CN113832147A - 一种高效的大片段dna合成与扩增的pcr引物、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效、特异地合成与扩增大片段DNA的PCR引物、方法及应用。本发明通过特别设计扩增引物，在正向引物和反向引物5'端添加相同的任意短序列，使扩增序列的单链DNA末端形成反向重复序列并配对产生发夹结构，对引物二聚体和短小的非特异DNA片段的扩增有良好的抑制效果；而较大的目标DNA片段末端难以相互配对不产生发夹结构，因而可避免非特异产物的竞争而被高效地特异性扩增。进一步，本发明使用嵌套式交错变温内循环，可优化目标序列的不同GC含量区间的有效延伸，与上述抑制效果的倍加效应最终提高PCR的扩增效率和特异性；本发明可提高大片段DNA序列从头合成的能力，从不同物种的基因组等各种模板扩增大片段目标DNA，扩增的DNA片段可应用于载体克隆、表达和基因组测序等目的，在分子生物学、合成生物学和生物技术领域具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，更具体地，涉及一种高效、特异地合成和扩增大片段DNA的PCR引物、方法及应用。
背景技术
PCR(Polymerase chain reaction)是一种应用广泛、功能强大、高灵敏度的DNA扩增技术，作为生物学的常用核心技术之一，在分子生物学、基因工程、合成生物学、医学等研究与应用领域有非常广泛的用途。然而，在许多方面的应用上现有的PCR技术仍然面临困难。在分子生物学、基因工程和合成生物学研究与应用中，经常需要从各种生物的复杂基因组中扩增出大片段DNA序列，或体外从头合成大片段DNA序列，用以检测和研究长度大的基因功能，多基因簇，序列结构变异等。为此，已经报道了各种改良的长片段PCR方法(LongPCR或Long range PCR)用以扩增大片段DNA序列，包括改良耐热性DNA聚合酶(提高DNA合成能力和保真度)和结合使用具有3’-5’校正活性的耐热性DNA聚合酶，改良优化反应缓冲液,补充反应添加剂，延长链延伸时间等。利用现有的长片段PCR方法体系，虽然偶然可以从复杂基因组扩增出较大DNA片段(>15kb)，但通常的实验还是难以稳定地扩增大部分10kb以上的DNA片段。
以现有的长片段PCR方法体系从高等生物的复杂基因组扩增大DNA片段时(要使用较多如35以上的循环数)，虽然使用特异性强的引物并采用“热启动”耐热性DNA聚合酶(含有抑制抗体)或采用“热启动”实验操作，通常还会产生一些非特异(非目标)产物。由于非特异产物的长度往往小于大片段目标序列的长度，这些非特异产物的扩增效率较高，因而形成对特异产物的很强的竞争性扩增，并大量消耗酶活力和引物等成分，最终大大降低特异产物的扩增效率，成为现有PCR技术对大片段DNA扩增困难的主要原因之一。因此，如果能消除或抑制非特异产物的产生和扩增，就能增强目标大片段序列的扩增效率。
另一方面，目标DNA序列的GC碱基含量及其分布特征是影响PCR效率的重要因素。大部分DNA序列的GC含量分布往往是不均匀的，有些区间的GC含量高，有些区间的GC含量低(高TA含量)。现有的PCR(包括Long PCR)方法的温度条件一般使用恒温的72℃(或68℃)进行链延伸反应。但是，当新链合成延伸到较低GC的区间时，在较高温度(68～72℃)下DNA碱基的氢键结合力减弱，双链结构不稳定，从而影响新链在此区间的稳定合成延伸，最终降低整个目标序列的扩增效率。
常规的基因工程操作技术仅能对已有的DNA序列进行有限的改造和重组，而DNA合成技术则可从头书写遗传信息，从另一个高度提升对生命的理解、预测和操控的能力。因此，DNA序列的设计合成是推动生命科学及其相关领域发展的关键共性底层技术，在分子生物学、合成生物学研究和应用、以及基于DNA的信息储存等领域中有重大的需求。大片段DNA序列的体外从头合成有两个关键步骤：1)以化学合成(或其它方法合成)技术生产多条寡核苷酸引物，各引物3’端和5’端序列之间重叠一定长度(一般16～18碱基)，使之覆盖整个目标序列。以目前主流的化学合成技术，每条高质量引物(保证一定的全长率)的最大长度在约200碱基(nt)以下(为保证质量一般不超过160nt)；2)用一定的方法将所有引物延伸拼接成全长的目标序列模板，再以PCR方法扩增出大量的目标序列，用于克隆到质粒载体中。其中，polymerase cycling assembly(PCA)或称为overlapping PCR是目前最主流的寡核苷酸引物拼接扩增技术。但由于化学合成引物的长度限制及其现有技术的引物拼接效率的限制，拼接产生大片段全长目标序列模板的质量、浓度、和纯度都较低，以及目前PCR方法扩增效率的限制，以现有的技术一次体外合成和扩增难以产生3～4kb以上的目标DNA序列。更长的目标DNA序列的合成需要将多个短片段在宿主细胞(大肠杆菌，酵母等)进行体内组装。突破这个DNA体外从头合成效能的技术瓶颈，将有利于促进分子生物学和合成生物学技术的发展和应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有PCR技术中存在的上述缺陷和不足，提出了一种高效的扩增大片段DNA的PCR方法，称为Suppression Thermo-Interlaced Long PCR(STI-LongPCR)。STI-Long PCR通过对正向、反向引物的优化设计，使扩增DNA链的末端具有一段短的反向互补序列，就可以避免或抑制非特异性产物的扩增。同时，利用不同温度进行链延伸的热交错内循环策略，可以优化链延伸反应效率。最终，本发明的STI-Long PCR方法能高特异性地从不同物种的复杂基因组中扩增大片段DNA，并且大大提高大片段DNA体外从头合成的效能。该方法的开发将对分子生物学、基因工程研究和合成生物学研究与应用具有重要意义。
本发明的第一目的在于提供一种高效、特异合成和扩增大片段DNA的PCR引物。
本发明的另一目的在于提供一种高效、特异合成和扩增大片段DNA的PCR方法。
本发明的再一目的在于提供所述PCR引物或PCR方法的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于合成和扩增大片段DNA的PCR抑制引物，包括正向引物和反向引物，正向和反向引物具有如下构成：5’-n(x)N(y)-3’，其中N(y)为与目的扩增序列的两末端位点特异结合的短序列(与常规的特异性引物部分相同)，N为4种碱基(A、T、C、G)的任一种，y为碱基数目；n(x)为N(y)引物5'端附加的一段任意短序列，n为4种碱基(A、T、C、G)的任一种，x为碱基数目，所述附加序列n(x)在正向和反向引物中相同。即用于合成和扩增大片段DNA的PCR引物，由扩增目的DNA片段的特异性正向引物和反向引物及其5'端的一段相同的任意短序列组成；所述任意短序列不包括与模板特异结合的序列。
本发明的PCR抑制引物为在扩增目的DNA片段的特异性正向引物和反向引物5'端添加的相同任意短序列，在PCR过程中产生的目标特异产物和可能产生的非特异产物链的两末端具有由5’-n(x)附加序列形成的反向互补短序列；其中，长度较短的非特异产物链(包括引物二聚体链)在PCR的复性(退火)和延伸阶段，其两末端的反向互补短序列由于距离近容易相互配对形成茎结构(整条链形成茎环结构或发夹结构)，从而阻止引物与末端位点配对而抑制此序列的扩增；而较长的特异产物链的两末端之间的距离远，较难相互配对成茎结构，使引物能与特异产物链末端位点配对而进行序列扩增；这种差异的PCR效率消除或减弱了较短非特异产物对较长特异产物的竞争性扩增，从而强化目标长片段DNA的PCR扩增效率。即：使扩增序列的单链DNA末端形成反向重复序列并配对产生发夹结构，对引物二聚体和短小的非特异DNA片段的扩增有良好的抑制效果；而较大的目标DNA片段末端难以相互配对不产生发夹结构，因而可被高效地特异性扩增。本发明设计的引物在一定程度上可提高扩增效率，扩增出较大的目标片段，并完全抑制或减少非特异性产物的扩增。
优选地，所述与N(y)5’端相连的n(x)部分可采用富含GC序列，以增加退火温度，增加发夹结构的稳定性，以提高目标序列扩增的特异性。
所述的两部分短序列的x或y可为18～30碱基，优选为20～25碱基。
N(y)部分的Tm值可为58～68℃，优选地为60～65℃，即与目的扩增序列的两末端位点特异结合的短序列Tm值优选为60～65℃。
n(x)的Tm值可为65～72℃，优选为66～70℃，即引物N(y)的5'端的一段附加的任意短序列的Tm值优选为66～70℃。
优选地，所述PCR抑制引物使用终浓度为0.10～0.15μM。本发明还提供上述任一引物在合成和/或扩增大片段DNA或在制备合成和/或扩增大片段DNA的试剂盒中的应用；所述大片段DNA是指4～5kb以上的序列，优先为10kb以上的序列。
一种合成和/或扩增大片段DNA的PCR方法，包括如下步骤：
S1.获取高质量的基因组DNA或cDNA、或由寡核苷酸引物拼接而成的DNA序列模板；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，采用上述任一所述用于扩增大片段DNA的PCR抑制引物进行PCR扩增反应。
步骤S2所述扩增反应可采用常规热循环(延伸阶段在68℃～72℃范围内的任一温度)条件进行扩增。例如：预变性94℃2min，35～38个PCR循环(96℃15s，66℃30s，72℃40s/kb)，补充后延伸72℃5min。
优选地，步骤S2所述PCR扩增反应程序链延伸阶段采用嵌套式交错变温内循环，即反应程序由包括变性，退火，和延伸阶段的超级循环(super-cycle)和其中链延伸阶段的嵌套式交错变温内循环(nested thermo-interlaced cycle)构成；每一个交错变温内循环由多个不同延伸温度或一定范围内连续变化的不同温度构成；所述延伸温度变化范围根据待扩增目标序列的GC含量和分布特征进行设定。通过使用可产生扩增序列两末端相互配对的特异引物，并结合使用在链延伸阶段的嵌套式交错变温内循环的PCR温度/时间程序，可以消除非特异产物的竞争性扩增，同时优化具有不同GC分布的DNA链的延伸效率，最终强化了从复杂基因组特异地扩增大片段目的序列的效果，可以更好地从包括复杂生物基因组的DNA模板中、或从寡核苷酸拼接的从头合成序列模板库中特异地扩增出大片段目的序列。
优选地，所述超级循环数为30～40。
优选地，所述交错变温内循环包括但不限于在60～70℃，62～70℃，62～72℃或65～72℃的范围内进行步进式的，或均匀渐变式的内循环。此交错变温内循环能优化具有不同GC含量分布特征的DNA链在延伸阶段的双链稳定性和DNA合成效率的关系，以提高PCR效率。
进一步优选地，所述PCR扩增反应程序包括但不限于如图2所示的基本程序I～IV，每个程序有35～40个超级循环，每个超级循环的链延伸阶段由一定数目(n)的嵌套式交错变温内循环组成，以优化具有不同GC含量和分布特征的目标DNA链的延伸。n的值主要由每个内循环的总时间和目标DNA链的长度决定。
其中，程序I用于扩增中等GC含量(平均40～55％)以及可能富含GC和/或富含AT小区的序列；程序II用于具有较高GC含量(平均>55％)或具有局部区域(>300bp)高GC含量(≥70％)的序列；使用97～98℃更利于较高GC区的完全变性，而72℃更利于较高GC区的延伸；程序III适用于GC含量较低(平均<40％)，其中62～63℃较利于富含AT区的延伸；程序IV适用于同时包含较高(≥70％)和较低(<30％)GC区的序列。
进一步优选地，还包括以少量步骤S2的扩增产物为模板，采用巢式引物进行第二轮的交错变温内循环PCR。所用的巢式引物的5’端可以根据用途进行必要的碱基添加；通过第二轮的热交错内循环PCR可进一步提升扩增大片段目的序列的效果，同时通过巢式引物引入其它用途的碱基，如用于目的片段克隆的位点(如酶切位点或同源重组位点)；所获得大片段DNA扩增产物可用于后续的分子生物学研究。
优选地，步骤S2所述PCR扩增反应采用一种高性能与高保真度的耐高温的DNA聚合酶及其配套的反应缓冲液。
优选地，步骤S2所述PCR反应体系为(以ddH2O调整反应液，使各成分的终浓度为)：1×Buffer 30.0μL(所用DNA聚合酶配套buffer)，4种dNTP各0.2mM，正向引物和反向引物各0.1～0.15μM，KOD FX Neo DNA聚合酶(或ApexHF CL DNA聚合酶)0.30～0.35单位，40～50ng基因组DNA，或1μL反转录cDNA模板，或1～2μL寡核苷酸引物拼接序列的模板。
本发明还提供另外一种合成和/或扩增大片段DNA的PCR方法，以由寡核苷酸引物拼接而成的DNA序列模板、基因组DNA或cDNA为模板，使用上述任一所述PCR抑制引物或常规特异性扩增引物进行PCR扩增；所述PCR扩增反应程序由超级循环和其中的嵌套式交错变温内循环构成，即在每一个超级循环的链延伸阶段进行由不同延伸温度构成的交错变温内循环；所述延伸温度范围根据待扩增目标序列的GC含量和分布特征进行设定，具体PCR扩增反应程序和体系如上所述。
在本发明中，单独采用PCR抑制引物或单独采用交错变温内循环的PCR扩增反应均可以改善对长片段的扩增效果，但两者结合对特异性扩增长片段有倍加的效果，具有显著的协同增效作用(1+1>2)。
本发明还提供一种合成和/或扩增大片段DNA的试剂盒，包括上述任一用于扩增大片段DNA的PCR抑制引物。
优选地，所述试剂盒还包括一种高性能与高保真度的耐高温的DNA聚合酶及其配套的反应缓冲液。
本发明还提供上述任一所述用于合成和/或扩增大片段DNA的PCR引物或任一所述合成和/或扩增大片段DNA的PCR方法或上述任一所述试剂盒在分子生物学和生物技术领域的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种PCR抑制引物，通过优化设计扩增引物，在正向引物和反向引物5'端添加相同的任意短序列，使扩增序列的单链DNA末端形成反向重复序列并配对产生发夹结构，对引物二聚体和短小的非特异DNA片段的扩增有良好的抑制效果；而较大的目标DNA片段末端难以相互配对不产生发夹结构，因而可被高效地扩增，从而避免非特异DNA产物的竞争性扩增，导致强化对大片段目标DNA的特异性扩增。进一步，本发明还提供包含嵌套式交错变温内循环(优选地62～72℃范围内循环)的PCR方法，可优化目标序列的不同GC含量区间的有效延伸，一定程度改良扩增效果；单独采用本发明的PCR抑制引物或单独采用嵌套式交错变温内循环的PCR扩增反应均可以改善对长片段的扩增效果，而这两种措施的结合以其倍加效应最终大大提高PCR的特异性和扩增效率，具有显著的协同增效作用(1+1>2)。本发明可以高效、特异性地扩增大片段DNA；特别适用于从不同物种的基因组特异地扩增大片段目标DNA，以及提高DNA体外从头合成的效能。扩增的基因组DNA片段可达10～30kb以上，已成功扩增出长达38kb的超大基因组片段；一次体外从头合成的DNA序列达到7kb或以上的长度。合成和扩增出的DNA片段可直接应用于载体克隆、转化细胞进行表达、和靶向基因组测序等目的，在分子生物学、合成生物学和生物技术领域具有重要的应用价值。
附图说明
图1为STI-long PCR的示意图。(A)PCR抑制引物的构成。(B)利用PCR抑制引物的PCR工作原理，不同长度的PCR产物的PCR抑制程度不同。(C)STI-long PCR的一种温度循环程序示意图，每个嵌套式交错变温内循环(巢式内循环)的各温度时间和总时间可以在一定范围内设定，每个超级循环中的内循环数(n)由目标片段长度决定。
图2为STI-Long PCR的基本程序图。程序I～IV是一轮STI-Long PCR的基本程序，在每个内循环的总时间为约30～35s的情况下，一般为每0.6～0.8kb使用1个内循环。其中，程序I适合于GC含量适中(平均约40～55％)的序列；程序II适合于GC含量偏高(平均>55％，或局部区间>70％)的序列；程序III适合于GC含量偏低(平均约<40％)的序列；程序IV适合于具有GC含量偏高(>70％和偏低(<30％)局部区间的序列。每个超级循环(super-cycle)的延伸阶段由n个热交错内循环数构成，n值按目的序列长度以每个内循环扩增约0.6～0.8kb计算。程序V是在选定的任一种程序I～IV的基础上，以第一轮STI-Long PCR产物为模板进行第二轮巢式PCR的程序。
图3为不同PCR方法(一轮PCR)对水稻基因组DNA片段扩增效果比较的0.8％琼脂糖凝胶普通电泳图。(A)以常规的特异引物(不含5’附加短序列)和常规热循环条件(延伸温度为恒定72℃)的扩增。9522和9311分别是粳稻和籼稻品种。(B)以常规引物和交错变温内循环条件的扩增。(C)以PCR抑制特异引物和常规热循环(恒定72℃延伸)条件的扩增。(D)以PCR抑制特异引物和交错变温内循环条件(即代表性STI-Long PCR)的扩增。所有PCR使用相同浓度的KOD FX Neo DNA聚合酶。(A～C)中的目标片段由箭头指示，其它为非特异性产物。
图4为使用ApexHF CL DNA聚合酶的一轮法STI-Long PCR从水稻基因组(粳稻品种日本晴)扩增的各种长度DNA片段(0.8％琼脂糖凝胶普通电泳图)。
图5为利用两轮法STI-Long PCR从水稻、玉米和人细胞系中高效和特异性扩增超大基因组片段的1.0％琼脂糖凝胶脉冲电场电泳图。所有PCR使用KOD FX Neo DNA聚合酶。
图6为利用一轮或两轮法STI-Long PCR扩增的DNA片段的限制性内切酶位点分布(A)和酶切产物的电泳图(B)。各片段的酶切图谱复合预期，证明扩增片段为特异产物。
图7为以改良Polymerase Cycling Assembly(PCA)和STI-Long PCR进行大片段DNA从头合成的原理图(A)和实际效果图(B)。以改良PCA即改良Overlapping PCR(使用链延伸交错变温内循环)将多条重叠的寡核苷酸引物延伸拼接和扩增出的大片段全长模板链含大量非全长中间产物，不能直接做后续克隆，因此再以STI-Long PCR高效特异地扩增出大量全长目标序列。图7B显示以PCA(第一轮反应)对分别覆盖全长3.4kb，4.2kb，和7.0kb目标序列的32条，38条，和58条寡核苷酸引物(每条110～155nt，相邻引物3’和5’端相互重叠16～18nt)拼接的模板(1μL)，以作为对照的普通PCR(恒温72℃延伸，泳道1，3，5)和STI-LongPCR(泳道2，4，6)扩增出的产物。普通PCR只扩增出3.4kb目标序列和微弱的4.2kb目标序列，而STI-Long PCR可扩增出很强的7.0kb目标序列。
图8为STI-Long PCR在大DNA片段克隆中的应用。(A)利用STI-Long PCR特异扩增水稻基因组DNA片段的电泳图。(B)A图中DNA片段被克隆到相应载体中的载体酶切电泳图。(A)所示9.8kb片段克隆到载体1产生克隆1，22.9kb片段克隆到载体2产生克隆2。
图9为利用STI-Long PCR扩增用于基因组目标区段测序的DNA片段电泳图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
表1实施例中各名称引物对应的核苷酸序列。小写字母为5’端PCR抑制附加序列，下划线为Gibson Assembly克隆序列。
实施例1STI-long PCR的方法示意图和PCR程序设计
STI-long PCR抑制引物的结构图(正向或反向)(图1A)。本发明中PCR抑制引物均添加任意一段5'-n(x)序列(优选地Tm＝66～70℃)，例如5'-gcctggctccacgctccgagt(Tm＝68℃，根据公式Tm＝69.3+41×GC％–650/L(L为引物碱基数)，在较低浓度的PCR抑制引物(终浓度0.10～0.15M)与DNA模板结合和链延伸过程中，引物二聚体和较短(如<3kb)的非特异性单链DNA的两末端的距离近，容易相互配对形成稳定的发夹结构，使引物不能高效与模板链结合，从而强烈抑制PCR扩增效率(图1B)。而大的(如>4kb)的目标DNA片段的两末端之间距离远，不容易相互配对形成发夹结构，引物就能高效与模板链结合和延伸(图1B)。因此，本发明使用PCR抑制引物有利于大片段目的DNA的特异性扩增。
本发明的STI-long PCR采用一种嵌套式交错变温内循环来优化具有不同GC含量分布的DNA链的延伸效率(图1C)。为简化对含有不同GC分布特征的目标序列的STI-longPCR程序设置，本发明设计了四种基本STI-long PCR程序I～IV(图2)。这些PCR程序有约36～40个超级循环，每个超级循环含有一定数目(n)的嵌套式交错变温内循环。n的值主要由每个内循环的总时间和目标DNA链的长度决定，在图2所示的条件下，一般每0.6～0.8kb使用1个内循环。
程序I用于扩增中等GC含量(平均40～55％)以及可能富含GC和/或富含AT小区的序列。
程序II用于具有较高GC含量(平均>55％)或具有局部区域(>300bp)高GC含量(≥70％)的序列；使用97～98℃更利于较高GC区的完全变性，而72℃更利于较高GC区的延伸。
程序III适用于GC含量较低(平均<40％)，62～63℃较利于富含AT区的延伸。
程序IV适用于同时包含较高(≥70％)和较低(<30％)GC区的序列。
为了简化交错变温内循环的设置，本发明使用了温度步进式的内循环。类似地，本发明也可以采用温度渐变式的内循环，可以达到类似的效果。
基于程序I～IV，本发明还提供了用于两轮巢式PCR的程序V，即以程序I～IV的任一种进行第一轮STI-long PCR(一般32～33超级循环)，以少量第一轮PCR产物(如0.3～0.5μL)为模板，再以巢式引物进行第二轮PCR(一般18～23超级循环)(图2)。
实施例2STI-Long PCR与其他PCR方法的比较(一轮法PCR)
为了显示本发明的STI-long PCR明显优于其它PCR方法对大片段DNA扩增的性能，本发明以不同品种的水稻基因组DNA(CATB法提取)为模板，分别使用常规引物和PCR抑制引物，再分别结合常规热循环和嵌套式交错变温内循环的PCR程序，以及使用日本TOYOBO公司的高保真高性能的DNA聚合酶KOD FX Neo kit(具有热启动特性)。以0.8％琼脂糖凝胶电泳对四组PCR效果进行比较(图3)。
PCR体系(以30μL为例)：2×Buffer 15.0μL，2mM dNTPs 3.0μL，KOD FX Neo 0.35μL(0.35单位)，1μM的正向(F)引物和反向(R)引物各4.5μL(最终浓度0.15μM)，DNA(40～50ng/μL)1μL，加ddH2O至最终30μL。本发明的实施例均使用德国Biometra GmbH公司的PCR仪Biometra TAdvanced 96S/SG。
使用的水稻基因组DNA模板包括来源于籼稻恢复系R498和ZSR5(含功能型育性恢复基因Rf4)、籼稻非恢复系J23和9311(含非功能型等位基因rf4)、以及粳稻9522。
A.第一组使用常规引物(不含5’附加序列)和常规热循环条件，其PCR程序为：预变性94℃2min，35个PCR循环(96℃15s，66℃30s，72℃40s/kb)，补充后延伸72℃5min。
使用的引物如表1所示，其中扩增4.9kb片段的引物Rf4-4.9Fs/Rf4-4.9Rs(SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10)是利用Rf4和rf4之间的序列变异，为特异地扩增功能型恢复基因Rf4而设计，这组引物不能有效地从非恢复系J23和9311扩增出含rf4的等位序列。此组PCR的结果表明，以恢复系R498和ZSR5的基因组DNA为模板可扩增出目的片段，但从非恢复系J23和9311也扩增出非特异性产物(图3A)。扩增6.7kb片段的引物为S58-Fs/S58-6.7Rs(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)，扩增8.3kb片段的引物为S58-Fs/S58-8.3Rs(SEQ ID NO.11和SEQID NO.13)，扩增10.5kb片段的引物为S58-Fs/S58-10.5Rs(SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.14)，扩增12.5kb片段的引物为S58-Fs/S58-12.5Rs(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.15)，扩增14kb片段的引物为S58-Fs/S58-14Rs(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16)。
结果如图3A所示，表明使用这些常规特异引物组和常规热循环条件仅能扩增到10.5kb的片段且浓度较低(4.9kb的Rf4片段浓度较高)，同时有很多非特异产物。目标片段由箭头指示，其它均为非特异性产物。
B.第二组使用常规引物(于第一组相同)和嵌套式交错变温内循环条件。其PCR程序为：4.9kb的PCR程序为程序I，6.7～14kb片段的PCR程序均为程序II(图2)。
结果如图3B所示，使用常规引物和交错变温内循环条件产生了与第一组相同的目标条带，最高可达12.5kb的目标片段但较弱，目标条带的染色荧光比第一组对应的条带更亮，但同样也产生了许多非特异性产物(包括在非恢复系中的非特异性产物)。图中的目标片段由箭头指示，其它为非特异性产物。此结果表明，只利用交错变温内循环可以一定程度改良扩增效果，但使用常规引物进行大片段PCR的特异性较低。
C.第三组使用PS引物和常规热循环条件，其PCR程序与第一组相同。
使用的PCR抑制引物如表1所示，其中扩增4.9kb(Rf4)片段的PCR抑制引物为Rf4-4.9F/Rf4-4.9R(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。扩增6.7kb片段的引物为S58-F/S58-6.7R(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，扩增8.3kb片段的引物为S58-F/S58-8.3R(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5)，扩增10.5kb片段的引物为S58-F/S58-10.5R(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6)，扩增12.5kb片段的引物为S58-F/S58-12.5R(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7)，扩增14kb片段的引物为S58-F/S58-14R(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8)。这些PS引物的目的片段特异结合部分与第一组对应的常规引物相同。
结果如图3C所示，只使用PCR抑制引物一定程度提高了扩增效率(与第一组和第二组相比，对应的目标条带更亮)，扩增出最大12.5kb目标片段；同时，各PCR反应产生相对较少的非特异性产物(恢复系和非恢复系中均未产生非特异产物)。目标片段由箭头指示，其它均为非特异性产物。
D.第四组使用PCR抑制引物和交错变温内循环条件，即本发明的STI-Long PCR。其PCR程序为：对Rf4片段的PCR程序为程序I，10.5～14kb片段的PCR程序均为程序II，19.8～26.2kb片段的PCR程序均为程序IV(图2)。
扩增4.9kb(Rf4)和10.5～14kb片段的PCP抑制引物与第三组相同，扩增19.8kb片段的PCR抑制引物为F2-19.8F/F2-19.8R(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)，扩增24.7kb片段的PCR抑制引物为F6-24.7F/F6-24.7R(SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24)，扩增26.2kb片段的PCR抑制引物为F7-F/F7-26.2R(SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26)。
结果如图3D所示，利用STI-Long PCR(一轮法PCR)成功扩增了长达26.2kb的目标片段，且所有反应都没有产生非特异产物，说明本发明方法优于其它PCR方法。以上结果表明，结合使用PCR抑制引物和交错变温内循环的STI-Long PCR，可以消除非特异产物的竞争性扩增，同时优化具有不同GC分布的DNA链的延伸效率，最终大大强化了从复杂基因组特异地扩增大片段目的序列的效果。
实施例3使用ApexHF HS DNA聚合酶CL的一轮法STI-Long PCR
为了显示利用其它种类的高保真高性能DNA聚合酶在STI-Long PCR的效果，本实验使用了艾科瑞生物(湖南)公司的国产ApexHF HSDNA聚合酶CL。使用的PCR抑制引物如表1所示，其中扩增7.8kb的PS引物为F5-7.8F/F5-7.8R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)，扩增17.2kb的PCR抑制引物为F5-17.2F/F5-17.2R(SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22)，其余PCR抑制引物与实施例2的第4组对应片段使用的相同，使用的PCR程序也与实施例2第4组的相同。
结果如图4所示，使用国产ApexHF HSDNA聚合酶CL的一轮法STI-Long PCR扩增水稻基因组的大片段DNA的效果与实施例2第4组(使用KOD FX Neo)的相当，或效果更好。
实施例4以两轮STI-Long PCR扩增基因组的超大DNA片段
本发明还可以进行两轮PCR以实现基因组超大DNA片段(>20kb)的有效扩增。首先利用第一轮STI-Long PCR扩增富集超大的目标序列，然后再以少量第一轮PCR产物作为模板，使用巢式特异引物(结合位点的Tm优选为63～66℃)进行第二轮PCR扩增。使用的巢式引物可以是常规的引物，也可以在引物中添加用于各种目的的碱基，如克隆位点序列。
第一轮STI-Long PCR体系(20μL)的各种成分浓度与实施例2第4组相同，超级循环数为32～33。
第二轮STI-Long PCR体系(以40μL为例)：2×Buffer 17.5μL，2mM dNTPs4.0μL，KOD FX Neo 0.45μL(0.45单位)，1μM正向和反向引物各6.0μL(终浓度0.15μM)，加ddH2O至39.5μL，第一轮STI-Long PCR产物0.5μL作为模板DNA。超级循环数为18～23。
本发明通过这种方法，从水稻基因组扩增出长达31.8kb的DNA片段(第一轮PCR引物F7-31.8F/F7-31.8R，SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.36；第二轮PCR引物F7-31.8nestF/F7-31.8nestR，SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35；基于基本程序II的两轮法PCR程序V–II)(图5)。本实验还从玉米基因组特异性扩增了22.1kb的DNA片段(第一轮PCR引物Maize-22.1F/Maize-R，SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.42；第二轮PCR引物-22.1nestF/Maize-nestR，SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.41；程序V–I)(图5)，以及从人细胞系基因组扩增了长达38.2kb的超大DNA片段(第一轮PCR引物Human P450-F/Human P450-38.2R，SEQ ID NO.43和SEQ IDNO.48；第二轮PCR引物Human P450-nestF/Human P450-38.2nestR，SEQ ID NO.44和SEQ IDNO.47；程序V–II)(图5)。
实施例5对STI-Long PCR扩增的基因组DNA大片段的特异性检测
本发明对以上实施例2～4以一轮法和两轮法STI-Long PCR扩增的部分基因组DNA大片段进行常规的限制性内切酶消化和电泳分析，确认了所有扩增片段的限制性内切图谱符合目标序列的酶切位点分布图(图6)，证明了STI-Long PCR扩增产物的特异性。
实施例6以改良PCA和STI-Long PCR提高DNA体外从头合成的效能受限于化学合成寡核苷酸引物的长度及其引物拼接效率和PCR扩增效率的限制，现有技术一次体外合成的DNA长度一般为3～4kb以下。本发明实施了对3.4kb，4.2kb，和7.0kb的基因序列的从头合成(原理如图7A)。首先，设计了分别对此3个序列的16组(32条)，19组(38条)，和29组(58条)寡核苷酸引物(各长110～155nt，相邻引物末端相互重叠16～18nt)覆盖所述的目标序列，由金唯智公司以化学合成制备这些引物。
以ApexHF HS DNA聚合酶CL配制对每个片段拼接的第一轮反应(20μL)，加入所述的混合引物(各引物0.01μM)，以应用了本发明内容之一的链延伸交错变温内循环的改良PCA(Overlapping PCR)反应，高效拼接全长目标序列模板：33超级循环[97℃10s,58℃15s，10x(62℃5s,65℃5s,68℃5s,70℃5s,72℃5s)]，其中10x(…)表示延伸阶段的10次嵌套式交错变温内循环。作为对照的普通PCA反应含有同样混合引物，但使用普通的PCR温度循环条件：33循环[97℃10s,58℃15s，72℃5min]。配制第二轮PCR反应，即STI-Long PCR反应和对照普通PCR(各40μL，使用ApexHF HS DNA聚合酶CL)：以2μL改良PCA产物为模板，使用表1所示的PCR抑制特异引物(DVS7.0F/DVS7.0R，SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50，各0.1μM)；以及对照的普通PCR以2μL普通PCA产物为模板，使用表1所示的普通特异引物(DVS7.0nF/DVS7.0nR，SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52，各0.15μM)。STI-Long PCR反应使用33超级循环[97℃10s,58℃15s，10x(62℃5s,65℃5s,68℃5s,70℃5s,72℃5s)]；对照PCR使用33循环[97℃10s,62℃15s，72℃5min]。将上述扩增产物(3μL)电泳分析，可见采用改良PCA和STI-Long PCR的反应能高效特异地扩增出所述的3个目标产物且浓度较高(图7B，泳道2，4，6)，而对照反应只扩出3.4kb片段和微弱的4.2kb片段，没有扩增出7.0kb片段(图7B，泳道1，3，5)，证明本发明提供的方法大大提高了体外从头合成大片段DNA的效能，能够一次体外合成拼接等于或大于7kb的目标序列。
实施例7STI-Long PCR在分子克隆中的应用
在功能基因组学和生物技术研究中，通常需要在载体中克隆大的基因组片段进行转化和表达实验。Gibson Assembly是一种常用且高效的克隆方法(Gibson et al.,2009,Nature Methods,6:343-345)。因此，本发明设计了巢式的特异性引物，其中第2轮PCR引物包含额外的5'端序列(20或25个碱基，表1中下划线指示)用于Gibson Assembly克隆。本发明通过两轮STI-Long PCR扩增了两个包含水稻功能基因的9.8kb(第一轮PCR引物AL-9.8F/AL-9.8R，SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.56；第二轮PCR引物AL-9.8nestF/AL-9.8nestR，SEQID NO.54和SEQ ID NO.55；程序V–II)和22.9kb(第一轮PCR引物Sc-22.9F/Sc-22.9R，SEQID NO.57和SEQ ID NO.60；第二轮PCR引物Sc-22.9nestF/Sc-22.9nestR，SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59；程序V–IV)的基因组DNA序列(图8A)。根据文献(Gibson et al.,2009,Nature Methods,6:343-345)，将两个片段以Gibson Assembly方法分别克隆到具有植物转化能力双元载体pCAMBIA-1300和pYLTAC380H(Zhu et al.,2017,Molecular Plant,10:918-929.)(图8B)。10μL反应体系：2×Gibson Assembly Mix 5μL，pCAMBIA-1300(或pYLTAC380H)质粒80～100ng，纯化后的目的DNA片段150～200ng，ddH2O补足到10μL。将反应产物电激转化大肠杆菌，用目的片段特异引物做菌落PCR，筛选出阳性克隆，最终分别用AscI和Not I酶切确认(图8B)，结果显示特异扩增的长目标片段能正确连入对应克隆载体中，获得符合预期大小的酶切片段，表明该方法能高效的用于大片段的扩增与分子克隆。
实施例8STI-Long PCR在靶向基因组测序中的应用
STI-Long PCR体系与实施例2第4组相同。
当前的靶向基因组区间测序技术系统通常使用合成的寡核苷酸芯片捕获并富集基因组目的区域的序列。靶向基因组区间测序的另一种策略是基于对基因组目标区域的PCR扩增，但通常的PCR方法一般只能扩增<10kb的片段。本发明通过一轮的STI-Long PCR，将水稻基因组中一个约65kb的目标基因组区域进行重叠片段扩增，包括两个大基因组片段19.8kb(F2-19.8F/F2-19.8R，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；程序II)和20.8kb(F1-20.8F/F1-20.8R，SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62；程序II，图2)，以及两个中等大小的基因组片段12.7kb(F4-12.7F/F4-12.7R，SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；程序II)和12.8kb(F3-12.8F/F3-12.8R，SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64；程序II，图2)(图9)。将4个片段混合，用以构建二代Illumina测序的文库进行测序。
上述实施例为本发明较佳的实施方式和部分应用例，但本发明的用途并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
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<120> 一种高效的大片段DNA合成与扩增的PCR引物、方法及应用
<141> 2021-09-08
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctggctcc acgctccgag tgggagtgag ggataaaagc attgc 45
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctggctcc acgctccgag tcgcactttt gggtcaaatt gacgtc 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcctggctcc acgctccgag tacgcgcgat cggatgcaac t 41
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tggtcagctc gatcggttat taactc 46
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctggctcc acgctccgag ttgaagcaac caacgacata ctggagt 47
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<212> DNA
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gcctggctcc acgctccgag tcctcgatcg atctccatta gct 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tccggtcaag catccgatgt taca 44
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gcctggctcc acgctccgag tgcacaattc caacagtgat aagcc 45
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gggagtgagg gataaaagca ttgc 24
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cgcacttttg ggtcaaattg acgtc 25
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gcacgcgcga tcggatgcaa ct 22
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ggtcagctcg atcggttatt aactc 25
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tgaagcaacc aacgacatac tggagt 26
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cctcgatcga tctccattag ct 22
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ccggtcaagc atccgatgtt aca 23
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gcacaattcc aacagtgata agcc 24
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gcctggctcc acgctccgag tggcccgact ttcacaactt gtatct 46
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gcctggctcc acgctccgag tggagtatca actatcccga gttagga 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tgccgtgagg tcgtgtggaa tca 43
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tccaccacag gagcattctc ca 42
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tgcccaccca aggacacatg a 41
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gcctggctcc acgctccgag tgctgtgctc ctgctaccgc ttt 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tgccgtgagg tcgtgtggaa tca 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tgctgtgctc ctgctaccgc ttt 43
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gcctggctcc acgctccgag tggctgccga aaacagtgac caaggtt 47
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gccggggccg ggcctaata 19
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ccccgtccgg tacagcccat agaa 24
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gcctggctcc acgctccgag tgggcctgaa ggcctgatct gtcaa 45
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ggcacatgtg ggaggagcaa t 21
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gcctggctcc acgctccgag tcccgggcaa tggctcagtt a 41
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gggcccacat ccccacaact 20
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<212> DNA
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gcctggctcc acgctccgag tcagcccatg ctgctccctt t 41
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<212> DNA
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gcctggctcc acgctccgag tgccacccgt cgagcaacct aa 42
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<212> DNA
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gtagggcagg gagggaccaa a 21
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cacacggtcc acgcggaaaa 20
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gcctggctcc acgctccgag tgggcctgaa ggcctgatct gtcaa 45
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cgcctggctc cacgctcggc tgaccgacta gggcgatta 39
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ggaccattgg tcagtgtagg agtc 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcctggctc cacgctcggc acataggacg atgttggacc attg 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgattagt cggacgactt gggtga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtgggtcgt gtgtcacgtg cgaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcctggctc cacgctcggc cagccctcat ccttagtctt g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tggagtcttg tccctcaaac agactgct 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagcggcta cacctcttca ctg 23
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gcttggctcc cagctggata cca 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tggccgagaa gggaacagac tg 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaggcagaa ggttcagcgt tagcaa 26
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gcctggctcc acgctccgag tgccagctgg atgagtcaaa aggct 45
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcctggctcc acgctccaga gctctgaggt ctcgctttcg gactcat 47
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gcctggctcc acgctccaga gcatgctatg tttacagtga gtcttttgct 50
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gctctgaggt ctcgctttcg gactcat 27
<210> 52
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccgcatgcta tgtttacagt gagtcttttg ct 32
<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcctggctcc acgctccgag tacctcagca acgtcttcga ga 42
<210> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aggctgtctc gtctcgtctc ggcgcgccgg gctgacgtca gcgaaaggg 49
<210> 55
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tggtaatcta tgtatcctgg ggcgcgccgg ggagaggcag gttccaaggc 50
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gcctggctcc acgctccgag tgcatgtatt gactcccgct g 41
<210> 57
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tctgccacca ctactcactc ccatg 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaccgcagtg ccagtagcac ttcgtgcacg agcattgagc tagttagca 49
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgttgcagtg ctgtgttcca tctgcgtgcc gcacagagtt tcaagattg 49
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gcctggctcc acgctccgag tcaagattgt gccgcacaga gtttc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tggcaccacc tgtgacctgt gta 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tggacgggca tgaatcatga gtgac 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gcctggctcc acgctccgag tgccgtgagg tcgtgtggaa tca 43
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gcctggctcc acgctccgag tggagcgcaa cgcaacaccc ata 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggctcc acgctccgag tggccatcca cgtaccactc a 41
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gcctggctcc acgctccgag tgctgtgctc ctgctaccgc ttt 43
Claims (10)
1.一种用于合成和扩增大片段DNA的PCR引物，其特征在于，包括正向引物和反应引物，正向和反向引物具有如下构成：5’-n(x)N(y)-3’，其中N(y)为与目的扩增序列的两末端位点特异结合的短序列，N为4种碱基的任一种，y为碱基数目；n(x)为N(y)引物5'端一段附加的任意短序列，n为4种碱基的任一种，x为碱基数目，所述附加的任意短序列在正向和反向引物中相同。
2.根据权利要求1所述用于合成和扩增大片段DNA的PCR引物，其特征在于，所述x或y为18～28碱基。
3.根据权利要求1所述用于合成和扩增大片段DNA的PCR引物，其特征在于，N(y)的Tm值为58～68℃。
4.根据权利要求1所述用于合成和扩增大片段DNA的PCR引物，其特征在于，n(x)的Tm值为65～72℃。
5.权利要求1～4任一所述PCR引物在合成和扩增大片段DNA或在制备合成和/或扩增大片段DNA的试剂盒中的应用。
6.一种合成和/或扩增大片段DNA的PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.获取由寡核苷酸引物拼接而成的DNA序列模板、基因组DNA或cDNA；
S2.以步骤S1从头合成的DNA序列、基因组DNA或cDNA为模板，采用权利要求1～4任一所述PCR引物进行PCR扩增反应。
7.一种合成和/或扩增大片段DNA的PCR方法，其特征在于，以由寡核苷酸引物拼接而成的DNA序列模板、基因组DNA或cDNA为模板，使用权利要求1～4任一所述设计合成的PCR引物或常规特异性扩增引物进行PCR扩增；所述PCR扩增反应程序由超级循环和其中的嵌套式交错变温内循环构成，即在每一个超级循环的链延伸阶段进行由不同延伸温度构成的交错变温内循环；所述延伸温度范围根据待扩增目标序列的GC含量和分布特征进行设定。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，还包括以少量扩增产物为模板，采用巢式引物进行第二轮的交错变温内循环PCR。
9.一种合成和/或扩增大片段DNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一所述设计合成的PCR引物。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，还包括高性能与高保真度的耐高温的DNA聚合酶及其配套的反应缓冲液。
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