KR20020007359A - 프라이머 쌍들의 증폭 및 시퀀싱 및 그 이용 - Google Patents

프라이머 쌍들의 증폭 및 시퀀싱 및 그 이용 Download PDF

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Abstract

올리고뉴클레오티드 앵커 및 프라이머를 포함하는 증폭 프라이머 쌍. 상기 앵커는 역전사효소 및 DNA 폴리머라제의 기질이 아닌 핵산 화학성질을 갖고 DNA 합성을 프라이밍할 수 없는 3'-말단을 갖는다. 상기 프라이머는 역전사효소 및 DNA 합성의 기질인 핵산 화학성질을 갖는다. 상기 앵커 및 프라이머는 각각, 서로 결합하여 스템 구조를 형성할 수 있도록 상보성인 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 그 스템 구조는 일반 프라어미에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 프라이머 쌍(역방향 쌍)은 제1 가닥 합성을 위해 사용되는 반면, 제2 프라이머쌍(전방향 쌍)은 제2 가닥 합성을 위해 사용된다. 일반 프라이머는 증폭 반응을 지원하며 최종 산물 대부분의 최종 산물을 생산한다.

Description

프라이머 쌍들의 증폭 및 시퀀싱 및 그 이용{Amplification and Sequencing Primer Pairs and Use thereof}
폴리머라제 사슬 반응(PCR)은 DNA 증폭 방법으로서 유전자 서열의 반대쪽 말단들에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 증가된 온도에서 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 존재하에서 변성, 어닐링 및 신장의 반복 사이클에 의해 그 서열을 증폭하는 데에 이용된다. 그러나, 이 방법은 이들 영역에 혼성화할 수 있는 프라이머를 설계하기 위해서 그 유전자의 반대쪽 말단들의 서열을 알고 있는 것이다. 따라서, 그 때 마다 유전자가 증폭되고 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 합성되어야 한다. 대안적으로, 프라이머를 손에 넣기를 원한다면 수백만 또는 수십억개의 종래 올리고뉴클레오티드들의 고정된 라이브러리를 이용하여 대략 100,000개의 각 인간 유전자를 성공적으로 표적하고 증폭할 수 있을 것이다. 수백만개의 PCR 프라이머의 순서가 정렬된 라이브러리는 현재 사용가능한 화학적, 물리적 그리고 구성적 수단들의 한계를 넘는 것이다.
게놈내에 존재하는 모든 표적 서열에 결합할 수 있는 합리적인 수의 프라이머를 포함하는 미리-제조된 PCR 프라이머 라이브러리가 필요하다.
본 발명은 두-구성요소의 조합적 PCR 프라이머 쌍들 및 핵산 서열의 증폭 및 시퀀싱에 있어서의 그 이용에 관한 것이다.
도1a 및 도1b는 각각 전방향 및 역방향 증폭 프라이머 쌍의 개략도이다. 각 프라이머 쌍은 그 도면에 나타낸 프라이머 쌍을 형성하도록 조합되는 개개 올리고뉴클레오티드의 라이브러리로부터 제조된다. 그 프라이머 쌍의 한 구성요소를 앵커(전방향 앵커 = FA; 역방향 앵커 = RA)라고 부르고, 다른 구성요소는 프라이머(전방향 프라이머= FP; 역방향 프라이머 = RP라고 부른다. 그 두 구성요소는 스템이라 불리우는 상보적인 올리고뉴클레오티드의 한 영역에 의해 비-공유결합되어 있다. 앵커는 링커에 의해 스템에 연결될 수 있다. 전방향 일반 프라이머(FUP) 및 역방향 일반 프라이머(RUP) 각각이 전방향 및 역방향 스템에 상보적이다. 그 프라이머 쌍은 적절한 개개의 올리고뉴클레오티드 서열을 선택함으로써 특정 유전자 서열을 증폭하기 위해 다듬어진다. 역방향 프라이머는 제1 가닥 cDNA 합성을 프라이밍하고, 전방향 프라이머는 제2 가닥 cDNA 합성을 프라이밍한다.
도2는 선택적 링커, 스템, 선택적 꼬리 및 일반 프라이머를 나타내는 증폭 프라이머 쌍의 개략도이다.
도3은 개개의 올리고뉴클레오티드의 한 라이브러리로부터 제조된 증폭 프라이머 쌍을 사용하는 본 발명의 방법에 대한 개략도이다. RA 및 FA는 최대 결합 친화도를 위해 복수의 변형된 염기 및 링키지를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며 핵산 증폭 반응을 프라이밍할 수 다(즉, 3'-OH기를 포함하지 않음). 이러한 구성요소들은 플렉시블 링커를 포함할 수 있다. RP 및 FP는 증폭 프라이머로서 기능하고, 결과된 DNA 분자안으로 통합된다. 제1 가닥 cDNA 합성은 RP에 의해 프라이밍되고, 제2 가닥 cDNA 합성은 FP에 의해 프라이밍된다. FA 및 RA는 증폭 반응 동안 치환된다. RUP 및 FUP는 각각 RP 및 FP의 일부에 상보적인 일반 프라이머들로서, 그것은 증폭된 cDNA 안으로 통합된다. RUP 및 FUP는 각각 역방향 및 전방향 생성물을 생산한다. 최종 생성물은 RUP 및 FUP를 포함하는 이중 가닥 앰플리콘이다.
본 발명의 개요
본 발명의 한 구체예는 올리고뉴클레오티드 앵커 및 프라이머를 포함하는 증폭 프라이머 쌍으로서, 그 앵커는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질이 아닌 핵산 화학성질을 갖고/거나 DNA 합성을 프라이밍 할 수 없는 3'-말단을 갖고; 그 프라이머는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질인 핵산 화학성질을 갖으며; 그 앵커 및 그 프라이머는 각각 서로 결합하여 일반 프라이머에 상보적인 영역을 포함하는 스템 구조를 형성할 수 있는 상보적인 뉴클레오티드 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 바람직한 구체예의 또다른 관점에서, 그 앵커 서열 및 그 스템 영역은 플렉시블(flexible) 링커(linker)에 의해 연결되어 있다. 이 바람직한 구체예의 또 다른 관점에서, 그 플렉시블 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 그 프라이머는 그 앵커의 스템 영역 길이 이상 확장한 꼬리 영역을 포함한다. 이 바람직한 구체예의 한 관점에서, 그 프라이머는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한다. 이 바람직한 구체예에의 또다른 관점에서, 그 앵커는 하나 이상의 변형된 백본 링키지를 포함한다. 상기 앵커 및 프라이머는 각각 6 내지 24의 염기길이인 것이 유용하다. 바람직하게는 그 프라이머 쌍은 스템 구조의 영역에 상보적인 일반 프라이머와 결합한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 올리고뉴클레오티드 앵커 및 프라이머를 포함하는 시퀀싱 프라이머 쌍으로서, 그 앵커는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질이 아닌 핵산 화학성질을 갖고/거나 핵산 합성을 프라이밍할 수 없는 3'-말단을 갖고; 그 프라이머는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질이 되는 핵산 화학성질을 갖으며; 그 앵커 및 프라이머는 각각 서로 결합하여 스템 구조를 형성할 수 있는 상보적 뉴클레오티드 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 바람직한 구체예의 한 관점에서, 그 앵커 서열 및 스템 영역은 플렉시블 링커에 의해 연결된다. 이 바람직한 구체예의 한 관점에서 그 플렉시블 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 그 프라이머는 그 앵커의 스템 영역 길이 이상으로 확장되는 꼬리 영역을 포함한다. 이 바람직한 구체예의 한 관점에서, 그 프라이머는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한다. 이 바람직한 구체예의 또 다른 관점에서 그 앵커는 하나 이상의 변형된 백본 링키지를 포함한다. 상기 앵커 및 프라이머는 각각 6 내지 24 염기길이인 것이 유익하다. 바람직하게는, 그 프라이머 쌍은 스템 구조의 한 영역에 상보적인 일반 프라이머와 결합한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 증폭하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 전방향 앵커(FA), 전방향 프라이머(FA), 역방향 앵커(RA), 역방향 프라이머(RP), 전방향 일반 프라이머(FUP) 및 역방향 일반 프라이머(RUP)와 핵산 분자를 조합하는 단계로서, FA/FP는 상보적인 스템 영역들의 결합을 통해 제1 프라이머 쌍을 형성하고 RA/RP는 상보적인 스템 영역들의 결합을 통해 제2 프라이머 쌍을 형성하며, RUP는 RA/RP 스템 영역과 상보적이며, 그 프라이머 쌍들은 RNA 서열을 플랭킹하도록 선택된 것을 특징으로 하는 단계; 및 효소-매개 증폭을 통해 상기 핵산 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 그 핵산 서열은 치료적 유전자 산물을 코딩하는 것이 유익하다. 바람직하게는, 그 핵산 서열은 DNA 또는 RNA이다. 이 바람직한 구체예의 한 관점에서 그 효소-매개 증폭은 PCR 증폭이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 원하는 DNA 서열을 증폭하거나 시퀀싱하는 데에 이용하기 위한 증폭 및 시퀀싱 프라이머 쌍을 제공한다. 이러한 프라어미 쌍은 프라이머 라이브러리에 존재하는 가능한 수의 미리-합성된 구성요소들을 사용하여 재빨리 제조되어서, 핵산 합성 및 검출에 이용된다. 구성요소들의 라이브러리는 필요시 어떤 원하는 프라이머 쌍을 형성하는 데에 적합하다. 어떤 원하는 핵산 서열을 증폭하기 위해서, 두 증폭 프라이머 쌍이 사용되는데, 각각은 개개 올리고뉴클레오티드 구성성분들로부터 제조된다. 모든 가능한 6-머(mer), 8-머, 12-머 또는 다른 길이의 올리고뉴클레오티드가 종래의 자동화된 DNA 시퀀싱에 의해 합성되고, 그것들은 6-머, 8-머, 12-머(또는 다른 길이의 올리고머)의 제2 세트에 상보적인 영역을 가져서, 그 두프라이머들이 생체외에서 조합되면 그들의 상보 영역에서 수소결합(왓슨-크릭 쌍형성)에 의해 셀프-어셈블링한다. 본 발명의 한 구체예에서, 앵커 및 프라이머 올리고뉴클레오티드는 각각 6 내지 약 24 염기길이이다.
모든 가능한 8-머는, 예컨대 48(65,536) 올리고뉴클레오티드의 보통-크기의 라이브러리 내에 나타낼 수 있다. 한편, 모든 가능한 16-머는 416(4×109) 올리고뉴클레오티드의 수많은 라이브러리가 필요할 것이다.
"올리고뉴클레오티드"라는 용어는, DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드로 구성된 분자를 말한다.
"올리고뉴클레오티드 유사체"란 올리고뉴클레오티드 유사 구조를 포함한 분자를 말하는 것으로서, 예컨대, 한 백본과 일련의 염기를 갖는 것을 말하며, 그 백본 및/또는 하나 이상의 염기는 자연적 DNA 또는 RNA에서는 발견되지 않는 적어도 하나의 염기 또는 백본 구조를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 유사체의 예로서는, DNA, RNA, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 메톡시에틸 포스포로티오에이트, 데옥시이노신 또는 데옥시 5-니트로인돌 등을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
여기서 사용되는 "백본"이라는 용어는 한정된 간격을 두고 부착된 복수개의 염기들을 지지할 수 있는 일반적으로 선형인 분자를 말한다. 바람직하게는, 그 백본은 그 지지된 표적 폴리뉴클레오티드의 염기들 간에 혼성화를 수행하는 기하학적 구조로 그 염기들을 지지할 것이다.
"비-자연발생적 염기"는 A, C, G, T 및 U 이외의 염기를 말하는 것으로서, 예컨대 자연적 염기 또는 비-자연발생적 염기에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 뿐만 아니라 축퇴성 및 보편적 염기들을 포함하는 것이다. 비-자연발생적 염기의 예로서, 프로핀일시토신, 프로핀일유리딘, 디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 7-데아자아데노신 및 7-데아자구아닌을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"보편적 염기"라는 용어는 어떤 염기로도 치환될 수 있는 부분을 말한다. 보편적 염기는 혼성화에 필요하지 않지만 혼성화로부터 현저히 벗어나 있어서도 아니된다. 보편적 염기의 예로서 이노신, 5-니트로인돌 및 4-니트로벤즈이미다졸을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"축퇴성 염기"라는 용어는 퓨린 또는 피리미딘 중 어느 하나(그러나 둘다는 아님) 염기쌍 형성할 수 있는 부분을 말한다. 축퇴성 염기의 예로서 6H, 8H-3,4-디히드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온("P", 피리미딘 모의체) 및 2-아미노-6-메톡시아미노퓨린("K" 퓨린 모의체)를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"표적 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 DNA 또는 RNA를 말하는 것으로서 예컨대 생체 내에서 발견되는 것으로서, 프라이머 쌍이 결합 또는 반응하고자 하는 대상을 말한다.
"라이브러리"라는 용어는 다양한 다른 분자들을 형성하기 위해 조인할 수 있는 구성요소들의 집합을 말한다. 본 발명의 실시를 위해, 라이브러리는 적어도 두 세트의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그 라이브러리는 제1 세트의 올리고머가 제2 세트의 올리고머와 커플지을 수 있도록 고안된다. 이 커플링은 바람직하게는두 올리고머의 첨가시 자발적으로 발생한다.
여기에서 언급한 "플렉시블 링커"라는 용어는, 커플링 부분에 결합 도메인을 공유적으로 결합시킬 수 있는 반응성 화학기를 말한다. 이러한 링커는 표적 핵산의 근접한 영역에 결합하는 두 결합 도메인 간에 커플링 부분을 개입시킴으로써 발생되는 압력을 경감시킨다. 그 플렉시블 링커는 바람직하게는 그 커플링 부분의 벌크가 혼성화, RNase 인지, 및/또는 복합체 상에서의 RNase 활성을 방해하지 않도록 하기 위해 충분한 길이를 가지며 플렉시블하고, 친수성인 것으로 선택된다. 그 링커는 결합 도메인의 터미널(terminal) 염기에 연결되거나, 말단(end)으로부터 하나 이상의 염기와 연결될 수도 있다. 적당한 플렉시블 링커는 전형적으로 하나 이상의 원자를 갖는 사슬 내에서 선형 분자이고, 더 전형적으로는 1 내지 12개 탄소 원자(및/또는 다른 백본 분자) 길이의 유기 폴리머 사슬이다. 플렉시블 링커의 예로서 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르 등을 들 수 있다.
"변형된 백본 링키지"란 용어는, 포스포디에스테르 링키지가 아닌 뉴클레오시드간 링키지를 말한다. 이러한 링키지의 예로서 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 모르폴리노스, MMI, 펩티드 핵산(PNA), 3'-아미데이트 등을 들 수 있다.
"스템"이라는 용어는, 두 올리고뉴클레오티드또는 올리고뉴클레오티드 유사체 커플링 부분을 커플링시킴으로써 에 의해서 형성되는 구조를 말한다.
도 1a-1b에 있어서, 두 프라이머 쌍, 전방향 쌍 및 후방향 쌍이 사용된다.각 쌍은 스템 영역 내에서 상보적 염기쌍 형성을 통해 결합된 앵커 및 프라이머를 포함한다. FA, FP, RA 및 RP의 서열은 증폭될 바로 그 핵산 서열 또는 유전자 서열에 기초하여 프라이머 라이브러리로부터 선택된다. FUP 및 RUP 프라이머 서열은 유전자-특이적이지 않다. 이러한 프라이머들의 서열들은 각각 통상의 전방향 스템 및 역방향 스템에 기초한다. FUP는 FP 스템 영역의 전부 또는 일부와 혼성화하고, RUP는 RP 스템 영역의 전부 또는 일부와 혼성화한다. 도2에 나타낸 "꼬리" 영역은 선택적이다. FA 및 FP는 전방향 스템 서열의 염기 혼성화를 통해 결합하고, RA 및 RP도 같은 방식으로 결합한다. 그 스템 서열은 매개할 FUP 및 RUP 내의 작고, 중첩하는 상보 영역에 대해서는 너무나 길다. FA는 상보적 스템 서열에 의해 FP와 스템을 형성한다(짧은 듀플렉스 영역을 형성하기 위해 혼성화한다). 스템 형성은 어떤 전방향 및 역방향 라이브러리 멤버들 간에는 불가능하다. 따라서, FA는 단지 FP하고만, RA는 단지 RP와만 쌍형성할 것이다.
프라이머 쌍의 앵커 구성요소는, 바람직하게는, 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 축퇴성 염기 및/또는 보편적 염기를 포함하고, 또한 하나 이상의 변형된 백본 링키지를 포함할 수도 있어서, 원하는 뉴클레오티드 서열에 대한 최대의 결합 친화도를 갖게 된다. 그 앵커는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질이 되는 어떤 핵산 화학성질(변형된 염기 및/또는 링키지)를 갖고/거나 DNA 합성을 프라이밍할 수 있는 3'-OH기와 같은 화학기를 포함하지 않는다. 대조적으로, 프라이머 구성요소는 더욱 더 "DNA에 유사"하고, 실질적으로 자연발생적 올리고뉴클레오티드(A, G, T, C, U) 및 포스포디에스테르 링키지를 포함하여, 역전사효소 및 DNA 폴리머라제의 주형으로서 기능하게 된다. 그 프라이머 구성요소들은 역전사효소 및 DNA 폴리머라제의 기질로서 작용하는 핵산 화학성질(자연적 염기, 비자연적 염기, 포스포디에스테르 링키지, 변형된 백본 링키지)을 포함한다. 역전사효소 및 DNA 폴리머라제의 기질로서 기능하는 원하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
앵커 서열 및 프라이머 서열이 선택적 플렉시블 링커에 의해 스템 영역에 조인될 수 있다(도2). 링커는 앵커가 긴장을 경감시키고, 결합 친화도를 증가시켜 어셈블된 앵커/프라이머 복합체의 프라이머/폴리머라제 기질 활성을 향상시키는 데에 더 적합할 것이다. 프라이머는, 비록 폴리머라제 활성을 유지하기 위해 사용되지만, 또한 링커를 포함할 수 있다.
증폭될 서열에 대한 지식을 가지고, FA, FP, RA 및 RP 올리고뉴클레오티드가 라이브러리로부터 선택되고 조합되어 프라이머를 형성한다. 유전자 서열-특이적 증폭 프라이머 쌍은 일반 프라이머를 포함하는 완전한 증폭(예컨대, PCR) 반응 버퍼 내에서 혼합된다. FA/FP 및 RA/RP의 비는 전형적으로 약 1 내지 10이하이다. 따라서, FA/FP 및 RA/RP는 전형적으로 제1 및 제2 가닥 cDNA 합성을 단지 촉매한다. RA/RP는 제1 가닥 합성에 사용되는 반면, FA/FP는 제2 가닥 합성에 사용된다(도3). 반대로, FUP 및 RUP는 증폭 반응을 유지하여 다수의 최종 앰플리콘 생성물을 생산한다. FA 및 FP는 전방향 스템 서열의 염기 혼성화에 의해서만 서로 즉시 결합되고 RA 및 RP 역시 같은 방식으로 서로 결합된다.
증폭될 주형 RNA 혼합물, 전형적으로 총 세포 RNA 또는 폴리(A) + RNA가 반응에 첨가되고 표적 RNA가 RA/RP 복합체 어셈블리에 의해 형성된 유전자 서열-특이적 서열의 혼성화에 기초하여 RA/RP 복합체에 의해 결합된다. 전형적으로 결합된 역전사효고/열안정성 DNA 폴리머라제 효소 혼합물 (즉,Tag폴리머라제)이 반응에 첨가되어 RNA의 역전사에 적합한 온도(통상 37-55℃)에서 인큐베이션시켜 제1 cDNA 가닥을 생산한다. 제1 가닥 cDNA 합성은 RA/RP 구조에 의해 프라이밍되고 역전사효소에 의해 RP의 3'-OH기가 확장된다. RP는 그 반응에 의해 소비되고 제1 가닥 cDNA 생성물의 5'-말단이 생긴다(도3). RA는 제2-가닥 cDNA 합성에 의해 치환되어 이어지는 증폭에서는 참여하지 않는다.
제2 가닥 cDNA 합성은 FA/FP에 의해 프라이밍되고, FP의 3'-OH는 DNA 폴리머라제(열안정성 또는 그렇지 않음)에 의해 확장된다. FP는 그 반응에 의해 소비되고 제2 가닥 생성물(또는 "코딩" 또는 "센스" 가닥으로 알려진)의 5'-말단이 된다. FA는 최종 "넌센스" 가닥 합성 동안 치환되어 이어지는 증폭 단계에서는 참여하지 않는다.
표준 써모사이클 프로그램이 이중 가닥 DNA 생성물을 증폭하기 위해 사용된다. 간단히, 그 반응 온도는 핵산을 변성시키기 위해 90 내지 95℃로 높아진다. 그런 다음 그 온도는 50 내지 65℃로 낮아져서 프라이머가 상보적인 프라이밍 사이트와 혼성화할 수 있도록 하고, 그 다음에 온도가 약 68 내지 74℃로 올라서 열안정 DNA 폴리머라제가 주형 DNA 분자를 따라 혼성화된 프라이머를 확장하도록 한다. 각 온도의 시간은 약 15초 내지 2분이다. 이러한 단계들은 이중 가닥 DNA를 증폭시키기 위하여 약 25 내지 35회 반복된다.
제1 변성 사이클 후에, FA/FP 복합체는 제1 가닥 cDNA와 혼성화하고 DNA 폴리머라제에 의해 신장되어 제2 가닥의 cDNA를 생산하여, 이중 가닥 cDNA 생성물을 얻는다. FUP 및 RUP는 개시 RNA 서열과 매치되지 않으므로 그 반응에는 제1 및 제2 가닥 cDNA 합성이 일어날 때 까지는 참여하지 않는다는 것을 꼭 명심해야 한다.
제1 및 제2 가닥 프라이밍 및 합성, 그리고 최종 앰플리콘 프라이밍 및 합성으로 FP 및 RP가 소비된다. 폴리머라제에 의한 프라이밍기, 전형적으로 3'-OH의 신장에 의해 FP 및 RP는 생성물 cDNA의 말단과 공유적으로 결합한다. cDNA의 5' 말단으로서 FP 및 RP 스템 서열의 통합으로 인해 FUP 및 RUP 각각에 대한 프라이밍 사이트가 생겨서 이어지는 cDNA 증폭을 결합시키고 프라이밍시킬 수 있다. FUP 및 RUP는 그 반응에 의해 소비되어 최종 이중 가닥 DNA 앰플리콘이 생성된다(도3). 또한, FP, RP, FUP 및/또는 RUP는 "검출" 부분을 부착하여 cDNA 또는 최종 DNA 증폭 생성물의 검출 및/또는 포착을 용이하게 할 수 있다. 적합한 "검출" 부분은 효소 표지, 형광 표지 및 방사선 표지를 포함한다.
수행된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 라이브러리는 제1 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 제2 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, 그 프라이머들은 스템 영역을 가져 프라이머들을 커플링시켜 증폭 프라이머 쌍을 형성시킨다.
관념적으로 증폭 프라이머를 두 조각으로 분리함으로써, 필요한 복수개의 증폭 프라이머를 합성하는 대신에 포괄적인 증폭 프라이머 라이브러리가 미리 제조될 수 있다. 이 프라이머 쌍 시스템은 증가된 결합 친화도로 인해 단일 프라이머 시스템에 유익하다. 4개의 자연적 염기를 사용한 모든 가능한 17-머 올리고뉴클레오티드의 완전한 라이브러리는 417(또는 약 1.7×1010)로 구성될 것이다. 두 구성성분으로 프라이머를 제공함으로써, 예컨대, 8-머의 한 라이브러리와 9-머의 한 라이브러리와 같이 제공함으로써 원하는 것을 재빨리 어셈블할 수 있는데, 필요로되는 그 라이브러리의 크기는 48+ 48, 도는 327,650 분자로 감소된다. 하나 이상의 보편적 또는 축퇴성 염기로 자연적 염기의 일부를 치환함으로써 라이브러리의 필요한 복잡성은 더욱 더 감소된다. 따라서, 예컨대, 9-머 라이브러리가 5개의 보편적 염기와 그 다음에 4개의 자연적 염기로 구성된다면, 구성성분의 수는 44(256)으로 떨어지고 총 라이브러리 크기는 48+ 44, 약 66,000 분자로 감소된다. 라이브러리의 복잡성은 또한 안티센스 분자를 셋 이상의 절편으로 나눔으로써 감소될 수 있다. 이 크기의 라이브러리를 합성하고 유지하는 것이 가능하고, 긴 올리고머의 기존의 데 노보 합성의 필요 없이도 우너하는 프라이머 쌍을 빠르게 어셈블할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 적어도 두 세트의 올리고머를 포함하는 라이브러리로서, 그 올리고머는 각 세트로부터 선택되어 필요에 따라 커플링된다.
적어도 하나의 결합 도메인은 약 3 내지 약 24개 염기, 바람직하게는 약 6 내지 약 8개의 염기를 포함한다. 예컨대, 라이브러리가 각각은 단지 단일 6-머 서열을 결합시키는 한 세트의 6-머 결합 도메인을 갖도록 구성될 수 있고, 단지 네개의 염기만이 서열-특이적이고 나머지 염기는 축퇴성 또는 보편적인 한 세트의 8-머결합 도메인을 갖도록 구성될 수 있다. 제1 세트는 가능한 46(4096) 서열을 포함하는 반면에, 제2 서열은 단지 44(256) 서열(4개의 "특이적" 염기와 4개의 보편적 염기로 추정되는)을 포함한다. 필요시 제1 및 제2 세트로부터 선택된 올리고머를 조합함으로써, 410(106)개의 다른 서열이 단지 4,352개 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 대조적으로, 14-머의 완전한 라이브러리는 414(2.7×108) 분자를 필요로 할 것이다.
두 구성요소 프라이머(프라이머 구성요소 P)의 제1 올리고뉴클레오티드는 단지 자연발생적 포스포디에스테르 링키지를 포함하며, 하나 이상의 변형된 염기(예컨대, 하기 기술될 보편적 및 축퇴성 염기)를 포함할 수 있다. 제2 올리고뉴클레오티드(앵커 구성요소 A)는 변형되어 RNA 표적 서열에 대한 높은 결합 친화도를 얻고 하나 이상의 변형된 염기 및 변형된 백본 링키지, 예컨대, 포스포로티오에이트, 데옥시 포스포로티오에이트, 2'-O-치환 포스포디에스테르 및 데옥시 유사체, 2'-O-치환 포스포디에스테르 및 데옥시 유사체, 2'-O-치환 포스포로티오에이트 및 데옥시 유사체, 모르폴리노, 펩티드 핵산(PNA; 미국특허 제5,539,082), 2'-O-알킬 메틸포스포네이트, 3'-아미데이트, MMI, 알킬 에테르(Cook et al, 미국특허 제5,223,618) 및 Cook et al.,에 기재된 기타의 것들, 미국특허 제5,378,825호, Sanghvi, et al.(미국특허 제5,489,677), Cook et al.(미국특허 제5,541,307) 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 보편적 염기들은 데옥시 5-니트로인돌, 데옥시3-니트로피롤, 데옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 데옥시 네불라린, 데옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 이노신, 2'-F 네불라린, 2'-F 5-니트로인돌, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, 2'-F 3-니트로피롤, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르폴리노-5-니트로인돌, 모르폴리노-네불라린, 모르폴리노-이노신, 모르폴리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르폴리노-3-니트로피롤, 포스포르아미데이트-5-니트로인돌, 포스포르아미데이트-네불라린, 포스포르아미데이트-이노신, 포스포르아미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포르아미데이트-3-니트로피롤, 2'-O-메톡시에틸 이노신, 2'-O-메톡시에틸 네불라린, 2'-O-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-O-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-O-메톡시에틸 3-니트로피롤, 데옥시 RpMP-5-니트로인돌 다이머 및 2'-OMe RPMP-5-니트로인돌 다이머를 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용하기에 적당한 축퇴성 염기로는 데옥시 P(A&G), 데옥시 K(U&C), 2'-OMe 2-아미노퓨린(U&C), 2'-OMe P(G&A), 2'-OMe K(U&C), 2'-F-2-아미노퓨린(U&C), 2'-F P(G&A), 2'-F K(U&C), PNA-2-아미노퓨린(U&C), PNA-P(G&A), PNA-K (U&C), 모르폴리노-2-아미노퓨린(U&C), 모르폴리노-P(G&A), 모르폴리노-K(U&C), 포스포르아미데이트-2-아미노퓨린(C&U), 포스포르아미데이트-P(G&A), 포스포르아미데이트-K(U&C), 2'-O-메톡시에틸 2-아미노퓨린(U&C), 2'-O-메톡시에틸 P(G&A), 2'-O-메톡시에틸 K(U&C), 데옥시 RPMP-KP 다이머, 데옥시 RPMP-PK 다이머, 데옥시 RPMP-Kk 다이머, 데옥시 RPMP-PP 다이머, 2'-OMe RPMP-KP 다이머, 2'-OMe RPMP-PK 다이머, 2'-OMe RPMP-KK 다이머, 2'-OMe RPMP-PP 다이머 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
두 올리고머를 공유적 또는 비공유적 상호작용, 예컨대 비공유적 결합 쌍에 의해 조인하기 위해 커플링 부분이 다른 세트로부터 선택된다. 커플링 부분은 그 커플링 부분은 바람직하게는, 한 라이브러리 내의 제1 세트의 올리고뉴클레오티드 상의 커플링 부분이 서로는 커플링되지 않지만 제2 세트의 올리고뉴클레오티드 상의 커플링 부분과는 쉽게 결합되도록 선택되어, 그 올리고뉴클레오티드는 의도된 방위(orientation)를 갖는다. 한 구체예에서, 커플링 부분은 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체이다.
본 발명의 프라이머 쌍은 또한 핵산 시퀀싱에 사용될 수 있고 핵산 증폭에 사용되는 것과 같지만, 도1a 및 도1b에 나타낸 역방향 또는 전방향 일반 프라이머를 포함하지 않는다는 점에서는 다르다. 예컨대, 도1a에 나타난 FA/FP 앵커/프라이머 쌍 및 도1b에 나타난 RA/RP 앵커/프라이머 쌍은 당업계에 잘 알려진 대로 수행되는 일차 시퀀싱 반응에 사용될 수 있다. 또한, 이 시퀀싱 프라이머 쌍의 스템 구조는 일반 프라이머에 상보적인 영역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
실시예1
PKCα의 증폭
하기 나타낸 서열에서, L은 Glen Research사의 링커이고(spacer 18, cat. #10-1918-90 또는 spacer 9, cat. # 10-1909-90), 밑줄친 아래쪽 뉴클레오티드는 유전자-특이적 서열이고 밑줄친 윗쪽 뉴클레오티드는 스템 서열 영역이다. 이 실시예에서, 모든 프라이머는 비변형된 DNA 백본만을 포함하며 일부 고-친화도의 변형된 염기, 예컨대, C-5 프로핀일-C 및 C-5-프로핀일-U를 포함한다. 앵커는 2'-OMe-변형된 슈가 백본 및 C-5-프로핀일-C를 포함한다. 본 실시예의 유전자-특이적 영역은 총 길이 12염기(각 6개의 앵커 및 프라이머) 내지 24염기(각 12개의 앵커 및 프라이머)에 걸쳐 있다. 그 스템 영역은 24염기길이이고, 일반 프라이머(FUP 및 RUP)는 19 또는 14염기길이다.
총 세포성 또는 폴리(A+)RNA(0.1-2,000ng)이 하기 물질들의 존재하에 반응당 첨가된다:
10mM Tris-HCl, pH 8.3
50mM KCl
200μM의 각 dATP, dGTP, dCTP, dTTP
0.2-1.0μM FUP
0.2-1.0μM RUP
0.02-0.1μM의 각 유전자-특이적 FA, FP, RA 및 RP
200U/100μl의 역전사효소
200U/100μl의 열안정성 DNA 폴리머라제
PCR은 상기 기재된 파라미터를 이용하여 수행된다. 최종 생성물의 크기는 1% 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인된다. 증폭된 PCR 단편은 상업적 PCR 클리닝 키트(예컨대 Qiagen)을 이용하여 세척 및 정제되어, 세포 또는 조직의 생체외 또는 생체내 트랜스펙션에 이용될 수 있다.
여기 기술된 실시예들이 핵산 서열의 PCR 증폭을 위한 증폭 프라이머에 관해 언급하지만, 이러한 프라이머 쌍은 DNA 또는 RNA 폴리머라제 프라이밍 활성을 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 이러한 프라이머 쌍은 가닥 치환 증폭(SDA)와 같이 PCR과 함께만이 상업적으로 사용되는 비-써모사이클링 프라이머-의존적 증폭 기술(Walker,PCR Methods Appl. 3:1-6, 1993; Spargo et al.,Mol. Cell. Probes10:247-256, 1996), 자가-지탱(self-sustained) 서열 복제(3SR) 및 인 시츄 자가-지탱 서열 복제(IS-3SR)(Mueller et al.,Histochem. Cell Biol.108:431-437, 1997), 롤링 서클 증폭(RCA)(Lizardi et al.,Nature Genet.19:225-232, 1998), 및 핵산서열 기초 증폭(NASBA)(Heim et al.,Nucl. Acids Res.26:2250-2251, 1998; Romano et al.,Immunol. Invest.26:15-28, 1997) 에 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예가 상세히 기술되었지마는, 이러한 구체예들이 제한이아닌 예시에 불과하다는 것은 당업자에게 명백하며, 본원 발명의 실제 범위는 하기 청구범위에 의해 정해진다.

Claims (21)

  1. 올리고뉴클레오티드 앵커 및 프라이머를 포함하는 증폭 프라이머 쌍으로서,
    상기 앵커는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질이 아닌 핵산 화학성질을 갖고/거나 핵산 합성을 프라이밍할 수 없는 3'-말단을 갖고;
    상기 프라이머는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질인 핵산 화학성질을 갖으며;
    상기 앵커 및 상기 프라이머는 각각, 서로 결합하여 스템 구조를 형성할 수 있는 상보적인 뉴클레오티드 영역을 포함하는데, 스템 구조는 일반 프라이머에 상보적인 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭 프라이머 쌍.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 앵커 서열 및 상기 스템 영역은 플렉시블 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 플렉시블 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머는 상기 앵커의 상기 스템 영역 길이 이상으로 확장된 꼬리 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머는 하나 이상의 변형된 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 앵커는 하나 이상의 변형된 백본 링키지를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 앵커 및 상기 프라이머는 각각 6 내지 24 염기길이인 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 스템 구조의 한 영역과 상보적인 일반 프라이머와 더 결합한 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  9. 올리고뉴클레오티드 앵커 및 프라이머를 포함하는 시퀀싱 프라이머쌍으로서,
    상기 앵커는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질이 아닌 핵산 화학성질을 갖고/거나 핵산 합성을 프라이밍할 수 없는 3'-말단을 갖고;
    상기 프라이머는 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 기질인 핵산 화학성질을 갖으며;
    상기 앵커 및 상기 프라이머는 각각, 서로 결합하여 스템 구조를 형성할 수 있는 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 스템 구조는 일반 프라이머에 상보적인 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 앵커 서열 및 상기 스템 영역은 플렉시블 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 플렉시블 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 프라이머는 상기 앵커의 상기 스템 영역 길이 이상으로 확장된 꼬리 영역을 포함한 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 프라이머는 하나 이상의 변형된 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 앵커는 하나 이상의 변형된 백본 링키지를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  16. 제 9 항에 있어서, 상기 앵커 및 상기 프라이머는 각각 6 내지 24 염기길이인 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  17. 제 9 항에 있어서, 상기 스템 구조의 한 영역에 상보적인 일반 프라이머와 더 결합한 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  18. 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서,
    상기 표적 핵산 서열을 전방향 앵커(FA), 전방향 프라이머(FP), 역방향 앵커(RA), 역방향 프라이머(RP), 전방향 일반 프라이머(FUP) 및 역방향 일반 프라이머(RUP)와 조합하는 단계 및 상기 핵산 서열을 효소-매개 증폭을 통해 증폭시키는 단계를 포함하되,
    상기 FA/FP는 그들의 상보적 스템 영역들의 결합을 통해 제1 프라이머 쌍을 형성하고, 상기 RA/RP는 그들의 상보적 스템 영역들의 결합을 통해 제2 프라이머 쌍을 형성하며;
    상기 FUP는 FA/FP 스템 영역과 상보적이고,
    상기 RUP는 RA/RP 스템 영역과 상보적이며,
    상기 프라이머 쌍들은 상기 표적 핵산 서열을 플랭킹하기 위해 상기 표적 핵산 서열에의 상보성에 기초하여 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 치료적 유전자 산물을 코딩하는 것을특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 효소-매개 증폭은 PCR 증폭인 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100943567B1 (ko) * 2001-08-17 2010-02-22 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 세포사멸-유도성 포스포디에스테르올리고뉴클레오타이드의 입체구조-활성 관계성
US7575863B2 (en) * 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
US20060057595A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-16 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for identifying and quantitating small RNA molecules
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
AU2007336839C1 (en) 2006-12-21 2013-12-19 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US20090036325A1 (en) * 2007-05-25 2009-02-05 Applera Corporation Directed assembly of amplicons to enhance read pairing signature with massively parallel short read sequencers
US8349563B2 (en) * 2008-11-18 2013-01-08 Life Technologies Corporation Sequence amplification with target primers
WO2011003020A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
JP6147502B2 (ja) * 2009-10-27 2017-06-14 スウィフト バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドプライマー及びプローブ
AU2012217788A1 (en) * 2011-02-14 2013-08-29 Swift Biosciences, Inc. Polynucleotide primers and probes
WO2013106770A1 (en) 2012-01-11 2013-07-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of ikbkap splicing
CA2968376C (en) * 2014-11-21 2020-06-23 Nanostring Technologies, Inc. Enzyme- and amplification-free sequencing
KR102187291B1 (ko) 2016-11-21 2020-12-07 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 화학적 조성물 및 이것을 사용하는 방법
KR20210061962A (ko) 2018-05-14 2021-05-28 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 화학 조성물 및 이의 사용 방법
GB201910635D0 (en) * 2019-07-25 2019-09-11 Ttp Plc Detection of target oligonucleotides

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5104792A (en) * 1989-12-21 1992-04-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for amplifying unknown nucleic acid sequences
US5623065A (en) * 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
AU7653691A (en) * 1990-04-05 1991-10-30 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Modified rna template-specific polymerase chain reaction
EP0502180B1 (en) * 1990-09-21 1997-04-16 Amgen Inc. Enzymatic synthesis of oligonucleotides
US5627032A (en) * 1990-12-24 1997-05-06 Ulanovsky; Levy Composite primers for nucleic acids
US5776563A (en) * 1991-08-19 1998-07-07 Abaxis, Inc. Dried chemical compositions
US6027863A (en) * 1991-09-05 2000-02-22 Intratherapeutics, Inc. Method for manufacturing a tubular medical device
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US6235887B1 (en) * 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US6197556B1 (en) * 1991-12-20 2001-03-06 The University Of Chicago Nucleic acid amplification using modular branched primers
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
DK0652973T3 (da) * 1992-07-31 1997-09-15 Behringwerke Ag Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider
US5646042A (en) * 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
US5872242A (en) * 1992-10-05 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
AUPM672594A0 (en) * 1994-07-08 1994-08-04 Royal Children's Hospital Research Foundation A method for the prophylaxis and/or treatment of proliferative and/or inflammatory skin disorders
US6372427B1 (en) * 1995-04-12 2002-04-16 Hybridon, Inc. Cooperative oligonucleotides
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
CA2319662C (en) * 1998-01-27 2009-11-24 Cytocell Limited Modified nucleic acid probes and uses thereof
US6287772B1 (en) * 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
US6172216B1 (en) * 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
AU2206800A (en) * 1998-12-11 2000-06-26 Regents Of The University Of California, The Targeted molecular bar codes and methods for using the same
US6346938B1 (en) * 1999-04-27 2002-02-12 Harris Corporation Computer-resident mechanism for manipulating, navigating through and mensurating displayed image of three-dimensional geometric model
DE10019135A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6451588B1 (en) * 2000-06-30 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Multipartite high-affinity nucleic acid probes
US6379932B1 (en) * 2000-07-17 2002-04-30 Incyte Genomics, Inc. Single primer PCR amplification of RNA

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