CN1578841A - 退火控制引物及该退火控制引物的使用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于提高在核酸扩增中退火特异性的退火控制引物和该退火控制引物在所有涉及核酸扩增技术领域的应用。本发明的引物包括(a)具有与与其杂交的模板核酸上的位点基本互补的杂交核苷酸序列的3′－末端部分；(b)具有预先选择的任意核苷酸序列的5′－末端部分；及(c)位于该3′－和5′－末端部分之间的调控子部分，该调控子部分含有至少一个通用碱基或非识别碱基类似物，从而该调控子部分能够结合退火温度条件调节该引物的退火部分。

Description

退火控制引物及该退火控制引物的使用
技术领域
本发明涉及一种退火控制引物及其应用。更具体地，本发明涉及一种用于在核酸扩增中提高退火特异性的退火控制引物及其在所有涉及核酸扩增的领域中的应用。
背景技术
核酸扩增对于分子生物学领域中的各种方法是一个关键的过程，因此各种不同的扩增方法被提出。例如，Miller，H.I.等(WO 89/06700)公开了基于启动子/引物序列同靶单链DNA(“ssDNA”)杂交，然后进行该序列的许多RNA拷贝的转录的核酸序列扩增。其它已知的核酸扩增程序包括基于转录的扩增系统(Kwoh，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：1173(1989)；and Gingeras T.R.et al.，WO 88/10315)。
在具有获得的“二-寡核苷酸”的序列的核酸存在的情况下，基于两个或多个寡核酸的连接，从而扩增该二-寡核苷酸的方案，被称作“连接链式反应”(LCR)，这也是已知的(Wu，D.Y.et al.，Genomics 4：560(1989))。
Davey，C.等(欧洲专利申请公开No.329,822)公开了一种涉及循环地合成单链RNA(″ssRNA″)、ssDNA、和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增过程。该ssRNA是第一引物寡核苷酸的模板，该引物寡核苷酸通过逆转录酶(RNA依赖的DNA聚合酶)延长。之后该RNA从得到的DNA:RNA双体中通过核糖核酸酶H的作用被去除。得到的ssDNA是第二引物的模板，也包括RNA聚合酶启动子的序列。该引物然后通过DNA聚合酶被延伸，得到双链DNA(“dsDNA”)分子，具有与两个引物之间的原始RNA相同的序列，并且在一个末端具有附加的启动子序列。该启动子序列可以通过适当的RNA聚合酶被使用以产生许多该DNA的RNA拷贝。这些拷贝然后可以再进入循环从而导致非常快速的扩增。
被称作聚合酶链反应(此后称为“PCR”)的最常见的核酸扩增的方法基于以下步骤的重复循环：双链DNA变性、寡核苷酸引物与DNA模板退火和通过DNA聚合酶进行引物延伸(Mullis et al.U.S.专利Nos.4,683,195，4,683,202，和4,800,159；Saiki et al.1985)。PCR中使用的寡核苷酸引物被设计与该DNA的相对的链退火，并定位，因此DNA聚合酶催化的一个引物的延伸产物可以作为另一个引物的模板链。PCR扩增过程导致长度由寡核苷酸引物的5’-末端决定的离散DNA片断的指数增加。
核酸扩增，尤其PCR扩增的成功依赖于引物仅与其靶(和不与非靶)序列退火的特异性，因此优化这种分子相互作用是重要的。引物是否能够仅与其完美的互补物退火或也与有一个或多个错配的序列退火关键取决于退火温度。通常，退火温度越高，引物与其完美配对的模板退火的特异性越强，因而仅靶序列进行扩增的可能性越大。温度越低，模板与引物之间的可耐受的错配越多，导致非靶序列的扩增增加。调节退火温度能够改变模板与引物之间配对的特异性。例如，如果没有产物，该温度可能是太高，可以被降低。如果，在仅有单一引物的对照中出现多种产物，这说明该单一引物与模板的多于一个区域退火。在这种情况下，退火温度应该被提高。考虑到退火温度对引物退火特异性的这种影响，仍非常需要能够根据退火温度控制引物退火以提高引物退火特异性的引物退火控制系统，而无论引物如何设计。
除了退火温度外，对于引物退火的特异性，许多“引物寻找参数(primer search parameters)”例如引物长度、GC含量和PCR产物的长度(Dieffenbach et al.，1995)也应该被考虑。如果满足所以这些参数的引物被使用，引物退火应该是特异性的，从而导致靶DNA扩增过程中引物退火特异性的显著提高，并且免于试验中由于使用的引物而引起的如背景和非特异性产物的问题。通常，设计完美的引物能够帮助避免非特异性退火和背景，也可在RNA-PCR中区分cDNAs或基因组模板。
许多方法已被研究出来以提高引物退火特异性并且因而完成目的产物的扩增。这些例子包括降温PCR(touchdown PCR)(Don et al.，1991)、热启动PCR(hot start PCR)(D’Aquila et al.，1991)、巢式PCR(Mullis and Faloona，1987)和激发PCR(booster PCR)(Ruano et al.，1989)。另一个可选择的方法已被报道，即许多“增强剂”化合物能够提高PCR的特异性。增强剂化合物包括提高反应的有效退火温度的化学物质、DNA结合蛋白和市售的试剂。然而，并没有能够确保每个PCR都能够成功的“神奇的”添加剂，并且在不同反应条件如退火温度下测试不同的添加剂是太漫长的。尽管这些方法在有些情况下有助于提高引物退火的特异性，但是它们还基本上达不到成为由于PCR扩增中使用的引物而引起的如非特异性产物和高背景的问题的解决方法。
在许多情况下，引物序列并不要求是模板的完全互补物。应该与模板完全匹配的引物区域是引物的3’-末端，因为引物的3’-末端是通过DNA聚合酶被延伸的引物区域，因而对于确保与正确的靶序列的退火特异性是最重要的。引物的5’-末端在决定与靶序列的退火特异性时是相对不重要的，并且可以被修饰以带有附加序列，如与模板不互补的限制位点和启动子序列(McPherson and Moller 2000)。这种概念适于如下所述的本发明的退火控制引物的设计。
基于PCR的技术已经不仅被广泛应用于靶DNA序列的扩增，而且被用于生物学和医学研究领域的科学应用或方法，如逆转录酶PCR(RT-PCR)、差异显示PCR(DD-PCR)、通过PCR克隆已知或未知的基因，cDNA末端的快速扩增(RACE)和基于PCR的基因组分析(McPherson and Moller，2000)。下面仅是典型的PCR应用。
在现代生物学中，设计用于鉴定在各种生理或试验条件下(如，分化、癌变、药理学治疗)由细胞差异调控的基因的技术已经变得非常关键。这样一种用于在不同细胞类型间或在细胞发育的不同阶段间通过PCR来筛选基因表达差异的方法被称作差异显示PCR(DD-PCR)，该方法由Liang和Pardee于1992年描述。这种方法使用10-mer随机引物同锚式cDNA引物的组合物，并且生成主要起源于poly(A)尾并向上游延伸约50～600个核酸的片断。通过将3’锚定寡聚(dT)引物与短的5’随机引物结合，转录体的子集被扩增，所得的cDNA片断通常在变性聚丙烯酰胺凝胶上被分离并且通过放射自显影技术显影。
尽管这种方法简单、快速并且仅需要少量的总RNA，常规的DD-PCR方法仍存在许多缺点。由于使用短的随机引物，差异带分布图的重复性通常很差，所以许多实验室使用这些方法难以获得重复性的结果。已显示，在试验之间，即使对训练有素的技术人员，至少40％的差异显示的带是不可重复的(Bauer el al.，1994)。此外，在Northern杂交上差异表达分布图经常不能被重复，并且假阳性的百分率高达90％(Sompayrac et al.，1995)。用于可替代的改良，使用更长的，如20个碱基的随机引物也不能满意地解决重复性的问题(Ito et al.，1994)。存在其它的引起DD-PCR相对重复性低的因素，如起始材料的量不足和用于制备差异带分布图的dNTP(2～5μM)的浓度非常低(Matz andLukyanov，1998)。用这些方法检测微量的转录本也是困难的(Matz andLukyanov，1998)。此外，因为通过DD-PCR获得的cDNA片断很短(典型地为100～500bp)而且对应于主要代表非翻译区域的基因的3’-末端，所以它们通常不包括大部分编码区。因而，除非显著的基因同源性、关于基因分类和功能预测的信息被获得，否则需要进行大工作量的全长cDNA筛选。
差异显示方法通常使用利用变性聚丙烯酰胺凝胶的放射性检测技术。这种反应产物的放射性检测由于需使用适合的设备因而限制了该技术在实验室的应用。相对较长的曝光时间和从聚丙烯酰胺上分离感兴趣的带所存在的问题是差异显示技术的另外的缺陷。尽管改进的非放射性差异显示技术最近已经被描述，这些方法包括银染(Gottschlichet al.1997；Kociok et al.，1998)、荧光标记的寡核苷酸(Bauer et al.1993；Ito et al.1994；Luehrsen et al.，1997；Smith et al.，1997)，使用生物素化的引物(Korn et al.，1992；Tagle et al.，1993；Rosok et al.，1996)和溴化乙锭染色琼脂糖凝胶(Rompf and Kahl，1997；Jefferies et al.，1998；Gromova et al.，1999)，但是这些方法只取得了非常有限的成功。如果反应产物可在溴化乙锭染色琼脂糖凝胶上简单地检测，且其结果是可重复的和可靠的，则将大大提高DD-PCR分析的速度并避免使用放射性。
另一个被称为靶定差异显示(targeted differential display)的基于PCR的方法利用了指导具有保守蛋白质区域的多基因家族成员的扩增的寡核苷酸引物。基因家族为一组基因的集合，该一组基因的功能特征通常为在细胞中由该基因产物承担特定的功能类型，并且结构上具有一个或多个共同的保守区域(域)。基因家族的例子包括MADS-box和同源基因，还进一步包括转录因子家族。细胞周期蛋白、细胞因子和球蛋白基因家族是医学应用的例子。Prosite数据库提供了具有共同结构域和序列基元的蛋白质列表。PCR中使用的寡聚核苷酸可以或者是用于低退火温度的特异性引物，或者更多的情况是用于更高严格性的简并引物混合物(Stone and Wharton，1994)。然而，使用兼并引物的扩增有时也是有问题的并且可能需要优化。使退火温度尽可能高以避免大量的非特异性扩增是重要的，并且一个好的经验规则是以55℃作为起始温度。通常，该规则难以遵守，因为简并引物应该根据作为前提的氨基酸序列或保守域序列设计。为了在这种方法中在简并引物与退火温度之间形成令人满意的关系，需要使用能够耐受退火温度，具体说高温如68℃，改变的退火控制引物，而无论引物如何设计。
再一基于PCR的技术是用于RNA指纹的任意引物PCR(AP-PCR)。AP-PCR的一个主要优点是简单性(Welsh andMcClelland，1991；Williams et al.，1990)。AP-PCR使用10-mers或更长的18-mers的单一引物或一对引物。该方法以前已经用于获得杂交细胞系(Ledbetter et al.，1990)和特定基因组区域(Welsh and McClelland，1990；Williams et al.，1990)的DNA指纹。该方法也提供了一种用于细菌、真菌和植物鉴定的基因组分析和种群研究的有用工具，其中个体分离物能够被快速地比较。例如，它们可以被用作鉴定病原体或鉴定特定种类或病变型的发生的工具。一般地，AP-PCR使用单一引物从与引物不完全配对的模板区域来启动DNA的合成。为了达到此目的，最初的循环，正常对于前5个循环，必须在低严格(37～50℃)条件下进行，这样能够使引物与分布于基因组的不完全匹配的位点退火。然后严谨度提高(55℃)以达到标准PCR扩增并且反应再进行30～35个循环。AP-PCR并不被建议用于如需要确定的结果的亲子鉴定的应用，因为会偶尔得到非双亲的产物。尽管已发展出包括巢式AP-PCR的可替代的AP-PCR方法(McClelland et al.，1993；Ralph et al.，1993)，但是重复性的问题仍然是主要的关注焦点。一个关于此的焦点是分布图可随时间和实验室不同而变化(see，e.g.，Meunier and Grimont，1993)。
另一基于PCR的应用是RACE(cDNA末端的快速扩增)技术。RACE是用于扩增对应于mRNA的5’-和3’-末端的cDNA区域的方法(Frohman et al.，1988)，并且它已经被成功地用于分离稀有转录本。基因特异性引物可以从包括部分cDNA、基因组外显子或肽的序列数据获得。在3’RACE中，mRNA分子的PolyA尾被用作PCR扩增的引发位点。通过使用本领域已知的逆转录酶和Oligo-dT引物，mRNA被转换成为cDNA。然后生成的cDNA可以直接被用于使用基因特异引物和与polyA区域退火的引物的PCR扩增。
与3’RACE相同的原理用于5’RACE，但是5’RACE无polyA尾。因此5’RACE通过不同的方法来标记cDNA的5’-末端(Fromont-Racineet al.，1993；Schaefer，1995；Franz et al.，1999)。大多数用于5’RACE的方法如同源多聚尾和连接锚定的尾需要在第一链cDNA合成完成后进行一系列酶反应(Schaefer，1995)。每个酶学步骤都有导致失败和破坏cDNA完整性的潜在可能。最近，一种所谓CapFinder方法的替代方法被介绍(Chenchik et al.，1998；Chenchik et al.U.S.Pat.Nos.5,962,271and 5,962,272)。该技术依赖与于逆转录酶的双重功能：一个功能是将无模板的核酸加到cDNA的3’-末端的末端转移酶活性，另一个功能是将一个模板转换到第二个模板的模板转换活性。这种特性在逆转录病毒的生命周期过程中被使用(Clark，1988；Kulpa et al.，1997)。莫洛尼氏鼠白血病毒(M-MLV)逆转录酶(RT)在锰和高镁存在时经常将3～4个非模板起源的胞嘧啶残基加到新合成的cDNAs的3’-末端(Schmidtand Mueller，1999)。因为如果完整的(带帽的)mRNA用作模板，M-MLVRT优先地将C残基加到cDNA上，所以该方法能够实现全长cDNA的扩增。
然而，用于5‘-RACE试验的CapFinder方法不能避免背景问题，如由于CapFinder和在cDNA合成中使用的Oligo-dT的污染而引起的DNA弥散(Chenchik et al.，1998)。因为两个引物都适合反应混合物中出现的所有cDNA，所以即使这些引物的残留的量也会导致高背景。此外，由于污染cDNA合成中使用的引物，cDNA合成中这些引物在PCR反应中生成非特异产物，所以3’-RACE和全长cDNA扩增也有相同的背景问题(Chenchik et al.，1998)。克服以上问题的新方法最近已经被介绍。一种方法是用于抑制非期望的PCR产物的step-outPCR(Matz et al.，1999)，但是已指出此方法仍然具有DNA弥散而不是单一DNA(Schramm et al.，2000)。另一种被介绍的更新的方法使用固相cDNA合成和去除在cDNA合成中使用的所有污染的流程(Schrammet al.，2000)，但此技术的主要缺点是需要使用固相cDNA合成及其后续流程所导致的成本高且耗时。因而，需要更有效、简单、快速和廉价的策略以完全消除由于污染cDNA合成中使用的引物如Oligo-dT或CapFinder引物而引起的问题。
除RACE技术外，在目前用于cDNA文库构建的技术中，基因的5’-末端在cDNA群体中倾向于未充分表达，尤其在第一cDNA链合成中使用poly(dT)和起始材料被限制的情况中5’-末端。尽管已发展出许多克服该问题的方法，但是大多数方法都被合成全长cDNAs或5‘富集的cDNAs所具有的许多固有问题所限制。由于需要多步酶步骤，这些方法都复杂或成本高且耗时和/或被认为不灵敏(Carninci et al.，1997；Suzuki et al.，1997；Guegler et al.U.S.Pat.Nos.6,083,727 and 6,326,175；Hayashizaki.U.S.Pat.No.6,143,528)。因此，关于开发用于产生，尤其以有限的起始材料来生产，全长或5’富集的cDNAs的改进方法的兴趣一直不断。
多重PCR是另一种形式的PCR技术，在该技术中，在同一个反应中多于一个靶序列可以通过超过一对引物被同时扩增。自从1988年它被第一次描述(Chamberlain et al.，1988)，该方法已经被成功的运用于DNA检测的许多领域，包括基因缺失的分析(Anonymous，1992；Henegariu，et al.，1994)、突变和多态性分析(Shuber et al.，1993；Mutirangura et al.，1993)、定量分析(Zimmermann et al.，1996)和RNA检测(Zou et al.，1998)。在传染病领域中，该技术已显示出是用于于鉴定病毒、细菌、真菌和/或寄生虫的一种有价值的方法。
然而，通过多重PCR获得的结果由于扩增程序的假象而经常被复杂化。这些结果包括由于反应失败而导致的“假阴性”结果和“假阳性”结果，如假产物的扩增，这种假产物的扩增是由于引物与与其相关但不能与其真正的识别序列区别的序列退火所导致。用于多重PCR时，引物应该被设计以使它的预测杂交反应动力学与样品多重反应中使用的其它引物的反应动力学相同。尽管某种程度上可以估计退火温度和引物浓度，用于每个多重反应的条件却通常是根据经验确定。由于随着每个添加的引物对，非特异性引发的可能性都会增加，所以随各个引物组被加入反应条件也必须做必要的改变。此外，由于随每个循环不相等扩增片断的产量的差异都会增强，所以对于源的竞争(如引物消耗)所导致的假相被扩大。因此，对于多重PCR反应条件的优化可能变得耗力且耗时。由于不同的多重PCR可能具有唯一的反应条件，所以新的诊断测试的发展可能变得成本很高。
因而，在本领域中，需要无须复杂优化步骤就能够使多重PCR反应被设计且进行的引物，而无论所使用的不同引物的潜在发散特性。此外，在本领域中还需要使在相同反应条件下同时生成等量的每一种扩增产物的多重PCR反应能够进行的引物。
单核苷酸多态性(SNPs)，在人类基因组中被发现的最常见的遗传变异，对于鉴定疾病相关的位点和对于药物遗传学研究是重要的标记(Landegren et al.，1998；Roses，2000)。SNPs在人类基因组中平均每1000bp出现一次并且总数大于3百万。各种方法被用于检测SNPs。然而，关键障碍之一是扩增DNA。大多数目前使用的试验包括扩增DNA样品的短片断的步骤，其中生成的DNA样品的短片断跨越每个靶SNP。因为从典型的临床样品中只能获得少量的DNA，所以这种扩增通常是必要的。该扩增也提高了该试验的信躁比，从而提高检测的可信度。大多数基因型技术通过使用PCR完成这种扩增。最重要的是，对于SNP基因型定型中PCR的应用，其PCR扩增的特异性是关键。因而，如果存在提高PCR特异性的方法并应用于SNP基因型试验的研究中将是有益的。如果在单一试验中这种方法能够提供多重分析(多重试验)也是有益的。
如上所述，尽管每种方法的改进方法一直不断地被介绍，但所有这些用于核酸扩增，尤其用于PCR扩增的方法和技术都不可能完全避免在每种方法中使用的引物的非特异性所带来的限制和问题，如假阳性、重复性差、高背景等。因而，仍需要能够提高退火特异性的新颖引物和能给出正确结果的方法。
贯穿于本申请，各种专利和文章被参考并且在括号中引入引用。因此本质上这些专利和文章公开的内容通过引用被包括在本申请中，以更充分地描述本发明和本发明涉及领域的发展状况。
发明内容
致力于解决用于核酸扩增的这种常规引物和各种方法存在的问题，本发明人已研究出一种新退火控制引物，该引物能够在所有基于核酸扩增的技术领域中进行具有更高特异性的核酸扩增和不受限制地被应用。
据此，本发明的目的是提供一种在核酸扩增中能提高退火特异性的退火控制引物。
本发明的另一个目的是提供一种以DNA或核酸混合物作为模板扩增核酸序列的方法。
本发明的另一目的是提供一种以DNA或核酸混合物作为模板选择性扩增靶核酸序列的方法。
本发明的另一目的是提供一种以mRNA扩增靶核酸序列的方法。
本发明的另一目的是提供一种在两种或多种核酸样品中检测与差异表达的mRMA互补的DNA的方法。
本发明的另一目的是提供一种快速扩增含有mRAN 3’-末端区域对应的cDNA区域的靶cDNA片断的方法。
本发明的另一目的是提供一种扩增含有mRAN 5’-末端区域对应的cDNA区域的靶cDNA片断的方法。
本发明的另一目的是提供一种扩增与mRNAs互补的全长双链cDNAs群体的方法。
本发明的另一目的是提供一种扩增与mRNA互补的5’富集双链cDNAs的方法。
本发明的另一目的是提供一种同时扩增多于一种靶核苷酸序列的方法。
本发明的另一目的是提供一种制备gDNA的DNA指纹的方法。
本发明的另一目的是提供一种制备mRNA样品的RNA指纹的方法。
本发明的另一目的是提供一种鉴定多基因家族的保守性同源片断的方法。
本发明的另一目的是提供一种鉴定靶核酸的核苷酸变异的方法。
本发明的另一目的是提供一种靶核酸的诱变的方法。
本发明的另一目的是提供一种包括退火控制引物的试剂盒。
本发明的另一目的是为用于核酸扩增的各种方法提供试剂盒。
本发明的另一目的是提供退火控制引物在用于核苷酸扩增过程的应用。
下面结合附图和附加权利要求进行详细说明，从而本发明的其它目的和优点会变得明显。
附图说明
图1A和1B说明了通过使用本发明的ACP进行选择性扩增双链DNA(1A)或mRNA(1B)靶核酸的示意图。
图2A和2B说明了使用本发明的ACP鉴定差异表达基因的示意图。
图3说明了使用本发明的ACP扩增含有mRAN 3’-末端对应的3’-末端区域的靶cDNA片断的示意图。
图4A和4B说明了使用本发明的ACP扩增含有mRAN 5’-末端对应的5’-末端区域的靶cDNA片断的示意图。其中OligodT(4A)或随机引物(4B)被用作第一链cDNA合成的引物。
图5说明了使用本发明的ACP扩增与mRNA分子互补的全长cDNA分子的示意图。
图6说明了使用本发明的ACP扩增与含有5’-末端信息的mRNA分子互补的5’富集cDNA分子的示意图。
图7A说明了使用本发明的ACP检测单核苷酸多态性(SNP)的示意图。
图7B说明了使用本发明的ACP检测单核苷酸多态(SNP)的另一示意图。
图8为琼脂糖凝胶照片，该琼脂糖凝胶照片显示在ACP的3’-和5’-末端区域之间脱氧次黄苷基团的效果。其中cDNA利用E4.5(泳道1和4)、E11.5(泳道2和5)和E18.5(泳道3和6)的从胚胎组织分离的总RNA，分别以dT10-JYC2(SEG ID NO.29)与ACP10(泳道1～3)(SEG ID NO.13)的引物组，和dT10-ACP1(SEG ID NO.30)与ACP10(泳道4～6)的引物组被扩增。
图9为显示PCR过程中根据脱氧次黄苷数目的变化位于ACP的3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基的影响的琼脂糖凝胶照片。泳道0、2、4、6和8分别表示脱氧次黄苷残基的数目。
图10A为显示使用EsxN7和EsXC6引物组(泳道1)和用EsxN7-ACP和EsXC6-ACP引物组(泳道2)进行两阶段PCR扩增Esx1的结果的琼脂糖凝胶照片。
图10B为显示使用EsxN1(泳道1)、EsxC2(泳道2)、EsxN1-ACP和EsXC2的引物组(泳道3)，和EsxN1-ACP和EsXC2-ACP的引物组(泳道4)进行两阶段PCR扩增Esx1的结果的琼脂糖凝胶照片。
图10C为显示使用EsxN3和EsxC5引物组(泳道1和2)和EsxN3-ACP和EsXC5-ACP引物组(泳道3)进行两阶段PCR扩增Esx1的结果的琼脂糖凝胶照片。
图10D为显示使用引物EsxN1(泳道1)、EsxC2(泳道2)、EsxN1和EsxC2引物对(泳道3)，和EsxN1-ACP和EsxC2-ACP引物对(泳道4)进行无间断两阶段PCR扩增Esx1的结果的琼脂糖凝胶照片。
图11A为显示用于使用不同阶段的鼠胚胎组织检测胚胎发育过程中差异表达mRNAs的ACP的例子的琼脂糖凝胶照片。该cDNAs使用从E4.5(泳道1)、E11.5(泳道2)和E18.5(泳道3)的胚胎组织分离的总RNA，用ACP3(SEG ID NO.3)和dT10-ACP1引物组被扩增。用箭头标示的带表示从差异表达mRNAs扩增的cDNA片断。箭头的数目表示用作图13的Northern杂交分析的探针的cDNA片断。
图11B为显示用于使用不同阶段的鼠胚胎组织检测胚胎发育过程中差异表达mRNAs的ACP的例子的琼脂糖凝胶照片。该cDNAs使用从E4.5(泳道1～2和7～8)、E11.5(泳道3～4和9～10)和E18.5(泳道5～6和11～12)的胚胎组织分离的总RNA，分别用ACP5(SEG IDNO.5)和dT10-ACP1(泳道1-6)引物组和ACP8(SEG ID NO.8)和dT10-ACP1(泳道7～12)引物组被扩增。用箭头标示的带表示从差异表达mRNAs扩增的cDNA片断。箭头的数目表示用作图13的Northern杂交分析的探针的cDNA片断。
图11C为显示使用ACP10和dT10-ACP1引物组从不同阶段的鼠胚胎样品(E4.5：泳道1和2；E11.5：泳道3和4；E18.5：泳道5和6)获得的cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶照片。
图11D为显示使用ACP14和dT10-ACP1引物组从不同阶段的鼠胚胎样品(E4.5：泳道1和2；E11.5：泳道3和4；E18.5：泳道5和6)获得的cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶照片。
图12A为显示使用ACP10和JYC5-T15-ACP引物组通过单间断(one-stop)的两阶段PCR扩增得到的不同阶段的鼠胚胎样品(E4.5：泳道1；E11.5：泳道2；E18.5：泳道3)的cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶照片。
图12B为显示使用ACP10和JYC5-T15-ACP引物组通过无间断的两阶段PCR扩增得到的不同阶段的鼠胚胎样品(E4.5：泳道1；E11.5：泳道2；E18.5：泳道3)的cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶照片。
图13显示胚胎发育中差异表达的mRNAs扩增的6个cDNA片断的Northern杂交分析。由图11中箭头表示的6个32P标记片断被用作Northern杂交分析的探针。箭头1、2、3、4、5和6分别为DEG1(图13A)、DEG3(图13B)、DEG2(图13C)、DEG8(图13D)、DEG5(图13E)、和DEG7(图1 3F)，其中该DEG序列分析的结果在表1中显示。DEG2(SEG ID NO.31)和DEG5(SEG ID NO.32)证明为新基因(表2)。对照板(各板的下部)显示杂交前的各凝胶，经溴化乙锭染色后在UV光下拍照，显示了与上样对照相同水平的18S和28SrRNA。
图14显示新基因DEG5在鼠胚胎的全阶段中的表达模式。Northern杂交分析使用放射性标记的DEG5 cDNA片断作为探针。制备如标记的妊娠期的鼠胚胎的总RNA(20μg/泳道)。下部的对照板显示杂交前的凝胶，经溴化乙锭染色后在UV光下拍照，显示与上样对照相同水平的18S和28SrRNA。
图15为显示常规3’-RACE(泳道1)和基于ACP的3’-RACE(泳道2)之间关于β-肌动蛋白3’-RACE的差异的琼脂糖凝胶照片。
图16为显示分别使用常规引物(泳道1和3)和ACP(泳道2和4)的CapFinder方法和基于ACP的方法之间关于鼠JunB(泳道1和2)和β-肌动蛋白5’-RACE(泳道3和4)的差异的琼脂糖凝胶照片。
图17为显示分别使用常规引物(泳道1)和ACP(泳道2、3和4)的CapFinder方法和基于ACP的方法之间关于鼠PLP-Cα5’-RACE的差异的琼脂糖凝胶照片。
图18为显示通过CapFinder方法或基于ACP的方法鼠的全长GAPDH cDNA的实际Northern分析结果。
图19为使用两个不同的任意ACPs组的7个鼠系的基因组指纹的结果的琼脂糖凝胶照片。
图20为显示用规方法(A)或基于ACP的方法(B)扩增三个靶核酸的多重PCR扩增产物的琼脂糖凝胶照片。
图21为显示用常规方法(A)或基于ACP的方法(B和C)扩增四个靶核酸的多重PCR的扩增产物的琼脂糖凝胶照片。基于ACP的多重扩增通过单间断(B)的或无间断(C)的两阶段PCR扩增进行。
图22为显示使用ACP的人TP53基因外显子4的SNP的等位基因特异性扩增结果的琼脂糖凝胶照片。
图23为6张琼脂糖凝胶照片，该琼脂糖凝胶照片显示6个额外SNPs的使用ACPs的等位基因特异性扩增的结果，其中各SNP出现在不同基因中，如β-2肾上腺素受体(ADRB2)(A)、趋化因子(Chemokine)(c-c基元)受体5(CCR5)(B)、白介素13受体(C)、白细胞粘合分子-1(LAM-1)(D)、速激肽受体3(TACR3)(E)和白介素1，β(IL1B)(F)。
具体实施方式
本发明主要关于：(a)核酸扩增特异性的退火控制引物和(b)它的应用。本发明的退火控制引物(下文称为“ACP”)使引物退火结合退火温度而被控制，因此核酸扩增(尤其PCR)的特异性能被显著提高。ACP的原理基于具有3’-和5’-末端独立部分的寡核苷酸引物的组合，其中3’-和5’-末端独立部分通过至少一个通用碱基或非识别碱基分离。本发明人已发现位于3’-和5’-末端部分之间的通用碱基或非识别碱基组在核酸扩增过程中结合退火温度作为调控子控制引物与模板核酸退火中。位于3’-和5’-末端部分之间的通用碱基或非识别碱基残基组的出现打断了5’-末端部分的退火，在一定退火温度下也限制了引物与3’-末端部分退火，这样导致退火特异性的显著提高。位于ACP的3’-和5’-末端部分之间的通用碱基组被设计用来规定各部分。出于这些理由，在核酸扩增中，在特定严格条件下该ACP提高引物退火特异性的功能基本不同于其它常规引物。
本发明的ACP非常有效，而且可以广泛地使用于基于核酸扩增的应用中。通过ACP，与常规PCR中的引物退火特异性有关的各种问题也基本被解决。核酸扩增(尤其PCR)中使用ACP带来的主要益处如下：
(a)由于位于3’-和5’-末端部分之间的通用碱基组的出现将引物退火部分限于3’-末端部分，在此条件下该3’-末端部分与该模板退火，所以引物的退火序列能够被精确控制，这样使设计一个具有理想数目的退火序列的引物成为可能。当引物的退火部分不得不受到限制(如单核苷酸多态性(SNP)基因型分析、DNA微阵列扫描、和差异表达基因的检测)时，这种设计的引物尤为有益；
(b)由于位于3’-和5’-末端部分间的通用碱基残基组的存在打断了5’-末端部分与模板的退火，在此条件下该3’-末端部分与该模板退火，所以最后，并不参与退火的5’-末端部分给3’-末端部分提供了引物退火特异性；
(C)引物退火特异性是高度敏感的，足能检测出甚至是单碱基的错配。因此，对于鉴定靶核酸的核苷酸变异，例如，包括单核苷酸多态性和点突变，是尤其地有帮助的；
(d)ACP能够提供对引物设计的“引物搜索参数”，如引物长度、退火温度、GC含量和PCR产物长度，具有高耐受力的引物；
(e)ACP系统提供能排除从非特异性扩增产物的双-阶段PCR扩增；
(f)PCR扩增的效率提高，这样使检测稀有mRNAs更容易；和
(g)PCR产物的重复性提高，这样能够节省大量的时间和成本。
ACP的原理
本发明的一个方面是提供一种用于在核酸扩增中提高退火特异性的退火控制引物，该退火控制引物包括：(a)3’-末端部分，该3’-末端部分具有与与之杂交的模板核酸上的位点基本互补的杂交核苷酸序列；(b)具有被预选定的随机核苷酸序列的5’-末端部分；和(c)位于所述3’-末端部分和所述5’-末端部分之间的调控子部分，包括至少一个通用碱基或非识别碱基类似物，因而所述调控子部分能够结合退火温度调控所述引物的退火部分。
该ACP原理基于具有3’-和5’-末端独立部分的寡核苷酸引物的组合和寡核苷酸引物3’-和5’-末端部分上的调控子部分的作用，其中3’-和5’-末端独立部分是通过含有至少一个通用碱基或非识别碱基的调控子部分而分隔的。在ACP的3’-和5’-末端部分之间出现含有至少一个通用碱基或非识别碱基的调控子部分，这是引物退火特异性提高的主要因素。
术语“模板”指核酸。术语“核酸”是以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合体，除非另有指明，包括已知的天然核苷酸的类似物。因此，本发明的ACP可以用于以单链或双链gDNA、cDNA或mRNA作为模板的核酸扩增。在此处与本发明的引物联合使用的术语“部分”是指由调控子部分分隔的核苷酸序列。术语“3’-末端部分”或“5’-末端部分”分别指本发明的引物的3’-末端或5’-末端部分的核苷酸序列，该3’-末端或5’-末端部分被调控子部分分隔。
用于此处的术语“引物”指寡核苷酸，无论是天然形成的还是合成制备的，当置于与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件下时，即，存在核苷酸和用于聚合的试剂如DNA聚合酶及在适合的温度和pH条件下，该寡核苷酸能够作为合成起始的点。引物优选为单链以获得扩增中的最大效率。优选引物为寡聚脱氧核苷酸。本发明的引物可以包括天然形成的dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)，被修饰的核苷酸或非天然的核苷酸。该引物也可以包括核糖核苷酸。该引物必须足够长以在聚合试剂存在时能够引发延伸产物的合成。引物的恰当长度取决于许多因素，包括温度、应用和引物资源。此处使用的术语“退火”或“引发”指寡聚脱氧核苷酸或核酸与模板核酸的并置，由此，所述并置使聚合酶能够将核苷酸聚合到与模板核酸或其一部分互补的核酸分子上。
ACP的3’-末端部分具有与模板核酸分子的位点基本互补的核苷酸序列。关于引物的术语“基本互补”在此处被使用，其含义为在指定的退火条件下该引物充分互补以与模板核酸序列选择性杂交，从而被退火的引物能够通过聚合酶被延伸以形成模板的互补拷贝。因此，该术语与“完全互补”或其相关术语含义不同。应该理解ACP的3’-末端部分在ACP能作为引物的程度上可以具有一个或多个与模板的错配。最优选地，ACP的3’-末端部分具有与模板上的位点完全互补的核苷酸序列，即没有错配。
ACP的3‘-末端部分依赖于其应用和模板序列可以具有各种核苷酸序列。例如，当ACP被用于使用逆转录的过程时，如差异显示PCR、RACE、全长cDNA的扩增、指纹识别、保守同源序列的鉴定等，ACP的3’-末端部分可以具有与mRNA的多聚腺苷(polyA)尾杂交的核苷酸序列，优选至少8个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，更优选至少10个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，最优选至少10个毗邻的脱氧胸腺嘧啶核苷酸。对于如上的涉及逆转录的过程，在一个实施例中，ACP的3’-末端部分有至少10个毗邻的在其3’-末端具有3’-V3’-末端的脱氧胸腺嘧啶核苷酸；其中V为选自包含脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组的一种，在另一个实施例中，至少10个毗邻的在3’-末端具有3‘-NV的脱氧胸腺嘧啶核苷酸；其中V为选自包含脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组的一种，N为选自包含脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组的一种物质。
此外，当ACP被用于靶核酸序列的扩增时，它的3’-末端部分包括基本与靶序列互补的核苷酸序列；在差异显示PCR中，包括与来自mRNA的cDNA上的位点基本互补的随机序列；在RACE中，包括与来自mRNA的cDNA上的位点基本互补的基因特异性序列；在5’富集的cDNAs的扩增中，包括与mRNA上的位点基本互补的至少6个核苷酸的随机序列；在保守的同源片断的鉴定中，包括与在基因家族中发现的共有序列或选自编码预定氨基酸序列的多个核苷酸组合的简并序列基本互补的核苷酸序列；在靶核酸的核苷酸变异(如等位基因位点)的鉴定中，包括含有与发生变异的核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列；和在诱变中，包括含有至少一个与靶核酸错配的核苷酸的核苷酸序列。
此处使用的术语“任意”核苷酸序列的含义为不知道将要被扩增的靶核酸的序列的情况下而被选择的核苷酸序列。术语任意在指引物时不应该与“随机”混淆，随机引物是指由组成各有不同和随机的序列的引物的随机群体的引物。与用于鉴定保守的同源片断的ACP结合的术语“简并”序列指由氨基酸序列推导得到的核苷酸序列，所以由于遗传密码子的简并性，简并序列能够形成由一个氨基酸序列得到的核苷酸序列的库。
根据该ACP的优选实施例，5’-末端部分的预选定的核苷酸序列基本上不与模板核酸上任何位点互补。
根据优选实施例，本发明的退火控制引物能够由5’-Xp-Yq-Zr-3’的通式(1)代表，其中Xp代表具有与模板核酸上任意位点基本不互补的预选定的任意核苷酸序列的5’-末端部分；Yq代表包括至少一个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；Zr代表具有与模板核酸上的位点基本互补的核苷酸序列的3’-末端部分；其中p，q和r代表核苷酸的数目；其中X，Y和Z是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
包含至少一个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分与在核酸扩增时与改变退火温度结合的ACP的主要功能有关。此处使用的术语“通用碱基或非识别碱基类似物”指能够与天然DNA/RNA的各碱基之间都以微弱差别形成碱基对的一个碱基。
众所周知，因为这类通用碱基能够非特异地与所有四种常规碱基形成碱基配对，所以简并引物的含糊位点上的核苷酸可以被通用碱基或非识别碱基类似物，如脱氧次黄苷(Ohtsuka et al，1985；Sakanari et al.，1989)，1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯(Nichols et al.，1994)和5-硝基吲哚(Loakes and Brown，1994)取代以解决与简并引物相关的引物设计问题。然而，还没有报道显示这种通用碱基或非识别碱基类似物，如脱氧次黄苷、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯和5-硝基吲哚被用于增加PCR过程中的引物退火的特异性。
由于其在碱基配对中的较弱的氢键作用，通用碱基，如脱氧次黄苷、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯和5-硝基吲哚出现在引物中产生低退火温度。作为这种理论的延伸，本发明人得出，在引物的3’-末端和5‘-末端之间出现毗邻的通用碱基能够产生具有低熔点、对该引物的每个3’-和5’-末端部分形成边界并且分别影响每个部分的退火的区域。这种理论提供了本发明的退火控制引物的基础。
在优选实施例中，该ACP在3’-和5’-末端部分序列之间含有至少两个通用碱基或非识别碱基类似物残基，更优选地，含有至少3个通用碱基或非识别碱基类似物。有利地，该在3’-和5’-末端部分序列间的通用碱基残基长度上可以达到15个残基。根据一个实施例，该ACP含有2-15个通用碱基或非识别碱基类似物残基。最优选地，在3’-和5’-末端部分序列间的通用碱基长度上约为5个残基。
根据最优的通用碱基的数目，即5个残基，在一定温度下进行核酸扩增的过程中，为了打断5’-末端部分同模板退火，ACP的3’-和5’-末端部分之间的通用碱基的优选为最少的数目。序列中通用碱基的长度(8～10碱基)非常可能并不显著影响它在ACP中的本身功能。
因为在3’-和5’-末端部分序列之间使用通用碱基残基能够在核酸扩增如PCR中给每个部分(3’-和5’-末端)提供与退火温度相关的不同的退火特异性，所以在3’-和5’-末端部分序列之间使用通用碱基被认为是本发明的关键性的特征。
根据优选实施例，调控子部分的通用碱基或非识别碱基类似物包括脱氧次黄苷、次黄苷、7-脱氮-2’-脱氧次黄苷、2-氮-2’-脱氧次黄苷、2′-OMe次黄苷、2′-F次黄苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-OMe3-硝基吡咯、2′-F3-硝基吡咯、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe 5-硝基吲哚、2′-F5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-次黄苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉-5-硝基吲哚、吗啉-水粉蕈素、吗啉-次黄苷、吗啉-4-硝基苯并咪唑、吗啉-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-次黄苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-O-甲氧乙基次黄苷、2′O-甲氧基乙基水粉蕈素、2′-O-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2′-O-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2′-O-甲氧基乙基3-硝基吡咯和它们的组合物，但不限与此。更优选地，通用碱基或非识别碱基类似物为脱氧次黄苷，1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚，最优选地，为脱氧次黄苷。
此处使用的寡聚核苷酸引物的优选长度以理想退火特异性和具有理想特异性的需要与模板杂交的寡核苷酸的数目来决定。例如，因为寡核苷酸每增加一个核苷酸都会提高引物与模板的退火温度，所以20个核苷酸的寡核苷酸引物比10个核苷酸的寡核苷酸引物特异性更强。
ACP的3’-和5’-末端部分序列的长度可以变化并且部分取决于每个使用ACP的应用的目的。在优选实施例中，该ACP的3’-末端部分的长度至少为6个核苷酸，这被认为是对于引物退火的长度的最低要求。更优选地，该3’-末端部分序列的长度为10～25个核苷酸并且可以到达60个核苷酸。在另一个实施例中，该ACP的3’-末端部分可以包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
在另一个实施例中，ACP的5’-末端部分的长度包括至少15个核苷酸，这被认为在高严谨度条件下对于退火的长度的最低要求。优选地，该5’-末端部分序列的长度可以达到60个核苷酸。更优选地，该5’-末端部分为6～50个核苷酸，最优选地，长度为20～25个核苷酸。整个ACP的长度优选为35～50个核苷酸，并可以达到100个核苷酸。
ACP的5’-末端部分具有与模板核酸上任意位点基本不互补的预先选定的任意核苷酸序列，并且该核苷酸序列可以作为后续扩增的引发位点。在此处使用的术语“预先选定的任意”核苷酸序列指任何确定的或预先选定的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或含有天然或修饰的核苷酸的特定序列的混合脱氧核糖核苷酸序列。在一些实施例中，5’-末端部分的预先选定的任意核苷酸序列可以由通用引物序列组成，如T3启动子序列、T7启动子序列、SP6启动子序列和M13正向或反向通用序列。在ACP的5’-末端部分使用更长的任意序列(约25～60个碱基)会降低ACP的效率，但是更短的序列(约15～17个碱基)会降低ACP在高严格条件下的退火效率。在ACP的5’-末端部分使用预先选定的任意核苷酸序列作为后续扩增的引发位点也是本发明的关键特征。
根据本发明的一个实施例，ACP的5’-末端部分可以进行一些修饰，只有该修饰不会破坏ACP的优点，即提高引物退火特异性。例如，5’-末端部分可以包括一个或多个限制性内切酶的识别序列，这可以使扩增产物克隆到适合的载体上。此外，5’-末端部分可以包括至少一个具有用于扩增产物的检测或分离的标记的核苷酸。适当的标记包括，但不限于此，荧光团、发色团、化学发光物、磁性粒子、放射性同位素、质量标记(mass label)、电子密集颗粒、酶、辅因子、酶底物和具有特异结合伴体的半抗原，如抗体、链霉抗生物素蛋白、生物素、地高辛和鳌合基团。5’-末端部分也包括噬菌体RNA聚合酶启动子区域。
根据本发明的优选实施例，该ACP被应用于PCR。更优选地，该PCR在第一和第二退火温度下即在不同严谨度的条件下进行。该第一退火温度可以等于或低于第二退火温度并且优选地，第二退火温度比第一退火温度高。在两个不同退火温度下进行的PCR过程，即两阶段PCR中，ACP的3’-末端参与第一退火温度下的退火，而合并在第一扩增阶段的扩增产物中的ACP的5’-末端在第二退火温度下作为引发位点。在这种情况下，根据以下设想ACP的优点将被证明：
(1)由于ACP的调控子部分由至少一个通用碱基和非识别类似物构成，该通用碱基或非识别类似物在碱基配对时由于其更弱的氢键相互作用而具有比ACP的其它部分低的Tm，所以在ACP的3’-末端部分在第一退火温度下与模板上位点退火的条件下ACP的调控子部分在退火方面并不适合于模板核酸。因此，在ACP的3’-和5’-末端部分之间出现含有至少一个通用碱基或非识别类似物的调控子部第一退火温度下限制引物退火部分在该3’-末端部分；
(2)在第一退火温度下没有参与退火的5’-末端部分持续干扰3’-末端部分与模板的退火；
(3)因此，在第一退火温度下，3’-末端部分序列特异性退火发生的强度相对强于非特异性退火发生的强度，这导致3’-末端部分引物退火特异性的提高；
(4)当5’-末端部分含有预先选定的任意核苷酸序列时，在高严谨度条件的并且应该高于第一退火温度的第二退火温度下，此部分用作3’-末端部分序列退火和延伸而产生的反应产物的下一轮扩增的引发位点；和
(5)因此，在第二反应温度下对于每一个PCR循环仅3’-末端部分序列退火和延伸而产生的反应产物能够以接近产物两倍增加的理论最优值被扩增。
因而，在第一退火温度下ACP的3’-末端部分仅用作模板的退火位点，在第二退火温度下ACP的5’-末端部分用作通过将ACP的3’-末端部分同模板接触和延伸所得产物的下一轮扩增的引发位点。
值得欣慰的是对于各种基于引物的核酸扩增方法都是非常有帮助的，包括Miller，H.I.(WO 89/06700)和Davey，C.等(EP 329，822)的方法、连接酶链反应(LCR，Wu，D.Y.et al.，Genomics 4：560(1989))、聚合酶连接酶链反应(Barany，PCR Methods and Applic.，1：5-16(1991))、Gap-LCR(WO 90/01069)、修补链式反应(EP 439,182)、3SR(Kwoh et al.，PNAS，USA，86：1173(1989))和NASBA(U.S.Pat.No.5,130,238)，但不限于此。
在本发明的另一方面中，提供含有根据本发明的退火控制引物或退火控制引物对的试剂盒。根据本发明的一个实施例，该试剂盒进一步包括具有ACP的5’-末端部分相应核苷酸序列的引物或引物对；对于5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括通用引物。该试剂盒可以任选地包括进行PCR反应需要的试剂如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶共作用因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒可以也包括多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和试剂和抑制DNA聚合酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性或阴性对着反应所必须的试剂。给定反应中反应试剂使用的优选量可以由具有目前公开内容优点的熟练技术人员即时地决定。该试剂盒典型地适合于以单独的包装或间隔包含前述组分。
本主题发明的ACP可以被用于多种基于核苷酸扩增的技术。证明ACP效果的代表例子是：
I.扩增核酸序列的应用；
II.扩增靶核酸序列的应用；
III.多重DNA扩增的应用；
IV.鉴定差异表达基因的应用；
V.快速扩增cDNA末端(RACE)的应用；
VI.扩增全长cDNA的应用；
VII.扩增5’-富集cDNA的引用；
VIII.DNA或RNA指纹的应用；
IX.鉴定多基因家族的保守同源片断的应用；
X.鉴定核苷酸序列变异的应用；
XI.基因突变的应用；和
XII.其它应用。
I扩增(靶)核酸序列的应用
在本发明的另一个实施例中，提供了一种扩增来自DNA或核酸混合物的核酸序列的方法，该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征为至少一个引物源于上述ACP的任意一种。优选地，根据ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的核酸序列区域基本互补的杂交序列。
在该方法的特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增进行扩增来自DNA或核酸混合物的核酸序列的方法，该方法包括：
(a)在每个引物都与核酸区域退火的条件下，在第一退火温度下进行第一阶段核酸序列扩增，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACP的引物对，其中每一个在其3’-末端部分具有与与其杂交的核酸序列区域基本互补的杂交序列，从而核酸序列的扩增产物被产生；和
(b)分别在每个引物与扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，在高严谨度条件的第二退火温度下进行第二-阶段扩增步骤(a)得到的扩增产物，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用与步骤(a)相同的引物或引物对，其中每一个都含有步骤(a)使用的每个引物的5’-末端部分相应的预先选定任意核苷酸序列，从而该扩增产物被再次扩增。
当该方法被用于靶核酸序列的扩增时，被使用的引物对在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列。因而，关于本发明的另一个方面，提供了一种用于选择性扩增来自DNA或核酸混合物的靶核酸序列的方法，其中该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征为至少一个引物源于上述ACP。优选地，根据ACP的结构的引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列。
在该方法的一个特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增来选择性扩增来自DNA或核酸混合物的靶核酸序列的方法，该方法包括：
(a)在每个引物都与其靶核酸区域退火的条件下，在第一退火温度下进行第一阶段核酸序列扩增，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACP的引物对，其中每一个在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列，从而靶核酸序列的扩增产物被产生；和
(b)分别在每个引物与扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，在高严谨度条件的第二退火温度下进行第二-阶段扩增步骤(a)得到的扩增产物，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用与步骤(a)相同的引物或引物对，其中每一个都含有步骤(a)使用的每个引物的5’-末端部分相应的预先选定任意核苷酸序列，从而该扩增产物被再次扩增。
当该方法用于mRNA扩增时，在扩增前需要制备cDNA。因而关于本发明的另一个方面，提供了一种用于选择性扩增来自mRNA的靶核酸序列的方法，其中该方法包括逆转录mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征为至少一个引物源于上述ACP。优选地，根据ACP的结构的引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列。
在本发明特定实施例种，提供了一种使用两阶段扩增来选择性扩增来自mRNA的靶核酸序列的方法，该方法包括：
(a)在足够模板驱动的酶促脱氧核糖核苷酸合成发生的条件下，将mRNA同与mRNA的polyA尾杂交的寡聚核苷酸dT引物接触；
(b)逆转录寡聚核苷酸dT引物与之杂交的mRNA以生成与核苷酸dT引物与之杂交的mRNA互补的第一条DNA链。
(c)在每个引物都与其靶核酸序列退火的条件下，在第一退火温度下进行第一阶段扩增来自步骤(b)所得DNA第一链的靶核酸序列，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACP的引物对，其中每一个在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列，从而靶核酸序列的扩增产物被产生；和
(d)分别在每个引物与扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，在高严谨度条件的第二退火温度下进行第二-阶段扩增步骤(c)得到的扩增产物，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用与步骤(c)相同的引物或引物对，其中每一个都含有步骤(ca)使用的每个引物的5’-末端部分相应的预先选定任意核苷酸序列，从而该扩增产物被再次扩增。
由于本发明的扩增方法使用本发明的ACP，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度多样性的这种说明的复杂性。
使用本主题发明的ACP的应用提供了通过使用核酸扩增，优选地，使用PCR来选择性扩增来自核酸或核酸混合物(DNA或mRNA)的靶核酸序列的一种改进方法。由于ACP的作用能够给常规引物提供引物退火特异性而无论用于引物设计的“引物输入参数”如引物长度、退火温度、GC含量核产物长度，所以当用于扩增靶核酸片断的常规引物太灵敏以至于这些参数不能生成特异性核酸扩增产物时特别地推进使用本发明的ACP。
使用如上所述的新ACP系统选择性扩增双链DNA靶核酸的示意图如图1A所说明。图1B说明使用新ACP系统选择性扩增mRNA靶核酸的示意图。参考图1A和1B，本方法将被更详细描述。
该用于扩增核酸序列的方法根据各种本领域已知的基于引物的核酸扩增被实施。优选地，该方法根据由本发明人研制的两阶段扩增被实施，更优选地，该扩增通过本领域已知的聚合酶链反应了来进行，最优选地，通过热启动PCR方法进行。
本发明的用于扩增核酸序列的方法可以由于扩增任何想要的核酸分子。这些分子可以是DNA或RNA。该分子可以是以双链形式或单链形式，优选地，以双链形式。当作为起始材料的核酸分子是双链的时候，优选将双链变为单链，或部分单链，的形式。已知的分离双链的方法包括，但不限于此，加热、碱、甲酰胺和乙二醛处理，酶学方法(如解旋酶作用)和结合蛋白。例如，链分离可以通过在80℃～105℃加热来实现。用于实现此处理的常规方法由Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中提供。
当mRNA作为起始材料用于扩增时，扩增前的逆转录步骤是必要的，其细节见Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；和Noonan，K.F.et al.，Nucleic Acids Res.16：10366(1988))。对于逆转录，与mRNA的polyA尾杂交的寡聚核苷酸dT引物被使用。该寡聚核苷酸dT引物由dTMPs组成，其中的一个或多个可以由其它dNMPs取代只要该dT引物能够作为引物。逆转录使用具有Rnase H活性的逆转录酶。如果逆转录使用具有Rnase H活性的酶，通过仔细选择反应条件可能省略Rnase H单独消化的步骤。
该方法不需要被扩增的分子具有任何特殊的序列或长度。特别地，被扩增的分子包括任何天然形成的原核的、真核的(例如，原生动物核寄生虫、真菌、酵母、高等植物、低等核高等动物，包括哺乳动物核人类)或病毒的(例如，疱疹病毒、HIV、流感病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等)或类病毒的核酸。该核酸分子也可以为已经或能够被化学合成的任意核酸分子。因此，该核酸序列能够或不能在自然界中被找到。
本发明使用的ACP与模板上的区域杂交或退火从而形成双链结构。适于形成这种双链结构的核酸杂交条件在Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)和Haymes，B.D.，et al.，NucleicAcid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)中被描述。ACP 3’-末端部分的序列不需要精确互补，而只需要序列能够基本互补能够形成稳定的双链结构。因此，偏离完全互补是允许的，只要这种偏离不足以完全排除生成双链结构的杂交。ACP与模板核酸上区域的杂交是使用聚合酶进行依赖模板的聚合的前提条件。影响ACP与其互补核酸形成碱基配对的因素(see Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；and Haymes，B.D.，et.al.，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985))随后会影响引发效率。ACP核苷酸组合可以影响最佳退火的温度从而影响其引发效率。
各种DNA聚合酶可以用于该方法的扩增步骤，这些DNA聚合酶包括E.coli DNA聚合酶I“Klenow”片断、热稳定DNA聚合酶和噬菌体T7 DNA聚合酶。优选地，该聚合酶为热稳定DNA聚合酶如从各种种类获得的热稳定DNA聚合酶，包括Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、和Pyrococcus furiosus(Pfu)。许多这些聚合酶可以从细菌本身分离获得或市售可得。用于本主题发明的聚合酶也可以从高水平表达编码聚合酶的克隆基因的细胞获得。当进行聚合反应时，优选在反应容器中提供过量的该反应所需的成分。关于扩增反应组分所指过量是指每一组分的量从而实现理想扩增的能力基本不受该组分的浓度限制。理想情况是给反应混合物提供足够的量所需共作用因子如Mg2+和dATP、dCTP、dGTP和dTTP以支持理想的反应程度。
所有用于该扩增反应的酶在相同反应条件下可以是有活性的。当然，在其中所有酶都接近其最佳反应条件的缓冲液存在。因此，本发明的扩增过程可以单一的反应体积中完成而无须改变任何反应条件如添加反应物。
可以理解用于第一阶段扩增的ACPs对的5’-末端部分可能包括相同或不同序列；如果包括相同序列，5’-末端部分序列的相应引物将被用于第二阶段扩增步骤，相反，如果包括不同序列，ACPs的每个5’-末端部分序列的每个对应引物将被用于第二阶段扩增步骤。
本发明包括使用ACP来选择性扩增来自核酸或混合物的靶核酸片断的可选择过程，其中包含ACP和常规引物的引物对可以替代ACP对被用于第一扩增步骤。此处使用的术语“常规引物”指具有不同于ACP结构的任何引物，尤其，指含有通用碱基的控制子部分的出现。在此情况下，该常规引物仅被加到使用ACP的第一扩增步骤中，并且只要一个ACP 5’-末端部分序列的对应预先选定任意引物被加到第二扩增步骤中。在优选实施中，当在第一扩增步骤中被使用的一对ACP的每个3’-部分具有不同熔点(Tm)时，可以使用替代过程。“Tm”指一半引物与靶区域发生退火时的温度。
该方法的两个扩增步骤(对于以mRNA扩增的情况，包括逆转录)仅在时间上可被分离。第一阶段扩增应该被跟随第二阶段扩增。可以理解第一阶段扩增反应混合物可以包括与第二阶段扩增的ACPs 5’-末端部分序列退火的5’-末端部分对应引物，这意味着5’-末端部分的对应引物可以在第一阶段扩增步骤反应时或在其后被添加到反应混合物中。
作为代替过程，在第二阶段扩增步骤中第一阶段扩增步骤中使用的ACPs完全序列，代替ACPs 5’-末端部分的对应引物，可以在高严谨度条件下作为再扩增第一阶段扩增步骤所得扩增产物的引物，其中第一阶段扩增步骤中在低严谨度条件下通过ACP对3’-末端部分序列与模板核酸退火和延伸所得产物的3’-和5’-末端包括ACP序列或其互补序列并且作为ACP对的完全配对位点。关于此点，由于替代过程不需要在第一阶段扩增步骤时或其后进一步将ACPs 5’-末端部分的对应引物添加到反应混合物中，所以该替代过程被优选使用。图1A也说明了通过上述替代过程进行选择性扩增靶核酸的示意图。
该方法中的退火或杂交是在允许核苷酸序列与ACP之间特异性结合的严谨条件下被进行的。该退火的严谨条件是依赖序列并且依赖环境参数而变化。在该方法中，第二阶段扩增通常在比第一阶段扩增更严谨的条件下进行。
在优选实施例中，用于第一阶段扩增步骤的第一退火温度的范围为30℃～68℃，更优选地，为40℃～65℃。优选，用于第二阶段扩增步骤的第二退火温度的范围为50℃～72℃。根据更优选实施例，第一退火温度等于或低于第二退火温度。ACP 3’-末端部分序列的长度或熔点(Tm)将决定第一阶段扩增的退火温度。例如，对于在3’-末端部分ACP含有10个任意核苷酸的情况，优选第一阶段扩增的退火温度约为45℃至55℃之间。
根据该方法，在低严谨条件下第一阶段扩增进行至少2个循环的退火、延伸和变性以在第一阶段扩增过程中提高引物退火的特异性，并且通过接下来的循环，在高严谨条件下，第二阶段扩增被更有效地进行。第一阶段扩增可以进行最多30个循环。在优选实施例中，第一阶段扩增进行2个循环。在另一个实施例中，高严谨条件下的第二阶段扩增进行至少1个循环(优选至少5个循环)并且可以最多达到45个循环以扩增第一阶段产物。在更优选实施例中，第二阶段扩增进行25～35个循环。高和低严谨条件可以由本领域已知的标准而即时决定。“循环”指导致生产靶核酸拷贝的过程。一个循环包括变性步骤、退火步骤和延伸步骤。
在最优选实施例中，根据U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202和4,800,159所公开的PCR进行扩增反应。
根据优选实施例，当进行第一阶段扩增时，在第一退火温度下ACP引物对的3’-末端部分残余退火并且当第二阶段扩增进行时，该引物对的5’-末端部分作为引发位点。这种采用退火部分的改变主要归因于ACP本身，特别地，归因于ACP的调控子部分。在该方法中，在第一退火温度下ACP的控制子部分能够将ACP的退火部分限制到其3’-末端部分，这是提高与靶序列退火的特异性的主要原因。
该方法可以与本领域已知的许多其它方法结合使用以实现特异性的目的。例如，可以在第二阶段扩增后进行扩增产物的分离(或纯化)。该过程可以通过凝胶电泳、柱层析、亲和层析或杂交来实现。此外，本发明的扩增产物可以被插入适当的克隆载体中。此外，本发明的扩增产物可以含有表达载体的适当宿主中表达。为了表达扩增产物，应该制备受启动子控制或与启动子运行地相关的携带扩增产物的表达载体。该启动子开始于载体本身或扩增产物的末端部分，该末端部分可以对应于ACP的5’-末端部分。现有许多标准技术可以用于构建含有扩增产物和转录/翻译/控制序列的表达载体以在各种宿主-表达系统中实现蛋白或肽的表达。用于真核宿主的启动子包括，但不限于此，pLλ启动子、trp启动子、lac启动子和T7启动子。用于原核宿主的启动子包括，但不限于此，金属硫因启动子、腺病毒后启动子、起源于多瘤病毒的牛痘病毒7.5K启动子、腺病毒2、猿病毒40和细胞巨化病毒。原核宿主的特定例子为E.coli、Bacillus subtilis和其它肠道杆菌如Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、和各种假单胞菌种。除微生物外，起源于多细胞生物的细胞系也可以作为宿主。原则上，任何此类细胞系是使用的，无论是起源于脊椎动物还是无脊椎动物系。除哺乳动物细胞系外，这类细胞系还包括感染重组病毒(如杆状病毒)表达载体的昆虫细胞系统；和感染重组病毒(如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)表达载体的植物细胞系统或转化含有一个或多个编码序列的重组质粒(如Ti质粒)表达载体的植物细胞系统。扩增产物表达的多肽通常可以根据本领域已知的方法以各种目的被纯化。
在本发明的另一个实施例中，提供了前述快速发明的核酸扩增的试剂盒，该试剂盒包括退火控制引物或上述的退火控制引物对。
关于本发明的另一个方面，提供了前述选择性扩增来自mRNA的靶核酸序列的试剂盒，该试剂盒包括退火控制引物或上述的退火控制引物对。
根据本发明的一个实施例，这些试剂盒进一步包括每一个都具有ACP 5’-末端部分对应核苷酸序列的引物或引物对；对于5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括该通用引物。该试剂盒可以任选地包括进行PCR反应所需的试剂盒如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶共作用因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒也可以包括各种多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和反应试剂和抑制DNA聚合酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性或阴性对着反应所必须的反应试剂。在给定反应中使用试剂的最佳量可以由具有当前公开内容的益处的熟练技术人员即时地决定。该试剂盒，典型地，适于以单独包装或分隔包含前述组分。
II.多重DNA合成的应用
使用本主题发明的ACP的引用也可以提供一种在同一反应中使用多于一对引物来扩增多于一个靶序列的改进方法。通常，引物PCR最优反应需要扩增甚至一个基因座而没有任何非特异性副产物，所以平行地确定扩增超过10个靶序列的PCR反应条件是非常困难的，从而已经做过多重PCR的那些研究者们不得不进行了困难的工作以优化它们的体系。由于在反应中退火需要在足够允许进行DNA-DNA完全配对的高温下发生，因为其提高扩增特异性的功能，所以本主题发明的ACP对于优化多重DNA扩增是理想的。此处使用的“多重PCR”指在一个聚合酶链反应(PCR)混合物中同时扩增多个DNA靶序列。
关于本发明的另一方面，提供了一种在同一反应中使用多于一对引物来同时扩增多于一个靶序列的方法，其中该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征为至少一个引物源于上述任何一个ACP。优选地，根据ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列。
在本发明的特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)在每个引物都与核酸区域退火的条件下，在第一退火温度下进行多于一个靶核苷酸序列的第一阶段核酸扩增，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACP的引物对，其中每个引物对其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列区域基本互补的杂交序列，从而核酸序列的扩增产物被产生；和
(b)分别在每个引物与扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，在高严格条件的第二退火温度下进行第二阶段扩增步骤(a)得到的扩增产物，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用与步骤(a)相同的引物或其中每一个都含有步骤(a)使用的每个引物的5’-末端部分相应的预先选定任意核苷酸序列的引物对，从而该扩增产物被再次扩增。
由于使用本发明的ACP的应用根据前面讨论的核酸序列扩增方法进行，所以除了使用多于一个靶核苷酸序列和引物对外，它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。
例如，在此过程与前面讨论的核酸序列扩增方法之间，被使用的ACP的组成和结构及扩增条件是相同的。
在优选实施例中，用于随后分析的每一靶核苷酸序列的扩增产物的大小不同。
根据优选实施例，多重靶核苷酸序列的扩增产物可以通过粒析被分析。该粒析比较可以使用多种本领域已知的方法完成，如通过聚丙烯酰胺凝胶基质或琼脂糖凝胶基质的电泳和核苷酸测序。该核苷酸测序可以使用从许多制造商可得的自动测序仪而快速完成。
如下面例子所示，本发明的ACP使最后扩增产物能够免于背景问题和在本领域已知的多重核酸扩增方法中使用常规引物所引起的非特异性问题。
多重扩增的优点是可以在同一试验中进行许多疾病或特异性核苷酸改变的分析(如单核苷酸多态性或点突变)。
可以被同时分析的数目是不受限制的；然而，上限可能为约20并且可能依赖于对于解析的扩增产物的大小差异和可用于解析扩增产物的方法。
关于本发明的另一个方面，提供了一种在同一反应中同时扩增多于一个靶核苷酸序列的试剂盒，该试剂盒包括上述退火控制引物或退火控制引物组。根据本发明的一个实施例，这些试剂盒进一步包括具有ACP 5’-末端部分对应核苷酸序列的引物或引物对；对于5’-末端部分包括通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括通用引物。该试剂盒可以任选地包括进行PCR反应所需的反应试剂如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒也可以包括各种多聚核苷酸分子、逆转录酶。各种缓冲液和反应试剂，及抑制DNA聚合酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性或阴性对照反应所必需的反应试剂。在给定反应中使用试剂的最佳量可以由具有当前公开知识的熟练技术人员轻易地决定。该试剂盒，典型地，适于以单独的包装或隔室包含前述组分。
本发明的方法和试剂盒可以用于遗传和传染疾病的诊断、性别确定、遗传连锁分析和法学研究。
III.鉴定差异表达基因的应用
使用本发明的ACP的应用也能够提供一种用于检测和克隆与两种或多种核酸样品中差异表达mRNAs互补的cDNAs的方法。
关于本发明的另一个方面，提供了一种用于检测与两种或多种核酸样品中差异表达mRNAs互补的DNA的方法，其中该方法包括逆转录mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征为至少一个引物源于上述任意一种ACP。优选地，根据ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与逆转录生成的cDNA链区域基本互补的杂交序列(更优选地具有任意序列)。
在本发明的特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)提供代表mRNA转录本的第一群体的核酸的第一样品和代表第二种mRNA转录本第二群体核酸的第二样品；
(b)在模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成足以发生的条件下，单独地将第一核酸样品和第二核酸样品各与任意一种上述ACP的第一引物接触，其中该第一引物的3’-末端部分包括与与其杂交的差异表达mRNA内第一位点基本互补的杂交核苷酸序列；
(c)逆转录第一引物与其杂交的差异表达mRNA以生成第一引物与其杂交的在第一核酸样品中的差异表达mRNA互补的第一cDNA链的第一群体，并且也生成第一引物与其杂交的在第二核酸样品中的差异表达mRNA互补的第一cDNA链的第二群体；
(d)纯化和定量各第一cDNA链的第一和第二群体；
(e)在第二引物都与第一cDNA链各群体中的第二位点退火的条件下，在第一退火温度下进行步骤(d)得到的第一DNA链的各第一群体和第二群体的第一阶段扩增，该扩增含有至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用上述任意一种ACP的第二引物，其中该引物在其3’-末端部分具有与第一cDNA链的第一和第二群体的第二位点基本互补的杂交序列，从而cDNA第二链的第一和第二群体被产生；
(f)分别在每个引物与每个第二cDNA链的3’-和5’-末端退火的条件下，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(e)得到的每一个第二cDNA链的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用分别与步骤(b)和(e)相同的第一和第二引物，其中每一个都含有步骤(a)使用的每个引物的5’-末端部分相应的预先选定任意核苷酸序列，从而生成第二cDNA链的扩增产物，和
(g)比较在步骤(f)得到的扩增产物的第一和第二群体中单独扩增产物的水平或存在。
由于使用本发明的ACP的应用使用了前面讨论的该用于扩增核酸序列的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。
使用新ACP的用于鉴定差异表达基因的示意图在图2A中被说明。
在该方法中，代表mRNA转录本群体的核酸样品可以从许多种生物材料获得。通常，第一核酸样品包括在第一细胞中表达的mRNA和第二核酸样品包括在第二种细胞中表达的mRNA。特别地，第一核酸样品包括在处于第一个发育阶段的细胞中表达的mRNA和第二核酸样品包括处于第二发育阶段的细胞中表达的mRNA。此外，第一核酸样品包括肿瘤细胞中表达的mRNA和第二核酸样品中包括正常细胞中表达的mRNA。
该应用中的步骤(e)和(f)除引物外可以使用相同反应物在一个试管中进行，这意味着步骤(e)和(f)只在时间上被分隔。可以理解5’-末端部分对应引物可以在第二cDNA链合成时或之后被加入到反应混合物中。在优选实施例中，5’-末端部分对应引物在步骤(e)完成之后马上被加到反应混合物中，然后进行第二cDNA链的后续的PCR扩增。
也可以理解分别在步骤(b)和(e)中使用的第一和第二ACPs的5’-末端部分序列可以相同或不同；如果它们是相同的，5’-末端部分序列的对应引物将被用于步骤(f)，反之如果它们是不同的，各与ACPs 5’-末端部分序列分别对应的两个引物被用于步骤(f)。在优选实施例中，在步骤(b)和(e)中使用的第一和第二ACPs的5’-末端部分序列是不同的，因此各与ACPs 5’-末端部分序列分别对应的两个引物被用于步骤(f)。
作为可替代过程，在步骤(f)中分别用于步骤(b)和(e)的第一和第二ACPs的完全序列代替ACPs 5’-末端部分对应引物可以在高严谨条件下作为引物用于扩增步骤(e)得到的每个第二DNA链，其中使用第二ACP最初被合成的第二DNA链的3’-和5’-末端分别包括第一ACP序列和第二ACP互补序列，并且也作为第一和第二ACP的完全配对位点。由此看来，因为在第一阶段PCR反应进行时或其完成后不必向反应混合物中加入ACP 5’-末端部分对应引物，所以该替代过程为优选。图2B说明了通过上述替代过程鉴定差异表达基因的示意图。
与需要多个cDNA合成锚定引物的常规差异显示PCR不同，用于检测基因表达差异的本应用的方法仅使用一个cDNA合成引物(第一ACP)与mRNA反应。在Liang和Pardee于1992年略述的最初差异显示方法中，12个锚定引物被引入。例如具有T12MN序列的锚定引物，其中M为A、C或G，N为A、C、G或T，生成了12个单独的cDNA群体。最近修改的锚定引物被提出，该修改通过改变核苷酸数目，如在能与5’紧邻mRNAs polyA尾的序列杂交的3’-末端用一或三代替二或通过在保留Oligo(dT)9-12MN尾同时在5’-末端添加核苷酸从而导致长度至少为21个核苷酸(Villeponteau et al.，1996，Combates et al.，2000)。
本发明关于ACP用于鉴定差异表达基因的方法中的实施例，其中步骤(b)中使用的第一ACP由以下通式(2)代表：5’-dXp-dYq-dTr-3’其中dX是四种脱氧核糖核苷酸，A、C、G或T中一种；dY是含有通用碱基的控制子部分，该控制子部分在PCR过程中负责与退火功能改变相关的ACP的主要功能；dT为T脱氧核糖核苷酸；p、q和r分别代表整数；dXp代表5’-末端部分并且包括预先选定的任意核苷酸序列；dYq包括至少2个通用碱基；dTr代表3’-末端部分；3’-末端部分核苷酸序列应该具有比5’-末端部分更低的Tm。式(2)遵循式(1)的规则。式(2)的3’-末端部分由能够与mRNA polyA尾退火的序列组成并且用作mRNA逆转录中合成cDNA的引物。
在优选实施例中，用于步骤(b)中第一ACP的3’-末端部分长度上包括至少6个T核苷酸，这被认为引物退火的最低长度要求。更优选地，3’-末端部分序列长度上包括10～20个T核苷酸并且最多可达30个核苷酸。最优选地，3’-末端部分序列在长度上约为15个T核苷酸。这种引物被命名为dT15退火控制引物(dT15-ACP)。在优选实施例中，第一引物具有式5’-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3’，其中dX代表脱氧核糖核苷酸并且包括与第一和第二mRNAs群体基本不互补的预先选定的任意核苷酸序列；dY代表含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；dT代表能与在第一和第二mRNAs群体中的第一位点退火的毗邻脱氧胸苷。
在一个实施例中，步骤(b)使用的第一ACP的3’-末端部分可以在3’-末端含有能与紧临polyA尾上游mRNA序列杂交的至少一个附加核苷酸。在第一ACP 3’-末端的额外核苷酸长度上最多可达3个核苷酸。例如，dT可以进一步在其3’-末端包括3’-V；其中V为选自脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷中的一种。此外，dT可以进一步在其3’-末端包括3’-NV；其中V为选自脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷中的一种，N为选自脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷中的一种。最优选地，步骤(b)使用的第一ACP 3’-末端部分只含有dT15。
在优选实施例中，第一完整ACP长度约为40～45个核苷酸并且在其3’-末端部分包括dT15、在其5’-末端部分包括dX20-25和在其3’-和5’-末端部分之间包括dY5。第一完整ACP长度最多可达100个核苷酸。第一引物的例子为SEQ ID NOs：30，39，57和61-63。
此处描述的第一ACP被用于与mRNA polyA尾杂交，该polyA尾在所有mRNA中都出现，除了一小部分少数mRNA外。对照于使用常规锚定引物的差异显示技术产生至少3～64个单独的cDNA群体，使用于本发明的ACP的利用仅导致一个反应并且仅生成一个cDNA群体。这样通过构建每个试验的mRNA群体的单链cDNA的基本标准库从而极大地增加了该方法的效率。
在步骤(d)中，通过第一ACP合成的cDNAs的标准库应该被纯化然后通过本领域普通技术人员熟知的技术如分光光度法被定量。该步骤对于精确控制扩增步骤的加入量是必须的，然后比较两种或多种样品之间的最终扩增产物。优选地，本方法中此处cDNA产生的量被测定。更优选使用紫外线光谱进行定量，尽管任何一种本领域普通技术人员已知的用于cDNA定量的已知标准方法为此目的而被使用都可以接受。当使用UV光谱方法时，约260nm的UV光的吸收值优先地被使用。通过在此步骤中测定cDNA的量，从而样品间的cDNA量能够被标准化然后进行扩增反应。
使用第一ACP合成第一cDNA链之后，第二cDNA链在低严谨条件下使用第二ACP引物并且通过至少一个包括变性、退火和引物延伸的循环而被合成，其中已被合成的第一cDNA链被用作模板。
第二ACP模板基本遵循式(1)并且其3’-末端部分包括短的任意序列，优选该序列比5’-末端部分具有更低的Tm。这种引物被命名为任意退火控制引物(AR-ACP)。在优选实施例中，第二ACP 3’-末端部分长度上含有8～15个核苷酸。最优选地，该第二ACP 3’-末端部分长度上含有约10个核苷酸。
根据优选实施例，该第二ACP具有式5’-dX15-30-dY2-10-dZ8-15-3’，其中dX代表脱氧核糖核苷酸并且包括与第一cDNA链的第一和第二群体基本不互补的预先选定的任意核苷酸序列；dY代表含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；dZ代表能够与第一和第二DNA链群体中的第二位点退火的杂交任意核苷酸序列。更优选地，该完整ACP长度最多可达100个核苷酸。该第二引物的例子为SEQ ID NOs：1-9，13-18和20-23。
此处描述的第二ACP不同于所谓的长的任意引物，如在已知的改进差异显示技术中使用的。例如，如Villeponteau等(1996)和Diachenko等(1996)所描述的常规长任意引物，其长度至少为21或25个核苷酸，在整个序列中仅包括任意核苷酸。这些常规长任意引物在早期PCR循环中实现任意引发所需的低退火温度(约40℃)下以非预测方式进行杂交，从而合理地设计代表性引物对是不可能的。此外，当在如此低严谨性下使用长引物由于其“粘性”许多带都代表相同的mRNA。
该用于检测差异表达基因的方法的优点主要归因于使用第二ACP。由于第二ACP被设计根据温度限制第二ACP与其3’-末端部分序列退火，并不限制与其5’-末端部分退火，所以所得退火以可预测的方式进行，从而合理地设计代表性引物对是可能的。此外，使用第二ACP可以避免如在以前差异显示技术中在低严谨条件下常规长引物的“粘性”所引起的假阳性问题。
步骤(e)中在低严谨条件下用于合成第二DNA链的退火温度优选约40℃至65℃之间，更优选约为40℃至55℃之间，最优选约50℃。然而，与退火温度在35℃至45℃之间的差异显示不同，与已知使用任意引物的经典或改进差异显示技术相比本应用所使用低严格条件的退火温度相对较高。
本用于检测差异表达基因的应用的另一个独特和显著优点是在随后扩增中仅扩增最初合成的第二DNA链，其中使用第二ACP最初被合成的第二DNA链的3’-和5’-末端分别包括第一ACP互补序列和第二ACP序列，因此第一和第二ACPs完整序列，或第一和第二ACPs 5’-末端部分序列被用作扩增第二DNA链的3’和5’引物。
由于该应用中的ACP导致特异性产物的扩增，所以可能是基本消除主要关键问题，如假阳性和重复性差的问题，的原因，这些问题是由常规任意引物和dT引物在已知差异显示技术中与DNA第一和第二链和在PCR过程中与扩增产物非特异性退火所导致。
在优选实施例中，在步骤(e)中合成第二DNA链是在能够实现任意引发的低严谨条件下由至少一个循环和随后循环而被进行，在步骤(f)中在高严谨度条件下所得第二DNA链的扩增被更有效地进行。最优选地，在步骤(e)中合成D第二NA链在低严格条件下通过一个扩增循环而被进行。
在优选实施例中，扩增步骤(e)中被合成的第二DNA链在高严格条件下使用分别在步骤(b)和(e)中使用的第一和第二ACPs完全序列而被进行，作为引物序列，其中所得第二DNA链的3’-和5’-末端提供与第一和第二ACPs完全配对的位点。然而，有趣的是因为其3’-末端部分需要相对较低的退火温度并且高严谨度条件不能允许它们与除了第二DNA链的3’-和5’-末端外不能与任何模板上位点退火，所以除了这种高严谨条件下作为反应单位的第二DNA链3’-和5’-末端的退火和延伸外，该第一和第二ACPs并不参与任何其它与模板核酸的退火。因此，由于ACP的此能够根据退火温度选择性与模板退火的功能，该扩增产物能够被免于分析中的高假阳性率、重复性差和可能低表达不mRNA片断的问题，这些问题是已知差异显示中存在的主要问题。由此看来，尽管它们在高严谨条件和低严谨条件都共同使用相同的引物，但是本方法和常规差异显示方法之间还存在着显著差异。
在优选实施例中，在步骤(f)中用于高严谨条件扩增的退火温度优选为约55℃～72℃。最优选地，用于高严谨条件的退火温度约为65℃～68℃。
在优选实施例中，在PCR中步骤(f)中高严谨条件下的扩增通过至少10个循环而被进行并且最多可达50个循环以扩增步骤(e)所合成的第二DNA链。最优选地，PCR扩增通过40～45个循环被进行。
第二链cDNA优选地通过PCR合成，更优选地使用不用DNA聚合酶而启动整个反应的程序并且在＞90℃的热循环仪上孵育试管以完成初始变性步骤的热启动PCR。然后，保持试管在70℃以上的同时，适量的DNA聚合酶可以通过移液管加入反应中。在优选实施例中，在第二cDNA链合成的完全反应之后用于第二阶段扩增的引物在如＞90℃变性温度下被加入反应混合物中。然后，保持试管高于＞90℃的同时，适量的用于第二阶段扩增的引物可以通过移液管被加入反应中。
第二DNA链合成和在一个反应试管中使用第一和第二ACPs 5’-末端部分的预先选定的任意序列进行所得第二DNA链的后续扩增的例子在以下条件下被进行：该第二DNA链在低严谨条件下通过第一阶段扩增的包括退火、延伸和变性反应的一个循环而被合成；含有第一cDNA链、PCR反应缓冲液(如Roche销售的)、dNTP和第二ACP的反应混合物在94℃下预热，在保持装有反应混合物的试管约为94℃的同时，Taq聚合酶(如Roche销售的)被加入到反应混合物中；PCR反应进行如下：1个循环的94℃1min、50℃3min和72℃1min；随后在94℃下变性扩增产物；在步骤(e)中的第二DNA链合成完全反应后，5’预先选择的任意引物和3’预先选择的任意引物被加到反应混合物中然后第二阶段扩增进行如下：40个循环的94℃40sec、68℃40sec和72℃40sec；随后72℃最后延伸5min。
第二DNA链合成和在一个反应试管中分别在步骤(b)和(e)中使用的第一和第二ACPs完全序列代替第一和第二ACPs 5’-末端部分预先选定的任意序列进行所得第二DNA链的后续扩增的替代例子在如下条件下被进行：第二DNA链在低严谨条件下通过第一阶段扩增的包括退火、延伸和变性反应的一个循环而被合成；含有第一cDNA链、PCR反应缓冲液(如Roche销售的)、dNTP、第一ACP(dT15-ACP)和第二ACP(AR-ACP)的反应混合物在94℃下预热，在保持装有反应混合物的试管约为94℃的同时，Taq聚合酶(如Roche销售的)被加入到反应混合物中；PCR反应进行如下：1个循环的94℃1min、50℃3min和72℃1min；随后进行包括退火、延伸和变性反应的第二阶段PCR扩增；PCR反应进行如下：40个循环的94℃40sec、65℃40sec和72℃40sec；随后72℃最后延伸5min。
应该注意由第一阶段扩增的一个循环合成cDNA第二链时使用恰当浓度的任意ACP(第二ACP)。如果在步骤(e)中使用第二ACP的量过低，则所得扩增产物是不可重复的。相反，在步骤(e)中使用过量的第二ACP则会引起PCR扩增中的背景问题如DNA弥散。在优选实施例中，步骤(e)中使用第二ACP的浓度约为0.1μM～1.0μM。更优选地，第二ACP和第一ACP的浓度约为0.2μM。在优选实施例中，步骤(f)中使用引物的浓度约为0.1μM～1μM，最优选地，约为0.4μM。
鉴定基因差异表达的本应用的另一个显著特征是此方法中使用高退火温度。步骤(f)中使用高退火温度增加了PCR扩增中引物退火的特异性，这导致完全地消除假阳性产物和提高重复性。免于假阳性问题，该问题是一个以前差异表达技术中存在的主要关键问题，对于进行证实已通过差异表达鉴定的cDNA片断的筛选步骤尤为重要。
比较步骤(f)所得扩增产物的存在和水平可以根据本领域各种已知方法进行。在优选实施例中，步骤(f)扩增产物的每一第一和第二群体都通过电泳分辨以鉴定差异表达的mRNA。更优选地，所得PCRcDNA片断通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶被检测。本应用的另一个特征是使用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶来鉴定差异表达的mRNAs。而通常，常规差异显示方法使用变性聚丙烯酰氨凝胶利用放射性检测技术。然而，根据该方法，通过两阶段扩增而得的扩增cDNA片断的显著量使可以利用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶来检测所得扩增cDNAs，这样增加速度和避免使用放射性。
可替代地，所得cDNA片断也可以在变性聚丙烯酰氨凝胶上通过放射自显影或非放射检测方法而被检测，如银染(Gottschlich et al.，1997；Kociok et al.，1998)、使用荧光标记的寡聚核苷酸(Bauer et al.1993；Ito et al.1994；Luehrsen et al.，1997；Smith et al.，1997)、和使用生物素化引物(Korn et al.，1992；Tagle et al.，1993；Rosok et al.，1996)。
在另一个实施例中，同时使用自动系统如自动DNA测序仪和用于检测或分析扩增产物的任何独特标记(Bauer等1993)对于诊断目的也许是有帮助的。
考虑到本应用的ACP的特征，该用于检测和克隆差异表达基因的方法基本不同与上述以前的差异显示技术。
总之，该方法使用ACP使仅扩增第二DNA链和利用足够起始材料和高浓度的dNTP成为可能，从而得到以下优点：a)提高退火特异性，b)去除需要随后的繁重工作以证实真阳性的假阳性问题，c)提高可信度和重复性d)检测稀有mRNA，e)生成大小为150bp～2.0kb的长距离PCR产物，f)允许使用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶检测产物，g)提高分析速度，h)特别地，并不需要经过良好训练的技术人员操作此方法，和I)允许合理设计代表性引物组。
关于本发明的另一个方面，提供了用于检测差异表达mRNA的互补DNA的试剂盒，该试剂盒包括上述退火控制引物或退火控制引物组(第一和第二引物)。根据本发明的一个实施例，该试剂盒进一步包括具有ACPs 5’-末端部分对应核苷酸序列的引物或引物对；对于5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括此通用引物。本试剂盒可以任选地包括进行PCR反应所需的反应试剂，如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒也可以包括各种多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和反应试剂，及抑制DNA聚合酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性和阴性对照反应所必须的反应试剂。在给定反应中使用试剂的最佳量可以由具有当前公开知识的熟练技术人员轻易地确定。该试剂盒，典型地，适于以单独包装或分隔包含前述组分。
IV.cDNA末端快速扩增的应用(RACE)
使用本发明的ACP的应用可以提供一种用于快速扩增cDNA末端的改进方法，所谓的RACE技术。特定地，该应用的ACP被用于与3’-和5’-末端相关的RACE技术，并且解决常规RACE技术中使用的引物所导致的背景问题。
关于本发明的另一个方面，提供了一种用于快速扩增包括mRNA3’-末端区域对应cDNA区域的靶cDNA片断的方法，其中该方法包括逆转录所述mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于上述任意一种ACPs。优选地，根据ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与逆转录生成的cDNA上位点基本互补的基因特异性杂交核苷酸序列和/或在其3’-末端部分具有与mRNA polyA基本互补的杂交核苷酸序列。
在本发明的特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增的方法，包括：
(a)在模板驱动脱氧核糖核酸酶促合成足以进行的条件下，将mRNA与上述任意一个ACP的第一引物接触，其中该引物的3’-末端部分包括与与其杂交的mRNAs polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)逆转录第一引物与其杂交的mRNAs以生成第一引物与其杂交的mNRA互补的cDNA第一链群体；
(c)在第二引物都与一个第一cDNA链上基因特异位点退火的条件下，在第一退火温度下进行第一cDNA链的第一阶段扩增，该扩增含有至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACP的第二引物，其中该引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的一个第一cDNA链上位点基本互补的基因特异性杂交序列，从而基因特异性第二cDNA链被生成；和
(d)分别在每个引物与基因特异性第二cDNA链的3’-和5’-末端退火的条件下，在高严格条件的第二退火温度下进行第二阶段扩增步骤(c)得到的基因特异性第二cDNA链，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用分别与步骤(b)和(c)相同的第一和第二引物，或引物对，其中每一个引物都含有步骤(a)和(c)分别使用的第一和第二引物的5’-末端部分相应的预先选定的任意核苷酸序列，从而生成基因特异性cDNA链的扩增产物。
由于使用本发明的ACP的应用使用了前面讨论的该用于扩增核酸序列的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。
使用被称为基于ACP的3’RACE的新ACP系统扩增包括mRNA3’-末端对应3’-末端区域的靶cDNA片断的示意图，在图3中被说明。
该应用的步骤(c)和(d)可以在一个试管中除引物外使用相同反应混合物而发生，这意味着步骤(c)和(d)仅在时间上被分离。可以理解对应该5’-末端部分的对应引物可以在第二cDNA链合成时或其后被添加到反应混合物中。在优选实施例中，该5’-末端部分对应的引物在步骤(2)完成后马上被加到反应混合物中，然后进行第二cDNA链的随后扩增。
作为替代过程，步骤(d)中第一和第二ACPs的完全序列，代替第一和第二ACPs 5’-末端部分对应引物，可以被作用扩增步骤(c)所得第二cDNA链的3’和5’引物，其中最初使用第二ACP被合成的第二cDNA链的3’-和5’-末端分别包括第一ACP的互补序列和第二ACP序列，并且也可以用作与第一和第二ACPs完全配对的位点。图3也说明了通过上述替代过程扩增包括mRNA 3’-末端对应3’-末端区域的靶cDNA片断的示意图。
本发明关于3’-RACE的显著特征之一是含有与mRNApolyA尾基本互补的核苷酸序列的第一ACP被用作cDNA合成引物，然后所得cDNAs直接被用作随后扩增的模板而无须任何去除该cDNA合成引物的额外纯化步骤。
在ACP原理中所述的相对高严谨的条件下，第一ACP与模板退火在随后循环中由于调控子部分对ACP 3’-和5’-末端部分的影响而被打断。结果是因为3’-末端部分的退火被位于ACPs 3’-和5’-末端部分之间调控子部分的出现而特异化，所以用于3’RACE的本应用通过减少扩增步骤而简化了常规RACE方法，并且该应用中的ACP也不涉及背景问题，相反常规cDNA合成引物如用于3’RACE的Oligo-dT引物在PCR过程中产生非特异性产物的背景。根据优选实施例，用于DNA合成的第一ACP的通式可以与式(2)相同。
当基因特异引物用作5’引物时，在步骤(c)中含3’-末端序列的靶cDNA片断的第一扩增根据本领域已知的常规PCR方法被进行。在此处的使用参照于序列的术语“基因特异性”指本领域熟练技术人员通常已知或可得的部分特定基因序列或其互补物。因而，基因特异性引物指包括基因特异性序列的引物。
生成的第二cDNA链通过本发明用于扩增上述靶核苷酸序列的应用中所使用的第二阶段扩增而被扩增。由于本发明中被描述的ACP在引物中可以产生稳定的Tm并且也可以忍受用于引物设计的“引物搜寻参数”如引物长度、退火温度、GC含量和PCR产物长度，所以当基因特异性引物序列具有低Tm或对此参数太敏感以至于不能生成特异性产物时是有帮助的。
关于本发明的另一个方面，提供了一种用于快速扩增包括mRNA5’-末端区域对应cDNA区域的靶cDNA片断的方法，其中该方法包括逆转录所述mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于上述任意一种ACPs。优选地，根据ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与逆转录生成的cDNA上位点基本互补的基因特异性杂交核苷酸序列。
在本发明的特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增的方法，包括：
(a)在模板驱动脱氧核糖核酸酶促合成足以进行的条件下，将mRNA与作为cDNA合成引物的寡聚核苷酸dT引物或随机引物接触，其中该cDNA合成引物包括与与其杂交的mRNAs区域基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)利用逆转录酶逆转录与cDNA合成引物杂交的mRNAs以生成与cDNA合成引物杂交的mNRAs互补的第一cDNA链群体，从而mRNA-cDNA中间产物被生成；
(c)通过逆转录酶的末端转移酶反应在以mRNA-cDNA中间产物形式存在的第一cDNA链3’-末端加胞嘧啶残基尾；
(d)在寡核苷酸的3’-末端部分与胞嘧啶尾杂交的条件下，将在步骤(c)中合成的第一cDNA链3’-末端的胞嘧啶尾同寡聚核苷酸接触，该寡聚核苷酸包括由一组通用碱基或非识别碱基类似物分隔的3’-末端部分和5’-末端部分，其中在寡核苷酸3’-末端部分与胞嘧啶尾杂交的条件下，该3’-末端部分在其3’-末端包括至少两个鸟嘌呤残基以与cDNA第一链3’-末端的胞嘧啶尾杂交并且5’-末端部分包括预先选定的任意核苷酸；
(e)使用逆转录酶延伸加尾的第一cDNA链3’-末端以生成与寡核苷酸互补的附加序列，其中该寡核苷酸在延伸反应中用作模板，从而全长第一cDNA链被延伸；
(f)在第一退火温度下进行步骤(e)生成的全长第一cDNA链的第一阶段扩增。包括如下(i)和(ii)步骤：
(i)在第一引物与全长cDNA第一链3’-末端退火的条件下，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用含有与全长第一cDNA链3’-末端序列基本互补的核苷酸序列的第一引物，从而全长第二cDNA链被生成；
(ii)在第二引物与全长第二cDNA链上基因上特异性位点退火的条件下，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用权利要求1～25中的在其3’-末端部分具有与与其杂交的全长第二cDNA链上区域基本互补的基因特异性杂交序列的引物，从而基因特异性cDNA链被生成；和
(g)在每一个引物分别与基因特异cDNA链3’-和5’-末端序列退火的条件下，在高严谨条件的第二退火温度下，进行基因特异cDNA链的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用分别与步骤(f)-(i)和(f)-(ii)相同的第一和第二引物或引物对，每一引物含有分别在步骤(f)-(i)和(f)-(ii)中使用的第一和第二引物每一5’-末端部分对应核苷酸序列，从而基因特异性cDNA链的扩增产物被生成。
使用被称为基于ACP的5’RACE的新ACP系统扩增含有与mRNA 5’-末端对应的5’-末端区域的靶cDNA片断的示意图，在图4A(使用寡核苷酸dT引物)和4B(使用随机引物)中被说明。
步骤(a)中使用寡核苷酸dT引物的说明与该扩增来自mRNA的靶核酸序列扩增方法中使用引物的相关说明相同。可替代地，当靶mRNA非常大以至于逆转录酶在达到5’全序列之前就脱落时，该随机引物被用作cDNA合成引物。
根据优选实施例，进行加胞嘧啶残基尾的步骤(c)在存在锰离子时进行。
该应用的步骤(f)和(g)可以在一个试管中除引物外使用相同的反应混合物而发生，这意味着步骤(f)和(g)仅在时间上被分隔。可以理解步骤(f)和(g)中每一步所使用的引物可以在该步反应进行或完成后加入反应混合物中。在优选实施例中，该引物在每一步反应完成之后马上加入反应混合物中，然后进行第二cDNA链的随后PCR扩增。
当基因特异性引物被用作5’引物时，扩增步骤(f)中含5’-末端序列的靶cDNA片断根据本领域已知的常规PCR方法在高严谨条件下被进行。
在优选实施例中，步骤(f)中含5’-末端序列的靶cDNA片断使用在3’-末端部分含有基因特异性序列的第二ACP通过上面本发明用于扩增靶核酸序列的应用中所使用的两阶段PCR扩增而被扩增。由于本发明中被描述的ACP在引物中可以产生稳定的Tm并且也可以忍受用于引物设计的“引物搜寻参数”如引物长度、退火温度、GC含量和PCR产物长度，所以当基因特异性引物序列具有低Tm或对此参数太敏感以至于不能生成特异性产物时是有帮助的。第二ACP的通式与其中3’-末端部分含有基因特异性序列的式(1)相同。
步骤(d)中使用的寡核苷酸与CapFinder引物(Chenchik et al.，1998；Chenchik et al.U.S.Pat.Nos.5,962,271 and 5,962,272)在两者都在其3’-末端含有至少3个鸟嘌呤残基并且把此鸟嘌呤残基作为通过逆转录酶进行第一cDNA链3’-末端延伸的模板转移引物上相同，然而，关于PCR过程中根据退火温度而控制引物与模板核酸退火的开关功能方面它们是完全不同的。CapFinder引物并不包括在ACP中负责控制引物退火的通用碱基残基基团，所以用于5’RACE的CapFinder PCR方法(Chenchik等1998)并不能免于高背景问题，如污染引物如在PCR过程中使用的CapFinder和Oligo-dT引物所导致的DNA弥散。另一方面，第一ACP的通用碱基残基组在控制引物退火中起关键性作用，因此该方法不存在在随后PCR扩增中导致背景问题的任何因素；这是用于5’-RACE的该ACP应用的关键特征。
此外，当本发明的ACP用于5’-RACE技术时，不必进行物理分离过程如固相cDNA合成和在cDNA合成中使用的作为去除所有污染物的替代方法(Schramm等2000)而被引入的步骤。
在优选实施例中，5’-RACE中与胞嘧啶尾形成碱基配对的寡核苷酸具有与ACP相同的结构，及其该寡核苷酸通过以下通式(3)代表：5’-dX15-30-dY2-10-dZ1-10-G3-5-3’，其中dX代表脱氧核糖核苷酸并且包括预先选定的任意序列；dY代表含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的控制子部分；dZ代表脱氧核糖核苷酸并且包括预先选定的任意序列；G3-5代表3～5个鸟嘌呤。
最优选地，该3’-末端部分序列dZ长度优选约为2～3个核苷酸。进一步，在一个实施例中，该5’-末端部分dX可以包括限制性内切酶的识别序列。
G3-5可以是3～5个核糖鸟嘌呤或脱氧鸟嘌呤，或核糖鸟嘌呤和脱氧核糖鸟嘌呤的组合。在更优选实施例中，G3-5包括两个核糖鸟嘌呤和一个脱氧核糖鸟嘌呤(r(G)2-d(G)-3’)，最优选地，为3个核糖鸟嘌呤。
当步骤(f)中使用的基因特异性引物被用于5’-RACE的3’引物时，含5’-末端序列的靶cDNA片断在高严谨条件下通过本领域已知的常规PCR方法被扩增。
在优选实施例中，含5’-末端序列的靶cDNA片断，使用在3’-末端部分含有基因特异性序列的第二ACP，通过本发明中用于扩增靶核酸序列的应用所用的两阶段PCR扩增而被扩增。由于本发明中被描述的ACP在引物中可以产生稳定的Tm并且也可以忍受用于引物设计的“引物搜寻参数”如引物长度、退火温度、GC含量和PCR产物长度，所以当基因特异性引物序列具有低Tm或对此参数太敏感以至于不能生成特异性产物时是有帮助的。第二ACP的通式与其中3’-末端部分含有基因特异性序列的式(1)相同。
在RACE技术中使用ACP显著地简化了并且提高了上述关于扩增cDNA末端的常规RACE技术。本发明的关键特征是免于常规RACE方法中使用的引物所导致的背景问题。因此此处描述的该方法被常规RACE方法可以更有效、更容易、更少的密集劳动和更可重复。
关于本发明的另一个方面，提供了快速扩增含有mRNA 3’-末端区域的靶cDNA片断的试剂盒，该试剂盒包括前述退火控制引物或退火控制引物组(包括第一和第二引物)。根据本发明的一个实施例，这些试剂盒进一步包括具有ACPs 5’-末端部分对应核苷酸序列的引物或引物对；对于5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括通用引物。该试剂盒可以任选地包括进行PCR反应所必需的反应试剂，如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒也可以包括各种多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和反应试剂和抑制DNA酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性和阴性对照反应所必需的反应试剂。在给定反应中使用试剂的最佳量可以由具有当前公开知识的熟练技术人员容易地确定。该试剂盒，典型地，适于以单独包装或分隔包含前述组分。
关于本发明的另一个方面，提供了快速扩增含有mRNA 5’-末端区域的靶cDNA片断的试剂盒，该试剂盒包括前述退火控制引物或退火控制引物组(包括用于cDNA合成的寡核苷酸dT引物和随机引物、与胞嘧啶尾形成碱基对的寡核苷酸和第一和第二引物)。根据本发明的一个实施例，这些试剂盒进一步包括每一个都具有步骤(f)-(i)和(f)-(ii)中所用第一和第二引物每个5’-末端部分对应核苷酸序列的引物对；对于5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括通用引物。
V.扩增全长cDNA的应用
关于本发明的另一个方面，提供了用于扩增与mRNA互补的全长双链cDNAs群体的方法，其中该方法包括逆转录和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于上述任意一个ACP。优选地，具有ACP结构的引物具有与mRNA polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列。
在优选实施例中，该方法包括：
(a)在模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成足以进行的条件下，将mRNA与上述任意一个ACP的第一引物接触，其中该第一引物3’-末端部分具有与与其杂交的mRNA polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)利用逆转录酶逆转录第一引物与其杂交的mRNAs以生成cDNA合成引物与其杂交的mNRAs互补的第一cDNA链群体，从而mRNA-cDNA中间产物被生成；
(c)通过逆转录酶的末端转移酶反应在以mRNA-cDNA中间产物形式存在的第一cDNA链3’-末端加胞嘧啶残基尾；
(d)在寡核苷酸的3’-末端部分与胞嘧啶尾杂交的条件下，将在步骤(c)中合成的第一cDNA链3’-末端的胞嘧啶尾同寡聚核苷酸接触，该寡聚核苷酸包括由一组通用碱基或非识别碱基类似物分隔的3’-末端部分和5’-末端部分，其中在寡核苷酸3’-末端部分与胞嘧啶尾杂交的条件下，该3’-末端部分在其3’-末端包括至少三个鸟嘌呤残基以与第一cDNA链3’-末端胞嘧啶尾杂交并且5’-末端部分包括预先选定的任意核苷酸；
(e)使用逆转录酶延伸加尾的第一cDNA链3’-末端以生成与寡核苷酸互补的附加序列，其中该寡核苷酸在延伸反应中用作模板，从而全长第一cDNA链被延伸；和
(f)分别在每一个引物与全长第一cDNA链3’-和5’-末端序列退火的条件下，扩增步骤(e)生成的全长第一cDNA链，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用各包括分别与在步骤(a)和(d)中所用相同的第一引物和寡核苷酸对应的核苷酸序列的引物对，或各包括分别与在步骤(a)和(d)中使用的第一引物和寡核苷酸各5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物对，从而mRNA互补全长cDNA链的扩增产物被生成。
由于使用本发明的ACP的应用在原理上使用了前述该用于扩增核酸序列的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。此外，上述3’-末端部分具有与polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列的ACP在原理上与该3’-RACE方法的第一引物相同。
本发明的用于扩增全长cDNA分子的示意图在图5中被说明。
如上所述使用ACP显著地简化了并且提高了关于扩增全长cDNAs的常规技术。本方法的关键特征为免于常规方法中使用的引物所导致的背景问题。因此，此处描述的该方法与常规方法相比更有效、更容易、更少的密集劳动和更可重复。
关于本发明的另一个方面，提供了用于扩增mRNA互补全长cDNA双链的试剂盒，该试剂盒包括前述退火控制引物或退火控制引物组(包括寡核苷酸dT引物、与胞嘧啶尾形成碱基对的寡核苷酸和步骤(f)中使用的引物)。根据本发明的一个实施例，这些试剂盒进一步包括每一个引物都含有分别在步骤(a)和(d)中使用的引物和寡核苷酸的各5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物对；在5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括通用引物。该试剂盒可以任选地包括进行PCR反应所需的反应试剂，如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒也可以包括各种多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和反应试剂，及抑制DNA聚合酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性或阴性对照反应所必须的反应试剂。在给定反应中使用试剂的最佳量可以由具有当前公开知识的熟练技术人员容易地决定。该试剂盒，典型地，适于以单独包装或分隔包含前述组分。
VI.扩增5’-富集cDNA的应用
关于本发明的另一个方面，提供了一种用于扩增包含mRNA 5’-末端区域对应cDNA区域的5’富集双链cDNAs群体的方法，其中该方法包括逆转录mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于任意一个上述ACP。优选地，该用于cDNA合成具有ACP结构的引物在其3’-末端部分具有至少6个随机核苷酸序列。
在本发明的优选实施例中，该方法包括：
(a)在模板驱动脱氧核糖核酸酶促合成足以进行的条件下，将mRNA与上述任意一个ACP的第一引物接触，其中该第一引物3’-末端部分具有与与其杂交的mRNA polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)进行扩增全长cDNAs双链方法的(b)～(e)步骤，从而5’富集cDNA第一链被延伸；
(c)分别在每一个引物与5’富集第一cDNA链3’-和5’-末端序列退火的条件下，扩增步骤(b)生成的5’富集第一cDNA链，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用每一个引物都包含分别在步骤(a)和(b)中使用的引物和寡核苷酸每一5’-末端部分对应寡核苷酸的引物对，从而5’富集cDNA链的扩增产物被生成。
由于使用本发明的ACP的应用在原理上使用了前述该用于扩增核酸序列的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。此外，与胞嘧啶尾形成碱基对的寡核苷酸和步骤(c)中使用的引物对在原理上与上面讨论的本发明的5’-RACE所用引物相同。
扩增mRNAs互补的5’富集双链cDNAs的方法的示意图在图6中被说明。
“5’富集cDNAs”指含有该cDNA对应的mRNA 5’-末端核苷酸序列信息的cDNA组分的大部分。
第一引物的通式与其中3’-末端部分含有随机核苷酸序列的式(1)相同。在优选实施例中，步骤(a)所用第一引物的3’-末端部分含有至少6个随机脱氧核糖核苷酸。在优选实施例中，步骤(e)所用第一引物的5’-末端部分可以包括限制性内切酶识别序列。
因为常规方法使用的引物不具控制引物退火的功能，所以常规方法扩增mRNA分子互补的5’富集cDNA分子所需步骤多于本方法。相反，由于ACP中通用碱基残基的作用带来的调控引物退火功能，本方法是一种相当地简单和有效的方法。
关于本发明的另一方面，提供了一种用于扩增mRNA互补的5’富集双链cDNAs的试剂盒，该试剂盒包括上述退火控制引物或退火控制引物组(第一引物、与胞嘧啶尾形成碱基对的寡核苷酸)。根据本发明的一个实施例，这些试剂盒进一步包括每一个引物都含有分别在步骤(a)和(b)中使用的引物和寡核苷酸5’-末端部分对应核苷酸序列的引物对；对于5’-末端部分含有通用引物序列的情况，更优选该试剂盒包括该通用引物。该试剂盒可以任选地包括进行PCR反应所需的试剂如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸。任选地，该试剂盒也可以包括各种多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和反应试剂及抑制DNA聚合酶活性的抗体。该试剂盒也可以包括进行阳性或阴性对照反应所必须的反应试剂。在给定反应中使用试剂的最佳量可以由具有当前公开知识的熟练技术人员容易地决定。该试剂盒，典型地，适于以单独包装或分隔包含前述组分。
VII.DNA或RNA指纹识别的应用
使用本发明的ACP的应用可以提供一种用于检测基因组DNA多态性(DNA指纹)或检测mRNA差异表达基因(RNA指纹)的改进方法。
关于本发明的另一个方面，提供了一种用于制备gDNA的DNA指纹的方法，其中该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于任意一个上述ACPs。优选地，该具有ACP的引物在其3’-末端部分具有与gDNA上位点互补的任意核苷酸序列。
在本发明的特定实施例中，提供了使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)在引物或引物对与gDNA退火的条件下，在第一退火温度下进行来自gDNA的DNA指纹的第一阶段扩增，该DNA指纹为一组具有基因组特征的离散DNA片断，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACP的引物或引物对，其中每一个引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的gDNA上位点基本互补的任意核苷酸序列，从而该组作为DNA指纹特征的离散DNA片断被生成；和
(b)分别在引物或引物对中每个引物与步骤(a)所得一组离散DNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)所得一组离散DNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用与步骤(a)相同的引物或引物对或每一个引物都含有步骤(a)使用的每个引物或引物对5’-末端部分对应核苷酸序列的引物或引物对，从而该组离散DNA片断被再次扩增。
关于本发明的另一个方面，提供了一种制备mRNA样品的RNA指纹的方法，其中该方法包括逆转录和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于上述任意一个ACP。优选地，根据ACP结构的该引物在其3’-末端部分具有与逆转录所得cDNA链上位点基本互补的任意核苷酸序列和/或在其3’-末端部分具有与mRNA polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列。
在本发明的特定优选实施例中，提供了使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)在模板驱动脱氧核糖核酸酶促合成足以进行的条件下，将mRNA与上述任意一个ACP的第一引物接触，其中该第一引物具有与与其杂交的mRNApolyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)逆转录与第一引物杂交的mRNA样品以生成第一引物与之杂交的mRNA样品互补的第一cDNA链群体；
(c)在引物或引物对与mRNA样品退火的条件下，在第一退火温度下进行步骤(b)所得第一cDNA链群体的第一阶段扩增，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用任意一种上述ACPs的第二引物或引物对，其中每一个引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的第一cDNA链上位点基本互补的任意核苷酸序列，从而该组作为RNA指纹特征的离散cDNA片断被生成；和
(d)分别在引物或引物对中每个引物与步骤(c)所得该组离散cDNA片断的3’-和5’-末端序列分别退火的条件下，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)所得一组离散DNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，使用与步骤(c)相同的引物或引物对或每一个引物都含有步骤(c)使用的每个引物或引物对的5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物或引物对，从而该组离散cDNA片断被再次扩增。
由于使用本发明的ACP的应用在大体上使用了前述该用于扩增核酸序列的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。此外，RNA指纹在原理上遵循检测差异表达mRNA的互补DNA的方法。
此处使用的术语“基因组DNA”指包括一个物种所有遗传成分的DNA群体。因此基因组DNA含有预选物种存在的全套基因。该物种的全套基因也称为基因组。此处使用的术语DNA或RNA“指纹”分别指具有基因组的特征的一组离散DNA扩增产物或具有mRNA样品的特征的一组离散cDNA扩增产物。
在以前的被称为AP-PCR的任意引发PCR指纹中，因为需要低退火温度以实现任意引发所以短或长的任意引物在非严谨条件下用于前2～5个PCR扩增循环，从而尽管在高严谨条件下的随后循环中进行有效扩增所分离片断的主要部分也仍然不可重复。
与AP-PCR向对照，由于位于ACP 3’-和5’-末端部分之间的通用碱基残基基团的功能，其中该通用碱基残基基团将退火位点限制到ACP 3’-末端部分并且使该3’-末端部分可以在相对高退火温度下进行退火，所以基于ACP的PCR用于指纹时提高了PCR过程中引物退火的特异性。因此，基于ACP的PCR用于指纹时完全消除了假阳性产物并且显著地提高了重复性。
在优选实施例中，该ACP在其3’-末端部分包括长度上具有至少6个核苷酸的任意序列。更优选地，该3’-末端部分包括长度为8～15个核苷酸，最优选地，包括长度为约10个核苷酸。
单个ACP或ACPs对在DNA指纹中被用于检测多态性。优选地，因为ACPs对能够比单个任意ACP生成更多产物，所以ACPs对被用于DNA指纹。
使用ACP的DNA指纹的例子通过两阶段PCR扩增在以下条件下进行：扩增反应在低严谨条件下通过包括退火、延伸和变性反应的两个循环的第一阶段PCR而被进行；含有基因组DNA、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP and dTTP)、ACPs对被预热、Taq聚合酶被加入反应混合物中；在第一阶段PCR完全反应后，ACP5’-末端部分对应的预先选定的任意引物JYC4被加入到反应混合物中然后进行第二阶段PCR扩增。
应该注意恰当的ACP浓度被用于制备DNA指纹。如果ACP的量过低，所得PCR扩增产物不可重复。相反，在PCR过程中ACP过量产生背景如DNA弥散。在优选实施例中，ACP浓度约为0.1μM～2μM，最优选地，ACP浓度为1.4μM。
在优选实施例中，ACP 5’-末端部分对应引物的浓度为0.1μM～2μM，最优选地，约为0.8μM。
基因组DNA和mRNA样品可以由许多生物材料和环境中获得。例如，它们可以由植物、动物(人类)和微生物而获得并且可由不同单个生物体而获得。
扩增产物可以通过凝胶电泳分析。在一个实施例中，所得PCR产物也可以在变性聚丙烯酰氨凝胶上通过放射自显影或非放射性检测方法被检测，如银染(Gottschlich et al.1997；Kociok et al.，1998)、荧光标记的寡核苷酸(Bauer et al.1993；Ito et al.1994；Luehrsen et al.，1997；Smith et al.，1997)，、使用生物素化的引物(Korn et al.，1992；Tagle et al.，1993；Rosok et al.，1996)。
关于本发明的另一个方面，提供了通过使用gDNA或mRNA制备DNA指纹的试剂盒，该试剂盒包括上述退火控制引物或退火控制引物组。本发明的用于扩增核酸序列和检测差异表达mRNA互补DNA的试剂盒的说明可以用于该试剂盒中。
VIII.鉴定多基因家族中保守同源片断的应用
使用本发明的ACP的应用也可以提供鉴定多基因家族中保守同源片断的改进方法。
关于此发明的另一个方面，提供了用于鉴定mRNA样品的多基因家族中保守同源片断的方法，其中该方法包括逆转录和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于上述任意一个ACPs。优选地，具有ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与共有序列或简并序列基本互补的杂交核苷酸序列，其中该共有序列或简并序列编码逆转录所得cDNA链上保守同源片断的氨基酸序列，和/或在其3’-末端部分具有与mRNApolyA尾基本互补的杂交核苷酸序列。
在本发明的特定实施例中，提供了使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)在模板足以驱动脱氧核酸酶促合成开始的条件下，将mRNA样品与权利要求1～29任意一项中的第一引物接触，其中该第一引物具有与与其杂交的mRNA样品polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)逆转录与第一引物杂交的mRNA样品以生成与第一引物杂交的mRNA样品的互补第一cDNA链群体；
(c)在第一退火温度下，使用权利要求1～25任意一项中的第二引物，该第二引物在其3’-末端具有编码与其杂交的cDNA第一链上保守同源片断的共有序列或简并序列的基本互补杂交序列，在第二引物与共有序列或简并序列退火的条件下，进行第一阶段扩增步骤(b)生成的第一cDNA链群体，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成具有共有序列或简并序列的3’-末端cDNA片断；和
(d)在高严谨条件的第二退火温度下，使用分别与步骤(a)和(c)相同的第一和第二引物或者使用每一个引物都含有步骤(a)和(c)使用的第一和第二引物每一5’-末端部分相应核苷酸序列的引物对，进行第二阶段扩增步骤(c)生成的3’-末端cDNA片断，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而3’-末端保守同源cDNA片断被扩增。
在原理上该特定实施例除了使用的第二引物外，遵循前面讨论的该3’RACE方法。
在本发明的另一个特定的实施例中，提供了使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)进行扩增全长双链cDNA群体方法的(a)～(e)步，从而生成全长cDNA链；
(b)在第一退火温度下进行步骤(a)得到的全长第一cDNA链的第一阶段扩增，包括以下步骤：
(i)使用含有与全长第一cDNA链3’-末端序列基本互补的核甘酸序列的第一引物，在第一引物与全长第一cDNA链3’-末端退火的条件下，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成全长第二cDNA链；和
(ii)使用权利要求1～25任意一项中的第二引物，该第二引物在其3’-末端具有编码与其杂交的全长第二cDNA链上保守同源片断的共有序列或简并序列的基本互补杂交序列，在该第二引物与全长第二cDNA链上的共有序列或简并序列退火的条件下，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成具有共有序列或简并序列的5’-末端cDNA片断；和
(c)在高严谨条件的第二退火温度下，使用分别与步骤(b)-(i)和(b)-(ii)中相同的第一和第一引物，或使用每一引物都分别含有步骤(b)-(i)和(b)-(ii)使用的第一和第二引物每一5’-末端部分所对应的核甘酸序列的引物对，进行步骤(b)生成的5’-末端cDNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而5’-末端保守同源片断被扩增。
在原理上该特定实施例除了使用的第二引物外遵循前面讨论的该5’RACE方法。
关于本发明的另一个方面，提供了一种用于从gDNA中鉴定多基因家族的保守同源片断的方法，其中该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于上述任意一个ACPs中。优选地，该具有ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与编码gDNA上保守同源片断的氨基酸序列的共有序列或简并序列基本互补的杂交序列。
在本发明的特定实施例中，提供了一种使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)在第一退火温度下，使用上述ACPs中任意一个引物或引物对，其中每一引物在其3’-末端部分具有与编码与其杂交的gDNA上保守同源片断的氨基酸序列的共有序列或简并序列基本互补的杂交序列，在该引物或引物对与gDNA的共有序列或简并序列退火的条件下，进行第一阶段扩增gDNA的保守同源片断，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成具有共有序列或简并序列的基因组DNA片断；
(b)在高严谨条件的第二退火温度下，使用步骤(a)相同的引物或引物对，或使用每一个引物都含有步骤(a)所用引物或引物对的5’-末端部分所对应核甘酸序列的引物对，在该引物或该引物对的每一个引物分别与步骤(a)所得基因组DNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，进行步骤(a)生成的基因组DNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该保守同源基因组片断被扩增。
在原理上该特定实施例除了使用的引物外遵循前面讨论的从DNA扩增靶核酸序列的方法。
由于这种使用本发明的ACP的扩增在大体上使用了该前面讨论的扩增核酸序列的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度重复的这种说明书的复杂性。此外，当mRNA作为起始材料时，该用于3’或5’RACE的方法在原理上被应用于鉴定多基因家族的保守同源片断的方法。
用于鉴定多基因家族的保守同源片断的ACP式子与式(1)相同，其中ACP的3’-末端部分具有与基因家族的共有序列或编码保守同源性氨基酸序列的简并序列基本互补的杂交序列。
两种主要的方法用于设计简并引物：(a)使用从纯化蛋白质得到的肽序列数据；和(b)使用从基因家族的比对得到的共有蛋白质序列数据。如果目的基因的同源基因(orthologs)已经从其它生物体中被克隆，或如果该基因是基因家族的成员，则得到蛋白质序列的比对是可能的。
这些可以揭示用于设计简并引物的合适区域，例如，来自高度保守区域的共有序列。使用简并引物进行扩增有时可能是有问题的且需要优化。第一参数是退火温度。使退火温度尽可能的高以避免大量的非特异性扩增是重要的，并且一个好的经验规则(thumb)是以55℃作为起始温度。通常，因为简并引物应该以基于氨基酸序列设计作为前提，所以难以遵守该规则。然而，因为该ACP在第二阶段扩增允许高退火温度如65℃而无论引物如何设计，所以本发明的ACP并不需要一定满足该要求。
根据优选实施例，该第二引物为各含有选自多个编码共有序列的氨基酸序列的核甘酸的简并序列的引物的引物库。
此处使用的术语“保守区域”，更具体地“多基因家族的基因的保守区域”指基因家族成员之间显著相似的基因核甘酸序列或蛋白质氨基酸序列的片断。相似的程度能够改变。有些情况下，基因家族成员的保守区域完全相同。有些情况下，核甘酸序列可以显著变化但仍编码基因家族成员之间保守的氨基酸片断。此处使用的术语“共有序列”指当比较大量相似的核甘酸序列时，在任意给定位置处最经常发现的碱基。
可替代地，该用于鉴定保守同源片断的方法也可以与检测差异表达的mRNAs的方法结合使用。
关于本发明的另一个方面，提供了使用mRNA或gDNA来鉴定保守同源片断的试剂盒，该试剂盒包括上述退火控制引物或退火控制引物组。本发明的用于扩增核酸序列、3’RACE和5’RACE的试剂盒的说明可以用于该试剂盒。
IX. 鉴定核苷酸变异的应用
使用本主题发明的ACP体系的应用也能够提供一种用于鉴定靶核酸中核苷酸变异的改进方法。
关于本发明的另一方面，提供了一种用于鉴定靶核酸中核苷酸变异的方法，其中该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物从上述任意一个ACP中获得。优选地，具有该ACP结果的引物为(a)第一引物，该引物在其3’-末端部分具有与靶核酸的第一位点处的预先选定的序列基本互补的杂交序列，其中各第一引物和第一位点包括核苷酸变异对应的置疑位置，和/或(b)具有与靶核酸的第二位点处的预先选定的序列基本互补的杂交序列的第二引物。
在本发明的特定实施例中，提供了使用两阶段扩增的方法，包括：
(a)使用上述任意一个ACP中的第一引物，该引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的该靶核酸的第一位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列，其中各该第一引物和该第一位点含有该靶核苷酸变异所对应的置疑位置，在第一退火温度下进行第一阶段扩增以生成与包括该核苷酸变异的该靶核酸互补的第一DNA链，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而当该置疑位置由该第一位点的对应核苷酸的互补的该第一引物的核苷酸占据时，生成包括该核苷酸变异的该靶核酸的互补第一DNA链；和
(b)在高严格条件的第二退火温度下，进行步骤(a)生成的该第一DNA链的第二阶段扩增，包括以下步骤：
(i)在该第二引物与靶核酸的该第二位点退火的条件下，使用上述任意一个ACP的第二引物，该引物在其3’-末端部分含有与与其杂交的该靶核苷酸的第二位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而与包括该核苷酸变异的该第一DNA链互补的第二DNA链被生成；和
(ii)在各引物与该第二DNA链的3’-和5’-末端序列分别退火的条件下，使用与步骤(a)和(b)-(i)相同的第一和第二引物或各具有与与其杂交的步骤(b)-(i)生成的该第二DNA链3’-和5’-末端互补的或对应的杂交序列的引物对，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而在其3’-和5’-末端含有该靶核酸的该第一和第二位点的该第二DNA链被扩增，因此含有该核苷酸变异的该第二DNA链对应的靶核苷酸短片断被生成。
由于该使用本发明的ACP的应用在原理上使用了该前面讨论的核酸序列扩增的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度多样性的说明复杂性。
使用新ACP的单核苷酸多态性(SNP)基因型定型的特定实施例的示意图在图7A中被说明。
用于核苷酸变异的ACP的通式与通式(1)相同，其中其3’-末端部分含有与与其杂交靶核酸的位点上的含有核苷酸变异的预先选定序列基本互补的杂交序列，其中核苷酸变异对应的核苷酸和它的ACP的互补核苷酸占据置疑位置。该应用的过程使用含有靶核苷酸变异的从样品如的病人血液获得的基因组DNA或样品DNA的短片断通过两阶段PCR扩增进行。感兴趣的核苷酸样品可以从人核酸和导致传染病的生物体获得。
使用两阶段PCR扩增用于检测单核苷酸多态性(SNP)基因型定型的方法基本遵守使用基因组DNA作为初始材料用于扩增靶核酸序列的过程。此外，多重DNA扩增的过程可以适于本应用。
为了将作为初始材料的包括靶核苷酸变异的样品DNA的短片断用于上述过程，优选该目标短片断在步骤(a)之前使用各引物具有与与其杂交的样品DNA基本互补的杂交序列的引物对被预扩增。此外，多于一个各含有SNP的靶核苷酸片断可以通过如应用II所描述的多重DNA扩增被制备以用作用于多SNP筛选的本主题发明的初始材料。
步骤(a)使用的用于检测多态碱基的第一ACP为等位基因特异性ACP，该等位基因特异性ACP在其由靶核酸中发生核苷酸变异的核苷酸对应的互补核苷酸占据的3’-末端部分内含有置疑位置。优选地，该第一引物的置疑位置位于其3’-末端部分的中间。在更优选实施例中，该等位基因特异性ACP的置疑位置位于3’-末端核苷酸的约10个碱基内。更有利地，该等位基因特异性ACP的置疑位置位于该等位基因特异性ACP的3’-末端核苷酸的约6个碱基内。在另一优选实施例中，该等位基因特异性ACP的置疑位置位于从3’-末端核苷酸起位置4～6内。最优选地，该等位基因特异性ACP的置疑位置位于从3’-末端核苷酸起位置5处。此处使用的术语“3’-末端核苷酸”指位于ACP的3’-末端处的核苷酸。
在另一实施例中，步骤(a)使用的等位基因特异性ACP的3’-末端部分的在长度上含有为引物退火所需的最低长度要求的至少6个核苷酸。优选地，该3’-末端部分序列的长度约为10个包括置疑位置的核苷酸。
在一个实施例中，至少一个人工错配也可以使用与所用四个碱基形成微弱氢键而无DNA双体空间破坏的通用碱基或非识别碱基类似物而被置于ACP的3’-末端部分内。尽管人工错配的位置能够根据试验设计而变化，优选该错配核苷酸基本临近该第一引物的置疑位置。
在优选实施例中，第一或第二引物含有至少一个具有用于检测或分离的标记的核苷酸。
根据优选实施例，步骤(a)中包括核苷酸变异的第一DNA链通过一个循环的引物退火、引物延伸和变性被生成。优选步骤(b)-(i)中包括核苷酸变异的该第二DNA链通过一个循环的引物退火、引物延伸和变性被生成。优选地，步骤(b)-(ii)中包括核苷酸变异的该第二DNA链通过5个包括引物退火、引物延伸和变性的循环被生成。
在使用含有核苷酸变异的扩增的短DNA链片断的本发明的实施例中，提供使用第一和第二扩增的两个独立扩增的方法，其中该第二扩增使用两阶段扩增进行，包括：
(a)在核苷酸变异位于该预先选择的序列之间的条件下，使用各引物具有与该靶核酸杂交位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列的引物对，进行该第一扩增以生成该在末端之间含有该核苷酸变异的DNA链短片断，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，其中该引物对的至少一个引物为上述任意一个ACP，该引物在其3’-末端部分具有杂交序列，从而在其末端之间含有该核苷酸变异的DNA链短片断被扩增；
(b)使用任意一个ACP的第一引物，该引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的该靶核酸的第一位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列，其中各该第一引物和该第一位点含有该靶核苷酸变异所对应的置疑位置，在第一退火温度下进行所述第二扩增的第一阶段扩增以生成包括该核苷酸变异的该DNA链短片断的互补第一DNA链，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而当该置疑位置由该第一位点的对应核苷酸的该第一引物的互补核苷酸占据时，生成包括该核苷酸变异的该靶核酸的互补第一DNA链；和
(c)在各引物与该第一DNA链的3’-和5’-末端序列分别退火的条件下，使用引物对，其中该引物对中的一个引物与步骤(a)所用任意一个ACP的引物相同，另一个与步骤(b)所用该第一引物相同，或使用引物对，其中各引物具有与其杂交的步骤(b)生成的该第一DNA链3’-和5’-末端的互补或对应杂交序列，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)生成的第一DNA链的该第二扩增的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸他和变性，从而该第一DNA链被扩增，因此含有该核苷酸变异的该第一DNA链对应的靶核苷酸短片断被生成。
使用新ACP的单核苷酸多态性(SNP)基因型定型的另一特定实施例的示意图在图7B中被说明。由于该实施例与上述实施例以相同的方式进行，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度多样性的说明复杂性。
本方法可以被用于包括单核苷酸多态性和点突变(替代、缺失和插入)的各种核苷酸变异。
扩增产物可以通过凝胶电泳被分析。在一个实施例中，所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)，荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)，和生物素标记的引物(Kom等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)的使用在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
用于多SNP筛选的通过多重DNA扩增生成的扩增产物可以通过产物的粒析被比较。该粒析比较也可以通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳或测序进行。该产物也可以通过用于自动分析的荧光标记的寡核苷酸引物的使用被检测。
此处使用的术语“置疑位置”指靶核酸内的感兴趣的特定核苷酸碱基的位置。例如，在SNPs的分析中，靶核酸的“置疑位置”为不同于野生型的位置。该置疑位置也包括与靶核酸的置疑位置互补的引物的核苷酸位置。当引物与靶核酸杂交时，该靶核酸的置疑位置与引物的置疑位置相对。
此处使用的术语“多态性”指在不同基因组或个体之间或之中两个或多个可选择的基因组序列或等位基因的出现。“多态性的”指特定基因组序列的两个或多个变异体能够在群体中被发现的条件。“多态性位点”指变异发生的基因座。单核苷酸多态性，或SNP，为单个碱基对的变异，典型地在多态性位点处的一个核苷酸由另一个核苷酸的替代。单核苷酸的缺失或单核苷酸的插入也会引起单核苷酸多态性。典型地，在不同基因组之间或不同个体之间，多态性位点可以由两个不同的核苷酸占据。此处使用的术语“等位基因”指在特定基因组的基因座或标记处天然发生的序列变异(在一群个体中为可发现的)的集合的特定成员。
关于本发明的再一方面，提供了用于鉴定靶核酸的核苷酸变异的试剂盒，其中包括上述的退火控制引物或退火控制引物对(包括第一和第二引物)。本发明的用于核酸序列的扩增的试剂盒说明书可以被用于该试剂盒。
X诱变发生的应用
使用本主题发明的应用也能够提供一种用于诱变发生的改进方法。基于ACP的PCR提供了用于诱变发生包括缺失、插入序列、改变一个或多个特异性核苷酸和核苷酸序列的随机突变的极好工具。
关于本发明的进一个方面，提供了一种用于靶核酸中诱变发生的方法，该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物从上述任意一个ACPs中获得。优选地，该具有ACP结构的引物在其3’-末端部分具有与靶核酸序列的区域基本互补的杂交序列，其中该杂交序列具有负责诱变发生的核苷酸序列。
在本发明的特定实施例中，提供了使用两阶段扩增的方法，该方法包括：
(a)在该引物或引物对与其靶核苷酸序列退火的条件下，使用上述任意一个ACP中的引物对，其中各引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的靶核酸序列的区域基本互补的杂交序列，其中杂交序列具有至少一个错配核苷酸以产生定点突变，在第一退火温度下，进行靶核酸序列的第一阶段扩增，该扩增包括至少两个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而生成含有定点突变位点的扩增产物；和
(b)在各引物分别与扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，使用步骤(a)所用相同的引物或使用各引物都含有步骤(a)所用引物的各5’-末端部分所对应的预先选定任意核苷酸序列，在高严格条件的第二退火温度下，进行第二阶段扩增步骤(a)生成的扩增产物，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而含有该定点突变位点的扩增产物被再扩增。
该特定实施例与定点诱变发生相关。
由于该使用本发明的ACP的应用在原理上使用了该前面讨论的核酸序列扩增的方法，所以它们之间的共同说明被省略以避免导致过度多样性的说明复杂性。
用于PCR诱变发生的ACP的通式与式(1)相同，其中3’-末端部分含有用于定点诱变发生或随机突变的序列。
关于本发明再进一步的方面，提供了用于靶核酸的诱变发生的试剂盒，该试剂盒包括上述退火控制引物或退火控制引物对。本发明的用于核酸序列扩增的试剂盒的说明可以用于该试剂盒。
XI.其它应用
本主题发明的ACP在许多涉及核酸扩增的各种方法，特别地，PCR中也是有用的。例如，这些方法包括混合寡聚核苷酸起始的cDNA扩增、长距离PCR、线性PCR、反向PCR、定量PCR、降落PCR、测序、原位PCR、vectorette PCR、和热不对称交织PCR。这些方法的常规流程可以在Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001)和M.J.McPherson，et al.，PCR，Springer-VerlagNew York Inc.，N.Y.(2000)中查到。
因而，本发明包括根据ACP的引物用于涉及核酸扩增，特别地，PCR过程的所有使用。
本发明的ACP显著地有效并且广泛地用于基于核酸扩增的应用。并且，通过本发明的ACP和方法以前核酸扩增技术中存在的与引物退火特异性相关各种问题也可以基本地被解决。在核酸扩增过程中使用ACP带来的主要益处如下：
(a)由于在3’-末端部分与模板退火得条件下，3’-和5’-末端部分之间出现调控子部分将退火部分限制在3’-末端部分，所以引物的退火序列可以被精确地控制，这使设计能够仅具有理想数目的退火序列的引物成为可能(或使设计能够控制其退火部分的引物成为可能)。当引物的退火部分不得不受限制时(如SNP基因定型、DNA芯片筛选和差异表达基因的检测)，这种特点尤其地有帮助；
(b)由于3’-和5’-末端部分之间出现调控子部分打断了在3’-末端部分与模板退火的条件下5’-末端部分与模板的退火，所以最终该没有参与退火的5’-末端部分给3’-末端部分提供了引物退火特异性；
(c)引物退火特异性是高度灵敏的足以检测甚至一个碱基的错配。对于单核苷酸多态性(SNPs)基因定型是特别有帮助的；
(d)该ACP能够提供用于引物设计的“引物输入参数”如引物长度、退火温度、GC含量和PCR产物长度具有高耐受的引物；
(e)该ACP提供了允许扩增产物免于非特异性扩增的两阶段核酸扩增；
(f)核酸扩增的效率被提高，这使检测稀有mRNAs更容易；和
(g)核酸扩增的重复性被提高，这样节省了大量的时间和金钱。
象核酸扩增技术如PCR已经影响了生物技术领域一样，如上所述ACP的使用通过显示不受限制的应用性而基本地改变了现有核酸扩增技术的原理，并且使现有核酸扩增技术曾一度显著地改进。结果是自从引入核酸扩增技术以来该ACP和其此处所描述的各种应用为打开新生物技术时代提供了转折点。
下面特定的实施例用于说明本发明但不应被直译以限制如附加权利要求所定义的本发明的范围。
                           实施例
以下试验公开中，以下简写被使用：M(摩尔)，mM(毫摩尔)，μM(微摩尔)，g(克)，μg(微克)，ng(纳克)，l(升)，ml(毫升)，μl(微升)，℃(摄氏度)；Promega(Promega公司，Madison，USA)；Clontech(CLONTECH实验室，Palo Alto，美国)；Roche(Roche诊室，Mannheim，德国)；QIAGEN(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)。
本主题发明使用的引物如表1所示。
实施例1： 估测ACP中通用碱基的作用
位于ACP 3’-和5’-末端部分之间的通用碱基残基的作用可以使用鼠胚胎组织通过RT-PCR来估测。
总RNA从妊娠期4.5、11.5和18.5日的鼠系ICR的完整胚胎中通过使用Tri-试剂(Sigma)或如前述(Chun等1999；Hwang等2000)的LiCl/尿素方法(Hogan et al.，1994)而被提取。使用ACP的两个独立cDNA扩增试验被进行以检测位于ACP 3’-和5’-末端部分之间的通用碱基，特别地，脱氧次黄苷残基的如下效果：A.ACP 3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基与不含脱氧次黄苷基团的ACP和常规引物相比较的效果；B.ACP 3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基的影响随脱氧次黄苷数目变化的效果。
这些试验基于以下假设被进行：
(i)由于在碱基配对时较弱氢原子结合相互作用而具有比ACP其它部分更低Tm的通用碱基残基的出现不会参与在第一退火温度时ACP 3’-末端部分与模板位点退火的条件下进行的与模板核酸的退火。
(ii)ACP 3’-和5’-末端部分之间至少一个通用碱基残基的出现能够打断该5’-末端部分的退火从而将引物退火部分限制到3’-末端部分。
(iii)ACP 3’-末端部分在PCR过程中仅作为与模板退火的部分。
(iv)含10个T核苷酸dT10的dT-ACP的3’-末端部分也具有低Tm以至于不能与模板核酸结合。
(v)结果是该dT10-ACP在高退火温度下不能生成任何PCR产物。A. ACP 3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基与不含脱氧次黄 苷基团的ACP和常规引物相比较的效果
(a) 第一链cDNA的合成
dT10-JYC2 5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTT
-3’(SEQ ID NO：29)或dT10-ACP1 5’-
GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTT-3’(SEQ IDNO：30)被作为cDNA合成的引物。
3微克总RNA和2μl 10μM dT10-JYC2或10μM dT10-ACP1以20μl终体积被混合。该溶液在65℃下加热10分钟，在冰上淬灭，然后微离心将溶剂收集到底部。在冰上将以下成分以依次加入到退火的引物/模板中：0.5μl(40units/μl)RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega)，4μl5x反应缓冲液(250mM Tris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mMMgCl2，50mM DTT；Promega)，5μl 2mM各脱氧核苷酸的混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)和1μl猴-鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(200units/μl；Promega)。20μl的反应混合物于37℃孵育90min，微离心，置于冰上2min。94℃孵育2min终止反应。
(b) 使用ACPs扩增cDNA
dT10-ACP1被用于检测PCR扩增中位于3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷基团的影响。不含有脱氧次黄苷基团的dT10-JYC2被用作对照。
ACP10 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：13)被用作此试验的5’引物。
PCR扩增以50μl体积进行，其中含有50ng第一链cDNA，5μl 10xPCR缓冲液，1μl 10μM 5’引物(ACP10)，1μl 10μM 3’引物(dT10-JYC2或dT10-ACP1)，3μl 25mM MgCl2，5μl 2mM dNTP，0.5μlTaq聚合酶(5units/μl)。PCR反应在以下条件下进行：94℃加热5min，接着94℃加热1min，54℃加热1min，和72℃加热1min进行30个循环；然后72℃最后延伸5min。扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳然后经溴化乙锭染色后分析。
结果是如图8所示含有脱氧次黄苷基团的dT10-ACP1几乎没有生成产物(泳道4～6)，然而不含有次黄苷基团的dT10-JYC2生成多个扩增的cDNA产物(泳道1～3)。与我们所假设的一致，该结果清楚地说明位于3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基基团在如此高退火温度下还影响了dT10-ACP的3’-和5’-末端部分与模板cDNA的退火，如上假设所述导致了没有产物生成。
B. ACP 3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基随脱氧次黄嘌呤 数目变化的效果
(a) 第一链cDNA的合成
如上使用dT10-JYC2作为cDNA合成的引物从鼠胚胎的总RNA合成第一链cDNA。
(b) 使用ACPs扩增cDNA
在特别严格的条件下，如下该试验使用四个各ACP都含有不同脱氧次黄苷残基数目的ACPs以检测位于3’-和5’-末端部分之间的脱氧次黄苷残基随脱氧次黄苷数目改变的效果。
ACP16  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：20)；
ACP17  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：21)；
ACP18  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：22)；
ACP195’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIIIGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：23)；和
不含有脱氧次黄苷残基的CRP2I0 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：19)被用作对照。
步骤(A)生成的在其5’-末端含有dT10-ACP的预先选定任意序列的第一链cDNA被用作模板，该dT10-ACP 5’-末端部分对应的引物JYC25’-GCTTGACTACGATACTGTGCGA-3’(SEQ ID NO：10)被作为3’引物。
PCR扩增以50μl体积进行，其中含有50ng第一链cDNA，5μl 10x PCR缓冲液，1μl 10μM 5’引物(ACP16，17，18，19，或CRP2I0)，1μl10μM 3’引物(JYC2)，3μl 25mM MgCl2，5μl 2mM dNTP，0.5μl Taq聚合酶(5units/μl)。PCR反应包括：94℃加热5min，接着94℃加热1min，57℃加热1min，和72℃加热1min进行30个循环；然后72℃最后延伸5min。扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳然后经溴化乙锭染色后分析。
结果如图9所示不含有任何脱氧次黄苷残基的CRP2I0生成多个cDNA扩增产物，然而含有至少两个脱氧次黄嘌呤残基的ACPs生成的cDNA产物显著减少，并且甚至含有8个脱氧次黄苷残基的ACP几乎不生成产物。所得结果与我们的假设一致，该结果清楚地说明因为由于脱氧次黄苷这种如在碱基配对时较弱氢原子结果相互作用的特性而使一组毗邻的脱氧次黄苷残基在高严格的条件下3’-末端和5’-末端部分的退火所以ACP 3’-末端部分与模板的退火能够与5’-部分分离。
实施例2：使用ACP的用于扩增靶核酸序列的方法
本主题发明的ACP被用于扩增鼠胎盘特异性同源框(homebox)基因Esx1 cDNA的靶核苷酸序列。使用ACPs扩增Esx1 cDNA的靶核苷酸序列的过程和结果在此处被描述。从18.5日龄鼠的胎盘提取的总RNA(3μg)被用作起始材料。除了使用寡聚-dT15做为第一链cDNA合成的引物外在与实施例1的cDNA合成相同的条件下制备第一链cDNAs。
寡聚-dT15 5’-TTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：54)
所得第一链cDNAs被用作使用ACPs扩增Esx1的靶cDNA片断的模板。这些试验进行了为本发明的独特特征之一的两阶段PCR扩增。
该实施例中使用的Esx1的常规引物为：
EsxN7  5’-GCCGGTTGCAGAAGCACC-3’(SEQ ID NO：44)；
EsxC6  5’-GAACCATGTTTCTGAATGCC-3’(SEQ ID NO：45)；
EsxN1  5’-GAATCTGAAACAACTTTCTA-3’(SEQ ID NO：48)；
EsxC2  5’-GATGCATGGGACGAGGCACC-3’(SEQ ID NO：49)；
EsxN3  5’-CGCCGCAACCCCTGCCCGCA-3’(SEQ ID NO：51)；和
EsxC5  5’-GATGCATGGGACGAGGCA-3’(SEQ ID NO：52)。
因为在本领域中已知的常规PCR方法中它们被认为是能够产生高背景和非特异性产物的引物对，所以三个引物对，EsxN7和EsxC6、EsxN1和EsxC2、EsxN3和EsxC5在本实施例中被使用
根据单一靶PCR体系，应该选择具有相似熔点(Tm)的引物。然而，EsxN1(Tm50.7℃)和EsxC2(Tm71.9℃)引物对在它们之间显示出相差大约20℃的不同熔点，且EsxN3(Tm86.9℃)和EsxC5(Tm66.2℃)的引物对都具有高熔点。并且，熔点相对接近的引物对EsxN7(Tm68.2℃)和EsxC6(Tm61.2℃)被选用以观察ACP的效果。
本主题发明的ACP被用于这三个常规引物对以说明是否该ACP体系能够克服这些常规引物对所带来的主要问题，如背景和非特异性产物。
以下ACPs在其3’-末端部分包括以上常规引物的序列并且被用作用于第一阶段PCR扩增的Esx1基因特异性引物：
EsxN7-ACP 5’引物
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCGGTTGCAGAAGC
ACC-3’(SEQ ID NO：46)；
EsxC6-ACP 3’引物
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGAACCATGTTTCT
GAATGCC-3’(SEQ ID NO：47)；
EsxN1-ACP 5’引物
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGAATCTGAAACAACT
TTCTA-3’(SEQ ID NO：50)；
EsxC2-ACP 3’引物
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCATGGGACGAG
GCACC-3’(SEQ ID NO：55)；
EsxN3-ACP 5’引物
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGCCGCAACCCCTG
CCCGCA-3’(SEQ ID NO：53)；和
EsxC5-ACP 3’引物
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCATGGGACGA
GGCA-3’(SEQ ID NO：56)。
该ACPs的5’-末端部分序列被用作仅用于第二阶段PCR扩增的预先选定任意引物序列：JYC2和JYC4 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3’(SEQ ID NO：12)。
在第一阶段PCR扩增中，引物对EsxN7-ACP和EsxC6-ACP被分别用作5’和3’引物以生成520-bp的Esx1 cDNA片断，EsxN1-ACP和EsxC2-ACP的引物对被分别用作5’和3’引物以生成784-bp，EsxN3-ACP和EsxC5-ACP的引物对被分别用作5’和3’引物以生成483-bp的Esx1 cDNA片断。
在第二阶段PCR扩增中，JYC4和JYC2被分别用作预先选定任意5’和3’引物。作为替换，ACPs的完整序列代替预定任意引物如JYC4和JYC2可以被用作5’和3’引物而用于在高严格条件下进行的第二阶段PCR扩增。在这种情况下，不必在第一阶段反应时或其后向反应混合物中加入预先选定任意引物(流程B)。
流程A： 一个间断的两阶段PCR扩增
(A) 第一阶段PCR扩增
第一阶段PCR扩增通过热启动PCR方法来进行，其中该方法是无DNA聚合酶条件下启动整个反应且将试管在热循环仪上孵育以在＞90℃时完成最初变性。然后在保持试管的温度高于70℃的同时，合适量的DNA聚合酶可以通过移液管加入反应中。
第一阶段PCR扩增通过两个循环的包括退火、延伸和变性反应的PCR而进行；反应混合液的终体积为49.5μl，其中包括50ng第一链cDNA，5μl 10xPCR反应缓冲液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μldNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2mM)，1.35μl 5’ACP(1μM)和1.35μl3’ACP(1μM)在94℃预热，在将含有反应溶液的试管保持在94℃的同时，0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Promega)被加入到反应混合液中；PCR反应包括两个循环的94℃加热40sec，60℃加热40sec，72℃加热40sec；然后在94℃变性扩增产物。
(B) 第二阶段PCR扩增
使用Esx1基因特异性ACPS通过第一阶段PCR扩增所得的cDNA产物然后在更高退火温度下通过随后的第二阶段PCR扩增被扩增。第一阶段PCR扩增完成后各1μl的10μM预先选定任意引物JYC4和JYC2在变性温度如94℃时被加到第一阶段PCR扩增所得的反应混合物中。第二阶段PCR反应进行如下：94℃加热40sec，68℃加热40sec和72℃加热40 sec进行35个循环；然后在72℃最后延伸5min。
扩增产物通过2％琼脂糖凝胶分析然后通过溴化乙锭染色来检测。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)，荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)，和生物素标记的引物(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)的使用在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
如图10A-C所示，使EsxN7-ACP和EsxC6-ACP、EsxN1-ACP和EsxC2-ACP、EsxN3-ACP和EsxC5-ACP的各引物对进行Esx1的一个间断的两阶段PCR扩增从而分别生成大小为520-bp(图10A，泳道2)，784-bp(图10B，泳道4)和483-bp(图10C，泳道3)的Esx1 cDNA片断的单一条带。相反，含有仅对应于各ACPs对的3’-末端部分的序列的常规引物对生成非特异性产物和高背景如DNA弥散(图10A，泳道1；图10B，泳道3；图10C，泳道1和2)。因为使用ACP对的PCR产物在其5’-和3’-末端包括预先选定任意序列，所以对应预先选定任意序列和脱氧次黄苷残基的附加54-bp序列被发现。
图10A显示通过下列引物对：EsxN7和EsxC6(泳道1)和引物对EsxN7-ACP和EsxC6-ACP(泳道2)生成的cDNA扩增产物。使用常规引物对EsxN7和EsxC6的PCR反应如下：94℃加热5min，接着94℃加热40sec，60℃加热40sec，和72℃加热40sec进行30个循环；然后在72℃最后延伸5min。
图10B显示使用如下单个引物或引物对生成的cDNA扩增产物，其中引物EsxN1和EsxC2被分别用于泳道1和2；EsxN1-ACP和常规引物EsxC2的组合被用于泳道3；两个ACPs EsxN1-ACP和EsxC2-ACP被用于泳道4。当常规引物对EsxN1和EsxC2在高退火温度60℃下被使用时，无特异性目标产物生成。当包括一个ACPEsxN1-ACP和常规引物EsxC2的引物对被使用时，由于常规引物EsxC2的非特异性结合所以特异性目标产物和非特异性产物都被扩增(泳道3)。然而，当ACP对被使用时，仅单一的特异性目标产物被扩增(泳道4)，这说明本主题发明的ACP提供了对与单一靶PCR体系所需通用引物的熔点相关的“引物设计参数”具有耐受的引物。
图10C显示通过使用下列引物对生成的cDNA扩增产物：引物对EsxN3和EsxC5用于泳道1和2，引物对EsxN3-ACP和EsxC5-ACP被用于泳道3。使用常规引物对EsxN3和EsxC5的PCR反应如下进行：94℃加热5min，接着94℃加热40sec，58℃加热40sec，和72℃加热40sec进行30个循环；然后在72℃最后延伸5min(泳道1)。常规引物和ACP对通过与ACP所用相同的两阶段PCR扩增而被比较，从而退火温度从60℃升高到68℃(泳道2)。这些结果也说明尽管包括具有高Tm的引物的常规引物被用于相同的两阶段PCR扩增，它们也不能免于非特异性产物和背景的问题，反之本主题发明的ACP能够帮助解决此类由常规引物所引起的问题。
流程B： 无间断的两阶段PCR扩增
可替换地，ACPs的全序列代替预先确定任意引物如JYC4和JYC2可以被用作在高严格条件下的第二阶段PCR扩增的引物。在这种情况下，不必在第一阶段PCR反应进行时或其完成后向反应混合物中加入预先确定任意引物。
除了在第一阶段PCR扩增时加入的ACPs浓度1μl5’ACP(10μM)和1μl 3’ACP(10μM)，和由于没有加入预定任意引物的步骤所以第二阶段PCR扩增跟随第一阶段PCR扩增而无耽搁地立即进行外无间断的两阶段PCR扩增的过程基本与流程A相同。
扩增产物通过2％琼脂糖凝胶被分析且通过溴化乙锭染色被检测。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)，荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)，和生物素标记的引物(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)的使用在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
图10D显示使用下列单一引物或引物对通过无间断的两阶段PCR扩增而生成cDNA扩增产物；引物EsxN1和EsxC2被分别用于泳道1和2；引物对EsxN1和EsxC2被用于泳道3；引物对EsxN1-ACP和EsxC2-ACP被用于泳道4。当常规引物对EsxN1和EsxC2被使用时，无靶特异性产物被生成。然而，当ACP对被用于无间断的两阶段PCR扩增时，仅单一的靶特异性产物被扩增(泳道4)，这与一个间断的两阶段PCR扩增的结果一致(图10B)。
这些例子说明ACP使产物免于本领域所述的PCR方法所用的常规引物所引起的背景问题和非特异性问题。也可以理解无论基因特异性引物如何设计ACP都允许生成特异性产物。
实施例3： 使用ACP的鼠胚胎发育过程中差异表达的mRNAs的 鉴定和表征
本主题发明的ACP已经被用于检测胚胎发育中差异表达的mRNAs。特别地，使用不同发育阶段的胚胎组织的总RNAs作为起始材料的三种不同流程和结果在此处被描述。本主题发明使用的引物如表1所示。
A1. 流程1
步骤(1)： 第一链cDNA的合成
使用dT10-ACP1或JYC5-T15-ACP作为cDNA合成的引物在与实施例1中合成cDNA相同的条件下制备第一链cDNAs。所得cDNAs通过旋转柱(PCR纯化试剂盒QIAGEN)纯化以去除引物、dNTP和上述试剂。在使用UV分光仪测定260nm的吸收值的cDNAs的浓度前必须进行纯化步骤。各样品的相同量cDNAs通过使用此处描述的ACP体系而被用于比较它们的扩增模式。
步骤(2)： 使用ACP的第一阶段PCR扩增
以下ACPs被用作用于第一PCR扩增的任意ACPs(AR-ACPs)：
ACP3  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACS-3’(SEQ ID NO：3)；
ACP5  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCS-3’(SEQ ID NO：5)；
ACP8  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCS-3’(SEQ ID NO：8)；
ACP10 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC-3’(SEQ ID NO：13)；
ACP13 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCG-3’(SEQ ID NO：16)；和
ACP145’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCC-3’(SEQ ID NO：17)。
dT10-ACP1和AR-ACPs的5’-末端部分序列被用作仅用于第二PCR扩增的预先选定任意引物序列。该预定任意引物是JYC2和JYC4。
步骤(1)生成的第一链cDNAs使用AR-ACPs(ACP3、ACP5、ACP8、ACP10、ACP13或ACP14)之一和dT10-ACP1分别作为5’和3’引物通过以下第一阶段PCR扩增而被扩增。第一阶段PCR扩增以50μl体积进行，其中含有50ng第一链cDNA，5μl 10xPCR缓冲液(Promega)，3μl 25mM MgCl2，，5μl dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.2mM)，5μl 5’引物(1μM)，5μl 3’引物(1μM)和0.5μl Taq聚合酶(5units/μl)。PCR反应在以下条件下进行：94℃加热5min，接着94℃加热1min，50℃加热1min和72℃加热1min进行20个循环；然后72℃最后延伸5min。
第一阶段PCR扩增的循环可以根据样品的类型而改变。例如鼠胚胎组织样品用20个循环的第一PCR扩增。
步骤(3)： 使用ACPs的5’-末端部分序列对应的预先选定的任意引 物进行第二阶段PCR扩增
步骤(2)生成的cDNA扩增产物通过以下第二阶段PCR扩增被再扩增，该扩增使用两个各分别对应AR-ACP和dT10-ACP1的5’-末端部分序列的预先选定的任意引物JYC4和JYC2。第二阶段PCR扩增以50μl体积进行，其中含有5μl第一扩增的cDNA产物(50μl)，5μl 10xPCR缓冲液(Promega)，3μl 25mM MgCl2，，5μl 2mM dNTP，1μl 5’引物(10μM)，1μl 3’引物(10μM)和0.5μl Taq聚合酶(5units/μl)。PCR反应进行如下：94℃加热5min，接着94℃加热1min，65℃加热1min和72℃加热1min进行30个循环；然后72℃最后延伸5min。
A2. 流程2
可替换的流程包括以下步骤：
(a)提供代表mRNA转录本的第一群体的核酸第一样品和代表mRNA转录本的第二群体的核酸第二样品；
(b)将各第一核酸样品和第二核酸样品都与第一ACP接触，其中该第一ACP与与其杂交的mRNA转录本的第一和第二群体的区域基本互补的杂交序列；
(c)逆转录与第一ACP杂交的mRNA生成DNA链的第一群体和DNA链的第二群体，其中DNA链第一群体中的DNA链与在第一核酸样品中与第一ACP杂交的mRNAs互补，DNA链第二群体中的DNA链与在第二核酸样品中与第一ACP杂交的mRNAs互补；
(d)纯化和定量互补DNA链作为逆转录步骤(c)的结果；
(e)通过至少一个包括变性、退火和引物延伸的循环，在低严格的条件下使用第二ACP来合成DNA链的各第一和第二群体的互补第二DNA链，其中该第二ACP具有与第一和第二DNA量群体基本互补的杂交序列；
(f)在高严格的条件下使用两个预先选定的任意引物，各引物都含有第一和第二退火控制引物的各5’-末端部分所对应的序列，扩增步骤(e)所得的各第二DNA链，该扩增通过至少一个包括变性、退火和引物延伸的循环，生成扩增产物的第一和第二群体；和
(g)比较扩增产物的第一和第二群体中各个扩增产物的量。
第一链cDNAs使用JYC5-T15-ACP 5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIIITTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：61)被合成。
JYC5-T15-ACP的5’-末端部分序列作为仅被用于PCR扩增的第二阶段的3’预先选定的任意引物序列。
JYC5 5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3’(SEQ ID NO：60)。
步骤(1)： 合成cDNA第一链
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合3μg总RNA和2μl 10μMJYC5-T15-ACP。
2.加入无菌H2O使最终体积为9.5μl。混合组分并在微离心机中短暂离心试管。
3.在80℃孵育试管3分钟或使用热循环仪以实现同样的目的。
4.试管在冰上冷却2分钟。在微离心机中短暂离心收集组分。
5.向同一个反应试管中加入以下试剂：4μl 5x第一链缓冲液(Promega)，5μl dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2mM)，0.5μl Rnasin抑制剂(40 units/μl，Promega)和1μlM-MLV逆转录酶(200U/μl)。
6.混合组分并在微离心机中短暂离心试管。
7.将试管在42℃孵育90min。
8.将管在94℃孵育2min以终止第一链的合成。
9.将试管在冰上放置2min。
10.通过旋转柱(PCR纯化试剂盒QIAGEN)纯化所得的cDNAs以去除引物、dNTP和以上试剂。
11.接下来，使用UV分光仪在260nm的吸收值处测cDNAs的浓度。
12.进行步骤2。
步骤(2) ：使用ACP的第二链cDNA的合成
相同量的各样品的cDNAs使用此处描述的ACPs被用于比较它们的扩增模式。第二链cDNA使用任意引物ACP10通过热启动PCR方法被合成，其中该流程无需DNA聚合酶而启动整个反应并且在热循环仪上保持温度＞90℃以完成最初变性。然后，在保持试管的温度高于90℃的同时，将合适量的DNA聚合酶通过移液管加入反应中。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：49.5μl总体积中包括1μl步骤1制备的第一链cDNA(50ng/μl)，5μl10xPCR缓冲液(Roche)，5μl2mM dNTP，1μl 10μM任意ACP(5’引物)和37.5μl无菌dH2O。
2.混合组分并在微离心机中短暂离心试管。
3.将试管置于热循环仪上94℃预热。
4.向反应中加入0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Roche)，同时保持试管的温度为94℃。
5.在以下条件下进行PCR反应：94℃加热5min，50℃加热3min，和72℃加热1min进行一个循环；然后在94℃变性第一扩增产物。
步骤(3)： 使用ACPs 5’-末端部分对应的预先选定的任意引物进行 第二链cDNAs的PCR扩增
1.第一阶段PCR扩增完成后，在保持试管的温度高于94℃的同时向步骤(2)中使用的反应混合物中加入2μl 10μM JYC4和2μl 10μM JYC5，其中各分别对应5’和3’ACPs的5’-末端部分序列。
2.在以下条件下进行第二阶段PCR反应：94℃加热40sec，68℃加热40sec和72℃加热40sec进行40个循环；然后72℃最后延伸5min。
A3. 流程3
作为替换流程，在流程2中的(f)步中，流程2中步骤(b)和(e)中使用的第一和第二ACPs的完全序列能够代替第一和第二ACPs 5’-末端部分的预先选定的任意序列被分别用作3’和5’引物，在高严格的条件下用于扩增流程2中步骤(e)所得的各第二链DNA，其中使用第二ACP被最初合成的第二链DNA的3’-和5’-末端分别包括第一ACP的序列和第二ACP的互补序列，并且也作为与第一和第二ACPs完美配对的位点。在这种情况下，在第一阶段PCR反应时或其后不必向反应混合物中加入预先选定的任意引物。
步骤(1)： 合成第一链cDNAs
使用JYC5-T15-ACP作为cDNA合成的引物在与流程2中cDNA合成相同的条件下制备第一链cDNAs。
步骤(2)： 使用无间断的两阶段PCR的第二链cDNA的合成和扩 增
相同量的各样品使用此处描述的ACPs被用于它们的扩增模式的比较。第二链cDNA使用任意引物ACP10通过热启动PCR方法被合成，其中该流程无需DNA聚合酶而启动整个反应并且在热循环仪上保持温度＞90℃以完成预变性。然后，在保持试管的温度高于90℃的同时，将合适量DNA聚合酶通过移液管加入反应中。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：49.5μl总体积中包括1μl步骤1制备的第一链cDNA(50ng/μl)，5μl 10xPCR缓冲液(Roche)，5μl 2mM dNTP，1μl 10μM任意ACP10(5’引物)，1μl 10μM JYC5-T15-ACP(3’引物)和37.5μl无菌dH2O。
2.混合组分并在微离心机中短暂离心试管。
3.将试管置于热循环仪上94℃预热。
4.向反应中加入0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Roche)，同时保持试管的温度为94℃。
5.在以下条件下进行PCR反应：94℃加热5min，50℃加热3min，和72℃加热1min进行一个循环；接着94℃加热40sec，65℃加热40sec，和72℃加热40sec进行40个循环；然后72℃最后延伸5min。
B. 通过电泳分析分离PCR扩增产物并回收差异显示的带
扩增产物通过2％琼脂糖凝胶分析然后通过溴化乙锭染色被检测。数个在胚胎发育时期(E4.5，E11.5和E18.5)的主要差异表达的带被选择、切割并使用GENECLEAN II试剂盒(BIO 101)从凝胶中被提取。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)，荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)，和生物素标记的引物(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)的使用在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
C. 回收带的再扩增
步骤B得到的带使用流程1，2和3所用相同的预先选定的任意引物和PCR条件被再扩增。
D. 克隆并测序再扩增的片断
各扩增片断被克隆到pGEM-T Easy载体上(Promega)且使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Perkin Elmer)用ABI PRISM 310Genetic Analyzer(Perkin Elmer Biosystem)被测序。计算机辅助序列分析使用BLAST(本地基本比对研究工具)研究程序进行。
E. Northern分析
20微克从胚胎组织提取的总RNA被溶解于1％甲醛变性琼脂糖凝胶中，转移到尼龙膜上(Hybond-N，Amersham，美国)，如前所述(Chun等1999；Hwang等2000)与溶解与QuikHyb溶液中(Stratagene，美国)的a32P标记的PCR亚克隆产物58℃下杂交过夜。杂交膜在65℃下用2xSSC，0.1％SDS洗20min，洗两次，用1xSSC，0.1％SDS洗20，洗且洗两次，用0.1xSSC，0.1％SDS洗20min，洗两次。所得膜在-80℃下用Fuji强化扫描仪被曝光于Kodak X-Omat XK-1底片。
图11A-D显示cDNA扩增产物，其中不同阶段的鼠胚胎样品分别使用以下引物对通过流程1被扩增：图11A中泳道1～3的ACP3和dT10-ACP1引物对；图11B中泳道1～6的ACP5和dT10-ACP1引物对和图10B中泳道7～12的ACP8和dT10-ACP1引物对。图11B也显示使用其它ACP对生成的cDNA扩增产物的附加结果。图11C～D中显示通过分别使用两对引物ACP10和dT10-ACP1(图11C)，和ACP14和dT10-ACP1(图11D)生成的扩增产物。在特定阶段的许多差异表达的带被获得，亚克隆到pGEM-T Easy载体上(Promega)并测序。序列分析揭示所有克隆除了两个新基因外(表2)都为已知基因。表达模式使用鼠胚胎阶段杂交通过Northern杂交证实(Seegene，Inc.，Seoul，韩国)。
图12A显示cDNA扩增产物，其中不同阶段(E4.5：泳道1；E11.5泳道2；E18.5：泳道3)的鼠胚胎样品使用ACP10和JYC5-T15-ACP引物对通过流程2被扩增。在特定阶段的许多差异表达的带被获得，亚克隆到pGEM-T Easy载体上(Promega)并测序。序列分析揭示所有克隆除了一个DEG 2外(表2)都为已知基因。表达模式使用鼠胚胎阶段杂交通过Northern杂交证实(Seegene，Inc.，Seoul，韩国)。
图12B显示cDNA的扩增产物，其中不同阶段(E4.5：泳道3；E11.5泳道4；E18.5：泳道5)的鼠胚胎样品使用上述流程3中提到的ACP10和JYC5-T15-ACP引物对通过无间断的两阶段PCR扩增被扩增。当ACP10和JYC5-T15-ACP引物对(泳道3～5)被使用时，所得带与包括一个间断的两阶段PCR扩增的流程2所得的带(图12A)相同。然而，当单一引物，ACP10(泳道1)或JYC5-T15-ACP(泳道2)被使用时无产物生成，这说明了仅当ACP10和JYC5-T15-ACP作为一对被用于它们的特异性结合时扩增产物才会被生成。
图13显示使用DEG1(A；图10A，图11和图12的箭头1)，DEG2(C)，DEG3(B；图10A，图11和图12的箭头2)，DEG5(E)，DEG7(F)和DEG8(D；图10A，图11和图12的箭头4)作为探针的表示6个不同克隆的Northern杂交的结果。DEG1探针也与原肌球蛋白的可替代异形杂交(图11和图12中的箭头1’)，这通过本发明被发现。与琼脂糖凝胶分析的结果一致，Northern杂交分析显示克隆的表达模式与琼脂糖凝胶上的最初带相同，这说明所有的克隆都是真阳性产物。因此，该ACP仅生成无任何假阳性的阳性产物，这意味着该ACP去除了假阳性的问题。
图14显示鼠胚胎发育过程中DEG5的表达的Northern杂交结果。测序分析证明DEG5是一个新基因，该基因显示出有趣的表达模式：在早期妊娠阶段(E4.5)出现强表达后，在中期它的表达逐渐变弱但在发育后期(E17.5和E18.5)又逐渐增强。
这些结果说明使用ACP来分离差异表达基因的方法仅生成真正的PCR产物且完全消除了假阳性产物。免于为以前差异表达技术中存在的主要问题之一的假阳性使避免了证明通过差异表达所鉴定cDNA片断所需的后续劳动密集型工作。
实施例5 ：使用ACP的cDNA 3’-末端的快速扩增(3’-RACE)的方 法
本实施例比较基于ACP的3’-RACE和常规3’-RACE以证明是否本发明的ACP能够去除cDNA合成中使用常规寡聚dT引物所引起的如背景问题。
在常规3’-RACE中，mRNA分子的poly(A)尾被用作PCR扩增的起始位点，因此寡聚dT引物被用作常规3’-RACE的3’引物。反之，本发明的ACP使用mRNApoly(A)作为仅用于cDNA合成的起始位点但不用于随后PCR扩增。
鼠第一链cDNAs使用寡聚VdT15-ACP5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIII TTTTTTTTTTTTTTTV-3’(SEQ ID NO：57)(V是A，C或G)作为cDNA合成引物在与实施例1中合成cDNA相同的条件下被制备，然后直接用作随后PCR扩增的模板而无需去除cDNA合成引物的纯化步骤。
对于常规3’-RACE，第一链cDNAs使用以下cDNA合成引物被合成；
CDS III/3’5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30-VN-3’(SEQ ID NO：35)(V是A，C或G；且N是A，C，T或G)。
该cDNA合成引物，CDS III/3’，被用作随后PCR扩增的3’引物。
PCR扩增以50μl体积进行，包括50ng第一链cDNA，5μl 10xPCR缓冲液(Promega)，1μl基因特异性5’引物(10μM)，1μl预先选定的任意3’引物JYC2(10μM)或CDS III/3’(10μM)，3μl 25mMMgCl2，5μl 2mM dNTP，0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Promega)。PCR反应在以下条件下进行：94℃加热5min，接着94℃加热1min 65℃加热1min，和72℃加热1min进行30个循环；然后在72℃最后延伸5 min。扩增产物通过2％琼脂糖凝胶分析然后通过溴化乙锭染色检测。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)，荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)，和生物素标记的引物(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)的使用在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
图15显示β-肌动蛋白3’-RACE的结果。常规3’-RACE(泳道1)与基于ACP的3’-RACE(泳道2)相比较。常规3’-RACE方法生成非特异性产物和DNA弥散背景，相反基于ACP的3’-RACE仅生成一条预测大小为348-bp的带。这些结果说明基于ACP的3’-RACE能够去除背景问题如DNA弥散和非特异性产物。
实施例6： 使用ACP的cDNA的5’-末端(5’-RACE)和全长的快 速扩增的方法
本主题发明的ACP也被用于扩增cDNA片断的5’-末端。第一链cDNAs使用寡聚VdT15-ACP或随机dN6-ACP被合成：
寡聚VdT15-ACP
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTTTTTTTV-3’(SEQ ID NO：57)，其中V可以为A，C或G；
随机dN6-ACP
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIINNNNNN-3’(SEQ ID NO：58)，其中N可以A，C，G或T。
以mRNA-cDNA中间体形式存在的第一链cDNA序列完全合成后，第一链cDNA序列3’-末端通过锰离子存在时逆转录酶的末端转移酶反应被加上胞嘧啶残基尾。使用第一链cDNA 3’-末端延伸ACP(rG3-ACP，rG2-ACP或dG3-ACP)延伸第一链cDNAs的3’-末端，然后直接用作随后PCR扩增的模板而无需去除第一链cDNA 3’-末端延伸ACP和cDNA合成引物的步骤。
第一链cDNA3’-末端延伸ACP的序列为：
rG3-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GGG)-3’(SEQID NO：36)；
rG2-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GG)-dG-3’(SEQ ID NO：37)；
rG1-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(G)-d(GG)-3’(SEQ ID NO：59)；或
dG3-ACP 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGd(GGG)-3’(SEQ ID NO：38)
(其中r和d分别表示核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)。
A. 第一链全长cDNA合成
流程A： 使用本主题发明的ACP合成第一链cDNA
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：3μg总RNA和2μl 10μM寡聚VdT15-ACP或随机dN6-ACP。
2.加无菌水使最终体积为10μl。混合组分在微离心机上短暂离心试管。
3.在65℃水浴中孵育15分钟或使用热循环仪实现相同目的。
4.将试管于冰上至少冷却2分钟。微离心机终短暂离心收集试管中的组分。
5.向同一个反应试管中加入以下试剂：4μl 5x第一链缓冲液(Invitrogen)，1μl 0.1 M DTT， 2μl BSA(1mg/ml)，2μl dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各10 mM)，0.4μl 100mM MnCl2和0.5μl RNasin抑制剂(40units/μl，Promega)。
6.混合组分且在微离心机中短暂离心试管。
7.在水浴锅中或热循环仪中42℃孵育试管2min。
8.加入1μl SuperScript II逆转录酶(200units/μl；Invitrogen)。
9.在水浴锅中或热循环仪中42℃孵育试管1小时。
10.加入1μl 10μM第一链cDNA 3’-末端延伸ACP(rG3-ACP，rG2-ACP或dG3-ACP)。
11.加入0.3μl SuperScript II逆转录酶(200units/μl；Invitrogen)。
12.在水浴锅中或热循环仪中42℃孵育试管30min。
13.在水浴锅中或热循环仪中70℃孵育试管15min以终止第一链的合成。
14.将试管置于冰上或-20℃储存。
流程B：使用CapFinder方法进行第一链全长cDNA合成
以下引物用于CapFinder方法(Clontech)：SMART IVTM寡聚核苷酸
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACG
GCCr(GGG)-3’(SEQ ID NO：33)；和
5’PCR引物5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(SEQ IDNO：34)，和CDS III/3’PCR引物。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：3μg总RNA，1μl 10μM CDS III/3’PCR引物(Clontech)和1μl 10μM SMART IV寡聚核苷酸(Clontech)。
2.加无菌水使最终体积为5μl。混合组分并在微离心机上短暂离心试管。
3.72℃孵育试管2min。
4.将试管于冰上冷却2分钟。在微离心机中短暂离心收集离心试管中的组分。
5.向同一个反应试管中加入以下试剂：10μl总体积中含有2μl 5x第一链缓冲液(Clontech)，1μl 20mM DTT，1μl dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各10mM)和1μl PowerScript逆转录酶(Clontech)。
6.混合组分并在微离心机上短暂离心试管。
7. 42℃孵育试管1小时。
8.将试管置于冰上或-20℃储存。
B. PCR扩增
流程C： 使用ACP体系或常规5’-RACE方法的靶5’-末端cDNA 片断的扩增
本实施例比较了现有CapFinder 5’-RACE技术和基于ACP的5’-RACE方法，其中现有CapFinder 5’-RACE技术由于流程中引物的残留量使其不能免于高背景。为了证明是否本发明的ACP能够去除引物如CapFinder引物，SMART IV寡聚核苷酸(Clontech)和cDNA合成引物，用于cDNA合成的CDS III/3’PCR引物(Clontech)所导致的背景问题，用于鼠JunB和β-肌动蛋白cDNA的5’-末端的扩增的基于ACP的5’-RACE和CapFinder 5’-RACE在相同条件下被进行。在18.5日龄鼠的胎盘RNA中的鼠JunB mRNA为相对稀有mRNA，然而鼠β-肌动蛋白相对丰富。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：50μl总体积中含有1μl流程A或B制备的第一链cDNA，5μl 10xPCR缓冲液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μl 2mM dNTP，1μl 10μM基因特异性5’-RACE引物，1μl 10μM JYC2或5’PCR引物(Clontech)，0.5μlTaq聚合酶(5units/μl；Promega)和31.5μl无菌dH2O。
2.混合组分并在微离心机上短暂离心试管。
3.在以下条件下进行PCR反应：94℃加热5min，接着94℃加热40seconds，58℃加热40seconds，和72℃加热1min 30sec进行30个循环；然后在72℃下最后延伸5min。
4.经2％琼脂糖凝胶电泳随后用溴化乙锭染色来分析扩增产物。
所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
如图16所示，使用5’-RACE引物(Clontech)和基因特异性引物用于鼠JunB和β-肌动蛋白5’-RACE的CapFinder方法会产生如许多研究者所描述(Chenchik等1998；Matz等1999；Schramm等2000)的高背景如DNA弥散(泳道1和3)，然而本发明的基于ACP的5’-RACE仅生成分别对应各预计大小为155-bp或319-bp的鼠JunB(泳道2)或鼠β-肌动蛋白(泳道4)5-末端cDNA片断的单一带。这些实施例说明使用该ACP能够被用于基本去除如cDNA合成中使用引物的污染所导致的背景问题而无需去除cDNA合成所用的引物的纯化步骤。
图17也显示本主题发明的ACP能够不形成CapFinder方法(泳道1)生成的非特异性产物。通过CapFinder方法(泳道1)或ACP方法(泳道2、3和4)合成的第一链cDNA然后直接被用作随后鼠泌乳刺激素样蛋白PLP-Cα5’-RACE PCR扩增的模板。PLP-Cα-特异性5’-RACE引物是：PLP-Cα5’-GAGAGGATAGTTTCAGGGAC-3’(SEQID NO：40)。在3’-末端含有三个核糖鸟苷(rG3-ACP；泳道2)、三个脱氧核糖鸟苷(dG3-ACP；泳道3)或者含有两个核糖鸟苷和一个脱氧核糖鸟苷的组合(rG2-ACP；泳道3)的第一链cDNA 3’-末端延伸ACPs生成5，-末端cDNAs因而对应预测大小为506-bp的鼠PLP-Cα5’-末端cDNA片断的单一带由用于PLP-Cα5’-RACE的基于ACP的PCR而被生成。
流程D： 使用ACP的5’富集的cDNA片断的扩增
在流程A中使用随机dN6-ACP合成第一链cDNA。PCR扩增通过热启动PCR方法来进行，其中该方法是无需DNA聚合酶而启动整个反应且将试管在热循环仪上孵育在＞90℃时完成最初变性。然后保持试管的温度高于70℃的同时，合适量的DNA聚合酶可以通过移液管加入反应中。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：49.5μl总体积中含有1μl在流程A中使用随机dN6-ACP制备的第一链cDNA，5μl 10xPCR缓冲液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μl 2mM dNTP，1μl 10μM JYC2(3’引物)，1μl 10μM JYC4(5’引物)和31.5μl无菌dH2O。
2.混合组分并在微离心机上短暂离心试管。
3.将试管置于热循环仪中94℃预热。
4.保持试管的温度为94℃的同时，向反应中加入0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Promega)。
5.在以下条件下进行PCR反应：94℃加热5min，接着94℃加热40seconds，68℃加热40 seconds和72℃加热1min 30sec进行30个循环；然后在72℃下最后延伸5min。
6.通过2％琼脂糖凝胶电泳然后进行溴化乙锭染色来分析扩增产物。
所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
流程E： 使用ACP的富集全长cDNAs的扩增
在流程A中使用寡聚VdT15-ACP合成cDNA第一链。该PCR扩增通过如流程D的热启动PCR方法来进行。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：49.5μl总体积中含有1μl在流程A中使用寡聚VdT15-ACP制备的第一链cDNA，5μl 10xPCR缓冲液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μl 2mM dNTP，1μl 10μM JYC2(3’引物)，1μl 10μM JYC4(5’引物)和3 1.5μl无菌dH2O。
2.混合组分并在微离心机上短暂离心试管。
3.将试管置于热循环仪中94℃预热。
4.保持试管的温度为94℃的同时，向反应中加入0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Promega)。
5.在以下条件下进行PCR反应：94℃加热5min，接着94℃加热40seconds，68℃加热40seconds，和72℃加热1min 30sec进行30个循环；然后在72℃下最后延伸5min。
6.通过2％琼脂糖凝胶电泳然后进行溴化乙锭染色来分析扩增产物。
所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
为了估测在全长cDNAs的扩增中使用ACP的方法的效率，通过以上ACP方法的流程或现有CapFinder方法而被扩增的全长cDNAs被点到Hybond-N膜上(Amersham/美国生物化学)。鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA使用随机标记试剂盒(Roche Diagnostics Co，Indianapolis，美国)用[α-32P]dCTP标记并作为探针。
如图18所示，GAPDH cDNA探针检测对应预测大小为1.3-kb的全长GAPDH cDNA的单一带。正如所预测，通过以上ACP方法生成的PCR产物的信号(泳道2)比通过CapFinder方法所生成PCR产物的信号(泳道1)强很多倍。该实施例说明本发明的ACP方法比CapFinder方法更有效地扩增全长cDNAs。
实施例7： 使用基于ACP的任意引发的PCR的基因组指纹
本主题发明的ACP已经用于检测鼠的多态性。鼠系C57BL/6J，CBA，BALB/cJ，NOR，SPRETUS，PANCEVO和韩国野生鼠的基因组DNAs被用作起始材料。基因组DNA使用QIAamp组织试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)从鼠的肝脏被制备。本主题发明使用的任意ACP为：
ACP101 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCGGAGGATC-3’(SEQ ID NO：64)；
ACP109  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTGCAGGACG-3’(SEQ ID NO：65)；和
ACP116  5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGGAGCATCC-3’(SEQ ID NO：66)。
任意ACPs、ACP101和ACP109(图19A)或ACP101和ACP116(图19B)的引物对被用作鼠基因组指纹的引物。该PCR扩增由如实施例2所述的热启动PCR方法进行。使用ACP的基因组指纹在以下条件下通过两阶段PCR扩增而被构建：扩增反应在低严格条件下通过两个循环的包括退火、延伸和变性反应的第一阶段PCR而进行；最后体积为49.5μl的反应混合物中含有50ng基因组DNA，5μl 10xPCR反应缓冲液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μl dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2 mM)，ACPs对(每种ACP各10μM)各7μl，该反应混合物94℃预热，保持装有反应混合物的试管的温度为94℃的同时，向反应混合物中加入0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Promega)；PCR反应如下进行：94℃加热40 sec，52℃加热3min和72℃加热1min进行2个循环；接着在94℃下变性扩增产物；第一阶段PCR完全反应后，4μl对应ACPs 5’-末端部分的预先选择的任意引物JYC4(10μM)被加入反应混合物中然后第二阶段PCR扩增如下进行：94℃加热40sec，68℃加热40sec，and 72℃加热40sec进行40个循环；然后72℃最后延伸5min。
溶解扩增产物用溴化乙锭染色的2.0％琼脂糖凝胶分析然后拍照。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
图19显示使用任意ACPs对扩增各种鼠系的基因组DNA片断的试验结果。为了检查基因组指纹的重复性，各鼠系的指纹使用两种不同的ACP对被重复。该基于ACP的PCR扩增以各引物对都生成许多DNA片断且结果可重复。鼠系之间的多态性是明显的，该多态性说明这些鼠系可以通过基于ACP的任意引发的PCR所得基因组指纹多态性被区分。因此，本主题发明的ACP对于检测多态性和建立遗传图谱是有帮助的。
实施例8： 使用基于ACP的PCR的多重PCR
为了证实ACP在多重PCR中的应用，含有人白细胞粘合分子I(血管内皮白细胞黏附分子1)和人p53(TP53)基因的单核苷酸多态性的部分通过使用常规引物或ACP被扩增。使用ACPs进行多重PCR的过程和结果在此处被描述。DNA模板从人胎盘而获得。
该实施例中所用的血管内皮白细胞黏附分子1的外显子3(155bp)的常规引物是：血管内皮白细胞黏附分子1N15’-TTGCACACTGTTGATTCTAA-3’(SEQ ID NO：67)；和血管内皮白细胞黏附分子1C1  5’-TTATTGATGGTCTCTACACA-3’(SEQ ID NO：68)。
该实施例中所用的血管内皮白细胞黏附分子1外显子10(287bp)的常规引物是：血管内皮白细胞黏附分子1N2  5’-CCACTGAGTCCAACATTC-3’(SEQ ID NO：69)；和血管内皮白细胞黏附分子1C2  5’-CTGAAACACTTCCCACAC-3’(SEQ ID NO：70)。
该实施例中所用的TP53外显子4(349p)的常规引物是：
P53N1    5’-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’(SEQ ID NO：71)；和
P53C1    5’-ATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’(SEQ ID NO：72)。
该实施例中所用的血管内皮白细胞黏附分子1外显子7～8(750bp)的常规引物是：
P53N2    5’-TGCTTGCCACAGGTCTC-3’(SEQ ID NO：73)；和
P53C2    5’-GCAGTGCTAGGAAAGAGG-3’(SEQ ID NO：74)。
该实施例中使用的这些常规引物是用于在本领域已知的常规多重PCR方法中生成非特异性产物的已知引物。
本主题发明的ACPs被用于这四个常规引物对以证实是否该ACP能够克服如多重PCR使用的这些常规引物所导致的非特异性产物问题。
ACPs的3’-末端部分包括以上述序列如下的常规引物，因此该ACP的大小比常规引物大26bp或27bp：
血管内皮白细胞黏附分子1N1-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITTGCACACTGTTGATTCTAA-3’(SEQ ID NO：75)；
血管内皮白细胞黏附分子1C1-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIITTATTGATGGTCTCTACACA-3’(SEQ ID NO：76)；
血管内皮白细胞黏附分子1N2-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCACTGAGTCCAACATTC-3’(SEQ ID NO：77)；
血管内皮白细胞黏附分子1C2-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICTGAAACACTTCCCACAC-3’(SEQ ID NO：78)；
P53N1-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’(SEQ ID NO：79)；
P53C1-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’(SEQ ID NO：80)；
P5 3N2-ACP5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITGCTTGCCACAGGTCTC-3’(SEQ ID NO：81)；和
P53C2-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIGCAGTGCTAGGAAAGAGG-3’(SEQ ID NO：82)。
该ACPs的5’-末端序列包括并用作仅用于第二阶段PCR扩增的预先选定任意引物序列：
JYC3 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3’(SEQ ID NO：11)和
JYC4 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3’(SEQ ID NO：12)。
多重PCR扩增通过为本发明的独特特征的一个停止的或无停止的两阶段PCR扩增来进行。该PCR扩增通过实施2所述的热启动PCR方法来进行。
流程A：一个中断的两阶段PCR扩增
(A) 第一阶段PCR扩增
第一阶段PCR扩增通过两个循环的包括退火、延伸和变性反应的PCR而进行；最后体积为49.5μl的反应混合物中含有50ng人基因组DNA，8μl10x PCR反应缓冲液(Promega)，7μl 25mM MgCl2，5μldNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2mM)，各5’ACP(10μM)和3’ACP对各0.5μl，该反应混合物94℃预热，保持装有反应混合物的试管的温度为94℃的同时，向反应混合物中加入0.5μlTaq聚合酶(5units/μl；Promega)；PCR反应进行如下：94℃加热40sec，60℃加热40sec和72℃加热40senc进行两个循环；然后在94℃下变性扩增产物；
(B) 第二阶段PCR扩增
使用多个ACPs对通过第一阶段PCR扩增所得产物然后在更高的退火温度下经随后的第二阶段PCR扩增而被扩增。第一阶段PCR扩增完成后，10μM预定任意引物JYC3和JYC4各2μl在如94℃的变性温度下被加到第一阶段PCR扩增所得反应混合物中。第二阶段PCR扩增反应进行如下：94℃加热40sec，68℃加热40sec，和72℃加热1min进行40个循环；然后72℃最后延伸5min。
扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶分析然后通过溴化乙锭染色分析。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Kom等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
图20和21显示三对或四对引物被用于在一个反应中扩增多个基因组DNA片断的试验结果。以三对(图20A)或四对(图21A)引物的常规引物对生成非特异性产物和特异性目的产物。反之，三对(图20B)或四对(图21B)ACPs仅生成多个靶产物。因此，本主题发明的ACP能够被用于多重PCR的扩增。
流程B： 无中断的两阶段PCR扩增
可替换地，各ACP对的完全序列代替预先选择的任意引物如JYC3和JYC4能够被用作在高严谨条件下的第二阶段PCR扩增的引物。在这种情况下，不需在第一阶段PCR反应时或其后向反应混合物中加入预先选择的任意引物。
除了因为没有加入预先选择的任意引物的步骤所以第二阶段PCR扩增应该立即跟随第一阶段PCR扩增进行而无任何担搁和各ACP对浓度，即5’ACP(10μM)和3’ACP对各1μl在第一阶段PCR扩增时被加入外无中断的两阶段PCR扩增的过程基本与流程A相同。
扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳分析然后通过溴化乙锭染色检测。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1 997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
与一个中断的两阶段PCR扩增的结果一致(图21B)，无中断的两阶段PCR扩增也仅生成多个特异性目标产物(图21C)。这些实施例说明该ACP使产物免于本领域已知的多重PCR方法中使用的常规引物所导致的背景问题和非特异性。
实施例9： 使用ACP鉴定多基因家族的保守同源片断
本主题发明的ACP被用于检测和克隆多基因家族的保守同源片断。在本实施例中，简并引物被设计以检测同源框序列。同源框基因的特征为编码60-aa的DNA结合发育同源结构域的已知同源框的180-bp保守核苷酸序列。为了分离参与鼠胚胎发育的同源框基因，胚胎发育不同阶段，4.5-、11.5-和18.5-日龄的鼠胚胎的总RNA被用作起始材料。第一链cDNA在与实施例3中cDNA合成相同的条件下被制备，其中JYC5-T15-ACP被用作第一链cDNA合成的引物。
以下ACPs在其3’-末端部分包括同源框序列的简并序列并且被用作第一阶段PCR扩增的简并同源框特异性引物：
JYC2-HD1
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTGTGGTT-3’(SEQ ID NO：83)；
JYC2-HD2
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTCTGGTT-3’(SEQ ID NO：84)；及
JYC2-HD3
5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTTTGGTT-3’(SEQ ID NO：85)。
PCR扩增通过如实施例2所述的热启动PCR方法进行且通过一个停止的或无停止的两阶段PCR扩增进行。以下为一个停止的两阶段PCR扩增过程的例子。
1.在0.2ml无菌微离心试管中混合以下试剂：49.5μl的总体积中含有1μl第一链cDNA(50ng/μl)，5μl 10xPCR缓冲液(Roche)，5μl 2mM dNTP，1μl的10μM JYC2-HD1，JYC2-HD2或JYC2-HD3(5’引物)之一和36.5μl无菌dH2O。
2.混合组分并在微离心机上短暂离心试管。
3.将试管置于热循环仪中在94℃下预热。
4.保持试管的温度为94℃的同时，向反应中加入0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Roche)。
5.在以下条件下进行PCR反应：94℃加热1min，52℃加热3min和72℃加热1min进行一个循环，接着94℃加热40seconds，65℃加热40seconds进行40个循环，和72℃加热40sec；然后在72℃下最后延伸5min。
扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳被分析然后经溴化乙锭染色被检测。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
特定阶段的许多差异表达的带被获得，被亚克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)并且被测序。序列分析揭示某些克隆含有同源框序列。Northern杂交或RT-PCR分析说明该克隆与电泳观察到的表达模式相同。这些结果说明使用本发明的ACP用于分离多基因家族的保守同源片断的方法仅生成真实PCR产物。免于了以前的用于分离多基因家族中保守同源片断的基于PCR的技术中存在的一个主要障碍即假阳性问题，这样避免了为了证实扩增的cDNA片断所需的后续劳动密集型工作。
实施例10： 使用基于ACP的PCR的单核苷酸多态性基因型定型
为了证明ACP在单核苷酸多态性基因型定型中的应用，含有人p53(TP53)基因的单核苷酸多态(SNP)的部分用常规引物或ACP被扩增。使用ACPs进行SNP基因型定型的过程和结果在此处被描述。DNA模板从在TP53基因的外显子4中具有SNP的人血液样品中提取。该多态性表达为通过第72位氨基酸处由C代替G而发生Arg→Pro的替代。在TP53基因的11991和12339核苷酸之间的349nt序列以下列引物对以各类型的模板被扩增：
P53N  5’-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’(SEQ ID NO：86)和
P53C-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’(SEQ ID NO：87)。
在两个引物的末端之间含有SNP的扩增产物被用作使用以下等位基因特异性ACPs检测SNP的模板：
P53N1A-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCC GCGTGG-3’(SEQ IDNO：88)，
P53N1B-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCC CCGTGG-3’(SEQ IDNO：89)，
P5 3N2A-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCC GCGTG-3’(S EQ IDNO：90)，
P53N2B-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCC CCGTG-3’(SEQ IDNO：91)，
P53N3A-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCC GCGT-3’(SEQ IDNO：92)，
P53N3B-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCC CCGT-3’(SEQ IDNO：93)，
P53N4A-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC GCG-3’(SEQ IDNO：94)，
P53N4B-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC CCG-3’(SEQ IDNO：95)，
P53N5A-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC G-3’(SEQ  IDNO：96)，和
P53N5B-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC C-3’(SEQ ID NO：97)。
各等位基因特异性ACP的3’-末端部分的多态性碱基被划线且该多态性碱基的位置被认为是置疑位置。置疑位置被置于从等位基因特异性ACPs的3’-末端起的几个不同位置以判断用于检测SNP的退火特异性中最关键的位置。
等位基因特异性ACPs被用作5’引物。P53C-ACP和P53N1A-ACP、P53N2A-ACP、P53N3A-ACP、P53N4A-ACP和P53N5A-ACP之一被用于野生型A基因型定型。P53-ACP和P53N1B-ACP、P53N2B-ACP、P53N3B-ACP、P53N4B-ACP和P53N5B-ACP之一被用于变异型B基因型定型。ACPs的5’-末端部分序列被用作第二阶段PCR扩增的预先选定的任意引物序列：
JYC3 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3’(SEQ ID NO：11)和
JYC4 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3’(SEQ ID NO：12)。
(A) 第一阶段PCR扩增
第一阶段PCR扩增由一个包括退火、延伸和变性反应的PCR循环来进行；最后体积为49.5μl的反应混合物中含有1μl在TP53基因的外显子4中含有SNP的扩增的靶基因组片断，5μl 10xPCR反应缓冲液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μl dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2mM)，和1μl一种等位基因特异性ACPs(10μM)，该反应混合物94℃被预热，保持装有反应混合物的试管的温度为94℃的同时，将0.5μl Taq聚合酶(5units/μl；Promega)加入反应混合物中；对于在其3’-末端部分具有10个核苷酸的等位基因特异性ACPs，进行如下PCR反应：94℃加热40sec，55℃加热40sec和72℃加热40sec进行一个循环；接着94℃下变性扩增产物；对于在其3’-末端部分具有8个核苷酸的等位基因特异性ACPs，进行如下PCR反应：94℃加热40sec，50℃加热40sec和72℃加热40sec进行一个循环；然后在94℃下变性扩增产物。所得产物为靶基因组片断的互补第一链DNA。
(B) 第二阶段PCR扩增
第一阶段PCR扩增所得产物在比第一退火温度更高的退火温度下再通过以下第二阶段PCR扩增被扩增。第一阶段PCR扩增完成后，1μl 10μM预先选定的任意引物，JYC3，在如94℃的变性温度下被加入第一阶段PCR扩增所得反应混合物中。第二阶段PCR反应进行如下：94℃加热40sec，68℃加热40sec和72℃加热40sec进行30个循环；然后72℃最后延伸5min。
扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳被分析然后经溴化乙锭染色被检测。所得PCR产物也可以通过放射自显影或通过非放射性检测方法检测如银染(Gottschlich等1997；Kociok等1998)、荧光标记寡核苷酸的使用(Bauer等1993；Ito等1994；Luehrsen等1997；Smith等1997)、和生物素标记的引物的使用(Korn等1992；Tagle等1993；Rosok等1996)在变性聚丙稀酰胺凝胶上被检测。
图22显示使用ACP的等位基因特异性扩增的结果。野生型A-特异性ACPs对(P53N2A-ACP和P53C-ACP)仅从具有纯合野生型A(泳道1)或杂合基因型(泳道3)的样品生成特异性目标产物，但不从具有纯合变异型B基因型(泳道5)的样品生成特异性目标产物。变异型B-特异性ACPs对(P53N2B-ACP和P53C-ACP)仅从具有纯合变异型B(泳道6)或杂合基因型(泳道4)的样品生成特异性目标产物，而不从具有纯合野生型A基因型(泳道2)的样品生成特异性目标产物。这些结果说明由于这种方法不需要使用荧光标记的DNA探针也不需要PCR后处理所以本主题发明的ACP可以被用作一种容易而经济的检测SNPs基因型的方法。各在其3’-末端部分具有置疑位置的等位基因特异性ACPs表现出退火特异性的提高。然而，当等位基因特异性ACP在从3’-末端起第5位(如P53N2A-ACP和P53N2B-ACP)处具有置疑位置时，退火特异性被最关键地实现。
为了证明是否从等位基因特异性ACP的实际3’-末端起第5位是最准确的置疑位置，使用与图22所用的相同过程进行额外的6个试验。DNA模板从具有SNP的人血液样品中获得。6个具有SNPs的短基因组片断使用如下各不同引物对被扩增：
703N
5’-ATTCTGATGGTGTGGATTGTG-3’(SEQ ID NO：98)和
SM703C
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIACCCTGGAGTAGACGAAGA-3’(SEQ ID NO：99)用于β-2肾上腺素受体(ADRB2)，
028N
5’-CCTTCTGTGCTTGATGCTTTT-3’(SEQ ID NO：102)和
SM028C
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICAGGAAGGATGAGCATTTAG-3’(SEQ ID NO：103)用于趋化因子(c-c基因座)受体5(CCR5)，
695N：5’-AGAAAAACCAGAGGCAGCTT-3’(SEQ ID NO：106)和SM695C 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIII
AGCACAAACCAAAGACACAGT-3’(SEQ ID NO：107)用于白介素13受体，
679N 5’-CTAGCTGCAAGTGACATCTCT-3’(SEQ ID NO：110)和
SM679C
5’-TCACAGAGTATCCAAGCGIIIIITCAGTAAGAAGCCAGGAGAG-3’(SEQ ID NO：111)用于白细胞粘合分子-1(LAM-1)，
832N 5’-TTTTGGGTGGAGGCTAACAT-3’(SEQ ID NO：114)和SM832C：
5’-TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIAACGATGCAGACACCACCA-3’(SEQ ID NO：115)用于速激肽受体3(TACR3)，和
880N 5’-CTTCCACCAATACTCTTTTCC-3’(SEQ ID NO：118)和SM880C：
5’-TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIII
GCATACACACAAGAGGCAGA-3’(SEQ ID NO：119)用于白介素1，β(IL1B)。
在两个引物的末端之间含有SNP的扩增产物被用作检测SNPs的模板，其中等位基因特异性ACPs应用如下：
SM703-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTAC AGGGC-3’(SEQ ID NO：100)和
SM703-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTAC CGGGC-3’(SEQ ID NO：101)用于β-2肾上腺素受体(ADRB2)，
SM028-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAA ACCAA-3’(SEQ ID NO：104)和
SM028-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAA CCCAA-3’(SEQ ID NO：105)用于趋化因子(c-c基因座)受体5(CCR5)，
SM695-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCATT TTAGG-3’(SEQ ID NO：108)和
SM695-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCATT GTAGG-3’(SEQ ID NO：109)用于白介素13受体，
SM679-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGA ACTTT-3’(SEQ ID NO：112)和
SM679-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGA CCTTT-3’(SEQ ID NO：113)用于白细胞粘合分子-1(LAM-1)，
SM832-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTG GTAAA-3’(SEQ ID NO：116)和
SM832-B 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTG ATAAA-3’(SEQ ID NO：117)用于速激肽受体3(TACR3)，和
SM880-A 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGC CATAA-3’(SEQ ID NO：120)和SM880-B
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGC TATAA-3’(SEQ IDNO：121)用于白介素1，β(IL1B)。
图23显示各出现在不同基因如β-2肾上腺素受体(ADRB2)(A)、趋化因子(c-c基因座)受体5(CCR5)(B)、白介素13受体(C)、白细胞粘合分子-1(LAM-1)(D)、速激肽受体3(TACR3)(E)和白介素1，β(IL1B)(F)中的6个额外SNPs的等位基因特异性扩增的结果。与图22个结果一致，当等位基因特异性ACP在从3’-末端起第5位具有置疑位置时，退火特异性被关键性地实现。野生型A-特异性ACPs对仅从具有纯合野生型A(泳道1)或杂合基因型(泳道3)的样品生成特异性目标产物，但不从具有纯合变异型B基因型(泳道5)的样品生成特异性目标产物。变异型B-特异性ACPs对仅从具有纯合变异型B(泳道6)或杂合基因型(泳道4)的样品生成特异性目标产物，而不从具有纯合野生型A基因型(泳道2)生成样品的特异性目标产物。
描述了本发明的优选实施例后可以理解本发明实质范围内的改变和修饰对于本领域的熟练技术人员是显而易见的，且本发明的范围由附加权利要求和它们的等价物决定。
                    表1
序列
设计编码的标号      序列信息
1    ACP1    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICAGGAGTGG-3’
2    ACP2    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGCGACGATS-3’
3    ACP3    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACS-3’
4    ACP4    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGATGCCCGW-3’
5    ACP5    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCS-3’
6    ACP6    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCTCCCGGTS-3’
7     ACP7     5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITTGTGGCGGS-3’
8     ACP8     5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCS-3’
9     ACP9     5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCTGCGGGTW-3’
10    JYC2     5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGA-3’
11    JYC3     5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3’
12    JYC4     5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3’
13    ACP10    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC-3’
14    ACP11    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACG-3’
15    ACP12    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCC-3’
16    ACP13    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCG-3’
17    ACP14    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCC-3’
18    ACP15    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCG-3’
19    CRP2I0   5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATGCCATCGACC-3’
20    ACP16    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIGCCATCGACC-3’
21    ACP17    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIGCCATCGACC-3’
22    ACP18    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIGCCATCGACC-3’
23    ACP19    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIIIGCCATCGACC-3’
24    dT-JYC3  5’-CACAGAAGTATGCCAAGCGACTCGAGTTTTTTTTTT
                       TTTTT-3’
25    dT-JYC2      5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTTTTTTT-3’
26    JYC2-T13C    5’-CTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTTTTTC-3’
27    JYC2-T13G    5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTTTTTTG-3’
28    JYC2-T13A    5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTTTTTA-3’
29    dT10-JYC2    5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTT-3’
30    dT10-ACP1    5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTT-3’
31    DEG 2           GCCATCGACCCGTTTCTCTAGCCCCATCTTCATGTGT
                       TTTAATGAGATGATATTAATTCATTACATTCATGGAT
                       AATATGTCCCTGAGTACATTCTAATCTAGATTTAACT
                       TCAAAAAAAAAAAAAAAAA
32    DEG 5           AGGCGATGCGGGCTGTACTCTGGGTGGCTGCCACAGT
                      CTCATGAGAAACCAAGGGCAAAGGACCAAGGAAAAG
                      GGTCTCAGGCCCCTAAAGCAGTGGCTTTCAACCATCCTAA
                      TGTTGTGACCTTTTAATACAGTTCCTCATGTTGTG
                      TGACCCCCCAACCATAAAATGATTTTTGTTTCTACTTC
33    SMARTIV       5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACG
          GCCr(GGG)-3’
34    5’PCR Primer 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
35    CDS III/3’     5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30
                           VN-3’
36    rG3-ACP        5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GGG)-3’
37    rG2-ACP        5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GG)d(G)-3’
38    dG3-ACP        5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGd(GGG)-3’
39    Oligo dT18-ACP 5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTT
                             TTTTTTTTT-3’
40    PLP-Ca         5’-GAGAGGATAGTTTCAGGGAC-3’
41    JunB3          5’-CTCCGTGGTACGCCTGCTTTCTC-3’
42    β-肌动蛋白1   5’-TCGTCACCCACATAGGAGTC-3’
43    β-肌动蛋白2   5’-CTAAGAGGAGGATGGTCGC-3’
44    EsxN7          5’-GCCGGTTGCAGAGCACC-3’
45    EsxC6          5’-GAACCATGTTTCTGAATGCC-3’
46    EsxN7-ACP      5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCGGT
                         TGCAGAGCACC-3’
47    EsxC6-ACP      5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGAACCAT
                             GTTTCTGAATGCC-3’
48    EsxN1          5’-GAATCTGAAACAACTTTCTA-3’
49    EsxC2           5’-GATGCATGGGACGAGGCACC-3’
50    EsxN1-ACP       5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGAATCT
                              GAAACAACTTTCTA-3’
51    EsxN3           5’-CGCCGCACCCCTGCCCGCA-3’
52    EsxC5           5’-GATGCATGGGACGAGGCA-3’
53    EsxN3-ACP       5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGCCGC
                           ACCCCTGCCCGCA-3’
54    Oligo-dT15     5’-TTTTTTTTTTTTTTT-3’
55    EsxC2-ACP       5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCA
                              TGGGACGAGGCACC-3’
56    EsxC5-ACP       5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCA
                           TGGGACGAGGCA-3’
57    OligoVdT15-ACP  5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTT
                         TTTTTTTTTV-3’
58    dN6-ACP        5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIINNNNNN-3’
59    rG1-ACP         5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(G)d(GG)-3’
60    JYC5            5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3’
61    JYC5-T15-ACP   5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIITTTTTT
                       TTTTTTTTT-3’
62 JYC5-T15V-ACP   5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIITTTTTTT
                       TTTTTTTTV-3’
63 JYC5-T15VN-ACP  5’-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIITTTTTT
                         TTTTTTTTTVN-3’
64  ACP101    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCGGAGGATC-3’
65  ACP109    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTGCAGGACG-3’
66  ACP116    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGGAGCATCC-3’
67  血管内皮白细胞黏附分子1N1    5’-TTGCACACTGTTGATTCTAA-3’
68  血管内皮白细胞黏附分子1C1    5’-TTATTGATGGTCTCTACACA-3’
69  血管内皮白细胞黏附分子1N2    5’-CCACTGAGTCCAACATTC-3’
70  血管内皮白细胞黏附分子1C2    5’-CTGAAACACTTCCCACAC-3’
71  P53N1     5’-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’
72  P53C1     5’-ATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’
73  P53N2     5’-TGCTTGCCACAGGTCTC-3’
74  P53C2     5’-GCAGTGCTAGGAAAGAGG-3’
75  血管内皮白细胞黏附分子1N1-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITTGCACACTGT
                       TGATTCTAA-3’
76血管内皮白细胞黏附分子  1C1-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIITTATTGATGGT
                       CTCTACACA-3’
77血管内皮白细胞黏附分子  1N2-ACP
5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCACTGAGTCC
                       AACATTC-3’
78血管内皮白细胞黏附分子  1C2-ACP
5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICTGAAACACTT
                       CCCACAC-3’
79  P53N1-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCTCTGACTGC
                       TCTTTTCAC-3’
80  P53C1-ACP    5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTC
                       ATGGAAGCC-3’
81  P53N2-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITGCTTGCCACA
                       GGTCTC-3’
82  P53C2-ACP    5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIGCAGTGCTAGG
                       AAAGAGG-3’
83  JYC2-HD1     5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTGTG
                       GTT-3’
84  JYC2-HD2      5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTCTG
                           GTT-3’
85  JYC2-HD3      5’-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTTTG
                           GTT-3’
86  P53N          5’-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’
87  P53C-ACP      5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA IIIIIATTGAAGTCTC
                           ATGGAAGCC-3’
88  P53N1A-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCC GCGTGG-3’
89  P53N1B-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCC CCGTGG-3’
90  P53N2A-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCC GCGTG-3’
91  P53N2B-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCC CCGTG 3’
92  P53N3A-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCC GCGT-3’
93  P53N3B-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCC CCGT-3’
94  P53N4A-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC GCG-3’
95  P53N4B-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC CCG-3’
96  P53N5A-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC G-3’
97  P53N5B-ACP    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCC C-3’
98  703N          5’-ATTCTGATGGTGTGGATTGTG-3’
99  SM703C     5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIACCCTGGAGTAG
                       ACGAAGA-3’
100 SM703-A    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTAC AGGGC-3’101
    SM703-B    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTAC CGGGC-3’102
    028N       5’-CCTTCTGTGCTTGATGCTTTT-3’
103 SM028C     5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICAGGAAGGATGA
                           GCATTTAG-3’
104 SM028-A    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAA ACCAA-3’
105 SM028-B    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAA CCCAA-3’
106 695N       5’-AGAAAAACCAGAGGCAGCTT-3’
107 SM695C     5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIAGCACAAACCAA
                            AGACACAGT-3’
108 SM695-A    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCATT TTAGG-3’
109 SM695-B    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCATT GTAGG-3’
110 679N       5’-CTAGCTGCAAGTGACATCTCT-3’
111 SM679C     5’-TCACAGAGTATCCAAGCGIIIIITCAGTAAGAAG
                            CCAGGAGAG-3’
112 SM679-A    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGA ACTTT-3’
113 SM679-B    5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGA CCTTT-3’
114 832N      5’-TTTTGGGTGGAGGCTAACAT-3’
115 SM832C    5’-TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIAACGATGCAG
                             ACACCACCA-3’
116 SM832-A   5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTG GTAAA-3’
117 SM832-B   5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTG ATAAA-3’
118 880N      5’-CTTCCACCAATACTCTTTTCC-3’
119 SM880C    5’-TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIGCATACACACA
                             AGAGGCAGA-3’
120 SM880-A   5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGC CATAA-3’
121 SM880-B   5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGC TATAA-3’
S＝G或C
W＝A或T
V＝A，G，或C
N＝A，G，C，或T
I为脱氧次黄嘌呤
r为核糖
d为脱氧核糖
                         表2
        通过本发明的ACP克隆的差异表达的cDNA片断
命名               特性                       同源性
DEG
                   原肌球蛋白2(β)            鼠92％
1
DEG
                   新                         新
2
DEG
                   假定蛋白(Tes基因)          鼠99％
3
DEG
                   蛋白酶-6                   鼠92％
4
DEG
                   新                         新
5
DEG
                   细胞色素氧化酶，亚基Vb     鼠99％
6
DEG
                   羟酰基-辅酶A脱氢酶(Hadh)   鼠98％
7
DEG                肌钙蛋白T2，兴奋剂
                                              鼠94％
8                  (Tnnt2)
DEG
            RNA结合基因座蛋白，X染色体        鼠96％
9
DEG
            过氧化物酶基因6(Prdx6)            鼠89％
10
DEG
            11日或13日胚胎cDNA                鼠98％
11
参考文献
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                     序列表
<110>视基因公司(SEEGENE.INC)
<120>退火控制引物及该退火控制引物的使用
<130>IP04-0497-XC12
<150>PCT/KR01/02133
<151>2001-12-08
<150>PCT/KR02/00816
<151>2002-05-01
<160>121
<210>1
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP1
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICAG GAGTGG    36
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，S＝G或C
<400>ACP 2
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCC ATCGACS    37
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，S＝G或C
<400>ACP 3
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCC ATCGACS    37
<210>4
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，W＝A或T
<400>ACP 4
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIAGA TGCCCGW     37
<210>5
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，S＝G或C
<400>ACP 5
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIAGG CGATGCS      37
<210>6
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，S＝G或C
<400>ACP 6
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITCT CCCGGTS     37
<210>7
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，S＝G或C
<400>ACP 7
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITTG TGGCGGS     37
<210>8
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，S＝G或C
<400>ACP 8
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICTC CGATGCS    37
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，W＝A或T
<400>ACP 9
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCT GCGGGTW    37
<210>SEQ ID NO：10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC2
<400>JYC2
GCTTGACTAC GATACTGTGC GA    22
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC3
<400>JYC3
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG A     21
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC4
<400>JYC4
GTCTACCAGG CATTCGCTTC AT                    22
<210>13
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP10
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCC ATCGACC    37
<210>14
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP14
GTCIACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCC ATCGACG     37
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP12
 GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIAGG CGATGCC    37
<210>16
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP13
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIAGG CGATGCG    37
<210>17
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP14
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICTC CGATGCC    37
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP15
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICTC CGATGCG    37
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CRP2I0
<400>CRP2I0
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATGCCATCGA CC         32
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP16
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIGCCATC GACC       34
<210>21
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP17
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIGCCA TCGACC    36
<210>22
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP18
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIIGC CATCGACC  38
<210>23
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP19
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIIII GCCATCGACC       40
<210>24
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dT-JYC3
<400>dT-JYC3
CACAGAAGTA TGCCAAGCGA CTCGAGTTTT TTTTTTTTTT T     41
<210>25
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dT-JYC2
<400>dT-JYC2
GCTTGACTAC GATACTGTGC GATTTTTTTT TTTTTTT    37
<210>26
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC2-T13C
<400>JYC2-T13C
CTTGACTACG ATACTGTGCG ATTTTTTTTT TTTTC      35
<210>27
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC2-T13G
<400>JYC2-T13G
GCTTGACTAC GATACTGTGC GATTTTTTTT TTTTTG    36
<210>28
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC2-T13A
<400>JYC2-T13A
GCTTGACTAC GATACTGTGC GATTTTTTTT TTTTTA    36
<210>29
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dT10-JYC2
<400>dT10-JYC2
GCTTGACTAC GATACTGTGC GATTTTTTTT TT         32
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>dT10-ACP1
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIITTT TTTTTTT    37
<210>31
<211>130
<212>DNA
<213>人工序列
<400>DEG2
GCCATCGACC CGTTTCTCTA GCCCCATCTT CATGTGTTTT AATGAGATGA TATTAATTCA     60
TTACATTCAT GGATAATATG TCCCTGAGTA CATTCTAATC TAGATTTAAC TTCAAAAAAA    120
AAAAAAAAAA                                                           130
<210>32
<211>208
<212>DNA
<213>人工序列
<400>DEG5
AGGCGATGCG GGCTGTACTC TGGGTGGCTG CCACAGTCTC ATGAGAAACC AAGGGCAAAG     60
GACCAAGGAA AAGGGTCTCA GGCCCCTAAA GCAGTGGCTT TCAACCATCC TAATGTTGTG    120
ACCTTTTAAT ACAGTTCCTC ATGTTGTGTG ACCCCCCAAC CATAAAATGA TTTTTGTTTC    180
TACTTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA                                       208
<210>33
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝核糖
<400>SMART IV
AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTGGCCATT ACGGCCr(GGG)    39
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5′PCR引物
<400>5′PCR引物：
AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGT                        23
<210>35
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>d＝脱氧核糖，V＝A，G或C，N＝A，G，C或T
<400>CDS III/3′
ATTCTAGAGG CCGAGGCGGC CGACATG-(dT)30VN     59
<210>36
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>d＝脱氧核糖，V＝A，G或C，N＝A，G，C或T
<400>rG3-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGGr(G GG)     32
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，r＝核糖，d＝脱氧核糖
<400>rG2-ACP：
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGGr(G G)d(G)  32
<210>38
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，r＝核糖，d＝脱氧核糖
<400>dG3-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGGd(G GG)               32
<210>39
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>寡聚dT18-ACP
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIITTT TTTTTTTTTT TTTTT    45
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PLP-Cα
<400>PLP-Cα
GAGAGGATAG TTTCAGGGAC                                    20
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JuB3
<400>JunB3
CTCCGTGGTA CGCCTGCTTT CTC                                 23
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>β-肌动蛋白1
<400>β-肌动蛋白1
TCGTCACCCA CATAGGAGTC                                 20
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>β-肌动蛋白2
<400>β-肌动蛋白2
CTAAGAGGAG GATGGTCGC                                 19
<210>44
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EsxN7
<400>EsxN7
GCCGGTTGCA GAGCACC                                    17
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EsxC6
<400>EsxC6
GAACCATGTT TCTGAATGCC                                 20
<210>46
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>EsxN7-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCC GGTTGCAGAG CACC     44
<210>47
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>EsxC6-ACP
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIIGAA CCATGTTTCT GAATGCC  47
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EsxN1
<400>EsxN1
GAATCTGAAA CAACTTTCTA                                 20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EsxC2
<400>EsxC2
 GATGCATGGG ACGAGGCACC                                20
<210>50
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>EsxN1-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGAA TCTGAAACAA CTTTCTA    47
<210>51
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EsxN3
<400>EsxN3
CGCCGCACCC CTGCCCGCA                                   19
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EsxC5
<400>EsxC5
GATGCATGGG ACGAGGCA                                      18
<210>53
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>EsxN3-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICGC CGCACCCCTG CCCGCA       46
<210>54
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡聚-dT15
<400>寡聚-dT15
TTTTTTTTTT TTTTT                                      15
<210>55
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>EsxC2-ACP
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIIGAT GCATGGGACG AGGCACC   47
<210>56
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>EsxC5-ACP
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIIGAT GCATGGGACG AGGCA   45
<210>57
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，V＝A，G或C
<400>OligVdT15-ACP
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIITTT TTTTTTTTTT TTV     43
<210>58
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，N＝A，G，T或C
<400>dN6-ACP
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIINNN NNN                33
<210>59
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，r＝核糖，d＝脱氧核糖
<400>rG1-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGGr(G) d(GG)                                 32
<210>60
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>JYC5
<400>JYC5
CTGTGAATGC TGCGACTACG AT                                                  22
<210>61
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>JYC5-T15-ACP
CTGTGAATGC TGCGACTACG ATIIIIITTT TTTTTTTTTT TT                                 42
<210>62
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，V＝A，G或C
<400>JYC5-T15V-ACP
CTGTGAATGC TGCGACTACG ATIIIIITTT TTTTTTTTTT TTV                                43
<210>63
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，V＝A，G或C，N＝A，G，T或C
<400>JYC-T15VN-ACP
CTGTGAATGC TGCGACTACG ATIIIIITTT TTTTTTTTTT TTVN                                 44
<210>64
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP101
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCG GAGGATC                                         37
<210>65
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP109
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICTG CAGGACG                                   37
<210>66
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>ACP116
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICGG AGCATCC                                   37
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>血管内皮白细胞黏附分子1N1
<400>血管内皮白细胞黏附分子1N1
TTGCACACTG TTGATTCTAA                                          20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>血管内皮白细胞黏附分子1C1
<400>血管内皮白细胞黏附分子1C1
TTATTGATGG TCTCTACACA                                          20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>血管内皮白细胞黏附分子1N2
<400>血管内皮白细胞黏附分子1N2
CCACTGAGTC CAACATTC                                 20
<210>70
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>血管内皮白细胞黏附分子1C2
<400>血管内皮白细胞黏附分子1C2
CTGAAACACT TCCCACAC                                 18
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P53N1
<400>P53N1
CCTCTGACTG CTCTTTTCAC    20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P53C1
<400>P53C1
ATTGAAGTCT CATGGAAGCC    20
<210>73
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P53N2
<400>P53N2
TGCTTGCCAC AGGTCTC    17
<210>74
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P53C2
<400>P53C2
GCAGTGCTAG GAAAGAGG    18
<210>75
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>血管内皮白细胞黏附分子1N1-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITTG CACACTGTTG ATTCTAA   47
<210>76
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>血管内皮白细胞黏附分子1C1-ACP
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIITTAT TGATGGTCTC TACACA    46
<210>77
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>血管内皮白细胞黏附分子1N2-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCA CTGAGTCCAA CATTC     45
<210>78
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>血管内皮白细胞黏附分子1C2-ACP
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIICTGA AACACTTCCC ACAC      44
<210>79
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N1-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCT CTGACTGCTC TTTTCAC   47
<210>80
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53C1-ACP
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIIATTG AAGTCTCATG GAAGCC    46
<210>81
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N2-ACP：
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITGC TTGCCACAGG TCTC      44
<210>82
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53C2-ACP
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIIGCAG TGCIAGGAAA GAGG  44
<210>83
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，N＝A，G，T或C，R＝A或G
<400>JYC2-HD1
 GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIIGTN CRRGTGTGGT T    41
<210>84
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，N＝A，G，T或C，R＝A或G
<400>JYC2-HD2
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIIGTN CRRGTCTGGT T    41
<210>85
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)，N＝A，G，T或C，R＝A或G
<400>JYC2-HD3
GCTTGACTAC GATACTGTGC GAIIIIIGTN CRRGTTTGGT T    41
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P53N
<400>P53N
CCTCTGACTG CTCTTTTCAC                                20
<210>87
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53C-ACP
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIATTG AAGTCTCATG GAAGCC    46
<210>88
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N1A-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCC C GCGTGG    37
<210>89
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N1B-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCC C CCGTGG    37
<210>90
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N2A-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITCC CC GCGTG    37
<210>91
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N2B-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITCC CC CCGTG    37
<210>92
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N3A-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICTC CCC GCGT      37
<210>93
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N3B-ACP
 GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICTC CCC CCGT     37
<210>94
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N4A-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCT CCCC GCG    37
<210>95
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N4B-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCT CCCC CCG    37
<210>96
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>P53N5A-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCT CCCC G      35
<210>97
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>703N
<400>P53N5B-ACP
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGCT CCCC C       35
<210>98
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>703N
<400>703N
ATTCTGATGG TGTGGATTGT G                      21
<210>99
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM703C
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIIACCC TGGAGTAGAC GAAGA    45
<210>100
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM703-A
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGGT AC AGGGC             37
<210>101
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM703-B
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGGT AC CGGGC    37
<210>102
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>028N
<400>028N
CCTTCTGTGC TTGATGCTTT T                     21
<210>103
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM028C
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIICAGG AAGGATGAGC ATTIAG   46
<210>104
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM028-A
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITCC AA ACCAA             37
<210>105
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM028-B
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIITCC AA CCCAA    37
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>695N
<400>695N
AGAAAAACCA GAGGCAGCTT                       20
<210>107
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM695C
TCACAGAAGT ATGCCAAGCG AIIIIIAGCA CAAACCAAAG ACACAGT    47
<210>108
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM695-A
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCA TT TTAGG               37
<210>109
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM695-B
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCA TT GTAGG    37
<210>110
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>679N
<400>679N
CTAGCTGCAA GTGACATCTC T                     21
<210>111
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM679C
TCACAGAGTA TCCAAGCGII IIITCAGTAA GAAGCCAGGA GAG    43
<210>112
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM679-A
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCA GA ACTTT           37
<210>113
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM679-B
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIICCA GA CCTTT           37
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>832N
<400>832N
TTTTGGGTGG AGGCTAACAT                              20
<210>115
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM832C
TCACAGAAGT ATGCCAGCGA IIIIIAACGA TGCAGACACC ACCA   44
<210>116
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM832-A
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGAC TG GTAAA    37
<210>117
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM832-B
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIGAC TG ATAAA    37
<210>118
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>880N
<400>880N
CTTCCACCAA TACTCTTTTC C                              21
<210>119
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM880C
TCACAGAAGT ATGCCAGCGA IIIIIGCATA CACACAAGAG GCAGA    45
<210>120
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM880-A
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIAAA GC CATAA    37
<210>121
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>I＝脱氧次黄苷(dI)
<400>SM880-B
GTCTACCAGG CATTCGCTTC ATIIIIIAAA GC TATAA    37

Claims (145)

1、一种用于提高在核酸扩增中退火特异性的退火控制引物，该引物包括(a)3’-末端部分，该3’-端部分具有与与其杂交的模板核酸上的位点基本互补的杂交核苷酸序列；(b)具有预先选择的任意核苷酸序列的5’-末端部分；和(c)位于所述3’-末端部分和所述5’-末端部分之间的调控子部分，该调控子部分含有至少一个通用碱基或非识别性碱基类似物，从而所述调控子部分能够结合退火温度调控退火所述引物的退火部分。
2、根据权利要求1的退火控制引物，其中所述5’-末端部分的所述预先选择的任意核苷酸序列基本不与所述模板核酸上任何位点互补。
3、根据权利要求1的退火控制引物，其中所述模板核酸为gDNA、cDNA或mRNA。
4、根据权利要求3的退火控制引物，其中所述gDNA或cDNA为单链或双链DNA。
5、根据权利要求1的退火控制引物，其中所述核酸扩增在第一和第二退火温度下进行。
6、根据权利要求5的退火控制引物，其中所述核酸扩增中的第一退火温度等于或低于所述第二退火温度。
7、根据权利要求5的退火控制引物，其中所述3’-末端部分参与在所述第一退火温度下的退火，而所述5’-末端部分在所述第二退火温度下作为启动位点。
8、根据权利要求5的退火控制引物，其中所述调控子部分在第一退火温度下能够将所述引物的退火部分限制到所述3’-末端部分。
9、根据权利要求5的退火控制引物，其中所述第一退火温度为大约30℃～68℃之间。
10、根据权利要求5的退火控制引物，其中所述第二退火温度为大约50℃～72℃之间。
11、根据权利要求1的退火控制引物，其中所述退火控制引物具有通式5’-Xp-Yq-Zr-3’，其中Xp代表具有所述与模板核酸上任意位点基本不互补的预先选择的任意核苷酸序列的5’-末端部分；Yq代表所述含有至少一个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；Zr代表所述具有与与其杂交的模板核酸上的位点基本互补的杂交核苷酸序列的3’-末端部分；其中p、q和r代表核苷酸的数目；且其中X、Y和Z为脱氧核糖核酸或核糖核酸。
12、根据权利要求11的退火控制引物，其中所述通用碱基或非识别碱基类似物能够与各天然DNA/RNA碱基形成碱基对，与所说的天然DNA/RNA碱基具有很小差别。
13、根据权利要求11的退火控制引物，其中所述通用碱基或非识别碱基类似物选自包含：脱氧次黄苷、次黄苷、7-脱氮-2’-脱氧次黄苷、2-氮-2’-脱氧次黄苷、2′-OMe次黄苷、2′-F次黄苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-OMe3-硝基吡咯、2′-F3-硝基吡咯、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe5-硝基吲哚、2′-F5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F4-硝基苯并咪唑、PNA-5-氮吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-次黄苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉-5-硝基吲哚、吗啉-水粉蕈素、吗啉-次黄苷、吗啉-4-硝基苯并咪唑、吗啉-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-次黄苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-O-甲氧乙基次黄苷、2′O-甲氧乙基水粉蕈素、2′-O-甲氧乙基5-硝基吲哚、2′-O-甲氧乙基4-硝基苯并咪唑、2′-O-甲氧乙基3-硝基吡咯和它们的组合物的组。
14、根据权利要求11的退火控制引物，其中所述通用碱基或非识别碱基类似物为脱氧次黄苷，1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
15、根据权利要求11的退火控制引物，其中所述调控子部分包含具有通用碱基或非识别碱基类似物的毗邻核苷酸。
16、根据权利要求11的退火控制引物，其中所述脱氧核糖核苷酸为天然形成的dNMP、修饰的核苷酸和非天然的核苷酸。
17、根据权利要求11的退火控制引物，其中p代表15～60的整数。
18、根据权利要求11的退火控制引物，其中q至少为2。
19、根据权利要求11的退火控制引物，其中q至少为3。
20、根据权利要求11的退火控制引物，其中q代表2～15的整数。
21、根据权利要求11的退火控制引物，其中r代表6～50的整数。
22、根据权利要求11的退火控制引物，其中p为15～60的整数，q为2～15的整数，r为6～30的整数。
23、根据权利要求11的退火控制引物，其中Xp包括通用引物序列。
24、根据权利要求11的退火控制引物，其中Xp包括被一种或多种限制性内切核酸酶识别的一个序列或多个序列。
25、根据权利要求11的退火控制引物，其中Xp包括至少一个具有用于检测或分离的标记的核苷酸。
26、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr为与mRNA的多聚腺苷尾杂交的核苷酸序列。
27、根据权利要求26的退火控制引物，其中Zr包括至少10个毗邻的脱氧胸苷核苷酸。
28、根据权利要求26的退火控制引物，其中Zr包括至少10个在其3’-末端具有3’-V的毗邻脱氧胸苷核苷酸，其中V选自包含脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组。
29、根据权利要求26的退火控制引物，其中Zr包括至少10个在其3’-末端具有3’-NV的毗邻的脱氧胸苷核苷酸；其中V选自包含脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组，N选自包含脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组。
30、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr为与模板核酸的靶序列基本互补的核苷酸序列。
31、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr为随机核苷酸序列。
32、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr为与基因家族中发现的共有序列基本互补的核苷酸序列。
33、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr为从多个编码预定氨基酸序列的核苷酸的组合中选择的简并核苷酸序列。
34、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr包括至少一个核苷酸。
35、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr包括至少一个与等位位点互补的核苷酸。
36、根据权利要求11的退火控制引物，其中Zr包括至少一个用于诱变的靶核苷酸的错配核苷酸。
37、含有根据权利要求1～36任意一项的引物或引物组的试剂盒。
38、根据权利要求37的试剂盒，其中进一步包括具有与根据权利要求1～36任意一项的所述退火控制引物的所述5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物或引物对。
39、一种用于扩增DNA或核酸混合物的核酸序列的方法，其中所述方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物由权利要求1～25中任意一项得出。
40、根据权利要求39的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，包括：
(a)在每个引物都与所述核酸序列的所述区域退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的引物对，其中各引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的所述核酸序列的区域基本互补的杂交序列，在第一退火退火退火温度下进行第一阶段所述核酸序列的扩增，包含至少两个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而所述核酸序列的扩增产物被生成；和
(b)分别在各引物与所述扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，使用与步骤(a)相同的引物或各含有步骤(a)所用引物的各5’-末端部分所对应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)得到的所述扩增产物的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而所述扩增产物被再次扩增。
41、一种选择性扩增DNA或核酸混合物的靶核酸序列的方法，其中所述方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25任意一项。
42、根据权利要求41的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，包括：
(a)在每个引物都与其靶核苷酸序列退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的各在其3’-末端部分具有与与其杂交的所述靶核酸序列的区域基本互补的杂交序列的引物对，在第一退火温度下进行第一阶段所述靶核酸序列的扩增，该扩增含有至少两个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而所述靶核苷酸序列的扩增产物被生成；和
(b)在各引物分别与所述扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，使用与步骤(a)相同的引物或各含有与步骤(a)所用引物的各5’-末端部分所对应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)得到的所述扩增产物的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而所述扩增产物被再次扩增。
43、一种用于选择性扩增mRNA的靶核酸序列的方法，其中所述方法包括逆转录所述mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25任意一项。
44、根据权利要求43的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，包括：
(a)在模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成足以发生的条件下，将所述mRNA同与所述mRNA的polyA尾杂交的寡聚核苷酸dT引物接触；
(b)逆转录与所述寡聚核苷酸dT引物杂交的所述mRNA以生成第一DNA链，该第一DNA链与所述寡聚核苷酸dT引物与之杂交的所述mRNA互补。
(c)在每个引物都与其靶核苷酸序列退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的各在其3’-末端部分具有与与其杂交的所述靶核酸序列的区域基本互补的杂交序列的引物对，在第一退火温度下进行步骤(b)中获得的所述第一DNA链的所述靶核酸序列的第一阶段扩增，该扩增含有至少两个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而所述靶核苷酸序列的扩增产物被生成；和
(d)在各引物分别与所述扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，使用与步骤(c)相同的引物或各含有步骤(c)所用引物的各5’-末端部分所对应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(c)得到的所述扩增产物的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而所述扩增产物被再次扩增。
45、一种用于检测两种或多种核酸样品中差异表达mRNA的互补DNA的方法，其中所述方法包括逆转录所述mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25任意一项。
46、根据权利要求45的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，包括：
(a)提供代表第一mRNA转录本群体的核酸的第一样品和代表第二mRNA转录本群体的核酸的第二样品；
(b)在足以使模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成发生的条件下，单独地将各所述核酸第一样品和所述核酸第二样品与权利要求1～29任意一项的第一引物接触，其中该第一引物的3’-末端部分包括与与其杂交的差异表达mRNA上第一位点基本互补的杂交核苷酸序列；
(c)逆转录与该第一引物杂交的差异表达mRNA以生成第一cDNA链的第一群体，该第一cDNA链与该第一引物杂交的该第一核酸样品中的差异表达mRNA互补，并且也生成与第一引物杂交的第二核酸样品中的差异表达mRNA互补的第一cDNA链的第二群体；
(d)纯化和定量各所述第一cDNA链的第一和第二群体；
(e)在所述第二引物与该第一cDNA链各群体中的该第二位点退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的在其3’-末端部分具有与该第一cDNA链的第一和第二群体的第二位点基本互补的杂交序列的第二引物，在第一退火温度下进行步骤(d)得到的各第一DNA链第一和第二群体的第一阶段扩增，该扩增含有至少一个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而第二cDNA链的第一和第二群体被生成；
(f)分别在各引物与各第二cDNA链的3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用分别与步骤(b)和(e)所用相同的第一和第二引物，或各含有分别与步骤(b)和(e)使用的第一和第二引物的各5’-末端部分所对应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(e)得到的各第二cDNA链的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成该第二cDNA链的扩增产物，和
(g)比较该步骤(f)得到的扩增产物第一和第二群体中单个扩增产物的出现或水平。
47、一种快速扩增含有mRNA 3’-末端区域所对应的cDNA区域的靶cDNA片断的方法，其中所述方法包括逆转录所述mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25任意一项。
48、根据权利要求47的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在足以使模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成进行的条件下，将mRNA与权利要求1～29任意一项的第一引物接触，其中该引物的3’-末端部分包括与与其杂交的该mRNAs的polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)逆转录与所述第一引物杂交的该mRNAs以生成与该第一引物杂交的该mNRA互补的第一cDNA链群体；
(c)在该第二引物与所述第一cDNA链之一上的基因特异位点退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的第二引物，其中该引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的一条第一cDNA链上位点基本互补的基因特异性杂交核苷酸序列，在第一退火温度下进行该第一cDNA链的第一阶段扩增，该扩增含有至少一个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而基因特异性第二cDNA链被生成；和
(d)在个引物与基因特异性第二cDNA链的3’-和5’-末端分别退火的条件下，使用分别与步骤(a)和(c)所用相同的第一和第二引物，或各含有步骤(a)和(c)分别使用的第一和第二引物5’-末端部分相应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(c)得到的基因特异性第二cDNA链的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个引物退火、引物延伸和变性的循环，从而生成基因特异性cDNA链的扩增产物。
49、快速扩增含有mRNA的5’-末端区域所对应cDNA区域的靶DNA片断的方法，其中所述方法包括逆转录所述mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25任意一项。
50、根据权利要求49的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在足以进行模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成的条件下，将mRNAs与作为cDNA合成引物的寡聚核苷酸dT引物或随机引物接触，其中该cDNA合成引物包括与与其杂交的mRNA的区域基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)利用逆转录酶逆转录与该cDNA合成引物杂交的mRNAs以生成与该cDNA合成引物杂交的该mRNAs互补的第一cDNA链群体，从而mRNA-cDNA中间产物被生成；
(c)通过逆转录酶的末端转移酶反应，在以该mRNA-cDNA中间产物形式存在的该第一cDNA链3’-末端加胞嘧啶残基尾；
(d)在该寡核苷酸3’-末端部分与胞嘧啶尾杂交的条件下，将在步骤(c)中产生的该第一cDNA链3’-末端的胞嘧啶尾同寡聚核苷酸接触，该寡聚核苷酸包括由一组通用碱基或非识别碱基类似物分隔的3’-末端部分和5’-末端部分，其中该3’-末端部分在其3’-末端包括至少三个鸟嘌呤残基以与该第一cDNA链3’-末端的胞嘧啶尾杂交，并且5’-末端部分包括预先选择的的任意核苷酸序列；
(e)使用逆转录酶延伸第一cDNA链加尾的3’-末端以生成与该寡核苷酸互补的额外序列，其中该寡核苷酸在延伸反应中用作模板，从而全长第一cDNA链被延伸；
(f)在第一退火温度下进行步骤(e)生成的该全长第一cDNA链的第一阶段扩增，包括如下步骤：
(i)在该第一引物与该全长第一cDNA链3’-末端退火的条件下，在该第一引物与该全长第一链cDNA退火的条件下，使用含有与该全长第一cDNA链3’-末端序列基本互补的核苷酸序列的第一引物，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而全长第二cDNA链被生成；
(ii)在该第二引物与该全长第二cDNA链之一上基因特异性位点退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项中的第二引物，该第二引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的一条全长第二cDNA链上区域基本互补的基因特异性杂交序列，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而基因特异性cDNA链被生成；和
(g)在各引物分别与基因特异cDNA链3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用分别与步骤(f)-(i)和(f)-(ii)所用相同的第一和第二引物或各含有分别在步骤(f)-(i)和(f)-(ii)中分别使用的第一和第二引物各5’-末端部分所对应核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下，进行基因特异cDNA链的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而基因特异性cDNA链的扩增产物被生成。
51、一种扩增mRNAs互补的全长双链cDNAs的群体的方法，其中该方法包括逆转录该mRNA和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源于权利要求1～29的任意一项。
52、根据权利要求51的方法，其中该方法包括：
(a)在模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成足以进行的条件下，将该mRNAs与权利要求1～29任意一项的第一引物接触，其中该第一引物3’-末端部分具有与与其杂交的该mRNAs的polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)利用逆转录酶逆转录与第一引物杂交的该mRNAs以生成与该引物杂交的mRNAs互补的第一cDNA链群体，从而mRNA-cDNA中间产物被生成；
(c)通过逆转录酶的末端转移酶反应，在以该mRNA-cDNA中间产物形式存在的该第一cDNA链3’-末端加胞嘧啶残基尾；
(d)在该寡核苷酸的3’-末端部分与胞嘧啶尾杂交的条件下，将在步骤(c)中合成的该第一cDNA链3’-末端的胞嘧啶尾同寡聚核苷酸接触，该寡聚核苷酸包括由一组通用碱基或非识别碱基类似物分隔的3’-末端部分和5’-末端部分，其中该3’-末端部分在其3’-末端包括至少三个鸟嘌呤残基以与该第一cDNA链3’-末端胞嘧啶尾杂交并且5’-末端部分包括预先选择的任意核苷酸序列；
(e)使用逆转录酶延伸第一cDNA链加尾的3’-末端以生成与该寡核苷酸互补的附加序列，其中该寡核苷酸在延伸反应中用作模板，从而全长第一cDNA链被延伸；和
(f)在各引物分别与该全长第一cDNA链3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用各含有分别与步骤(a)和(d)中所用相同的第一引物和寡核苷酸对应的核苷酸序列的引物对，或各含有分别与步骤(a)和(d)中使用的该第一引物和寡核苷酸各5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物对，扩增步骤(e)生成的全长第一cDNA链，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该mRNAs互补的全长cDNA链的扩增产物被生成。
53、用于扩增mRNAs互补的5’-富集双链cDNAs的方法，其中所述方法包括逆转录所述mRNAs和使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25任意一项。
54、根据权利要求53的方法，其中所述方法包括：
(a)在模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成足以进行的条件下，将该mRNAs与权利要求1～25任意一项的第一引物接触，其中该第一引物3’-末端部分具有至少6个随机核苷酸序列；
(b)进行权利要求52中的步骤(b)～(e)，从而5’富集的第一cDNA链被延伸；
(c)在各引物分别与该5’富集的第一cDNA链的3’-和5’-末端序列退火的条件下，分别使用各包含与步骤(a)和(b)中使用的该引物和寡核苷酸的各5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物对，扩增步骤(b)生成的该5’富集的第一cDNA链，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该5’富集cDNA链的扩增产物被生成。
55、一种用于在同一个反应中使用多对引物同时扩增多个靶核苷酸序列的方法，其中所述方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25中任意一项。
56、根据权利要求55的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在各引物都与其靶核苷酸序列退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的引物对，其中各引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的所述靶核酸序列的区域基本互补的杂交核苷酸序列，在第一退火温度下进行多个靶核苷酸序列的第一阶段扩增，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而所述靶核苷酸序列的扩增产物被生成；和
(b)在各引物对分别与所述步骤(a)产生的扩增产物的3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用与步骤(a)使用的相同的引物对或各含有步骤(a)所用引物对的各5’-末端部分所对应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)得到的所述扩增产物的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而所述扩增产物在相同的反应中被再次扩增。
57、一种用于生成gDNA的DNA指纹的方法，其中所述方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25中的任意一项。
58、根据权利要求57的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在该引物或该引物对与该gDNA退火的条件下，使用权利要求1～25中任意一项的引物或引物对，其中各引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的该gDNA上的位点基本互补的任意核苷酸序列，在第一退火温度下进行来自该gDNA的DNA指纹的第一阶段扩增，该DNA指纹为一系列基因组特征的离散DNA片断，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而作为DNA指纹的该一系列离散DNA片断被生成；和
(b)在该引物或该引物对的各引物分别与步骤(a)所得一组离散DNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用与步骤(a)相同的引物或引物对，或各含有步骤(a)使用的引物或引物对的各5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物或引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)所得该组离散DNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该组离散DNA片断被再次扩增。
59、用于生成mRNA样品的RNA指纹的方法，其中所述方法包括逆转录和使用引物进行扩增反应，该方法特征在于至少一个引物源于权利要求1～29中的任意一项。
60、根据权利要求59的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在模板驱动酶促脱氧核糖核酸合成足以进行的条件下，将所述mRNA样品与权利要求1～29中任意一项的第一引物接触，其中该第一引物具有与与其杂交的该mRNA样品的polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)逆转录与该第一引物杂交的mRNA样品以生成与该第一引物杂交的该mRNA样品互补的第一cDNA链群体；
(c)在该引物或引物对与该mRNA样品退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项的第二引物或引物对，其中各引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的该第一cDNA链上位点基本互补的任意核苷酸序列，在第一退火温度下进行步骤(b)所得的该第一cDNA链群体的第一阶段扩增，该扩增含有至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该组作为RNA指纹特征的离散cDNA片断被生成；和
(d)在该引物或该引物对的各引物分别与步骤(c)所得该组离散cDNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用与步骤(c)中相同的引物或引物对，或各含有步骤(c)使用的引物或引物对的各5’-末端部分对应的核苷酸序列的引物或引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(c)所得该组离散DNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该组离散cDNA片断被再次扩增。
61、一种用于从mRNA样品鉴定多基因家族的保守同源片断的方法，其中所述方法包括逆转录和使用引物进行扩增反应，该方法的特征在于至少一个引物源自权利要求1～25中任意的一项。
62、根据权利要求61的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在模板酶促驱动脱氧核酸合成足以发生的条件下，将该mRNA样品与权利要求1～29任意一项中的第一引物接触，其中该第一引物具有与与其杂交的该mRNA样品polyA尾基本互补的杂交核苷酸序列；
(b)逆转录与该第一引物杂交的mRNA样品以生成与该第一引物杂交的该mRNA样品互补的第一cDNA链群体；
(c)在该第二引物与第一cDNA链的共有序列或简并序列退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项中的第二引物，该第二引物在其3’-末端部分具有与编码与其杂交的该第一cDNA链上保守同源片断的氨基酸序列的共有序列或简并序列基本互补的杂交序列，在第一退火温度下进行步骤(b)生成的第一cDNA链群体的第一阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成具有共有序列或简并序列的3’-末端cDNA片断；和
(d)在各引物分别与该3’-末端cDNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，分别使用与步骤(a)和(c)相同的第一和第二引物或者使用各含有步骤(a)和(c)使用的第一和第二引物各5’-末端部分相应的核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(c)生成的3’-末端cDNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该3’-末端保守同源cDNA片断被扩增。
63、根据权利要求61的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)进行权利要求52中的步骤(a)～(e)，从而生成全长cDNA链；
(b)在第一退火温度下进行步骤(a)得到的该全长第一cDNA链的第一阶段扩增，包括以下步骤：
(i)在该第一引物与该全长第一cDNA链的3’-末端退火的条件下，在该第一引物与该全长第一链cDNA退火的条件下，使用含有与该全长第一cDNA链3’-末端序列基本互补的核苷酸序列的第一引物，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成全长第二cDNA链；和
(ii)在该第二引物与该全长第二cDNA链的共有序列或简并序列退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项中的第二引物，该第二引物在其3’-末端部分具有与编码与其杂交的全长第二cDNA链上保守同源片断的氨基酸序列的共有序列或简并序列基本互补的杂交序列，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成具有该共有序列或简并序列的5’-末端cDNA片断；和
(c)在各引物分别与该5’-末端cDNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用分别与步骤(b)-(i)和(b)-(ii)中相同的第一和第二引物，或使用分别含有步骤(b)-(i)和(b)-(ii)使用的第一和第二引物各5’-末端部分所对应的核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下，进行步骤(b)生成的5’-末端cDNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该5’-末端保守同源cDNA片断被扩增。
64、一种用于鉴定gDNA的多基因家族的保守同源片断的方法，其中该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25中任意一项。
65、根据权利要求64的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)在该引物或引物对与该gDNA的共有序列或简并序列退火的条件下，使用权利要求1～25中任意一项的引物或引物对，其中各引物在其3’-末端部分具有与编码与其杂交的gDNA上保守同源片断的氨基酸序列的共有序列或简并序列基本互补的杂交序列，在第一退火温度下进行gDNA的保守同源片断的第一阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而生成具有该共有序列或简并序列的基因组DNA片断；
(b)在该引物或该引物对的各引物分别与步骤(a)所得该基因组DNA片断的3’-和5’-末端序列退火的条件下，使用步骤(a)相同的引物或引物对，或使用各含有步骤(a)所用引物或引物对的5’-末端部分所对应的核苷酸序列的引物或引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)生成的基因组DNA片断的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而该保守同源基因组片断被扩增。
66、一种用于鉴定靶核酸的核苷酸变异的方法，其中所述方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25。
67、根据权利要求66的方法，其中所述方法使用两阶段扩增进行，该方法包括：
(a)使用权利要求1～25中任意一项的第一引物，该引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的该靶核酸的第一位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列，其中各该第一引物和该第一位点含有该靶核苷酸变异所对应的置疑位置，在第一退火温度下进行第一阶段扩增以生成与包括该核苷酸变异的该靶核酸互补的第一DNA链，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而当该置疑位置由该第一位点的对应核苷酸的互补的该第一引物的核苷酸占据时，生成包括该核苷酸变异的该靶核酸的互补第一DNA链；和
(b)在高严格条件的第二退火温度下，进行步骤(a)生成的该第一DNA链的第二阶段扩增，包括以下步骤：
(i)在该第二引物与靶核酸的该第二位点退火的条件下，使用权利要求1～25中任意一项的第二引物，该引物在其3’-末端部分含有与与其杂交的该靶核苷酸的第二位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而与包括该核苷酸变异的该第一DNA链互补的第二DNA链被生成；和
(ii)在各引物与该第二DNA链的3’-和5’-末端序列分别退火的条件下，使用与步骤(a)和(b)-(i)相同的第一和第二引物或各具有与与其杂交的步骤(b)-(i)生成的该第二DNA链3’-和5’-末端互补的或对应的杂交序列的引物对，进行至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而在其3’-和5’-末端含有该靶核酸的该第一和第二位点的该第二DNA链被扩增，因此含有该核苷酸变异的该第二DNA链对应的靶核苷酸短片断被生成。
68、根据权利要求66的方法，其中所述方法使用第一和第二扩增的两个独立扩增进行，其中该第二扩增使用两阶段扩增，包括：
(a)在核苷酸变异位于该预先选择的序列之间的条件下，使用各引物具有与该靶核酸杂交位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列的引物对，进行该第一扩增以生成该在末端之间含有该核苷酸变异的DNA链短片断，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，其中该引物组的至少一个引物为权利要求1～25中任意的一项，该引物在其3’-末端部分具有杂交序列，从而在其末端之间含有该核苷酸变异的DNA链短片断被扩增；
(b)使用权利要求1～25中任意一项的第一引物，该引物在其3’-末端部分具有与与其杂交的该靶核酸的第一位点处的预先选择的序列基本互补的杂交序列，其中各该第一引物和该第一位点含有该靶核苷酸变异所对应的置疑位置，在第一退火温度下进行所述第二扩增的第一阶段扩增以生成包括该核苷酸变异的该DNA链短片断的互补第一DNA链，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而当该置疑位置由该第一位点的对应核苷酸的该第一引物的互补核苷酸占据时，生成包括该核苷酸变异的该靶核酸的互补第一DNA链；和
(c)在各引物与该第一DNA链的3’-和5’-末端序列分别退火的条件下，使用引物对，其中该引物对中的一个引物与步骤(a)所用权利要求1～25任意一项的引物相同，另一个与步骤(b)所用该第一引物相同，或使用引物对，其中各引物具有与其杂交的步骤(b)生成的该第一DNA链3’-和5’-末端的互补或对应杂交序列，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)生成的第一DNA链的该第二扩增的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸他和变性，从而该第一DNA链被扩增，因此含有该核苷酸变异的该第一DNA链对应的靶核苷酸短片断被生成。
69、一种用于靶核苷酸诱变的方法，该方法包括使用引物进行扩增反应，其特征在于至少一个引物源自权利要求1～25的任意一项。
70、根据权利要求69的方法，其中所述诱变为定点诱变，并使用两阶段扩增，包括以下步骤：
(a)在该引物或引物对与其靶核苷酸序列退火的条件下，使用权利要求1～25任意一项权利要求的引物对，各在其3’-末端部分具有与与其杂交的该靶核苷酸序列的区域基本互补的杂交序列，其中该杂交序列具有至少一个错配核苷酸以产生定点突变，在第一退火温度下进行该靶核苷酸序列的第一阶段扩增，该扩增包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性，从而含有定点突变位点的扩增产物被生成；和
(b)在各引物分别与该扩增产物的3’-和5’-末端退火的条件下，使用与步骤(a)相同的引物，或使用各含有步骤(a)所用引物的各5’-末端部分对应的预先选择的任意核苷酸序列的引物对，在高严格条件的第二退火温度下进行步骤(a)生成的扩增产物的第二阶段扩增，该扩增包括至少一个循环的引物退火、引物延伸他和变性，从而该含有定点突变位点的扩增产物被再扩增。
71、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述第二阶段扩增重复至少5次。
72、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述扩增依据聚合酶链反应进行。
73、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述核酸为双链且该核酸的链通过变性分离。
74、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述核酸为单链。
75、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述第一退火温度为约30℃～68℃之间。
76、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述第二退火温度为约50℃～72℃之间。
77、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述第一退火温度等于或低于该第二退火温度。
78、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中当该第一阶段扩增进行时，权利要求1～36任意一项的引物对的3’-末端部分参与第一退火温度下的退火，当所述第二阶段扩增进行时，引物的5’-末端部分作为启动位点。
79、根据权利要求40～70任意一项的方法，其中所述权利要求1～36中任意一项的引物的调控子部分在该第一退火温度下能够与该引物的退火部分限制到3’-末端部分。
80、根据权利要求40～70任意一项的方法，该方法进一步包括在第二扩增阶段后分离扩增的DNA产物的步骤。
81、根据权利要求80的方法，该方法进一步包括将分离的DNA产物克隆到载体的步骤。
82、根据权利要求40、42、44、48、50、56、58、60、62、63或65的方法，其中该第一阶段扩增使用的所述引物对为选自权利要求1～25的引物和常规引物的退火控制引物的组合。
83、根据权利要求45～46和55～68中任意一项的方法，其中该引物包括至少一个具有用于检测或分离的标记的核苷酸。
84、根据权利要求46的方法，其中所述第一核酸样品包括在第一细胞中表达的mRNA，该第二核酸用品包括在第二细胞中表达的mRNA。
85、根据权利要求46的方法，其中该第一核酸样品包括处于第一发育阶段的细胞表达的mRNA，第二核酸样品包括处于第二发育阶段的细胞表达的mRNA。
86、根据权利要求46的方法，其中该第一核酸样品包括肿瘤细胞中表达的mRNA，该第二核酸样品包括正常细胞中表达的mRNA。
87、根据权利要求46的方法，其中该mRNA的该第一位点包括polyA。
88、根据权利要求46的方法，其中该第一引物的通式为5’-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3’，其中dX表示脱氧核糖核苷酸并包括与该mRNAs的第一和第二群体基本不互补的预先选择的任意核苷酸序列；dY表示含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；dT表示能够与该mRNAs的第一和第二群体的该第一位点退火的毗邻的脱氧胸苷。
89、根据权利要求48、52、60或62的方法，其中该第一引物具有通式5’-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3’，其中dX表示脱氧核糖核苷酸并包括与mRNAs基本不互补的预先选择的任意核苷酸序列；dY表示含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；dT表示能够与mRNA的polyA尾退火的毗邻的脱氧胸苷。
90、根据权利要求88或89的方法，其中该方法进一步在其3’-末端包括3’-V；其中V为选自包括脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组的一种。
91、根据权利要求88或89的方法，其中dT进一步在其3’-末端包括3’-NV；其中V为选自包括脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的组的一种，N为选自包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧胸苷和脱氧鸟苷的组的一种。
92、根据权利要求46的方法，其中该第二引物具有通式5’-dX15-30-dY2-10-dZ8-15-3’，其中dX表示脱氧核糖核苷酸并包括与该第一cDNA链的第一和第二群体基本不互补的预先选择的任意核苷酸序列；dY表示含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；dZ表示能够与DNA链的该第一和第二群体的该第二位点退火的杂交任意核苷酸序列。
93、根据权利要求46的方法，其中所述第一或第二引物包含被一或多个限制性内切酶识别的一个或多个序列。
94、根据权利要求46的方法，其中步骤(g)包括通过电泳在琼脂糖凝胶上解析各扩增产物的第一和第二群体并比较特定大小的带的出现或水平。
95、根据权利要求46的方法，其中步骤(g)包括通过电泳在变性聚丙烯酰胺凝胶上解析扩增产物的各第一和第二群体并比较特定大小的带的出现或水平。
96、根据权利要求50、52、54和63任意一项的方法，其中进行加胞嘧啶残基尾的步骤在锰离子存在时进行。
97、根据权利要求50、52、54和63任意一项的方法，其中与胞嘧啶尾形成碱基对的所述寡核苷酸具有通式5’-dX15-30-dY2-10-dZ1-10-G3-5-3’，其中dX表示脱氧核糖核苷酸并包括预先选择的任意序列；dY表示含有2～10个通用碱基或非识别碱基类似物的调控部分；dZ表示脱氧核糖核苷酸并包括预先选择的任意序列；G3-5表示3～5个鸟嘌呤。
98、根据权利要求97的方法，其中G3-5表示3～5个核糖鸟苷。
99、根据权利要求97的方法，其中G3-5表示3～5个脱氧核糖鸟苷。
100、根据权利要求97的方法，其中G3-5为核糖鸟苷和脱氧核糖鸟苷的组合。
101、根据权利要求55～60的方法，进一步包括通过扩增产物的粒析来比较该扩增产物。
102、根据权利要求101的方法，其中该粒析比较通过聚丙烯酰胺基质或琼脂糖凝胶基质的电泳进行。
103、根据权利要求101的方法，其中该粒析比较通过DNA自动测序仪完成。
104、根据权利要求58的方法，其中步骤(a)使用的该引物或该引物对的3’-末端部分的长度为8～15个核苷酸。
105、根据权利要求60的方法，其中步骤(c)使用的该第二引物或第二引物对的该3’-末端部分的长度为8～15个核苷酸。
106、根据权利要求58或60的方法，其中该基因组DNA或该mRNA样品来自不同的生物个体。
107、根据权利要求58或60的方法，其中该基因组DNA或该mRNA样品源选自包含植物、动物和微生物的组。
108、据权利要求58或60的方法，其中该基因组DNA或该mRNA样品源为人。
109、根据权利要求62、63或65的方法，其中权利要求62或63使用的该第二引物，或权利要求65的步骤(a)使用的该引物或引物对表示引物库，其中各引物含有选自编码保守序列的氨基酸序列的多个核苷酸的简并序列。
110、根据权利要求67或68的方法，其中该靶核酸为基因组DNA.
111、根据权利要求67或68的方法，其中该靶核酸为包括核苷酸变异的核苷酸短片断。
112、根据权利要求67或68的方法，其中该靶核酸包括多于一个的靶核苷酸短片断，其中各靶核苷酸短片断包括通过多重核酸扩增制得的核苷酸变异。
113、根据权利要求67或68的方法，其中该核苷酸变异为单核苷酸多态性或点突变。
114、根据权利要求67或68的方法，其中该核苷酸变异被包括在人的核酸内。
115、根据权利要求67或68的方法，其中该核苷酸变异被包括在导致传染病的生物体的核酸内。
116、根据权利要求67或68的方法，其中该含有核苷酸变异的第一DNA链通过一个循环的引物退火、引物延伸和变性被生成。
117、根据权利要求67或68的方法，其中该第一引物的3’-末端部分含有由对应核苷酸变异的相应核苷酸的互补核苷酸占据的置疑位置。
118、根据权利要求67或68的方法，其中该第一引物的置疑位置位于该第一引物的3’-末端部分的中间。
119、根据权利要求67或68的方法，其中该第一引物的3’-末端部分的长度为8～20个核苷酸。
120、根据权利要求67或68的方法，其中该第一引物的置疑位置在该第一引物的3’-末端核苷酸的约10个碱基内。
121、根据权利要求120的方法，其中该第一引物的置疑位置在该第一引物的3’-末端核苷酸的约6个碱基内。
122、根据权利要求121的方法，其中该第一引物的置疑位置位于该第一引物3’-末端核苷酸起4～6位内。
123、根据权利要求122的方法，其中该第一引物的置疑位置位于该第一引物3’-末端核苷酸起5位内。
124、根据权利要求67或68的方法，其中该第一引物在其3’-末端部分具有至少一个充分邻近该第一引物的置疑位置的人为错配核苷酸，其中该错配核苷酸包括通用碱基或非识别碱基类似物。
125、根据权利要求67的方法，其中步骤(b)-(i)中包括核苷酸变异的该第二DNA链通过一个循环的引物退火、引物延伸和变性被生成。
126、根据权利要求67的方法，其中步骤(b)-(ii)中包括核苷酸变异的该第二DNA链通过至少5个循环的引物退火、引物延伸和变性被扩增。
127、根据权利要求68的方法，其中步骤(c)中包括核苷酸变异的该第一DNA链通过至少5个循环的引物退火、引物延伸和变性被扩增。
128、根据权利要求67或68的方法，其中含有该核苷酸变异的该靶核苷酸短片断通过含有至少一个具有用于检测的标记的核苷酸的第一和第二引物被检测。
129、用于核酸扩增的试剂盒，其中该试剂盒包括权利要求39或40描述的退火控制引物或退火控制引物组。
130、用于选择性扩增DNA的靶核酸序列的试剂盒，其中该试剂盒包括权利要求41或42描述的退火控制引物或退火控制引物组。
131、用于选择性扩增mRNA的靶核酸序列的试剂盒，其中该试剂盒包括权利要求43或44描述的退火控制引物或退火控制引物组。
132、用于检测与差异表达mRNA互补的DNA的试剂盒，其中该试剂盒包括权利要求45～46、82、87和89～92任意一项描述的退火控制引物或退火控制引物组。
133、用于快速扩增含有与mRNA的3’-末端区域对应的cDNA区域的靶cDNA片断的试剂盒，其中该试剂盒包括权利要求47或48描述的退火控制引物或退火控制引物组。
134、用于快速扩增含有mRNA的5’-末端区域对应的cDNA区域的靶cDNA片断的试剂盒，其中该试剂盒包括权利要求49或50描述的退火控制引物或退火控制引物组。
135、用于扩增mRNAs互补的全长双链cDNAs群体的试剂盒，该试剂盒包括权利要求51或52描述的退火控制引物或退火控制引物组。
136、用于扩增与mRNA的5’-末端区域互补的5’富集的双链cDNAs的试剂盒，该试剂盒包括权利要求53或54描述的退火控制引物或退火控制引物组。
137、用于同时扩增多个靶核苷酸序列的试剂盒，该试剂盒包括权利要求55或56描述的退火控制引物或退火控制引物组。
138、用于通过使用gDNA产生DNA指纹的试剂盒，该试剂盒包括权利要求57或58描述的退火控制引物或退火控制引物组。
139、用于通过使用mRNA生成mRNA指纹的试剂盒，该试剂盒包括权利要求59或60描述的退火控制引物或退火控制引物组。
140、用于通过使用mRNA来鉴定多基因家族中的保守同源片断的试剂盒，该试剂盒包括权利要求61、62或63描述的退火控制引物或退火控制引物组。
141、根据权利要求134～135或140的试剂盒，该试剂盒进一步包括权利要求98～101任意一项中描述的寡核苷酸。
142、用于通过使用gDNA来鉴定多基因家族的保守同源片断的试剂盒，该试剂盒包括权利要求64或65描述的退火控制引物或退火控制引物组。
143、用于鉴定靶核苷酸的核苷酸变异的试剂盒，该试剂盒包括权利要求66、67或68描述的退火控制引物或退火控制引物组。
144、用于靶核酸诱变的试剂盒，该试剂盒包括权利要求69或70描述的退火控制引物或退火控制引物对。
145、根据权利要求1～36任意一项的引物在涉及核酸扩增的过程中的应用。
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