JP4504015B2

JP4504015B2 - アポトーシスを誘導するためのオリゴヌクレオチド組成物およびそれらの使用

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Publication number: JP4504015B2
Application number: JP2003521837A
Authority: JP
Inventors: シー．フィリップス，ニゲル; シー．フィリオン，マリオ; リチャードホラン，ズデネク
Original assignee: バイオニケライフサイエンシーズインコーポレイテッド
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2002-08-19
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2022-08-19
Also published as: EP1417307A2; WO2003016567A3; HK1069205A1; ATE325341T1; MXPA04001315A; JP2005521119A; KR101017483B1; AU2002326067B2; DE60231986D1; US20030144233A1; WO2003016567A2; EP1417307B1; US7199228B2; IL160407A0; MXPA04001480A; KR20040032925A; JP2005509411A; ATE428781T1; US20030113763A1; DE60211206T2

Description

［発明の分野］
本発明は、細胞増殖の阻害、細胞周期停止の誘導およびアポトーシス誘導を含む細胞機能の変更のための新規オリゴヌクレオチド組成物ならびにそれらの使用方法に関する。

［発明の背景］
増殖は、１つの細胞を２つの細胞に分裂させる細胞周期を通しての細胞の進行の極致である。細胞周期の５つの主な期は、Ｇ_０、Ｇ_１、Ｓ、Ｇ_２およびＭである。Ｇ_０期中、細胞は静止状態である。ある時期には身体中のほとんどの細胞がこの段階にある。Ｇ_１期中、分裂するためのシグナルに応答する細胞は、ＤＮＡ合成に必要なＲＮＡおよびタンパク質を産生する。Ｓ期（ＳＥ：初期Ｓ期、ＳＭ：中期Ｓ期、およびＳＬ：後期Ｓ期）中、細胞はそれらのＤＮＡを複製する。Ｇ_２期中、タンパク質は細胞分裂のための調製において合成される。有糸分裂（Ｍ）期中、細胞は２つの娘細胞に分裂する。細胞周期進行の変異はすべての癌で生じ、それは遺伝子の過剰発現、調節遺伝子の突然変異、またはＤＮＡ損傷チェックポイントの変異に起因し得る(Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic
Agents, 8:903, 1997)。

アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、望ましくない細胞の死滅および除去のための生理学的プロセスであり、化学療法剤が癌細胞を死滅させるメカニズムである。アポトーシスは、核クロマチンの凝縮、細胞収縮、核の崩壊、原形質膜小疱形成、および膜結合アポトーシス体の形成を包含する細胞内の特有の形態学的変化を特徴とする(Wyllie et
al., Int. Rev. Cytol., 68:251, 1980)。原形質膜の内面から外面へのホスファチジルセリンのトランスロケーションがクロマチン凝縮と同時に起こり、アポトーシスの細胞の特徴とみなされる(Koopman, G. et al., Blood, 84:1415, 1994)。アポトーシスの実際のメカニズムは、カスパーゼとして知られるシステインプロテアーゼのファミリーの活性化により媒介されることが知られている。しかしながら、ほとんどの従来技術の抗癌療法は、アポトーシスの誘導を対象にしていても、臨床用途には決して適当ではないことが証明されている。これらの療法の多くは、効果的でないかまたは毒性があり、有害な副作用を有し、結果として薬剤耐性または免疫感作を発生させ、レシピエントを衰弱させている。多くの疾患または状態は望ましくない細胞増殖を特徴とし、医学または獣医学の技術分野の当業者に既知である。これらの疾患および状態を治療するための新規組成物および方法が必要とされる。

合成オリゴヌクレオチドは、細胞において内部移行されるポリアニオン性配列である(Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197:95, 1994)。癌細胞の増殖を阻害するために、核酸(Wagner, R., Nature, 372:333, 1994)、特定の細胞タンパク質(Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999)、および特定の核タンパク質(Scaggiante et al., Eur. J. Biochem, 252:207, 1998)に選択的に結合する合成オリゴヌクレオチドが報告されている。

グアニン（Ｇ）および可変量のチミン（Ｔ）（オリゴヌクレオチドＧＴｎ）（ここで、ｎは１以上または７以下であり、塩基数は２０以上である）を含有する合成２７塩基配列(Scaggiante et al., Eur. J. Biochem., 252:207, 1998)は、４５ｋＤａの核タンパク質への配列特異的結合により癌細胞株の成長を阻害することが報告されているのに対し、ＧＴｎ（ここで、塩基数は２０以下である）は、癌細胞株に対して不活性であることが報告
されている(Morassutti et al., Nucleosides and Nucleotides, 18:1711, 1999)。３’アミノアルキル修飾を伴う１５塩基および２９塩基の２つの合成ＧＴリッチなオリゴヌクレオチドは、ヌクレオリンに結合するＧ四分子を形成し、かつ癌細胞株の増殖を阻害することが報告されている(Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999)。哺乳動物テロメア反復配列と同一の配列を有する合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホロチオエートは、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでバーキットリンパ腫細胞の増殖を阻害することが報告されている(Mata et al., Toxicol. Applied Pharmacol., 144:189, 1997)。しかしながら、合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホジエステルヌクレオチドは抗テロメラーゼ活性を有さないことが報告されている（米国特許第５，６４３，８９０号）。

アンチセンスＤＮＡ（ｍＲＮＡ結合または三重鎖形成ＤＮＡ）または免疫賦活性ＣｐＧモチーフのような生物活性を有するデオキシリボヌクレオチドは、多くの場合分子内塩基対結合により安定化される配列特異的線状モチーフを特徴とする。ホスホロチオエート置換のような骨格修飾は不都合に影響を及ぼさず、これらの分子の活性を高める場合が多い。

本発明者等はすでに、（Ｇ_ｘＴ_ｙ）_ｎ、（Ｔ_ｙＧ_ｘ）_ｎ、ａ（Ｇ_ｘＴ_ｙ）_ｎ、ａ（Ｔ_ｙＧ_ｘ）_ｎ、（Ｇ_ｘＴ_ｙ）_ｎｂ、（Ｔ_ｙＧ_ｘ）_ｎｂ、ａ（Ｇ_ｘＴ_ｙ）_ｎｂ、ａ（Ｔ_ｙＧ_ｘ）_ｎｂ（ここで、ｘおよびｙは１〜７の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、１つまたは複数のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２〜２０塩基の３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチドを含む組成物および方法について報告しており、ここで、配列は２〜２０塩基であり、また配列は、多数の癌細胞における細胞周期停止の誘導、増殖の阻害、カスパーゼ活性化の誘導、およびアポトーシスの誘導からなる群から選択される応答を誘導する（ＰＣＴＣＡ００／０１４６７号、ＷＯ０１／４４４６５号）。これらのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス活性を有するように、テロメラーゼの活性を阻止するように、またはＤＮＡと三重らせんを形成するように設計されていない。ネブラリン、ヒポキサンチンまたはウラシルのような非ＤＮＡ塩基を有するオリゴヌクレオチドがアポトーシスを誘導することは報告されていない。

ほとんどの従来技術の抗癌療法は、増殖の阻害、細胞周期停止の誘導、またはアポトーシスの誘導を対象にしていても、臨床用途には決して適当ではないことが証明されている。これらの療法の多くは、効果的でないかまたは毒性があり、重大な副作用を有し、結果として薬剤耐性または免疫感作を発生させ、レシピエントを衰弱させている。

したがって、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患および状態（例えば、自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患、炎症および癌）を治療するのに有効な新規な組成物および方法が引き続き必要とされる。かかる組成物および方法は、細胞、特に癌細胞において細胞増殖を抑制し、細胞周期停止を誘導し、またアポトーシスを誘導するのに必要とされる。

［発明の概要］
本発明は、１つもしくは複数のネブラリン塩基、１つもしくは複数のヒポキサンチン塩基または１つもしくは複数のウラシル塩基、あるいはネブラリン塩基、ヒポキサンチン塩基およびウラシル塩基の組合せを含む３〜９塩基長の新規合成オリゴヌクレオチド配列（これ以降、配列）を提供することにより、この必要性を満たす。これらの配列は任意に、１つもしくは複数のグアニン塩基または１つもしくは複数のチミン塩基あるいはそれらの組合せをさらに含む。

本発明はまた、細胞応答を誘導するために、これらの新規合成オリゴヌクレオチド配列を許容可能なキャリアと組み合わせて組成物を作製し、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでこの組成物を投与することにより、これらの新規合成オリゴヌクレオチド配列を使用する方法を提供する。好ましくは、細胞応答は、細胞増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導である。細胞増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導のための好ましい細胞は癌細胞である。

本発明は、本発明の配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を有する動物またはヒトに、疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療する方法を提供する。望ましくない細胞増殖を特徴とする任意の疾患または状態は、本発明の組成物で治療され得る。望ましくない細胞増殖を特徴とするかかる疾患または状態としては、自己免疫疾患、炎症、リンパ増殖性疾患および癌が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、薬剤の調製におけるこれらの新規合成オリゴヌクレオチド配列の使用を提供する。かかる薬剤は、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するのに有用である。

本発明の１つまたは複数の新規配列は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで組成物として許容可能なキャリアとともに投与され得る。さらに、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療剤と一緒に投与されてもよい。本発明の組成物のかかる投与は、医学または獣医学の技術分野の当業者に既知の１つまたは複数の治療剤の投与前、投与中または投与後に行われ得る。医学または獣医学の技術分野の当業者に既知であり、また疾患を治療するのに使用される任意の治療剤がこれらの新規配列と組み合わせて使用され得る。かかる組合せはより低投与量の治療剤の使用を可能にして、望ましくない副作用を減少させ得る。

有効量の１つまたは複数の本発明の配列を含む組成物を動物またはヒトに投与することは、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を防止、治療あるいは排除する治療上の処置である。かかる疾患および状態は、医学または獣医学の技術分野の当業者に既知であり、癌、炎症、関節炎、リンパ増殖性障害、喘息および血管形成術後の動脈の再狭窄が挙げられるが、これらに限定されない。

癌としては、扁平上皮癌、線維肉腫、サルコイド癌腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫およびそれらに由来する転移が挙げられるが、これらに限定されない。

当業者に既知の動物およびヒトへの治療剤の投与方法ならびに経路を用いて、本発明の配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与してもよい。

細胞応答を誘導する、特に細胞において細胞増殖を阻害する、細胞周期進行を停止させる、および／またはアポトーシスを誘導する本発明のオリゴヌクレオチド配列の予期せぬ驚くべき能力は、医学の技術分野で長い間実現されていない必要性に対処し、動物およびヒトにとって重要な有益性を提供する。これらの新規組成物は、自己免疫疾患、関節炎、喘息、血管形成術後の血管の再狭窄、リンパ増殖性疾患、炎症および癌を含むがこれらに限定されない動物およびヒトにおける望ましくない細胞増殖の状態を治療するのに使用され得る。

したがって、本発明の目的の１つは、１つもしくは複数のネブラリン塩基、１つもしくは複数のヒポキサンチン塩基、または１つもしくは複数のウラシル塩基、あるいはネブラリン塩基、ヒポキサンチン塩基およびウラシル塩基の組合せを含む３〜９塩基長の新規合成オリゴヌクレオチド配列（これ以降、配列）を提供することである。これらの配列は任意に、１つもしくは複数のグアニン塩基または１つもしくは複数のチミン塩基、あるいはそれらの組合せをさらに含む。好ましくは、グアニンおよびチミン塩基はホスホジエステル塩基である。

したがって、本発明の目的は、細胞応答を誘導する新規組成物を提供することである。

本発明の目的は、細胞応答を誘導するためのこれらの組成物を使用する方法を提供することであり、ここで細胞応答は、細胞増殖の阻害、細胞周期進行の停止、またはアポトーシスの誘導である。

本発明のさらなる目的は、細胞応答を誘導するためのこれらの組成物を使用する方法を提供することであり、ここで細胞応答は、癌細胞における細胞増殖の阻害、細胞周期進行の停止、またはアポトーシスの誘導である。

本発明の別の目的は、動物またはヒトにおける疾患を治療するためのこれらの組成物を使用する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、動物またはヒトにおける疾患を治療するための薬剤の調製において使用するためのこれらの組成物を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、動物またはヒトにおける望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するのに有効な量で、本発明の１つまたは複数の組成物を投与することを含む方法を提供することである。

本発明のさらなる別の目的は、動物またはヒトにおける疾患または状態を治療するのに有効な量で、本発明の１つまたは複数の組成物を投与することを含む方法を提供することであり、ここで疾患または状態は、望ましくない細胞増殖を特徴とし、自己免疫疾患、炎症、喘息、リンパ増殖性疾患、血管形成術後の血管の再狭窄または癌である。

本発明のさらに別の目的は、細胞応答を誘導するために別の治療用物質の投与前、投与中または投与後に本発明の１つまたは複数の組成物を投与することを含む方法を提供することである。

本発明のさらなる別の目的は、細胞応答を誘導するために別の治療用物質の投与前、投与中または投与後に本発明の１つまたは複数の組成物を投与することを含む方法を提供することであって、ここで細胞応答は、癌細胞における細胞増殖の阻害、細胞周期進行の停止またはアポトーシスの誘導である。

本発明のさらに別の目的は、動物またはヒトにおける疾患を治療するために別の治療用物質の投与前、投与中または投与後に本発明の１つまたは１つより多い組成物を投与することを含む方法を提供することであって、ここで疾患は、望ましくない細胞増殖を特徴とする。

本発明のさらなる別の目的は、動物またはヒトにおける望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するために別の治療物質の投与前、投与中または投与後に本発明の１つまたは１つより多い組成物を投与することを含む方法を提供することであり、こ
こで疾患または状態は、自己免疫疾患、炎症、リンパ増殖性疾患、関節炎、喘息、血管形成術後の血管（例えば、動脈）の再狭窄または癌である。

本発明の別の目的は、癌を治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。

本発明のさらなる別の目的は、薬剤の調製におけるこれらの新規合成オリゴヌクレオチド配列の使用を提供することであり、薬剤は、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するのに有用である。

本発明の別の目的は、調製しやすい組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、レシピエントにとって毒性が最小限である組成物を提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的、特徴ならびに利点は、開示する実施形態の以下の詳細な説明および添付の特許請求項を参照した後に明らかとなるであろう。

［発明の詳細な説明］
本発明は、新規合成オリゴヌクレオチド配列およびそれらの使用方法を提供する。３〜９塩基長のこれらの新規合成オリゴヌクレオチド配列（これ以降、配列）は、１つもしくは複数のネブラリン塩基、１つもしくは複数のヒポキサンチン塩基、または１つもしくは複数のウラシル塩基、あるいはネブラリン塩基、ヒポキサンチン塩基およびウラシル塩基の組合せを含む１つまたは複数の非ＤＮＡ塩基を含む。これらの配列は任意に、１つもしくは複数のグアニン塩基または１つもしくは複数のチミン塩基、あるいはそれらの組合せをさらに含む。好ましくは、グアニン塩基およびチミン塩基は、ホスホジエステル塩基である。これらの配列の１つまたは複数は、薬学的に許容可能なキャリアのような許容可能なキャリアと組み合わせて、組成物を形成してもよい。さらに、これらの組成物は、１つまたは複数の既知の治療剤と組み合わせてもよい。

これらの組成物は、細胞応答を誘導する際に有用である。一実施形態では、配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、動物またはヒトにおいて細胞応答を誘導するのに有効な量で、動物またはヒトに投与される。一実施形態では、細胞応答は、細胞増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導である。好ましい実施形態では、細胞は癌細胞である。

本発明の組成物は、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するのに使用され得る。

好ましい実施形態では、配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、動物またはヒトにおける癌を治療するのに有効な量で、癌を有する動物またはヒトに投与される。細胞応答（例えば、細胞増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導）を誘導するこれらの配列の予期せぬ能力は、医学の技術分野で長い間の切実な実現されていない必要性に対処し、動物およびヒトにとって重要な有益性を提供する。

以下の表記は、本発明のオリゴヌクレオチド配列における塩基の配列を記載するのに使用される：Ｇ＝グアニン、Ｉ＝ヒポキサンチン、Ｎｅｂ＝ネブラリン、Ｔ＝チミン、およびＵ＝ウラシル。本明細書中で使用する場合、配列は、少なくも１つの塩基Ｉ、Ｎまたは
Ｕ、あるいはそれらの組合せを含み、さらに任意に少なくとも１つの塩基ＧまたはＴ、あるいはそれらの組合せを含有する合成オリゴヌクレオチドを指す。配列は好ましくは、３〜９塩基長である。

本明細書中で使用する場合、応答は細胞応答の誘導を指す。任意の細胞が選ばれてよく、癌細胞、免疫細胞、滑膜細胞および内皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞応答の誘導のための好ましい細胞は癌細胞である。

本明細書中で使用する場合、「治療上の処置」および「に有効な量」という語句は、細胞増殖の阻害、細胞周期進行の停止またはアポトーシスの誘導を含むがこれらに限定されない細胞応答を誘導するのに有効な配列の量を指す。

本明細書中で使用する場合、「応答」という単語は、細胞における増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導を指す。

本明細書中で使用する場合、「応答細胞において有効」という語句は、増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導を含むがこれらに限定されない細胞における応答を引き起こす配列の能力を指す。

本明細書中で使用する場合、「治療上の処置」、「有効量」および「に有効な量」という語句は、細胞における応答を引き起こすか、あるいは望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するのに有効な配列量を指す。

本明細書中で使用する場合、「化学療法薬」という語句は、動物またはヒトにおける疾患、特に癌を治療するための、国家または州政府の規制当局により認可されているか、あるいは米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に列挙される任意の作用物質である。

本明細書中で使用する場合、「疾患」という単語は、身体上の健康が損なわれている状態を指す。疾患および状態は、本出願全体にわたって交換可能に用いられる。

本明細書中で使用する場合、「抗腫瘍性」という単語は、癌細胞の発達、成熟、増殖または拡延を防止することを指す。

動物またはヒトへの有効量の本発明の配列および許容可能なキャリアを含む組成物の投与は、癌、炎症、リンパ増殖性障害、炎症、喘息および血管形成術後の血管（例えば、動脈）の再狭窄を含むがこれらに限定されない疾患または状態を防止、治療または排除する治療上の処置である。癌としては、扁平上皮癌、線維肉腫、サルコイド癌腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫およびそれらに由来する転移が挙げられるが、これらに限定されない。関節炎の形態としては、若年性関節炎、変形性関節症および慢性関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。

これらの配列の治療上の有効性は、塩基、糖またはリン酸骨格の化学修飾、化学的補充、適切な配列を含有する細菌プラスミドを用いた配列の生物工学的増幅、生物学的キャリアまたは化学的キャリアへの複合体形成、あるいは組織型もしくは細胞型指向性リガンドまたは抗体への配列の連結を含むがこれらに限定されない方法により増大され得る。

１つまたは複数の配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、配列および薬学的に許容可能なキャリアを均一かつ緊密に会合させることにより調製される。「薬学
的に許容可能なキャリア」または「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、有害な生理学的応答を引き起こすことなく生きた動物またはヒト組織と接触して使用するのに適切であり、かつ害のある様式で組成物の他の構成成分と相互作用しない、水または生理食塩水、ゲル、クリーム、軟膏剤、溶媒、希釈剤、液体軟膏基剤、軟膏、ペースト、インプラント、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等を含むがこれらに限定されない任意の液体、固体または半固体（限定的ではない）を意味するのに本明細書中で使用される。当業者に既知の他の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を用いて、本発明のオリゴヌクレオチド配列を送達するための組成物を作製してもよい。液体キャリアとしては、水性キャリア、非水性キャリアまたはその両方であり、水性懸濁液、ジメチルスルホキシド、エタノール、油エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期残留エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョンおよびナノエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアは、配列の持続性放出を可能にする生物学的キャリア、化学的キャリアまたはその両方であり、ウイルスベクター系、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、および生分解性もしくは非生分解性の天然または合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョン、ミニポンプおよびポリマーは、送達が必要とされる場所の近傍に埋没させることができる。配列（複数可）を固体キャリアに複合体形成させるのに使用される方法としては、固体キャリア表面への直接的吸着、固体キャリア表面への共有結合（直接的にあるいは連結部分を介して）、および固体キャリアを作製するのに使用されるポリマーへの共有結合または静電結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、配列（複数可）は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ）、ヒアルロン酸もしくは水酸化アルミニウムのような非イオン性またはイオン性ポリマーの添加により安定化させることができる。当業者に既知の他のキャリアを使用してもよい。

好ましい水性キャリアとしては、水、生理食塩水および薬学的に許容可能な緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアとしては、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびそれらの混合物を含むがこれらに限定されない鉱油または天然油が挙げられるが、これらに限定されず、ここで上記油は、ポリ不飽和および飽和脂肪酸の適切な混合物を含有する。例としては、ダイズ油、カノラ油、パーム油、オリーブ油およびミグリオール(miglyol)が挙げられるが、これらに限定されず、ここで脂肪酸は飽和または不飽和であり得る。任意に、応答性細胞に配列を提示するのに使用される薬学的に許容可能なキャリアに関わらず、賦形剤を含んでもよい。これらの賦形剤としては、酸化防止剤、緩衝液および静菌薬が挙げられるが、これらに限定されず、また沈殿防止剤および増粘剤を含んでもよい。

本発明の配列は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで組成物として投与され得る。投与形態としては、注射剤、溶液、クリーム、ゲル、インプラント、ポンプ、軟膏、エマルジョン、懸濁液、ミクロスフェア、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ペースト、パッチ、錠剤、経皮送達デバイス、スプレー、エーロゾル、または当業者に精通している他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。かかる薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に一般に既知である。本発明の薬学的配合物は、既知の容易に入手可能な成分を用いて、当該技術分野で既知の手順により調製することができる。例えば、化合物は、一般的な賦形剤、希釈剤またはキャリアと配合させて、錠剤、カプセル、懸濁液、粉末等に成形することができる。かかる化合物に適した賦形剤、希釈剤およびキャリアの例としては、以下の充填剤および増量剤（例えば、デンプン、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン）、加湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウム）、溶解遅延用作用物質（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例
えば、第四級アンモニウム化合物）、界面活性剤（例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート）、吸着キャリア（例えば、カオリンおよびベントナイト）、乳化剤、防腐剤、甘味剤、安定剤、着色剤、香料剤、風味剤、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウム）、固体ポリエチルグリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。

配合物は、それらが可能ならば一定の時間をかけて、専らもしくは好ましくは特定の位置で有効成分を放出するように構成することができる。かかる組合せはさらに、放出動態を制御するためのさらなるメカニズムを提供する。コーティング、エンベロープおよび保護マトリックスは、例えば高分子物質またはワックスから作製され得る。

１つまたは複数の配列は、単独で、あるいは化学療法剤、免疫療法剤、抗菌剤、抗ウイルス剤を含むがこれらに限定されない他の治療様式と併用して、または放射線療法と併用して投与され得る。化学療法剤としては、代謝拮抗剤、ＤＮＡ損傷剤、微小管不安定化剤、微小管安定化剤、アクチン脱重合剤、成長阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、プリン阻害剤、ピリミジン阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、血管新生阻害剤、分化増強剤および免疫療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。抗関節炎剤としては、抗炎症剤、代謝拮抗剤、アポトーシス促進剤、ＤＮＡ損傷剤、微小管不安定化剤、微小管安定化剤、アクチン脱重合剤、成長阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プリン阻害剤、ピリミジン阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤および血管新生阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

投与経路は、当業者に既知であり、経口（例えば、頬または舌下）、直腸、坐剤として、局所、非経口、皮下、経皮、皮下、筋内、腹腔内、膀胱内、関節内、静脈内、皮内、頭蓋内、病変内、髄腔内、腫瘍内、眼内、エーロゾル、肺内、脊髄内、前立腺内、舌下、身体腔内での配置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕およびエレクトロポレーション、子宮内、膣、体腔への、腫瘍または内部損傷の位置での外科的投与、直接腫瘍への、臓器の内腔または実質への、および骨髄への投与が挙げられるが、これらに限定されない。上述の様々な投与形態で有用な技法としては、局所塗布、摂取、外科的投与、注射、スプレー、経皮送達デバイス、浸透圧ポンプ、所望の部位への直接的な電着、または当業者に精通している他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。適用部位は、表皮上のような外部、または内部（例えば、胃潰瘍、手術野または他の箇所）であり得る。

本発明の組成物は、クリーム、ゲル、溶液、懸濁液、リポソーム、粒子、または組成物の配合および送達の技術分野の当業者に既知の他の手段の形態で適用され得る。超微細粒子サイズは、治療薬の吸入送達に使用することができる。皮下投与に適した配合物の幾つかの例としては、インプラント、デポ剤、針、カプセルおよび浸透圧ポンプが挙げられるが、これらに限定されない。膣投与に適した配合物の幾つかの例としては、クリームおよびリングが挙げられるが、これらに限定されない。経口投与に適した配合物の幾つかの例としては、丸剤、液体、シロップおよび懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。経皮投与に適した配合物の幾つかの例としては、ゲル、クリーム、ペースト、パッチ、スプレーおよびゲルが挙げられるが、これらに限定されない。皮下投与に適した送達メカニズムの幾つかの例としては、インプラント、デポ剤、針、カプセルおよび浸透圧ポンプが挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与に適した配合物としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬および配合物を対象レシピエントの血液と等張性にさせる溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。即時調合注射溶液および懸濁液は、当業者により一般に使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。

本発明の組成物を例えば１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と
組み合わせる実施形態は、単位投薬形態で利便性よく提示されてもよく、従来の薬学的技法により調製され得る。かかる技法としては、有効成分および薬学的キャリア（複数可）または賦形剤（複数可）を含有する組成物を会合させる工程が挙げられる。概して、配合物は、有効成分を液体キャリアと均一かつ緊密に会合させることにより調製される。好ましい単位投薬配合物は、投与される成分の用量または単位、あるいはそれらの適切な部分を含有する配合物である。特に上述する成分のほかに、本発明の組成物を含む配合物は、技術分野の当業者に一般に使用される他の作用物質を含んでもよいことが理解されるべきである。

投与容量は、投与経路に応じて様々である。かかる容量は、動物またはヒトに組成物を投与する技術分野の当業者に既知である。投与経路に応じて、１用量当たりの容量は、好ましくは約０．００１〜１００ｍｌ／用量、より好ましくは約０．０１〜５０ｍｌ／用量、最も好ましくは約０．１〜３０ｍｌ／用量である。好ましくは、１用量当たりの投与される配列量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。配列、配列の組合せ、および／またはさらなる治療剤は、スケジュール通りに、治療される疾患、レシピエントの状態および投与経路に適切な時間をかけて、単回用量治療で、複数回用量治療で投与することができるか、あるいは連続的に注入することができる。さらに、治療剤の投与前に、投与と同時に、あるいは投与後に、配列を投与することができる。投与される特定の配列および特定の治療剤、１用量当たりの容量および投与経路は、当業者に既知の方法を用いて専門家により決定されるべきであり、治療される疾患または状態、例えば癌のタイプ、癌の重篤性、癌の位置および他の臨床要因（例えば、レシピエントの大きさ、体重および健康状態）に依存する。

治療剤、例えば化学療法剤と組み合わせた配列は、化学療法剤の抗腫瘍性効果、または抗関節炎剤の抗関節炎効果を増強するのに有効な量で、癌または関節炎を有する動物に投与される。好ましくは、１用量当たりの投与される治療剤の量は、約０．００１〜１０００ｍｇ／ｍ^２または約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｍ^２または約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｍ^２または約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与される特定の配列および特定の治療剤、１用量当たりの量、用量スケジュールおよび投与経路は、当業者に既知の方法を用いて専門家により決定されるべきであり、疾患のタイプ、疾患の重篤性、疾患の位置および他の臨床要因（例えば、レシピエントの大きさ、体重および健康状態）に依存する。さらに、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイを任意に使用して、配列および配列＋治療剤投与に関する最適範囲を特定するのを助長してもよい。この目的に有用な様々なアッセイは、ＰＣＴＣＡ００／０１４６７号（ＷＯ０１／４４４６５号）（この全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明の配列の有効性の評価に関するさらなるアッセイ、および他の治療剤と組み合わせたこれらの配列の有効性の評価に関するさらなるアッセイは、Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, California, 92039（Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003、特に５〜２９５頁）（この全体が参照により本明細書に援用される）により記載されている。かかるアッセイとしては、ＤＮＡ断片化、アポトーシス、ミトコンドリアマーカー、小胞体マーカー、遊離ヌクレオソーム、核マトリックスタンパク質を分析するように設計されたアッセイ、カスパーゼ１〜１４、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ、ｂｃｌ−２ファミリーの成員を含むがこれらに限定されない多数のカスパーゼおよび関連タンパク質の検出ならびに活性、Ｆａｓ／ＴＮＲ−Ｒスーパーファミリー、ＰＡＲＰ関連産物の分析、アポトーシスシグナルトランスデューサーの分析、デス受容体、Ａｐｏ２、デコイ受容体を含む様々なシグナル伝達受容体の分析、アポトーシス膜タンパク質、神経系アポトーシスマーカー、細胞周期および細胞増殖に関する多数のマーカー、有糸分裂キナーゼ、ブロモデオキシウリジンアッセイ、およびｐ５３アッセイが挙げられる。本発明の配列の有効性の評価はまた
、Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, California, 92039（Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003、特に９９〜１０４頁および２１４〜２５５頁、この全体が参照により本明細書に援用される）により記載されるように、アポトーシスおよび細胞同調の誘導物質のような他の作用物質および治療剤に対して評価され得る。かかる作用物質としては、アクチノマイシンＤ、アンフィドコリン(amphidocolin)、Ａ２３１８７、カフェイン、カンプトテシン、シクロヘキシミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、パクリタキセル、スタウロスポリン、チミジン、ビンブラスチン、レチノイン酸、エトポシド、オカダ酸、ビンクリスチンおよびメトトレキサートが挙げられるが、これらに限定されない。

以下の実施例は、本発明をさらに説明する役割を果たすが、しかし同時に本発明の任意の限定を構成しない。逆に、本発明の様々な他の実施形態、変更形態および等価物に対する方策がなされてもよく、それらは、本明細書中の説明に目を通した後に、本発明の精神を逸脱することなく当業者に思い浮かび得ることが明らかに理解されよう。

配列の調製
配列は、Sigma-Genosys(Woodlands, TX, USA)により調製された。ネブラリン（２’デオキシネブラリン）、イノシンおよびウラシルホスホルアミダイトは、Glen Research, Sterling, VA, USAから購入した。配列は、高圧滅菌した脱イオン水中または薬学的に許容可能な緩衝液（例えば、生理食塩水が挙げられるが、これに限定されない）中に、使用直前に分散させた。

細胞
ヒトジャーカットＴ細胞白血病細胞は、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から入手した。ジャーカットＴ細胞は、１０％熱失活（５６℃、３０分）ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（すべてSigma Aldrich, Canadaから）中に５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃で維持した。細胞は、６ウェル平底組織培養プレートにおいて２×１０^５個の細胞／ｍｌで培地に播種し、本発明の配列とともにインキュベートした。

ネブラリン塩基を含有する配列によるアポトーシスの誘導
原形質膜のホスファチジルセリンの再分布は、アポトーシスを受けた細胞の特徴である(Martin et al., J. Exp. Med., 182:1545, 1995)。アポトーシス中の原形質膜におけるホスファチジルセリンの再分布は、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ(BD Pharmingen, San Diego, CA)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。ジャーカットＴ細胞白血病細胞は、２．５×１０^５個の細胞／ｍｌで本発明の配列５３．０μＭとともに４８時間インキュベートした。配列に暴露した後のアポトーシスの細胞％を表１に報告した。未処理のジャーカットＴ細胞白血病細胞におけるアポトーシス％は５％であった。

表１に示すように、ＮｅｂＮｅｂＮｅｂＮｅｂＮｅｂＮｅｂおよびＮｅｂＮｅｂＮｅｂＴＮｅｂＮｅｂを除くこれらの配列はすべて、ジャーカットＴ細胞白血病細胞のアポトーシスを誘導した。

ヒポキサンチン塩基を含有する配列による細胞増殖の阻害、細胞周期停止およびアポトーシスの誘導
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、２．５×１０^５個の細胞／ｍｌで本発明の幾つかの配列とともに４８時間インキュベートした。細胞増殖は、ジメチルチアゾール−ジフェニル−テトラゾリウム（ＭＴＴ）還元(Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983)を用いて測定した。ＭＴＴ還元は、多重分光光度計読取り機を用いて５７０ｎｍの波長で測定した。細胞周期段階は、市販のキット（ＣｙｃｌｅＴｅｓｔ（商標）ＰｌｕｓＤＮＡ、Becton Dickinson)を用いて確定した。Ｇ０／Ｇ１、初期（ＳＥ）、中期（ＳＭ）、後期（ＳＬ）またはＧ２／Ｍ期の細胞の蓄積は、ＭＯＤＦＩＴＬＴソフトウェア(Verity Software House Inc., Topsham, MA, USA)を用いてフローサイトメトリーにより分析した。アポトーシスの細胞％は、実施例３に記載するようにアネキシン−ＶＦＩＴＣにより確定した。配列処理後の細胞増殖の阻害、細胞周期停止およびアポトーシスの誘導を表２に報告する。

表２に示すように、これらの配列はすべて、ジャーカットＴ細胞白血病細胞の細胞増殖を阻害したか、細胞周期を停止したか、またはアポトーシスを誘導した。

ウラシル塩基を含有する配列による細胞増殖の阻害、細胞周期停止およびアポトーシスの誘導
ジャーカット白血病Ｔ細胞を、２．５×１０^５個の細胞／ｍｌで配列とともに４８時間インキュベートした。増殖の阻害はＭＴＴ還元により測定し、細胞周期停止はＣｙｃｌｅＴｅｓｔ（商標）ＰｌｕｓＤＮＡキットにより測定し、アポトーシスは、実施例３に記載するようにアネキシン−ＶＦＩＴＣにより確定した。配列処理後の細胞増殖の阻害、細胞周期停止およびアポトーシスの誘導を表３に報告した。

表３に示すように、これらの配列はすべて、ジャーカットＴ細胞白血病細胞の細胞増殖を阻害したか、細胞周期を停止したか、またはアポトーシスを誘導した。

上記で引用した特許、刊行物および抜粋はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。上記事項は本発明の好ましい実施形態のみに関するものであり、添付の特許請求項で規定されるような本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多数の修正または変更が本発明においてなされ得ることが理解されるべきである。

Claims

ＮｅｂＴＮｅｂ、ＧＮｅｂＧ、ＮｅｂＮｅｂＧＮｅｂＮｅｂＮｅｂ、ＧＧＧＮｅｂＧＧ、ＧＧＧＴＮｅｂＧ、ＧＧＮｅｂＮｅｂＧＧ、ＧＧＮｅｂＴＧＧ、ＮｅｂＧＧＴＧＧ、ＮｅｂＧＧＴＧＮｅｂ、ＧＧＧＴＧＧＮｅｂおよびＮｅｂＧＧＧＴＧＧからなる群から選ばれる核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチド。
ＧＧＩＴＧＧ、ＧＧＧＩＧＧ、ＩＩＧＴＩＩ、ＩＧＧＧＴＧＧ、ＧＧＧＴＧＧＩ、ＩＧＧＧＴＧＧＩ、ＧＧＧＴＧＧＩＩＩおよびＧＩＧからなる群から選ばれる核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチド。
ＧＧＵＴＧＧ、ＵＵＧＴＵＵ、ＵＧＧＧＴＧＧ、ＧＧＧＴＧＧＵ、ＵＧＧＧＴＧＧＵ、ＧＧＧＴＧＧＵＵＵおよびＧＵＧからなる群から選ばれる核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチド。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成オリゴヌクレオチド又はＧＧＧＵＧＧの核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチド、および許容可能なキャリアを含む、細胞応答を誘導するための組成物であって、該細胞応答は、細胞増殖の阻害、細胞周期停止の誘導またはアポトーシスの誘導である、組成物。
前記細胞は、癌細胞または免疫系細胞である、請求項４に記載の組成物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成オリゴヌクレオチド又はＧＧＧＵＧＧの核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチド、および許容可能なキャリアを含む、動物またはヒトにおける望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態を治療するための組成物。
前記疾患または状態は、癌またはリンパ増殖性疾患である、請求項６に記載の組成物。
アクチノマイシンＤ、アンフィドコリン(amphidocolin)、Ａ２３１８７、カフェイン、カンプトテシン、シクロヘキシミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、パクリタキセル、スタウロスポリン、チミジン、ビンブラスチン、レチノイン酸、エトポシド、オカダ酸、ビンクリスチンおよびメトトレキサートからな
る群から選ばれる治療剤をさらに含む、請求項６又は７に記載の組成物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成オリゴヌクレオチド又はＧＧＧＵＧＧの核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、医薬の製造方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成オリゴヌクレオチド又はＧＧＧＵＧＧの核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、動物またはヒトにおける望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または状態の治療のための医薬の製造方法。