CN118308469A - 具有polyA序列的核酸的合成方法 - Google Patents
具有polyA序列的核酸的合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118308469A CN118308469A CN202211708972.7A CN202211708972A CN118308469A CN 118308469 A CN118308469 A CN 118308469A CN 202211708972 A CN202211708972 A CN 202211708972A CN 118308469 A CN118308469 A CN 118308469A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primers
- primer
- nucleic acid
- fragment
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 103
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 36
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 23
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 10
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 33
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 13
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 carbon sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种具有polyA序列的核酸的合成方法。该具有polyA序列的核酸的合成方法，对于polyA序列的合成不再依赖Oligo退火，针对全长polyA序列使用化学方法人工合成超长引物，整个合成过程只需要进行一轮PCR即可获得具有polyA序列的核酸全长，大大简化了实验操作，规避了Oligo退火中繁琐的实验步骤，降低了时间成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种具有polyA序列的核酸的合成方法。
背景技术
合成生物学旨在通过设计、改造、重建生物分子、生物元件和生物分化过程，构建具有生命活性的生物元件、系统以及人造细胞或生物体。利用基因合成的方式获得目的基因，不但能够获得自然界中不存在的或者模板含量极低的基因序列，而且可以通过序列优化提高表达量或者达到基因功能修饰的目的。在可预期的将来，基因合成将在生命科学以及新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物医药等领域中发挥巨大作用。
polyA序列是在mRNA的3’端添加的非模板化腺苷，在mRNA的翻译和稳定性中起到了关键作用，人工构建具有polyA序列的核酸需求日益上涨。而在核酸合成过程中，此类型的序列往往因PCR难以扩增而导致合成失败，成为基于PCR的核酸合成技术的一大难点和瓶颈。
目前具有polyA序列的核酸合成方法主要是将目标产物拆分为不含polyA序列的前序列和polyA序列两个片段进行制备，不含polyA序列的前序列使用常规核酸合成方法，polyA序列主要使用Oligo退火的方法来合成。将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段可经处理插入至适当的载体上，之后将此载体酶切，与不含polyA序列的前序列重组最终获得具有polyA序列的全长序列。按此方法，2kb以内序列核酸合成的实验周期为8天～13天。在合成过程中，由于polyA序列本身的特殊性，在退火过程中容易错配，发生错误延伸，导致合成的polyA结构缺失，序列合成的成功率低以及核酸合成的产量小，无法直接用于下游操作，导致整个实验周期延长，费时耗力。
发明内容
基于此，有必要提供一种能提高效率的具有polyA序列的核酸的合成方法。
此外，还提供一种用于制备具有polyA序列的核酸的试剂盒。
一种具有polyA序列的核酸的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
根据目标片段设计多条引物，所述多条引物能够经退火首尾互补连接后延伸而形成线性核酸，所述线性核酸包括与所述目标片段具有相同核苷酸序列的片段，其中：每条引物的长度为50bp～100bp；所述多条引物中包括尾引物，所述尾引物包括连接段和与所述连接段连接的Oligo(dT)序列，所述连接段用于与所述尾引物相邻的引物互补连接；及
在无所述目标片段作为模板的条件下，将所述多条引物进行PCR扩增，制备具有polyA序列的核酸。
上述具有polyA序列的核酸的合成方法，对于polyA序列的合成不再依赖Oligo退火，针对全长polyA序列使用化学方法人工合成超长引物，整个合成过程只需要进行一轮PCR即可获得具有polyA序列的核酸全长，大大简化了实验操作，规避了Oligo退火中繁琐的实验步骤，降低了时间成本。
在其中一个实施例中，多条引物间经退火而互补连接的片段的长度独立地为12bp～25bp。
在其中一个实施例中，所述目标片段的长度为300bp～5000bp。
在其中一个实施例中，所述目标片段的长度超过2000bp，所述合成方法的步骤包括：
根据所述目标片段，设计两个以上400bp～800bp的首尾能够相互重叠的小片段并分别合成，其中具有polyA序列的小片段根据本申请具有polyA序列的核酸的合成方法合成，及采用重叠延伸PCR将所述小片段拼接形成所述目标片段。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增的程序包括：
94℃～98℃预变性1min～5min之后，94℃～98℃变性10s～20s，40℃～45℃退火10s～30s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行22～25个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸1min～5min。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增的程序包括：
98℃预变性4min～5min之后，98℃变性10s～20s，40℃退火10s～20s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸1min～5min。
在其中一个实施例中，所述多条引物中包括首引物，所述首引物包括第一同源臂，所述尾引物包括第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂用于将所述线性核酸连接到转化载体上；在所述PCR扩增后，还包括以下步骤：将扩增产物通过同源重组的方式连接到转化载体上后，转化、菌落PCR筛选及测序。
在其中一个实施例中，所述转化载体包括线性化载体。
一种用于制备具有polyA序列的核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
多条引物，所述多条引物能够经退火首尾互补连接后延伸而形成线性核酸，所述线性核酸包括与目标片段相同的片段，其中：每条引物的长度为50bp～100bp；所述多条引物中包括尾引物，所述尾引物包括连接段和与所述连接段连接的Oligo(dT)序列，所述连接段用于与所述尾引物相邻的引物互补连接；及
PCR扩增反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。
在其中一个实施例中，所述多条引物中包括首引物，所述首引物包括第一同源臂，所述尾引物包括第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂用于将所述线性核酸连接到转化载体上。
附图说明
图1为实施例1中其中一个正确克隆序列的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左至右第二泳道的条带大小为627bp，第一泳道为DNAmarker；
图2为实施例1中其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图；
图3为实施例2中三种不同产物片段的琼脂糖凝胶电泳结果示意图，从左至右第二至四条泳道的条带大小分别为838bp、705bp和1428bp，第一泳道为DNA marker；
图4为实施例2中其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图；
图5为实施例3中五种不同产物片段的琼脂糖凝胶电泳结果示意图，从左至右第二至六条泳道的条带大小分别为497bp、581bp、572bp、513bp和1835bp，第一泳道为DNAmarker；
图6为实施例3中其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图；
图7为实施例4中九种不同产物片段的琼脂糖凝胶电泳结果示意图，从左至右第二至七条泳道的条带大小分别为686bp、724bp、700bp、788bp、681bp和1080bp，第九至十一条泳道的条带大小分别为1281bp、1892bp、3136bp，第一泳道和第八泳道为DNA marker；
图8为实施例4中其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所述的“核酸”是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，核苷酸单体由五碳糖、磷酸基和含氮碱基组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。
所示的“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。
本申请一实施方式提供了一种具有polyA序列的核酸的合成方法，包括步骤S01和步骤S02，具体地：
步骤S01：根据目标片段设计多条引物，上述多条引物能够经退火首尾互补连接后延伸而形成线性核酸，该线性核酸包括与目标片段具有相同核苷酸的片段，其中：每条引物的长度为50bp～100bp；上述多条引物中包括尾引物，该尾引物包括连接段和与该连接段连接的Oligo(dT)序列，该连接段用于与上述尾引物相邻的引物互补连接。
在其中一个实施例中，多条引物间经退火而互补连接的片段的长度独立地为12bp～25bp。
步骤S02：在无目标片段作为模板的条件下，将上述多条引物进行PCR扩增，制备具有polyA序列的核酸。
在其中一个实施例中，目标片段的长度为300bp～5000bp。
在其中一个实施例中，目标片段的长度超过2000bp，该合成方法的步骤包括：根据所述目标片段，设计两个以上400bp～800bp的首尾能够相互重叠的小片段并分别合成，其中具有polyA序列的小片段根据步骤S01和步骤S02所述的合成方法合成；及采用重叠延伸PCR将所述小片段拼接形成所述目标片段。
在其中一个实施例中，PCR扩增的程序包括：94℃～98℃预变性1min～5min之后，94℃～98℃变性10s～20s，40℃～45℃退火10s～30s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行22～25个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸1min～5min。
进一步地，PCR扩增的程序包括：98℃预变性4min～5min之后，98℃变性10s～20s，40℃退火10s～20s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸1min～5min。
上述合成方法通过该超长链引物来合成具有polyA序列的核酸，能够较大程度上避免了Oligo退火过程中导致的polyA结构缺失，提高合成具有polyA序列全长的核酸的成功率。
在其中一个实施例中，上述多条引物中包括首引物，该首引物包括第一同源臂，尾引物包括第二同源臂，第一同源臂和第二同源臂用于将上述线性核酸连接到转化载体上；在上述PCR扩增后，还包括以下步骤：将扩增产物通过同源重组的方式连接到转化载体上后，转化、菌落PCR筛选及测序。
可以理解的是，在其他一些实施例中，上述首引物和尾引物不包括同源臂，首引物包括第一酶切位点，尾引物包括第二酶切位点，第一酶切位点和第二酶切位点用于将上述线性核酸连接到转化载体上；在上述PCR扩增后，还包括以下步骤：将扩增产物通过双酶切的方式连接到转化载体上后，转化、菌落PCR筛选及测序。
在其中一个实施例中，转化载体包括线性化载体。
本申请一实施方式还提供了一种用于制备具有polyA序列的核酸的试剂盒，该试剂盒包括：多条引物，多条引物能够经退火首尾互补连接后延伸而形成线性核酸，线性核酸包括与目标片段相同的片段，其中：每条引物的长度为50bp～100bp；多条引物中包括尾引物，该尾引物包括连接段和与该连接段连接的Oligo(dT)序列，连接段用于与尾引物相邻的引物互补连接；及PCR扩增反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。
在其中一个实施例中，多条引物中包括首引物，首引物包括第一同源臂，尾引物包括第二同源臂，第一同源臂和第二同源臂用于将所述线性核酸连接到转化载体上。
上述具有polyA序列的核酸的合成方法和试剂盒，对于polyA序列的合成不再依赖Oligo退火，针对全长polyA序列使用化学方法人工合成超长引物，整个合成过程只需要进行一轮PCR即可获得具有polyA序列的核酸全长，大大简化了操作流程，规避了Oligo退火中繁琐的步骤，降低了时间成本。
2kb以内具有polyA序列的核酸的合成的周期由8天～13天缩短至3天～5天。2kb～5kb的具有polyA序列的核酸合成可将目的核酸拆分进行两轮或多轮重组，合成周期由15天～19天缩短至6天～12天。同时本发明的方法规避了Oligo退火过程中polyA序列缺失严重的问题，能够合成含完整polyA的完整序列，实验数据表明本方法的一次成功率在80％以上。因此，本发明方法能提高具有polyA序列的核酸的合成的效率，且准确率较高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.设计并合成引物
根据如表1中SEQ ID NO:1所示的长度为627bp的目标基因序列1，设计并合成10条引物，从引物1-1(首引物)至引物1-10(尾引物)的序列分别如表1中SEQ ID NO:2～SEQ IDNO:11所示，其中具有Oligo(dT)序列的超长链引物使用24通道单链核酸合成仪合成，其他引物通过常规方法(固相亚磷酰胺三酯法)合成。
2.PCR扩增
设置PCR扩增程序为：98℃预变性5min之后，98℃变性15s，40℃退火15s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸3min。
分别将步骤1中合成的10条引物在同一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物1。
3.连接转化
连接体系为：线性化载体(50ng)、扩增产物1(载体和插入片段摩尔比1:5)、2×SoSoo Mix( SoSoo Cloning Kit，最终体系中为1×)；连接程序为：50℃反应15min。连接完成后得到重组产物1。
转化步骤如下：
1)取100μL冰浴中融化的DH5α-感受态细胞，加入重组产物1，轻轻混匀，冰上静置25min。
2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min(晃动会降低转化效率)。
3)向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌液体培养基(LB)，混匀后于37℃，200RPM复苏1h。
4)吸取适量复苏液均匀涂布到含相应抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
4.菌落PCR筛选及测序
挑选出16个在步骤3制备的平板皿上长出的菌落，进行菌落PCR后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选长度正确的克隆，进行测序检测核苷酸序列。实验周期为三天。
其中，菌落PCR体系为：菌液2μL，正反向引物(20pmol)，2×T5 PCR Mix(TSINGKETSE005 2×T5Super PCR Mix(Colony)，最终体系中为1×)，通过PCR扩增目标序列。
测序结果显示13个克隆序列正确，正确率为81.25％。图1为其中一个正确克隆序列的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左至右第二泳道的条带大小为627bp，图2为其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图(阴影部分为polyA序列)。
表1
实施例2
1.设计并合成引物
将如表2中SEQ ID NO:12所示的长度为1428bp的目标基因序列2，拆分成尽量等长的两段700bp左右的片段A和片段B，其中片段B具有polyA序列。根据片段A(838bp)设计并合成16条引物(引物2-1～引物2-16)，根据片段B(705bp)设计并合成12条引物(引物2-15～引物2-26)，从引物2-1(首引物)至引物2-26(尾引物)的序列分别如表2中SEQ ID NO:13～SEQID NO:38所示，其中具有Oligo(dT)序列的超长链引物使用24通道单链核酸合成仪合成，其他引物通过常规方法合成。
2.PCR扩增
设置PCR扩增程序为：98℃预变性5min之后，98℃变性15s，40℃退火15s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸3min。
分别将步骤1中合成的片段A的16条引物在同一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物A。
分别将步骤1中合成的片段B的10条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物B。
再将扩增产物A(20ng)、扩增产物B(20ng)、引物2-1(20pmol)和引物2-26(20pmol)加入到反应体系中，进行新一轮PCR扩增，得到扩增产物2。
3.连接转化
连接体系为：线性化载体(50ng)、扩增产物2(载体和插入片段摩尔比1:5)、2×SoSoo Mix( SoSoo Cloning Kit，最终体系中为1×)；连接程序为：50℃反应15min。连接完成后得到重组产物2。
转化步骤如下：
1)取100μL冰浴中融化的DH5α-感受态细胞，加入重组产物2，轻轻混匀，冰上静置25min。
2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min(晃动会降低转化效率)。
3)向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌液体培养基(LB)，混匀后于37℃，200RPM复苏1h。
4)吸取适量复苏液均匀涂布到含相应抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
4.菌落PCR筛选及测序
挑选出16个在步骤3制备的平板皿上长出的菌落，进行菌落PCR后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选长度正确的克隆，进行测序检测核苷酸序列。实验周期为3天～5天。
其中，菌落PCR体系为：菌液2μL，正反向引物(20pmol)，2×T5 PCR Mix(TSINGKETSE005 2×T5 Super PCR Mix(Colony)，最终体系中为1×)，通过PCR扩增目标序列。
测序结果显示14个克隆序列正确，正确率为87.5％。图3为三种不同产物片段的琼脂糖凝胶电泳结果示意图，从左至右第二至四条泳道的条带大小分别为838bp(片段A)、705bp(片段B)和1428bp(全长片段)。图4为其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图(阴影部分为polyA序列)。
表2
实施例3
1.设计并合成引物
将如表3中SEQ ID NO:39所示的长度为1835bp的目标基因序列3，拆分成尽量等长的四段500bp左右的片段C、片段D、片段E和片段F，其中片段F具有polyA序列。根据片段C(497bp)设计并合成10条引物(引物3-1～引物3-10)，根据片段D(581bp)设计并合成12条引物(引物3-9～引物3-20)，根据片段E(572bp)设计并合成12条引物(引物3-19～引物3-30)，根据片段F(513bp)设计并合成8条引物(引物3-29～引物3-36)，从引物3-1(首引物)至引物3-36(尾引物)的序列分别如表3中SEQ IDNO:40～SEQ ID NO:75所示，其中具有Oligo(dT)序列的超长链引物使用24通道单链核酸合成仪合成，其他引物通过常规方法合成。
2.PCR扩增
设置PCR扩增程序为：98℃预变性5min之后，98℃变性15s，40℃退火15s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸3min。
分别将步骤1中合成的片段C的10条引物在同一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物C。
分别将步骤1中合成的片段D的12条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物D。
分别将步骤1中合成的片段E的12条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物E。
分别将步骤1中合成的片段F的8条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物F。
再将扩增产物C、扩增产物D、扩增产物E、扩增产物F、引物3-1(20pmol)和引物3-36(20pmol)加入到反应体系中，进行新一轮PCR扩增，得到扩增产物3。
3.连接转化
连接体系为：线性化载体(50ng)、扩增产物3(载体和插入片段摩尔比1:5)、2×SoSoo Mix(TreliefSoSoo Cloning Kit，最终体系中为1×)；连接程序为：50℃反应15min。连接完成后得到重组产物3。
转化步骤如下：
1)取100μL冰浴中融化的DH5α-感受态细胞，加入重组产物3，轻轻混匀，冰上静置25min。
2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min(晃动会降低转化效率)。
3)向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌液体培养基(LB)，混匀后于37℃，200RPM复苏1h。
4)吸取适量复苏液均匀涂布到含相应抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
4.菌落PCR筛选及测序
挑选出14个在步骤3制备的平板皿上长出的菌落，进行菌落PCR后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选长度正确的克隆，进行测序检测核苷酸序列。实验周期为3天～5天。
其中，菌落PCR体系为：菌液2μL，正反向引物(20pmol)，2×T5 PCR Mix(TSINGKETSE005 2×T5Super PCR Mix(Colony)，最终体系中为1×)，通过PCR扩增目标序列。
测序结果显示10个克隆序列正确，正确率为71.42％。图5为五种不同产物片段的琼脂糖凝胶电泳结果示意图，从左至右第二至六条泳道的条带大小分别为497bp(片段C)、581bp(片段D)、572bp(片段E)、513bp(片段F)和1835bp(全长片段)。图6为其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图(阴影部分为polyA序列)。
表3
实施例4
1.设计并合成引物
将如表4中SEQ ID NO:76所示的长度为4227bp的目标基因序列4，拆分成尽量等长的七段700bp左右的片段G、片段H、片段I、片段J、片段K、片段L和片段M，其中片段M具有polyA序列。根据片段G(686bp)设计并合成12条引物(引物4-1～引物4-12)，根据片段H(724bp)设计并合成16条引物(引物4-11～引物4-26)，根据片段I(700bp)设计并合成16条引物(引物4-25～引物4-40)，根据片段J(788bp)设计并合成18条引物(引物4-39～引物4-56)，根据片段K(681bp)设计并合成16条引物(引物4-55～引物4-70)，根据片段L(661bp)设计并合成16条引物(引物4-69～引物4-84)，根据片段M(624bp)设计并合成12条引物(引物4-83～引物4-94)，从引物4-1(首引物)至引物4-94(尾引物)的序列分别如表4中SEQ IDNO:77～SEQ ID NO:170所示，其中具有Oligo(dT)序列的超长链引物使用24通道单链核酸合成仪合成，其他引物通过常规方法合成。
2.PCR扩增
设置PCR扩增程序为：98℃预变性5min之后，98℃变性15s，40℃退火15s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸3min。
分别将步骤1中合成的片段G的12条引物在同一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物G。
分别将步骤1中合成的片段H的16条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物H。
分别将步骤1中合成的片段I的16条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物I。
分别将步骤1中合成的片段J的18条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物J。
分别将步骤1中合成的片段K的16条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物K。
分别将步骤1中合成的片段L的16条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物L。
分别将步骤1中合成的片段M的12条引物在另一反应体系中加入20pmol，再加入1.1×T6 mix(TSINGKE TSE101金牌Mix(green))进行一轮PCR扩增，得到扩增产物M。
再将扩增产物G、扩增产物H、扩增产物I、扩增产物J和扩增产物K引物4-1(20pmol)和引物4-70(20pmol)加入到反应体系中，进行新一轮PCR扩增，得到扩增产物G-K。
再将扩增产物L、扩增产物M、引物4-69(20pmol)和引物4-94(20pmol)加入到反应体系中，进行新一轮PCR扩增，得到扩增产物L-M。
3.连接转化
连接体系G-K为：线性化载体(50ng)、扩增产物G-K(载体和插入片段摩尔比1:5)、2×SoSoo Mix(SoSoo Cloning Kit，最终体系中为1×)；连接程序为：50℃反应15min。连接完成后得到重组产物G-K。
连接体系L-M为：线性化载体(50ng)、扩增产物L-M(载体和插入片段摩尔比1:5)、2×SoSoo Mix(SoSoo Cloning Kit，最终体系中为1×)；连接程序为：50℃反应15min。连接完成后得到重组产物L-M。
转化步骤如下：
1)分别取100μL冰浴中融化的DH5α-感受态细胞，分别加入重组产物G-K和重组产物L-M，轻轻混匀，冰上静置25min。
2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min(晃动会降低转化效率)。
3)向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌液体培养基(LB)，混匀后于37℃，200RPM复苏1h。
4)吸取适量复苏液均匀涂布到含相应抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
4.菌落PCR筛选及测序
挑选出在步骤3制备的平板皿上长出的菌落，进行菌落PCR后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选长度正确的克隆，进行测序检测核苷酸序列。挑选出测序正确的克隆G-K和克隆L-M。
其中，菌落PCR体系为：菌液2μL，正反向引物(20pmol)，2×T5 PCR Mix(TSINGKETSE005 2×T5Super PCR Mix(Colony)，最终体系中为1×)，通过PCR扩增目标序列。
5.再次PCR扩增
将测序正确的克隆G-K和克隆L-M、引物4-1(20pmol)和引物4-94(20pmol)加入到反应体系中，进行新一轮PCR扩增，得到扩增产物4。
6.连接转化
连接体系为：线性化载体(50ng)、扩增产物4(载体和插入片段摩尔比1:5)、2×SoSoo Mix( SoSoo Cloning Kit，最终体系中为1×)；连接程序为：50℃反应15min。连接完成后得到重组产物G-K。
转化步骤如下：
1)分别取100μL冰浴中融化的DH5α-感受态细胞，分别加入重组产物4，轻轻混匀，冰上静置25min。
2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min(晃动会降低转化效率)。
3)向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌液体培养基(LB)，混匀后于37℃，200RPM复苏1h。
4)吸取适量复苏液均匀涂布到含相应抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
7.菌落PCR筛选及测序
挑选出16个在步骤3制备的平板皿上长出的菌落，进行菌落PCR后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选长度正确的克隆，进行测序检测核苷酸序列。
其中，菌落PCR体系为：菌液2μL，正反向引物(20pmol)，2×T5 PCR Mix(TSINGKETSE005 2×T5Super PCR Mix(Colony)，最终体系中为1×)，通过PCR扩增目标序列。
整个实验周期为6天～12天。测序结果显示13个克隆序列正确，正确率为81.25％。图7为九种不同产物片段的琼脂糖凝胶电泳结果示意图，从左至右第二至七条泳道的条带大小分别为686bp、724bp、700bp、788bp、681bp和1080bp(片段L～片段M)，第九至十一条泳道的条带大小分别为1281bp(片段G～片段H)、1892bp(片段I～片段K)、3136bp(片段G～片段K)。图8为其中一个正确克隆序列的polyA序列的一代测序结果图(阴影部分为polyA序列)。
表4
从以上实施例可知，2kb以内具有polyA序列的核酸合成的周期由8天～13天缩短至3天～5天。2kb～5kb的具有polyA序列核酸合成可将目的核酸拆分进行两轮或多轮重组，合成周期由15天～19天缩短至6天～12天。同时本发明的方法规避了Oligo退火过程中polyA序列缺失严重的问题，能够合成含完整polyA的完整序列，实验数据表明本方法的一次成功率在80％以上。因此，本发明方法能提高具有polyA序列的核酸合成的效率，且准确率较高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种具有polyA序列的核酸的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据目标片段设计多条引物，所述多条引物能够经退火首尾互补连接后延伸而形成线性核酸，所述线性核酸包括与所述目标片段具有相同核苷酸序列的片段，其中：每条引物的长度为50bp～100bp；所述多条引物中包括尾引物，所述尾引物包括连接段和与所述连接段连接的Oligo(dT)序列，所述连接段用于与所述尾引物相邻的引物互补连接；及
在无所述目标片段作为模板的条件下，将所述多条引物进行PCR扩增，制备具有polyA序列的核酸。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，多条引物间经退火而互补连接的片段的长度独立地为12bp～25bp。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述目标片段的长度为300bp～5000bp。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述目标片段的长度超过2000bp，所述合成方法的步骤包括：
根据所述目标片段，设计两个以上400bp～800bp的首尾能够相互重叠的小片段并分别合成，其中具有polyA序列的小片段根据权利要求1所述的合成方法合成；及
采用重叠延伸PCR将所述小片段拼接形成所述目标片段。
5.根据权利要求1～4任一项所述的合成方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：
94℃～98℃预变性1min～5min之后，94℃～98℃变性10s～20s，40℃～45℃退火10s～30s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行22～25个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸1min～5min。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：
98℃预变性4min～5min之后，98℃变性10s～20s，40℃退火10s～20s，72℃延伸，延伸时间为1min/2kb；共进行23个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环升高1℃；最后，72℃延伸1min～5min。
7.根据权利要求1～4和6中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述多条引物中包括首引物，所述首引物包括第一同源臂，所述尾引物包括第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂用于将所述线性核酸连接到转化载体上；在所述PCR扩增后，还包括以下步骤：将扩增产物通过同源重组的方式连接到转化载体上后，转化、菌落PCR筛选及测序。
8.根据权利要7所述的合成方法，其特征在于，所述转化载体包括线性化载体。
9.一种用于制备具有polyA序列的核酸的试剂盒，其特征在于，包括：
多条引物，所述多条引物能够经退火首尾互补连接后延伸而形成线性核酸，所述线性核酸包括与目标片段相同的片段，其中：每条引物的长度为50bp～100bp；所述多条引物中包括尾引物，所述尾引物包括连接段和与所述连接段连接的Oligo(dT)序列，所述连接段用于与所述尾引物相邻的引物互补连接；及
PCR扩增反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述多条引物中包括首引物，所述首引物包括第一同源臂，所述尾引物包括第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂用于将所述线性核酸连接到转化载体上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211708972.7A CN118308469A (zh) | 2022-12-29 | 2022-12-29 | 具有polyA序列的核酸的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211708972.7A CN118308469A (zh) | 2022-12-29 | 2022-12-29 | 具有polyA序列的核酸的合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118308469A true CN118308469A (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=91732401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211708972.7A Pending CN118308469A (zh) | 2022-12-29 | 2022-12-29 | 具有polyA序列的核酸的合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118308469A (zh) |
-
2022
- 2022-12-29 CN CN202211708972.7A patent/CN118308469A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101467969B1 (ko) | 핵산분자의 제조방법 | |
| CN102321612A (zh) | 工业化的基因合成方法 | |
| AU3798393A (en) | Exchangeable template reaction | |
| AU2009301367A1 (en) | Process of clean cloning | |
| KR101600899B1 (ko) | 초병렬적 핵산 합성법을 통한 dna 라이브러리의 동시 합성 방법 | |
| US20030152984A1 (en) | Method for the manufacture of DNA | |
| WO2018006567A1 (zh) | 一种高效的dna接头连接方法 | |
| WO2003033718A1 (en) | Synthesis of oligonucleotides on solid support and assembly into doublestranded polynucleotides | |
| KR20020007359A (ko) | 프라이머 쌍들의 증폭 및 시퀀싱 및 그 이용 | |
| CN113481194A (zh) | 一种dna的合成方法 | |
| US9695417B2 (en) | Method for large-scale synthesis of long-chain nucleic acid molecule | |
| US20020164635A1 (en) | Novel methods of directed evolution | |
| CN118308469A (zh) | 具有polyA序列的核酸的合成方法 | |
| AU2002254773A1 (en) | Novel methods of directed evolution | |
| CN113832147B (zh) | 一种高效的大片段dna合成与扩增的pcr引物、方法及应用 | |
| CN111004813A (zh) | 一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用 | |
| WO2019044820A1 (ja) | ２本鎖ｄｎａ断片を製造する方法 | |
| CN111394379B (zh) | 基于重组酶和超保真dna聚合酶的大载体dna的定点突变方法 | |
| CN114592022A (zh) | 一种基于dna模板的长链tna合成方法 | |
| CN111434771A (zh) | 一种线性化载体自重组的质粒构建方法 | |
| EP3759243A1 (en) | Methods and compositions for enriching nucleic acids | |
| WO1997016566A1 (en) | Sequence modification of oligonucleotide primers to manipulate non-templated nucleotide addition | |
| CN118325933B (zh) | 一种简单且高效的慢病毒载体文库的构建方法、慢病毒载体文库及其应用 | |
| Chutia et al. | Recent developments in RACE-PCR for the full-length cDNA identification | |
| US20090305359A1 (en) | Method for producing circular duplex polynucleotides from linear duplex polynucleotides and applications thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |