DE60211206T2 - Zusammenhang zwischen konformation und biologischer aktivität von apoptose induzierenden phosphodiesteroligonukleotiden - Google Patents

Zusammenhang zwischen konformation und biologischer aktivität von apoptose induzierenden phosphodiesteroligonukleotiden Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt auf der Grundlage der dreidimensionalen Struktur und Ladungscharakteristika von Oligonukleotiden ein computergestütztes Verfahren zur Vorhersage, ob diese Oligonukleotide in Krebszellen Apoptose induzieren können, bereit.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Krebs ist eine anormale, vernetzte Anhäufung atypischer Zellen, welche aus einem Übermaß an Proliferation oder einem unzureichendem Maß an Zelltod oder einer Kombination von beiden herrühren kann.
  • Die Proliferation ist der Kulminationspunkt den eine Zelle während des Zellzyklus durchläuft und der zur Teilung einer Zelle in zwei Zellen führt. Die fünf Hauptphasen des Zellzyklus sind G0, G1, S, G2 und M. Während der G0-Phase befinden sich die Zellen im Ruhezustand. Zu einem gegebenen Zeitpunkt befinden sich die meisten Zellen des Körper in diesem Stadium. Während der G1-Phase erzeugen Zellen, welche auf Signale zur Teilung ansprechen, die zur DNA-Synthese notwendige/n RNA und Proteine. Während der S-Phase (SE, frühe S-Phase; SM, mittlere S-Phase und SL, späte S-Phase) replizieren die Zellen ihre DNA. Während der G2-Phase werden Proteine in Vorbereitung auf die Zellteilung produziert. Während der mitotischen (M) Phase teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen. Abweichungen im Verlauf des Zellzyklus treten in allen Krebsarten auf und können aus einer Überexpression von Genen, Mutation von regulatorischen Genen oder der Außerkraftsetzung von Kontrollstellen für geschädigte DNA herrühren (Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 8:903, 1997).
  • Apoptose oder programmierter Zelltod ist der physiologische Vorgang zur Abtötung und Entfernung unerwünschter Zellen und stellt einen Mechanismus dar, mittels welchem chemotherapeutische Mittel Krebszellen abtöten. Apoptose ist durch ausgeprägte morphologische Veränderungen innerhalb der Zellen gekennzeichnet, welche eine Kondensation des Kernchromatins, ein Schrumpfen der Zelle, Zersetzung des Zellkerns, die Bildung von Ausstülpungen und Bläschen an der Plasmamembran („plasma membran blebbing") und die Bildung von membrangebundenen apoptotischen Körpern umfassen (Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68:251, 1980). Die Translokation von Phosphatidylserin von der innenseitigen Oberfläche der Plasmamembran zur äußeren Oberfläche fällt zeitlich mit der Chromatinkondensation zusammen und wird als ein zelluläres Merkmal für Apoptose betrachtet (Koopman, G. Et al., Blood, 84:1415, 1994). Vom eigentlichen Apoptosemechanismus ist bekannt, dass er durch die Aktivierung einer Familie von Cysteinproteasen, welche als Caspasen bekannt sind, vermittelt wird. Jedoch hat sich gezeigt, dass die meisten auf die Induktion von Apoptose gerichteten Antikrebstherapien aus dem Stand der Technik für klinische Anwendungen nicht zweckentsprechend sind. Viele dieser Therapien sind leistungsschwach oder toxisch, weisen ungünstige Nebenwirkungen auf, führen zur Entwicklung von Resistenzen gegen Wirkstoffe oder Immunosensibilisierung und schwächen den Empfänger. Viele Erkrankungen oder Zustände sind durch eine unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet und sind dem durchschnittlichen Mediziner oder Tierarzt bekannt.
  • Die Induktion des programmierten Zelltods via Induktion von Seneszenz (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:20, 1995) oder Apoptose (Wyllie et al., Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980) ist für die Behandlung von Erkrankungen, welche eine anormale Anhäufung unerwünschter Zellen umfassen, wie beispielsweise aber nicht beschränkt auf Krebs, autoreaktive, autoimmune, entzündliche oder proliferative Erkrankungen, wichtig. Jedoch haben sich die meisten Antikrebstherapien aus dem Stand der Technik, ob sie nun auf die Induktion von Apoptose oder auf die Stimulation des Immunsystems gerichtet sind, für klinische Anwendungen als nicht zweckentsprechend erwiesen. Viele dieser Therapien sind leistungsschwach oder toxisch, weisen ungünstige Nebenwirkungen auf, führen zur Entwicklung von Resistenzen gegenüber Wirkstoffen oder Immunosensibilisierung und schwächen dem Empfänger. Neue Verfahren zur Bewertung von Molekülen werden benötigt, um vorherzusagen, ob sie eine gewünschte biologische Aktivität besitzen.
  • Synthetische Oligonukleotide sind polyanionische Sequenzen, die von Zellen internalisiert werden (Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197:95, 1994). Für synthetische Oligonukleotide wird beschrieben, dass sie selektiv an Nukleinsäuren (Wagner, R., Nature, 372:333, 1994) an spezifische zelluläre Proteine (Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999) und an spezifische Kernproteine binden (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem., 252:207, 1998), um die Proliferation von Krebszellen zu hemmen.
  • Für synthetische Sequenzen mit 27 Basen, welche Guanin (G) und variable Mengen Thymin (T) (Oligonukleotide GTn) enthalten, wobei n ≥ 1 oder ≤ 7 ist und wobei die Zahl der Basen ≥ 20 ist (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem., 252:207, 1998), wird beschrieben, dass sie das Wachstum von Krebszellen durch sequenzspezifisches Binden an ein 45 kDa Kernprotein hemmen, wohingegen für GTn beschrieben wird, dass sie gegen Krebszelllinien inaktiv sind (Morassutti et al., Nucleosides and Nucleotides, 18:1711, 1999), wobei die Zahl der Basen ≤ 20 ist. Für zwei synthetische GT-reiche Oligonukleotide mit 15 und 29 Basen mit 3'-Aminoalkylmodifikationen wird die Bildung von G-Quartetten beschrieben, die an das Nukleolin binden und die Proliferation von Krebszelllinien hemmen (Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999). Für das synthetische sechsbasige TTAGGG-Phosphorthioat, welches eine Sequenz identisch zu der der Telomerrepeatsequenz aus Säugern aufweist, wird beschrieben, dass es die Proliferation von Burkitt's Lymphomazellen in vitro und in vivo hemmt (Mata et al., Toxicol. Applied Pharmacol., 144:189, 1997). Allerdings wird für das synthetische sechsbasige TTAGGG-Phosphodiesternukleotid beschrieben, dass es keine Antitelomeraseaktivität aufweist (US-Patent Nr. 5,643,890).
  • Deoxyribonukleotide mit biologischer Aktivität, wie beispielsweise Antisense DNA (mRNA-bindende oder triplex-bindende DNA) oder immunostimulatorische CpG-Motive sind durch sequenzspezifische lineare Motive gekennzeichnet, welche häufig durch intramolekulare Basenpaarbindung stabilisiert werden.
  • Rückgratmodifikationen, wie beispielsweise Phosphorthioat-Substitutionen, wirken sich nicht nachteilig auf die Aktivität dieser Moleküle aus und steigern diese oftmals.
  • Wir haben kürzlich eine Zusammensetzung und ein Verfahren beschrieben, umfassend 3'-OH, 5'-OH synthetische Oligonukleotide mit 2 bis 20 Basen ausgewählt aus der Gruppe, die aus (GxTy)n, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb, a(TyGx)nb besteht, wobei x und y eine ganze Zahl zwischen 1 und 7 ist, n eine ganze Zahl zwischen 1 und 12 ist, a und b eines oder mehrere As, Cs, Gs oder Ts sind, wobei die Sequenz zwischen 2 und 20 Basen aufweist und wobei die Sequenz eine Reaktion induziert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus einer Induktion des Zellzyklusarrests, einer Hemmung der Proliferation, einer Induktion der Caspaseaktivierung und einer Induktion von Apoptose in einer Reihe von Krebszellen (PCT CA00/01467, WO 01/44465).
  • Computergestützte Verfahren erlauben eine Korrelation von dreidimensionalen molekularen Strukturen mit biologischer Aktivität und ermöglichen eine Vorhersage der Konformation aktiver Moleküle. Modellierung bringt die Verwendung mathematischer Gleichungen mit sich, die in der Lage sind, das untersuchte Phänomen richtig darzustellen. Die Analyse molekularer Mechanismen (Allinger, N.L., J. Comput. Chem., 12, 844, 1991) kann verwendet werden, um strukturelle und konformative Beziehungen zu analysieren. Die grundlegende Annahme molekularer Mechanik ist, dass Daten, welche für kleine Moleküle bestimmt worden sind (Bindungslänge, Bindungswinkel, etc.) auf größere Moleküle extrapoliert werden können. Molekulare Modellierungsansätze sind verwendet worden, um die Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität zu bestimmen und um die Vorhersage von aktiven dreidimensionalen molekularen Konformationen zu ermöglichen (N. Evrard-Todeschi et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 38:742, 1998; Chen H. et al., J. Med. Chem. 36:4094, 1993; A. Guarna et al., J. Med. Chem, 40:3466, 1997; M. Read, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:4844, 2001).
  • Es gibt deshalb einen fortdauernden Bedarf zur Identifizierung neuer dreidimensionaler Konformationen oder struktureller Motive in Oligonukleotiden, die bei der Vorhersage der biologischen Aktivität dieser Oligonukleotide nützlich sind, insbesondere im Hinblick auf deren Fähigkeit, zelluläre Reaktionen in Zellen zu induzieren. Es besteht an Bedarf nach der Fähigkeit, zelluläre Reaktionen einschließlich Reaktionen, wie beispielsweise Apoptose in Krebszellen, vorherzusagen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß Anspruch 1 erfüllt die vorliegende Erfindung durch Bereitstellung eines computergestützten Verfahrens, welches bei der Vorhersage, ob Oligonukleotidsequenzen apoptotische Aktivität besitzen, nützlich ist diesen Bedarf. Dieses in silico-Verfahren sagt die relative Wirksamkeit der Oligonukleotidsequenz Apoptose zu induzieren, ebenfalls voraus. Dieses Verfahren stellt eine rationale Grundlage zur in silico-Bewertung oder zum Screening von Oligonukleotidzusammensetzungen im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, bereit, wobei ein Mittel bereitgestellt wird, spezifische Oligonukleotidzusammensetzungen zum weiteren Austesten in vivo oder in vitro auszuwählen. Diese Erfindung stellt eine signifikante Kostenersparung bei der Wirkstoffkonzipierung und -entwicklung bereit, durch: a) Identifizierung von Oligonukleotidzusammensetzungen mit der spezifisch vorhergesagten biologischen Aktivität; b) Vorhersage der Wirksamkeit der Oligonukleotidzusammensetzungen mit der spezifischen vorhergesagten biologischen Aktivität; und c) Verringerung der Zahl an Oligonukleotidzusammensetzungen mit Kandidatenstatus, welche in vitro und in vivo auf apoptotische Aktivität auszutesten sind.
  • Die Vorhersage, ob eine Sequenz in der Lage ist Apoptose zu induzieren, ist bei etlichen Erkrankungen und Zuständen erwünscht, einschließlich aber nicht limitiert auf die folgenden: Krebs, hyperproliferative Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Arthritis, rheumatoide Arthritis, Entzündung, lymphoproliferative Erkrankungen, Restenose von Gefäßen nach Angioplastie und Asthma. Die Vorhersage, ob eine Sequenz in der Lage ist Apoptose zu induzieren, ist insbesondere bei Krebserkrankungen wünschenswert, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkoma, Sarcoidkarzinom, Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, kolorektales Karzinom, Nierenkrebs, Osteosarkom, Hautkrebs, Basalzellenkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Blasenkrebs, Hirnkarzinom, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Lymphknotentumor und davon abgeleitete Metastasen.
  • Die unerwartete Fähigkeit, Apoptose induzierende Aktivität in silico mit einem hohen Maß an Genauigkeit (>95 %) vorherzusagen, verringert den Bedarf für kostenintensive chemische Synthesen im Hochdurchsatzverfahren und Apoptose induzierendes Screening, wodurch die Identifizierung von biologisch aktiven Molekülen in einer sehr viel wirksameren und kosteneffektiveren Weise ermöglicht wird.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie die Entdeckung neuer therapeutischer Zusammensetzungen beschleunigt. Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie die Kosten zur Entdeckung neuer therapeutischer Zusammensetzungen durch Bereitstellen von Oligonukleotidsequenzen mit Kandidatenstatus zum biologischen Testen in vivo und in vitro bereitstellt. Diese Einsparungen wirken sich direkt auf die Kosten von therapeutischen Wirkstoffen für Patienten aus und dadurch auf die Industrie zur Gesundheitsfürsorge für Menschen und Tiere. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist ferner, dass sie die Kosten zur Entdeckung neuer therapeutischer Zusammensetzungen durch Vorhersage der Wirksamkeit von Oligonukleotidsequenzen absenkt und dadurch einen Schwerpunkt auf biologisches Testen in vivo und in vitro legt.
  • Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein computergestütztes Verfahren, welches bei der Bewertung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein computergestütztes Verfahren bereitzustellen, welches zur Bewertung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, um vorherzusagen, ob sie in der Lage sind, eine Reaktion in einer Zelle zu induzieren, wie beispielsweise eine Hemmung der Zellproliferation, eine Induktion des Zellzyklusarrests oder eine Induktion von Apoptose.
  • Es ist eine spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein computergestütztes Verfahren bereitzustellen, welches zur Bewertung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, um vorauszusagen, ob sie die Fähigkeit besitzen, in Zellen Apoptose zu induzieren.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein computergestütztes Verfahren bereitzustellen, welches zur Bewertung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, um so vorherzusagen, ob sie die Fähigkeit besitzen, in Krebszellen Apoptose zu induzieren.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, welches zur Identifizierung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, die bei der Behandlung von Krankheiten anwendbar sind.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches zur Identifizierung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, die bei der Behandlung von durch unerwünschte zelluläre Proliferation gekennzeichneten Erkrankungen und Zuständen nützlich sind.
  • Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches zur Identifizierung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, die bei der Behandlung von Erkrankungen und Zuständen, welche durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet sind, nützlich sind, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, Entzündung, Arthritis, Asthma, Restenose von Gefäßen nach Angioplastie, hyperproliferative Erkrankungen, lymphoproliferative Erkrankungen und Krebs.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches zur Identifizierung von Oligonukleotidsequenzen nützlich ist, die bei der Behandlung von Krebs nützlich sind.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Identifizierung von Molekülen mit Apoptose induzierender Aktivität in silico erlaubt, ohne auf chemische Synthese im Hochdurchsatzverfahren und Screeningverfahren nach biologischer Aktivität zurückgreifen zu müssen.
  • Die unerwartete und überraschende Fähigkeit der vorliegenden Erfindung vorherzusagen ob, eine Oligonukleotidsequenz die Fähigkeit und Wirksamkeit aufweist, eine zelluläre Reaktion zu induzieren, und insbesondere die Zellproliferation zu hemmen, das Fortschreiten des Zellzyklus zu arretieren und/oder Apoptose in Zellen zu induzieren, adressiert ein lange unerfülltes Bedürfnis in der Medizin und stellt einen wichtige Unterstützung für Tiere und Menschen bereit.
  • Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der folgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführungsform und den angefügten Ansprüchen offensichtlich.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. räumliche Definition der allgemeinen Orientierung eines Zentrums in drei Dimensionen (vorne, hinten, ventral, dorsal, seitlich links und seitlich rechts).
  • 2a. Schematische Darstellung eines umrahmten Zentrums für Elektronegativität in drei Dimensionen.
  • 2b. Schematische Darstellung eines umrahmten Zentrums für Elektronegativität in drei Dimensionen, wobei die wie in der Beschreibung gezeigten Variablen x, y, z, alpha (α) und beta (β) und die 5'- und 3'-Orientierung gezeigt sind. Außerdem sind Bereiche mit Elektronegativität von Phosphatgruppen, Bereiche mit Elektropositivität von Aminen und Amidogruppen, Phosphaten, Deoxyribose und Basen gezeigt.
  • 3-13. Die folgenden 3-13 bestehen jeweils aus im Folgenden dargelegten Ansichten:
    • a) Position 1 als Ausgangsposition
    • b) Position 2 nach 90°-Drehung um die x-Achse aus der Ausgangsposition
    • c) Position 3 nach 180°-Drehung um die x-Achse aus der Ausgangsposition
    • d) Position 4 nach 270°-Drehung um die x-Achse aus der Ausgangsposition
    • e) Position 1 als Ausgangsposition in schwarz und weiß, wobei die für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche gezeigt ist.
  • Die erste Position ist als körperliches Schwarz-und-Weiß-Bild und als Farbbild mit Punkten, welche die für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche darstellen, zweimal gezeigt. Zur besseren Übersichtlichkeit sind die Wasserstoffatome ausgeblendet. Um die Atome in den dreidimensionalen Sequenzen, die in den Figuren gezeigt sind, darzustellen, werden die folgenden Farben verwendet: Blau = Stickstoff; Grau = Kohlenstoff; Pink = Phosphor; Rot = Sauerstoff; Gelb = Schwefel. Die vier Rotationsansichten (a, b, c und d) werden als Beispiele bereitgestellt, um die kugelförmige Natur des Zentrums in verschiedenen Orientierungen zu zeigen.
  • 3. TGT
  • 4. GGGGGG
  • 5. GGGTGG Phosphorthioat-Rückgrat
  • 6. GGG
  • 7. TTGTGG
  • 8. GGGTGGGG
  • 9. GGGTGG_3P (3'-Phosphat)
  • 10. 5P_GGGAGG (5'-Phosphat)
  • 11. 5P_GGGTGG (5'-Phosphat)
  • 12. GGGTGG
  • 13. GGGGTGG
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt gemäß Anspruch 1 ein computergestütztes Verfahren bereit, welches zur Vorhersage nützlich ist, ob Nukleotidsequenzen die Fähigkeit besitzen, eine zelluläre Reaktion zu induzieren und insbesondere, ob sie die Fähigkeit besitzen, Zellproliferation zu hemmen, das Fortschreiten des Zellzyklus zu arretieren und/oder Apoptose in Zellen zu induzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sagt dieses in silico-Verfahren voraus, ob Oligonukleotidsequenzen die Fähigkeit besitzen, Apoptose zu induzieren. Dieses in silico-Verfahren sagt auch die relative Wirksamkeit der Oligonukleotidsequenzen voraus, eine zelluläre Reaktion zu induzieren und insbesondere Zellproliferation zu hemmen, das Fortschreiten des Zellzyklus zu arretiern und/oder Apoptose in Zellen zu induzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sagt dieses in silico-Verfahren die relative Wirksamkeit der Oligonukleotidsequenzen voraus, Apoptose in Zellen zu induzieren. Diese Erfindung stellt eine rationale Grundlage zur in silico-Bewertung oder zum Screening von Oligonukleotidzusammensetzungen bereit, um deren Fähigkeit Zellproliferation zu hemmen, das Fortschreiten des Zellzyklus zu arretieren, Caspasen zu aktivieren, PARP zu spalten und/oder Apoptose in Zellen zu induzieren, vorherzusagen, wobei so ein Mittel bereitgestellt wird, spezifische Oligonukleotidzusammensetzungen für weitere Tests in vivo oder in vitro auszuwählen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird verwendet, um zu bestimmen, ob eine Oligonukleotidsequenz ein oder mehrere Zentren besitzt, welche bei der Vorhersage, ob die Sequenz eine apoptotische biologische Aktivität aufweist, nützlich sind.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich Sequenz auf eine Ansammlung von Basen, Deoxyribose- und Phosphodiestergruppen in einer Oligonukleotidsequenz, welche eine identifizierbare kugelförmige dreidimensionale Struktur bilden (die auf dem Zentrum negativ geladener Phosphatgruppen basiert, umrahmt durch positive Ladungen von Amino/Amidogruppen von Basen auf der gegenüber liegenden Seite), die verwendet wird, um die Fähigkeit der Sequenz, in Zellen Apoptose zu induzieren, vorherzusagen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Zentrum" auf die Abwesenheit oder Anwesenheit einer intramolekularen Substruktur, die zwei oder mehr Phosphatgruppen und zwei oder mehr benachbarte Basen (Typ A Zentrum) oder nicht benachbarte Basen (Typ B Zentrum), mit oder ohne stabilisierende intermolekulare Wasserstoffbrückenbindung, umfasst. Das Zentrum ist definiert als benachbart (Typ A), wenn die Basen in einer senkrechten Orientierung in der gleichen oder entgegengesetzten Ebene zur Phosphatkette zueinander benachbart sind. Das Zentrum ist als nicht benachbart definiert (Typ B), wenn die Folge der Basen nicht aufeinander folgend ist. Eine bevorzugte Orientierung ist Typ A oder B, eine stärker bevorzugte Orientierung ist Typ A und B, eine am stärksten bevorzugte Orientierung ist Typ A mit den Basen in der gleichen Ebene senkrecht zur Phosphatkette. Wenn eine Sequenz ein Zentrum am 5'-Ende aufweist und ein zweites Zentrum am 3'-Ende aufweist, bezieht sich der Subscriptindex, z.B. A1, auf das Typ A-Zentrum am 5'-Ende. Subscript A2 bezieht sich auf das Typ A-Zentrum am 3'-Ende. Die gleiche Indizierung wird auf das Typ B-Zentrum angewendet. Ein Zentrum wird als umrahmt angesehen, wenn Amino- oder Amidogruppen oder beide Gruppen an den gegenüber liegenden Stellen der Phosphatkette auftreten.
  • Die folgende Notierung wird verwendet, um die Basensequenz in den Oligonukleotidsequenzen zu beschreiben: A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin.
  • Die folgenden Parameter werden bei der Beschreibung der dreidimensionalen Oligonukleotidsequenzen verwendet: A) alle Abstände sind in pm angegeben; B) von intermolekularen Wasserstoffbindungen wird angenommen, dass sie sich bilden, wenn der wechselseitige Abstand der teilnehmenden Atome weniger als 300 pm beträgt; und C) die molekulardynamischen Werte sind in kcal/mol angegeben.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich eine zelluläre Reaktion im Allgemeinen auf die Hemmung von Proliferation, ein Arretieren des Fortschreitens im Zellzyklus und/oder die Induktion von Apoptose in Zellen. Eine bevorzugte Reaktion ist die Induktion von Apoptose. Zellen umfassen jede beliebige Zelle, insbesondere Zellen, die unerwünschte Proliferation zeigen. Solche Zellen können bei hyperproliferativen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Arthritis, rheumatoider Arthritis, Entzündung, lymphoproliferativen Erkrankungen, Krebs und Asthma gefunden werden. Krebszellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Zellen aus Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkoma, Sarcoidkarzinom, Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, kolorektales Karzinom, Nierenkrebs, Osteosarkom, Hautkrebs, Basalzellenkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Blasenkrebs, Hirnkarzinom, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Lymphknotentumor und davon abgeleitete Metastasen.
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Formulierungen „therapeutische Behandlung" und „wirksame Menge" auf eine Menge einer dreidimensionalen Oligonukleotidsequenz, welche wirksam ist, Zellproliferation zu hemmen, ein Fortschreiten des Zellzyklus zu arretieren oder Apoptose in Zellen, einschließlich Krebszellen, zu induzieren.
  • Die Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge einer Oligonukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, an ein Tier, einschließlich Mensch, stellt eine therapeutische Behandlung dar, die einer Erkrankung vorbeugt, sie behandelt oder beseitigt, einschließlich aber nicht beschränkt auf Krebs, Arthritis, rheumatoide Arthritis, hyperproliferative Erkrankungen, Restenose von Gefäßen nach Angioplastie, lymphoproliferative Erkrankungen und Asthma.
  • Eine Induktion von Apoptose ist insbesondere bei Krebs wünschenswert, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkoma, Sarcoidkarzinom, Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, kolorektales Karzinom, Nierenkrebs, Osteosarkom, Hautkrebs, Basalzellenkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Blasenkrebs, Hirnkarzinom, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Lymphknotentumor und davon abgeleitete Metastasen.
  • Obwohl es nicht beabsichtigt ist, durch die folgende Ausführungen gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass eine molekulare Kombination negativer Ladungen oder Elektronegativität (z.B. von Phosphatgruppen), positiver Ladungen oder Elektropositivität (z.B. von Amino- und Amidogruppen) in einer Oligonukleotidsequenz in Verbindung mit geeigneten intramolekularen Wasserstoffbindungen und interatomaren Dimensionen, wie sie hierin bestimmt sind, die Fähigkeit besitzt, Apoptose in Krebszellen zu induzieren.
  • Computer Hardware und Software
  • Es ist selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung unter Verwendung beliebiger Computer, die über ausreichend Speicher und Rechengeschwindigkeit verfügen, um die vom Fachmann verwendete chemische Zeichensoftware handzuhaben und um die Parameter des Zentrums zu messen, durchgeführt werden kann. Messungen der verschiedenen Parameter des Zentrums werden durch Softwaremittel erreicht, welche gezeichnete Strukturen in 3D-Strukturen übersetzen.
  • Unter Verwendung der Software werden interatomare Abstände in der dreidimensionalen Struktur in pm (Picometer) gemessen, wobei das erste Atom ausgewählt wird und an der Spitze des Cursors (Zeiger) die Information über den Abstand zwischen diesen Atomen angezeigt wird.
  • Ferner kann jede chemische Software verwendet werden, welche die Bestimmung der Komponenten des Zentrums ermöglicht, die im Folgenden beschrieben werden. Solche Software ist dem Fachmann allgemein bekannt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die ChemDraw-Software verwendet. Die Chem3D-Software wird von Cambridgesoft.Com, Cambridge, MA, USA, bereitgestellt. Andere, dem Fachmann bekannte Softwarepakete zur molekularen Modellierung können verwendet werden, wie beispielsweise Sybill (von Tripos), Charm und Inside II (von Accelrys).
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von Personalcomputern, wie sie für Verbraucher allgemein zugänglich sind, durchgeführt werden, zum Beispiel Desktopeinheiten und Laptops, hergestellt von Dell, Apple, Compaq, Hewlett-Packard, Gateway, IBM oder leistungsfähigeren Computern, wie beispielsweise Silicon Graphics oder Cray Computer.
  • Der Computer ist operativ mit einem Mittel zur Eingabe von Information verknüpft, wie beispielsweise einer Tastatur, einem Touchscreen oder jeder anderen, dem Fachmann bekannten Eingabevorrichtung. Der Computer ist operativ mit Mitteln verbunden, wie beispielsweise Vorrichtungen zum Lesen und Beschreiben von CDs, einem Diskettenlaufwerk oder anderen, dem Fachmann bekannten Mitteln zum Abrufen und Eingeben von Information. Ferner kann der Computer mit dem Internet, dezentralen Datenbanken oder anderen Servern, die Zugang zu Datenbanken von chemischen Strukturen bereitstellen, operativ verknüpft sein, so dass, spezifische molekulare Strukturen betreffende Informationen schnell erhalten werden können.
  • Der Computer ist operativ verknüpft mit einem Mittel zur Anzeige oder Ausgabe von Information, wie beispielsweise Bildschirmen, Druckern und anderen, dem Fachmann bekannten Anzeigemitteln. Solche Mittel erlauben die Visualisierung einer dreidimensionalen Struktur von Oligonukleotidsequenzen und verschiedenen mit der Struktur verbundenen Parametern, wie zum Beispiel einer kugelförmigen Form, der Form der Phosphatrückgratorientierung und der Lokalisierung von Phosphatgruppen, 2-Deoxyribose, Purinen, Pyrimidinen, Aminogruppen, Amidogruppen, Hydroxylgruppen an 3'- und 5'-Enden und Zentren.
  • Allgemeines Verfahren der Erfindung zur in silico-Identifizierung von Zentren in Oligonukleotiden
  • Die folgenden Schritte beschreiben das allgemeine erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Zentren in einer Oligonukleotidsequenz.
    • 1) Zeichnung des Moleküls. Die Oligonukleotidmoleküle wurden unter Verwendung von ChemDraw v.5-Software gezeichnet.
    • 2) Überprüfung auf Fehler. Die Strukturen wurden überprüft, um sicherzustellen, dass die Atome, Bindungen und Valenzen korrekt waren.
    • 3) Translation und Analyse eines gezeichneten Modells durch Chem3D-Software. Die Struktur wurde gezeichnet und anschließend geöffnet, um unter Verwendung der Chem3D-Softwarestruktur, ein dreidimensionales Modell zu erzeugen. Wenn ein Fehler gefunden wurde (z.B. Doppelbindungen anstelle von Einzelbindungen), wurde eine Warnmeldung generiert, welche anzeigte, welche auf den Fehler hinwies. In einem solchen Fall wurde ChemDraw-Programm verwendet, um Änderungen in der gezeichneten Struktur vorzunehmen und das Verfahren wurde durch Öffnen der gezeichneten (korrigierten) Struktur in Chem3D-Software wiederholt.
    • 4) Minimieren von Energie. Zur Feststellung stabiler Konformationen war eine Energieminimierung erforderlich. Aus dem MM2-Menü in der Chem3D-Software wurde die Wahl „Minimize energy" getroffen. Der Defaultwert 0,1000 war ein vernünftiger Kompromiss zwischen Genauigkeit und Geschwindigkeit. Das Ergebnis enthielt die Werte der folgenden Parameter: Energie der Bindungslänge (bond stretching); Energie des Bindungswinkels (angle bending); Torsionsenergie; nicht Bindungsvermittelte Energie (non-bonded); van der Waals-Energie; elektrostatische Energie; Dipol/Dipolverteilung; Dipol/Ladungsverteilung; Biegeschwingung außerhalb der Ebene (out of plane bending); und Längen-Winkel (stretch-bend) Parameter. Die Längen-Winkel Parameter sind Kraftkonstanten für die Längen-Winkel Wechselwirkungsbezeichnungen in der obigen Liste von Elementen. Die Parameter sind bereits als Teil der Software installiert. X und y stellen jedes Nicht-Wasserstoffatom dar. Wenn ein Winkel gestaucht ist, verwendet das MM2-Kraftfeld die Längen-Winkel Kraftkonstanten, um die Bindungen vom Zentralatom im Winkel zu den zwei anderen Atomen im Winkel zu verlängern. Die sterische Gesamtenergie für die gegebene Konformation wird durch die Summe der oben erwähnten Werte (Energie der Bindungslänge; Energie des Bindungswinkels; Torsionsenergie; van der Waals Energie; elektrostatische Energie und Längen-Winkel Energie) in der Einheit kcal/mol ausgedrückt. Längen-Winkel-Kombinationen (stretch-bend cross terms) werden verwendet, wenn eine Kopplung zwischen Bindungslänge und Bindungswinkel stattfindet. Die Summe dieser Energien führt zu der sich ergebenden sterischen Gesamtenergie.
    • 5) Berechnung der molekularen Dynamik eines Moleküls bei 310 °K. Berechnungen zur molekularen Dynamik griffen auf Newtonsche Mechanismen zurück, um die Bewegung von Atomen zu simulieren, wobei kinetische Energie addiert oder subtrahiert wurde, wenn sich das Modell von niedriger zu höherer Temperatur oder umgekehrt bewegt. Die molekulare Dynamik wurde im Menü MM2 durch Auswählen Molecular Dynamics berechnet. Die vorliegende Berechnung verwendete die folgenden Default-Parameter: Schrittintervall: 2 fs; Rahmenintervall: 10 Femtosekunden (fs); Termination nach: 10.000 Schritten; Erwärmungs/Abkühlungsrate: 1 kcal/Atom/Picosekunde (ps); Zieltemperatur gesetzt auf 300 °K (K). Die Zieltemperatur wurde nach einer Serie von Versuchen auf 300 °K gesetzt, um die Abweichung zwischen 300 °K und 310 °K im Hinblick auf die Form der Moleküle und den Temperaturbereich eines jeden Moleküls zu bestimmen. Es wurde herausgefunden, dass der Default-Wert von 300 °K den Temperaturbereich bis zu 310 °K abdeckte (300 °K entspricht der Temperatur 37 °C, bei welcher die Experimente durchgeführt wurden). Es wurde beobachtet, dass, wenn die Temperatur auf 310 °K gesetzt wurde, der Bereich der berechneten Werte den 310 °K Bereich gewöhnlich überschritt.
    • 6) Anzeige von für Lösungsmittel zugänglichen Oberflächen, um die molekulare Konformation, Basenfinger und Nacken zwischen diesen Basenfingern zu identifizieren und um kugelförmige oder lineare Domänen von gegebenen Molekülen zu identifizieren. Eine für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche stellt Informationen über die gesamten Moleküle anstelle von Informationen über ein spezifisches Atom oder eine Bindung bereit. Die für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche stellt den Teil des Moleküls dar, der Lösungsmittelmolekülen zugänglich ist. Gewöhnliche Lösungsmittel weisen verschiedene Radiuswerte auf. Es wurde der Defaultwert von Wasser (140 pm) verwendet. Die Oberflächen zeigen Informationen über die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Moleküls an. Die Oberflächen zeigen Aspekte der äußeren Oberflächengrenzfläche (oder Elektronenverteilung) eines Moleküls an. Typen molekularer Oberfläche sind körperlich, vom Drahtgerüst-Typ (wire mesh), Punkte oder transluzent. Um die molekularen Oberflächen darzustellen, wurden im Menü View vier Auswahlen getroffen: A) die körperliche Oberfläche ist in einer blickdichten Gestalt gezeigt. Dies war nützlich, um Details der Oberfläche selbst und nicht der genau darunter liegenden Atome und Bindungen zu untersuchen. B) Das Drahtgerüst wurde als vernetztes Netz an Linien dargestellt. Das Drahtgerüst zeigt Merkmale der Oberfläche und erlaubt die Sicht auf Atome und Bindungen. C) Punkte wurden als eine Reihe unverknüpfter Punkte dargestellt. Dies wurde von uns verwendet, um die zugrunde liegende Struktur zu betrachten. D) Eine transluzente Oberfläche ist in einer körperlichen Form dargestellt, aber sie ist teilweise transparent, so dass die Atome und Bindungen sichtbar sind.
    • 7) Identifizierung intramolekularer Wasserstoffbrückenbindungen. Wasserstoffbrücken-Bindungen können sich ausbilden, wenn der Abstand gleich oder kleiner als 300 pm ist.
    • 8) Identifizierung des Vorliegens von Phosphatgruppen, welche eine Phosphatkette oder ein Kügelchen-ähnliches Erscheinungsbild als Grundlage zur Bildung eines stark elektronegativen Zentrums bilden. Wenn eine Phosphatkette vorlag, wurde die Größe des Zentrums berechnet.
    • 9) Bestimmung der räumlichen Orientierung der Basen für eine elektropositive Umrahmung in Bezug auf Phosphatgruppen in einem elektronegativen Zentrum.
    • 10) Messung der interatomaren Abstände der Amino/Amidogruppen und 3'- und 5'-Hydroxylgruppen von Phosphatgruppen. Unter Verwendung der Software wurden in der dreidimensionalen Struktur interatomare Abstände in pm (Picometer) gemessen, wobei das erste Atom ausgewählt wird und an der Spitze des Cursors (Zeigers) die Information über den Abstand zwischen diesen Atomen angezeigt wird. Interatomare Abstände: Die relative Position eines jeden Atoms in unserem Modell wurde durch einen Satz von Messungen bestimmt, welche als interne Koordinaten der Z-Matrix bezeichnet wurden. Die internen Koordinaten für jedes bestimmte Atom bestehen aus Messungen, im vorliegenden Fall Bindungslängen zwischen ihm und anderen Atomen (ausführlichere Analysen umfassen gegebenenfalls Bindungswinkel und dihedrale Winkel). Die Werte für interne Koordinaten wurden durch Auswahl von Werten aus dem Tools-Menü erhalten, wobei auf Zeige Modell-Tabellen (show model tables) gezeigt wurde und anschließend interne Koordinaten gewählt wurde. Die ersten drei Atome in einer Z-Matrix wurden wie folgt definiert: 1) Das Ausgangsatom war das erste Atom in der Z-Matrix und alle anderen Atome im Modell wurden in Bezug auf dieses Atom positioniert; 2) Das erste positionierte Atom wurde nur bezüglich des Ausgangsatoms positioniert. Die Position des zuerst positionierten Atoms wurde durch den Abstand vom Ausgangsatom beschrieben; (im vorliegenden Fall war dies die Messung der interatomaren Abstände zwischen Phosphatgruppen, zwischen Phosphatgruppen und Amino/Amidogruppen und zwischen Amino/Amidogruppen und beteiligten Basen); 3) Das zweite positionierte Atom wird bezüglich des Ausgangsatoms und des ersten positionierten Atoms positioniert. Der vollständige Satz an internen Koordinaten wurde aus dem Tools-Menü durch Zeigen auf die Modell-Tabelle, um diese anzuzeigen, und Auswählen der internen Koordinaten erhalten.
    • 11) Vergleich der Vorhersage aus dem Modell mit dem tatsächlichen Grad an Apoptoseinduktion. Es wurde ein Vergleich der kugelförmigen oder linearen Form und interatomarer Abstände des elektronegativen Zentrums, welches von Amino/Amidogruppen umrahmt war, unternommen und die apoptotische Aktivität gemessen.
    • 12) Wenn zwei Zentren gefunden wurden, liegt eine hohe Wahrscheinlichkeit für ein höheres Maß an Apoptoseinduktion vor.
  • Beschreibung eines elektronegativen Zentrums, welches sowohl von Amino/Amidogruppen von Basen als auch von Hydroxylgruppen an 5'- und 3'-Enden umrahmt ist.
  • Die folgende Beschreibung eines Zentrums umfasst dessen Schlüsselmerkmale. 2a und 2b zeigen diese Merkmale. 1 stellt die generelle Orientierung eines Zentrums bereit (Vorderseite, Rückseite, ventral, dorsal, seitlich links und seitlich rechts).
  • Orientierung von Basen im Zentrum. Ein Zentrum wird als benachbart (Typ A) definiert, wenn die Basen einer senkrechten Orientierung in der gleichen oder in der entgegengesetzten Ebene zu der Phosphatkette benachbart sind. Das Zentrum wird als nicht-benachbart (Typ B) definiert, wenn die Abfolge der Basen nicht aufeinander folgend ist. Eine bevorzugte Orientierung ist Typ A oder B, eine stärker bevorzugte Orientierung ist Typ A und B, die am stärksten bevorzugte Orientierung ist Typ A, wobei sich die Basen in der gleichen senkrechten Ebene zur Phosphatkette befinden. Eine Sequenz kann sowohl Typ A als auch Typ B aufweisen. Wenn in einer gegebenen Sequenz zwei Zentren gefunden wurden, stellt A1 das erste Zentrum am 5'-Ende und A2 das zweite Zentrum am 3'-Ende dar.
  • Phosphoratome im Zentrum. Die x-Achse stellt den interatomaren Abstand zwischen Phosphoratomen, die dem Zentrum angehören, dar. Wenn zwei Phosphatatome einbezogen sind (z.B. 5'-N1PN2PN3-3', wobei Nx für Purin- oder Pyrimidindeoxyribonukleoside steht und P für die Phosphatgruppe steht), beträgt x zwischen etwa 700 bis 1360 pm. Wenn vier Phosphatatome einbezogen sind, beträgt x etwa zwischen 750 bis 1300 pm (z.B. 5'-N1PN2PN3PN4PN5-3', wobei Nx für die Zahl an Purin- oder Pyrimidindeoxyribonukleosiden als ganze Zahl im Bereich von 2 bis 4 steht und P für die Zahl von Phosphatgruppen als ganze Zahl steht).
  • Phosphatrückgrat-Basenabstand. Die Y-Achse stellt den längsten Abstand zwischen dem Phosphatrückgrat und dem entferntesten Atom einer beteiligten Base dar. Dies hängt von der Rotation der gegebenen Base ab und davon, welches Atom (Gruppe) betrachtet wird (Methyl, Carbonyl oder Aminogruppe).Y ist gleich oder liegt zwischen etwa 780 bis 2200 pm. Es gibt keinen bevorzugten Abstand für Y.
  • Tiefe des Zentrums. Bei Betrachtung von oben stellt die Z-Achse den Abstand von der Vorderseite zur Rückseite des Zentrums dar. Z ist gleich oder liegt zwischen etwa 400 bis 1300 pm. Es gibt keinen bevorzugten Abstand.
  • Amin/Amido-Umrahmung. Der nächste bestimmende Parameter α ist der weiteste Umrahmungsabstand der Amino/Amidogruppen von den Phosphatgruppen. Der α-Abstand ist gleich oder liegt zwischen etwa 900 und 1500 pm.
  • Amin/Amidoabstand. Der nächste definierende Parameter β ist der weiteste interatomare Abstand der Amino/Amidogruppen. Der Wert ist gleich oder liegt zwischen etwa 300 bis 1700 pm.
  • Intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung. Diese Bindung stabilisiert sowohl die Größe und Form von Molekülen als auch interatomare Abstände. Abstände von Wasserstoffbrückenbindungen sollten gleich oder weniger als etwa 300 pm betragen. Die am häufigsten beobachtete Bindung ist eine via Carbonylgruppen und Amino- oder Amidogruppen. Der nächsthäufigste Typ von Wasserstoffbrückenbindung findet zwischen Carbonylgruppen und Hydroxylgruppen an den 3'- oder 5'-Enden der Moleküle statt. Der letzte Typ von Wasserstoffbrückenbindung findet zwischen Carbonylgruppen und den Hydroxylgruppen von Phosphaten statt. Ein bevorzugter Typ von Wasserstoffbrückenbindung umfasst alle drei Typen, eine stärker bevorzugte Wasserstoffbrückenbindung findet via Carbonylgruppen und Amino/Amidogruppen statt und zwischen Carbonylgruppen und Phosphatgruppen und die am stärksten bevorzugte Wasserstoffbrückenbindung findet über Carbonyl- und Amino/Amidogruppen statt.
  • Abstand der 5'- oder 3'-Hydroxylenden zu ihren dazugehörigen Phosphatgruppen.
  • Der letzte Parameter ist der Abstand der 5'- oder 3'- Hydroxylenden zu ihren dazugehörigen Phosphatgruppen. Der bevorzugte Abstand ist gleich oder liegt zwischen etwa 320 und 650 pm, ein stärker bevorzugter Abstand ist gleich oder liegt zwischen etwa 390 bis 420 pm und der am meisten bevorzugte Abstand ist etwa 380 pm.
  • Zufällig orientierte Moleküle weisen Basen auf, welche Finger mit Einschnürungen bilden, welche die einzelnen Finger voneinander trennen. Diese Strukturen besitzen kein wie oben bestimmtes Zentrum oder Zentren und sind entweder inaktiv oder besitzen eine schwache Aktivität (<20 % Apoptose induzierende Aktivität, siehe Tabelle 4).
  • Die vorliegende Erfindung zeigt, dass eine molekulare Kombination von negativen Ladungen oder Elektronegativität (zum Beispiel von Phosphatgruppen), positiven Ladungen oder Elektropositivität (zum Beispiel von Amin- oder Amidogruppen) in Verbindungen mit geeigneten intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen und mit wie oben bestimmten X, Y, Z, α und β Dimensionen die Fähigkeit besitzen, in Krebszellen Apoptose zu induzieren. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in silico Analyse von molekularen Strukturen, insbesondere Oligonukleotidstrukturen bereit, um so deren apoptotische Aktivität vorherzusagen.
  • Dreidimensional computergestützte Berechnung wird eingesetzt, um ein dreidimensionales Zentrum oder dreidimensionale mehrere Zentren in Oligonukleotidsequenzen oder anderen Molekülen zu identifizieren, die eine molekulare Kombination negativer Ladungen oder Elektronegativität (von Phosphatgruppen), positiver Ladungen oder Elektropositivität (von Aminen oder Amidogruppen) in Verbindung mit geeigneten intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen und mit wie oben bestimmten X, Y, Z, α und β Dimensionen umfassen und die bei biologischer Austestung die Fähigkeit zeigen, in Krebszellen Apoptose zu induzieren.
  • Es wird vorgeschlagen, dass eine derartige molekulare Kombination von negativen Ladungen oder Elektronegativität (beispielsweise von Phosphatgruppen), positiven Ladungen oder Elektropositivität (beispielsweise von Amin- und Amidogruppen) in Verbindung mit geeigneten intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen und mit wie oben bestimmten X, Y, Z, α und β Dimensionen die Fähigkeit besitzt, Apoptose in Krebszellen zu induzieren. Während eine solche molekulare Kombination für Oligonukleotidsequenzen beschrieben ist, ist es selbstverständlich, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um eine molekulare Modellierung auszuführen und um Apoptose induzierende Zentren in anderen molekularen Spezies zu identifizieren.
  • Zusätzlich zu dem in Beispiel 3 gezeigten Beispiel, welches Färbung mit Annexin umfasst, können gegebenenfalls andere in vitro Assays verwendet werden, um die über das Zentrum vorhergesagte biologische Aktivität von Sequenzen zu bewerten. Es können auch in vivo Assays verwendet werden. Verschiedene Assays, die für diesen Zweck nützlich sind, sind in PCT CA00/01467, WO 01/44465 beschrieben. Zusätzliche Assays zur Bewertung der Wirksamkeit der Sequenzen werden in Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, Californien, 92039 (Apoptosis Catalog an Technical Guide 2002-2003, insbesondere Seiten 5-295) beschrieben. Solche Assays umfassen Assays, welche konzipiert wurden, um DNA-Fragmentierung, Apoptose, mitochondrielle Marker, Marker des endoplasmatischen Retikulums, freie Nukleosomen, Matrixproteine des Kerns, Detektion und Aktivität zahlreicher Caspasen und verwandter Proteine einschließlich aber nicht beschränkt auf Caspase 1 bis 14, Glutathion, Superoxiddismutase, Mitglieder der bcl-2-Familie, Analyse der Fas/TNR-R Superfamilie, Produkten, die mit PARP im Zusammenhang stehen, Analyse von apoptotischen Signaltransducern, Analyse von verschiedenen Signalrezeptoren, einschließlich Death-Rezeptor, Apo2, Decoy-Rezeptoren, Analyse apoptotischer Membranproteine, Nervensysteme, apoptotische Marker, zahlreiche Marker des Zellzyklus und der Zellproliferation, mitotische Kinasen, Bromdeoxyuridin-Assays und p53-Assays zu analysieren. Die Bewertung der Wirksamkeit der mit dem analytischen Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen kann auch in Gegenwart anderer Mittel und therapeutischer Mittel bestimmt werden, wie beispielsweise Inducern von Apoptose und Reagenzien zur Zellsynchronisation, wie beispielsweise beschrieben in Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, Kalifornien, 92039 (Apoptosis Catalog an Technical Guide 2002-2003, insbesondere Seiten 99-104 und Seiten 214-255). Solche Mittel umfassen sind aber nicht beschränkt auf Actinomycin D, Amphidocolin, A23187, Koffein, Camptothecin, Cycloheximid, Dexamethason, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Hydroxyharnstoff, Paclitaxel, Staurosporin, Thymidin, Vinblastin, Retinsäure, Etoposid, Okadainsäure, Vincristin und Methotrexat.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Deoxyribonukleinsäuresequenzen
  • Phosphodiester und Phosphorthioatsequenzen wurden von Sigma-Genosys (Woodlands, TX) unter Verwendung von Abacus Segmented Synthesis Technology hergestellt. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Sequenzen kurz vor der Verwendung in autoklavierten, deionisierten Wasser oder in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie beispielsweise aber nicht beschränkt auf Salzlösung, gelöst.
  • Beispiel 2
  • Zellen und Behandlung
  • Humane leukämische Jurkat T Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen. Die Jurkat T-Zellen wurden in einer Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C in RPMI 1640 Medium gehalten, welches mit 10 hitzeinaktiviertem (56 °C, 30 min) fötalen Kälberserum (alle von Sigma Aldrich, Kanada) supplementiert war. Die Zellen wurden mit 2 × 105 Zellen/ml Medium in 6-Loch-Float-Bottom-Gewebekulturplatten angeimpft und mit Oligonukleotiden bei einer Endkonzentration von 53 μM inkubiert. Das Austesten anderer Oligonukleotidkonzentrationen zeigte, dass Apoptose in konzentrationsabhängiger Weise induziert wird.
  • Beispiel 3
  • Analyse von Apoptose
  • Apoptose wurde durch Anfärben der Zellen mit Annexin V FITC und Propidiumjodid (PI) (BD Pharmingen, San Diego, Ca. USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die zelluläre Fluoreszenz wurde durch Flusscytometrie (FCM) bestimmt. Die FCM- und Datenanalysen wurden unter Verwendung eines FACSCalibur-Instruments (Anregung 488 nm, Emission 530 nm für Annexin-V und 580 nm für PI) unter Verwendung des Programms CELLQuest durchgeführt.
  • Beispiel 4
  • Dreidimensionales molekulares Modelling
  • Chem3D-Version 5.0 und 6.0 Software (CabridgeSoft Corporation, Cambridge, MA) wurde verwendet, um dreidimensionale Abbildungen von spezifischen Sequenzen zu erzeugen. Computergestützte Berechnungen zur molekularen Mechanik von Konformationen mit minimaler Energie (MM2; Allinger N.L., J. Comput. Chem., 1993,14:755-68) wurden bei einem Defaultwert von 300 °K unter Verwendung Newton'scher Mechanik ausgeführt, um die Bewegung von Atomen zu simulieren, wobei kinetische Energie zugeführt wird, wenn die Temperatur des Modells ansteigt. Sowohl die Werte zur molekularen Dynamik als auch die Werte zum Temperaturbereich, in welchem die molekulare Dynamik valide ist, sind angegeben. Dreidimensionales Modellieren wurde durchgeführt, um die Abwesenheit oder Anwesenheit intramolekularer Gruppenbildung, definiert als ein Zentrum, zu identifizieren. Die räumliche Anordnung elektronegativer Ladungen (Phosphat- und Carbonylgruppen von Basen) und elektropositiven Ladungen (Amino-, Amido- oder Hydroxylgruppen an 3'- und 5'-Enden) wurde ebenfalls analysiert. Wenn in den dreidimensionalen Modellen eine intramolekulare Gruppenbildung beobachtet wurde, wurden die räumlichen Charakteristika gemäß der Lokalisierung von Phosphatgruppen, der Lokalisierung von Amin/Amidogruppen und der Position von Hydroxylgruppen oder der/den intramolekulare(n) Gruppe(en) in den Oligonukleotiden bestimmt. Die sich ergebenden Strukturen sind mit dem 5'-Ende links und dem 3'-Ende rechts dargestellt.
  • Die räumliche Orientierung ist, wie in 1 gezeigt, charakterisiert. Auch wenn es nicht erwünscht ist, durch die folgende Hypothese gebunden zu sein, ist es beabsichtigt, dass die vereinfachte ideale dreidimensionale Sequenz, welche in 2a gezeigt ist, in der ventralen Position aus Phosphatgruppen (Kreisen) und 2-Deoxyriboseeinheiten (Zylinder) und an der dorsalen Seite aus horizontal orientierten Basen (Prismen) besteht.
  • Beispiel 5
  • ODN mit relativ schwacher (<20 %) apoptotischer Aktivität
  • Die Ergebnisse der computergestützten Analyse und die Korrelation mit Apoptose induzierender Aktivität sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Oligonukleotide, die zwischen 3 und 8 Basen enthalten, und Apoptosewerte kleiner als 20 % aufweisen, besitzen kein identifizierbares dreidimensional umrahmtes Zentrum. Typische veranschaulichende dreidimensionale Strukturen von Sequenzen mit schwacher apoptotischer Aktivität sind in den 3, 4 und 5 gezeigt.
  • Tabelle 1 Daten von Sequenzen mit schwacher (<20 %) apoptotischer Aktivität
    Figure 00250001
  • Beispiel 6
  • ODN mit mittlerer (>20 % <40 %) apoptotischer Aktivität
  • Die Ergebnisse der computergestützten Analyse und der Korrelation mit Apoptose induzierender Aktivität sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Oligonukleotide, die zwischen 3 und 8 Basen enthalten, und eine apoptotische Aktivität von >20 % <40 % aufweisen, besaßen ein identifizierbares Zentrum, entweder vom Typ A oder vom Typ B. Typische veranschaulichende dreidimensionale Strukturen sind in den 6-8 gezeigt.
  • Figure 00260001
  • Beispiel 7
  • ODN mit hoher (541 % ≤80 % Apoptose) Aktivität
  • Die Ergebnisse der computergestützten Analyse und der Korrelation mit Apoptose induzierender Aktivität sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Oligonukleotide, welche zwischen 3 und 7 Basen enthalten und eine apoptotische Aktivität von ≥41 % ≤80 % aufweisen, besaßen ein identifizierbares Zentrum, entweder vom Typ A oder Typ B. Typische veranschaulichende dreidimensionale Strukturen sind in den 9-13 gezeigt.
  • Beispiel 8
  • Einfluss des Phosphodiesterrückgrats im Vergleich zum Phosphorthioatrückgrat auf die dreidimensionale Konformation und die apoptotische Aktivität
  • Der Vergleich der Aktivität und der dreidimensionalen Konformation der Sequenz GGGTGG mit einen Phosphodiesterrückgrat (Tabelle 3 und 12) und GGGTGG mit einem Phosphorthioatrückgrat (Tabelle 1 und 5) zeigt, dass die Veränderung bezüglich der Apoptose induzierenden Aktivität (50 % bzw. 0 %) mit einem Verlust eines umrahmten Zentrums mit starker Elektronegativität korreliert, wobei der Verlust des umrahmten Zentrums sowohl aus der überwiegend planaren Orientierung der ersten drei Gs, als auch der Aminogruppe von G4 am vorderen unteren Ende herrührt und daher herrührt, dass von G5 am dorsalen oberen Ende die letzten beiden Gs vom umrahmten Zentrums ausgeschlossen sind.
  • Figure 00280001
  • Beispiel 9
  • 3'- oder 5'-Modizierung führt nicht zu einem Verlust an Apoptose induzierenden Zentren
  • 3' modifizierte GGGTGG-Phosphat Sequenzen (Tabelle 3, 9), 5' modifizierte Phosphat-GGGTGG Sequenzen (Tabelle 3, 11) enthielten alle ein umrahmtes Zentrum. Eine 3', 5' oder 3',5' Modifizierung von Oligonukleotiden, welche ein Aktivitätszentrum enthalten, führt nicht zum Verlust solcher Zentren führender Konformationsänderungen.
  • Beispiel 10
  • Vorhersage der apoptotischen Wirksamkeit einer Sequenz
  • Die Sequenzen in Tabelle 4 wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert, um zu bestimmen, ob sie ein Zentrum besitzen. Eine Vorhersage wurde getroffen, ob diese Sequenzen die Fähigkeit besitzen, Apoptose zu induzieren, die willkürlich auf 20 % gesetzt wurde. Anders ausgedrückt, eine Vorhersage apoptotischer Aktivität unterstellte eine Aktivität >20 %. Nachfolgend wurden die Sequenzen in vitro auf apoptotische Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt und zeigen eine hohe Erfolgsrate bei der Vorhersage apoptotischer Aktivität. Das Verfahren war für jede analysierte Sequenz erfolgreich. Die Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße in silico Verfahren Sequenzen mit unterschiedlichen Graden an apoptotischer Aktivität identifiziert, wobei es eine Grundlage für eine vorranige Auswahl an Sequenzen zum biologischen Testen bereitstellt.
  • Tabelle 4 Gemäß des Verfahrens vorhergesagte Werte unter Verwendung neuer Sequenzen mit unbekannter Apoptose indizierende Aktivität
    Figure 00300001

Claims (4)

  1. Computergestütztes Verfahren zur Vorhersage biologischer Aktivität einer Oligonukleotidsequenz, wobei die biologische Aktivität Hemmung der zellulären Proliferation, Induktion einer Hemmung des Zellzyklus oder Apoptose ist, umfassend eine Analyse der Oligonukleotidsequenz um zu bestimmen, ob die Oligonukleotidsequenz wenigstens ein Zentrum enthält, wobei ein Zentrum in der Sequenz vorliegt, wenn Y gleich oder zwischen 780 bis 2200 pm ist; Z gleich oder zwischen 400 bis 1300 pm ist; alpha gleich oder zwischen 900 bis 1500 pm ist; beta gleich oder zwischen 300 bis 1700 pm ist; und X zwischen 700 bis 1360 pm ist, wobei X der interatomare Abstand zwischen mit dem Zentrum verknüpften Phosphoratomen ist, Y der längste Abstand zwischen dem Phosphatrückgrat und dem entferntesten Atom einer beteiligten Base ist, Z der Abstand von Vorderseite zu der Rückseite des Zentrums ist, alpha der weiteste umrahmende Abstand der Amino-/Amidogruppe von den Phosphatgruppen ist und beta der weiteste interatomare Abstand der Amino-/Amidogruppen ist, und ferner umfassend das Testen der Sequenz auf biologische Aktivität.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Analyse ein Untersuchen der Sequenz hinsichtlich Elektronegativität, Elektropositivität, intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen und interatomaren Abständen umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 umfassend, Zeichnen der Sequenz unter Verwendung chemischer Zeichensoftware; Überprüfen der gezeichneten Sequenz nach Fehlern, Erzeugen eines dreidimensionalen Models der gezeichneten Sequenz; Minimieren der Energie des dreidimensionalen Models; Berechnen molekularer Dynamik unter Verwendung chemischer Analysesoftware; Darstellen einer lösungsmittelzugänglichen Oberfläche des dreidimensionalen Models auf einem Darstellungsmittel; Identifizieren kugelförmiger und linearer Domänen in dem dreidimensionalen Model; Identifizieren intramolekularer Wasserstoffbrückenbindungen; Identifizieren von Phosphatgruppen, welche fähig sind ein elektronegatives Zentrum zu bilden; Berechnen der räumlichen Orientierung der Basen in dem dreidimensionalen Model für eine elektropositive Umrahmung im Bezug auf die Phosphatgruppen im elektronegativen Zentrum; Messen interatomarer Abstände von Amino-/Amidogruppen und 3' und 5'-Hydroxylgruppen von Phosphatgruppen; und Vorhersagen, ob die Sequenz biologische Aktivität besitzt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Messen interatomarer Abstände von Amino-/Amidogruppen und 3' und 5'-Hydroxylgruppen von Phosphatgruppen umfasst: Messen eines ersten interatomaren Abstands X zwischen mit dem Zentrum verknüpften Phosphoratomen; Messen eines zweiten interatomaren Abstands alpha zwischen Phosphaten und einem entferntesten Atom in einer beteiligten Base; Messen eines dritten interatomaren Abstands beta als der weiteste interatomare Abstand beta zwischen Amdio- oder Aminogruppen; Messen eines vierten interatomaren Abstands Z zwischen einer Vorderseite des Zentrums zu einer Rückseite des Zentrums; und Messen eines fünften interatomaren Abstands Y als längster Abstand zwischen einem Phosphatrückgrat und dem entferntesten Atom in einer beteiligten Base.
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