KR100943567B1 - 세포사멸-유도성 포스포디에스테르올리고뉴클레오타이드의 입체구조-활성 관계성 - Google Patents

세포사멸-유도성 포스포디에스테르올리고뉴클레오타이드의 입체구조-활성 관계성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 3차원 구조 및 전하 특징에 기초하여 올리고뉴클레오타이드가 생물학적 활성 및 생물학적 활성의 효능을 보유하는지를 예측하는 컴퓨터 기반 방법을 제공함으로써, 생물학적 활성에 대한 분자의 인실리코(in silico) 평가를 촉진한다. 생물학적 활성은 세포 증식, 세포 주기 정지와 세포사멸의 유도를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
올리고뉴클레오타이드, 3차원 구조, 생물학적 활성, 세포사멸, 인실리코 방법

Description

세포사멸-유도성 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드의 입체구조-활성 관계성{CONFORMATION-ACTIVITY RELATIONSHIP OF APOPTOSIS-INDUCING PHOSPHODIESTER OLIGONUCLEOTIDES}
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 3차원 구조 및 전하 특징에 기초하여 올리고뉴클레오타이드가 암세포에서 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있는지를 예측하는 컴퓨터 기반 방법을 제공한다.
암은 과도한 증식, 불충분한 세포사, 또는 이들 2가지의 조합으로부터 발생할 수 있는, 비정형 세포의 이상 순축적이다.
증식은 1개의 세포를 2개의 세포로 분열시키는 세포 주기를 통한 세포 발달의 정점이다. 세포 주기의 주요 5단계는 G0, G1, S, G2, 및 M기이다. G 0기 동안에, 세포는 정지해있다. 체내 대부분의 세포는 한때 이 단계에 있다. G1기 동안에, 세포는 분열하기 위한 신호에 반응하여, DNA 합성에 필요한 RNA 및 단백질을 생성한다. S기(S기 초기인 SE; S기 중기인 SM; 및 S기 후기인 SL) 동안 세포는 그들의 DNA를 복제한다. G2기 동안에, 단백질은 세포 분열에 대비하여 잘 구성된다. 유사분열(M)기 동안, 세포는 2개의 딸세포로 분열된다. 세포 주기 진행에서의 변경이 모든 암 에서 발생하는데 이는 유전자의 과다 발현, 조절 유전자의 돌연변이, 또는 DNA 손상 체크포인트의 결함으로부터 유발될 수 있다(Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 8:903, 1997).
세포사멸 또는 프로그램된 세포사(progammed cell death)는 바람직하지 않은 세포를 사멸시키고 제거하기 위한 생리학적 과정이며 화학요법제가 암세포를 사멸시키는 기작이다. 세포사멸은 핵 크로마틴의 응축, 세포 수축, 핵 붕괴, 원형질막 기포형성, 및 막-결합 세포사멸체의 형성을 포함하는 세포내 뚜렷한 형태적 변화를 특징으로 한다(Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68:251, 1980). 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 원형질막 내면에서 외면으로의 이동은 크로마틴 응축과 동시에 일어나며 세포사멸의 세포적 증명으로서 간주된다(Koopman, G. et al., Blood, 84:1415, 1994). 세포사멸의 실제 기작은 카스파제(caspase)로서 공지된 시스테인 프로테아제 부류의 활성화에 의해 매개되는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 세포사멸의 유도에 관한 대부분의 선행기술 항암 치료법은 임상용으로 적절하지 않은 것으로 증명되어 왔다. 이들 치료의 다수는 효과가 없거나 독성이 있고, 부작용을 일으키며, 약물 내성이나 면역감작의 발달을 초래하고, 피치료자를 쇠약하게 만든다. 다수의 질환 및 증상이 바람직하지 못한 세포 증식을 특징으로 하며 의학계 또는 수의학계의 당업자에게 공지되어 있다.
노화(Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:20, 1995) 또는 세포사멸(Wyllie et al., Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980)의 유도를 통한 프로그램된 세포사의 유도는 암, 자가반응, 자가면역, 염증 및 증식성 질환과 같지만 이에 한정되지 않는, 바람직하지 않은 세포의 이상 축적을 수반하는 질환의 치료에 중요하다. 하지만, 세포사멸의 유도나 면역계의 자극에 관한 대부분의 선행기술 항암 치료법은 임상용으로 적절하지 않은 것으로 증명되어 왔다. 이들 치료의 다수는 효과가 없거나 독성이 있고, 부작용을 일으키며, 약물 내성이나 면역감작의 발달을 초래하고, 피치료자를 쇠약하게 만든다. 신규의 방법은 분자가 목적한 생물학적 활성을 보유할 것인지를 예측하기 위해 이들을 평가하는 데 필요하다.
합성 올리고뉴클레오타이드는 세포내 이입시킨 다중음이온성 서열이다(Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197:95, 1994). 합성 올리고뉴클레오타이드는 암세포의 증식을 억제하기 위해 핵산(Wagner, R., Nature, 372:333, 1994), 특이 세포 단백질(Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999) 및 특이 핵 단백질(Scaggiante et al., Eur. J. Biochem, 252:207, 1998)에 선택적으로 결합하는 것으로 보고되었다.
구아닌(G) 및 다양한 양의 티민(T)을 함유하는 합성 27염기 서열(올리고뉴클레오타이드 GTn)에서 n이 1 이상 또는 7 이하이고 염기 갯수가 20개 이상인 GTn(Scaggiante et al., Eur. J. Biochem., 252:207, 1998)은 이 서열이 45 kDa 핵 단백질에 특이적으로 결합함으로써 암세포주의 성장을 억제하는 것으로 보고된 반면, 염기 갯수가 20개 이하인 GTn은 암세포주에 대해 비활성인 것으로 보고되었다(Morassutti et al., Nucleosides and Nucleotides, 18:1711, 1999). 3' 아미노알킬 변형을 갖는, 15개 및 29개 염기로 이루어진 두 종류의 합성 GT-풍부 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오린(nucleolin)에 결합하는 G-쿼텟을 형성하여 암 세포주의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다(Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999). 포유류 텔로미어 반복 서열과 동일한 서열을 갖는 합성 6염기 TTAGGG-포스포로티오에이트는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 세포의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다(Mata et al., Toxicol. Applied Pharmacol., 144:189, 1997). 그러나, 합성 6염기 TTAGGG-포스포디에스테르 뉴클레오타이드는 항텔로머라제 활성을 갖지 않는 것으로 보고되었다(미국 특허 번호: 5,643,890).
안티센스 DNA(mRNA 결합 DNA 또는 트리플렉스-형성 DNA) 또는 면역자극성 CpG 모티프와 같은 생물학적 활성을 갖는 디옥시리보뉴클레오타이드는 종종 분자내 염기쌍 결합에 의해 안정화되는 서열-특이성 선형 모티프를 특징으로 한다. 포스포로티오에이트 치환과 같은 골격 변형은 이들 분자의 활성에 역효과를 주지 않으며 종종 활성을 증진시킨다.
(GxTy)n, (TyGx)n, a(GxT y)n, a(TyGx)n, (GxTy)n b, (TyGx)nb, a(GxTy)nb, a(T yGx)nb로 구성된 그룹 중에서 선택된, 2 내지 20개 염기의 3'-OH, 5'-OH 합성 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 및 방법을 앞서 기술했는데, 여기서 x 및 y는 1 내지 7 사이의 정수이고, n은 1 내지 12 사이의 정수이며, a 및 b는 하나 이상의 As, Cs, Gs 또는 Ts이고, 여기서 서열은 2 내지 20개 사이의 염기이며, 또한 서열은 다수의 암세포에서 세포 주기 정지의 유도, 증식의 억제, 카스파제 활성의 유도 및 세포사멸의 유도로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나의 반응을 유도한다(PCT CA00/01467, WO 01/44465).
컴퓨터적 절차는 생물학적 활성과 3차원 분자 구조와의 상관관계를 가능케 하여, 활성 분자의 입체구조 예측을 촉진한다. 모델링은 연구에서 나타난 현상을 정확하게 표현할 수 있는 수학적 방정식의 사용을 필요로 한다. 분자 역학 분석법(Allinger, NL., J. Comput. Chem., 12, 844, 1991)을 구조적 및 입체구조적 관계성을 분석하는 데 사용할 수 있다. 분자 역학의 기본적 가정은 소형 분자에 대해 실험적으로 측정한 데이터(결합 길이, 결합 각도 등)는 보다 큰 분자에 대해 외삽할 수 있다는 것이다. 분자 모델링 접근법은 구조와 활성의 관계성을 측정하여 활성인 3차원 분자 입체구조를 예측하기 위해 사용되어 왔다(N. Evrard-Todeschi et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 38:742, 1998; Chen H. et al., J. Med. Chem., 36:4094, 1993; A. Guarna et al., J. Med. Chem., 40:3466, 1997; M. Read, et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 98:4844, 2001).
그러므로, 올리고뉴클레오타이드의 생물학적 활성, 구체적으로는 세포에서 세포 반응을 유도하는 이들의 능력과 관련된 활성을 예측하는 데 유용한, 올리고뉴클레오타이드내 신규의 3차원 입체구조 또는 구조적 모티프 규명에 대한 계속적인 요구가 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 세포사멸 활성을 보유한 올리고뉴클레오타이드 서열인지를 예측하는 데 유용한 컴퓨터 기반 방법을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다. 이러한 인실리코(in silico) 방법은 또한 세포사멸을 유도하는 올리고뉴클레오타이드 서열 의 상대적 효능을 예측한다. 본 발명은 세포사멸을 유도하는 능력에 대해 올리고뉴클레오타이드 조성물을 인실리코 평가하거나 스크리닝하기 위한 합리적인 기초를 제공함으로써, 생체내 또는 시험관내에서 추가로 시험하기 위한 특정 올리고뉴클레오타이드 조성물을 선택하는 수단을 제공한다. 본 발명은 a)예측된 특정 생물학적 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 조성물의 규명; b)예측된 특정 생물학적 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 조성물의 효능 예측; 및 c)세포사멸 활성에 대해서 시험관내 및 생체내 시험하기 위한 올리고뉴클레오타이드 조성물 후보물질 수의 감소에 의해 약제 설계 및 개발의 비용을 유의적으로 절감시킨다.
세포사멸을 유도하는 서열의 능력 예측은 암; 과도증식성 질환; 자가면역 질환; 관절염; 류머티스성 관절염; 염증; 림프구 증식성 질환; 혈관성형술에 따른 혈관의 재협착증; 및 천식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 몇몇 질환 및 증상에 필요하다. 세포사멸을 유도하는 서열의 능력 예측은 편평 세포 암종, 섬유육종, 사르코이드 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 신장암, 골육종, 피부 흑색종, 기저 세포 암종, 췌장암, 방광암, 뇌암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 림프종 및 이들로부터 유래된 전이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 암에 특히 필요하다.
인실리코를 통해 높은 정확도(> 95%)로 세포사멸-유도 활성을 예측하는 예상치 못한 능력은 값비싼 고처리량 화학 합성 및 세포사멸-유도 스크리닝의 필요성을 감소시킴으로써, 훨씬 더 효과적이고 저렴한 방식으로 생물학적 활성 분자의 규명을 가능케 한다.
본 발명의 이점은 신규 치료 조성물의 발견을 가속화시킨다는 것이다. 본 발 명의 또다른 이점은 생체내 및 시험관내에서 생물학적으로 시험하기 위한 올리고뉴클레오타이드 서열 후보물질을 제공함으로써 신규 치료 조성물의 발견 비용을 감소시킨다는 것이다. 이러한 절감은 환자를 위한 치료약의 가격 및 인간과 동물에 대한 건강 관리 산업 전반에 직접적으로 영향을 준다. 본 발명의 한층 또다른 이점은 올리고뉴클레오타이드 서열의 효능을 예측함으로써, 생체내 및 시험관내 생물학적 시험에 대한 우선순위를 제공하는 것에 의해, 신규 치료 조성물의 발견 비용을 감소시킨다는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 올리고뉴클레오타이드 서열의 평가에 유용한 컴퓨터 기반 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 올리고뉴클레오타이드 서열이 세포 증식의 억제, 세포 주기 정지의 유도 또는 세포사멸 유도와 같은 세포에서의 반응을 유도하는 능력을 보유하는지 예측하기 위해 이들을 평가하는 데 유용한 컴퓨터 기반 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정 목적은 올리고뉴클레오타이드 서열이 세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 보유하는지 예측하기 위해 이들을 평가하는 데 유용한 컴퓨터 기반 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 보다 또다른 목적은 올리고뉴클레오타이드 서열이 암세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 보유하는지 예측하기 위해 이들을 평가하는 데 유용한 컴퓨터 기반 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 보다 또다른 목적은 질환의 치료에 유용할 올리고뉴클레오타이드 서열의 규명에 유용한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 바람직하지 못한 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 증상의 치료에 유용할 올리고뉴클레오타이드 서열의 규명에 유용한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한층 또다른 목적은 자가면역 질환, 염증, 관절염, 천식, 혈관성형술에 따른 혈관의 재협착증, 과도증식성 질환, 림프구 증식성 질환, 및 암과 같이 바람직하지 못한 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 증상의 치료에 유용할 올리고뉴클레오타이드 서열의 규명에 유용한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 보다 또다른 목적은 암의 치료에 유용할 올리고뉴클레오타이드 서열의 규명에 유용한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 고처리량 화학 합성 및 생물학적 활성 스크리닝에 의지하지 않고, 인실리코를 통해 세포사멸-유도 활성을 갖는 분자를 규명케 하는 방법을 제공하는 것이다.
세포 반응을 유도하는, 구체적으로는 세포에서 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 진행을 정지시키고/거나 세포사멸을 유도하는 올리고뉴클레오타이드 서열의 능력 및 효능을 예측하는 본 발명의 예기치 못한 놀라운 능력은 의학계에서 장기간 충족되지 못했던 요구를 다루고 있으며 동물 및 인간에게 중대한 이득을 제공한다.
본 발명의 이들 목적 및 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 개시된 구체예의 상세한 설명 및 첨부된 청구항을 검토함으로써 명확해질 것이다.
도 1은 3차원에서 중심부(centrum)의 일반적인 배향의 공간적 정의(전면, 후면, 복면, 배면, 좌측면 및 우측면)를 보여주는 것이고;
도 2a는 3차원에서 전기음성도의 프레임화(framed) 중심부를 표현한 개략도이며;
도 2b는 명세서내 정의된 바와 같은 X, Y, Z, 알파(α) 및 베타(β) 변수와 5' 및 3' 배향을 보여주며, 3차원에서 전기음성도의 프레임화 중심부를 표현하는 개략도이며, 이것은 또한 포스페이트기로부터의 전기음성도 영역, 아민 및 아미도기로부터의 전기음성도 영역, 포스페이트, 디옥시리보오스, 및 염기를 나타내는 것이며;
도 3-13은 각각 다음과 같은 뷰(view)로 구성된다:
a)시작 위치로서의 위치 1
b)시작 위치로부터 X축을 따라 90°회전시킨 후의 위치 2
c)시작 위치로부터 X축을 따라 180°회전시킨 후의 위치 3
d)시작 위치로부터 X축을 따라 270°회전시킨 후의 위치 4
e)용매 접근가능 표면을 나타내기 위해 흑백으로 표현한 시작 위치로서의 위치 1.
제1 위치는 입체의 흑백 사진 및 용매 접근가능 표면을 점으로 나타낸 컬러 사진으로서 2회 표현된다. 수소 원자는 보다 나은 명확성을 위해서 나타내지 않았다. 도면에 나타낸 3차원 서열내 원자를 표현하기 위해 다음 색상을 사용했다: 청 색 = 질소; 회색 = 탄소; 분홍색 = 인; 적색 = 산소; 황색 = 황.
4개의 회전 뷰(a, b, c, 및 d)는 상이한 배향에서 중심부의 구형 성질을 설명하기 위해 예시적으로 제공된다.
도 3. TGT
도 4. GGGGGG
도 5. GGGTGG 포스포로티오에이트 골격
도 6. GGG
도 7. TTGTGG
도 8. GGGTGGGG
도 9. GGGTGG_3P(3'-포스페이트)
도 10. 5P_GGGAGG(5'-포스페이트)
도 11. 5P_GGGTGG(5'-포스페이트)
도 12. GGGTGG
도 13. GGGGTGG
본 발명은 올리고뉴클레오타이드 서열이 세포 반응을 유도하는, 구체적으로는 세포에서 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 진행을 정지시키고/거나 세포사멸을 유도하는 능력을 보유하는지를 예측하기에 유용한 컴퓨터 기반 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 인실리코 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열이 세포사멸을 유도하는 능력을 보유하는지를 예측한다. 이러한 인실리코 방법은 또한 세 포 반응을 유도하는, 구체적으로는 세포에서 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 진행을 정지시키고/거나 세포사멸을 유도하는 올리고뉴클레오타이드 서열의 상대적 효능을 예측한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 인실리코 방법은 세포에서 세포사멸을 유도하는 올리고뉴클레오타이드 서열의 상대적 효능을 예측한다. 본 발명은 세포에서 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 진행을 정지시키고, 카스파제(caspase)를 활성화시키고, PARP를 절단하고/거나, 세포사멸을 유도하는 올리고뉴클레오타이드 조성물의 능력을 예측하기 위해 이것을 인실리코 평가하거나 스크리닝하기 위한 합리적인 기초를 제공함으로써, 생체내 또는 시험관내에서 추가로 시험하기 위한 특정 올리고뉴클레오타이드 조성물을 선택하는 수단을 제공한다.
본 발명의 방법은 서열이 세포사멸성 생물학적 활성을 갖는지를 예측하기에 유용한 하나 이상의 중심부를, 올리고뉴클레오타이드 서열이 보유하는지를 측정하는 데 사용된다.
본원에 사용되는 서열은, 세포에서 세포사멸을 유도하는 서열의 능력을 예측하기 위해 사용되는 규명가능한 구형의 3차원 구조(맞은편 염기의 아미노/아미도기의 양전하에 의해 프레임화된 음전하 포스페이트기 중심부를 기초로 하는 것)를 형성하는, 올리고뉴클레오타이드 서열내 염기, 디옥시리보오스 및 포스포디에스테르기의 결합체를 의미한다.
본원에 사용되는 "중심부"는 분자간 수소결합을 안정화시키거나 안정화시키지 않으면서, 2개 이상의 포스페이트기 및 2개 이상의 인접 염기(A형 중심부) 또는 비-인접 염기(B형 중심부)를 포함하는 분자내 구조의 부재 또는 존재를 의미한다. 중심부는 염기가 포스페이트 목걸이(necklace)에 대해 동일 평면 또는 반대 평면에서 수직 배향으로 인접해 있을 경우에는 인접(A형)으로 정의된다. 중심부는 염기의 순서가 연속적이지 않을 경우에는 비-인접(B형)으로 정의된다. 바람직한 배향은 A형 또는 B형이고, 보다 바람직한 배향은 A형 및 B형이며, 가장 바람직한 배향은 포스페이트 목걸이에 수직인 동일 평면내 염기를 갖는 A형이다. 서열이 5' 말단에서 제1 중심부를 가지고 3' 말단에서 제2 중심부를 가질 경우에는 아래첨자 표시하여, 예컨대 A1은 5' 말단의 A형 중심부를 의미한다. 아래첨자 A2는 3' 말단의 A형 중심부를 의미한다. 동일한 표시체계가 B형 중심부에 대해서도 적용된다. 중심부는 포스페이트 목걸이의 맞은편에 아미노기나 아미도기 또는 둘다가 존재할 때 프레임화된 것으로 간주한다.
올리고뉴클레오타이드 서열내 염기 서열을 기술하기 위해 다음 표기법을 사용한다: A = 아데닌; C = 시토신; G = 구아닌; T = 티민.
3차원 올리고뉴클레오타이드 서열을 기술하는 데 다음 매개변수를 사용한다: A)모든 거리는 pm로 나타낸다; B)분자내 수소결합은 관여 원자들간 상호 거리가 300 pm 미만인 경우에 형성되는 것으로 가정한다; C)분자 동력학 값은 kcal/mol로 나타낸다.
본원에 사용되는 세포 반응은 일반적으로 세포에서의 증식의 억제, 세포 주기 진행의 정지 및/또는 세포사멸의 유도를 의미한다. 바람직한 반응은 세포사멸의 유도이다. 세포는 임의의 세포, 구체적으로는 바람직하지 못한 증식을 나타내는 세 포를 포함한다. 이러한 세포는 과도증식성 질환; 자가면역 질환; 관절염; 류머티스성 관절염; 염증; 림프구 증식성 질환; 암; 및, 천식에서 발견될 수 있다. 암세포는 편평 세포 암종, 섬유육종, 사르코이드 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 신장암, 골육종, 피부 흑색종, 기저 세포 암종, 췌장암, 방광암, 뇌암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 또는 림프종 및 이들로부터 유래된 전이로부터의 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 "치료적 처리" 및 "효과적인 양"이란 구는 암세포를 포함하는 세포에서 세포 증식을 유도하거나, 세포 주기 진행을 정지시키거나 또는 세포사멸을 유도하기에 효과적인 3차원 올리고뉴클레오타이드 서열의 양을 의미한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 서열 유효량을 포함하는 조성물의, 인간을 포함하는 동물에 대한 투여는 암, 관절염, 류머티스성 관절염, 과도증식성 질환, 혈관성형술에 따른 혈관의 재협착증, 림프구 증식성 질환 및 천식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 질환을 예방, 치료 또는 제거하는 치료적 처리이다.
세포사멸의 유도는 편평 세포 암종, 섬유육종, 사르코이드 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 신장암, 골육종, 피부 흑색종, 기저 세포 암종, 췌장암, 방광암, 뇌암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 림프종 및 이들로부터 유래된 전이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 암에 특히 필요하다.
본원에 정의된 바와 같은 적절한 분자내 수소결합 및 원자간 거리와 관련된 음전하 또는 전기음성도(예를 들면 포스페이트기로부터의), 양전하 또는 전기양성도(예를 들면 아민 및 아미도기로부터의)의 올리고뉴클레오타이드 서열내 분자 결 합체는 암세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 보유할 것으로 제안하는 바이지만, 이에 얽매이고자 하는 것은 아니다.
컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어
본 발명은 당업자에 의해 사용되는 화학적 설계 소프트웨어를 작동시키고 중심부의 매개변수를 측정하기에 충분한 메모리 및 계산 속도를 갖는 임의의 컴퓨터를 사용하여 실시할 수 있다. 중심부의 각종 매개변수 측정은 설계된 구조를 3차원 구조로 변환시키는 소프트웨어에 의해 달성된다.
소프트웨어를 사용하여, 3차원 구조에서의 원자간 거리를 pm(피코미터) 단위로 측정하는데, 여기서 첫번째 원자를 선택하면 커서(포인터) 끝에 이들 원자 사이의 거리에 대한 정보가 나타난다.
추가로, 후술되는 중심부의 성분 측정을 촉진하는 임의의 화학적 소프트웨어를 사용할 수 있다. 이러한 소프트웨어는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 일 구체예에서는, ChemDraw 소프트웨어가 사용되었다. Chem3D 소프트웨어는 캠브릿지소프트 닷컴(Cambridgesoft.Com; Cambridge, MA, USA)에서 공급된다. 분자 모델링 분야의 당업자에게 공지되어 있는 다른 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있는데, 예컨대 Sybill(트리포스(Tripos) 제품), Charm and Inside Ⅱ(액셀리스(Accelrys) 제품)가 있다.
본 발명의 방법은 소비자가 일반적으로 입수가능한, 예컨대 델(Dell), 애플(Apple), 컴팩(Compaq), 휴렛-팩커드(Hewlett-Packard), 게이트웨이(Gateway), 아이비엠(IBM)에서 제조한 데스크탑 장치 및 랩탑과 같은 개인용 컴퓨터 또는 실리 콘 그래픽스(Silicon Graphics)나 크레이(Cray) 컴퓨터와 같은 고급 컴퓨터를 사용하여 실시할 수 있다.
컴퓨터는 정보 입력 수단, 예컨대 키보드, 터치스크린 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 입력 장치와 작동적으로 연결된다. 컴퓨터는 CD 읽기 쓰기 장치, 디스크 드라이브와 같은 수단 또는 정보 접근 및 입력 분야의 당업자에게 공지되어 있는 다른 수단에 작동적으로 연결된다. 추가로, 컴퓨터는 특정 분자 구조에 관한 정보를 신속하게 얻을 수 있도록 인터넷, 원격 데이터베이스, 또는 화학적 구조의 데이터베이스에 대한 접근을 제공하는 다른 서버와 작동적으로 연결될 수 있다.
컴퓨터는 정보의 표시 또는 출력 수단, 예컨대 모니터, 프린터 및 당업자에게 공지되어 있는 다른 표시 수단에 작동적으로 연결된다. 이러한 수단은 올리고뉴클레오타이드 서열의 3차원 구조 및 이 구조와 연관된 각종 매개변수, 예컨대 구형 형태, 포스페이트 골격 배향의 형태, 및 포스페이트기, 2-디옥시리보오스, 퓨린, 피리미딘, 아미노기, 아미도기, 3' 말단과 5' 말단 하이드록시기의 위치, 및 중심부를 시각화해준다.
올리고뉴클레오타이드내 중심부의 인실리코 규명을 위한 본 발명의 일반적인 방법
하기 단계는 올리고뉴클레오타이드 서열내 중심부를 규명하기 위한 본 발명의 일반적인 방법을 서술한 것이다.
1)분자 설계. ChemDraw v.5 소프트웨어를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 분자를 설계했다.
2)에러 점검. 정확한 원자, 결합 및 원자가를 보장하기 위해 구조를 검사했 다.
3)Chem3D 소프트웨어에 의한 설계 모델의 변환 및 분석. 구조를 설계한 다음 Chem3D 소프트웨어를 사용해서 구조를 전개하여 3차원 모델을 만들어냈다. 에러가 발견되면(예컨대, 단일결합 대신 이중결합) 무엇인가 잘못되었음을 지시하는 경고 메시지가 생성되었다. 이러한 경우에 설계 구조에 변화를 만들기 위해 ChemDraw 프로그램을 사용하며, 설계된(수정된) 구조를 Chem3D 소프트웨어로 전개시킴으로써 과정을 반복했다.
4)에너지의 최소화. 에너지의 최소화는 안정한 입체구조로 배치하기 위해 필요했다. Chem3D 소프트웨어의 MM2 메뉴에서 "에너지 최소화하기"를 선택했다. 0.1000의 디폴트값(default value)이 정확성과 속도 사이의 합리적인 절충값이었다. 결과는 다음 매개변수의 값을 포함했다: 결합 신장 에너지; 각 굽힘 에너지; 비틀림 에너지; 비-결합 에너지; 반 데르 발스 에너지; 정전기 에너지; 이중극자/이중극자 기여도; 이중극자/전하 기여도; 평면외 굽힘; 및 신장-굽힘 매개변수. 신장-굽힘 매개변수는 전술한 인자 목록에서의 신장-굽힘 상호작용 항에 대한 힘 상수이다. 매개변수는 소프트웨어의 한 부분으로서 이미 설치되어 있다. x 및 y는 임의의 비-수소 원자를 나타낸다. 각이 축소될 때, MM2 역장은 각의 중심 원자에서 각의 다른 2개 원자까지의 결합을 늘이기 위해서 신장-굽힘 힘 상수를 사용한다.
주어진 입체구조에 대한 총 입체 에너지는 전술한 값(결합 신장 에너지, 각 굽힘 에너지, 비틀림 에너지, 반 데르 발스 에너지, 정전기 에너지 및 신장-굽힘 에너지)의 총합을 kcal/mol의 단위로 표현한다. 신장 굽힘 교차항은 결합 신장 및 각 굽힘 사이에서 커플링이 발생할 때 사용된다. 이들 에너지의 합은 결과적인 총 입체 에너지를 부여한다.
5)310°K에서의 분자의 분자 동력학 계산. 분자 동력학 계산은 원자의 운동을 모의실험하기 위해, 뉴턴 역학을 사용하여 모델이 저온에서 고온으로 및 그 반대로 이동할 때의 운동에너지를 더하거나 뺌으로써 수행했다.
분자 동력학은 MM2 메뉴로부터 분자 동력학을 선택함으로써 계산했다. 본 계산은 다음과 같은 디폴트 매개변수를 사용했다: 단계 간격: 2 펨토초(femtosecond; fs); 프레임 간격: 10 fs; 종결까지의 단계: 10,000 단계; 가열/냉각 속도: 1 kcal/원자/1 피코초(picosecond; ps); 목표 온도 설정: 300°켈빈(Kelvin; K).
목표 온도는 분자의 형태 및 각 분자의 온도 범위를 고려하여 300°K 내지 310°K 사이에서 변수를 측정하기 위한 실험 세트를 수행한 후 300°K로 설정했다. 300°K의 디폴트값은 310°K 까지의 온도 범위를 포함할 수 있는 것으로 밝혀졌다(300°K는 실험을 수행한 온도인 37℃에 상응했다). 온도를 310°K로 설정하면, 계산값의 범위가 일반적으로 310°K 범위를 초과하는 것이 관찰되었다.
6)분자 입체구조, 염기 핑거(finger)와 이들 사이의 넥(neck)을 규명하고, 주어진 분자의 구형 또는 선형 도메인을 규명하기 위한 용매 접근가능 표면의 표시. 용매 접근가능 표면 표시는 특정 원자 및 결합 정보보다는 전체 분자에 대한 정보를 제공한다. 용매 접근가능 표면은 용매 분자가 접근할 수 있는 분자의 부위를 나타낸다. 일반적인 용매는 상이한 값의 반경을 가진다. 물의 디폴트값(140 pm)이 사용되었다. 표면은 분자의 물리 화학적 성질에 대한 정보를 표시한다. 표면은 분자의 외부 표면 계면(또는 전자 분포)의 양상을 표시한다. 분자 표면 유형은 고체, 철망, 점, 또는 반투명이다. 분자 표면을 표시하기 위해 다음 4가지 선택과 함께 보기(view) 메뉴를 사용했다: A)고체형 표면은 불투명형으로서 표시된다. 이것은 표면 그 자체를 상세하게 검사하는 데는 유용하지만 밑에 있는 원자 및 결합에 대해서는 특별히 유용하지는 않다. B)철망형은 선의 연결 망으로서 표시된다. 철망형은 표면 특성을 표시하며 원자 및 결합도 볼 수 있게 해준다. C)점형은 연결되지 않은 일련의 점으로서 표시된다. 이것은 밑에 있는 구조를 관찰하는 데 사용된다. D)반투명성 표면은 고체형으로 표시되지만 부분적으로 투명하기 때문에 원자 및 결합을 볼 수 있다.
7)분자내 수소결합의 규명. 수소결합은 거리가 300 pm 이하일 때 형성될 수 있다.
8)강력한 전기음성적 중심부 형성의 기초가 되는 포스페이트 목걸이 또는 비드형 외관을 형성하는 포스페이트기의 존재 규명. 포스페이트 목걸이가 존재하는 경우, 중심부의 크기를 계산했다.
9)전기음성적 중심부내 포스페이트기에 대한 전기양성적 프레임화를 위한 염기의 공간적 배향의 측정.
10)포스페이트기에서 아미노/아미도기, 3' 및 5' 하이드록시기까지의 원자간 거리 측정. 소프트웨어를 사용하여, 3차원 구조에서의 원자간 거리를 pm(피코미터) 단위로 측정했는데, 여기서 첫번째 원자를 선택하면 커서(포인터) 끝에 이들 원자 사이의 거리에 대한 정보가 나타난다. 원자간 거리: 본 발명의 모델내 각 원자의 상대적 위치는 Z-매트릭스의 내부 좌표로 일컬어지는 측정 세트로 측정했다. 임의의 특정 원자에 대한 내부 좌표는 본 발명의 경우에는, 해당 원자와 다른 원자 사이의 결합 길이 측정값으로 구성된다(보다 상세한 분석은 임의로는 결합각 및 이면각을 포함한다).
내부 좌표값은 도구(tool) 메뉴로부터 값을 선택하고, 지정하여 모델 표를 나타낸 다음, 내부 좌표를 선택함으로써 얻었다. Z-매트릭스내 첫번째 3개 원자는 다음과 같이 정의되었다: 1)원점 원자는 Z-매트릭스내 첫번째 원자이고, 모델내 모든 다른 원자는 이 원자와 관련해서 위치했다; 2)첫번째 위치된 원자는 오직 원점 원자와 관련해서 위치했다. 첫번째 위치된 원자의 위치는 원점 원자로부터의 거리에 의해 특정화되었다(본 발명의 경우에는 관련된 염기의 포스페이트기 사이, 포스페이트기와 아미노/아미도기 사이, 및 아미노/아미도기 사이의 원자간 거리 측정이었다); 3)두번째 위치된 원자는 원점 원자 및 첫번째 위치된 원자와 관련해서 위치했다. 내부 좌표의 전체 세트는 도구 메뉴로부터 지정하여 모델 표를 나타내고 내부 좌표를 선택함으로써 얻었다.
11)실제 세포사멸-유도의 정도와 모델 예측과의 비교. 구형 또는 선형 형태, 및 아미노/아미도기에 의해 프레임화된 전기음성적 중심부의 원자간 거리를, 측정된 세포사멸 활성을 비교했다.
12)2개의 중심부가 발견되면, 세포사멸-유도의 정도가 더 높을 가능성이 높다.
5' 및 3' 말단의 하이드록시기 뿐 아니라 염기의 아미노/아미도기에 의해 프레임화 된 전기음성적 중심부에 대한 서술
중심부에 대한 하기 서술은 그 핵심적인 특성을 포함한다. 도 2a 및 2b는 이들 특성을 표시한다. 도 1은 중심부의 일반적인 배향을 제공한다(전면, 후면, 복면, 배면, 좌측면 및 우측면).
중심부내 염기의 배향. 중심부는 염기가 포스페이트 목걸이에 대해 동일 평면 또는 반대 평면에서 수직 배향으로 인접해 있을 경우에는 인접(A형)으로 정의된다. 중심부는 염기의 순서가 연속적이지 않을 경우에는 비-인접(B형)으로 정의된다. 바람직한 배향은 A형 또는 B형이고, 보다 바람직한 배향은 A형 및 B형이며, 가장 바람직한 배향은 포스페이트 목걸이에 수직인 동일 평면내 염기를 갖는 A형이다. 1개의 서열이 A형 및 B형을 둘다 보유할 수 있다. 주어진 서열에서 2개의 중심부가 발견되면, A1은 5' 말단의 제1 중심부를 나타내고, A2는 3' 말단의 제2 중심부를 나타낸다.
중심부 인 원자. X축은 중심부와 관련된 인 원자 사이의 원자간 거리를 나타낸다. 2개의 포스페이트 원자가 관여한다면(예컨대 5'-N1PN2PN3-3', 여기서 NX는 퓨린 또는 피리미딘 디옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고 P는 포스페이트기를 나타낸다) X는 대략 700 내지 1360 pm 사이이다. 4개의 포스페이트 원자가 관여한다면(예컨대 5'-N1PN2PN3PN4PN5-3', 여기서 NX는 2 내지 4 범위의 정수인 퓨린 또는 피리미딘 디옥시리보뉴클레오사이드의 갯수를 나타내고, P는 정수인 포스페이트기의 갯수를 나타낸다) X는 대략 750 내지 1300 pm 사이이다.
포스페이트 골격-염기 거리. Y축은 포스페이트 골격과 관여 염기의 가장 먼 원자간의 가장 긴 거리를 나타낸다. 이것은 주어진 염기의 회전 및 어느 원자(기)가 고려되는가(메틸기, 카르보닐기, 또는 아미노기)에 따라 달라질 것이다. Y는 대략 780 내지 2200 pm 이다. Y에 대해 바람직한 거리는 없다.
중심부 깊이. Z축은 위에서 보았을 때 중심부의 전면에서 후면까지의 거리를 나타낸다. Z는 약 400 내지 1300 pm 이다. 바람직한 거리는 없다.
아민/아미도 프레임화. 다음으로 정의할 매개변수 α는 포스페이트기에서 아민/아미도기까지의 가장 먼 프레임화 거리이다. α거리는 약 900 내지 1500 pm 이다.
아민/아미도 거리. 다음에 정의할 β는 아민/아미도기의 가장 먼 원자간 거리이다. 값은 약 300 내지 1700 pm 이다.
분자내 수소결합. 이 결합은 원자간 거리 뿐 아니라 분자의 크기 및 형태도 안정화시킨다. 수소결합 거리는 약 300 pm 이하이어야 한다. 가장 빈번하게 관찰되는 결합은 카르보닐기와 아미노기 또는 아미도기 간의 결합이다. 다음으로 가장 빈번한 수소결합 유형은 카르보닐기와 분자의 3' 및 5' 말단 하이드록시기 사이의 결합이다. 수소결합의 마지막 유형은 카르보닐기와 포스페이트의 하이드록시기 사이의 결합이다. 수소결합의 바람직한 유형은 상기 3가지 유형 모두를 포함하고, 보다 바람직한 수소결합은 카르보닐기와 아미노/아미도기 간, 및 카르보닐기와 포스페이트기 간의 결합이며, 가장 바람직한 수소결합은 카르보닐기와 아미노/아미도기 간의 결합이다.
5' 및 3' 말단 하이드록시기와 그 해당 포스페이트기까지의 거리. 마지막 매개변수는 5' 및 3' 말단 하이드록시기와 그 해당 포스페이트기까지의 거리이다. 바람직한 거리는 약 320 내지 650 pm 이고, 보다 바람직한 거리는 약 390 내지 420 pm 이며, 가장 바람직한 거리는 약 380 pm 이다.
무작위적으로 배향된 분자는 핑거를 형성하는 염기와, 개별적인 핑거로 분리시켜주는 넥을 갖는다. 이들 구조는 앞서 정의된 바와 같은 중심부 또는 중심부들을 보유하지 않으며 비활성이거나 약한 활성(< 20% 세포사멸-유도 활성, 표 4 참조)을 보유한다.
본 발명은 앞서 정의된 바와 같은 적절한 분자내 수소결합 및 X, Y, Z, α및 β수치와 관련된 음전하 또는 전기음성도(예를 들면 포스페이트기로부터의), 양전하 또는 전기양성도(예를 들면 아민 및 아미도기로부터의)의 분자 결합체는 암세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 보유함을 증명한다. 따라서, 본 발명은 세포사멸 활성의 예측을 위한, 분자 구조, 특히 올리고뉴클레오타이드 구조의 인실리코 분석 방법을 제공한다.
앞서 정의된 바와 같은 적절한 분자내 수소결합 및 X, Y, Z, α및 β수치와 관련된 음전하 또는 전기음성도(포스페이트기로부터의), 양전하 또는 전기양성도(아민 및 아미도기로부터의)의 분자 결합체를 포함하고, 생물학적 시험을 통해 암세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 증명하는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 다른 분자내에서 하나 이상의 3차원 중심부 또는 중심부들을 규명하기 위해 3차원적 컴퓨터 작업이 사용된다.
앞서 정의된 바와 같은 적절한 분자내 수소결합 및 X, Y, Z, α및 β수치와 관련된 음전하 또는 전기음성도(포스페이트기로부터의), 양전하 또는 전기양성도(아민 및 아미도기로부터의)의 이러한 분자 결합체는 암세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 보유할 것으로 제안된다. 이러한 분자 결합체를 올리고뉴클레오타이드 서열에 대해서 서술했지만, 상기 접근법은 다른 분자종에서의 분자 모델링 및 세포사멸 유도성 중심부 규명을 수행하기 위해서도 사용할 수 있음이 확실하다.
서열의 중심부-예측된 생물학적 활성을 평가하기 위해, 아넥신(Annexin) 염색을 수반하는 실시예 3에 나타낸 검정법 외에, 다른 시험관내 검정법도 임의로 사용할 수 있다. 생체내 검정법 또한 사용할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 각종 검정법은 전체를 본원에서 참조로 인용하는 PCT CA00/01467(WO 01/44465)에 기재되어 있다. 서열의 효능 평가를 위한 추가의 검정법은 전체가 본원에서 참조로 인용되는 옹커진 리서치 프로덕츠(Oncogene Research Products, P.O.BOX 12087, La Jolla, California, 92039; Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003, 구체적으로는 p.5-295)에 의해 기재되어 있다. 이러한 검정법은 DNA 프래그멘테이션, 세포사멸, 미토콘드리아 마커, 소포체 마커, 자유 뉴클레오솜, 핵 매트릭스 단백질과, 카스파제 1-14, 글루타티온, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, bcl-2 패밀리의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 카스파제 및 관련 단백질의 검출 및 활성을 분석하도록 고안된 검정법, Fas/TNR-R 수퍼 패밀리, PARP 관련 산물의 분석법, 세포사멸 신호 변환기의 분석법, 사멸 수용기, Apo2, 디코이(decoy) 수용기를 포함하는 각종 신호 수용기의 분석법, 세포사멸 막단백질, 신경계 세포사멸 마커, 세포 주기 및 세포 증식에 대한 각종 마커, 유사분열 키나제의 분석법, 브로모디옥시유리딘 검정법, 및 p53 검정법을 포함한다. 본 발명의 분석 방법으로 규명된 서열의 효능 평가는 또한 옹커진 리서치 프로덕츠(Oncogene Research Products, P.O.BOX 12087, La Jolla, California, 92039; 전체가 본원에서 참조로 인용되는 Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003, 구체적으로는 p.99-104 및 p.214-255)에 의해 기재된 바와 같이, 세포사멸 유도제 및 세포 동기화 시약과 같은 다른 약제 및 치료제의 존재하에서도 측정했다. 이러한 약제는 액티노마이신 D, 앰피도콜린, A23187, 카페인, 캄프토테신, 사이클로헥시미드, 덱사메타손, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 하이드록시우레아, 파클리탁셀, 스타우로스포린, 티미딘, 빈블라스틴, 레티노산, 에토포사이드, 오카다산, 빈크리스틴 및 메토트렉세이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하기 실시예가 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공되지만, 이와 동시에 임의의 제한을 구성하는 것은 아니다. 오히려, 본원의 기재사항을 읽은 후, 본 발명의 취지에서 벗어나지 않는 한 당업자에게 제안될 수 있는 각종 구체예, 변형, 및 이에 상당하는 것에 의지할 수 있음을 분명하게 이해해야 한다.
실시예 1
디옥시리보핵산 서열의 제조
포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 서열은 시그마-제노시스(Sigma-Genosys; Woodlands, TX)에서 애버커스 세그멘티드 신테시스 테크놀러지(Abacus Segmented Synthesis Technology)를 사용하여 제조했다. 다른 언급이 없는 한, 서열은 사용하기 직전에, 오토클레이브 처리된 탈이온수 중에서 또는 염수(이에 한정되지 않음)와 같은 약학적 허용성 완충액 중에서 분산시켰다.
실시예 2
세포 및 처리
인간 Jurkat T 세포 백혈병 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; Rockville, MD)으로부터 입수했다. 37℃, 5% CO2의 대기 중에서, Jurkat T 세포를 RPMI 1640 배양액에 유지시키고, 10% 열-비활성화(56℃, 30분) 태송아지 혈청으로 보충시켰다(모두 시그마 알드리치(Sigma Aldrich; Canada)에서 입수). 세포를 6-웰의 편평바닥 조직 배양 플레이트에 배양액 ml당 2 ×105 세포수로 접종하고 최종 농도 53μM인 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양했다. 다른 농도의 올리고뉴클레오타이드 시험은 이들이 농도 의존적인 방식으로 세포사멸을 유도함을 증명했다.
실시예 3
세포사멸의 분석
제조업자의 권고에 따라 아넥신 V FITC 및 요오드화 프로피듐(PI)(비디 파민젠(BD Pharmingen; San Diego, Ca. USA))으로 염색한 세포를 사용하여 세포사멸을 측정했다. 흘림세포계측법(Flow Cytometry(FCM))으로 세포 형광을 측정했다. FCM 및 데이터 분석은 CELLQuest 프로그램을 사용하는 FACSCalibur 기계(아넥신 V에 대 해 여기 488 nm, 방출 530 nm 및 PI에 대해 580 nm)를 사용하여 수행했다.
실시예 4
3차원 분자 모델링
특정 서열의 3차원 이미지를 생성하기 위해 Chem3D 버젼 5.0 및 6.0 소프트웨어(캐브릿지소프트 코포레이션(CabridgeSoft Corporation; Cambridge, MA, USA))를 사용했다. 원자의 운동을 모의실험하기 위해, 디폴트값 300°K에서 뉴턴 역학을 사용하여 모델의 온도가 증가될 때의 운동에너지를 더함으로써 최소 에너지 입체구조의 분자 역학 계산(MM2; Allinger N. L., J. Chem., 1993, 14:755-68)을 수행했다. 분자 동력학이 유효한 온도 범위 뿐 아니라 분자 동력학 값도 기재했다. 3차원 모델링은 중심부로 정의된, 분자내 그룹화의 부재 또는 존재를 규명하기 위해서 수행되었다. 전기음성적 전하(포스페이트기 및 염기 카르보닐기), 및 전기양성적 전하(아미노기, 아미도기, 또는 3' 및 5' 말단 하이드록시기)의 공간적 배열 또한 분석했다. 3차원 모델에서 분자내 그룹화가 관찰되었을 때, 공간적 특징은 올리고뉴클레오타이드내에서의 포스페이트기의 편재화, 아민/아미도기의 편재화, 및 하이드록시기, 또는 분자내 그룹화의 위치에 따라 정의되었다. 생성된 구조는 왼쪽에는 5' 말단이, 오른쪽에는 3' 말단이 존재했다.
공간적 배향은 도 1에 나타낸 바를 특징으로 한다. 도 2a에 나타낸 바와 같이 단순화시킨 이상적 3차원 서열은 복면의 포스페이트기(원)와 2-디옥시리보오스 단위(원기둥) 및 배면의 수평 배향 염기(각기둥)로 구성되는 것으로 사료되지만, 이 가설에 얽매이고자 하는 것은 아니다.
실시예 5
상대적으로 약한(< 20%) 세포사멸 활성을 갖는 ODN
컴퓨터적 분석의 결과 및 세포사멸-유도 활성과의 상관관계를 표 1에 요약했다. 3 내지 8개 사이의 염기 및 20% 미만의 세포사멸 값을 함유한 올리고뉴클레오타이드는 규명가능한 3차원 프레임화 중심부를 보유하지 않았다. 약한 세포사멸 활성을 갖는 서열의 전형적인 도해적 3차원 구조를 도 3, 4, 및 5에 나타냈다.
표 1
약한(< 20%) 세포사멸 활성을 갖는 서열의 데이터
Figure 112004006413811-pct00001
실시예 6
중간의(> 20% < 40%) 세포사멸 활성을 갖는 ODN
컴퓨터적 분석의 결과 및 세포사멸-유도 활성과의 상관관계를 표 2에 요약했다. 3 내지 8개 사이의 염기 및 20% 초과, 40% 미만의 세포사멸 활성을 함유한 올리고뉴클레오타이드는 A형 또는 B형의 규명가능한 중심부를 보유했다. 전형적인 도해적 3차원 구조를 도 6 내지 8에 나타냈다.
표 2
중간의 세포사멸 활성을 갖는 서열의 데이터
Figure 112004006417635-pct00063
실시예 7
높은(≥41% ≤80%) 활성을 갖는 ODN
컴퓨터적 분석의 결과 및 세포사멸-유도 활성과의 상관관계를 표 3에 요약했다. 3 내지 7개 사이의 염기 및 41% 이상, 80% 이하의 세포사멸 활성을 함유한 올리고뉴클레오타이드는 A형 또는 B형의 규명가능한 중심부를 보유했다. 전형적인 도해적 3차원 구조를 도 9 내지 13에 나타냈다.
실시예 8
3차원 입체구조 및 세포사멸 활성에 대한 포스포디에스테르 대 포스포로티오에이트 골격의 영향
포스포디에스테르 골격을 갖는 서열 GGGTGG(표 3 및 도 12)와 포스포로티오에이트 골격을 갖는 GGGTGG(표 1 및 도 5)의 활성 및 3차원 입체구조 비교는 세포사멸-유도 활성(각각 50% 및 0%)의 변화가, 전면 바닥 G4의 아미노기 및 배면 맨위 G5의 아미노기 뿐 아니라 처음 3개 G의 우세한 평면 배향이 나머지 2개 G를 프레임화 중심부로부터 배제시키는 데서 기인하는, 강한 전기음성도의 프레임화 중심부의 손실과 관련있음을 보여준다.
표 3
높은 세포사멸 활성을 갖는 서열의 데이터
Figure 112004006413811-pct00003
실시예 9
3' 또는 5' 변형은 세포사멸-유도성 중심부의 손실을 초래하지 않는다
3' 변형 서열 GGGTGG-포스페이트(표 3, 도 9), 5' 변형 서열 포스페이트-GGGTGG(표 3, 도 11)는 모두 프레임화 중심부를 함유했다. 활성의 중심부를 함유한 올리고뉴클레오타이드의 3', 5' 또는 3'과 5' 변형은 이러한 중심부의 손실을 일으키는 입체구조 변화를 초래시키지 않는다.
실시예 10
서열의 세포사멸 효능 예측
표 4의 서열을 본 발명의 방법으로 분석하여 이들이 중심부를 보유하는지를 측정했다. 예측은 서열이 임의적으로 설정한 20%의 세포사멸을 유도하는 능력을 보유하는지에 대해 이루어졌다. 즉, 세포사멸 활성의 예측은 20%를 넘는 활성을 의미한다. 그 다음, 서열을 세포사멸 활성에 대해 시험관내 시험했다. 결과는 표 4에 제시되어 있으며 세포사멸 활성의 예측에 대한 매우 높은 성공율을 나타내고 있다. 본 방법은 분석된 각 서열에 대해서 성공적이었다. 이들 데이터는 본 발명의 인실리코 방법이 상이한 정도의 세포사멸 활성을 갖는 서열을 규명함으로써, 생물학적으로 시험하기 위한 서열의 우선순위 선정에 대한 기초를 제공함을 증명한다.
표 4
세포사멸-유도 활성을 알 수 없는 새로운 서열을 사용한 방법의 예측값
Figure 112004006413811-pct00004
전술한 내용은 단지 본 발명의 바람직한 구체예에 관한 것이며 첨부한 청구항에 규정된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 한 다수의 변형 및 변경이 가능함을 이해해야 한다.

Claims (7)

  1. 올리고뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 중심부(centrum)를 함유하는지 측정하는 올리고뉴클레오타이드 서열의 분석을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 예측하는 컴퓨터 기반 방법으로서,
    상기 분석은 X가 700 내지 1360 pm이고, Y가 780 내지 2200 pm이며, Z가 400 내지 1300 pm이고, 알파(α)는 900 내지 1500 pm이며, 베타(β)는 300 내지 1700 pm인 경우 올리고뉴클레오타이드 서열 내에 중심부가 존재하는 것으로 분석하고,
    상기 X는 중심부와 관련된 인 원자 사이의 원자간 거리이고, 상기 Y는 포스페이트 골격과 관여 염기의 가장 먼 원자 간의 가장 긴 거리이며, 상기 Z는 중심부 전면과 후면 사이의 원자간 거리이고, 상기 알파는 포스페이트기에서 아민/아미도기까지의 가장 먼 프레임화 거리이며, 상기 베타는 아민/아미도기의 가장 먼 원자간 거리이고,
    상기 생물학적 활성은 세포 증식의 억제, 세포 주기 정지 또는 자가세포사멸의 유도인.
    올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 예측하는 컴퓨터 기반 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분석이 전기음성도, 전기양성도, 분자내 수소결합 및 원자간 거리에 대해 서열을 검사하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 예측하는 컴퓨터 기반 방법.
  3. 올리고뉴클레오타이드 서열을 화학적 설계 소프트웨어에 입력하는 단계;
    입력된 서열의 에러를 점검하는 단계;
    입력된 서열의 3차원 모델을 생성하는 단계;
    3차원 모델의 에너지를 최소화하는 단계;
    화학적 분석 소프트웨어를 사용하여 분자 동력학을 계산하는 단계;
    3차원 모델의 용매 접근가능 표면을 표시 수단 상에 표시하는 단계;
    3차원 모델 내 구형 및 선형 도메인을 규명하는 단계;
    분자내 수소결합을 규명하는 단계;
    전기음성적 중심부를 형성할 수 있는 포스페이트기를 규명하는 단계;
    3차원 모델 내 염기의 공간적 배향을 규명하는 단계; 및
    올리고뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 중심부(centrum)를 함유하는지 분석하는 단계를 포함하는,
    올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 예측하는 컴퓨터 기반 방법으로서,
    상기 분석은 X가 700 내지 1360 pm이고, Y가 780 내지 2200 pm이며, Z가 400 내지 1300 pm이고, 알파(α)는 900 내지 1500 pm이며, 베타(β)는 300 내지 1700 pm인 경우 올리고뉴클레오타이드 서열 내에 중심부가 존재하는 것으로 분석하고,
    상기 X는 중심부와 관련된 인 원자 사이의 원자간 거리이고, 상기 Y는 포스페이트 골격과 관여 염기의 가장 먼 원자 간의 가장 긴 거리이며, 상기 Z는 중심부 전면과 후면 사이의 원자간 거리이고, 상기 알파는 포스페이트기에서 아민/아미도기까지의 가장 먼 프레임화 거리이며, 상기 베타는 아민/아미도기의 가장 먼 원자간 거리이고,
    상기 생물학적 활성은 세포 증식의 억제, 세포 주기 정지 또는 자가세포사멸의 유도인.
    올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 예측하는 컴퓨터 기반 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 시험하는 단계를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 서열의 생물학적 활성을 예측하는 컴퓨터 기반 방법.
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