dito iniciador ou par de iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que o dito iniciador ou cada um do dito par de iniciadores anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ dos ditos segmentos de DNA genômico gerados a partir da etapa (a), respectivamente, por meio das quais os ditos segmentos genômicos de homologia conservada são amplificados.

63. Método para identificar uma variação de nucleotídeo em um ácido nucléico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando amplificações de estágio duplo, que compreende: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio para produzir um primeiro filamento de DNA complementar ao dito ácido nucléico alvo incluindo a dita variação de nucleotídeo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um primeiro iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada a um primeiro sítio do dito ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, em que cada um do dito primeiro iniciador e do dito primeiro sítio compreende uma posição de interrogação que corresponde à dita variação de nucleotídeo, por meio da qual o dito primeiro filamento de DNA complementar ao dito ácido nucléico alvo incluindo a dita variação de nucleotídeo é gerado quando a dita posição de interrogação é ocupada pelos nucleotídeos complementares do dito primeiro iniciador aos seus nucleotídeos correspondentes do dito primeiro sítio; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito primeiro filamento de DNA gerado a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende as etapas: (i) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um segundo iniciador de qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma sequência hibridizadora substancialmente complementar a uma sequência pré selecionada a um segundo sítio do dito ácido nucléico alvo para hibridizar com ela sob condições em que o dito segundo iniciador anela ao dito segundo sítio do ácido nucléico alvo, por meio da qual um segundo filamento de DNA complementar ao dito primeiro filamento de DNA incluindo a dita variação de nucleotídeo é gerado; e (ii) pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando os mesmos primeiro e segundo iniciadores como usados nas etapas (a) e (b)-(i), respectivamente, ou um par de iniciadores cada um tendo uma sequência hibridizadora complementar ou que corresponde às extremidades 3’ e 5’ do dito segundo filamento de DNA gerado a partir da etapa (b)-(i) para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela às sequências de extremidades 3’ e 5’ do dito segundo filamento de DNA, respectivamente, por meio da qual o dito segundo filamento de DNA que compreende o dito primeiro e segundo sítios do dito ácido nucléico alvo às suas extremidades 3’ e 5’ é amplificado de modo que um segmento de nucleotídeo alvo curto que corresponde ao dito segundo filamento de DNA contendo a dita variação de nucleotídeo é gerado.

65. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado usando duas amplificações individuais de uma primeira e uma segunda amplificações em que a dita segunda amplificação é realizada usando amplificações de dois estágios, que compreende: (a) realizar a dita primeira amplificação para produzir um fragmento de filamento de DNA curto contendo a dita variação de nucleotídeo entre as suas extremidades que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores cada iniciador compreendendo uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma sequência pré selecionada a um sítio do dito ácido nucléico alvo sob condições em que a dita variação de nucleotídeo seja posicionada entre as ditas sequências pré selecionadas, em que pelo menos um iniciador do dito conjunto de iniciadores é como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ a dita seqüência hibridizadora, por meio da qual o dito fragmento de filamento de DNA curto contendo a dita variação de nucleotídeo entre as suas extremidades é amplificado; (b) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita segunda amplificação para produzir um primeiro filamento de DNA complementar ao dito fragmento de filamento de DNA curto incluindo a dita variação de nucleotídeo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um primeiro iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma seqüência pré selecionada a um primeiro sítio do dito ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, em que cada um do dito primeiro iniciador e do dito primeiro sítio compreende uma posição de interrogação que corresponde a dita variação de nucleotídeo, por meio da qual o dito primeiro filamento de DNA complementar ao dito ácido nucléico alvo incluindo a dita variação de nucleotídeo é gerado quando a dita posição de interrogação é ocupada pelos nucleotídeos complementares do dito primeiro iniciador aos seus nucleotídeos correspondentes do dito primeiro sítio; e (c) realizar uma amplificação de segundo estágio da dita segunda amplificação do dito primeiro filamento de DNA gerado a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador usando um par de iniciadores em que entre o dito par de iniciadores um é o mesmo que o dito iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 usado na etapa (a) e o outro é o mesmo que o dito primeiro iniciador usado na etapa (b) ou um par de iniciadores cada um tendo uma seqüência hibridizadora complementar ou que corresponde às extremidades 3’ e 5’ do dito primeiro filamento de DNA gerado a partir da etapa (b) para hibridizar com ela, sob condições em que cada iniciador anela às seqüências de extremidades 3’ e 5’ do dito primeiro filamento de DNA, respectivamente, por meio das quais o dito primeiro filamento de DNA é amplificado de modo que um segmento de nucleotídeo alvo curto que corresponde ao dito primeiro filamento de DNA contendo a dita variação de nucleotídeo é gerado.

66. Método para a mutagênese em um ácido nucléico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação usando iniciadores, distinguidos por pelo menos um iniciador ter a mesma estrutura como o iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a dita mutagênese é direcionada a sítio e usa amplificações de dois estágios, que compreende as etapas de: (a) realizar uma amplificação de primeiro estágio da dita sequência de ácido nucléico alvo em uma primeira temperatura de anelamento que compreende pelo menos dois ciclos de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando um par de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 cada um tendo na sua porção de extremidade 3’ uma seqüência hibridizadora substancialmente complementar a uma região da dita sequência de ácido nucléico alvo para hibridizar com ela, em que uma das ditas seqüências de hibridização tem pelo menos um nucleotídeo de ligação inespecífica para gerar a mutação direcionada a sítio, sob condições em que o dito iniciador ou par de iniciadores anela à sua sequência de nucleotídeo alvo, por meio das quais um produto de amplificação contendo o sítio da mutação direcionada a sítio é gerado; e (b) realizar uma amplificação de segundo estágio do dito produto de amplificação gerado a partir da etapa (a) a uma segunda temperatura de anelamento, que está em condições de alta severidade, que compreende pelo menos um ciclo de anelamento do iniciador, estender e desnaturar o iniciador, usando os mesmos iniciadores como usados na etapa (a) ou um par de iniciadores cada um compreendendo uma sequência de nucleotídeo pré selecionada arbitrária que corresponde a cada porção de extremidade 5’ dos ditos iniciadores usados na etapa (a), sob condições em que cada iniciador anela às extremidades 3’ e 5’ do dito produto de amplificação, respectivamente, por meio das quais o dito produto de amplificação contendo o sítio da mutação direcionada a sítio é re-amplificado.

68. Método de acordo com as reivindicações 37, 39, 41, 45, 47, 53, 55, 57, 59, 60 ou 62, caracterizado pelo fato de que o dito par de iniciadores usado na dita amplificação do primeiro estágio é uma combinação de um iniciador de controle de anelamento selecionado dos iniciadores como definidos em as reivindicações de 1 a 24 e um iniciador convencional.

69. Uso do iniciador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 33, caracterizado pelo fato de ser em um processo que envolve a amplificação de ácido nucléico.