EA013468B1 - Иммуностимулирующая одноцепочечная рибонуклеиновая кислота с фосфодиэфирным остовом - Google Patents

Abstract

Иммуностимулирующие одноцепочечные олигорибонуклеотиды (ssOPH) с фосфодиэфирными остовами индуцируют TLR7-независимую и MyD88-зависимую активацию иммунной системы. Такие иммуностимулирующие ssOPH полезны для индуцирования у субъекта иммунного ответа Th1-подобного типа, для индуцирования у субъекта специфического в отношении антигена иммунного ответа и лечения субъекта, имеющего рак, инфекционное заболевание, аллергическое состояние или астму.

Description

Предпосылки создания изобретения

В последнее время на рибонуклеиновой кислоте (РНК) сконцентрировано повышенное внимание благодаря только что обнаруженной возможности ее использования в качестве терапевтического средства. Например, недавно сообщалось, что некоторые специфические в отношении последовательности двухцепочечные РНК размером, как правило, приблизительно 21-23 нуклеотидов можно использовать для подавления избирательным образом экспрессии гена способом, называемым интерференция РНК (ΡΗΚί) или посттраскрипционное подавление (молчание) гена. Двухцепочечные РНК, используемые для этого типа интерференции РНК, включают, в частности, так называемые короткие интерферирующие РНК (δίΡΗΚ). Наппоп С.1., 2002, Ыа1иге 418:244-51. Напротив, как также недавно сообщалось, что неспецифическая в отношении последовательности двухцепочечная РНК может индуцировать иммуностимулирующие эффекты, действуя через То11-подобный рецептор 3 (ТЬК3). А1ехорои1ои Ь. е1 а1., 2001, №11иге 413:732-8. Кроме того, недавно также сообщалось, что некоторые одноцепочечные РНК, обычно включающие гуанозин (С) и уридин (И) и, в частности, включающие определенные мотивы последовательностей, также являются иммуностимулирующими. ЫрГогб е1 а1., США 2003/0232074 А1. Сообщалось, что иммуностимулирующая одноцепочечная РНК действует через То11-подобный рецептор 7 (ТЬК7) и То11подобный рецептор 8 (ТЬК8).

Помимо стимуляции иммунной системы, возникающей благодаря взаимодействию РНК с ТЬК.3, ТЬК7 и ТЬК8, некоторые молекулы нуклеиновых кислоты, содержащие динуклеотид цитозин-гуанин (СрС), в частности СрС-содержащая дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), как недавно сообщалось, вызывают иммуностимулирующий эффект благодаря взаимодействию с То11-подобным рецептором 9 (ТЬК9). Негшт1 Н. е1 а1., 2000, Ыа1иге 408:740-5. Любой из ТЬК7, ТЬК8 и ТЬК9 передает сигнал зависимым от МуЬ8 8 способом.

Молекулы дезоксирибонуклеиновых кислот и, даже более того, молекулы рибонуклеиновых кислот с природными фосфодиэфирными межнуклеотидными связями в их сахаро-фосфатном остове чувствительны к опосредуемой нуклеазами деградации. Поскольку для клинического применения иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты часто получают в виде синтетических олигонуклеотидов, такие иммуностимулирующие синтетические олигонуклеотиды часто включают одну или несколько стабилизированных межнуклеотидных связей в их сахаро-фосфатном остове. Обычно используемой стабилизированной межнуклеотидной связью является фосфоротиоат.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением в настоящее время неожиданно обнаружено, что одноцепочечная РНК с фосфодиэфирным остовом, но не с фосфоротиоатным остовом, стимулирует активацию иммунной системы, по меньшей мере, отчасти через зависимый от МуЬ88 То11-подобный рецептор, отличный от ТЬК7 или ТЬК8. Предполагают, что зависимым от МуЬ88 То11-подобным рецептором, ответственным за данный иммунный ответ, является ТЬК9.

СрС-опосредуемая активация иммунной системы, действуя через ТЬК9, включает активацию врожденного иммунитета и приводит к сдвигу иммунного ответа к иммунному ответу типа Т111 или Т111подобного типа. Сообщалось, что СрС-олигонуклеотиды, таким образом, полезны в качестве адъювантов и активных агентов, используемых для лечения заболеваний, для которых желательна стимуляция иммунного ответа типа ТЫ, т.е. рака, инфекций, аллергии и астмы.

Соответственно, в соответствии с настоящим изобретением в настоящее время неожиданно обнаружено, что одноцепочечную РНК с фосфодиэфирным остовом, или без СрС, или без специфических в отношении последовательности признаков ранее описанной иммуностимулирующий одноцепочечной РНК, можно использовать для любого применения, при котором требуется опосредуемая ТЬК9 активация иммунной системы. Такие применения включают, но не ограничиваясь ими, лечение субъекта, имеющего рак, инфекцию, аллергию или астму.

В одном из аспектов изобретение представляет собой способ индуцирования у субъекта иммунного ответа Т111-подобного типа. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадию введения субъекту эффективного количества иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (δδΟΡΗ) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С, при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х1Х₂ССХ₃Х₄, где Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды, и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий 88ΟΡΗ не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В одном из аспектов изобретение представляет собой способ индуцирования у субъекта специфического в отношении антигена иммунного ответа. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадии введения субъекту антигена и введения субъекту эффективного количества

- 1 013468 иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (δδΟΡΗ) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С, при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х1Х₂ССХ₃Х₄, где Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий δδΟΡΗ не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В одном из аспектов изобретение представляет собой способ лечения субъекта, имеющего рак. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадию введения субъекту эффективного количества иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (δδΟΡΗ) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С, при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х₁Х₂ССХ₃Х₄, где Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды, и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий δδΟΡΗ не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В одном из аспектов изобретение представляет собой способ лечения субъекта, имеющего инфекционное заболевание. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадию введения субъекту эффективного количества иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (δδΟΡΗ) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х1Х2ССХ3Х4, где Х1, Х2, Х3 и Х4 представляют собой нуклеотиды, и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий δδΟΡΗ не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В одном из аспектов изобретение представляет собой способ лечения субъекта, имеющего аллергическое состояние. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадию введения субъекту эффективного количества иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (δδΟΡΗ) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С, при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х1Х2ССХ3Х4, где Х1, Х2, Х3 и Х4 представляют собой нуклеотиды, и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий δδΟΡΗ не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В одном из аспектов изобретение представляет собой способ лечения субъекта, имеющего астму. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадию введения субъекту эффективного количества иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (δδΟΡΗ) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х₁Х₂ССХ₃Х₄, где Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды, и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий δδΟΡΗ не присутствует в виде части двухцепочеч

- 2 013468 ной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения размер иммуностимулирующего ззОРН составляет 5-40 нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения размер иммуностимулирующего ззОРН составляет 5-20 нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения размер иммуностимулирующего ззОРН составляет 5-12 нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий ззОРН представляет собой синтетический ззОРН.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий ззОРН не является полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из поли-ϋ, поли-С, поли-А или поли-С.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение субъекту эффективного количества иммуностимулирующего 88ОРН представляет собой системное введение субъекту эффективного количества иммуностимулирующего 88ОРН.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен схематический рисунок, изображающий некоторые То11-подобные рецепторы, их лиганды и особенности их путей внутриклеточной передачи сигнала, как ранее понималось. МуЬ88 изображен как адаптерный белок для реагирующих на нуклеиновые кислоты То11-подобных рецепторов ТЬК7, ТЬК8 и ТЬК9, а также для не реагирующих на нуклеиновые кислоты То11-подобных рецепторов ТЬК2, ТЬК4 и ТЬК5.

На фиг. 2 представлена диаграмма, изображающая не зависимое от ТЬК.7 распознавание одноцепочечной РНК с фосфодиэфирным остовом. РЬ, фосфодиэфирный остов; РТО, фосфоротиоатный остов; ^Т, дикий тип. ΚΝΑ63 представляет собой олигорибонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, предоставленную как 5'-САССиСиСиСАи-3' (8ЕЦ ГО NО:1). СрС-О^N 1668 представляет собой олигодезоксинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, предоставленную как 5'ТССАТСАССТТССТСАТССТ-3' (81Ь) ГО ^:2).

На фиг. 3 представлена группа из трех диаграмм, изображающих секрецию различных указанных цитокинов РЬК3-Ь-индуцированными дендритными клетками в ответ на различные стимулы. ЬР8, липополисахарид. СрС-О^N 2216 представляет собой олигодезоксинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, предоставленную как 5'-СССССАССАТССТСССССС-3' (8ЕЦ ГО Ν0:3).

На фиг. 4 представлен ряд из четырех диаграмм, изображающих РА8С-анализы на экспрессию СГО69 на РЬК3-Ь-индуцированных дендритных клетках в ответ на указанные 88ОРН.

На фиг. 5 представлены две диаграммы, изображающие секрецию 1Ь-12р40 М-С8Р-происходящими макрофагами и СМ-С8Р-происходящими дендритными клетками в ответ на указанные стимулы.

На фиг. 6 А представлена диаграмма, изображающая секрецию 1Ь-12р40 РЬК3-Ь-индуцированными дендритными клетками от мышей дикого типа (^Т), ТЬК7-дефицитных мышей (ТЬК.7-/-) и МуЬ88дефицитных мышей (МуЬ88-/-) в ответ на указанные стимулы. р1:С, полиинозин:цитидин.

На фиг. 6В представлен ряд диаграмм, изображающих РА8С-анализы на экспрессию СГО69 РЬК3-Ьиндуцированными дендритными клетками от мышей дикого типа (^Т), ТЬК7-дефицитных мышей (ТЬК7-/-) и МуЬ88-дефицитных мышей (МуЬ88-/-) в ответ на указанные стимулы.

Подробное описание изобретения

Иммунный ответ концептуально делят на врожденный иммунитет и приобретенный иммунитет. Полагают, что врожденный иммунитет включает распознавание ассоциируемых с патогеном молекулярных структур (РАМР), являющихся общими у некоторых классов молекул, экспрессируемых инфекционными микроорганизмами, или чужеродных макромолекул. Полагают, что ассоциируемые с патогеном молекулярные структуры распознаются распознающими структуры рецепторами (РКК) на определенных клетках иммунной системы.

То11-подобные рецепторы (ТЬК) являются семейством высококонсервативных полипептидов, играющих решающую роль во врожденном иммунитете у млекопитающих. В настоящее время идентифицировано десять членов семейства, обозначенных ТЬК1-ТЬК10. Цитоплазматические домены различных ТЬК характеризуются наличием домена рецептора для То11-интерлейкина 1 (1Ь-1) (Т1К). МебхйЦот К. е! а1., 1998, Мо1. Се11 2:253-8. Распознавание ТЬК микробной инвазии запускает активацию системы передачи сигнала, которая является эволюционно консервативной у ПгозорЫ1а и у млекопитающих. Содержащий домен Т1К адаптерный белок МуЬ88, как сообщалось, связывается со многими ТЬК и привлекает к пополнению рецепторов ТЬК связанную с рецептором 1Ь-1 киназу (1КАК) и связанный с рецептором фактора некроза опухолей (ΤΝΕ) фактор 6 (ТКАР6). Зависимый от МуЬ88 путь передачи сигнала, как полагают, приводит к активации факторов транскрипции NР-кВ и активируемых митогеном с-1ип ΝΉ₂концевой киназы Цпк) протеинкиназ (МАРК), решающим стадиям в активации иммунной системы и продукции воспалительных цитокинов. Для обзора, см. Абегет А. е! а1., 2000, №1иге 406:782-87.

Хотя имеются сообщения о ряде специфических лигандов для ТЬК, лиганды для некоторых ТЬК остаются неидентифицированными. Лиганды для ТЬК2 включают пептидогликан и липопептиды. УозЫтцга А. е! а1., 1999, 1. 1ттипо1. 163:1-5; АйргапДс А.О. е! а1., 1999, 8с1епсе 285:736-9. Сообщалось, что

- 3 013468 двухцепочечная РНК (бзРНК) вирусного происхождения и поли-(1:С), синтетический аналог бзРНК, являются лигандами ТБК3. А1ехорои1ои Ь. е! а1., 2001, Ыа!иге 413:732-8. Липополисахарид (ЬР8) является лигандом для ТБК4. Ро1!огак А. е! а1., 1998, 8с1епсе 282:2085-8; НозЫпо К. е! а1., 1999, 1. 1ттипо1. 162:3749-52. Бактериальный флагеллин является лигандом для ТБК5. НауазЫ Р. е! а1., 2001, Ыа!иге 410:1099-1103. Сообщалось, что пептидогликан является лигандом не только для ТЕК2, но также для ТБК6. Охпъку А. е! а1., 2000, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 97:13766-72; ТакеисЫ О. е! а1., 2001, 1п!. 1ттипо1. 13:933-40. Сообщалось, что одноцепочечная РНК, содержащая гуанозин и уридин, является лигандом для ТБК7 и ТБК8. Заявка на патент США 2003/0232074 А1. Сообщалось, что некоторые низкомолекулярные синтетические соединения, имидазохинолоны имихимод (К-837) и резихимод (К-848), являются лигандами ТЬК7 и ТБК8. 1игк М. е! а1., 2002, Ыа!. 1ттипо1. 3:499; Нетт1 Η. Е! а1., 2002, Ыа!. 1ттипо1. 3:196-200. Сообщалось, что бактериальная ДНК (СрС-ДНК) является лигандом для ТЬК9. Нетт1 Н. е! а1., 2000, Ыа!иге 408:740-5; Ваиег 8. е! а1., 2001, Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 98, 9237-42. Природные лиганды для ТЬК1 и ТЕК10 не известны.

Любой из ТЕК7, ТЬК8 и ТЬК9 передает сигнал в ответ на лиганд в виде соответствующей нуклеиновой кислоты с участием адаптерного белка МуЭ88. Полагают, что ТЬК8 крысы, в отличие от ТЬК8 человека, является нефункциональным. Таким образом, у мышей функциональными являются ТЕК7 и ТЬК9, и они передают сигнал в ответ на лиганд в виде соответствующей нуклеиновой кислоты с участием МуЭ88. Мыши, у которых отсутствует ТЬК7, имеют, таким образом, только ТЬК9 в качестве функционального ТЬК, который, как известно, способен передавать сигнал в ответ на лиганд в виде соответствующей нуклеиновой кислоты через зависимый от МуЭ88 путь (см. фиг. 1).

В настоящее время неожиданно обнаружено, что определенные одноцепочечные олигорибонуклеотиды с фосфодиэфирным остовом, но не с фосфоротиоатным остовом, способны стимулировать клетки иммунной системы зависимым от МуЭ88 способом у мышей, у которых отсутствует функциональный ТЬК7 или ТЬК8.

Иммуностимулирующий одноцепочечный олигорибонуклеотид (ззОРН), применимый в соответствии с настоящим изобретением, имеет размер, составляющий 5-100 нуклеотидов, имеет фосфодиэфирный остов и нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С, при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) или (b) не включает СрС-мотив Х₄Х₂ССХ₃Х₄, где Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды, и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий ззОРН не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).

Иммуностимулирующий одноцепочечный олигорибонуклеотид (ззОРН), применимый в соответствии с настоящим изобретением, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения можно получить и выделить из природных источников РНК. Альтернативно и более конкретно, иммуностимулирующий одноцепочечный олигорибонуклеотид (ззОРН), применимый в соответствии с настоящим изобретением, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения можно получить синтетическими методами, хорошо известными в данной области.

Иммуностимулирующий 88ОРН настоящего изобретения может быть природного или неприродного происхождения. Природная РНК является типом нуклеиновой кислоты, который, как правило, относится к линейному полимеру из определенных рибонуклеозидных единиц, каждая рибонуклеозидная единица состоит из основания в виде пурина или пиримидина и сахара в виде рибозы, связанных с помощью межнуклеозидных фосфодиэфирных связей. В этом отношении термин линейный, как подразумевается, описывает первичную структуру РНК. РНК, как правило, может быть одноцепочечной или двухцепочечной, включая частично двухцепочечной.

Используемый в данном описании термин нуклеозид относится к одной составляющей в виде сахара (например, рибозе или дезоксирибозе), связанной с взаимозаменяемым органическим основанием, которое является или замещенным пиримидином (например, цитозином, тимином или урацилом), или замещенным пурином (например, аденином или гуанином). Соответствующими нуклеотидами являются цитидин, тимидин, уридин, аденозин и гуанозин, которые обычно обозначают как С, Т, и, А и С, соответственно. Как описано в данном описании, нуклеозид может быть природным нуклеозидом, модифицированным нуклеозидом или синтетическим (искусственным) нуклеозидом.

Используемые взаимозаменяемо термины нуклеиновая кислота и олигонуклеотид означают множество нуклеотидов, т.е. молекул, включающих сахар (например, рибозу или дезоксирибозу), связанный с фосфатной группой и взаимозаменяемым органическим основанием, описанным выше. Используемые в данном описании термины относятся к олигорибонуклеотидам (ОРН), а также к олигодезоксирибонуклеотидам (ОДН). Эти термины также включают полинуклеозиды (т.е. полинуклеотид минус фосфат) и любой другой, содержащий органические основания полимер. Молекулы нуклеиновых кислот можно получить из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномная НК или

- 4 013468 кДНК), но предпочтительными являются синтетические молекулы нуклеиновых кислот (например, полученные синтезом нуклеиновых кислот).

Термины нуклеиновая кислота и олигонуклеотид также включают нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с заменами или модификациями, такими как в основаниях и/или сахарах. Например, они включают нуклеиновые кислоты, имеющие сахара в остове, которые ковалентно связаны с низкомолекулярными органическими группами, отличными от гидроксильной группы в положении 3' и от фосфатной группы в положении 5'. Таким образом, модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать 2'-О-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать сахара, такие как арабиноза, вместо рибозы. Нуклеиновые кислоты могут, следовательно, быть гетерогенными в отношении состава остова, они могут, таким образом, содержать любую возможную комбинацию полимерных единиц, связанных вместе, такие как пептидонуклеиновые кислоты (которые имеют аминокислотный остов с основаниями нуклеиновых кислот). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты являются гомогенными в отношении состава остова. Нуклеиновые кислоты также включают замещенные пурины и пиримидины, такие как С-5 пропин-модифицированные основания. ХУадпсг Κ.ν. е! а1., 1996, №11. Вю1ес11по1. 14:840-4. Пурины и пиримидины включают, но, не ограничиваясь ими, аденин, цитозин, гуанин, тимидин, 5-метилцитозин, 2аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие природные и неприродные нуклеооснования, замещенные и незамещенные ароматические составляющие. Специалистам в данной области известны другие такие модификации.

Основания природных нуклеозидов можно заменить модифицированным нуклеозидным основанием, которое выбирают, например, из гипоксантина; дигидроурацила; псевдоурацила; 2-тиоурацила; 4тиоурацила; 5-аминоурацила; 5-(С₁-С₆)алкилурацила; 5-(С₂-С₆)алкенилурацила; 5-(С₂-С₆)алкинилурацила; 5-(гидроксиметил)урацила; 5-хлорурацила; 5-фторурацила; 5-бромурацила; 5-гидроксицитозина; 5- (С1-С6)алкилцитозина; 5-(С2-С6)алкенилцитозина; 5-(С2-С6)алкинилцитозина; 5-хлорцитозина; 5-фторцитозина; 5-бромцитозина; №-диметилгуанина; 2,4-диаминопурина; 8-азапурина (включающего, в частности, 8-азагуанин); замещенного 7-деазапурина (включающего, в частности, 7деазагуанин), включая 7-деаза-7-замещенный и/или 7-деаза-8-замещенный пурин, или других модификаций оснований природных нуклеозидов. Данный перечень представлен в качестве примера, и его не следует интерпретировать как ограничивающий.

В частности, когда в иммуностимулирующем ккОРН присутствует по меньшей мере один гуанозин, по меньшей мере одно основание гуанина иммуностимулирующего ккОРН может быть замещенным или модифицированным гуанином, таким как 7-деазагуанин; 8-азагуанин; 7-деаза-7-замещенный гуанин (такой как 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин; 7-деаза-8-замещенный гуанин; гипоксантин; 2,6-диаминопурин; 2-аминопурин; пурин; 8-замещенный гуанин, такой как 8-гидроксигуанин; и 6-тиогуанин. Данный печень представлен в качестве примера, и его не следует интерпретировать как ограничивающий.

Также, в частности, когда в иммуностимулирующем ккОРН присутствует по меньшей мере один уридин, по меньшей мере одно основание урацила иммуностимулирующего ккОРН может быть замещенным или модифицированным урацилом, таким как псевдоурацил и 5-метилурацил.

Для использования в настоящем изобретении нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно синтезировать бе ηονο, используя любую из числа методик, хорошо известных в данной области, например, β-цианоэтилфосфорамидатный метод (Веаисаде 8.Ь. е! а1., (1981) Те!гайебгоп Ьей 22:1859), нуклеозид-Н-фосфонатный метод (Сагедд е! а1., (1986) Тейайебгоп Ьей 27:4051-4; РгоеЫег е! а1., 1986, Ыис1. Ас1б Кек. 14:5399-407; Сагедд е! а1., 1986, Те!гайебгоп Ьей 27:4055-8; СаГГпеу е! а1., 1988, Те!гайебгоп Ьей 29:2619-22). Такие химические технологии можно выполнить с помощью множества автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, имеющихся в продаже. На указанные нуклеиновые кислоты приводится ссылка как на синтетические нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты можно получить из существующих последовательностей нуклеиновых кислот (например, рибосомальной, информационной или транспортной РНК), используя известные методики, в которых используются рестрикционные ферменты, экзонуклеазы или эндонуклеазы. На нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, приводится ссылка как на выделенные нуклеиновые кислоты. Выделенная нуклеиновая кислота обычно относится к нуклеиновой кислоте, которая выделена из компонентов, с которыми она обычно связана в природе. Например, выделенная нуклеиновая кислота может быть нуклеиновой кислотой, которая выделена из клетки, из ядра, из митохондрии или из хроматина. Термин нуклеиновая кислота включает как синтетическую, так и выделенную нуклеиновую кислоту.

Применимый в соответствии с настоящим изобретением ккОРН является иммуностимулирующим. Используемый в данном описании термин иммуностимулирующий ккОРН относится к ккОРН, который способен индуцировать иммунный ответ, например, стимулировать клетку иммунной системы с активацией ее пролиферации, дифференциации, миграции, с увеличением ее цитолитической активности, увеличением экспрессии секретируемых продуктов, ассоциируемых с ее активацией, увеличением экспрессии маркеров клеточной поверхности или состимулирующих молекул, ассоциируемых с активацией клетки иммунной системы, или с любой их комбинацией. Секретируемые продукты, ассоциируемые с активацией иммунной клетки, хорошо известны в данной области и могут включать, но не ограничиваясь

- 5 013468 ими, цитокины, хемокины и антитела.

Иммуностимулирующий ззОРН настоящего изобретения можно использовать для индукции иммунного ответа Тй1-подобного типа как ίη νίίτο, так и ίη νίνο. Используемый в данном описании термин иммунный ответ Т111-подобного типа относится к активации клеток иммунной системы с экспрессией Т111-подобны.х секретируемых продуктов, включая определенные цитокины, хемокины и подклассы иммуноглобулинов, и к активации определенных клеток иммунной системы. Т111-подобные секретируемые продукты включают, но не ограничиваясь ими, цитокины ΙΕΝ-γ, 1Ь-2, 1Ь-12, 1Ь-18, ТИЕ-α и хемокин 1Р10 (СХСЬ10). У мыши активация иммунного ответа типа ТЫ стимулирует секрецию 1дС2а. У человека активация иммунного ответа типа ТЫ стимулирует секрецию 1дС1. Соответственно, иммунный ответ ТЫ-подобного типа у мыши может включать увеличение секреции 1дС2а, и иммунный ответ Т111подобного типа у человека может включать увеличение секреции 1дС1. Активация иммунного ответа ТЫ-типа и ТЫ-подобного типа может включать активацию ΝΚ-клеток (природных киллеров) и дендритных клеток, т.е. клеток, вовлеченных в клеточный иммунитет. Полагают, что активация иммунного ответа ТЫ-типа и ТЫ-подобного типа приводит к встречной регуляции активации иммунного ответа Т112-типа.

Иммуностимулирующий ззОРН настоящего изобретения можно использовать для индукции специфического в отношении антигена иммунного ответа как ίη νίίτο, так и ίη νίνο. Как использовано в данном описании, специфический в отношении антигена иммунный ответ представляет собой адаптивный иммунный ответ, возникающий в результате контакта между клетками иммунной системы и антигеном.

Термин антиген относится к молекуле, способной провоцировать иммунный ответ. Термин антиген в широком значении включает любой тип молекулы, распознаваемой системой хозяина в качестве чужеродного. Антигены включают, но, не ограничиваясь ими, микробные антигены, раковые антигены и аллергены. Антигены включают, но, не ограничиваясь ими, клетки, клеточные экстракты, белки, полипептиды, пептиды, полисахариды, конъюгаты полисахаридов, пептидные и непептидные имитаторы полисахаридов и других молекул, малые молекулы, липиды, гликолипиды и углеводороды. Многие антигены являются по природе белком или полипептидом, поскольку белки или полипептиды являются, как правило, более антигенными, чем углеводороды или жиры.

Антиген может быть антигеном, кодируемым являющимся нуклеиновой кислотой вектором, или он может быть антигеном сам по себе. В первом случае являющийся нуклеиновой кислотой вектор вводят субъекту, и антиген экспрессируется ίη νίνο. Во втором случае антиген можно вводить субъекту непосредственно. Используемый в данном описании термин антиген, не кодируемый являющимся нуклеиновой кислотой вектором, относится к любому типу антигена, который не является нуклеиновой кислотой. Например, в некоторых аспектах настоящего изобретения антиген, не кодируемый являющимся нуклеиновой кислотой вектором, представляет собой пептид или полипептид. Минорные модификации первичных аминокислотных последовательностей антигенов в виде пептидов или полипептидов могут также привести к полипептиду, который имеет, по существу, эквивалентную антигенную активность по сравнению с немодифицированной копией полипептида. Такие модификации могут быть намеренными, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза, или спонтанными. Любой полипептид, полученный с помощью таких модификаций, включен в данное описание, при условии, что антигенность все еще существует. Пептиды или полипептиды могут быть, например, вирусного происхождения. Антигены, применимые в настоящем изобретении, могут иметь любую длину, находящуюся в диапазоне от небольших пептидных фрагментов полноразмерного белка или полипептида до полноразмерных форм. Например, длина антигена может быть меньше 5, меньше 8, меньше 10, меньше 15, меньше 20, меньше 30, меньше 50, меньше 70, меньше 100 или более аминокислотных остатков, при условии, что антиген стимулирует специфический иммунный ответ.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигеном является раковый антиген. Как использовано в данном описании, раковый антиген представляет собой соединение, такое как пептид или белок, которое связано с поверхностью опухолевой или раковой клетки и способно провоцировать иммунный ответ при экспрессии на поверхности антигенпрезентирующей клетки в контексте молекулы МНС (главного комплекса гистосовместимости). Раковые антигены можно получить из раковых клеток или с помощью приготовления грубых экстрактов раковых клеток, например, как описано у Οοΐιοη Р.А. с1 а1., 1994, Санссг Кез. 54:1055-8, с помощью частичной очистки антигенов, с помощью рекомбинантной технологии или с помощью бе ηονο синтеза известных антигенов. Раковые антигены включают, но не ограничиваясь ими, антигены, которые рекомбинантно экспрессированы, их иммуногенную часть или опухоль, или злокачественную опухоль в целом. Такие антигены можно выделить или получить рекомбинантно или с помощью любого другого способа, известного в данной области.

Термины раковый антиген и опухолевый антиген используются взаимозаменяемо и относятся к антигенам, которые дифференциально экспрессируются раковыми клетками и могут, таким образом, эксплуатироваться для того, чтобы использовать раковые клетки в качестве мишеней. Раковыми антигенами являются антигены, которые могут потенциально стимулировать явно специфические в отношении опухоли иммунные ответы. Некоторые из таких антигенов кодируются, хотя необязательно экспрессируются, нормальными клетками. Такие антигены можно охарактеризовать как антигены, которые явля

- 6 013468 ются обычно подавленными (молчащими) (т.е. не экспрессируются) в нормальных клетках, как антигены, которые экспрессируются только на определенных стадиях дифференциации, и как антигены, которые временно экспрессируются, такие как эмбриональные и фетальные антигены. Другие раковые антигены кодируются мутантными клеточными генами, такими как онкогены (например, активированный онкоген гак), супрессорные гены (например, мутант р53), слитые белки, являющиеся результатом внутренних делеций или хромосомных транслокаций. Другие раковые антигены могут еще кодироваться вирусными генами, такими как гены, переносимые онкогенными вирусами, содержащими РНК и ДНК. Примеры опухолевых антигенов включают МАСЕ, МЛИТ-1/Мс1ап-Л. др100, дипептидилпептидазу IV (ΌΡΡίν), аденозиндезаминаза-связывающий белок (АОАЬр), циклофилин Ь, ассоциируемый с толстой и прямой кишками антиген (СКС)-С017-1А/СА733, канцероэмбриональный антиген (СЕА) и его иммуногенные эпитопы САР-1 и САР-2, е!уб, ат11, специфический в отношении предстательной железы антиген (Р8А) и его иммуногенные эпитопы Р8А-1, Р8А-2 и Р8А-3, специфический в отношении предстательной железы мембранный антиген (Р8МА), Т-клеточный рецептор/СО3-зета цепь, МАСЕ-семейство опухолевых антигенов (например, МАСЕ-А1, МАСЕ-А1, МАСЕ-А3, МАСЕ-А4, МАСЕ-А5, МАСЕ-Аб, МАСЕА7, МАСЕ-А8, МАСЕ-А9, МАСЕ-А10, МАСЕ-А11, МАСЕ-А12, МАСЕ-Хр2 (МАСЕ-В2), МАСЕ-Хр3 (МАСЕ-В3), МАСЕ-Хр4 (МАСЕ-В4), МАСЕ-С1, МАСЕ-С2, МАСЕ-С3, МАСЕ-С4, МАСЕ-С5), САСЕсемейство опухолевых антигенов (например, САСЕ-1, САСЕ-2, САСЕ-3, САСЕ-4, САСЕ-5, САСЕ-б, САСЕ-7, САСЕ-8, САСЕ-9), ВАСЕ, КАСЕ, ЬАСЕ-1, ЫАС, СпТ-ν, МПМ-1, СОК4, тирозиназу, р53, МПС-семейство, НЕК2/пеи, р21га§, КСА81, α-фетопротеин, Е-кадгерин, а-катенин, β-катенин и γкатенин, р120е!п, др100^Рте1117, РКАМЕ, ХУ-Е8О-1, ейе27, коли-белок аденоматозного полипоза (АРС), фодрин, коннексин 37, 1д-идиотип, р15, др75, ганглиозиды СМ2 и СЭ2, вирусные продукты, такие как белки вируса папилломы человека, 8тай-семейство опухолевых антигенов, 1тр-1, Р1А, ЕВVкодируемый ядерный антиген (ЕВЫА)-1, гликогенфосфорилаза головного мозга, 88Х-1, 88Х-2 (НОММЕЬ-40), 88Х-1, 88Х-4, 88Х-5, 8СР-1 и СТ-7, и с-егВ-2.

Злокачественные опухоли или опухоли и ассоциированные с такими опухолями опухолевые антигены включают (но не исключительно) острый лимфобластный лейкоз (е1сб; ат11; циклофилин Ь), Вклеточную лимфому (1д-идиотип), глиому (Е-кадгерин; α-катенин; β-катенин; γ-катенин; р120е!п), рак мочевого пузыря (р21га§), билиарный рак (р21га§), рак молочной железы (МПС-семейство; НЕК2/пеи: сегВ-2), рак шеи (р53; р21га§), рак толстой кишки (р21гак; НЕК2/пеи; с-егЬ-2; МПС-семейство), рак толстой и прямой кишок (ассоциируемый с толстой и прямой кишками антиген (СЯС)-С017-1Л/СА733; АРС), хориокарциному (СЕА), эпителиальноклеточный рак (циклофилин Ь), рак желудка (НЕК2/пеи; сегЬВ-2; гликопротеин да733), печеночноклеточный рак (α-фетопротеин), лимфому Ходжкина (1тр-1; ЕВЫА-1), рак легкого (СЕА; МАСЕ-3; ΝΥ-Β8Ο-1), происходящий из лимфоидных клеток лейкоз (циклофилин Ь), меланому (белок р15; др75, онкофетальный антиген, ганглиозиды СМ2 и СЭ2), миелому (МПС-семейство; р21га§), немелкоклеточный рак легкого (НЕК2/пеи; с-егЬВ-2), рак носоглотки (1тр-1; ЕВNА-1), рак яичников (МПС-семейство; НЕК2/пеи; с-егЬВ-2), рак предстательной железы (специфический в отношении предстательной железы антиген (Р8А) и его иммуногенные эпитопы Р8А-1, Р8А-2 и Р8А-3; Р8МА; НЕК2/пеи; с-егЬВ-2), рак поджелудочной железы (р21гак; МПС-семейство; НЕК2/пеи; сегЬВ-2; гликопротеин да733), рак почки (НЕК2/пеи; с-егЬВ-2), чешуйчатоклеточные раки шеи и пищевода (вирусные продукты, такие как белки вируса папилломы человека), рак яичка (ΝΥ-Β8Ο-1), Т-клеточный лейкоз (эпитопы ΠΓΕν-1) и меланому (Ме^-А/МАКТ-Ц сйс27; МАСЕ-2; р21гак; др100^Рте1117).

Размер иммуностимулирующего ккОРН настоящего изобретения составляет обычно по меньшей мере 5 и не более 100 нуклеотидов. В различных определенных вариантах осуществления настоящего изобретения размер иммуностимулирующего ккОРН настоящего изобретения составляет не более 40 нуклеотидов, включая 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1б, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2б, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 3б, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий ккОРН настоящего изобретения может включать последовательность поли-С, включая по меньшей мере 4 последовательных нуклеотида С, при условии, что ккОРН не состоит полностью из поли-С. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения последовательность поли-С, когда присутствует, находится на 3'-конце ккОРН.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий ккОРН настоящего изобретения не состоит полностью из поли-и. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий ккОРН настоящего изобретения не состоит полностью из полиА. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий ккОРН настоящего изобретения не состоит полностью из поли-С.

ккОРН настоящего изобретения, в частности, может быть применим для лечения субъектов, имеющих рак, субъектов, имеющих инфекционное заболевание, субъектов, имеющих аутоиммунное заболевание, субъектов, имеющих аллергию, и субъектов, имеющих астму.

Используемый в данном описании термин рак относится к неконтролируемому росту клеток, которые мешают нормальному функционированию органов и систем организма. Злокачественные опухоли,

- 7 013468 которые мигрируют из своего первоначального местонахождения и обсеменяют необходимые для жизни органы, могут, в конечном счете, привести к смерти субъекта благодаря функциональному истощению пораженных органов. Типы рака кроветворной системы, такие как лейкоз, способны вытеснить у субъекта нормальные компартменты кроветворной системы, что приводит, таким образом, к нарушению кроветворной системы (в форме анемии, тромбоцитопении и нейтропении), приводящему, в конечном счете, к смерти.

Используемый в данном описании термин субъект, имеющий рак, относится к субъекту, который имеет определяемые раковые клетки.

Метастаз является областью раковых клеток, отличной от местонахождения первичной опухоли, являющейся результатом диссеминирования раковых клеток из первичной опухоли в другие части организма. Во время диагностики массы первичной опухоли субъекта можно проверить на наличие метастазов. Метастазы наиболее часто определяют благодаря исключительному или комбинированному использованию изображений, получаемых с помощью магнитного резонанса (МК1), изображений, получаемых при компьютерной томографии (СТ), числа форменных элементов крови и тромбоцитов, исследований функции печени, рентгеновского исследования грудной клетки и сканограмм костей помимо контролирования специфических симптомов.

Злокачественные опухоли включают, но, не ограничиваясь ими, базальноклеточную карциному, рак желчных путей, рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга и центральной нервной системы, рак молочной железы, рак шеи, хориокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, эндометрический рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак желудка, интраэпителиальную опухоль, рак почки, рак гортани, лейкоз, рак печени, рак легкого (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный), лимфому, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, меланому, миелому, нейробластому, рак ротовой полости (например, губ, языка, рта и глотки), рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак прямой кишки, рак почки, рак дыхательной системы, саркому, рак кожи, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак матки, рак мочевой системы, а также другие карциномы и саркомы.

Используемый в данном описании термин инфекционное заболевание относится к нарушению, возникающему из-за инвазии инфекционного микроорганизма в хозяина, поверхностно, местно или по всему организму. Инфекционные микроорганизмы включают бактерии, вирусы, паразиты и грибы.

Используемый в данном описании термин субъект, имеющий инфекционное заболевание, относится к субъекту, который подвергся воздействию инфекционного организма и имеет определяемый уровень острой или хронической инфекции в организме. Воздействие инфекционного организма, как правило, происходит с наружной поверхности субъекта, например, кожи или слизистых оболочек, и/или относится к проникновению инфекционного организма в наружную поверхность субъекта.

Примеры вирусов, которые были обнаружены у людей, включают, но не ограничиваясь ими, Ке1гоушбае (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как Ηΐν-1 (на который также приводится ссылка как на ΗΌΤν-ΙΙΙ, ΤΆνΕ или ΗΤΕν-ΙΙΙ/ΕΑν, или Ηΐν-ΐΐΐ; и другие изоляты, такие как Ηΐν-ΕΡ); Ρ^со^ηаν^^^бае (например, полиовирусы, вирус гепатита А, энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, ЕСНО-вирусы); Са1с1ушбае (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Тодаушбае (например, вирусы энцефалита у лошадей, вирусы краснухи); Иаушбае (например, вирусы лихорадки денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Согоиоутбае (например, коронавирусы); КйаЬбоушбае (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Ебоушбае (например, вирусы Эбола); Ρа^атуxоν^^^бае (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паратита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Ο^ίйотуxоν^^^бае (например, вирусы гриппа), Виидаушбае (например, вирусы Гантаан, бунгавирусы, флебовирусы и наировирусы); Агепаушбае (вирусы геморрагической лихорадки); Веоушбае (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Впиаушбае; Иерабпаутбае (вирус гепатита В); Ρа^νоν^^^бае (парвовирусы); йароуаутбае (папилломавирусы, полиомавирусы); Абепоушбае (большинство аденовирусов); Ηе^реδν^^^бае (вирус простого герпеса (Ηδν) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (СМУ), вирус герпеса); Ρоxν^^^бае (вирусы натуральной оспы, вирусы осповакцины, вирусы оспы) и !г1боу1Г1бае (например, вирус африканской лихорадки свиней), и неклассифицированные вирусы (например, агент дельта-гепатита, который, как полагают, является дефектным спутником вируса гепатита В; агенты гепатита не-А, не-В (класса 1 = внутренне передающийся; класса 2 = парентерально передающийся (т.е. гепатит С); вирусы Норвалк и родственные вирусы и астровирусы).

У позвоночных животных как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии служат в качестве антигенов. Такие грамположительные бактерии включают, но не ограничиваясь ими, виды Ρаδ1еиге11а, виды 81ар11у1ососс1 и виды 81герЮсоссщ. Грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваясь ими, Εδ^^πΗ^-ι со11, виды Ρδеиботоηаδ и виды 8а1топе11а. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают, но не ограничиваясь ими, Ηе1^соЬасΐе^ ру1о^^δ, ВоггеНа ЬигдбогГегг Ьедюпе11а рпеиторЬШа, виды МусоЬас1епа (например, М. ΐиЬе^си1оδ^δ, М. аушт, М. т1гасе11и1аге, М. каг^Мг М. догбопае), 81арку1ососсш аигеш, Nе^δδе^^а допоггкоеае, Nе^δδе^^а тешпд^ί^б^δ, ^^δΐе^^а топосуΐодепеδ, 81герЮсоссш руодепеδ (стрептококк группы А), 81герЮсоссщ ада1асбае (стрептококк группы В), 81гер1ососсш (зеленящие), 81гер1ососсш Гаеса^, 81герЮсоссщ Ьоν^δ, 81гер1ососсщ (анаэробные виды), 81гер1ососсщ

- 8 013468 рпеитошае, патогенные виды Сашру1оЬас1ег, виды Еп1егососсик, Наеторббик тПиспхас. ВасШик апИгаак, СогупеЬас1егшт бгрбИебае, виды СогупеЬас1егшт. ЕгубреИИпх гбикюраШае, С1окб1бшт регГппдепк. С1окбтбтт 1е1ат. Еп1егоЬас1ег аегодепек, К1еЬк1е11а рпеитошае, Рак1иге11а тиЙошба, виды Вас1его1бек, ЕикоЬас1ебит ппс1еа1пт. 81гер1оЬасб1ик тотНГоптк. Тгеропета ра1йбшт, Тгеропета ребепие, Ьер1окр1га. Р|ске1181а и Асбпотусек 1кгаеШ.

Примеры грибов включают СгурЮсосспк пеоГогтапк. Нй1ор1акта саркп1а1ит. Сосс1бю1бек нптШк. В1ак1отусек бегтабббй, Сб1атуб1а басботабк, Сапб1ба а1Ысапк.

Другие инфекционные организмы (т.е. одноклеточные организмы) включают виды Р1актобшт, такие как Р1актобшт ГаШрагит. Р1актобтт та1абае, Р1актобшт оса1е и Р1актобшт снах и Тохор1акта допбб. Паразиты крови-кости и/или тканей включают виды Р1актобшт, ВаЬеба шкгоб, ВаЬеба ббегдепк, Ьейбшаша борюа, виды Ьейбшаша, Ьейбшаша Ьгахб1епк1к. Ьейбшата бопосат. Тгурапокота датЫепке и Тгурапокота гбобебепке (африканский трипаносомоз), Тгурапокота сгу/ί (болезнь Шагаса) и Тохор1акта допби.

Другие релевантные в медицинском отношении микроорганизмы подробно описаны в литературе, например, см. С.О.А. Тботак, Мебюа1 МюгоЬю1оду, Вабйеге Ттба11, Великобритания 1983, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.

ккОРН настоящего изобретения также применим для лечения и профилактики аутоиммунного заболевания. Аутоиммунное заболевание представляет собой класс заболеваний, при которых собственные антитела субъекта реагируют с тканями хозяина или при которых эффекторные Т-клетки иммунной системы являются аутореактивными в отношении эндогенных аутопептидов и вызывают разрушение ткани. Таким образом, возникает иммунный ответ против собственных антигенов субъекта, на которые приводится ссылка как на аутоантигены. Аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит, болезнь Крона, множественный склероз, системную красную волчанку (8ЬЕ), аутоиммунный энцефаломиелит, тяжелую миастению (МО), зоб Хасимото, синдром Гудпасчера, пузырчатку (например, пузырчатку обыкновенную), болезнь Грейвса, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, склеродерму с антителами против коллагена, болезнь смешанных соединительных тканей, полимиозит, пернициозную анемию, идиопатическую болезнь Аддисона, аутоиммунное сопутствующее бесплодие, гломерулонефрит (например, полулунный гломерулонефрит, пролиферативный, гломерилонефрит), буллезный пемфигоид, синдром Шегрена, инсулинорезистентность и аутоиммунный сахарный диабет.

Используемый в данном описании термин аллергия относится к приобретенной гиперчувствительности к веществу (аллергену). Аллергические состояния включают, но не ограничиваясь ими, экзему, аллергический ринит или острый ринит, сенную лихорадку, аллергический конъюнктивит, бронхиальную астму, крапивницу (сыпь) и пищевые аллергии, другие атопические состояния, включая атопический дерматит; анафилаксию; лекарственную аллергию и болезнь Квинке. Аллергические заболевания включают, но не ограничиваясь ими, ринит (сенную лихорадку), астму, крапивницу и атопический дерматит.

Как использовано в данном описании, субъектом, имеющим аллергию, является субъект, который имеет аллергическую реакцию в ответ на аллерген.

Аллерген относится к веществу (антигену), который индуцирует аллергическую или астматическую реакцию у чувствительного субъекта. Перечень аллергенов огромен и может включать пыльцу, яды насекомых, пыль-перхоть животного происхождения, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин). Примеры природных аллергенов животного и растительного происхождения включают, но, не ограничиваясь ими, белки, специфические в отношении следующих родов: Сашк (Сашк ГашШапк); Пегта1орбадо1бек (например, Пегта1орбадо1бек Гаппае); Еейк (Еейк ботекбсик); АтЬгоба (АтЬгоба аг1етбк£оба); Ьобит (например, Ьобит регеппе или Ьобит тибШогит); Сгур1отеба (Сгур1отеба )ароп1са); АЙетаба (АЙетаба абегпа1а); А1бег; А1пик (А1пик ди1бпоака); Ве1и1а (Ве1и1а уеггисока); Оиегсик (Опегспк а1Ьа); О1еа (О1еа еигора); Абет1к1а (Абетша уи1дапк); Р1ап1адо (например, Р1ап1адо 1апсео1а1а); Рапе1апа (например, Рапе1апа оШстабк или Рапе1апа )пба1са); В1айе11а (например, В1айе11а дегташса); Ар1к (например, Арй ши1бГ1огит); Сиргеккик (например, Сиргеккик кетрегунепк, Сиргеккик апхотса и Сиргеккик тасгосагра); Ишрегик (например, Ишрегик каЫпо1бек, Ишрегик убдйиапа. Ишрегик соттишк и Ишрегик акбе1); Тбиуа (например, Тбиуа обейабк); Сбатаесурабк (например, Сбатаесурабк оЬика); Ребр1апе1а (например, Ребр1апе1а атебсапа); Адгору гоп (например, Адгору гоп герепк); 8еса1е (например, 8еса1е сегеа1е); Тббсит (например, Тббсит аекбуит); Эас1у11к (например, Эас1у11к д1отега!а); ЕекШса (например, ГскШса е1абог); Роа (например, Роа рга!епк1к или Роа сотргекка); Ауепа (например, Ауепа кабуа); Но1сик (например, Но1сик 1апа1ик); Ап1бохап1йит (например, Ап1йохап1бит обогаШт); АггбепаИегит (например, АттбепаИегит е1абик); Адгокбк (например, Адгокбк а1Ьа); Рб1еит (например, Рб1еит рга!епке); Рба1апк (например, Рба1апк агипбтасеа); Ракра1ит (например, Ракра1ит по1аШт); 8огдбит (например, 8огдбит ба1ерепк1к) и Вготик (например, Вготик тегтй).

Используемый в данном описании термин астма относится к заболеванию респираторной системы, характеризующемуся воспалением, сужением дыхательных путей и увеличенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемые агенты. Астма часто, хотя не исключительно, ассоциируется с атопиче- 9 013468 ским или аллергическим состоянием. Симптомы астмы включают повторяющиеся эпизоды стерторозного дыхания, одышки и сжатия в груди, и кашель, являющийся результатом затрудненного дыхания. Воспаление дыхательных путей, сопровождающее астму, можно определить благодаря наблюдению за рядом физиологических изменений, таких как денудация эпителия дыхательных путей, отложение коллагена ниже базальной мембраны, отек, активация тучных клеток, инфильтрация воспалительных клеток, включая нейтрофилы, инозинофилы и лимфоциты. В результате воспаления дыхательных путей у больных астмой часто наблюдается гиперреактивность дыхательных путей, затрудненное дыхание, респираторные симптомы и хронический характер болезни. Затрудненное дыхание включает острый бронхостеноз, отек дыхательных путей, образование слизистых пробок и коррекция дыхательных путей, признаки, которые часто приводят к бронхиальной непроходимости. В некоторых случаях астмы может иметь место фиброз суббазальной мембраны, что приводит к персистированному нарушению функции легких.

Как использовано в данном описании, субъектом, имеющим астму, является субъект, который имеет заболевание респираторной системы, характеризующееся воспалением, сужением дыхательных путей и увеличенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемые агенты. Астма часто, хотя не исключительно, сопровождается атопическими или аллергическими симптомами. Астма часто, хотя не исключительно, ассоциируется с контактом с инициатором. Инициатор, как использовано в данном описании, относится к композиционному состоянию или условию окружающей среды, которые инициируют астму. Инициаторы включают, но, не ограничиваясь ими, аллергены, низкие температуры, физические нагрузки, вирусные инфекции, §О₂.

88ОРН настоящего изобретения можно использовать или отдельно, или в комбинации с другими терапевтическими агентами. Другой терапевтический агент в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой 8бОРН настоящего изобретения. 8бОРН и другой терапевтический агент можно вводить одновременно или последовательно. Когда другие терапевтические агенты вводят одновременно, их можно вводить в одной и той же композиции или в отдельных композициях, но их вводят в одно и то же время. Другие терапевтические агенты вводят последовательно с одним другим терапевтическим агентом и с 88ОРН, когда введение других терапевтических агентов и 88ОРН разделено во времени. Разделение во времени между введением таких соединений может быть делом минут или дольше. Другие терапевтические агенты включают, но, не ограничиваясь ими, противомикробные агенты, противораковые агенты, противоаллергические агенты и т. д.

88ОРН настоящего изобретения можно вводить субъекту с противомикробным агентом. Противомикробный агент, используемый в данном описании, относится к природному или синтетическому соединению, которое способно уничтожать или ингибировать инфекционные микроорганизмы. Тип противомикробного агента, применимый в соответствии с настоящим изобретением, будет зависеть от типа микроорганизма, которым инфицирован или риск инфицирования которым имеется у субъекта. Противомикробные агенты включают, но не ограничиваясь ими, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, противогрибковые агенты и антипаразитарные агенты. Такие выражения, как противоинфекционный агент, антибактериальный агент, противовирусный агент, противогрибковый агент, антипаразитарный агент и паразитицид, имеют хорошо установившиеся значения для специалистов в данной области и определены в стандартных руководствах по медицине. Кратко, антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют бактерии и включают антибиотики, а также другие синтетические или природные соединения, имеющие схожие функции. Антибиотики представляют собой низкомолекулярные молекулы, которые продуцируются в виде вторичных метаболитов клетками, такими как микроорганизмы. Как правило, антибиотики блокируют одну или несколько функций или структур бактерий, которые являются специфическими для микроорганизма и которые не присутствуют в клетках-хозяина. Противовирусные агенты можно выделить из природных источников или синтезировать, и они используются для уничтожения или ингибирования вирусов. Противогрибковые агенты используют для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также инфекций, вызванных условно-патогенными грибами, и первичных системных грибковых инфекций. Антипаразитарные агенты уничтожают или ингибируют паразитов.

Примеры антипаразитарных агентов, на которые также приводится ссылка как на паразитициды, используемые для введения человеку включают, но не ограничиваясь ими, альбендазол, амфотерицин В, бензнидазол, битионол, хлорохин НС1, хлорохина фосфат, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, дилоксанида фуроат, эфлорнитин, фуразолидон, глюкокортикоиды, галофантрин, иодхинол, иверместин, мебендазол, мефлохин, меглюмина антимониат, меларсопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, парамомицин, пентамицина изотионат, пиперазин, празиквантел, примахина фосфат, прогуанил, пирантела памоат, пириметаминсульфонамиды, пириметаминсульфадоксин, хинакрин НС1, хинина сульфат, хинидина глюконат, спирамицин, стибоглюконат натрия (натрия сурьмы глюконат), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметропримсульфаметоксазол и трипарсамид, некоторые из которых используются отдельно или в комбинации с другими.

Антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют рост или функцию бактерий. Большим классом антибактериальных агентов являются антибиотики. На антибиотики, эффективные для уничтожения или ингибирования широкого ряда бактерий, приводится ссылка как на антибиотики широкого спектра. Другие типы антибиотиков преимущественно эффективны против грамположительных или гра

- 10 013468 мотрицательных бактерий. На такие типы антибиотиков приводится ссылка как на антибиотики узкого спектра. На другие антибиотики, которые эффективны против одного организма или болезни и не эффективны против других типов бактерий, приводится ссылка как на антибиотики ограниченного спектра. Классификацию антибактериальных агентов иногда проводят на основе первичного образа действия. Как правило, антибактериальные агенты являются ингибиторами синтеза клеточной стенки, ингибиторами клеточной мембраны, ингибиторами синтеза белков, синтеза нуклеиновых кислот или функциональными ингибиторами и конкурентными ингибиторами.

Противовирусными агентами являются соединения, которые предотвращают инфицирование клеток вирусами или репликацию вирусов внутри клетки. Существует намного меньше противовирусных лекарственных средств, чем антибактериальных лекарственных средств, поскольку процесс репликации вирусов столь близко связан с репликацией ДНК внутри клетки-хозяина, что неспецифические противовирусные агенты часто являются токсичными для хозяина. Существует несколько стадий внутри процесса вирусной инфекции, которые можно блокировать или ингибировать с помощью противовирусных агентов. Эти стадии включают прикрепление вируса к клетке-хозяина (иммуноглобулин или связывающие пептиды), декапсидацию вируса (например, амантадин), синтез или трансляцию вирусной мРНК (например, интерферон), репликацию вирусной РНК или ДНК (например, аналоги нуклеотидов), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторы протеаз) и почкование и высвобождение вируса.

Аналогами нуклеотидов являются синтетические соединения, сходные с нуклеотидами, но которые имеют неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. При попадании аналогов нуклеотидов в клетку они фосфорилируются с образованием трифосфатных форм, которые конкурируют с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. После включения трифосфатной формы аналога нуклеотида в растущую нуклеотидную цепь он вызывает необратимое связывание с вирусной полимеразой и, следовательно, обрыв цепи. Аналоги нуклеотидов включают, но не ограничиваясь ими, ацикловир (используемый для лечения вируса простого герпеса и вируса ветряной оспы), ганцикловир (используемый для лечения цитомегаловируса), идоксуридин, рибавирин (используемый для лечения респираторно-синцитиального вируса), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин, цидовудин (азидотимидин), имиквимод и резимиквимод.

Интерфероны представляют собой цитокины, которые секретируются инфицированными вирусами клетками, а также клетками иммунной системы. Интерфероны функционируют, связываясь со специфическими рецепторами на клетках, примыкающих к инфицированным клеткам, что вызывает в клетке изменение, которое защищает ее от инфицирования вирусом. Интерфероны α и β также индуцируют экспрессию молекул МНС класса I и II на поверхности инфицированных клеток, что приводит к увеличению презентации антигенов для распознавания клетками иммунной системы. Интерфероны α и β доступны в рекомбинантных формах и использовались для лечения хронического гепатита В и С. В дозах, которые являются эффективными для противовирусной терапии, интерфероны имеют тяжелые побочные эффекты, такие как лихорадка, недомогание и потеря веса.

Противовирусные агенты, используемые в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь ими, иммуноглобулины, амантадин, интерфероны, аналоги нуклеотидов и ингибиторы протеаз. Конкретные примеры противовирусных агентов включают, но, не ограничиваясь ими, ацеманнан, ацикловир, ацикловир натрий, адефовир, аловудин, алвирцепт судотокс, амантадин гидрохлорид, аранотин, арилдон, атевирдина мезилат, авридин, цидофовир, ципамфиллин, цитарабин гидрохлорид, делавирдина мезилат, десцикловир, диданозин, дисоксарил, эдоксудин, энвираден, энвироксим, фамцикловир, фамотин гидрохлорид, фиацитабин, фиалуридин, фосарилат, фоскарнет натрий, фосфонет натрий, ганцикловир, ганцикловир натрий, идоксуридин, кетоксаль, ламивудин, лобукавир, мемотин гидрохлорид, метисазон, невирапин, пенцикловир, пиродавир, рибавирин, римантадин гидрохлорид, саквинавира мезилат, сомантадин гидрохлорид, соривудин, статолон, ставудин, тилорон гидрохлорид, трифлуридин, валацикловир гидрохлорид, видарабин, видарабина фосфат, видарабина натрия фосфат, вироксим, залыдитабин, цидовудин и цинвироксим.

Противогрибковые агенты применимы для лечения и профилактики инфекционных грибов. Классификацию противогрибковых агентов иногда проводят по их механизму действия. Некоторые противогрибковые агенты функционируют в качестве ингибиторов клеточной стенки путем ингибирования глюкозосинтазы. Такие агенты включают, но не ограничиваясь ими, базиунгин/ЕСВ. Другие противогрибковые агенты функционируют путем дестабилизации целостности мембраны. Такие агенты включают, но, не ограничиваясь ими, иммидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, интраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконазол, а также РК 463, амфотерицин В, ΒΑΥ 38-9502, МК 991, прадимицин, ИК 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибковые агенты функционируют путем разрушения хитина (например, хитиназа) или иммуносупрессии (крем 501).

δδΟΡΗ настоящего изобретения можно также вводить в соединении с противораковой терапией. Противораковая терапия включает лекарственные средства против рака, облучение и хирургические способы. Используемый в данном описании термин лекарственное средство против рака относится к агентам, которые вводят субъекту с целью лечения рака. Как использовано в данном описании, лечение ра

- 11 013468 ка включает предотвращение развития рака, уменьшение симптомов рака и/или ингибирование роста укоренившегося рака. В других аспектах лекарственное средство против рака вводят субъекту с риском развития рака с целью уменьшения риска развития рака. Различные типы лекарственных средств для лечения рака описаны в данном описании. Для целей данного описания лекарственные средства против рака классифицируют в виде химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов, противораковых вакцин, гормонотерапии и модификаторов биологического ответа.

Химиотерапевтические агенты могут быть выбраны из группы, состоящей, но не ограничиваясь ими, из метотрексана, винкристина, адриамиуина, цисплатина, не содержащих сахара хлорэтилнитрозомочевин, 5-фторурацила, митомицина С, блеомицина, доксорубицина, дакарбазина, таксола, фрагилина, мегламина СЬЛ, валрубицина, кармустаина и полиферпосана, ΜΜΙ270, ΒΑΥ 12-9566, ингибитора фамезилтрансферазы ΚΑδ, ингибитора фамезилтрансферазы, ММР, ΜΤΑ/ΕΥ231514, ^Υ264618/лометексола, гламолека, С1-994, ΤΝΡ-470, гикамтина/топотекана, РКС412, валсподара/Р8С833, новантрона/митроксантрона, метарета/сурамина, батимастата, Е7070, ВСН-4556, С8-682, 9-АС, ΑΟ3340, ΑΟ3433, инсела/УХ-710, УХ-853, ΖΌ0101, ΙδΙ641, ΘΌΝ 698, ТА 2516/мармистата, ВВ2516/мармистата, СОР 845, Ό2163, ΡΌ183805, ΩΧ8951Γ. лемонала ΌΡ 2202, РК 317, пицибанила/ОК-4 32, ΑΌ 32/валрубицина, метастрона/производного стронция, темодала/темозоломида, эвацета/липосомального доксорубицина, ютаксана/паклитаксела, таксола/паклитаксела, кселоада/капецитабина, фуртулона/доксифлуридина, циклопакса/перорального паклитаксела, перорального таксоида, δΡυ-077/цисплатина, ΗΜΚ. 127 5/флавопиридола, СР-358(774)/Е6РК, СР-609 (754)/ингибитора онкогена ΚΑδ, ΒΜδ-182751/пероральной платины, иРТ(тегафура/урацила), эргамизола/левамизола, энилурацила/776С85/усилителя 5РИ, кампто/ левамизола, камптосара/иринотекана, тумодекса/ралитрекседа, леустатина/кладрибина, паксекса/паклитаксела, доксила/липосомального доксорубицина, каеликса/липосомального доксорубицина, флудара/ флударабина, фармарубицина/эпирубицина, ИероСу!, ΖΌ1839, ЬИ 79553/бис-нафталимида, ЬИ 103793/ доластаина, каетикса/липосомального доксорубицина, гемзара/гемцитабина, ΖΌ 0473/анормеда, ΥΜ 116, затравочных кристаллов лодина, ингибиторов ί.ΌΚ4 и СЭК2, ингибиторов ΡΑΡΡ, В4 809/дексифосамида, ифеса/меснекса/ифосфамида, вумона/тенипозида, параплатина/карбоплатина, плантинола/цисплатина, вепезида/этопозида, ΖΌ 9331, таксотера/доцетаксела, пролекарства гуанина арабинозида, аналога таксана, нитрозомочевин, алкилирующих агентов, таких как мелфелан и циклофосфамид, аминоглутетимида, аспарагиназы, бусулфана, карбоплатина, хлоромбуцила, цитарабина НС1, дактиномицина, даунорубицина НС1, эстрамустина фосфата натрия, этопозида (ΥΡ16-213), флоксуридина, фторурацила (5-РИ), флутамида, гидроксимочевины (гидроксикарбамида), ифосфамида, интерферона альфа-2а, альфа-2Ь, леупролида ацетата (аналога ЬНКН-высвобождающего фактора), ломустина (СС^и), мехлоретамина НС1 (нитрогена мустарда), меркаптопурина, месны, митотана (о.р'-ΌΌΌ), митоксантрона НС1, октреотида, пликамицина, прокарбазина НС1, стрептозоцина, тамоксифена цитрата, тиогуанина, тиотепа, винбластина сульфата, амсакрина (т-ΑΜδΑ), азацитидина, эртропоэтина, гексаметилмеламина (НММ), интерлейкина 2, митогуазона (метил-ΟΑΟ; метилглиоксаля бис-гуанилгидразона; ΜΟΒΟ), пентостатина (2'дезоксикоформицина), семустина (метил-ССNυ), тенипозида (νΜ-26)κ виндесина сульфата.

Иммунотерапевтические агенты могут быть выбраны из группы, состоящей, но, не ограничиваясь ими, из рибутаксина, герцептина, квадрамета, панорекса, ΙΌΕ^Υ2Β8, ВЕС2, С225, онколима, δΜΑΚΤ Μ195, ΑΤΚΑΟΕΝ, оварекса, бексксара, ΕΌΡ-03, юг ΐ6, ΜΌΧ-210, ΜΌΧ-11, ΜΌΧ-22, Ον103, 3622^94, анти-νΕΟΡ, зенапакса, ΜΌΧ-220, ΜΌΧ-447, ΜΕΕΙΜΜυΝΕ-2, ΜΕΕΙΜΜυΝΕ-1, СΕΑСI^Ε, Ρ^еΐа^деΐ, ΝονοΙΜώ-ΟΣ, ΤΝΤ, глиомаб-Н, СМ-250, ΕΜΌ-72000, ЬутрйоОбе, СΜΑ 676, монофарм-С, 4В5, ίοτ едГ.г3, 1ог с5, ΒΑΒδ, анти-РЬК-2, ΜΌΧ-2 60, ΑΝΑ Α^ δΜΑΚΤ 1Ό10 Α^ δΜΑΚΤ ΑΒΕ364 ΑЬ и IттиηοКΑIΤСΕΑ.

Противораковые вакцины могут быть выбраны из группы, состоящей, но не ограничиваясь ими, из ΕΟΡ, антиидиотипических противораковых вакцин, антигена Ср75, вакцины против меланомы ΟΜΚ, вакцины на основе конъюгата с ганглиозидом ΜΟν, Нег2/пеи, оварекса, Μ-ναχ, Ο-ναχ, Ь^ах, δΤη-КНЬ тератопа, ΒΕΡ25 (ΜυΓ-1), липосомальной идиотипической вакцины, мелацина, вакцины на основе пептидных антигенов, вакцин на основе токсина/антигена, вакцин на основе ΜνΑ, ΡΑΟδ, вакцины БЦЖ, ΤΑ-№ν, ΤΑ-ΟΝ, ИКС-вируса и IттиηοСу8ΐ/Τйе^аСу8.

88ΟΡΗ настоящего изобретения можно также вводить субъекту с лекарственным средством против астмы/аллергии. Лекарственное средство против астмы/аллергии, используемое в данном описании, представляет собой обсуждаемую композицию, уменьшающую симптомы, предотвращающую развитие или ингибирующую астматическую или аллергическую реакцию. Различные типы лекарственных средств для лечения астмы и аллергии описаны в публикации 6шбе1ше8 Рог Ме П1адпо818 апб Уападетеп! оГ ΑδίΗπια, Εxре^ι Вапе1 Керой 2, МН ΡυΜ^ΐ^ №. 97/4051, 1и1у 19, 1997, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки. Краткое описание лекарственных средств, представленных в публикации МН, приведено ниже. В большинстве вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство против астмы/аллергии используется до некоторой степени для лечения как астмы, так и аллергии.

Лекарственные средства для лечения астмы, как правило, разделяют на две категории, быстро ослабевающие лекарственные средства и лекарственные средства продолжительного действия. Больные аст

- 12 013468 мой принимают лекарственные средства продолжительного действия ежедневно для достижения и сохранения контроля над персистированной астмой. Лекарственные средства продолжительного действия включают противовоспалительные агенты, такие как кортикостероиды, кромолин натрия и недокромил; продолжительно действующие бронхолитические средства, такие как продолжительно действующие β₂агонисты и метилксантины, и модификаторы лейкотриена. Быстро успокаивающие лекарственные средства включают короткого действия [Г-агонисты. антихолинергичекие средства и системные кортикостероиды. Существует много побочных эффектов, связанных с каждым из указанных лекарственных средств, и ни одно из них отдельно или в комбинации не способно предотвратить или полностью вылечить астму.

Лекарственные средства против астмы включают, но не ограничиваясь ими, ингибиторы РЭЕ-4, бронхолитические средства/[₂-агонисты, средства, открывающие К⁺-каналы, антагонисты УЬА-4, антагонисты нейрокина, ингибиторы синтеза тромбоксана А2 (ТХА2), ксантины, антагонисты арахидоновой кислоты, ингибиторы 5-липоксигеназы, антагонисты рецептора для ТХА2, антагонисты ТХА2, ингибитор активирующих 5-липоксигеназу белков и ингибиторы протеаз.

Бронхолитическое средство/[₂-агонисты являются классом соединений, вызывающих расширение бронхов или релаксацию гладкой мускулатуры. Бронхолитическое средство/[₂-агонисты включают, но, не ограничиваясь ими, сальметерол, сальбутанол, альбутерол, тербуталин, Э2522/формотерол, фенотерол, битолтерол, пирбутерол, метилксантины и орципреналин. [₂-агонисты и бронхолитические средства продолжительного действия представляют собой соединения, которые используют в дополнение к противовоспалительной терапии для продолжительного предотвращения симптомов. [₂-агонисты продолжительного действия включают, но, не ограничиваясь ими, сальметерол и альбутерол. Такие соединения обычно используются в комбинации с кортикостероидами и, как правило, не используются без какойлибо противовоспалительной терапии. Они сопровождаются побочными эффектами, такими как тахикардия, тремор скелетной мускулатуры, гипокалемия и удлинение интервала ОТе при передозировке.

Метилксантины, включающие, например, теофиллин, использовались для продолжительного контроля и предотвращения симптомов. Данные соединения вызывают расширение бронхов, являющееся результатом ингибирования фосфодиэстеразы и, по-видимому, антагонизма в отношении аденозина. С этим типом соединений особой проблемой является связанная с дозой острая токсичность. В результате следует контролировать определенную концентрацию в сыворотке для того, чтобы объяснить токсичность и сузить терапевтический диапазон, возникающий из-за индивидуальных различий в метаболическом очищении. Побочные эффекты включают тахикардию, тахиаритмию, тошноту и рвоту, стимуляцию центральной нервной системы, головную боль, припадки, гематемезис, гипергликемию и гипокалемию. [₂-агонисты короткого действия включают, но, не ограничиваясь ими, альбутерол, битолтерол, пирбутерол и тербуталин. Некоторые побочные эффекты, связанные с введением [₂-агонистов короткого действия, включают тахикардию, тремор скелетной мускулатуры, гипокалемию, увеличение молочной кислоты, головную боль и гипергликемию.

Традиционные способы лечения или профилактики аллергии включали использование антигистаминных средств или десенсибилизационной терапии. Антигистаминные средства и другие лекарственные средства, которые блокируют действие химических медиаторов аллергической реакции, помогают контролировать тяжесть аллергических симптомов, но не предотвращают аллергическую реакцию и не оказывают влияния на последующие аллергические реакции. Десенсибилизационную терапию проводят путем назначения небольших доз аллергена, обычно с помощью инъекции под кожу, для того чтобы индуцировать ответ 1дО-типа против аллергена. Присутствие антител в виде 1дС помогает нейтрализовать продукцию медиаторов, являющуюся, как полагают, результатом индукции антител в виде 1дЕ. Первоначально субъекта подвергают лечению очень низкой дозой аллергена для того, чтобы избежать индукции тяжелой реакции, и дозу медленно увеличивают. Данный тип терапии является опасным, поскольку субъекту на самом деле вводят соединения, которые вызывают аллергическую реакцию, и результатом могут быть тяжелые аллергические реакции.

Лекарственные средства против аллергии включают, но не ограничиваясь ими, антигистаминные средства, стероиды и индукторы простагландинов. Антигистаминные средства представляют собой соединения, которые нейтрализуют гистамин, высвобождаемый тучными клетками или базофилами. Данные соединения хорошо известны в данной области и обычно используются для лечения аллергии. Антигистаминные средства включают, но не ограничиваясь ими, астемизол, азеластин, бетатастин, буклизин, цетиризин, аналоги цетиризина, С8 560, деслоратадин, эбастин, эпинастин, фексофенадин, Н8И 609, левокабастин, лоратидин, мизоластин, норастемизол, терфенадин и траниласт.

Индукторы простагландинов представляют собой соединения, которые индуцируют активность простагландинов. Простагландины функционируют путем регуляции релаксации гладкой мускулатуры.

Индукторы простагландинов включают, но без ограничения, 8-5751.

Лекарственные средства против астмы/аллергии также включают стероиды и иммуномодуляторы. Стероиды включают, но не ограничиваясь ими, беклометазон, флутиказон, триамцинолон, кортикостероиды и булезонил.

- 13 013468

Кортикостероиды включают, но не ограничиваясь ими, беклометазона дипропионат, будезонид, флунисолид, флутиказона пропионат и триамцинолона ацетонид. Хотя дексаметазон является кортикостероидом, обладающим противовоспалительным действием, его не используют на регулярной основе для лечения астмы/аллергии в ингаляционной форме, поскольку он сильно абсорбируется и имеет продолжительные супрессивные побочные эффекты при эффективной дозе. Однако дексаметазон можно использовать в соответствии с настоящим изобретением для лечения астмы/аллергии, поскольку при введении в комбинации с нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения его можно вводить в низкой дозе для уменьшения побочных эффектов. Некоторые побочные эффекты, связанные с кортикостероидами, включают кашель, дисфонию, стоматит (кандидоз), и при более высоких дозах системные эффекты, такие как подавление надпочечников, остеопороз, подавление роста, утончение кожи и легкость возникновения кровоподтеков. Ватег & Ре^тю]·!. 1993, Ат. Кез. Кезрп. Όίδ. 148:81-826; Катаба А.К. е1 а1., 1996, Ат. Е Кезрт Сгй. Саге Меб. 153:1739-48.

Системные кортикостероиды включают, но не ограничиваясь ими, метилпреднизолон, преднизолон и преднизон. Введение кортикостероидов сопровождается обратимыми изменениями метаболизма глюкозы, увеличением аппетита, задержкой жидкости, увеличением веса, изменением настроения, гипертензией, пептической язвой и асептическим некрозом кости. Данные соединения используют для предотвращения в течение короткого времени (3-10 дней) воспалительной реакции при недостаточно контролируемой персистированной астме. Они также функционируют при предотвращении в течение длительного времени симптомов при тяжелой персистированной астме для подавления и контроля, и даже реверсии воспаления. Некоторые побочные эффекты, связанные с продолжительным использованием, включают подавление системы надпочечников, подавление роста, утончение кожи, гипертензию, диабеты, синдром Кушинга, катаракты, мышечную слабость и в редких случаях снижение функции иммунной системы. Рекомендуется использование таких типов соединений в их самых низких эффективных дозах. Сшбе1тез Γογ 6ί;·ΐβηο5ί5 апб танадетегИ ο£ аз1та; ехрей ране1 ΐΌροΡ ΐο; ΝΙΗ РиЫ^саί^οп Νο. 97-4051; би1у 1997.

Иммуномодуляторы включают, но, не ограничиваясь ими, группу, состоящую из противовоспалительных агентов, антагонистов лейкотриенов, мутеинов 1Ь-4, растворимых рецепторов для 1Ь-4, иммунодепрессантов (таких как вызывающая толерантность пептидная вакцина), антител против 1Ь-4, антагонистов 1Ь-4, антител против 1Ь-5, слитых белков растворимый 1Ь-13-рецептор/Рс, антител против 1Ь-9, антагонистов ССК3, антагонистов ССК5, ингибиторов УЪА-4 и супрессоров 1дЕ.

Модификаторы лейкотриенов часто используют для продолжительного контроля и предотвращения симптомов персистированной астмы средней степени тяжести. Модификаторы лейкотриенов функционируют в качестве антагонистов рецепторов лейкотриенов путем избирательной конкуренции за рецепторы для ЬТО-4 и ЬТЕ-4. Данные соединения включают, но не ограничиваясь ими, зафирлукаст и зилеутон в таблетках. Зилеутон в таблетках функционирует в качестве ингибитора 5-липоксигеназы. Прием таких лекарственных средств сопровождается повышением ферментов печени и в некоторых случаях обратимым гепатитом и гипербилирубинемией. Лейкотриены являются биохимическими медиаторами, высвобождаемыми из тучных клеток, инозинофилов и базофилов, которые вызывают сокращение гладкой мускулатуры дыхательных путей и увеличивают проницаемость сосудов, секрецию слизи и активируют клетки воспаления в дыхательных путях больных астмой.

Другие иммуномодуляторы включают нейропептиды, которые, как было показано, обладают иммуномодулирующими свойствами. Функциональные исследования показали, что вещество Р, например, может оказывать влияние на функцию лимфоцитов с помощью опосредуемых специфическими рецепторами механизмов. Вещество Р также, как было показано, модулирует отдельные реакции гиперчувствительности немедленного типа путем стимуляции образования получаемых из арахидоновой кислоты медиаторов в тучных клетках слизистой оболочки. МсСППез Е е1 а1., 1987, Ееб Ргас. 45:196-9. Вещество Р представляет собой нейропептид, впервые идентифицированный в 1931 году. νοη Еи1ег а1'1б Оаббит, Е Р11У8Ю1 (Εοπ6οπ) 72:74-87 (1931). Его аминокислотная последовательность сообщена СНаид е1 а1. (1971) СНаид М.М. е1 а1., 1971, №11иге Νο\ν Вю1 232:86-87. Иммунорегуляторная активность фрагментов вещества Р исследовалась 8|етюг1 Ι.Ζ. е1 а1. (1990) Μο^. Iттипο1. 27:887-890.

Другой класс соединений представляет собой супрессоры 1дЕ. Данные соединения включают пептиды или другие молекулы, обладающие способностью связываться с рецептором для 1дЕ и, таким образом, предотвращать связывание специфического в отношении антигена 1дЕ. Другим типом супрессора 1дЕ является моноклональное антитело, направленное против связывающегося с рецептором для 1дЕ района молекулы 1дЕ человека. Следовательно, одним типом супрессора 1дЕ является антитело против 1дЕ или фрагмент такого антитела. Антитело против 1дЕ разработано СетеШесЬ. Специалист в данной области сможет получить функционально активные фрагменты антитела в виде связывающихся пептидов, которые имеют такие же функции. Другим типом супрессора 1дЕ являются полипептиды, способные блокировать связывание антител против 1дЕ с рецепторами Ес на клеточной поверхности и вытеснять 1дЕ из сайтов связывания, с которыми 1дЕ уже связан.

Одна проблема, связанная с супрессорами 1дЕ, состоит в том, что многие молекулы не обладают способностью связываться с рецептором, соответствующей очень сильному взаимодействию между природной молекулой 1дЕ и ее рецептором. Молекулы, обладающие такой способностью, имеют тенденцию

- 14 013468 связываться необратимо с рецептором. Однако такие вещества относительно токсичны, поскольку они могут связываться ковалентно и блокировать другие структурно схожие молекулы в организме. В этой связи интерес представляет тот факт, что α-цепь рецептора для 1дЕ принадлежит большому семейству генов, в котором содержаться, например, несколько различных рецепторов для Рс 1дС. Указанные рецепторы абсолютно необходимы для защиты организма от, например, бактериальных инфекций. Молекулы, активированные для ковалентного связывания, являются, кроме того, часто относительно нестабильными и, следовательно, они, вероятно, должны вводиться несколько раз в день и в таком случае в относительно высоких концентрациях, для того чтобы сделать возможным полное блокирование непрерывно возобновляемого пула рецепторов для 1дС на тучных клетках и базофильных лейкоцитах.

Кромолин натрия и недокромил используются в качестве лекарственных средств продолжительного действия для предотвращения первичных симптомов астмы, возникающих от физических нагрузок, или аллергических симптомов, возникающих от аллергенов. Полагают, что данные соединения блокируют ранние и поздние реакции на аллергены, мешая функции хлоридных каналов. Они также стабилизируют мембраны тучных клеток и ингибируют активацию и высвобождение медиаторов из инозинофилов и эпителиальных клеток. Для достижения максимальной пользы обычно требуется введение на протяжении четырех-шести недель.

Антихолинергичекие средства обычно используют для ослабления острого бронхоспазма. Полагают, что данные соединения функционируют путем конкурентного ингибирования мускариновых холинергичеких рецепторов. Антихолинергичекие средства включают, но без ограничения, ипратропия бромид. Данные соединения реверсируют только холинергичеки опосредуемый бронхоспазм и не модифицируют какую-либо реакцию на антиген. Побочные эффекты включают сухость во рту и респираторную секрецию, возрастание стерторозного дыхания у некоторых индивидуумов и затуманенное зрение при попадании в глаза.

Для использования ίη νίίΐΌ и ίη νί\Ό 88ΟΡΗ настоящего изобретения обычно используют в эффективном количестве. Используемый в данном описании термин эффективное количество относится, как правило, к любому количеству, достаточному для достижения желаемого биологического эффекта. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффективное количество представляет собой клинически эффективное количество, причем клинически эффективным количеством является любое количество, которое достаточно для лечения субъекта, имеющего заболевание. Используемые в данном описании термины лечить и лечение относятся к уменьшению, устранению или предотвращению по меньшей мере одного признака или симптома заболевания у субъекта, имеющего заболевание или имеющего риск развития заболевания. Используемый в данном описании термин субъект относится к человеку или другому млекопитающему.

В комбинации с представленными в данном описании методиками, путем выбора среди различных активных соединений и учитывая такие факторы, как активность, относительная биодоступность, масса тела пациента, тяжесть неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, можно планировать эффективную профилактическую или терапевтическую схему лечения, которая не вызывает существенной токсичности и все еще является эффективной для лечения конкретного субъекта. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретный вводимый 88ΟΡΗ, размер субъекта или тяжесть заболевания или состояния. Специалист в данной области сможет эмпирически определить эффективное количество конкретного 88ΟΡΗ и/или другого терапевтического агента без необходимости чрезмерного экспериментирования. Обычно предпочтительно использовать максимальную дозу, т. е. наивысшую безопасную дозу согласно некоторым медицинским оценкам. Можно рассматривать множество доз в день для достижения системных уровней соединений. Соответствующие системные уровни можно определить с помощью, например, измерения у больного максимального или устойчивого уровня лекарственного средства в плазме. Термины доза и дозировка используются в данном описании взаимозаменяемо.

Как правило, ежедневные пероральные дозы активных соединений составляют приблизительно от 0,01 до 1000 мг/кг в день. Ожидают, что пероральные дозы, находящиеся в диапазоне 0,5-50 мг/кг, для одного или нескольких введений в день дадут желаемые результаты. Дозы можно регулировать соответствующим образом для достижения желаемых уровней лекарственных средств, местных или системных, в зависимости от способа введения. Например, ожидают, что ежедневная доза при внутривенном введении будет на порядок до нескольких порядков ниже. В том случае, если при таких дозах реакция субъекта является недостаточной, можно использовать даже более высокие дозы (или более высокие эффективные дозы, доставляемые с помощью отличного, более локализованного пути доставки) в такой степени, которую может переносить пациент. Можно рассматривать множество доз в день для достижения соответствующих системных уровней соединений.

Для любого описанного в данном описании соединения терапевтически эффективное количество можно определить на моделях животных. Терапевтически эффективную дозу можно также определить по данным от человека для 88ΟΡΗ, которая была протестирована на людях, и по соединениям, для которых известно, что они проявляют схожую фармакологическую активность, таким как другие родствен

- 15 013468 ные активные агенты. Более высокие дозы могут потребоваться для парентерального введения. Применяемую дозу можно регулировать на основе относительной биодоступности и активности вводимого соединения. Регулирование дозы для достижения максимальной эффективности на основе способов, описанных выше, и других способов, хорошо известных в данной области, находится в компетенции специалиста в данной области.

Для того чтобы повысить доставку 88ОРН в клетки, 88ОРН необязательно можно представить, получить или иным образом объединить с катионным липидом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения таким катионным липидом является ЭОТАК.

Для применения в терапии эффективное количество 88ОРН можно вводить субъекту любым способом, с помощью которого 8§ОРН доставляется на желаемую поверхность. Введение фармацевтической композиции настоящего изобретения можно осуществить с помощью любого способа, известного специалистам в данной области. Предпочтительные способы введения включают, но не ограничиваясь ими, оральный, парентеральный, внутримышечный, интраназальный, подъязычный, внутритрахеальный, ингаляционный, глазной, вагинальный и ректальный.

88ОРН настоящего изобретения можно доставить к конкретной ткани, типу клетки или иммунной системе, или к тому и другому, с помощью вектора. В самом широком смысле вектор представляет собой любой носитель, способный облегчать перенос композиции к клеткам-мишеням. Вектор обычно транспортирует 88ОРН, антитело, антиген и/или специфическое в отношении заболевания лекарственное средство к клеткам-мишеням с уменьшенной деградацией относительно степени деградации, которая происходит в отсутствие вектора.

Как правило, используемые в настоящем изобретении векторы делят на два класса: биологические векторы и химические/физические векторы. Биологические векторы и химические/физические векторы используют для доставки и/или поглощения терапевтических агентов настоящего изобретения.

Используемый в данном описании термин химический/физический вектор относится к природной или синтетической молекуле, отличной от молекул, получаемых из бактериологических или вирусных источников, способной доставлять 88ОРН и/или другое лекарственное средство.

Предпочтительный химический/физический вектор настоящего изобретения представляет собой коллоидную дисперсную систему. Коллоидные дисперсные системы включают системы на основе липидов, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой настоящего изобретения является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные емкости, которые используются в качестве векторов доставки ш νίνο или ш νί!το. Показано, что в большие однослойные везикулы (ЬИУ), размер которых находится в диапазоне 0,24 мкм, можно инкапсулировать большие макромолекулы. РНК, ДНК и интактные вирионы можно инкапсулировать в водное содержимое и доставлять к клеткам в биологически активной форме. Рга1еу е! а1., 1981, Тгепбз Вюсйет. 8сг 6:77.

Липосомы можно нацелить на конкретную ткань путем сочетания липосомы со специфическим лигандом, таким как моноклональное антитело, сахар, гликолипид или белок. Лиганды, которые можно использовать для нацеливания липосомы на клетку иммунной системы, включают, но не ограничиваясь ими, интактные молекулы или их фрагменты, которые взаимодействуют со специфическими в отношении иммунных клеток рецепторами и молекулами, такие как антитела, которые взаимодействуют с маркерами клеточной поверхности клеток иммунной системы. Такие лиганды можно легко идентифицировать с помощью анализов связывания, хорошо известных специалистам в данной области. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липосому можно нацелить на рак путем ее сочетания с одним из иммунотерапевтических антител, обсуждаемых выше. Кроме того, вектор можно подвергнуть сочетанию с нацеленным на ядро пептидом, который будет направлять вектор в ядро клеткихозяина.

Липидные композиции для трансфекции коммерчески доступны от О1АСЕ№ например, как ЕРРЕСТЕЫЕ (нелипосомальный липид со специальным ДНК-конденсирующим усилителем) и 8ИРЕКРЕСТ™ (новая действующая дендримерная техника).

Липосомы коммерчески доступны от С1Ьсо ВКЬ, например, как ЫРОЕЕСТГЫ™ и ЫРОЕЕСТАСЕ™, которые образованы из катионных липидов, таких как Ы-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-Ы,Ы,Ы-триметиламмонийхлорид (ЭОТМА) и диметилдиоктадециламмонийбромид (ЭОАВ). Способы получения липосом хорошо известны в данной области и описаны во многих публикациях. Обзор липосом также представлен Сгедог1аб18 С. (1985) Тгепбз Вю!есйпо1. 3:235-241.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения носитель представляет собой биосовместимую микрочастицу или имплантат, который подходит для имплантации или введения являющемуся млекопитающим реципиенту. Примеры биоразрушаемых имплантатов, которые применимы в соответствии с данным способом, описаны в опубликованной международной заявке \УО 95/24929, озаглавленной Ро1утепс Сепе Ое1гуегу §уз!ет. В XVО 95/24929 описана биосовместимая, предпочтительно биоразрушаемая полимерная матрица для вмещения экзогенного гена под контролем соответствующего промотора. Полимерную матрицу можно использовать для достижения непрерывного высвобождения

- 16 013468 терапевтического агента у субъекта.

Полимерная матрица предпочтительно находится в форме микрочастиц, таких как микросферы (в которых нуклеиновая кислота и/или другой терапевтический агент диспергированы по всей твердой полимерной матрице) или микрокапсулы (в которых нуклеиновая кислота и/или другой терапевтический агент хранятся в ядре, покрытом полимерной оболочкой). Другие формы полимерной матрицы для вмещения терапевтического агента включают пленки, покрытия, гели, имплантаты и стенты. Размер и состав устройства в виде полимерной матрицы выбирают таким образом, чтобы получить в результате благоприятную кинетику высвобождения в ткани, в которую вводят матрицу. Размер полимерной матрицы, кроме того, выбирают в соответствии со способом доставки, который должен применяться, обычно инъекцией в ткань или введением суспензии с помощью аэрозоля в области носа и/или легких. Когда используется аэрозольный путь, полимерную матрицу и нуклеиновую кислоту и/или другой терапевтический агент предпочтительно включать в носитель в виде поверхностно-активного вещества. Композицию полимерной матрицы можно выбрать таким образом, чтобы она имела благоприятную скорость разрушения, а также чтобы образовывался материал, который является биоадгезивным, для дополнительного увеличения эффективности переноса при назначении матрицы на поверхность носа и/или легкого, которая подверглась повреждению. Композицию матрицы также можно выбрать таким образом, чтобы она не разрушалась, а быстро высвобождалась посредством диффузии на протяжении продолжительного периода времени. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту вводят субъекту через имплантат, в то время как другой терапевтический агент вводят в экстренном порядке. Биосовместимые микросферы, которые подходят для доставки, такой как доставка в ротовую полость или слизистые оболочки, раскрыты СЫскегшд е! а1. (1996) Вю!еск. Вюепд. 52:96-101 и Ма11ио\\'Цх е! а1. (1997) №!иге 386:410-414 и в заявке РСТ \УО 97/03702.

Как био-неразрушаемые, так и биоразрушаемые полимерные матрицы можно использовать для доставки субъекту нуклеиновой кислоты и/или другого терапевтического агента. Предпочтительными являются биоразрушаемые матрицы. Такие полимеры могут быть природными или синтетическими полимерами. Полимеры выбирают на основе периода времени, на протяжении которого желательно высвобождение, обычно порядка от нескольких часов до года или дольше. Как правило, наиболее желательным, в частности, для агентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, является высвобождение на протяжении периода времени в пределах от нескольких часов до трех-двенадцати месяцев. Полимер необязательно находится в форме гидрогеля, который может абсорбировать до приблизительно 90% его массы в воде и, кроме того, необязательно поперечно сшит с поливалентными ионами или другими полимерами.

Представляющие особый интерес биоадгезивные полимеры включают биоразрушаемые гидрогели, описанные Н.8. 8атЬпеу, С.Р. Ра!1а1 и РА. НиЬе11 в Масгото1еси1ез, 1993, 26:581-587, рекомендации которых включены в данное описание. Они включают полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глутин, полиангидриды, полиакриловую кислоту, альгинат, хитозан, поли(метилметакрилаты), поли(этилметакрилаты), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат).

Также может быть желательным использование уплотняющих агентов. Уплотняющие агенты также можно использовать отдельно или в комбинации с биологическим или химическим/физическим вектором. Используемый в данном описании термин уплотняющий агент относится к агенту, такому как гистон, который нейтрализует отрицательные заряды на нуклеиновой кислоте и, таким образом, делает возможным уплотнение нуклеиновой кислоты в тонкоизмельченную гранулу. Уплотнение нуклеиновой кислоты облегчает поглощение нуклеиновой кислоты клеткой-мишенью. Уплотняющие агенты можно использовать отдельно, т.е. для доставки нуклеиновой кислоты в форме, которая наиболее эффективно поглощается клеткой, или, более предпочтительно, в комбинации с одним или несколькими из описанных выше векторов.

Другие примеры композиций, которые можно использовать для облегчения поглощения нуклеиновой кислоты, включают фосфат кальция и другие химические медиаторы внутриклеточного транспорта, микроинжекторные композиции, композиции для электропорации и гомологичной рекомбинации (например, для интеграции нуклеиновой кислоты в предварительно выбранное местонахождение в пределах хромосомы клетки-мишени).

Соединения можно вводить отдельно (например, в солевом растворе или буфере) или с использованием любого вектора доставки, известного в данной области. Например, описаны следующие средства доставки: кохлеаты (Сои1б-Родегйе е! а1., 1994, 1996); эмульсомы (Уапсой е! а1., 1998, Бо\уе11 е! а1., 1997); 18СОМ (Мота! е! а1., 1993, Саг1ззоп е! а1., 1991, Ни е! а1., 1998, Могеш е! а1., 1999); липосомы (Сйббегз е! а1., 1999, М1ска1ек е! а1., 1989, 1992, бе Наап 1995а, 1995Ь); живые бактериальные векторы (например, 8а1топе11а, ЕзсНепсЫа со11, бациллы Кальметта-Гирена, 8Ыде11а, Ьас!оЬасй1из) (Нопе е! а1., 1996, Роите1з е! а1., 1998, СкаШе1б е! а1., 1993, 8!оуег е! а1., 1991, №деп! е! а1., 1998), живые вирусные векторы (например, вирус осповакцины, аденовирус, вирус простого герпеса) (СаШсЬап е! а1., 1993, 1995, Мозз е! а1., 1996, №деп! е! а1., 1998, Р1ехпег е! а1., 1988, Моггот е! а1., 1999); микросферы (Сир!а е! а1., 1998, 1опез е!

- 17 013468 а1., 1996, Ма1оу е! а1., 1994, Мооге е! а1., 1995, О'Надап е! а1., 1994, Е1бпбде е! а1., 1989); вакцины на основе нуклеиновых кислот (Еупап е! а1., 1993, КикНп е! а1., 1997, 8акак1 е! а1., 1998, Окаба е! а1., 1997, Ικΐιίί е! а1., 1997), полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан) (НатаДта е! а1., 1998, 1аЬЬа1-6Ш е! а1., 1998); полимерные кольца (ν.νηΙΙ е! а1., 1998); протеосомы (Уапсо!! е! а1., 1998, Ьо^е11 е! а1., 1988, 1996, 1997); натрия фторид (НакЫ е! а1., 1998); трансгенные растения (Таске! е! а1., 1998, Макоп е! а1., 1998, Над е! а1., 1995); виросомы (С1иск е! а1., 1992, Мепд1агб1 е! а1., 1995, ί’ΐΎζ е! а1., 1998) и вирусоподобные частицы (Лапд е! а1., 1999, Ье1Ь1 е! а1., 1998).

Композиции настоящего изобретения вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые могут в заведенном порядке содержать фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов.

Термин фармацевтически приемлемый носитель означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин носитель означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также можно смешивать с компонентами настоящего изобретения и друг с другом таким образом, чтобы не было взаимодействия, которое может существенно ослабить желаемую фармакологическую эффективность.

Для орального введения соединения (т.е. ккОРН и необязательно другие терапевтические агенты) можно легко приготовить в виде лекарственного средства комбинированием активного(ых) компонента(ов) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители дают возможность приготовить соединения настоящего изобретения в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для орального приема субъектом, подвергаемым лечению. Фармацевтические препараты для орального применения можно получить в виде твердых эксципиентов, необязательно измельчая полученную в результате смесь и перерабатывая смесь гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно, с получением ядер таблеток или драже. Подходящими эксципиентами являются, в частности, такие наполнители, как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; такие целлюлозные препараты, как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (РУР). Если желательно, можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Необязательно пероральные композиции можно также приготовить в солевом растворе или буферах, например, ЕИТА, для нейтрализации внутренних кислотных условий, или их можно вводить без каких-либо носителей.

Также специально предусмотрены пероральные дозированные формы вышеуказанного соединения или соединений. Соединение или соединения могут быть химически модифицированы таким образом, чтобы оральная доставка производного была эффективной. Как правило, предусмотренная химическая модификация представляет собой присоединение к самой молекуле соединения по меньшей мере одной составляющей, которая делает возможным (а) ингибирование протеолиза и (Ь) поступление в кровоток из желудка или кишечника. Также желательным является увеличение общей стабильности соединения или соединений и увеличение времени циркуляции в организме. Примеры таких составляющих включают полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин. АЬис1ю\\'кк| апб Οηνίκ. 1981, 8о1иЬ1е Рο1уте^-Еηζуте Аббис!к Ιη: Еηζутек ак Игидк, НосепЬегд апб КоЬейк, ебк., ’№11еу-1п!ег8с1епсе, Ыете Уогк, ΝΥ, рр. 367-383; Ые^тагк е! а1., 1982, I. Арр1. Вюсйет. 4:185-189. Другими полимерами, которые можно использовать, являются поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-триоксолан. Предпочтительными для фармацевтического применения, как указано выше, являются составляющие полиэтиленгликоля.

Для компонента (или производного) местом высвобождения может быть желудок, тонкая кишка (двенадцатиперстная, тощая или подвздошная) или толстая кишка. Специалисты в данной области располагают подходящими рецептурами композиций, которые не растворяются в желудке, но высвобождают материал в двенадцатиперстной кишке или еще в каком-либо другом месте в кишечнике. Предпочтительно, чтобы высвобождение было лишено вредных воздействий желудочной среды или с помощью защиты ккОРН (или производного), или с помощью высвобождения биологически активного материала после желудочной среды, например в кишечнике.

Для гарантии полной устойчивости к желудочной среде существенным является покрытие, непроницаемое по меньшей мере при рН 5,0. Примерами наиболее общих инертных ингредиентов, которые используются в качестве энтеросолюбильных покрытий, являются тримеллитат ацетата целлюлозы (САТ), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, фталат поливинилацетата (РУАР), Еибгадй Ε30Ό, Адиа!ег1с, фталат ацетата целлюлозы (САР), Еибгадй Ь, Еибгадй 8 и 81е11ас. Такие покрытия можно использовать в виде смешанных пленок.

Для таблеток можно также использовать покрытие или смесь покрытий, которые не предназначены

- 18 013468 для защиты против желудочной среды. Такие покрытия включают сахарные покрытия или покрытия, которые облегчают глотание таблетки. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой как желатин) для доставки сухого терапевтического агента, т. е. порошка; для жидких форм можно использовать мягкую желатиновую оболочку. Материалом крахмальных капсул может быть плотный крахмал или другая съедобная бумага. Для пилюль, лепешек, формованных таблеток и таблеток в виде порошков можно использовать методику влажного уплотнения.

Терапевтический агент может быть включен в композицию в виде множества тонкоизмельченных частиц в форме гранул с размером частиц, составляющим приблизительно 1 мм. Композиция материала для введения в капсулы также может быть в виде порошка, слегка прессованных включений или даже в виде таблеток. Терапевтический агент можно приготовить с помощью прессования.

Можно включить красители или корригенты. Например, ккОРН (или производное) можно приготовить в виде лекарственного средства (например, с помощью инкапсуляции в липосомы или микросферы) и затем включить в съедобный продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий красители или корригенты.

Терапевтический агент можно развести или увеличить его объем с помощью инертного материала. Такие разбавители могут включать углеводороды, в частности, маннит, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Можно также использовать в качестве наполнителей некоторые неорганические соли, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторыми коммерчески доступными разбавителями являются Еай-Ио, Етйех, 8ТА-Кх 1500, Етсотргекк и Ау1се11.

В композицию терапевтического агента в твердой дозированной форме можно включить дезинтегрирующие вещества. Материалы, используемые в качестве дезинтегрирующих веществ, включают, но не ограничиваясь ими, крахмал, включая коммерческие дезинтегрирующие вещества на основе крахмала, Ехр1о1аЬ. Можно использовать гликолят натрийкрахмала, АтЬегШе, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, ультраамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновую корку, кислую карбоксиметилцеллюлозу, природный пористый материал и бентонит. Другой формой дезинтегрирующих веществ являются нерастворимые катионообменные смолы. Камеди в виде порошка можно использовать в качестве дезинтегрирующих веществ и в качестве связующих веществ, и они могут включать камеди в виде порошка, такие как агар, камедь карайи или трагакант. В качестве дезинтегрирующих веществ используют также альгиновую кислоту и ее натриевую соль.

Для удерживания вместе терапевтического агента с образованием твердой таблетки можно использовать связующие агенты, и они включают природные продукты, такие как аравийская камедь, трагакант, крахмал и желатин. Другие связующие агенты включают метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу (ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (СМС). Как поливинилпирролидон, так и гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС) можно использовать в спиртовых растворах для грануляции терапевтического агента.

В композицию терапевтического агента можно включить антифрикционный агент для предотвращения прилипания во время процесса приготовления. Лубриканты можно использовать в виде слоя между терапевтическим агентом и стенкой формы, и они включают, но не ограничиваясь ими, стеариновую кислоту, включая ее соли магния и кальция, политетрафторэтилен (РТЕЕ), жидкий парафин, растительные масла и воски. Можно также использовать растворимые лубриканты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, СагЬо^ах 4000 и б000.

Можно добавлять способствующие скольжению вещества (глиданты), которые могут улучшать характеристики текучести лекарственного средства во время приготовления и помочь перегруппировке во время прессования. Способствующие скольжению вещества могут включать крахмал, тальк, пирогенный кремнезем и гидрированный силикоалюминат.

Для помощи растворению терапевтического агента в водной среде можно добавить поверхностноактивное вещество в качестве смачивающего вещества. Поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктилнатрия и сульфонат диоктилнатрия. Можно использовать катионные детергенты, и они могут включать бензальконийхлорид или бензетонийхлорид. Список возможных неионных детергентов, которые могут быть включены в композицию в качестве поверхностно-активных веществ, включает лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрированное касторовое масло 10, 50 и б0, моностеарат глицерина, полисорбат 40, б0, б5 и 80, сложный эфир жирных кислот и сахарозы, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу.

Такие поверхностно-активные вещества могут быть представлены в композиции ккОРН или его производного или отдельно, или в смеси в различных соотношениях.

Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, включают выдерживающие давление капсулы, изготовленные из желатина, в также мягкие герметизированные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Выдерживающие давление капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, таким как крахмалы, и/или лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленг

- 19 013468 ликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Можно также использовать микросферы, полученные для орального введения. Такие микросферы подробно описаны в данной области. Все композиции для орального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения.

Для трансбуккального введения композиции могут принимать форму таблеток или лепешек, приготовленных традиционным способом.

Для введения с помощью ингаляции соединения, используемые в соответствии с настоящим изобретением, можно обычным образом доставить в форме аэрозольного спрея из упаковок, в которых создано повышенное давление, или распылителя с использованием подходящего диспергатора, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под повышенным давлением единицу дозы можно определить с помощью вентиля для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например из желатина, для использования в ингаляторе или инсульффляторе можно получить таким образом, чтобы они содержали смесь в виде порошка соединения и подходящего основания для порошка, такого как лактоза или крахмал.

Также в данном изобретении предусмотрена доставка ββΟΡΗ (или его производных) в легкие. δδΟΡΗ (или производное) доставляется в легкие млекопитающего при вдыхании и перемещается через эпителиальную выстилку легких в кровоток. Другие сообщения о вдыхаемых молекулах включают Аб_)е1 е! а1., 1990, Ρйа^тасеи!^са1 Кезеагсй, 7:565-569; Аб)е1 е! а1., 1990, 1п!ета!юпа1 1оита1 о£ Ρйа^тасеиΐ^сδ, 63:135-144 (лейпролид ацетат); Вгасще! е! а1., 1989, 1оигпа1 о£ Сагбю\'а8си1аг Ρйа^тасо1оду, 13(зирр1. 5):143-146 (эндотелин-1); ИнЬЬагб е! а1., 1989, Аппа1з о£ 1п!егпа1 Мебкте, 111:206-212 (альфа-1антитрипстн); 8тйй е! а1., 1989, I. С1ш. 1пте81. 84:1145-1146 (а-1-протеиназа); ΟδλλΌίπ е! а1., 1990, Аего8о1|/а11оп о£ Ρι^ωε, Ρ^осееб^ηдδ о£ 8утрозшт оп Кезр1га!огу Эгид ЭеК^'егу II, Кеуз!опе, Со1огабо, Магсй (рекомбинантный гормон роста человека); ЭеЬз е! а1., 1988, I. ^тцпок 140:3482-3488 (интерферонгамма и фактор альфа некроза опухоли) и ΡΠ-ιΙζ е! а1., патент США № 5284656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Способ и композиция для доставки в легкие лекарственных средств для системного эффекта описаны в патенте США № 5451569, выданном 19 сентября 1995 на имя Аопд е! а1.

Для использования на практике настоящего изобретения предусмотрен широкий диапазон механических устройств, предназначенных для доставки в легкие терапевтических продуктов, включающих, но не ограничиваясь ими, распылители, ингаляторы отмеренной дозы и порошковые ингаляторы, все из которых известны специалистам в данной области.

Некоторыми конкретными примерами коммерчески доступных устройств, подходящих для осуществления на практике настоящего изобретения, являются распылитель и11га\'еп1. изготовляемый МаШпскгоб!, Шс., 8!. Ьошв, М188оп; распылитель Асогп II, изготовляемый Мащцез! Мебюа1 Ρ^обис!δ, Епд1етеооб, Со1огабо; ингалятор отмеренной дозы Уеп!о1ш, изготовляемый С1ахо Шс., Кезеагск Тпапд1е Багк, Ыопй Сагойпа; и порошковый ингалятор 8ршка1ег, изготовляемый Р18опз Согр., ВебТогб, Маззасйизейв.

Для всех таких устройств требуется использовать композиции, подходящие для диспергирования δδΟΡΗ (или производного). Как правило, такие композиции являются специфическими в отношении типа используемого устройства и могут включать использование соответствующего материала в виде диспергатора в дополнение к обычным разбавителям, адъювантам и/или носителям, применяемым в терапии. Также предусмотрено использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включения или других типов носителей. Химически модифицированные δδΟΡΗ также могут быть приготовлены в различных композициях в зависимости от типа химической модификации или типа используемого устройства.

Композиции, пригодные для использования с распылителем, или струйным, или ультразвуковым, обычно включают δδΟΡΗ (или производное), растворенный в воде в концентрации, составляющей приблизительно от 0,1 до 25 мг биологически активного δδΟΡΗ на мл раствора. Композиция может также включать буфер или простой сахар (например, для стабилизации δδΟΡΗ и регуляции осмотического давления). Композиция для распылителя может также содержать поверхностно-активное вещество для уменьшения или предотвращения индуцированной на поверхности агрегации δδΟΡΗ, вызванной атомизацией раствора при образовании аэрозоля.

Композиции, используемые в устройствах в виде ингалятора отмеренной дозы, включает очень хорошо разделяемый порошок, содержащий δδΟΡΗ (или производное), суспендированный в диспергаторе с помощью поверхностно-активного вещества. Диспергатором может быть любой общепринятый материал, используемый для данной цели, такой как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2тетрафторэтан, или их комбинация. Подходящие поверхностно-активные вещества включают триолеат сорбитана и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества может использоваться олеиновая кислота.

Композиции для рассеивания из устройства в виде порошкового ингалятора содержат очень хорошо разделяемый сухой порошок, содержащий δδΟΡΗ (или производное), и может также включать наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза или маннит, в количествах, которые облегчают рассеивание порошка из устройства, например, 50-90 мас.% композиции. δδΟΡΗ (или производное) наиболее выгодно

- 20 013468 получать в форме частиц со средним размером, составляющим менее 10 мкм (микрон), наиболее предпочтительно 0,5-5 мкм, для самой эффективной доставки в дистальные участки легкий.

Также предусматривается назальная доставка фармацевтической композиции. Назальная доставка делает возможным поступление фармацевтической композиции настоящего изобретения в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос, без необходимости депонирования продукта в легком. Композиции для назальной доставки включают композиции с декстраном или циклодекстраном.

Для назального введения используемым устройством является небольшой твердый флакон, к которому присоединен разбрызгиватель отмеренной дозы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения отмеренная доза доставляется с помощью втягивания фармацевтической композиции раствора настоящего изобретения в камеру точно определенного объема, которая имеет отверстие, которому приданы нужные размеры для распыления аэрозольной композиции путем образования брызг, когда жидкость в камере сжата. Камеру сжимают для введения фармацевтической композиции настоящего изобретения. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения камера представляет собой поршневое устройство. Такие устройства коммерчески доступны.

Альтернативно, используют пластиковый сжимаемый флакон с отверстием, которому приданы нужные размеры для распыления аэрозольной композиции путем образования брызг при сжатии. Отверстие обычно находится наверху флакона, и верх обычно является тонким и удлиненным для того, чтобы частично входить в носовые проходы для эффективного введения аэрозольной композиции. Предпочтительно назальный ингалятор обеспечивает отмеренное количество аэрозольной композиции для введения отмеренной дозы лекарственного средства.

Соединения, когда желательно доставить их системно, можно приготовить для парентерального введения с помощью инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Композиции для инъекции могут быть представлены в единичной дозированной форме, например, в ампулах или в контейнерах с множеством доз, с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать формообразующие агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных компонентов в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных компонентов можно приготовить в виде соответствующих масляных суспензий для инъекции. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекции могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, увеличивающие растворимость соединений, которые дают возможность приготовить растворы с высокой концентрацией.

Альтернативно, активные компоненты могут быть в форме порошка для составления с подходящим носителем, например, стерильной свободной от пирогенов водой, перед применением.

Из соединений можно также приготовить ректальные или вагинальные композиции, такие как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычные основания для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Помимо описанных выше композиций из соединений можно приготовить препараты-депо. Такие композиции продолжительного действия можно приготовить с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменных смол или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде плохо растворимой соли.

Фармацевтические композиции также могут содержать подходящие носители или эксципиенты, твердые или гелевой фазы. Примеры таких носителей или эксципиентов включают, но не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Подходящими жидкими или твердыми формами фармацевтических препаратов являются, например, водные или солевые растворы для ингаляции, микроинкапсулированные, помещенные внутрь кохлеат, нанесенные на микроскопические частицы из золота, содержащиеся в липосомах, распыляемые аэрозоли, гранулы для имплантации в кожу или высушенные на остром предмете, делающем царапины в коже. Фармацевтические композиции также включают гранулы, порошки, таблетки, покрытые таблетки, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с длительным высвобождением активных компонентов, в которых обычно используют, как описано выше, эксципиенты и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как дезинтегрирующие вещества, связующие вещества, агенты для покрытия, агенты, вызывающие набухание, лубриканты, корригенты, подсластители или солюбилизаторы. Фармацевтические композиции подходят для применения в различных системах доставки лекарственного средства. С целью краткого обзора способов доставки лекарственных средств см. публикацию Ьаидег, Басисе 249:1527-1533, 1990, которая включена в данное описание посредством ссылки.

- 21 013468 δδΟΡΗ и необязательно другие терапевтические агенты можно вводить сами по себе (чистыми) или в форме терапевтически приемлемых солей. При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но фармацевтически неприемлемые соли могут быть подходящим образом использованы для получения их приемлемых солей. Такие соли включают, но не ограничиваясь ими, соли, полученные из следующих кислот: хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, паратолуолсульфокислоты, винной, лимонной, метансульфокислоты, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфокислоты и бензолсульфокислоты. Также такие соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочно-земельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция, и карбоксильной группы.

Подходящие буферные агенты включают уксусную кислоту и соль (1-2% мас./об.); лимонную кислоту и соль (1-3% мас./об.); борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас./об.); и фосфорную кислоту и соль (0,8-2% мас./об.). Подходящие консерванты включают бензальконийхлорид (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимеросал (0,004-0,02% мас./об.).

Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат эффективное количество δδΟΡΗ, и необязательно один или несколько дополнительных терапевтических агентов можно включить в фармацевтически приемлемом носителе.

Терапевтический(ие) агент(ы), включающие, в частности, но, не ограничиваясь ими, δδΟΡΗ, могут быть предоставлены в форме частиц. Используемый в данном описании термин частицы означает нано- или микрочастицы (или в некоторых случаях более крупные), которые состоят полностью или частично из δδΟΡΗ или другого терапевтического агента(ов), описанного в данном описании. Частицы могут содержать терапевтический агент(ы) в ядре, окруженном оболочкой, включая энтеросолюбильную оболочку. Терапевтический агент(ы) может быть также диспергирован во всей частице. Терапевтический агент(ы) может быть адсорбирован на частицах. Частицы могут обладать кинетикой высвобождения любого порядка, включая высвобождение нулевого порядка, высвобождение первого порядка, высвобождение второго порядка, замедленное высвобождение, непрерывное высвобождение, немедленное высвобождение или любую их комбинацию, и т.д. Помимо терапевтического агента(ов) частицы могут включать любой из материалов, которые обычно используются в области фармации и медицине, включая разрушаемый, неразрушаемый, биоразрушаемый или био-неразрушаемый материал или их комбинации. Частицы могут быть в форме микрокапсул, которые содержат 88ΟΡΗ в растворе или в полурастворенном состоянии. Частицы могут быть фактически любой формы.

При получении частиц для доставки терапевтического агента(ов) можно использовать как бионеразрушаемый, так и биоразрушаемый полимерный материал. Такие полимеры могут быть природными или синтетическими полимерами. Полимер выбирают на основе периода времени, на протяжении которого желательно высвобождение. Представляющие особый интерес биоадгезивные полимеры включают биоразрушаемые гидрогели, описанные Η.8. 8атейпеу, Ο.Ρ. Ρ;·ι11ι;·ι1< апб ТА. ИнЬсИ ίη Масгото1еси1е8, 1993, 26:581-587, рекомендации которых включены в данное описание. Они включают полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глутин, полиангидриды, полиакриловую кислоту, альгинат, хитозан, поли(метилметакрилаты), поли(этилметакрилаты), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат).

Терапевтический агент(ы) может содержаться в системах контролируемого высвобождения. Термин контролируемое высвобождение, как подразумевается, относится к любой содержащей лекарственное средство композиции, в которой контролируется способ и профиль высвобождения лекарственного средства. Это относится к композициям как немедленного, так и не немедленного высвобождения, при этом композиции не немедленного высвобождения включают, но не ограничиваясь ими, композиции непрерывного высвобождения и замедленного высвобождения. Используемый в его обычном значении термин непрерывное высвобождение (на который также приводится ссылка как на длительное высвобождение) относится к композиции лекарственного средства, которая обеспечивает постепенное высвобождение лекарственного средства на протяжении длительного периода времени и которая предпочтительно, хотя и необязательно, приводит, по существу, к постоянным уровням лекарственного средства в крови на протяжении длительного периода времени. Используемый в его обычном значении термин замедленное высвобождение относится к композиции лекарственного средства, для которой существует задержка во времени между введением композиции и высвобождением из нее лекарственного средства. Замедленное высвобождение может включать или не включать постепенное высвобождение лекарственного средства на протяжении длительного периода времени и, следовательно, может быть или не быть непрерывным высвобождением.

Для лечения хронических состояний может, в частности, подходить использование имплантата с длительным непрерывным высвобождением. Используемый в данном описании термин длительное высвобождение означает, что имплантат создан и аранжирован для доставки терапевтических уровней активного ингредиента на протяжении по меньшей мере 7 дней и предпочтительно 30-60 дней. Имплантаты с длительным непрерывным высвобождением хорошо известны специалистам в данной области и включают некоторые из систем высвобождения, описанных выше.

- 22 013468

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание любой приведенной в данном описании ссылки (включая литературных ссылки, выданные патенты, опубликованные заявки на патент и находящиеся в процессе одновременного рассмотрения заявки) специально включено, таким образом, посредством ссылки во всей их полноте.

Примеры

Пример 1. Независимое от ТБВ7 распознавание одноцепочечной РНК с фосфодиэфирным остовом.

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из мышей дикого типа и ТБВ7-/-, переносили в подходящую для роста среду и затем разносили аликвоты отдельно в индивидуальные лунки многолуночных культуральных планшетов. В индивидуальные лунки с клетками добавляли следующие агенты: ΚΝΑ63 ΡΌ, одноцепочечный ОРН, имеющий нуклеотидную последовательность, предоставленную как 5'-САССиСиСиСАи-3' (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:1), в которой все межнуклеотидные связи являются фосфодиэфирными, за исключением фосфоротиоатной связи между А и и на 3'-конце ОРН; КУА63 РТО, одноцепочечный ОРН, имеющий такую же нуклеотидную последовательность, как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:1, в которой все межнуклеотидные связи являются фосфодиэфирными; СрС-ΟΌΝ 1668, олигодезоксинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, предоставленную как 5'-ТССАТСАССТТССТСАТССТ-3' (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2); только ^ΟΤΑВ; В-848; ВNΑ63 РТО плюс ^ΟΤΑВ; ВNΑ63 ΡΌ плюс ^ΟΤΑВ; и только среду. Клетки выдерживали в культуре в течение 24 часов, затем супернатанты из индивидуальных лунок собирали и анализировали, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), специфический в отношении ГЕ-12р40. Результаты продемонстрированы на фиг. 2. Данные представлены как среднее арифметическое±8ЕМ.

Как показано на фиг. 2, как ВNΑ63 ΡΌ, так ВNΑ63 РТО, при добавлении с ^ΟΤΑВ, индуцировали ГО-12р40 в клетках дикого типа. В противоположность, однако, ВNΑ63 ΡΌ, но не ВNΑ63 РТО, при добавлении с ^ΟΤΑВ, индуцировал ГЕ-12р4 0 в клетках ТЬВ7-/-. Полученный последний из указанных результатов поддерживает предположение о том, что одноцепочечный ОРН с фосфодиэфирным, но не с фосфоротиоатным, остовом индуцирует активацию иммунной системы независимым от ТЬВ7 образом.

Пример 2. ВNΑ63 ΡΌ индуцирует ГЕ-12р40 зависимым от дозы образом, а также индуцирует ΙΌ-6 и ΙΕΝ-α в ЕВЬ3-Ь-индуцированных дендритных клетках от мышей ТЬВ7-/-.

ЕЬВ3-Ь-индуцированные дендритные клетки получали от мышей дикого типа и ТЬВ7-/- и культивировали в присутствии различных количеств ВNΑ63 ΡΌ или ВNΑ63 РТО, каждый с ^ΟΤΑВ. После инкубации в течение 24 ч супернатанты собирали и анализировали с помощью Еи8А, специфического в отношении 1Ь-12р40, ΙΌ-6 и ΙΕΝ-α. В качестве контролей использовали ΌΡ8, В-848, СрС-ΟΌΝ 1668, СрС-ΟΌΝ 2216 (5'-СССССАССАТССТСССССС-3', 8ЕО ΙΌ ΝΟ:3), только 1ЮТАВ и только среду. Результаты продемонстрированы на фиг. 3. Данные представлены как среднее арифметическое ± 8ЕМ.

Как показано на фигуре, как ВNΑ63 ΡΌ, так ВNΑ63 РТО, каждый в присутствии ^ΟΤΑВ, индуцировал значительные количества ГО-12р40 (фиг. 3А), ΙΌ-6 (фиг. 3В) и ΙΕΝ-ос (фиг. 3С) в дендритных клетках дикого типа. В противоположность, однако, ВNΑ63 ΡΌ, но не ВNΑ63 РТО, при добавлении с ΌΟТАВ, индуцировал ГЕ-12р40 и, хотя менее сильно, как ΙΌ-6, так и ΙΕΝ-α в дендритных клетках ТЬВ7-/-. Количество ГЕ-12р40, индуцированное в дендритных клетках ТЬВ7-/- с помощью ВNΑ63 ΡΌ, менялось пропорционально концентрации ВNΑ63 ΡΌ.

Пример 3. ВNΑ63 ΡΌ, но не ВNΑ63 РТО, индуцирует ΕΌ69 на ЕЬВ3-Ь-индуцированных дендритных клетках от мышей ТЬВ7-/-.

ЕВЕ3-Ь-индуцированные дендритные клетки получали от мышей дикого типа и ТЬВ7-/- и культивировали в течение 24 часов в присутствии ВNΑ63 ΡΌ или ВNΑ63 РТО, каждый с ^ΟΤΑВ, как в примере 2. После инкубации в течение 24 ч клетки собирали и анализировали с помощью ЕАС8 на наличие Ε'Ό69. Результаты продемонстрированы на фиг. 4.

Как показано на фиг. 4, как ВNΑ63 ΡΌ, так ВNΑ63 РТО, каждый в присутствии ^ΟΤΑВ, индуцировал значительные количества ΕΌ69 на дендритных клетках дикого типа (две левые панели). В противоположность, однако, ВNΑ63 ΡΌ, но не ВNΑ63 РТО, при добавлении с ^ΟΤΑВ, индуцировал ΕΌ69 на дендритных клетках ТЬВ7-/- (две правые панели).

Пример 4. ВЫА63 ΡΌ, но не ВЫА63 РТО, индуцирует ГО-12р40 в М-С8Е-происходящих макрофагах и СМ-С8Е-происходящих дендритных клетках от мышей ТЬВ7-/-.

М-С8Е-происходящие макрофаги и СМ-С8Е-происходящие дендритные клетки получали от мышей дикого типа и ТЬВ7-/- и культивировали в течение 24 часов в присутствии ВNΑ63 ΡΌ плюс ^ΟΤΑВ; ВNΑ63 РТО плюс ^ΟΤΑВ; ΌΡ8; В-848; СрС-ΟΌΝ 1668; СрС-ΟΌΝ 2216; только ^ΟΤΑВ и только среды. Супернатанты культур затем собирали и анализировали с помощью ЕБ18А, специфического в отношении ГЕ-12р40. Результаты продемонстрированы на фиг. 5.

Данные представлены как среднее арифметическое ± 8ЕМ.

Как показано на фиг. 5, как ВNΑ63 ΡΌ, так ВNΑ63 РТО, каждый в присутствии ^ΟΤΑВ, индуцировал значительные количества ГЕ-12р40 как в М-С8Е-происходящих макрофагах, так и в СМ-С8Епроисходящих дендритных клетках от мышей дикого типа. В противоположность, однако, ВNΑ63 ΡΌ, но

- 23 013468 не ΚΝΑ63 РТО, при добавлении с ΌΘΤΑΚ, индуцировал значительные количества 1Ь-12р40 в ТЬК7-/- МС8Е-происходящих макрофагах и ТЬК7-/- СМ-С8Р-происходящих дендритных клетках.

Пример 5. Независимое от ТЬК7 распознавание одноцепочечной РНК с фосфодиэфирным остовом является МуО88-зависимым.

ЕЬК3-Ь-индуцированные дендритные клетки получали отдельно от мышей дикого типа, ТЬК7-/- и МуЬ88-/- и культивировали в течение 24 ч в присутствии Κ.ΝΑ63 ΡΌ или ΚΝΑ63 РТО, каждый с ΌΘΤΑΚ, как в примере 2. После инкубации в течение 24 часов клетки собирали и анализировали с помощью ЕЫ8А, специфического в отношении 1Ь-12р40, и ЕАС8 на наличие СЭ69. Результаты продемонстрированы на фиг. 6.

Как показано на фиг. 6, индукция 1Ь-12р40 и СЭ69 отсутствовала в дендритных клетках МуЭ88-/- и в случае ΚΝΑ63 ΡΌ, и случае ΚΝΑ63 РТО одинаково.

Пример 6. ТЬК7-независимая стимуляция иммунной системы с помощью ккРНК зависит от ТЬК9 и ТЬК8.

Поскольку ТЬК7-независимая стимуляция иммунной системы с помощью ккРНК зависит от МуЭ88 и эндосомального созревания, была построена гипотеза, что вовлечены другие внутриклеточные ТЕК.. ТЬК3 кажется слабым кандидатом на распознавание ккРНК, поскольку он по большей части полагается на адаптерную молекулу ТК1Е, а не на МуЬ88 (НоеЬе, Эи с1 а1. 2003). Тем не менее, чтобы исключить ТЬК.3 в качестве рецептора для ккРНК, скрещивали ТЬК3- и ТЬК7-дефицитных мышей с получением вдвойне ТЬК3/ТЬК7 дефицитных мышей, и клетки иммунной системы от таких мышей тестировали на стимуляцию с помощью ккРНК. Результаты таких экспериментов показали, что КNΑ63-стимулированная продукция 1Ь-12р40 и индукция СЭ69 в вдвойне ТЬК3/ТЬК7 дефицитных ЕЬТ3-Ь-индуцированных дендритных клетках все еще были функциональными, что говорит о том, что ТЬК3 не вовлечен в распознавание ккРНК ТЬК7-независимым образом. Также получали вдвойне ТЬК7/ТЬК9 дефицитных мышей для исследования вовлечения ТЬК9 в распознавание КNΑ63. Вызывает интерес, что вдвойне ТЬК7/ТЬК9 дефицитные СМ-С8Е-происходящие дендритные клетки и отсортированные зрелые дендритные клетки не продуцировали 1Ь-12р40, и в них не происходила индукция СЭ69. что говорит о том, что ТЬК9 вовлечен в распознавание ккРНК ТЬК7-независимым образом. В общем, полученные данные говорят о том, что ТЬК9 перекрестно реагирует с ккРНК и опосредует стимуляцию иммунной системы с помощью 55РНК.

Пример 7. Роль ТЬК9 в распознавании одноцепочечной РНК с фосфодиэфирным остовом.

Для дальнейшего исследования роли ТЬК9 в распознавании ккРНК с фосфодиэфирным остовом синтезировали различные РНК-последовательности, такие как КNΑ41 (5'-СССССΑСΑСΑΑСΑСΑСΑ СΑС-3', 8ЕЕ) Ш N0:4) и ΒΝΑ42 (5'^^Αυ№ΑυυΑυΑυΑΑ№^3', 8ЕЕ) ГО ΝΟ;5), которые были ранее описаны в качестве неактивных в клетках крысы при синтезе с фосфоротиоатным остовом (Ней, Нетт1 е1 а1. 2004). При сравнении стимулирующей способности ОРН с фосфоротиоатным (РТО) или фосфодиэфирным (РО) остовом наблюдали, что КNΑ41 РО и КNΑ42 РО стимулируют 1Ь-12р40, 1Ь-6 и ΙΕΝ-α ТЬК7-независимым образом в клетках крысы и ТБЕ-α (но не ΙΕΝ-α) в РВМС человека, в то время как соответствующие РТО-модифицированные ОРН были неактивными. Вызывает интерес, что когда зрелые дендритные клетки дикого типа, дефицитные в отношении ТЬК7 или дефицитные в отношении ТЬК9, стимулировали КNΑ41 РО и КNΑ42 РО, ТЬК9-дефицитные клетки не продуцировали 1Ь-12р40, что говорит о том, что ТЬК9, но не ТЬК7, вовлечен в распознавание Не-С/Ь-богатых молекул 8&РНК. Напротив, Сυ-богатая КNΑ40 (5'-СССССЬСЬСЬ^СЬСЬСΑСЬС-3'; 8Е0 ΙΌ N0:6) индуцировала некоторое количество 1Ь-12р40 в клетках, дефицитных только в отношении ТЬК7, и в клетках, дефицитных только в отношении ТЬК9, что говорит о том, что ТЬК7 или ТЬК9 может функционировать в качестве рецептора для 8&РНК. Незрелые дендритные клетки распознавали СЬ-богатую РНК ТЬК7-зависимым образом, но удивительно Не-Сυ-богатые КNΑ41 и КNΑ42 также распознавались клетками дикого типа, хотя клетки, дефицитные только в отношении ТЬК7, и клетки, дефицитные только в отношении ТЬК9, не отвечали, что говорит о том, комплексы ТЬК7/ТЬК9 вовлечены в распознавание Не-ОЬ-богатых РНК.

Пример 8. Роль ТЬК8 в распознавании одноцепочечной РНК с фосфодиэфирным остовом.

Используя короткие интерферирующие РНК, специфические в отношении тТЬК8, было продемонстрировано, что ТЬК8 вовлечен в распознавание 8&РНК. ЕЬК3-Ь-индуцированные дендритные клетки дикого типа обрабатывали ТЬК8-специфической короткой интерферирующей РНК или контрольной короткой интерферирующей РНК против еСЕР и стимулировали СрС-ΟΌΝ, ΡΝΑ40 РО, ΡΝΑ41 РО и КNΑ42 РО. Клетки, обработанные тТЬК8-специфической короткой интерферирующей РНК, демонстрировали снижение секреции 1Ь-12 на 75% или 50% при стимуляции КNΑ41 и КNΑ42, соответственно. На стимуляцию КNΑ40 не влияла ТЬК-8-специфическая короткая интерференционная РНК, поскольку стимуляция иммунной системы с помощью КNΑ40 критическим образом зависит от тТЬК7. Контрольная еСЕР-специфическая короткая интерференционная РНК не оказывала ингибирующего эффекта на продукцию 1Ь-12, и величины 1Ь-12 соответствовали величинам при стимуляции клеток, не трансфицированных короткой интерферирующей РНК. Для дальнейшей оценки вовлечения ТЬК8 в ТЬК7независимую стимуляцию иммунной системы с помощью 8&РНК ТЬК7-дефицитные ЕЬК-Ь-индуцированные дендритные клетки транфицировали с использованием тТЬК8- или еСЕР-специфической корот

- 24 013468 кой интерферирующей РНК, и определяли продукцию 1Ь-12р40, индуцированную ΚΝΆ63. Дендритные клетки, обработанные тТЬК8-специфической короткой интерферирующей РНК, демонстрировали сильное снижение продукции 1Ь-12р40 и уменьшение маркеров активации, таких как СЭ40. в то время как еСЕР-специфическая короткая интерференционная РНК не имела эффекта. Снижение активации с помощью ΡΝΆ63 иммунной системы коррелировало с супрессией РНК для тТЬК8 под действием короткой интерферирующей РНК. Вместе взятые полученные данные демонстрируют, что ТЬК.8 вовлечен в распознавание 8§РНК.

Пример 9. Гетеродимеры ТЬК.8/ТЬК9 опосредуют распознавание одноцепочечной РНК.

Поскольку ТЬК.8 и ТЬК.9 вовлечены в распознавание 8&РНК, исследовали, кооперируют ли оба рецептора и могут ли образовывать комплексы, опосредующие распознавание 8§РНК. С помощью трансфекции меченых ТБЕ в клетки НЕК293 с последующей иммунопреципитацией и вестерн-блоттингом показали, что ТБЕ8-Пад связывается с тТЬЮ-НЛ и наоборот, в то время как внутриклеточные ТБЕ3 и ТЬК9 не взаимодействуют.

Эквиваленты

Считается, что предшествующее описание является достаточным для того, чтобы специалист в данной области смог осуществить на практике настоящее изобретение. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенными примерами, поскольку примеры предназначены только для иллюстрации одного из аспектов изобретения, и другие функционально эквивалентные варианты осуществления настоящего изобретения входят в пределы объема настоящего изобретения. Различные модификации настоящего изобретения помимо тех, которые продемонстрированы и описаны в данном описании, будут очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания и входят в пределы объема прилагаемой формулы изобретения. Преимущества и объекты настоящего изобретения необязательно охватываются каждым вариантом осуществления настоящего изобретения.

<110> <120>	Список последовательностей Со1еу РЬагтасеиМса! СтЪН ИММУНОСТИМУДИРУЩАЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНАЯ РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА С ФОСФОДИЭФИРНЫМ ОСТОВОМ
<130>	01041.70052
<150>	НВ 60/718,087
<151>	2005-09-16
<160>	6
<170>	РаЕепЫп νβτδίοη 3.2
<210>	1
<211>	12
<212>	РНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	олигонуклеотид
<400>	1
саддисидид -ан		12
<210>	2
<211>	20
<212?	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	олигонуклеотид

<4О0> 2

ЬссаЪдасдЪ ЪссЪдаЪдс!: 20

<210>	3
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Синтетический олигонуклеотид
<400>	3
дддддасдай сдссддддд	19

<210>	4
<211>	20
<212>	РНК
<213>	Искусственная последовательность

- 25 013468 <220>

<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 4 дсссдасада адададасас <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

РНК

Искусственная последовательность

Синтетический олигонуклеотид <4 00>

400> 5 асссаисиаи иаиаиаасис <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

РНК

Искусственная последовательность

Синтетический олигонуклеотид <400> 6 дсссдцсидц. идидидасис

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ индуцирования у субъекта иммунного ответа ТЫ-подобного типа, включающий введение субъекту эффективного количества иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (ккОРН) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х₄Х₂ССХ₃Х₄, где Χι, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий 8§ОРН не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).
2. 2. Способ индуцирования у субъекта иммунного ответа 1Ъ1-подобного типа по п.1, подходящий для индуцирования у субъекта специфического в отношении антигена иммунного ответа, дополнительно включающий введение субъекту антигена.
3. 3. Фармацевтическая композиция для индуцирования у субъекта иммунного ответа 1Ъ1-подобного типа или лечения субъекта, имеющего рак, инфекционное заболевание, аллергическое состояние или астму, содержащая эффективное количество иммуностимулирующего одноцепочечного олигорибонуклеотида (ззОРН) размером 5-100 нуклеотидов, который имеет фосфодиэфирный остов и включает нуклеотидную последовательность, которая (1) не включает гуанозин (С) или (2) включает по меньшей мере один С при условии, что, когда нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один С, нуклеотидная последовательность (a) не включает уридин (И) и (b) не включает СрС-мотив Х₄Х₂ССХ₃Х₄, где Х₄, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды и СС представляет собой динуклеотид цитозин (С)-гуанин (С), где С в СС динуклеотиде является неметилированным, при условии, что иммуностимулирующий 88ОРН не присутствует в виде части двухцепочечной молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК).
4. 4. Фармацевтическая композиция для индуцирования у субъекта иммунного ответа 1Ъ1-подобного типа по п.3, подходящая для индуцирования у субъекта специфического в отношении антигена иммунного ответа, дополнительно содержащая антиген.
5. 5. Способ по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.3 или 4, в которых размер иммуностимулирующего 88ОРН составляет 5-40 нуклеотидов.
6. 6. Способ по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.3 или 4, в которых размер иммуно

   - 26 013468 стимулирующего ззОРН составляет 5-20 нуклеотидов.
7. 7. Способ по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.3 или 4, в которых размер иммуностимулирующего ззОРН составляет 5-12 нуклеотидов.
8. 8. Способ по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.3 или 4, в которых иммуностимулирующий ззОРН представляет собой синтетический ззОРН.
9. 9. Способ по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.3 или 4, в которых иммуностимулирующий ззОРН не является полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из поли-ϋ, поли-С, поли-А и поли-С.
10. 10. Способ по п.1 или 2, в котором введение субъекту эффективного количества иммуностимулирующего ззОРН представляет собой системное введение субъекту эффективного количества иммуностимулирующего ззОРН.
11. 11. Фармацевтическая композиция по п.3 или 4, приготовленная для системного введения субъекту.

    Липопротеины (бактерии)

    Т1_К- лиганды

    ЬРЗ (бактерии)

    Флагеллин (бактерии)

    Гемагглютинин (корь)