EA008741B1 - Аналоги олигонуклеотидов с-класса с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью - Google Patents

Аналоги олигонуклеотидов с-класса с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью Download PDF

Info

Publication number
EA008741B1
EA008741B1 EA200600865A EA200600865A EA008741B1 EA 008741 B1 EA008741 B1 EA 008741B1 EA 200600865 A EA200600865 A EA 200600865A EA 200600865 A EA200600865 A EA 200600865A EA 008741 B1 EA008741 B1 EA 008741B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
nucleic acid
substituted
immunostimulatory nucleic
immunostimulatory
Prior art date
Application number
EA200600865A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600865A1 (ru
Inventor
Ойген Ульманн
Йорг Фолльмер
Артур М. Криг
Бернхард О. Нолль
Original Assignee
Коли Фармасьютикал Гмбх
Коли Фармасьютикал Груп, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Коли Фармасьютикал Гмбх, Коли Фармасьютикал Груп, Инк. filed Critical Коли Фармасьютикал Гмбх
Publication of EA200600865A1 publication Critical patent/EA200600865A1/ru
Publication of EA008741B1 publication Critical patent/EA008741B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/056—Immunostimulating oligonucleotides, e.g. CpG
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Изобретение относится к классу иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов, содержащих иммуностимулирующий CpG-мотив и второй мотив, способный формировать вторичную структуру, включая дуплекс и структуры более высокого порядка in vitro и in vivo. Олигонуклеотиды по изобретению полезны как адъюванты при вакцинации. Олигонуклеотиды полезны также для индукции иммунного ответа, индукции экспрессии интерферона I типа (IFN), индукции экспрессии интерферона гамма (IFN-γ) и для лечения ряда состояний, включая аллергию, астму, инфекцию и рак.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение, в основном, относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, композициям на их основе и способам применения иммуностимулирующих нуклеиновых кислот.
Предпосылки изобретения
Бактериальная ДНК, в отличие от ДНК позвоночных, оказывает иммуностимулирующий эффект для активации В-клеток и природных клеток-киллеров. Токипада Т. е! а1. (1988) брп I Сапсег Кез 79:6826; Токипада Т. е! а1. (1984) ЖС1 72:955-62; Меззта ТР. е! а1. (1991) I 1ттипо1 147:1759-64; и обзоры в Кпед, 1998, 1п: АррНеб О11допис1ео!1бе ТесБпо1оду, С.А. 8!ет апб А.М. Кпед, (Ебз.), боЬп ^Неу апб 8опз, 1пс., №\ν Уогк, ΝΥ, рр. 431-448 и Кпед АМ (2002) Аппи Кеу 1ттипо1 20:709-60. В настоящее время понятно, что такие иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК являются результатом присутствия неметилированных СрО-динуклеотидов в окружении конкретных оснований (СрО-мотивов), обычных в бактериальных ДНК, но метилированных и редко присутствующих в ДНК позвоночных. Кпед А.М. е! а1. (1995) №Шге 374:546-9; Кпед А.М. (1999) БюсЫт ВюрБуз Ас!а 1489:107-16.
Иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК можно мимикрировать синтетическими олигодезоксинуклеотидами (ΟΌΝ), содержащими эти СрО-мотивы. Такие СрО-ΟΌΝ оказывают сильные иммуностимулирующие эффекты на мышиные и человеческие лейкоциты, включая пролиферацию Вклеток; секрецию цитокинов и иммуноглобулинов; цитолитическую активность натуральных клетоккиллеров (ΝΕ) и секрецию интерферона гамма (ΙΤΝ-γ); и активацию дендритных клеток (ИС) и других антиген-презентирующих клеток для экспрессии костимулирующих молекул и секреции цитокинов, особенно цитокинов ТБ1-типа, важных для стимуляции Т-клеточных ответов ТБ1-типа. Данные иммуностимулирующие эффекты природного фосфодиэфирного остова СрО-ΟΌΝ высоко специфичны для СрО, так как данные эффекты значительно уменьшаются, если СрО-мотив метилирован, заменен на ОрС, или другим образом удален или изменен. Кпед А.М. е! а1. (1995) №Шге 374:546-9; Наг!тапп О. е! а1. (1999) Ргос №!1. Асаб 8οΐ И8А 96:9305-10.
В ранних исследованиях считали, что иммуностимулирующий СрО-мотив следует формуле пуринпурин-СрО-пиримидин-пиримидин. Кпед А.М. е! а1. (1995) №1иге 374:546-9; Р1зе!зку И.8. (1996) I 1ттипо1 156:421-3; Наскег Н. е! а1.(1998) ЕМВО I 17:6230-40; Ыркогб О.В. е! а1. (1998) Тгепбз М1сгоБю1 6:496-500. Однако в настоящее время понятно, что мышиные лимфоциты достаточно хорошо отвечают на фосфодиэфирные СрО-мотивы, не следующие данной «формуле» (Υί А.К. е! а1. (1998) I 1ттипо1 160:5898-906), и то же самое справедливо для В-клеток и дендритных клеток человека (Наг!тапп О. е! а1. (1999) Ргос №!1 Асаб 8с1 И8А 96:9305-10; Ыапд Н. е! а1. (1996) I СБп 1пуез! 98:1119-29).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение частично относится к иммуностимулирующим СрО-содержащим олигонуклеотидам и олигонуклеотидным аналогам, обладающим вторичной структурой с инвертированным повтором на 3'-конце молекулы или около него. Вторичная структура вовлекает формирование дуплекса или структур высшего порядка в определенных условиях. Как важное свойство олигонуклеотидов и олигонуклеотидных аналогов по изобретению инвертированный повтор не является строгим УотсонКриковским палиндромом, но предпочтительнее прерван промежуточной последовательностью или аналогами нуклеотидов. Как второе свойство олигонуклеотидов и олигонуклеотидных аналогов по изобретению остов можно модифицировать для включения в состав в стратегических местах межнуклеотидные связи, устойчивые к нуклеазе или чувствительные к нуклеазе, таким образом благоприятствуя активности и уменьшая потенциальную токсичность. Дополнительно обнаружено, что данные олигонуклеотиды и олигонуклеотидные аналоги проявляют иммуностимулирующую активность и А-класса, и В-класса и, следовательно, их классифицируют как новые иммуностимулирующие молекулы нуклеиновых кислот Скласса.
Изобретение частично основано на открытии авторами настоящего изобретения, что СрОсодержащие иммуностимулирующие олигонуклеотиды и олигонуклеотидные аналоги, содержащие несовершенный палиндром на 3'-конце молекулы или около него, обладают определенными преимуществами, исходя из их получения и их биологической активности. Конкретно, олигонуклеотиды и олигонуклеотидные аналоги С-класса по настоящему изобретению обычно являются мономерными в растворе. Считают, что данные одинаковые молекулы могут формировать 1п У1!го структуры внутримолекулярного дуплекса, предоставляя им стабильность против нуклеазного расщепления. Считают также, что те же самые нуклеиновые кислоты могут формировать внутримолекулярный дуплекс и, возможно, даже структуры более высокого порядка в окружении внутриэндосомальной среды, где, как полагают, они проявляют свою биологическую активность.
В одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей иммуностимулирующую молекулу нуклеиновой кислоты формулы I
Ζι [ (ΧιΥιΚι) Ν (Χ2Υ2Κ2) к^г] р (31) 4Ν' (Νη) . . . (Ν2) (Νι)32(Νχ#) (Ν2#) . . . (Νη#) Ζ3 где каждый из Ζχ, Ζ2 и Ζ3 независимо представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 12 нуклеотидов, необязательно включающую ненуклеотидный линкер или абазический б-спейсер; каждый из Χχ и Х2 независимо представляет собой нуклеотид, включающий в себя тимин, урацил, аденин или 5замещенный урацил; каждый из Υ1 и Υ2 независимо представляет собой цитозин (С) или модифициро
- 1 008741 ванный цитозин; каждый из Κι и К2 независимо представляет собой гуанин (С) или модифицированный гуанин; каждый из N и Ν' независимо представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 12 нуклеотидов, необязательно содержащую ненуклеотидный линкер или абазический 0-спейсер; 81 представляет собой ненуклеотидный линкер, абазический линкер (0-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля, необязательно предусматривающие 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'межнуклеозидные связи; 82 представляет собой любую непалиндромную последовательность длиной от 1 до 10 нуклеотидов или ненуклеотидный линкер, абазический линкер (0-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля; каждый из Ν1, Ν2, ... Νη и Ν1#, Ν2# ... Νη# представляет собой любой нуклеотид или модифицированный нуклеотид, где спариваются основания Ν1 с Νι#, спариваются основания Ν2 с Ν2# и спариваются основания Νη с Νη#; к представляет собой целое число от 0 до 5; η представляет собой целое число от 2 до 16; р представляет собой целое число от 1 до 6; и с.| представляет собой целое число от 0 до 10, и где, когда (Νη)...(Ν2)(Νι)82(Νι#)(Ν2#)...(Νη#) обладает длиной от 10 до 42 нуклеотидов, 82 обладает длиной от 4 до 10 нуклеотидов, 82 включает в себя ненуклеотидный линкер, абазический линкер (0-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля, и/или (Νη)...(Ν2)(Ν1)82(Ν1#)(Ν2#)...(Νη#) обладает содержанием СС менее чем 2/3.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ... Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη# выбирают из С, С или их модификаций, где спариваются основания С с С.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ... Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη# выбирают из Т, А или их модификаций, и спариваются основания Т с А.
В данном и других вариантах осуществления каждый из С, С, А или Т может относиться к дезоксинуклеотидам с соответствующими основаниями цитозином, гуанином, аденином и тимином.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ... Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη# выбирают из С, Т, А, С или их модификаций, и спариваются основания С с С, спариваются основания Т с С, спариваются основания А с Т и спариваются основания А с С.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, .... Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη# выбирают из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, формирующих Уотсон-Криковские пары оснований, т.е. каждая пара оснований Ν1-Ν1#, Ν2-Ν2#, ... Νη-Νη# представляет собой Уотсон-Криковскую пару оснований.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один из каждого из Ν1, Ν2, ... Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη# выбирают из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, формирующих не УотсонКриковские пары оснований, т.е. по меньшей мере одна пара оснований Ν1-Ν1#, Ν2-Ν2#, ... Νη-Νη# представляет собой не Уотсон-Криковскую пару оснований.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит частично стабилизированный остов по меньшей мере с одной фосфодиэфирной связью.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующие молекулы нуклеиновых кислот содержат остов по меньшей мере с одной стабилизированной межнуклеотидной связью.
В одном варианте осуществления все межнуклеотидные связи олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит частично стабилизированный остов с фосфодиэфирной связью, соединяющей по меньшей мере один из Υ1Κ1 или Υ2Κ2.
В одном варианте осуществления Υ1 представляет собой С.
В одном варианте осуществления Κι представляет собой С.
В одном варианте осуществления Υ1 представляет собой С и Κι представляет собой С.
В одном варианте осуществления Х1 или Х2 представляет собой Т.
В одном варианте осуществления Х1 представляет собой Т, Х2 представляет собой Т, Υ1 представляет собой С, Κ1 представляет собой С и к равно 1.
В одном варианте осуществления Х1 представляет собой Т, Х2 представляет собой Т, Υ1 представляет собой С, Κ| представляет собой С, к равно 1, р равно 1, каждый из Ν, Ν' и Ζ3 содержит ноль нуклеотидов и Ζ2 представляет собой ТТТТ или О(Ииии), где О(Ииии) представляет собой ОШШШИ, т.е. (дезоксиИ)4.
В одном варианте осуществления 82 представляет собой ненуклеотидный линкер.
В одном варианте осуществления 82 содержит по меньшей мере один абазический остаток 0спейсера.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну разветвленную ненуклеозидную связь.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно двойное звено, по меньшей мере одно тройное звено или по меньшей мере одно двойное звено и по меньшей мере одно тройное звено.
В одном варианте осуществления 81 представляет собой двойное звено или тройное звено.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеозидную связь.
- 2 008741
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты формулы I не является антисмысловой нуклеиновой кислотой.
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей молекуле нуклеиновой кислоты формулы II
Ζι (Νη) (Νη_!) . . . (Ν2) (N1) 32 (ΝΧ#) (Ν2#) . . .
(Νη-1#) (Νη#) (3ι)4Ζ3[ (ΧιΥιΚ1)Ν(Χ2Υ2Β2))ίΖ2]ρ где каждый из Ζι, Ζ2 и Ζ3 независимо представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 12 нуклеотидов, необязательно содержащую ненуклеотидный линкер или абазический ά-спейсер; каждый из Х1 и Х2 независимо представляет собой нуклеотид, включающий в себя тимин, урацил, аденин или 5замещенный урацил; каждый из Υ1 и Υ2 независимо представляет собой цитозин (С) или модифицированный цитозин; каждый из К1 и К2 независимо представляет собой гуанин (О) или модифицированный гуанин; N представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 12 нуклеотидов, необязательно включающую ненуклеотидный линкер или абазический ά-спейсер; 81 представляет собой ненуклеотидный линкер, абазический линкер (ά-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля, необязательно предусматривающие 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеозидные связи; 82 представляет собой любую непалиндромную последовательность длиной от 1 до 10 нуклеотидов или ненуклеотидный линкер, абазический линкер (ά-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля; каждый из N1, Ν2, ..., Νη-1, Νη и Ν1#, Ν2#, ..., Νη-1#, Νη# представляет собой любой нуклеотид или модифицированный нуклеотид, где спариваются основания Ν1 с Ν1#, спариваются основания Ν2 с Ν2#, и спариваются основания Νη с Νη#; к представляет собой целое число от 0 до 5; η представляет собой целое число от 2 до 16; р представляет собой целое число от 1 до 6; и ς представляет собой целое число от 0 до 10, и где, когда (Νη)...(Ν2)(Ν1)82(Ν1#)(Ν2#)...(Νη#) обладает длиной от 10 до 42 нуклеотидов, 82 обладает длиной от 4 до 10 нуклеотидов, 82 включает в себя ненуклеотидный линкер, абазический линкер (ά-спейсеры) звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля и/или (Νη)...(Ν2)(Ν1)82(Ν1#)(Ν2#)...(Νη#) имеет содержание ОС менее чем 2/3.
В одном варианте осуществления Ζ1(Νη)(Νη-1) представляет собой ΤΥΚ, где Υ представляет собой цитозин или модифицированный цитозин и К представляет собой гуанин или модифицированный гуанин.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ..., Νη-1, Νη и Ν1#, Ν2#, .... Νη-1#, Νη# выбирают из С, О или их модификаций, где спариваются основания С с О.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ... Νη-1, Νη и Ν1#, Ν2#, ..., Νη-1#, Νη# выбирают из Т, А или их модификаций, и спариваются основания Т с А.
В данном и других вариантах осуществления каждый из С, О, А и Т может относится к дезоксинуклеотидам с соответствующими основаниями цитозином, гуанином, аденином и тимином.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ... Νη-1, Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη-1#, Νη# выбирают из С, Т, А, О и/или их модификаций, и спариваются основания С с О, спариваются основания Т с О, спариваются основания А с Т, и спариваются основания А с О.
В одном варианте осуществления каждый из Ν1, Ν2, ... Νη-1, Νη и Ν1#, Ν2#, .... Νη-1#, Νη# выбирают из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, формирующих Уотсон-Криковские пары оснований, т.е. каждая пара оснований Ν1-Ν1#, Ν2-Ν2#, ..., Νη-Νη# представляет собой Уотсон-Криковскую пару оснований.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один из каждого Ν1, Ν2, ..., Νη-1, Νη, и Ν1#, Ν2#, ..., Νη-1#, Νη# выбирают из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, формирующих не Уотсон-Криковские пары оснований, т.е. по меньшей мере одна пара оснований Ν1-Ν1#, Ν2-Ν2#, ..., Νη-Νη# представляет собой не Уотсон-Криковскую пару оснований.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит частично стабилизированный остов по меньшей мере с одной фосфодиэфирной связью.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит остов по меньшей мере с одной стабилизированной межнуклеотидной связью.
В одном варианте осуществления все межнуклеотидные связи олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит частично стабилизированный остов с фосфодиэфирной связью, соединяющей по меньшей мере один из Υ1Κ1 или Υ2Κ2.
В одном варианте осуществления Υ1 представляет собой С.
В одном варианте осуществления К1 представляет собой О.
В одном варианте осуществления Υ1 представляет собой С и К1 представляет собой О.
В одном варианте осуществления Х1 или Х2 представляет собой Т.
В одном варианте осуществления Х1 представляет собой Т, Х2 представляет собой Т, Υ1 представляет собой С, К1 представляет собой О и к равно 1.
В одном варианте осуществления Х1 представляет собой Т, Х2 представляет собой Т, Υ1 представляет собой С, К1 представляет собой О, к равно 1, р равно 1, каждый из Ν, Ν' и Ζ3 содержит ноль нуклео
- 3 008741 тидов, и Ζ2 представляет собой ТТТТ или ά(υυυυ), где ά (ииии) представляет собой бШШШи, т.е. (дезоксии)4.
В одном варианте осуществления 82 представляет собой ненуклеотидный линкер.
В одном варианте осуществления 82 содержит по меньшей мере один абазический остаток άспейсера.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну разветвленную ненуклеозидную связь.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно двойное звено, по меньшей мере одно тройное звено или по меньшей мере одно двойное звено и по меньшей мере одно тройное звено.
В одном варианте осуществления 81 представляет собой двойное звено или тройное звено.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеозидную связь.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты формулы I не является антисмысловой нуклеиновой кислотой.
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей молекуле нуклеиновой кислоты формулы III (Ζ')тг3(з3) где Ζ' представляет собой Ζι[(ΧιΥιΚι)Ν(Χ2Υ2Κ2)^Ζ2]ρ(8ι)4Ν’(Νη)...(Ν3)(Ν2)(Νι)82(Νι#)(Ν2#)(Ν3#)...(Νη#), каждый из Ζ1, Ζ2 и Ζ3 независимо представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 12 нуклеотидов, необязательно содержащую ненуклеотидный линкер или абазический ά-спейсер; каждый из Х1 и Х2 независимо представляет собой нуклеотид, включающий в себя тимин, урацил, аденин или 5замещенный урацил; каждый из Υ1 и Υ2 независимо представляет собой цитозин или модифицированный цитозин; каждый из Е1 и В2 независимо представляет собой гуанин или модифицированный гуанин; каждый из Ν и Ν' независимо представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 12 нуклеотидов, необязательно включающую ненуклеотидный линкер или абазический ά-спейсер; 81 представляет собой ненуклеотидный линкер, абазический линкер (ά-спейсеры) звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля, необязательно предусматривающие 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеозидные связи; 82 представляет собой любую непалиндромную последовательность длиной от 1 до 10 нуклеотидов или ненуклеотидный линкер, абазический линкер (ά-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля; 83 представляет собой прямую или непрямую 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'межнуклеозидную связь или ненуклеотидный линкер, где указанный ненуклеотидный линкер содержит абазические линкеры (ά-спейсеры), звенья триэтиленгликоля или звенья гексаэтиленгликоля, облегчающие 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-связь т частей последовательности; каждый из Ν1, Ν2, ... Νη и Ν1#, Ν2#, ... Νη# представляет собой любой нуклеотид или модифицированный нуклеотид, где спариваются основания Ν1 с Ν1#, спариваются основания Ν2 с Ν2#, спариваются основания Ν3 с Ν3# и спариваются основания Νη с Νη#; к представляет собой целое число от 0 до 5; т представляет собой целое число от 2 до 10; η представляет собой целое число от 2 до 16; р представляет собой целое число от 1 до 6 и ς представляет собой целое число от 0 до 10.
В конкретных вариантах осуществления Ζρχρρ^Ν^Υ^χΖρ^/ представляет собой непалиндромную последовательность.
В конкретных вариантах осуществления Ζι[(ΧιΥιΚ.ι)Ν(Χ2Υ2&2)ΐίΖ2]Ρ(8ι)4 представляет собой ТСОТСОТТТТ (8Ες II) ΝΟ:40), ТСОТСОТТЬЬ, ТСОЛ, ТСОЛС, ТСОЛСОТС или ТСОЛСОТСО, где Ь представляет собой ά-спейсер.
В конкретных вариантах осуществления ΖΡΧΡΡ^ΝΡ^ΚΡΖΡ^/ представляет собой палиндромную последовательность.
В конкретных вариантах осуществления Ζι[(ΧιΥιΚ.ι)Ν(Χ2Υ2&2)ΐίΖ2]Ρ(8ι)4 представляет собой ТСОЛСОТСОЛ (8Ες II) ΝΟ:19) или ТСОТСОЛСОЛ (8Ες II) ΝΟ:34).
В конкретных вариантах осуществления Ζι[(ΧιΥιΚ.ι)Ν(Χ2Υ2&2)ΐίΖ2]Ρ(8ι)4 представляет собой ТСОСОЛСОТТ (8Ες II) ΝΟ:26) или ТСОСОТСОТТ (8Ες II) ΝΟ:69).
В одном варианте осуществления (Νη)...(Ν2)(Ν1)82(Ν1#)(Ν2#)...(Ν2#)Ζ3 включает в себя последовательность
АОСОААОСТ, СААТАТТТАТТО (8Е0 ГО N0:1), ССОТПТОТОО (8Е(2 ГО N0:2),
СООСОССОТОССО (8Εζ) ГО N0:19), СООСОССОТТОССС (8Е<2 ГО N0:34), СООСОЬЬСОССО (8Εζ) ГО N0:5), СООСОЬЬЬТОССО (8Е() ГО N0:6), СООСООЬЬССОССС (8Е() ГО N0:7), СООСОТСОССОССО (8Е(} ГО N0:8), СОТСОАСОООАСООО (8Е() ГО N0:10), СОТСОАСОТОАСООО (8Е0 ГО N0:11), ОАОАОТТОООСТСТС (8Е() ГО N0:12), ОТСОАООАООТ (8Е() ГО N0:14), ТААТАЬЬТАТТА (8Е() ГО N0:15), ТААТАТССАТТА (8Е<2 ГО N0:16), или ТААТАТТТАТТА (8Е() ГО N0:17),
- 4 008741 где Ь представляет собой б-спейсер.
В одном из вариантов осуществления (Νη)...(Ν2)(Ν1)82(Ν1#)(Ν2#)...(Νη#) включает в себя последовательность ООСОСОСТОССО (8ЕО ΙΌ N0:13).
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула включает в себя последовательность
ТСОАСОТСОАССОТТТТОТОО (8Е<2 ГО N0:20), ТСОАСОТСОАССООАСООО (8Е() ГО N0:21), ТСОАСОТСОАСОТОАСООО (8Е(2 ГО N0:22), ТСОАСОТСОАОАОТТОООСТСТС (8Е() ГО N0:23), ТСОАСОТСОАОССААССТ (8Ες ГО N0:24), или ТСОАСОТСОАООАООТ (8Е() ГО N0:25).
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула включает в себя последовательность
ТСОТСОТТЬЕАСООСОССОТОССО (8Е0 ГО N0:37), ТСОТСОТТЬЬАСООСОЕЬЬТОССО (8Εζ) ГО N0:38), ТСОТСОТТЬЬСООСОСООСОССО (8Е0 ГО N0:39), ТСОТСОТТТТАСООСОССОТТОССО (8Е0 ГО N0:44), ТСОТСОТТТТАСООСОЬЬЬТОССО (8Е(2 ГО N0:45), ТСОТСОТТТТАССОСОТТТТОССС (8Εζ) ГО N0:49), ТСОТСОТТТТСААТАТТТАТТО (8Е<2 ГО N0:50), ТСОТСОТТТТСООСОЬЬСОССО (8Е() ГО N0:52), ТСОТСОТПТСООСООЬЬССОССО (8Е(2 ГО N0:54), ТСОТСОТТТТСООСОТСОССОССО (8Е() ГО N0:55), ТСОТСОТТТТТААТАЕЬТАТТА (8Е() ГО N0:57), ТСОТСОТТПТААТАТССАТТА (8Е(} ГО N0:58), или ТСОТСОТТГТТААТАТТТАГГА (8Е() ГО N0:59), где Е представляет собой б-спейсер.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула включает в себя последовательность ТСОСОТСОТТСООСОСОСТОССО (8ЕС ΙΌ N0:30).
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой включает в себя последовательность ТСОСОАСОТТСООСОСОСТОССО (8ЕС ΙΌ N0:27).
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой включает в себя последовательность, выбранную из Т*С*0*Т*С*0*Т*Т*Т*Т*А*С_0*0*С_0*С*С_0*Т*0*С*С*0 (8Е(2 ш N0:43), Т*С*0*Т*С_0*Т*Т*Т*Т*А*С_0*0*С*0*С*С_0*Т*0*С*С*0 (8Е(2 ГО N0:43), т*С*О*Т*С*с*т*Т*Т*Т*А*С*0*А*С*0*С*С*0*Т*0*С*С*0 (8Е() ГО N0:42), Т*С*0*Т*С*0*С*Т*Т*Т*С*С*0*А*С*0*С*С*0*Т*0*С*С*0 (8Εζ> ГО N0:36), Т*С*О*Т*С*О*С*С*С*О*О*С*О*А*С*О*С*С*О*Т*О*С*С*О (8Εζ) ГО N0:35), нуклеиновой нуклеиновой нуклеиновой кислоты кислоты кислоты кислоты кислоты
Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С*О*С*С*О*С*С*О*Т*Т*С*С*С*О (8Е<2 ГО N0:44), Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Е*Е*А*С*О*О*С*О*С*С*О*Т*О*С*С*О (8Е0 ΙΏΝΟ:37), Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С*О*О*С*О*Ь*Ь*Ь*Т*О*С*С*О (8Ер 1П N0:45), Т*С*0*Т*С*0*Т*Т*Ь*Е*А*С*0*0*С*0*Ь*Ь*Ь*Т*0*С*С*0 (8Е(2 ГО N0:38), т*с*0*т*с*0*т*т*т*т*с*0*0*с*0*0*ь*ь*с*с*0$с*с*0 ζ8Ερ го N0:54), Т*С*0*Т*С*0*Т*Т*Т*Т*С*0*0*С*0*Т*С*0*С*С*0*С*С*0 (8Ер го N0:55), Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Е*Е*С*О*О*С*О*С*О*О*С*О*С*С*О (8Ер го N0:39), т*с*о*т*с*о*т*т*т*т*с*о*о*с*о*Е*Е*с*о*с*с*о (8Бр 10 N0:52), Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*А (8Ер ш N0:59), Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*А (8Е() ГО N0:59), Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Т*Т*С*А*А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*О (8Ер ш N0:50),
- 5 008741
Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Т*С*С*А*Т*Т*А (8Е(2 ΙΌ N0:58), РКС*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Ь*Е*Т*А*Т*Т*А (8Ер ш N0:57), Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Т*Т*А*С*О*О*С*О*Е*Ь*Ь*Т*О*С*С*О (8Е<2 Ю N0:45), Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Ь*Ь*А*С*О*О*С*О*Ь*Ь*Ь*Т*О*С*С*С (8Е<2 Ш N0:38), и Т*С*0*Т*С_0*Т*Т*Т*Т*С*0*0*С*0*0*Ь*Ь*С*С*0*С*С*0 (8Е<2 ГО N0:54), где Ь представляет собой ά-спейсер, * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность, выбранную из
Т*С*О*А*С*О*Т*С*О_А_С*О*О*О*А*С*С*О*О (8Εζ) ГО N0:21), Т*С*О*А*С*О*Т*С*О_А_С*С*Т*О*А*С*О*О*О (8Е0 ГО N0:22), Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*С’!‘О*О*О*А*С*О*О*О (8Е(2 ГО N0:21), Т*С*0*А*С*0*Т*С*0*А*0*0*А*0*0*Т (8Е<2 ГО N0:25), Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*О*С*О*А* А*О*С*Т (8Е(2 ГО N0:24), Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*С*С*О*Т*Т*Т*Т*О*Т*О*О (8ЕС> ГО N0:20), и Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*О*А*О*Т*Т*О*О*О*С*Т*С*Т*С (8Е() ГО N0:23), где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность, выбранную из
Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*С*О*Т*О*А*С*О*Т*О (8Е0 ГО N0:62), Т*С*0*А*С*0*Т*С*0*А*С*0*Т*0*А*С*0 (8Е<2 ГО N0:61), Т*С_0*Т*С_0*А*С_0*Т*Т*С_0*0*С*0*С*С_0*Т*0*С*С*0 (8Еф ГО N0:65), Т*С*0*Т*С_0*Т*А*С_0*0*С*0*С*С_0*Т*0*С*С*0 (8Е0 ГО N0:66), Т*С*0*Т*С_0*Т*Т*А*С_0*0*С*0*С*С_0*Т*0*С*С*0 (8ЕС) ГО N0:67), Т*С*С-*А*С*О*Т*С*О*А*С*С-*Т*С-*А*С*О*Т*Т (8Е0 ГО N0:63), Т*С*0*Т*С_0*А*С_0*А*Т*С_0*0*С*0*С*С_0*Т*0*С*С*0 (8Е(2 ГО N0:64), Т*С*0*Т*С*0*А*С*0*А_Т_С*0*0*С*0*С*С*С*Т*0*С*С*0 (8Εζ) ГО N0:64), Т*С*О*А*С_О*Т*С*О*А*С_О*Т*О*А*С*О*Т*Т (8ЕЧ ГО N0:63), Т*С*0*А*С_0*Т*С*0*А*С*0*Т_0*А*С*0*Т*Т (8Е0 ГО N0:63), и Т*С*о*т*с_о*т*т*т*А*с_о*о*с*0*с*е_0*Т*0*С*С*0*Т (8Е<2 ГО N0:68), где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность, выбранную из
Т*С*О*С_С*Т*С*О*Т*Т*С_О*О*С*О*С_О*С*Т*О*С*С*Сг (8Е0 ГО N0:30), Т*С*0_С*0*Т*С*0*Т*Т*С_0*0*С*0*С_0*С*Т*0*С*С*0 (8ЕЧ ГО N0:30), и Т*С*О*С*О_Т*С*О*Т*Т*С_О*О*С*О*С_О*С*Т*О*С*С*О (8Е(2 ГО N0:30), где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность
Т*С*С*С^*А*С*О*Т*Т*С_О*С*С*С*С_О*С*Т*О*С*С*О (8Е<2 ΙϋΝΟ: 27) , где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность, выбранную из
Т*с_С*Т*С*С*Т*Т*Т*Т*А*С*6*С*С*С*Т*С*С*Т*С*С*С*С (ЗЕ<2 Ю N0: 48),
Т*С_С*Т*С*С*Т*Т*Т*Т*А*С*0*С*С*С*Т*С*С*С*С*С*С*6 (ЗЕ<2 Ю N0: 47), и Т*СЭ+Т*С*С*Т*Т*Т*ТА*С*С*С*С*6*Т*С*С*С*С (ЗЕО Ю N0: 46) , где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность
Т*С_С*Т*С*0*Т*Т*Т*Т*А*С*С*6*С*0*Т*С*6*Т*С*С*С*0 (3Εζ) Ю N0: 48) , где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
- 6 008741
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность
Т*С_С*6*С*6*С*С_С*Т*6*С*С*6*Т*С*6*Т*С_(3*Т*Т*Т (ЗЕО Ю N0: 33), где * представляет собой фосфоротиоат и _ представляет собой фосфодиэфир.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один нуклеотид в олигонуклеотиде представляет собой замещенный или модифицированный пурин или пиримидин.
В одном из вариантов осуществления замещенный пиримидин представляет собой С5- или С6замещенный пиримидин.
В одном из вариантов осуществления замещенный пурин представляет собой С8- или С7замещенный пурин.
В одном из вариантов осуществления замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, включающей в себя 5-замещенные цитозины, 6-замещенные цитозины, N4замещенные цитозины, 5-азацитозин, 2-меркаптоцитозин, изоцитозин, псевдоизоцитозин, аналоги цитозина с конденсированными кольцевыми системами и производные урацила, производные тимина, 7деазагуанин, 7-деаза-7-замещенный гуанин, 7-деаза-8-замещенный гуанин, 7-деаза-8-азагуанин, гипоксантин, №-замещенные гуанины, 5-амино-3-метил-3Н, 6Н-тиазоло[4,5-Т]пиримидин-2,7-дион, 2,6диаминопурин, 2-аминопурин, пурин, индол, замещенные аденины, 8-замещенный гуанин и 6-тиогуанин.
В одном из вариантов осуществления замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, включающей в себя 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-хлорцитозин, 5-бромцитозин,
5-йодцитозин, 5-гидроксицитозин, 6-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 5-дифторметилцитозин и незамещенный или замещенный 5-алкинилцитозин, №-этилцитозин, Ν,Ν'-пропиленцитозин, феноксазин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-бромвинилурацил, 4-тиоурацил, 5-гидроксиурацил, 5- пропинилурацил, 2-тиотимин, 4-тиотимин, 6-замещенные тимины, 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин, N2метилгуанин, Ж-метиладенин, 8-оксоаденин, 8-гидроксигуанин и 8-бромгуанин.
В одном из вариантов осуществления замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, включающей в себя универсальное основание, ароматическую циклическую систему и атом водорода (ά-спейсер).
В одном из вариантов осуществления замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, включающей в себя 4-метилиндол, 5-нитроиндол, 3-нитропиррол, Р-основание и К-основание, бензимидазол, дихлорбензимидазол, амид 1-метил-1Н-[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты, фторбензол и дифторбензол.
В одном из вариантов осуществления любой из Ν, 8, X или Ζ замещен остатком, выбранным из группы, включающей в себя С6-С30 алкильную цепь, желчные кислоты, холевую кислоту, таурохолевую кислоту, дезоксихолат, холестерин, олеиллитохолевую кислоту, олеоилхоленовую кислоту, гликолипиды, фосфолипиды, сфинголипиды, изопреноиды, стероиды, витамины, витамин Е, насыщенные жирные кислоты, ненасыщенные жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, триглицериды, пирены, порфирины, тексафирин, адамантан, акридины, биотин, кумарин, флуоресцеин, родамин, Техас красный, дигоксигенин, диметокситритил, трет-бутилдиметилсилил, трет-бутилдифенилсилил, цианиновые красители, цианиновый краситель Су3, цианиновый краситель Су576, краситель Хехст 33258, псорален и ибупрофен.
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей: (а) 5'-конец, начинающийся иммуностимулирующим мотивом, выбранным из (ТСбЦХ и ΚΌΟΟΥ1Υ2Ν, где Т представляет собой тимин, С представляет собой неметилированный цитозин, О представляет собой гуанин, К представляет собой пурин, Ό не является С, каждый из Υ1 и Υ2 независимо представляет собой пиримидин, η является целым числом от 1 до 4 включительно, и N представляет собой любую последовательность длиной 0-12 оснований; (Ь) 3'-конец, оканчивающийся инвертированным повтором, способным формировать структуру шпильки или стебля-петли, где указанная структура содержит ОС-богатый стебель длиной 2-6 последовательных пар оснований и по меньшей мере одно неспаренное или некомплементарно спаренное основание, и (с) частично стабилизированный остов, содержащий по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь 5'-СрО-3'. Любой или оба из С и О в СрОдинуклеотиде может являться модифицированным.
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель имеет длину 2 последовательные пары оснований.
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель имеет длину 3 последовательные пары оснований.
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель имеет длину 4 последовательные пары оснований.
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель имеет длину 5 последовательных пар оснований.
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель имеет длину 6 последовательных пар оснований.
- 7 008741
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель содержит по меньшей мере 2 пары оснований Сг-С.
В одном из вариантов осуществления ОС-богатый стебель содержит по меньшей мере 3 пары оснований Сг-С.
В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одно неспаренное или некомплементарно спаренное основание представляет собой Т.
В одном из вариантов осуществления частично стабилизированный остов, содержащий по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь 5'-СрСг-3', дополнительно содержит множество фосфоротиоатных межнуклеотидных связей.
В одном из вариантов осуществления 5’-конец обладает последовательностью, представленной как ТССТССТТТТА (ЗЕС Ю N0: 41}.
В одном из вариантов осуществления З’-конец оканчивается инвертированным повтором, обладающим последовательностью оснований, представленной как СССССССОТСССС (ЗЕ<2 Ю N0: 19).
В одном из вариантов осуществления З’-конец оканчивается инвертированным повтором, обладающим последовательностью оснований, представленной как СССССТСЗТСССС (5Е<2 Ю N0: 9).
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, обладающей последовательностью оснований, представленной как тсстсдтттТАСС6Сессстессс <ЗЕ2 10 Ν0: 43%
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, обладающей последовательностью оснований, представленной как тсстссттттассссстсстсссс (5Е0 ю N0: 48).
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, обладающей последовательностью оснований, представленной как Т*с^б*т*С*С*т*г*т*Т*а*С*С*6*С*6*С*С*6*Т*С*С*С*(л (ЗЕО 10 N0: 43), где * обозначает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь и _ обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь.
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, обладающей последовательностью оснований, представленной как т*с*е-,т*с*е*т*т*т*т*А»с_с*е*с_е*с,с_е*т*с*с*С’,с (ЗЕе тв Ν0: «), где * обозначает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь и _ обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь.
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, обладающей последовательностью оснований, представленной как т*с+е*т*с*с*т+т*т*т*А*с^*е*с*с*с*С_с+т*е*с*с*с (5Ες Ι0 Ν0. 213), где * обозначает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь и _ обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь.
В одном аспекте изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, обладающей последовательностью оснований, представленной как т*с*с*т*с_с*т*т*т*т*А*с_с*с*с*с*с*с_с*т*б*с*с*с (ЗЕ£ ίη N0: 43), где * обозначает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь и _ обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь.
В одном аспекте изобретение относится к вакцине, содержащей иммуностимулирующую молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и антиген.
В одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуностимулирующую молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из аспектов изобретение относится к способу индукции экспрессии интерферона I типа (ΙΡΝ). Способ по данному аспекту изобретения предусматривает контактирование клетки, способной экспрессировать ΙΡΝ I типа, с иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению в количестве, эффективном для индукции экспрессии ΙΡΝ I типа.
В одном из вариантов осуществления ΙΡΝ I типа представляет собой интерферон альфа (ΙΡΝ-οι).
В одном из вариантов осуществления ΙΡΝ I типа представляет собой интерферон бета (ΙΡΝ-β).
В одном из аспектов изобретение относится к способу индукции экспрессии интерферона гамма (ΙΡΝ-γ). Способ по данному аспекту изобретения предусматривает контактирование клетки, способной экспрессировать ΙΡΝ-γ, с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой по изобретению в количестве, эффективном для индукции экспрессии ΙΡΝ-γ.
В одном из аспектов изобретение относится к способу активации природной клетки-киллера (ΝΚ). Способ по данному аспекту изобретения предусматривает контактирование ΝΚ-клетки с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой по изобретению в количестве, эффективном для активации ΝΚ-клетки.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения инфекции. Способ по данному аспекту изобретения предусматривает введение субъекту, страдающему от инфекции или подверженному риску ее развития, иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения инфекции.
В одном из вариантов осуществления субъект имеет инфекцию, выбранную из вирусной, бактериальной, грибковой или паразитической инфекции, или подвержен риску ее развития.
В одном из вариантов осуществления субъект имеет вирусную инфекцию вирусом, выбранным из вируса гепатита В (НВУ), вируса гепатита С (НСУ), цитомегаловируса (СМУ), вируса Эпштейна-Барра
-8008741 (ЕВУ), вируса папилломы, вируса иммунодефицита человека (ИГУ) или вируса простого герпеса (Н8У), или подвержен риску ее развития.
В одном из вариантов осуществления субъект имеет бактериальную инфекцию видами бактерий, выбранных из ЬсЫипаша. ЬМспа или ЛиШгах, или подвержен риску ее развития.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения аллергического состояния. Способ по данному аспекту изобретения предусматривает введение субъекту, страдающего аллергическим состоянием или подверженному риску его развития, иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения аллергического состояния.
В одном из вариантов осуществления аллергическое состояние представляет собой аллергическую астму.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения рака. Способ по данному аспекту изобретения предусматривает введение субъекту, страдающего раком или подверженному риску его развития, иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения рака.
В одном из вариантов осуществления рак выбран из базально-клеточной карциномы, рака желчных путей, рака мочевого пузыря, рака кости, рака мозга и центральной нервной системы, рака молочной железы, рака шейки матки, хориокарциномы, рака ободочной и прямой кишки, рака соединительной ткани, рака пищеварительной системы, эндометриального рака, рака пищевода, злокачественной опухоли глаза, злокачественной опухоли головы и шеи, рака желудка, интраэпителиальной неоплазии, рака почки, рака глотки, лейкоза, рака печени, рака легкого, лимфомы, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, меланомы, миеломы, нейробластомы, рака полости рта, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака прямой кишки, рака почки, злокачественной опухоли респираторной системы, саркомы, рака кожи, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, рака матки, злокачественной опухоли мочевыделительной системы или других карцином и сарком.
В одном из вариантов осуществления рак представляет собой рак, чувствительный к лечению интерфероном альфа (ΓΡΝ-α).
В одном из вариантов осуществления рак, чувствительный к лечению интерфероном альфа (ΓΡΝ-α) выбран из лейкоза ворсистых клеток, хронического миелолейкоза, кожного Т-клеточного лейкоза, множественной миеломы, фолликулярной лимфомы, злокачественной меланомы, плоскоклеточной карциномы, связанной со СПИДом саркомы Капоши, почечно-клеточной карциномы, карциномы предстательной железы, дисплазии шейки матки или карциномы толстой кишки.
В одном из аспектов изобретение относится к применению иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению для производства лекарственного средства для применения в лечении инфекции.
В одном из аспектов изобретение относится к применению иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению для производства лекарственного средства для применения в лечении аллергического состояния.
В одном из аспектов изобретение относится к применению иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению для производства лекарственного средства для применения в лечении аллергической астмы.
В одном из аспектов изобретение относится к применению иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по изобретению для производства лекарственного средства для применения в лечении рака.
Каждое из ограничений изобретения может охватывать различные варианты осуществления по изобретению. Следует предупредить, однако, что каждое из ограничений изобретения, относящееся к любому элементу или сочетанию элементов, можно включить в каждый аспект изобретения.
Краткое описание фигур
Настоящее изобретение можно более просто и полно понять, если рассматривать в совокупности с сопровождающими фигурами. Фигуры приведены только для иллюстративных целей и не являются необходимыми для понимания или осуществления изобретения.
Фиг. 1 представляет собой серию графиков, показывающих индукцию посредством ΘΌΝ 332, 333 и 334 О-а и передачи сигнала ТЬК9.
Фиг. 2 представляет собой серию графиков, показывающих индукцию посредством ΘΌΝ 611, 614 и 620 ΓΡΝ-α и передачи сигнала ТЬК.9.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий продукцию ΓΡΝ-α периферическими мононуклеарными клетками крови (РВМС), стимулированными панелью олигонуклеотидов.
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий средние групповые титры (СМТ) общих антиген-специфических ГдС после иммунизации 1 мкг поверхностного антигена вируса гепатита В (НВкЛд) с указанным количеством ΘΌΝ.
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий СМТ выделенных изотипов антигенспецифических ГдС после иммунизации 1 мкг НВкЛд с указанным количеством ΘΌΝ.
- 9 008741
Фиг. 6 представляет собой график, показывающий ответы антиген-специфических цитолитических Т-лимфоцитов после иммунизации 1 мкг НВ 8 Ад с указанным количеством ΟϋΝ.
Фиг. 7А представляет собой график, показывающий выживаемость в соответствии с различными лечениями ΟϋΝ на мышиной модели опухоли нейробластомы.
Фиг. 7В представляет собой график, показывающий объем опухоли в соответствии с различными лечениями ΟϋΝ на мышиной модели опухоли нейробластомы.
Таблица выбранных последовательностей
ΟϋΝ Последовательность зе<? го ΝΟ:
126 Т*С С*Т*С*С*Т*Т*Т*Т*А*С*С*0*С*0*Т*С*6*С*0*С*С*С 47
128 Т*С 0*Т*С*0*Т*Т*Т*Т*А*С*а*0*С*0*Т*С*С*Т*0*С*С*0 48
129 Т*С О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С*а*О*С*(Э*С*С*<}*Т*О*С*С*О 43
130 Т*С О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С*О*О*С*О*Т*С*С*С*С 46
286 Т*С*О*А*С*О*Т*С*О А С*С*Т*О*А*С*О*О*О 22
291 Т*С*О*А*С*Сг*Т*С*С*А*С*Ст*Сг*С*А*С*Сг*О*О 21
298 Т*С*О*Т*С*С*Т*Т*Т*Т*А*С*О*А*С*О*С*С*6*Т*а*С*С*О 42
299 т* С*О*Т*С* О*С*Т*Т*Т*О*С*О*А*С*О*С*С*О*Т*О*С*С*О 36
300 Т*С*О*Т*С*С*С*С*С*О*О*С*О*А*С*а*С*С*С*Т*О*С*С*С 35
301 Т*С*а*Т*С*0*Т*Т*Т*Т*А*С*0*0*С*6*С*С*0*Т*Т*0*С*С*0 44
306 Т*С*С*Т*С*С*Т*Т*Т*Ь*А*С*0*6*С*0*С*С*0*Т*6*С*С*С 37
307 Т*С*С*Т*С*С*Т*Т*Т*Т*А*С*С*О*С*С*Ь*Ь*Т*Т*О*С*С*а 45
308 Т*С*С*Т*С*О*Т*Т*Ь*Ъ*А*С*С*С*С*О*Т*Ь*Е*Т*О*С*С*О 38
310 т*с*о*т*с*о*т*т*т*т*с*о*а*с*о*о*ъ*ь*с*с*о*с*с*о 54
312 т*с*с*т*с*о*т*т*т*т*с*о*о*с*о*т*с*о*с*с*с*с*с*о 55
313 Т*С*0*Т*С*С*Т*Т*Ь*Е*С*6*С*С*С*С*О*С*С*0*С*С*С 39
314 Т*с*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*С*а*С*С*О*Е*Е*С*О*С*С*О 52
331 Т*С*0*С 0*А*С*0*Т*Т*С 0*0*С*0*С 6*С*Т*а*С*С*0 27
332 т*с*о*с о*т*с*о*т*т*с о*о*с*о*с о*с*т*о*с*с*о 30
333 Т*С*С*С С*А*С*6*Т*Т*С 0*С*С*0*С 0*Т*С+0*С*С*0 28
334 Т*С*(3*С с*А*с*Сг*Т*Т*С о*о*с*о*о*с т*с*о*с*с*о 29
335 Т*С*С С*О*Т*С*О*Т*Т*С„С*О*С*6*С О*С*Т*О*С*С*О 30
336 Т*С*С*С*0 Т*С*0*Т*Т*С 0*0*С*0*С 0*С*Т*6*С*С*0 30
337 т*с*а*с*с А*с*о*т*т*с о*с*с*о*с о*т*с*а*с*с*о 28
338 Т*С*а*С*0„А*С*0*Т*Т*С 0*0*С*6*0*С Т*С*0*С*С*6 29
339 Т*С*<}С*О*А*С*С*Т*Т*С 6*С*С*С*С О*Т*С*О*С*С*О 28
340 Т*С*О С*С*А*С*Ст*Т*Т*С О*<3*С*О*в*С Т*С*С*С*С*О 29
341 т*с*а*с о*т*с*о*т*т*с с*а*с*о*с о*т*с*о*с*с*о 31
342 т*с*с*с о*т*с*о*т*т*с с*о*с*о*о*с т*с*о*с*с*о 32
343 т*с*о*с*о т*с*о*т*т*с а*о*с*о*с о*т*с*о*с*с*с 31
344 Т*С*О*С*О Т*С*О*Т*Т*С О*С*С*О*6*С Т*С*О*С*С*О 32
380 Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*С*О*А*С*О*Т 25
382 Т*С*О*А*С*О*Т*С*О*А*С*С*О*А*А*О*С*Т 24
-10008741
383 Т*С*С*А‘С*О*Т*С*О*А*С*С*С*Т*Т*Т*Т*О*Т*О*С 20
384 Т*С*0*А*С*0*Т*С*0*А*&*А*С*Т*Т*0*0*0*С*Т*С*Т*С 23
608 т*с*о*т*с с*т*т*т*т*с<г*а*с с*с*с*с с*с*с*о 51
611 Т*С*С*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С^О*О*С О*С*С а*Т*С*С*С*О 43
614 Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С а*О*С*О*С*С О*Т*6*С*С*6 43
618 т*с*а*т*с а*т*т*т*т*с а*а*с*б*о*с*с о*с*с*с 53
его Т*С*0*Т*С 0*Т*Т*Т*Т*А*С 0*0*С*а*С*С 0*Т*0*С’С*0 43
644 Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*Т*А‘А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*А 59
645 Т*С*О*Т*С О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*А 59
646 Т*С*О*Т*С О*Т*Т*Т*Т*С*А*А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*О 50
647 Т*С*О*Т*С О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Т*С*С*А*Т*Т*А 58
648 Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Ь*Ь*Т*А*Т*Т*А 57
649 Т*С*С*Т*С С*Т*Т*Т*Т*А*С*0*6*С*а*Е*Ь*Ь*Т*0*С*С*О 45
650 Т*С*0*Т*С 6*Т*Т*Е*Ь*А*С*0*0*С*0*Ь*Ь*Ь*Т*0*С*С*0 38
65! т*с*о*т*с о*т*т*т*т*с*с*о*с*о*о*е*ь*с*с*о*с*с*о 54
830 Т*С*0*А*С*0*Т*С*0 А^С+0*0*0*А*С*0*0*а 21
Подробное описание изобретения
В одном аспекте изобретение основано на открытии, что конкретные подклассы иммуностимулирующих СрС-олигонуклсотидов. обладающие определенной вторичной структурой, высокоэффективно опосредуют иммуностимулирующие эффекты. Данные СрС-нуклеиновые кислоты являются терапевтически и профилактически полезными для стимуляции иммунной системы для лечения рака, инфекционных заболеваний, аллергии, астмы и других заболеваний и для помощи при защите против умеренных инфекций после химиотерапии рака. Сильные, но сбалансированные клеточный и гуморальный иммунные ответы, получаемые при стимуляции СрС, отражают собственную природную защиту организма против вторгающихся патогенов и раковых клеток.
Последовательности по изобретению обладают некоторым структурным сходством с классом С'рСолигонуклеотидов, на который ссылаются как на С-класс или олигонуклеотидную с комбинированным мотивом СрС. См. опубликованную международную заявку на получение патента РСТ XVО 03/015711. Подобно описанным выше олигонуклеотидам С-класса, СрС-олигонуклеотиды С-класса по настоящему изобретению обладают определенными 5'- и З'-мотивами как частями молекулы. Данные описанные выше олигонуклеотиды С-класса обладают традиционной «стимулирующей» СрС-последовательностью, как правило, расположенной на 5'- или 3'-конце и мотивом «СС-богатого палиндрома», как правило, расположенным на другом конце молекулы или вблизи него. Такие нуклеиновые кислоты с комбинированным мотивом оказывают иммуностимулирующие эффекты, где-то промежуточные между такими эффектами, связанными с традиционными СрС-ΟϋΝ «В-класса», являющимися сильными индукторами активации В-клеток и активации дендритных клеток, и такими эффектами, связанными с более недавно описанным классом СрС-содержащих иммуностимулирующих нуклеиновых кислот (СрС-ΟϋΝ «А-класса»), являющимися сильными индукторами ΙΡΝ-α и активации ΝΚ-клеток, но сравнительно слабыми индукторами активации В-клеток и активации ОС.
Новые СрС-олигонуклеотиды С-класса по настоящему изобретению также отличаются по структуре от описанных ранее СрС-олигонуклеотидов С-класса. По сравнению с описанными ранее СрСолигонуклеотидами С-класса, иммуностимулирующие молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению характеризуются более мягкими требованиями по отношению к ОС-богатому палиндрому на одном конце молекулы. Например, описанные ранее СрО-олигонуклеотиды С-класса в одном из вариантов осуществления содержат строгий или точный палиндром длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, имеющий содержание ОС по меньшей мере 2/3. В некоторых вариантах осуществления палиндром описанных ранее олигонуклеотидов С-класса может содержать не более чем минимальное число последовательных некомплементарно спаренных нуклеотидов.
В отличие от описанных ранее олигонуклеотидов С-класса, аналоги олигонуклеотидов С-класса по настоящему изобретению характеризуются палиндромными мотивами, которые могут иметь, в различных вариантах осуществления, менее 10 нуклеотидов; содержание ОС между нулем и менее чем 2/3; различные аналоги нуклеотидов и заместители, включая лишенные каких-либо нуклеиновых оснований (6спейсер); удлиненную инвертированную последовательность, содержащую четыре или более последовательных нуклеотидов или заместителей нуклеотидов, не формирующих Уотсон-Криковские пары оснований, и любые их сочетания. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления 3'-части двух или более молекул можно соединить вместе за их 3'-концы. Обнаружено, что олигонуклеотиды данного нового подкласса, не имеющие точного палиндрома, еще способны, подобно описанным ранее СрСолигонуклеотидам с комбинированным мотивом, индуцировать высокие уровни продукции ΙΕΝ, включая
-11 008741
ΙΕΝ I типа (например, ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β) и ΙΕΝ-γ.
«Палиндром» и, эквивалентно, «палиндромная последовательность», как применяют здесь, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, точно обратно комплементарной себе самой (т.е. последовательности, такой как ΆΒΟΌΕΕ'ΌΌΒ'Ά', в которой А и А', В и В', С и С', Ό и Ό', Е и Е' представляют собой основания, способные формировать обычные Уотсон-Криковские пары оснований, т.е. С-С. А-Т и А-и. Как применяют здесь, «палиндром» в строгом смысле исключает инвертированную последовательность или инвертированную ненуклеотидную структуру, не участвующую в формировании обычных Уотсон-Криковских пар оснований.
«Инвертированный повтор», как применяют здесь, относится к неточному палиндрому, т.е. последовательности нуклеиновой кислоты, в которой присутствуют как нуклеотиды, способные формировать обычные Уотсон-Криковские пары оснований, так и нуклеотиды, аналоги нуклеотидов и другие структуры, не участвующие в формировании обычных Уотсон-Криковских пар оснований (например, последовательность, такая как АВСПЕ-8-Е'П'С'В'А', в которой А и А', В и В', С и С', Ό и Ό', Е и Е' представляют собой основания, способные формировать обычные Уотсон-Криковские пары оснований, и 8 представляет собой непалиндромную последовательность или ненуклеотидный линкер или абазический линкер (б-спейсер)). В конкретных вариантах осуществления нуклеотиды, аналоги нуклеотидов и другие структуры, не участвующие в формировании обычных Уотсон-Криковских пар оснований, прерывают точный во всем остальном палиндром. В конкретных вариантах осуществления нуклеотиды, не участвующие в формировании обычных Уотсон-Криковских пар оснований, могут формировать не Уотсон-Криковские пары оснований с другим нуклеотидом, например С-Т. Не Уотсон-Криковская пара оснований, как применяют здесь, представляет собой любую пару оснований, отличную от Уотсон-Криковской пары оснований, включающую в себя в качестве неограничивающих примеров Хугстэновские взаимодействия и так называемое неоднозначное спаривание. В конкретных вариантах осуществления нуклеотиды, не участвующие в формировании обычных Уотсон-Криковских пар, непарные и не имеют нуклеотидного основания или аналога нуклеотидного основания, с которым могут формировать Уотсон-Криковскую или не Уотсон-Криковскую пару оснований, например С напротив б-спейсера. В конкретных вариантах осуществления нуклеотиды, не участвующие в формировании пар оснований, могут формировать нестандартные пары оснований с другим нуклеотидом, например диаминопиридин может формировать пару оснований с ксантозином.
По одному из вариантов осуществления 5'-конец нуклеиновой кислоты начинается с иммуностимулирующего мотива, выбранного из (Τί.Ό)ηΝ и ΒΌί,ΌΥΥ^. Т представляет собой тимин, С представляет собой неметилированный цитозин, С представляет собой гуанин, К представляет собой пурин, Ό не является С, каждый из Υ1 и Υ2 независимо представляет собой пиримидин, η представляет собой целое число от 1 до 4 включительно, и Ν представляет собой любую последовательность длиной 0-12 пар оснований.
З'-конец нуклеиновой кислоты оканчивается инвертированным повтором, способным формировать структуру шпильки или стебля-петли. Термин «оканчивается» относится к структуре на З'-конце или вблизи него. Таким образом, конец неточного палиндрома может располагаться на фактическом З'-конце молекулы, или, в качестве альтернативы, З'-конец может содержать 1 или несколько дополнительных нуклеотидов, не являющихся частью структуры инвертированного повтора. Предпочтительно З'-конец молекулы содержит З или менее нуклеотидов, не формирующих часть структуры инвертированного повтора.
По одному из вариантов осуществления «инвертированный повтор, способный формировать структуру шпильки или стебля-петли», как применяют здесь, относится к последовательности нуклеотидов, формирующей СС-богатый стебель или шпильку длиной 2-10 последовательных пар оснований и содержащей по меньшей мере одно неспаренное или некомплементарно спаренное основание. В отдельных вариантах осуществления СС-богатый стебель имеет длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных пар оснований. В некоторых вариантах осуществления СС-богатый стебель содержит по меньшей мере 2, З или 4 пары оснований С-С.
По одному из вариантов осуществления «инвертированный повтор, способный формировать структуру шпильки или стебля-петли», как применяют здесь, относится к последовательности нуклеотидов, формирующей АТ-богатый стебель или шпильку длиной от 2 до 10 последовательных пар оснований и содержащей по меньшей мере одно неспаренное или некомплементарно спаренное основание. В отдельных вариантах осуществления АТ-богатый стебель имеет длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных пар оснований. В некоторых вариантах осуществления АТ-богатый стебель содержит по меньшей мере 2, 3 или 4 пары оснований А-Т.
В некоторых случаях по меньшей мере одно неспаренное или некомплементарно спаренное основание соединяет мостиком концы стебля или шпильки. Это может позволять формирование вторичной структуры предоставлением точки перегиба в молекуле для стеблей для образования пары оснований и формирования шпильки. В качестве альтернативы неспаренное или некомплементарно спаренное основание (основания) может присутствовать внутри стебля. Если некомплементарно спаренное основание присутствует внутри стебля, тогда предпочтителен стебель длиной по меньшей мере 3 пары оснований.
- 12 008741
В некоторых вариантах осуществления неспаренное или некомплементарно спаренное основание представляет собой Т. Неспаренные нуклеотиды на конце двойных цепей известны также как выступающие нуклеотиды или свободные концы, которые могут значительно стабилизировать формирование дуплекса или формирование шпильки. Рге1ег 8.М. е! а1. (1983) Еккес!з ок З'бапдйпд епб з!аскшд оп !йе з!аЪШ!у ок СССС апб СССС боиЪ1е йейхез. ВюсйешщЕу 22:6198-206.
Нуклеиновая кислота содержит также частично стабилизированный остов, содержащий по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь 5'-СрО-3'.
В некоторых случаях двухцепочечная часть молекулы может содержать также неприродные (нестандартные) пары оснований (например, диаминопиридин, спаренный с ксантозином). Би!/ М.1. е! а1. (1998) Кесодпйюп ок а поп-з!апбагб базе рай Ъу !йегшоз!аЫе ΌΝΆ ро1утегазез. Вюогд Меб Сйеш Бей 8:1149-52.
Формулы определяют подгруппы класса СрО-олигонуклеотидов, демонстрирующих отличные иммуностимулирующие свойства. В формулах 5' относится к свободному 5'-концу олигонуклеотида и 3' относится к свободному З'-концу олигонуклеотида.
Олигонуклеотиды могут иметь один или несколько доступных 5'- или З'-концов. В некоторых вариантах осуществления 3'-конец можно присоединить к другому 3'-концу. Так как обнаружена и описана здесь важность 5'- и 3'-мотивов, возможно также получить модифицированные олигонуклеотиды, имеющие два таких 5'- или З'-конца. Этого можно достичь, например, соединением двух олигонуклеотидов посредством связи 3'-3' для получения олигонуклеотида, имеющего два доступных 5'-конца. 3'3'- или 5'5'связь может представлять собой фосфодиэфирный, фосфоротиоатный или любой другой модифицированный межнуклеозидный мостик. Способы осуществления такого связывания известны в данной области. Например, такие связи описаны в 8ейдег Н. е! а1. (1991) Ойдопис1ео!1бе апа1одз айй !егшша1 З'-З'- апб 5'-5'-ш!егпис1ео!1б1с йпкадез аз апйзепзе шЫЪйогз ок уйа1 депе ехргеззюп, Ж|с!еоз1без & Ж|с1ео11без 10:469-77 апб Лапд Ζ. е! а1. (1999) Рзеибо-сусйс о11допис1еойбез: ш уйго апб ш у1уо ргорегйез, Вюогд Меб Сйеш 7:2727-35.
Кроме того, З'-З'-связанные или 5'-5'-связанные ΟΌΝ, где связь между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами не является фосфодиэфирным, фосфоротиоатным или другим модифицированным мостиком, можно получить с применением дополнительного спейсера, такого как три- или тетраэтиленгликольфосфатная группа (Эигапб М. е! а1. (1992) Тпр1е-йе11х когшайоп Ъу ап ойдопис1ео!1бе соп!ашшд опе (бА) 12 апб !ао (бТ) 12 зециепсез Ъпбдеб Ъу !ао Иехае!йу1епе д1усо1 сйашз, ВюсйешЕйу 31:9197-204; патент США № 5658738 и патент США № 5668265). В качестве альтернативы, ненуклеотидный линкер можно получить из этандиола, пропандиола или из абазического дезоксирибозного звена (б-спейсера) (Роп!апе1 М.Б. е! а1. (1994) 8!епса1 гесодпйюп Ъу Т4 ро1упис1ео!1бе кшазе ок поп-пис1еоз1б1с то1ейез 5'-а!!асНеб !о ойдопис1ео!1без, №с1е1с Ас1бз Кез 22:2022-7) с применением обычной фосфорамидитной химии. Ненуклеотидные линкеры можно вводить один или несколько раз или сочетать друг с другом, позволяя любое желательное расстояние между З'-концами двух подлежащих связыванию ΟΌΝ.
«Ненуклеотидный линкер», как применяют здесь, относится к любому линкерному элементу, не являющемуся нуклеотидом или его полимером (т.е. полинуклеотидом), где нуклеотид включает в себя пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание и фосфат сахара. Таким образом, ненуклеотидный линкер включает в себя абазический нуклеотид (б-спейсер), т.е. нуклеотидоподобное сахарофосфатное звено, в котором нуклеиновое основание заменено атомом водорода. Ненуклеотидный линкер может представлять собой полиэтиленгликоль, включающий в себя в качестве неограничивающих примеров триэтиленгликоль и гексаэтиленгликоль.
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид обладает одной из следующих структур: ТСОТСОТПТА (8Εζ) ГО N0:41), СООСОССОТОССО (8Е0 ГО N0:19),
СООСОТСОТОССО (8Е0 ГО N0:9), ТСОТСОТТТТАСООСОССОТОССО (8Εζ) ГО
N0:43), ТСОТСОТТТТАСООСОТСОТОССО (8Е() Ш N0:48),
Т*С_0*Т*С*0*Т*Т*Т*Т*А*С*0*0*С*0*С*С*6*Т*0*С*С*0 (8Е0 ГО N0:43), т*с*о*т*с*о*т*т*т*т*А*с_о*о*с_О*С*С_О*Т*О*С*С*О (8Е(2 ГО N0:43), Т*С*О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С_О*О*С*О*С*С_О*Т*О*С*С*О (8Ер N0:43), и Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Т*Т*А*С_С*О*С*О*С*С_О*Т*О*С*С*О (8Εζ) ГО N0:43).
Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи и _ означает присутствие фосфодиэфирной связи.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, как правило, имеют длину в диапазоне от 6 до 100 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления длина находится в диапазоне 6-40, 13-100, 13-40, 13-30, 15-50 или 15-30 нуклеотидов, или в любом диапазоне целых чисел между ними.
Термины «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» применяют попеременно, обозначая множественные нуклеотиды (т.е. молекулы, содержащие сахар (например, рибозу или дезоксирибозу)), связанную с фосфатной группой и с взаимозаменяемым органическим основанием, представляющим собой замещенный пиримидин (например, цитозин (С), тимин (Т) или урацил (И)) или замещенный пурин (на
- 1З 008741 пример, аденин (А) или гуанин (С)). Как применяют здесь, термины «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» относятся к олигорибонуклеотидам так же, как к олигодезоксирибонуклеотидам. Термины «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» должны относится также к полинуклеозидам (т.е. полинуклеотиду минус фосфат) и любому другому полимеру, содержащему органическое основание. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномной или кДНК), но предпочтительно являются синтетическими (например, полученными синтезом нуклеиновых кислот).
Термины «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид», как применяют здесь, относятся к молекулам нуклеиновой кислоты и олигонуклеотидам по изобретению так же, как к аналогам олигонуклеотидов по изобретению. Термины «олигодезоксинуклеотид» и, эквивалентно, «ΘΌΝ», как применяют здесь, относится к немодифицированным олигодезоксинуклеотидам по изобретению так же, как к аналогам олигодезоксинуклеотидов по изобретению.
Термины «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид», как применяют здесь, относятся к молекулам нуклеиновой кислоты и олигонуклеотидам с замещениями или модификациями, такими как замещения или модификации в основаниях и/или сахарах. Например, они включают в себя нуклеиновые кислоты, имеющие сахара остова, ковалентно присоединенные к низкомолекулярным органическим группам, отличным от гидроксильной группы в 2'-положении и отличным от фосфатной группы или гидроксигруппы в 5'-положении. Такие модифицированные нуклеиновые кислоты могут содержать 2'-Оалкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут содержать сахара, такие как арабинозу или 2'-фторарабинозу вместо рибозы. Соответственно, нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными в составе остова, таким образом, содержащими любые возможные сочетания звеньев полимера, соединенных вместе, такими как пептид-нуклеиновые кислоты (имеющие пептидоподобный остов с основаниями нуклеиновых кислот). Другие примеры более детально описаны ниже.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут охватывать различные химические модификации или замещения по сравнению с природными РНК и ДНК, вовлекающие фосфодиэфирный межнуклеозидный мостик, β-Ό-рибозное звено и/или природное нуклеозидное основание (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил). Примеры химических модификаций известны специалистам в данной области и описаны, например, в иЫтапи Е. е! а1. (1990) СНет Кеу 90:543; Рго1осо18 £от О1щогшс1еокке5 апк Апа1од§ 8уп1ке515 апк Рторегйек & 8уп1ке8щ апк Апа1уйса1 Тес11пк|ие5. 8. Адп-птак Ек, Нитапа Рте88, То1о^а, И8А 1993; Сгооке 8.Т. е! а1. (1996) Аппи Кеу РНагтасо1 Тох1со1 36:107-29; и Нип/|кег 1. е! а1. (1995) Мок 8уп111 Ме1кок8 7:331-417. Олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций, где каждая модификация локализована в конкретном фофсодиэфирном межнуклеозидном мостике и/или в конкретном β-Ό-рибозном звене и/или в конкретном положении природного нуклеозидного основания по сравнению с олигонуклеотидом такой же последовательности, составленном из природных ДНК или РНК.
Например, олигонуклеотиды могут содержать одну или несколько модификаций, где каждую модификацию независимо выбирают из:
a) замены фосфодиэфирного межнуклеозидного мостика, локализованного на 3'- и/или 5'-конце нуклеозида модифицированным межнуклеозидным мостиком,
b) замены фосфодиэфирного мостика, локализованного на 3'- и/или 5'-конце нуклеозида дефосфомостиком,
c) замены сахарофосфатного звена из сахарофосфатного остова молекулы другим звеном,
к) замены β-Ό-рибозного звена звеном модифицированного сахара и
е) замены природного нуклеозидного основания модифицированным нуклеозидным основанием. Более подробные примеры химических модификаций олигонуклеотида следующие.
Олигонуклеотиды могут содержать модифицированные межнуклеотидные связи, такие как описаны выше в а) или Ь). Данные модифицированные связи могут быть частично устойчивыми к деградации (например, стабилизированными). «Стабилизированная молекула олигонуклеотида» означает олигонуклеотид, в результате таких модификаций относительно устойчивый к деградации ίπ у1уо (например, посредством экзо- или эндонуклеазы). Олигонуклеотиды с фосфоротиоатными связями, в некоторых вариантах осуществления, могут обеспечивать максимальную активность и защиту олигонуклеотида от деградации внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами.
Фосфодиэфирный межнуклеозидный мостик, локализованный на 3’- и/или 5'-конце нуклеозида, можно заменить модифицированным межнуклеозидным мостиком, где модифицированный межнуклеозидный мостик выбран, например, из фосфоротиоата, фосфородитиоата, NК1К2-фосфорамидата, боранфосфата, α-гидроксибензилфосфата, фосфат-(С1-С21)-О-алкилового сложного эфира, фосфат-[(С6С12)арил-(С1-С21)-О-алкил] сложного эфира, (С1-С8)алкилфосфонатных и/или (С6-С12)арилфосфонатных мостиков, (С7-С12)-а-гидроксиметиларила (например, описанного в \УО 95/01363), где (С6-С12)арил, (С6С20)арил и (С6-С14)арил необязательно заменен галогеном, алкилом, алкокси-, нитро-, циано-, и где К1 и К2 независимо друг от друга представляют собой водород, (С1-С18)алкил, (С6-С20)арил, (С6-С14)арил-(С1
- 14 008741
С8)алкил, предпочтительно водород, (С1-С8)алкил, предпочтительно (С1-С4)алкил и/или метоксиэтил, или К1 и К2 вместе с несущим их атомом азота формируют 5-6-членное гетероциклическое кольцо, которое может дополнительно содержать добавочный гетероатом из группы О, 8 или Ν.
Замена фосфодиэфирного мостика, локализованного на 3'- и/или 5'-конце нуклеозида, дефосфомостиком (дефосфомостики описаны, например, в ИЫтапп Е. апб Реутап Α. ίη МеШобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Уо1. 20, РгоЮсо1к Гог О11допис1еоббе8 апб Апа1од§, 8. Адгатеа1, Еб., Нитапа Ргекк, ТоЮтеа 1993, СНарЮг 16, рр. 355 ГГ), где дефосфомостик, например, выбран из дефосфомостиков формацетальной, 3тиоформацетильной, метилгидроксиламиновой, оксимной, метилендиметилгидразо, диметиленсульфоновой и/или силиловой групп.
Сахарофосфатное звено (например, β-Ό-рибозу и фосфодиэфирный межнуклеозидный мостик, вместе формирующие сахарофосфатное звено) из сахарофосфатного остова (т.е. сахарофосфатный остов состоит из сахарофосфатных звеньев) можно заменить другим звеном, где другое звено, например, пригодно для построения «морфолино-производного» олигомера (как описано, например, в 811гсНак Е.Р. е1 а1. (1989) №.1с1е1с Ас1б§ Кек 17:6129-41), что представляет собой, например, замену «морфолинопроизводным» звеном; или для построения полиамидной нуклеиновой кислоты («ΡΝΑ»; как описано, например, в №е1кеп Р.Е. е1 а1. (1994) Вюсопщд С1ет 5:3-7), что представляет собой, например, замену звеном остова ΡΝΑ, например, 2-аминоэтилглицином. Олигонуклеотид может иметь другие модификации и замены в остове, такие как пептидные нуклеиновые кислоты с фосфатными группами (ΡΗΟΝΑ), замкнутые нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ) и олигонуклеотиды с участками остова с алкиловыми линкерами или аминолинкерами. Алкиловый линкер может быть разветвленным или неразветвленным и хирально однородным или рацемической смесью.
β-рибозное звено или в-О-2'-дезоксирибозное звено можно заменить модифицированным сахарным звеном, где модифицированное сахарное звено, например, выбирают из β-Ό-рибозы, α-Ό-2'дезоксирибозы, Ь-2'-дезоксирибозы, 2'-Е-2'-дезоксирибозы, 2'-Е-арабинозы, 2'-О-(С1-С6)алкилрибозы, где 2'-О-(С1-С6)алкилрибоза предпочтительнее представляет собой 2'-О-метилрибозу, 2'-О-(С2С6)алкенилрибозу, 2'-[О-(С1-С6)алкил-О-(С1-С6)алкил]рибозу, 2'-ЯН2-2'-дезоксирибозу, β-Ό-ксилофуранозы, α-арабинофуранозы, 2,4-дидезокси-в-Э-эритрогексопиранозы и аналогов сахаров, карбоциклических (описанных, например, в ЕгоеЫег (1992) 1 Αт С1ет 8ос 114:8320) и/или с открытой цепью (описанных, например, в УапбепбпекксНе е1 а1. (1993) Те1гаНебгоп 49:7223), и/или бицикло-сахарных аналогов (описанных, например, в Тагкоу М. е1 а1. (1993) Не1у СЫпа Α^η 76:481).
В некоторых вариантах осуществления сахар представляет собой 2'-О-метилрибозу, особенно для одного или обоих нуклеотидов, связанных фосфодиэфирной или фосфодиэфирно-подобной межнуклеозидной связью.
Нуклеиновые кислоты содержат также замещенные пурины и пиримидины, такие как С-5пропинпиримидин и 7-деаза-7-замещенные модифицированные основания. Уадпег К.У. е1 а1. (1996) №11 Вю1ес11по1 14:840-4. Пурины и пиримидины включают в себя в качестве неограничивающих примеров аденин, цитозин, гуанин, тимин и урацил, и другие природные и неприродные нуклеиновые основания, замещенные и незамещенные ароматические молекулы.
Модифицированное основание представляет собой любое основание, химически отличное от природного основания, обычно находящегося в ДНК и РНК, такого как Т, С, О, А и и, но разделяющего основные химические структуры с природными основаниями. Модифицированное нуклеозидное основание можно выбрать, например, из гипоксантина, урацила, дигидроурацила, псевдоурацила, 2-тиоурацила, 4тиоурацила, 5-аминоурацила, 5-(С1-С6)алкилурацила, 5-(С2-С6)алкенилурацила, 5-(С2-С6)алкинилурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5-хлорурацила, 5-фторурацила, 5-бромурацила, 5-гидроксицитозина, 5-(С1-С6)алкилцитозина, 5-(С2-С6)алкенилцитозина, 5-(С2-С6)алкинилцитозина, 5-хлорцитозина, 5-фторцитозина, 5-бромцитозина, №-диметилгуанина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7-деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина,
5-гидроксиметилцитозина, ^-алкилцитозина, например №-этилцитозина, 5-гидроксидезоксицитидина, 5-гидроксиметилдезоксицитидина, №-алкилдезоксицитидина, например №-этилдезоксицитидина, 6тиодезоксигуанозина, и дезоксирибонуклеозида из нитропиррола, С5-пропинилиримидина и диаминопурина, например 2,6-диаминопурина, инозина, 5-метилцитозина, 2-аминопурина, 2-амино-6-хлорпурина, гипоксантина или других модификаций природных нуклеозидных оснований. Данный список является примерным и не должен интерпретироваться как ограничивающий.
В конкретные формулы, описанные здесь, можно включать модифицированные основания. Например, цитозин можно заменять модифицированным цитозином. Модифицированный цитозин, как применяют здесь, представляет собой природное или неприродное пиримидиновое основание, являющееся аналогом цитозина, которым можно заменить данное основание без снижения иммуностимулирующей активности олигонуклеотида.
Модифицированные цитозины включают в себя в качестве неограничивающих примеров 5замещенные цитозины (например, 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-хлорцитозин, 5-бромцитозин, 5йодцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 5-дифторметилцитозин и незамещенный или
- 15 008741 замещенный 5-алкинилцитозин), 6-замещенные цитозины (например, 6-гидроксицитозин), Ν4замещенные цитозины (например, №-этилцитозин), 5-азацитозин, 2-меркаптоцитозин, изоцитозин, псевдоизоцитозин, аналоги цитозина с конденсированными кольцевыми системами (например, Ν,Ν'пропиленцитозин или феноксазин), и урацил и его производные (например, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-бромвинилурацил, 4-тиоурацил, 5-гидроксиурацил, 5-пропинилурацил). Некоторые из предпочтительных цитозинов включают в себя 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-гидроксицитозин, 5гидроксиметилцитозин и Ш-этилцитозин. В других вариантах осуществления по изобретению цитозиновое основание заменяют универсальным основанием (например, 3-нитропиррол, Р-основание), ароматической кольцевой системой (например, фторбензол и дифторбензол) или атомом водорода (б-спейсер).
Гуанин можно заменить модифицированным гуаниновым основанием. Модифицированный гуанин, как применяют здесь, представляет собой природное или неприродное пуриновое основание, являющееся аналогом гуанина, которым можно заменить данное основание без снижения иммуностимулирующей активности олигонуклеотида. Модифицированные гуанины включают в себя в качестве неограничивающих примеров 7-деазагуанин, 7-деаза-7-замещенный гуанин (такой как 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенный гуанин, гипоксантин, №-замещенные гуанины (например, №-метилгуанин), 5амино-3-метил-3Н,6Н-тиазоло[4,5-б]пиримидин-2,7-дион, 2,6-диаминопурин, 2-аминопурин, пурин, индол, аденин, замещенные аденины (например, ^-метиладенин, 8-оксоаденин), 8-замещенный гуанин (например, 8-гидроксигуанин и 8-бромгуанин) и 6-тиогуанин. В другом варианте осуществления по изобретению гуанин заменяют универсальным основанием (например, 4-метилиндолом, 5-нитроиндолом и К-основанием), ароматической кольцевой системой (например, бензимидазолом или дихлорбензимидазолом, амидом 1-метил-1Н-[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты) или атомом водорода (б-спейсер).
В одном варианте осуществления и С, и С из СС-динуклеотида представляют собой немодифицированные основания цитозина и гуанина соответственно. В одном варианте осуществления С в ССдинуклеотиде является неметилированным.
Для применения по настоящему изобретению олигонуклеотиды по изобретению можно синтезировать бе ηονο с применением любой из ряда процедур, хорошо известных в данной области, например, β-цианоэтил-фосфорамидный способ (Веаисаде 8.Ь. е! а1. (1981) Те1гаНебгоп ЬеИ 22:1859); или нуклеозид-Н-фосфонатный способ (Сагедд е! а1. (1986) ТейаЬебгоп ЬеИ 27:4051-4; РгоеЫег В.С. е! а1. (1986) Νυс1е1с Ас1бк Кек 14:5399-407; Сагедд е! а1. (1986) Те!гайебгоп Ье!! 27:4055-8; Сайиеу е! а1. (1988) Те!гайебгоп Ьей 29:2619-22). Данные химические способы можно осуществлять посредством автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, доступных в продаже. На данные олигонуклеотиды ссылаются как на синтетические олигонуклеотиды. На выделенный олигонуклеотид, как правило, ссылаются как на олигонуклеотид, отделенный от компонентов, с которыми он обычно связан в природе. В качестве примера, выделенный олигонуклеотид может представлять собой олигонуклеотид, отделенный от клетки, от ядра, от митохондрий или от хроматина.
Модифицированные остовы, такие как фосфоротиоаты, можно синтезировать с применением автоматических способов, применяющих фосфорамидатные или Н-фосфонатные химические способы. Арилили алкил-фосфонаты можно получить, например, как описано в И.8. Ра!. Νο. 4469863; и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная группа алкилирована, как описано в патенте США № 5023243 и европейском патенте № 092574) можно получить автоматическим твердофазным синтезом с применением коммерчески доступных реагентов. Способы получения других модификаций и замещений остова ДНК описаны (например, иЫтапп Е. е! а1. (1990) СЬет Ке\г 90:544; СообсЫ1б 1 (1990) Вюсоп_)ида!е СЬет 1:165).
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут содержать также одну или несколько необычных связей между нуклеотидами или аналогичными нуклеотидам составляющими. Обычной межнуклеозидной связью является 3'5'-связь. Все другие связи считают необычными межнуклеозидными связями, такие 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- и 2'3'-связи. Таким образом, номенклатуру от 2' до 5' выбирают в соответствии с атомом углерода рибозы. Однако если применяют неприродные сахарные составляющие, такие как аналоги сахаров с расширенным кольцом (например, гексаноза, циклогексен или пираноза) или ди- или трициклические аналоги сахара, тогда данную номенклатуру изменяют в соответствии с номенклатурой мономера. В 3'-дезокси-3-О-рибопиранозных аналогах (называемых также р-ДНК) мононуклеотиды соединены, например, 4'2'-связью.
Если нуклеотид содержит одну 3'3'-связь, тогда данный олигонуклеотид, как правило, имеет два несвязанных 5'-конца. Подобным образом, если нуклеотид содержит одну 5'5'-связь, тогда данный олигонуклеотид, как правило, имеет два несвязанных 3'-конца. Доступность несвязанных концов нуклеотидов может быть более доступна их рецепторам. Оба типа необычных связей (3'3'- и 5'5'-) описаны Огбдао ΓΡ. е! а1. (1992) Апбкепке Кек Ое\г 2:129-46, в силу чего опубликовано, что олигонуклеотиды, имеющие 3'3'-связь, показывают улучшенную стабильность по отношению к расщеплению нуклеазами.
Различные типы связей можно также сочетать в одной молекуле, что может приводить к разветвлению олигомера. Если одна часть олигонуклеотида присоединена 3'-концом посредством 3'3'-связи ко второй части олигонуклеотида и 2'-концом посредством 2'3'-связи к третьей части молекулы, это приво
- 16 008741 дит, например, к образованию разветвленного нуклеотида с тремя 5'-концами (3'3'-, 2'3'-разветвленного).
В принципе, связи между различными частями олигонуклеотида или между различными олигонуклеотидами, соответственно, можно осуществлять через все части молекулы, пока это не влияет отрицательно на узнавание ее рецептором. В соответствии с природой нуклеиновой кислоты связь может вовлекать составляющую сахара (8и), гетероциклическое нуклеиновое основание (Ва) или фосфатный остов (Ρ11). Таким образом, возможны связи типа 8и-8и, 811-ΡΙ1. 8и-Ва, Ва-Ва, Ва-8и, Ва-Рй, ΡΙι-ΡΙι. ΡΙ1-811 и Ρΐι-Ва. Если олигонуклеотиды дополнительно модифицируют конкретными ненуклеотидными заместителями, могут присутствовать связи между модифицированными частями олигонуклеотидов. Данные модификации включают в себя также модифицированные нуклеиновые кислоты, например, ΡΝΑ, ΤΝΑ, или морфолино-олигонуклеотидные аналоги.
Связи предпочтительно состоят из С, Н, Ν, О, 8, В, Р и галогена и содержат от 3 до 300 атомов. Примером с 3 атомами является ацетальная связь (ОЭШ-3'-О-СН2-О-3'-ОЭ№; ЕгоеЫег аиб Ма11еисе1), соединяющая, например 3'-гидроксигруппу одного нуклеотида с 3'-гидроксигруппой второго олигонуклеотида. Примером с примерно 300 атомами является ΡΕΟ-40 (тетраконтаполиэтиленгликоль). Предпочтительными связями являются фосфодиэфирная, фосфоротиоатная, метилфосфонатная, фосфорамидатная, боранфосфонатная, амидная, простая эфирная, тиоэфирная, ацетальная, тиоацетальная, мочевинная, тиомочевинная, сульфонамидная, Шиффова основания и дисульфидная связи. Другой возможностью является применение системы 8о1и11пк ВюСощцдайои (ТпЬшк ВюТесйио1од1е8, 8ап Э1едо, СА).
Если олигонуклеотид составлен из двух или более частей последовательности, данные части могут быть идентичными или различными. Так, в олигонуклеотиде с 3'3'-связью последовательности могут быть идентичными, например 5'-ОЭШ-3'3'-ОЭШ-5', или различными, например 5'-ОЭЮ-3'3'-ОЭ№-5'. Кроме того, химическая модификация различных частей олигонуклеотида, так же как соединяющий их линкер, могут различаться. Так как поглощение коротких олигонуклеотидов, по-видимому, менее эффективно, чем длинных олигонуклеотидов, соединение двух или более коротких последовательностей приводит к улучшенной иммунной стимуляции. Длина коротких олигонуклеотидов предпочтительно составляет 2-20 нуклеотидов, более предпочтительно 3-16 нуклеотидов, но наиболее предпочтительно 5-10 нуклеотидов. Предпочтительными являются связанные олигонуклеотиды, имеющие два или более несвязанных 5'-концов.
Частичные последовательности олигонуклеотидов можно также связывать ненуклеотидными линкерами, в частности абазическими линкерами (б-спейсерами), звеньями триэтиленгликоля или звеньями гексаэтиленгликоля. Другие линкеры включают в себя алкиламинолинкеры, такие как С3, С6, С12аминолинкеры, и также алкилтиоловые линкеры, такие как С3 или С6-тиоловые линкеры. Олигонуклеотиды можно связывать также ароматическими остатками, которые в дальнейшем можно заменить алкильными или замещенными алкильными группами.
Олигонуклеотиды могут содержать также удвоенное или утроенное звено (С1еи Кекеагсй, 81ег1шд, УА), в частности, такие олигонуклеотиды с 3'3'-связями. Удвоенное звено в одном из вариантов осуществления может основываться на 1,3-бис-[5-(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2цианоэтил)-(ЦЦ-диизопропил)]фосфорамидит. Утроенное звено в одном из вариантов осуществления может основываться на введении трис-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2цианоэтил)-(ЦЦ-диизопропил)]фосфорамидита. Разветвление олигонуклеотидов множественными удвоенными, утроенными или другими умножающими звеньями приводит к дендримерам, являющимся дополнительным вариантом осуществления по настоящему изобретению. Олигонуклеотиды могут также содержать линкерные звенья, получаемые пептид-модифицирующими или олигонуклеотидмодифицирующими реагентами (С1еи Кекеагсй, 81ег1шд, УА). Кроме того, линкеры могут содержать один или несколько неприродных аминокислотных остатков, соединенных пептидными (амидными) связями.
Другой возможностью для связи олигонуклеотидов является перекрестное связывание гетероциклических оснований (Уегта 8. е! а1 (1998) Аиии Рет Вюсйет 67:99-134; раде 124). Еще одной возможностью является связь между группой сахара одной последовательности с гетероциклическим основанием другой части последовательности (1уег е! а1. (1999) Сигг Орш Мо1 Тйегареибск 1:344-58; раде 352).
Различные олигонуклеотиды, содержащие необычные связи, синтезированы общепризнанными способами и могут быть соединены вместе ои-1ше во время твердофазного синтеза. В качестве альтернативы, их можно соединить вместе после синтеза отдельных частичных последовательностей.
СрС-фосфоротиоатные олигонуклеотиды с сильной стимулирующей активностью в мышиной системе имеют тенденцию показывать более низкую активность в иммунных клетках человека или других, не относящихся к грызунам. ДНК, содержащая данные мотивы (Τί.Ό)ΜΝ или КЭССУ 1Υ2Ν, сильно стимулирует периферические клетки крови человека к продукции ΙΕΝ-α.
В соответствии с изобретением обнаружено, что подгруппы иммуностимулирующих СрСолигонуклеотидов оказывают существенные иммуностимулирующие эффекты на клетки человека, такие как РВМС, что позволяет предполагать, что такие иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды являются эффективными терапевтическими средствами для вакцинации человека, иммунотерапии рака, иммунотерапии астмы, общего улучшения иммунной деятельности, улучшения гематопоэтического восста
- 17 008741 новления после облучения или химиотерапии и других иммуномодулирующих вариантов применения.
Как применяют здесь, термины обработка, лечить или лечение, когда их применяют по отношению к нарушению, такому как инфекционное заболевание, рак, аллергия или астма, относятся к профилактическому лечению, увеличивающему устойчивость субъекта к развитию заболевания (например, к инфекции патогеном) или, другими словами, уменьшающему вероятность того, что у субъекта разовьется заболевание (например, он станет инфицированным патогеном), так же как к лечению заболевания после того как у субъекта разовьется заболевание, чтобы бороться с заболеванием (например, уменьшить или прекратить инфекцию) или чтобы предупредить заболевание от ухудшения.
Таким образом, иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды в некоторых аспектах по изобретению полезны в качестве вакцины для лечения субъекта, страдающего аллергией или астмой, инфекцией, вызванной инфекционным организмом, или раком, для которого идентифицирован специфический опухолевый антиген, или подверженного риску их развития. Иммуностимулирующие СрОолигонуклеотиды, таким образом, можно вводить субъекту в соединении с антигеном или аллергеном для лечения инфекции, аллергии, астмы или рака. Альтернативно и в дополнение иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды можно давать самостоятельно без антигена или аллергена для защиты против инфекции, аллергии, или рака, или можно вводить с другими терапевтическими средствами. Иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды можно вводить также с другими терапевтическими средствами. Повторные дозы могут позволить более длительную защиту.
Субъект, подверженный риску, как применяют здесь, является субъектом, имеющим любой идентифицируемый риск воздействия вызывающего инфекцию патогена или аллергена или риск развития злокачественной опухоли. Например, субъектом, подверженным риску развития инфекции, может являться субъект, планирующий поездку в район, где обнаружен конкретный тип инфекционного агента, или им может являться субъект, вследствие образа жизни или медицинских процедур подверженный воздействию жидкостей организма, которые могут содержать инфекционные организмы, или непосредственно организма, или им может являться любой субъект, живущий в районе, где обнаружен инфекционный организм или аллерген. Субъекты, подверженные риску развития инфекции, также включают в себя полные популяции, которым медицинские организации рекомендуют вакцинацию конкретным антигеном инфекционного организма. Если антиген является аллергеном, и у субъекта развиваются аллергические ответы на данный конкретный антиген, и субъект может быть подвержен воздействию антигена, например во время сезона опыления, тогда данный субъект является подверженным риску развития аллергического ответа. Субъект, подверженный риску развития аллергии или астмы, подразумевает субъектов, идентифицированных как страдающих аллергией или астмой, но не имеющих активного заболевания во время лечения иммуностимулирующими СрО-олигонуклеотидами. Субъект, подверженный риску развития аллергии или астмы, также подразумевает субъектов, считающихся подверженными риску развития аллергии или астмы из-за генетических факторов или факторов внешней среды.
Субъектом, подверженным риску развития рака, является субъект, имеющий высокую вероятность развития рака. Данные субъекты включают в себя, например, субъектов, имеющих генетическую аномалию, для которой показана корреляционная связь с повышенной вероятностью развития рака, субъектов, подверженных воздействию ассоциированных с раком веществ, таких как табак, асбест или другие химические токсины, и субъектов, которые ранее лечились от рака и находятся в выраженной ремиссии. Когда подверженного развитию рака субъекта лечат иммуностимулирующими СрО-олигонуклеотидами и, необязательно, антигеном, специфическим для типа рака, риску развития которого подвержен субъект, субъект может быть способен убивать раковые клетки при их развитии. Если у субъекта начинает формироваться опухоль, субъект развивает специфический иммунный ответ против опухолевого антигена.
В дополнение к применению иммуностимулирующих СрО-олигонуклеотидов для профилактического лечения изобретение также относится к применению иммуностимулирующих СрОолигонуклеотидов для лечения субъектов, страдающих инфекцией, аллергией, астмой или раком.
Субъект, страдающий инфекцией, является субъектом, подвергавшимся воздействию инфекционного патогена и имеет острые или хронические детектируемые уровни патогена в организме. Иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды можно применять с антигеном или другой терапией или без них для поднятия врожденного или антиген-специфического системного иммунитета или иммунитета слизистых оболочек, способного уменьшать уровень инфекционного патогена или уничтожать его. Инфекционное заболевание, как применяют здесь, представляет собой заболевание, развивающееся вследствие присутствия чужеродного микроорганизма в организме. Особенно важно развивать эффективные вакцинные стратегии и способы лечения для защиты поверхностей слизистых оболочек организма, являющихся первичным участком входа патогена.
Субъект, страдающий аллергией, является субъектом, способным развивать аллергическую реакцию в ответ на аллерген. Аллергия относится к приобретенной гиперчувствительности к веществу (аллергену). Аллергические состояния включают в себя в качестве неограничивающих примеров экзему, аллергические риниты или острый насморк, поллиноз, конъюнктивит, бронхиальную астму, аллергическую астму, уртикарную сыпь (крапивницу), пищевые аллергии и другие атопические состояния.
- 18 008741
Аллергии, как правило, вызваны образованием антител 1дЕ против безопасных аллергенов. Цитокины, индуцируемые системным введением или введением на слизистые оболочки иммуностимулирующих СрС-олигонуклеотидов, преимущественно относятся к классу, называемому ТЫ (примерами являются 1Ь-12, ΙΡ-10, ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-γ), и индуцируют и гуморальный, и клеточный иммунные ответы. Другим основным типом иммунного ответа, ассоциированным с продукцией цитокинов ΙΕ-4 и ΙΕ-5, является иммунный ответ, называемый Т112. Как правило, аллергические заболевания, по-видимому, вызваны иммунными ответами Т112-типа. Основываясь на способности иммуностимулирующих СрСолигонуклеотидов, описанных здесь, сдвигать иммунный ответ субъекта от преобладающего Т112 (связанного с продукцией антител ΙβΕ и аллергией) к сбалансированному ответу Т112/ТЫ (являющемуся защитным против аллергических реакций), можно вводить субъекту эффективную дозу иммуностимулирующих СрС-олигонуклеотидов для лечения астмы и аллергии.
Таким образом, иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды имеют значительную терапевтическую полезность в лечении аллергических состояний и астмы. Уровни ТЪ2-цитокннов, особенно ΙΕ-4 и ΙΕ-5, повышены в дыхательных путях страдающих астмой субъектов. Данные цитокины стимулируют важные аспекты астматического воспалительного ответа, включая переключение изотопов Ι§Ε, хемотаксис и активацию эозинофилов и рост тучных клеток. ТЫ-цитокины, особенно ΙΕΝ-γ и ΙΕ-12, могут подавлять формирование ТЪ2-клонов и продукцию ТЪ2-цитокинов. Астма относится к заболеваниям респираторной системы, характеризующимся воспалением, сужением дыхательных путей и повышенной реактивностью дыхательных путей к вдыхаемым веществам. Астма часто, хотя не исключительно, ассоциирована с атопическими или аллергическими симптомами. Таким образом, астма включает в себя аллергическую астму и не аллергическую астму.
Субъект, страдающий от рака, является субъектом, имеющим детектируемые злокачественные клетки. Опухоль может являться злокачественной или незлокачественной опухолью. Раковые заболевания или опухоли включают в качестве неограничивающих примеров рак желчных путей; рак мозга; рак молочной железы; рак шейки матки; хориокарциному; рак ободочной кишки; эндометриальный рак; рак пищевода; рак желудка; интраэпителиальные неоплазии; лимфомы; рак печени; рак легкого (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный); меланому; нейробластомы; рак полости рта; рак яичника; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; рак прямой кишки; саркомы; рак кожи; рак яичка; рак щитовидной железы и рак почки, так же как другие карциномы и саркомы. В одном из вариантов осуществления рак представляет собой лейкоз ворсистых клеток, хронический миелолейкоз, кожный Тклеточный лейцкоз, множественную миелому, фолликулярную лимфому, злокачественную меланому, плоскоклеточную карциному, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря или рак ободочной кишки.
Субъект означает человека или позвоночное животное, включая в качестве неограничивающих примеров собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, индейку, курицу, примата, например обезьяну, и рыбу (аквакультурные виды), например лосося. Таким образом, соединения можно применять для лечения рака и опухолей, инфекций и аллергии/астмы у людей и субъектов, не относящихся к человеку. Рак является одной из главных причин смерти животных - спутников человека (например, кошек и собак).
В случаях, когда СрС-олигонуклеотид вводят вместе с антигеном, субъект может быть подвержен воздействию антигена. Как применяют здесь, термин «подвержен воздействию» относится к активной стадии приведения субъекта в контакт с антигеном или к пассивному воздействию антигена на субъекта ίη νίνο. Способы активного приведения субъекта в контакт с антигеном хорошо известны в данной области. Как правило, антиген вводят непосредственно субъекту любыми способами, такими как внутривенное, внутримышечное, оральное, чрескожное, на слизистую оболочку, интраназальное, интратрахеальное или подкожное введение. Антиген можно вводить системно или местно. Способы введения антигена и иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида более детально описаны ниже. Субъект, пассивно подверженный воздействию антигена, становится доступным для воздействия иммунных клеток в организме. Субъект может пассивно подвергаться воздействию антигена, например, посредством входа чужеродного патогена в организм или посредством развития опухолевой клетки, экспрессирующей чужеродный антиген на своей поверхности.
Способы, в которых субъект пассивно подвержен воздействию антигена, могут особенно зависеть от распределения по времени введения иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида. Например, для субъекта, подверженного риску развития опухоли или инфекционного заболевания, или аллергического или астматического ответа, субъекту можно вводить иммуностимулирующий СрС-олигонуклеотид на регулярной основе, когда риск является наибольшим, например, во время сезона аллергии или после воздействия вещества, вызывающего рак. Кроме того, иммуностимулирующий СрС-олигонуклеотид можно вводить путешественникам перед их поездкой в зарубежные страны, где они подвержены риску воздействия инфекционных агентов. Подобным образом, иммуностимулирующий СрС-олигонуклеотид можно вводить солдатам или гражданскому населению при риске воздействия биологического оружия для индукции системного иммунного ответа или иммунного ответа слизистых оболочек на антиген, когда и
- 19 008741 если субъект подвержен его воздействию.
Антиген, как применяют здесь, представляет собой молекулу, способную провоцировать иммунный ответ. Антигены включают в себя в качестве неограничивающих примеров клетки, экстракты клеток, белки, полипептиды, пептиды, полисахариды, полисахаридные конъюгаты, пептидные и непептидные миметики полисахаридов и других молекул, низкомолекулярные молекулы, липиды, гликолипиды, углеводы, вирусы и вирусные экстракты, и многоклеточные организмы, такие как паразиты и аллергены. Термин антиген в широком смысле относится к любому типу молекулы, узнаваемой иммунной системой хозяина как чужеродной. Антигены включают в себя в качестве неограничивающих примеров опухолевые антигены, микробные антигены и аллергены.
Опухолевый антиген, как применяют здесь, представляет собой соединение, такое как пептид или белок, связанное с поверхностью опухолевой или раковой клетки и способное провоцировать иммунный ответ в окружении молекулы МНС. Опухолевые антигены можно получить из раковых клеток получением грубых экстрактов раковых клеток, например, как описано в СоНсн Р.А. с1 а1. (1994) Сапсег Кек 54:1055-8, или частичной очисткой антигенов, или рекомбинантным способом, или синтезом известных антигенов 0е ηονο. Опухолевые антигены включают в себя в качестве неограничивающих примеров антигены, экспрессированные рекомбинантным способом, их иммуногенную часть или целую опухолевую или раковую клетку. Такие антигены можно выделить или получить рекомбинантным или любыми другими способами, известными в данной области.
Как применяют здесь, термины «раковый антиген» или «опухолевый антиген» применяют попеременно по отношению к антигенам, которые дифференциально экспрессированы раковыми клетками и, таким образом, могут быть использованы для нацеливания на раковые клетки. Раковые антигены представляют собой антигены, потенциально способные стимулировать предположительно опухолеспецифические иммунные ответы. Некоторые из данных антигенов кодированы, но необязательно экспрессированы нормальными клетками. Такие антигены можно охарактеризовать как молчащие в норме (т.е. не экспрессированные) в нормальных клетках, такие, которые экспрессированы только на конкретных стадиях дифференцировки, и такие, которые временно экспрессированы, такие как антигены эмбриона и плода. Другие раковые антигены кодированы мутантными клеточными генами, такие как онкогены (например, активированный онкоген гак), генами супрессоров (например, мутантный р53), гибридные белки, полученные при внутренних делециях или хромосомных транслокациях. Еще другие раковые антигены могут быть кодированы вирусными генами, такими, которые несут опухолевые РНК- или ДНК-вирусы.
Микробный антиген, как применяют здесь, представляет собой антиген микроорганизма и включает в себя в качестве неограничивающих примеров вирусы, бактерии, паразиты и грибы. Такие антигены включают в себя интактный микроорганизм, так же как природные изоляты и их фрагменты или производные и также синтетические соединения, идентичные или подобные природным антигенам микроорганизмов и индуцирующие иммунный ответ, специфический для данного микроорганизма. Соединение является подобным природному антигену микроорганизма, если оно индуцирует иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный) на природный антиген микроорганизма. Такие антигены общеупотребительны в данной области и хорошо известны обычным специалистам в данной области.
Вирусы, обнаруженные у человека, включают в себя в качестве неограничивающих примеров Ке1гохтйае (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как Н1У-1 (на который ссылаются также как на НТЬУ-ΙΙΙ, ЬАУ или НТЬУ-Ш/ЬАУ или Н1У-111; и другие изоляты, такие как Н1У-БР); Рюотатш0ае (например, полиовирусы, вирус гепатита А; энтеровирус, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Са1сгхш0ае (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Тодатшбае (например, вирус конского энцефалита, вирусы краснухи); Натгхтбае (например, вирусы лихорадки Денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Сο^οпаν^^^άае (например, коронавирусы); КйаЬйохтйае (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); РПохтйае (например, вирусы Эбола); Рагашухохтйае (например, вирусы парагриппа, вирус свинки, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Огйютухохтйае (например, вирусы гриппа); Βικυ/πνίΓίώ^ (например, вирусы Хантаан, буньявирусы, флебовирусы и найровирусы); Агеиа ттйае (вирусы геморрагической лихорадки); Кеоттйае (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Вотахтйае; Нераάпаν^^^άае (вирус гепатита В); Рагхохтйае (парвовирусы); Рарохахтйае (вирусы папилломы, вирусы полиомы); АйегюттОае (большинство аденовирусов); Негректшбае (вирус простого герпеса (Н8У) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (СМУ), вирус герпеса); Рохтшбае (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); Ыботтбае (например, вирус африканской лихорадки свиней) и неклассифицированные вирусы (например, возбудитель гепатита дельта (считающийся дефектным сателлитом вируса гепатита В); гепатита С; Норволк и родственные вирусы и астровирусы).
И грамположительные, и грамотрицательные бактерии служат антигенами для позвоночных животных. Такие грамположительные бактерии включают в себя в качестве неограничивающих примеров виды Рак1еиге11а, виды §1арйу1ососс1 и виды 81гер1ососсик. Грамотрицательные бактерии включают в себя в качестве неограничивающих примеров ЕксйепсЫа со11, виды РкеиОототк и виды 8а1тог1е11а. Конкретные инфекционные бактерии включают в себя в качестве неограничивающих примеров Не1юоЬас1ег ру1опк. Воггейа ЬигдйогГеп. Бед^еИа рпеитοрЫ1^а, виды МусоЬас1епа (например, М. 1иЬегси1ок1к, М.
- 20 008741 аушт, М. т1гасе11и1аг, М. каизазп, М. догбопае), 8!ар1у1ососсиз аигеиз, №1ззепа допоггйоеае, №1ззепа тешпдй1б1з, Ыз!ег1а топосу!одепез, 8!гер!ососсиз руодепез (8!гер!ососсиз группы А), 8!гер!ососсиз ада1асйае (8!гер!ососсиз группы В), 8!гер!ососсиз (группы ушбапз), 81гер!ососсиз Гаесайз, 8!гер!ососсиз Ьоу1з, 81гер!ососсиз (анаэробные виды), 81гер!ососсиз рпеитошае, патогенные виды Сатру1оЬас!ег, виды Еп!егососсиз, Наеторйбиз тПиен/ае, ВасШиз аи!йгас1з, СогупеЬас!егшт б1рй!йепае, виды СогупеЬас!егшт, Егуз1ре1о1йпх гйизюра!Ыае, С1оз1пбшт регГгтдепз, С1оз1пбшт !е!аш, Еп!егоЬас!ег аегодепез, К1еЬз1е11а рпеитошае, Раз!иге11а ти1!ос1ба, виды Вас!его1без, РизоЬас!ейит пис1еа!ит, 8!гер!оЬасШиз топШГогтз, Тгеропета ра1йбит, Тгеропета рейепие, Ьер!озрпа, К1ске!!з1а и Асйпотусез 1згаеШ.
Примеры грибов включают в себя Сгур!ососсиз пеоГогтапз, Н1з!ор1азта сарзи1а!ит, Сосс1бю1без 1ттй1з, В1аз!отусез бегтабйб1з, Сй1атуб1а !гасйотабз, Сапб1ба а1Ысаиз.
Другие инфекционные организмы (например, протисты) включают в себя виды Р1азтобшт, такие как Р1азтоб1ит Га1арагит, Р1азтобшт та1апае, Р1азтобшт оуа1е и Р1азтобшт у1уах, и Тохор1азта допбп. Переносимые с кровью и/или тканевые паразиты включают в себя виды Р1азтобшт, ВаЬез1а т1сгой, ВаЬез1а б1уегдепз, Ье1зйташа !горюа, виды Ье1зйтап1а, Ье1зйтата ЬгахШепз1з, Ье1зйташа бопоуаш, Тгурапозота датЫепзе и Тгурапозота гйобез1епзе (сонная африканская болезнь), Тгурапозота сги/ί (болезнь Шагаса) и Тохор1азта допбп.
Другие значимые с медицинской точки зрения микроорганизмы широко описаны в литературе, например см. С.О.А Тйотаз, Мебюа1 МюгоЬю1оду, Вабйеге Тшба11, Огеа! Вгйат 1983, которая приведена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Аллерген относится к веществу (антигену), которое может индуцировать аллергический или астматический ответ у чувствительного субъекта. Список аллергенов огромный и может включать пыльцу, яды насекомых, перхоть животных, пыль, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин). Природные аллергены, аллергены животных и растений включают в себя в качестве неограничивающих примеров белки, специфические для следующих родов: Сашпе (Сашз ГашШапз); ЭегтаЮрйадо1без (например, ^е^ша!оρйадо^без Гайпае); РеНз (Рейз ботезйсиз); АтЬгоз1а (АтЬгоз1а айетйзГойа); Ьойцт (например, Ьойцт регеппе или Ьойцт тийгйогцт); Сгур!отепа (СгурЮтепа _)арошса); АЙетапа (АЙетапа а1!ета!а); А1бег; А1пиз (А1пиз дийшоаза); Ве!и1а (Ве!и1а уеггисоза); Оиегсиз (Оиегсиз а1Ьа); О1еа (О1еа еигора); Апе11йз1а (Аг1ет1з1а уц1дапз); Р1ап!адо (например, Р1ап!адо 1апсео1а!а); Рапе!апа (например, Рапе!апа оГйстайз или Рапе!апа ]иба1са); В1а!!е11а (например, В1а!!е11а дегтатса); Ар1з (например, Ар1з тийгйогцт); Сиргеззиз (например, Сиргеззиз зетрегуйепз, Сиргеззиз апхошса и Сиргеззиз тасгосагра); йпирегиз (например, .йпирегиз заЬто1без, .йпирегиз уйд1шапа, .йпирегиз сошшишз и йпирегиз азйе1); Тйиуа (например, Тйиуа опегИайз); Сйатаесурапз (например, Сйатаесурапз оЬ!иза); Репр1апе1а (например, Рейр1апе!а атепсапа); Адгоругоп (например, Адгоругоп герепз); 8еса1е (например, 8еса1е сегеа1е); Тййсит (например, Тййсит аезйуцт); Оас(у11з (например, Оас(уПз д1отега!а); Рез!иса (например, Рез!иса е1а!юг); Роа (например, Роа рга!епз1з или Роа сотргезза); Ауепа (например, Ауепа зайуа); Но1сиз (например, Но1сиз 1апа!из); Ап1йохап!йит (например, Ап1йохап!йцт обога!ит); АггйепаИегцт (например, Аггйепа!йегцт е1айиз); Адгозйз (например, Адгозйз а1Ьа); РЫеит (например, РЫеит рга!епзе); РПа1аг1з (например, РПа1аг1з агипбтасеа); Разра1ит (например, Разра1ит по!а!ит); 8огдйцт (например, 8огдйцт Йа1ерепз1з) и Вготиз (например, Вготиз тегппз).
Антиген может являться в основном очищенным. Термин в основном очищенный, как применяют здесь, относится к антигену, например, полипептиду, в основном свободному от других белков, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе. Специалист в данной области может очистить полипептидные антигены с применением обычных способов очистки белков. В основном чистый полипептид часто дает одну главную полосу в невосстанавливающем полиакриламидном геле. В случае частично гликозилированных полипептидов или полипептидов, имеющих несколько стартовых кодонов, в невосстанавливающем полиакриламидном геле может существовать несколько полос, но они формируют отличительный рисунок для данного полипептида. Чистоту полипептидного антигена можно также определить секвенированием Ν-конца. Другие типы антигенов, такие как полисахариды, низкомолекулярные, миметики и т.д., относятся к изобретению и, необязательно, могут быть в основном чистыми.
Олигонуклеотиды по изобретению можно вводить субъекту с противомикробным средством. Противомикробное средство, как применяют здесь, относится к природному или синтетическому соединению, способному убивать или ингибировать инфекционные микроорганизмы. Тип противомикробного средства, применимого по изобретению, зависит от типа микроорганизма, которым субъект инфицирован или подвержен риску быть инфицированным. Противомикробные средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров противобактериальные средства, противовирусные средства, противогрибковые средства и противопаразитарные средства. Такие фразы как «противомикробное средство», «противобактериальное средство», «противовирусное средство», «противогрибковое средство», «противопаразитарное средство» и «средство для уничтожения паразитов» имеют твердо установившиеся значения для обычных специалистов в данной области и определены в обычных медицинских текстах. Коротко, противобактериальные средства убивают или ингибируют бактерии и включают в себя антибиотики, так же как другие синтетические или природные вещества, обладающие подобными функциями.
- 21 008741
Антибиотики представляют собой низкомолекулярные молекулы, производимые как вторичные метаболиты клетками, такими как микроорганизмы. Как правило, антибиотики повреждают одну или несколько бактериальных функций или структур, специфических для микроорганизма и не присутствующих в клетках-хозяевах. Противовирусные средства можно выделить из природных источников или синтезировать и применять для убивания или ингибирования вирусов. Противогрибковые средства применяют для лечения поверхностных грибковых инфекций, так же как условно-патогенных и первичных системных грибковых инфекций. Противопаразитарные средства убивают или ингибируют паразитов.
Противопаразитарные средства, на которые ссылаются также как на средства для уничтожения паразитов, включают в себя в качестве неограничивающих примеров альбендазол, амфотерицин В, бензнидазол, битионол, хлорохин НС1, хлорохина фосфат, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, дилоксанида фуроат, эфлорнитин, фуразолидон, глюкокортикоиды, галофантрин, йодохинол, ивермектин, мебендазол, мефлохин, меглумин антимониат, меларсопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, паромомицин, пентамидина изетионат, пиперазин, празиквантел, примахина фосфат, прогуанил, пирантела памоат, пириметамин-сульфонамиды, пириметаминсульфадоксин, хинакрин НС1, хинина сульфат, хинидина глюконат, спирамицин, стибоглюконат натрия (глюконат сурьмы натрия), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметропримсульфаметоксазол и трипарсамид, некоторые из которых применяют самостоятельно или в сочетании с другими.
Противобактериальные средства убивают бактерии или ингибируют их рост или функцию. Большой класс противобактериальных средств представляет собой антибиотики. На антибиотики, эффективные для уничтожения или ингибирования широкого ряда бактерий, ссылаются как на антибиотики широкого спектра действия. Другие типы антибиотиков предпочтительно эффективны против бактерий грамположительного или грамотрицательного классов. На данные типы антибиотиков ссылаются как на антибиотики узкого спектра действия. На другие антибиотики, эффективные против отдельного организма или заболевания и не эффективные против других типов бактерий, ссылаются как на антибиотики ограниченного спектра действия. Иногда противобактериальные средства классифицируют по их первичному способу воздействия. Как правило, противобактериальные средства являются ингибиторами синтеза клеточной стенки, ингибиторами клеточной мембраны, ингибиторами белкового синтеза, ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот или функциональными ингибиторами и конкурентными ингибиторами.
Противовирусные средства представляют собой соединения, предупреждающие инфекцию клеток вирусами или репликацию вируса внутри клетки. Противовирусных средств намного меньше, чем противобактериальных средств, так как процесс вирусной репликации так тесно связан с репликацией ДНК в клетке-хозяине, что неспецифические противовирусные средства часто являются токсичными для хозяина. В процессе вирусной инфекции существует несколько стадий, которые можно блокировать или ингибировать противовирусными средствами. Данные стадии включают в себя присоединение вируса к клетке-хозяину (иммуноглобулин или связывающие пептиды), декапсидацию вируса (например, амантадин), синтез или трансляцию вирусной мРНК (например, интерферон), - репликацию вирусной РНК или ДНК (например, нуклеозидные аналоги), созревание белков нового вируса (например, ингибиторы протеаз) и почкование и высвобождение вируса.
Аналоги нуклеотидов представляют собой синтетические соединения, подобные нуклеотидам, но имеющие неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. После попадания нуклеотидных аналогов в клетку они подвергаются фосфорилированию, образуя трифосфатную форму, конкурирующую с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. После включения трифосфатной формы нуклеотидного аналога в растущую цепь нуклеиновой кислоты оно приводит к необратимому присоединению вирусной полимеразы и, таким образом, терминации цепи. Аналоги нуклеотидов включают в себя в качестве неограничивающих примеров ацикловир (применяемый для лечения от вируса простого герпеса и вируса ветряной оспы), ганцикловир (применяемый для лечения от цитомегаловируса), идоксуридин, рибавирин (применяемый для лечения от респираторно-синцитиального вируса), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин, зидовудин (азидотимидин), имиквимод и резимиквимод.
Интерфероны представляют собой цитокины, секретируемые клетками, инфицированными вирусом, так же как иммунными клетками. Интерфероны действуют посредством связывания со специфическими рецепторами на клетках, соседних с инфицированными клетками, вызывая в клетке изменение, защищающее ее от инфекции вирусом, α- и β-интерферон также индуцируют экспрессию молекул МНС класса I и класса II на поверхности инфицированной клетки, приводя к увеличенной презентации антигена для узнавания иммунными клетками хозяина, α- и β-интерфероны доступны в рекомбинантных формах, и их применяют для лечения хронической инфекции гепатитом В и С. В дозах, эффективных для противовирусного лечения, интерфероны обладают тяжелыми побочными эффектами, такими как лихорадка, дисфория и потеря веса.
Противовирусные средства, применяемые по изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров иммуноглобулины, амантадин, интерфероны, аналоги нуклеозидов и ингибиторы
- 22 008741 протеаз. Конкретные противовирусные средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров Ацеманнан; Ацикловир; Ацикловир Натрия; Адефовир; Аловудин; Алвирцепт Судотокс; Амантадина Гидрохлорид; Аранотин; Арилдон; Атевирдина Мезилат; Авридин; Цидофовир; Ципамфилин; Цитарабина Г идрохлорид; Делавирдина Мезилат; Десцикловир; Диданозин; Дизоксарил; Эдоксудин; Энвираден; Энвироксим; Фамцикловир; Фамотина Гидрохлорид; Фиацитабин; Фиалуридин; Фозарилат; Фоскарнет Натрия; Фосфонет Натрия; Ганцикловир; Ганцикловир Натрия; Идоксиуридин; Кетоксал; Ламивудин; Лобукавир; Мемотина Гидрохлорид; Метисазон; Невирапин; Пенцикловир; Пиродавир; Рибавирин; Римантадина Гидрохлорид; Саквинавира Мезилат; Сомантадина Гидрохлорид; Соривудин; Статолон; Ставудин; Тилорона Гидрохлорид; Трифлуридин; Валацикловира Гидрохлорид; Видарабин; Видарабина Фосфат; Видарабина Фосфат Натрия; Вироксим; Зальцитабин; Зидовудин и Зинвироксим.
Противогрибковые средства пригодны для лечения и предупреждения от инфекционных грибов. Иногда противогрибковые средства классифицируют по механизму действия. Некоторые противогрибковые средства действуют как ингибиторы клеточной стенки посредством ингибирования синтазы глюкозы. Они включают в себя в качестве неограничивающих примеров базиунгин/ЕСВ. Другие противогрибковые средства действуют посредством дестабилизации целостности мембраны. Они включают в себя в качестве неограничивающих примеров имидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконакол, так же как ЕК 463, амфотерицин В, ВАУ 389502, МК 991, прадимицин, ИК 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибковые средства действуют посредством разрушения хитина (например, хитиназа) или иммуносупрессии (крем 501).
Иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды можно сочетать с другими терапевтическими средствами, такими как адъюванты, для усиления иммунных ответов. Иммуностимулирующий СрСолигонуклеотид и другое терапевтическое средство можно вводить одновременно или последовательно. Когда другие терапевтические средства вводят одновременно, их можно вводить в том же или отдельных составах, но вводить в одно и то же время. Другие терапевтические средства вводят последовательно друг с другом и с иммуностимулирующим СрС-олигонуклеотидом, когда введение других терапевтических средств и иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида разделены во времени. Более конкретно, иммуностимулирующий СрС-олигонуклеотид можно вводить до или после введения (или воздействия) по меньшей мере одного другого терапевтического средства. Разделение по времени между введением данных соединений может быть вопросом минут, или может длиться дольше. Другие терапевтические средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров адъюванты, цитокины, антитела, антигены и т. д.
Композиции по изобретению можно вводить также с адъювантами, отличными от нуклеиновых кислот. Адъювант, отличный от нуклеиновой кислоты, представляет собой любую молекулу или соединение, за исключением описанных здесь иммуностимулирующих СрС-олигонуклеотидов, которое может стимулировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Адъюванты, отличные от нуклеиновых кислот, включают в себя, например, адъюванты, создающие эффект депо, иммуностимулирующие адъюванты и адъюванты, создающие эффект депо и стимулирующие иммунную систему.
Иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды полезны также в качестве адъювантов для слизистых оболочек. Ранее обнаружено, что и системный иммунитет, и иммунитет слизистых оболочек индуцируют введением СрС-нуклеиновых кислот на слизистые оболочки. Таким образом, олигонуклеотиды можно вводить в сочетании с другими адъювантами для слизистых оболочек.
Иммунный ответ можно также индуцировать или усиливать совместным введением или колинеарной экспрессией цитокинов (Вие1ег & МиШдап, 1996; С1ю\у е! а1., 1997; СекДег е! а1., 1997; е! а1.,
1997; К1т е! а1., 1997) или костимулирующих молекул, таких как В7 (1^а8ак1 е! а1., 1997; Тыщ е! а1., 1997), с иммуностимулирующими СрС-олигонуклеотидами. Термин цитокин применяют как общее название разнообразной группы растворимых белков и пептидов, действующих как гуморальные регуляторы в концентрациях от нано- до пикомолярных, и в нормальных или патологических условиях модулирующих функциональную активность отдельных клеток и тканей. Данные белки также напрямую опосредуют взаимодействия между клетками и регулируют процессы, происходящие во внеклеточной среде. Цитокины включают в себя в качестве неограничивающих примеров интерлейкин-1 (1Ь-1), 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, ΣΠ-10, 1Ь-12, ΣΠ-15, ΣΠ-18, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор роста (СМ-С8Е), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Е), ΣΕΝ-γ, ΣΕΝ-α, ΣΕΝβ, фактор некроза опухолей (Т№), ТСЕ-β, Е1!-3-лиганд и СО40-лиганд. В дополнение к цитокинам СрСолигонуклеотиды можно применять в сочетании с антителами против конкретных цитокинов, такими как анти-1Ь-10 и анти-ТСЕ-β, так же как с ингибиторами циклооксигеназы, т.е. ингибиторами СОХ-1 и СОХ-2.
Олигонуклеотиды полезны также для переключения иммунного ответа с ТН2-иммунного ответа на ТЬ1-иммунный ответ. Это приводит к получению относительно сбалансированной ТН1/ТН2-среды. Переключение иммунного ответа с ТН2- на ТЬ1-иммунный ответ можно оценить измерением уровней цитокинов, полученных в ответ на нуклеиновую кислоту (например, посредством индукции моноцитарных клеток и других клеток для продукции ТЫ-цитокинов, включая ΣΕΝ-α). Переключение или изменение ба
- 23 008741 ланса иммунного ответа с ТН2- на ТЫ-ответ особенно полезно для лечения астмы. Например, эффективным количеством для лечения астмы может быть количество, пригодное для переключения ТН2-типа иммунного ответа, ассоциированного с астмой, на ТН1-тип ответа или сбалансированную Т111/Т112-среду. Уровни Т112-цитокинов. особенно ББ-4 и ББ-5, повышены в дыхательных путях страдающих астмой субъектов. Описанные здесь иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды вызывают повышение ТН1цитокинов, что помогает восстанавливать равновесие иммунной системы, предотвращать или уменьшать неблагоприятные эффекты, связанные с предпочтительным ТН2-иммунным ответом.
Переключение иммунного ответа с ТН2- на ТН1-иммунный ответ можно также оценить измерением уровней специфических изотипов иммуноглобулина. Например, у мышей 1дО2а ассоциирован с ТН1 иммунным ответом, а 1дО1 и 1дЕ ассоциированы с ТН2-иммунным ответом.
Иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды обладают уникальной способностью стимулировать клеточные выживание, дифференцировку, активацию и созревание дендритных клеток, и пригодны для способов ίη νίίτο, ίη νίνο и ех νίνο, вовлекающих дендритные клетки.
Иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды повышают также литическую активность натуральных клеток-киллеров и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС). АЭСС можно осуществлять с применением иммуностимулирующих СрО-олигонуклеотидов в сочетании с антителом, специфичным к клеточной мишени, такой как раковая клетка. Когда иммуностимулирующие СрОолигонуклеотиды вводят субъекту одновременно с антителом, иммунную систему субъекта индуцируют для убивания раковой клетки. Антитела, пригодные для процедуры АЭСС, включают в себя антитела, взаимодействующие с клеткой в организме. Многие такие антитела, специфические для клеточных мишеней, описаны в данной области и многие коммерчески доступны.
Иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды можно вводить также одновременно с противораковым лечением. Противораковое лечение включает в себя противораковые лекарственные средства, облучение и хирургические процедуры. Как применяют здесь, «противораковые медикаменты» относятся к средству, вводимому субъекту с целью лечения рака. Как применяют здесь, «лечение рака» предусматривает предупреждение развития рака, уменьшение симптомов рака и/или ингибирование роста развившейся опухоли. В других аспектах противораковые медикаменты вводят субъекту, подверженному риску развития рака, с целью уменьшения риска развития рака. Различные типы противораковых медикаментов описаны здесь. С целью данного описания противораковые медикаменты классифицированы как химиотерапевтические средства, иммунотерапевтические средства, противораковые вакцины, гормональное лечение и модификаторы биологического ответа.
Кроме того, способы по изобретению предназначены для охвата применения более чем одного противоракового лекарственного средства вместе с иммуностимулирующими СрО-олигонуклеотидами. В качестве примера, когда это целесообразно, иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды можно вводить и с химиотерапевтическим средством, и с иммунотерапевтическим средством. В качестве альтернативы, противораковый медикамент может охватывать иммунотерапевтическое средство и противораковую вакцину или химиотерапевтическое средство и противораковую вакцину, или химиотерапевтическое средство, иммунотерапевтическое средство и противораковую вакцину, все вводимые одному субъекту с целью лечения субъекта, страдающего от рака или подверженного риску его развития.
Химиотерапевтическое средство можно выбрать из группы, включающей в себя в качестве неограничивающих примеров метотрексат, винкристин, адриамицин, цисплатин, не содержащие сахаров хлорэтилнитрозомочевины, 5-фторурацил, митомицин С, блеомицин, доксорубицин, дакарбазин, таксол, фрагилин, Мегламин ОБА, валрубицин, кармустин и полиферпосан, ΜΜΙ270, ΒΑΥ 12-9566, ингибитор КА8фарнезилтрансферазы, ингибитор фарнезилтрансферазы, ММР, ΜТΑ/^Υ231514, ^Υ264618/Лометексол, Гламолек, С1-994, ТИР-470, Гикамтин/Топотекан, РКС412, Валсподар/Р8С833, Новантрон/Митроксантрон, Метарет/Сурамин, Батимастат, Е7070, ВСН-4556, С8-682, 9-АС, АО3340, АО3433, Инцел/УХ710, УХ-853, ΖΌ0101, Ι8Ι641, ΟΌΝ 698, ТА2516/Мармистат, ВВ2516/Мармистат, СОР 845, Ό2163, ΡΌ183805, ΌΧ8951ί, Лемонал ΌΡ2202, ЕК 317, Пицибанил/ОК-432, АЭ32/Валрубицин, Метастрон/производное стронция, Темодал/Темозоломид, Эвацет/липосомальный доксорубицин, Ютаксан/Паклитаксел, Таксол/Паклитаксел, Кселод/Капецитабин, Фуртулон/Доксифлуридин, Циклопакс/оральный паклитаксел, Оральный Таксоид, δΡϋ-077/Цисплатин, ΗΜΚ 1275/Флавопиридол, СР358(774)/ЕОЕК, СР-609(754)/ингибитор онкогена КА8, ΒΜδ-182751/оральную платину, ИЕТ (Тегафур/Урацил), Эргамизол/Левамизол, Енилурацил/776С85/5Еи-энхансер, Кампто/Левамизол, Камптозар/Иринотекан, Тумодекс/Ралитрексед, Лейстатин/Кладрибин, Паксекс/Паклитаксел, Доксил/липосомальный доксорубицин, Келикс/липосомальный доксорубицин, Флудара/Флударабин, Фармарубицин/Эпирубицин, ДепоЦит, ΖΌ1839, Би9553/Бис-Нафталимид, БИ 103793/Доластин, Кетикс/липосомальный доксорубицин, Гемзар/Гемцитабин, ΖΌ 0473/Анормед, ΥΜ 116, семена лодина, ингибиторы ί.ΌΚ4 и СЭК2, ингибиторы РАКР, 04809/Дексифосфамид, Ифес/Меснекс/Ифосфамид, Вумон/Тенипозид, Параплатин/Карбоплатин, Плантинол/цисплатин, Вепезид/Этопозид, ΖΌ 9331, Таксотер/Доцетаксел, пролекарство гуанина арабинозид, Аналог Таксана, нитрозомочевины, алкилирующие агенты, такие как мелфелан и циклофосфамид, Аминоглутетимид, Аспарагиназу, Бусульфан, Карбоплатин, Хлоромбуцил, Цитарабин НС1, Дактиномицин, Даунорубицин НС1, Эстрамустин фосфат натрия,
- 24 008741
Этопозид (УР16-213), Флоксуридин, Фторурацил (5-Ευ), Флутамид, Гидроксимочевина (гидроксикарбамид), Ифосфамид, Интерферон Альфа-2а, Альфа-2Ь, Лейпролида ацетат (аналог фактора высвобождения ЬНКН), Ломустин (ССМИ), Мехлорэтамин НС1 (азотный аналог горчичного газа), Меркаптопурин, Месну, Митотан (о.р'-ЭЭЭ), Митоксантрон НС1, Октреотид, Пликамицин, Прокарбазин НС1, Стрептозоцин, Тамоксифена цитрат, Тиогуанин, Тиотепа, Винбластина сульфат, Амсакрин (т-АМ8А), Азацитидин, Эритропоэтин, Гексаметилмеламин (НММ), Интерлейкин 2, Митогуазон (метил-САС; метилглиоксальбис-гуанилгидразон; МСВС), Пентостатин (2'-дезоксиформицин), Семустин (метил-ССИИ), Тенипозид (УМ-26) и Виндезина сульфат.
Иммунотерапевтическое средство может быть выбрано из группы, включающей в себя в качестве неограничивающих примеров Ритуксан, Рибутаксин, Герцептин, Квадрамет, Панорекс, ШЕС-У2В8, ВЕС2, С225, Онколим, 8МАКТ М195, АТКАСЕЫ, Оварекс, Бексар, ΕΌΡ-03, иор т6, ΜΌΧ-210, ΜΌΧ-11, ΜΌΧ-22, Ον103, 3622А94. анти-УЕСЕ, Зенапакс, Μ^Χ-220, Μ^Χ-447, МЕЕ!ММГ\Е-2. МЕЕ!ММГ\Е1, СЕАСГОЕ, Претаргет, ЫоуоМАЬ-С2, ТАГ С1ютаЬ-Н, СМ-250, ЕМО-72000, ЛимфоЦид, СМА 676, Монофарм-С, 4В5, иор е§Гг3, иор с5, ВАВ8, анти-ЕЬК-2, Χ1ΙΓΧ-2 60, А\А АЬ, 8МАКТ 1Э10 АЬ, 8МАКТ АВЬ 364 АЬ и IттиΚАIТ-СΕА.
Противораковую вакцину можно выбрать из группы, включающей в себя в качестве неограничивающих примеров ЕСЕ, антиидиотипические противораковые вакцины, антиген Ср75, СМК-вакцину против меланомы, конъюгированную с ганглиозидом вакцину МСУ, Нег2/пеи, оварекс, М-Уах, Ο-Уах, ЬУах, тератоп 8Тп-КНЬ, ВЕР25 (МИС-1), липосомальную идиотипическую вакцину, мелацин, вакцины с пептидными антигенами, токсин/антигенные вакцины, вакцину на основе МУА, РАСК, ВСС-вакцину, ТА-НРУ, ТА-СШ. ЭКС-вирус и [ттиСуЧ/ТНегаСАъ.
Применение иммуностимулирующих СрС-олигонуклеотидов в совокупности с иммунотерапевтическими средствами, такими как моноклональные антитела, способно увеличивать длительную выживаемость по ряду механизмов, предусматривающих значительное увеличение АЭСС (как обсуждалось выше), активацию ΝΚ-клеток и увеличение уровней ΣΕΝ-α. Нуклеиновые кислоты, когда их применяют в сочетании с моноклональными антителами, служат для снижения дозы антитела, необходимого для достижения биологического результата.
Изобретение относится также к способам индукции с применением иммуностимулирующих СрСолигонуклеотидов активации не специфического к антигену врожденного иммунного ответа и широкого спектра устойчивости к инфекционному заражению. Термин активация врожденного иммунного ответа, как применяют здесь, относится к активации иммунных клеток, отличных от В-клеток памяти, и может предусматривать, например, активацию моноцитов, нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток, ΝΚклеток и/или других иммунных клеток, которые могут отвечать антиген-независимым способом. Широкий спектр устойчивости к инфекционному заражению индуцируется, поскольку иммунные клетки находятся в активной форме и примированы для ответа на любое вторгающееся соединение или микроорганизм. Клетки необязательно должны быть специфически примированы против конкретного антигена. Это особенно полезно в биологической войне или в других условиях, описанных выше, таких как путешествия.
Иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды можно непосредственно вводить субъекту или одновременно с комплексом доставки нуклеиновой кислоты. Комплекс доставки нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, ассоциированную (например, ионно или ковалентно связанную с или инкапсулированную в) со средствами для направленной доставки (например, с молекулой, осуществляющей высокоаффинное связывание с клеткой-мишенью. Примеры комплексов доставки нуклеиновых кислот включают в себя нуклеиновые кислоты, ассоциированные со стерином (например, холестерин), липидом (например, катионный липид, виросома или липосома) или средством, специфически связывающим клетку-мишень (например, лиганд, узнаваемый специфическим рецептором клетки-мишени). Предпочтительные комплексы могут быть достаточно стабильными ίη νίνο для предотвращения значительного разъединения до интернализации клеткой-мишенью. Однако комплекс можно расщепить в подходящих условиях внутри клетки, высвобождая олигонуклеотид в функциональной форме.
Иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды, и/или антиген, и/или другие лекарственные средства можно вводить самостоятельно (например, в соляном растворе или буфере) или с применением любых доставляющих носителей, известных в данной области. Например, описаны следующие носители для доставки: Кохлеаты (СоиШ-Еодетйе е! а1., 1994, 1996); Эмульсомы (Уаисой е! а1., 1998, Ьо^е11 е! а1., 1997); КСЮМ (Мота! е! а1., 1993, Сщ1ккои е! а1., 1991, Ни е!., 1998, Могеш е! а1.,1999); Липосомы (СЫ1бег8 е! а1., 1999, М1сйа1ек е! а1., 1989, 1992, бе Нааи 1995а, 1995Ь); Живые бактериальные векторы (например, 8а1тοηе11а, ЕксйепсЫа соБ, бацилла Кальметта-Герена, 8Ыде11а, БасЮЬасШик) (Ноне е! а1., 1996, Роита1к е! а1., 1998, СЬаШеШ е! а1., 1993, 81отег е! а1., 1991, МщегИ е! а1., 1998); Живые вирусные векторы (например, коровьей оспы, аденовирус, простого герпеса) (СаШсЕт е! а1., 1993, 1995, Мокк е! а1., 1996, МщеШ е! а1., 1998, ΕΚχ^τ е! а1., 1988, Моттов е! а1., 1999); Микросферы (Сир!а е! а1., 1998, Киек е! а1., 1996, Ма1оу е! а1., 1994, Мооге е! а1., 1995, ΟΉηβηη е! а1., 1994, Ε1б^^бде е! а1., 1989); Нуклеиновые кислоты-вакцины (Εуηаи е! а1., 1993, Кик1ш е! а1., 1997, 8акак1 е! а1., 1998, Οкаба е! а1., 1997, кЬп е! а1., 1997); Полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан) (Натарта е! а1., 1998, 1аЬЬа1-С111 е! а1., 1998);
- 25 008741
Полимерные кольца (\Ууа(( е! а1., 1998); Протеосомы (Уапсо!! е! а1., 1998, Бо\\'е11 е! а1., 1988, 1996, 1997); Фторид Натрия (НакЫ е! а1., 1998); Трансгенные растения (Таске! е! а1., 1998, Макоп е! а1., 1998, Нац е! а1., 1995); Виросомы (С1иск е! а1., 1992, Мепдьагбь е! а1., 1995, Сгу/ е! а1., 1998); Вирусоподобные частицы (Лапд е! а1., 1999, Ье1Ы е! а1., 1998). Другие носители для доставки известны в данной области.
Термин «эффективное количество», как правило, относится к количеству, достаточному для осуществления желаемого биологического эффекта. Например, эффективное количество иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида, вводимого с антигеном для индукции иммунитета слизистых оболочек, представляет собой количество, необходимое, чтобы под действием антигена вызвать развитие ΙβΛ в ответ на антиген, тогда как такое количество, требуемое для индукции системного иммунитета, представляет собой количество, необходимое, чтобы под действием антигена вызвать развитие ^С в ответ на антиген. В сочетании с приведенными здесь объяснениями посредством выбора среди различных активных соединений и оценки факторов, таких как активность, относительная биодоступность, масса тела пациента, тяжесть неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, можно планировать эффективный режим профилактического или терапевтического лечения, не приводящий к существенной токсичности и еще вполне эффективный для лечения конкретного субъекта. Эффективное количество для любого конкретного применения может меняться в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, подлежащее лечению, конкретный вводимый иммуностимулирующий СрСолигонуклеотид, размер субъекта, или тяжесть заболевания или состояния. Обычный специалист в данной области может эмпирически определить эффективное количество конкретного иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида, и/или антигена, и/или другого терапевтического средства без требования проведения лишних экспериментов.
Дозы описанных здесь соединений для местного введения или введения на слизистые оболочки субъекта, как правило, находятся в диапазоне приблизительно от 10 мкг до 10 г на одно введение, в зависимости от того, что возможно ежедневное, еженедельное или ежемесячное применение, или с любым другим количеством времени между применениями, или как необходимо иначе. Более типично дозы для местного введения или введения на слизистые оболочки находятся в диапазоне приблизительно от 1 до 500 мг на введение и наиболее типично приблизительно от 1 до 100 мг, с 2-4 введениями, разделенными друг от друга сутками или неделями. Более типично дозы иммуностимулянта находятся в диапазоне приблизительно от 10 мкг до 100 мг на введение и наиболее типично от 100 мкг до 10 мг, с ежедневными или еженедельными введениями. Дозы для парентеральной доставки субъекту описанных здесь соединений с целью индукции антиген-специфического иммунного ответа, где соединения доставляют с антигеном, но не с другим лекарственным средством, обычно в 5-10000 раз превышают эффективную дозу для применений вакцинного адъюванта или иммунного стимулятора на слизистых оболочках, более типично превышают в 10-1000 раз и наиболее типично в 20-100 раз. Дозы описанных выше соединений для парентеральной доставки с целью индукции врожденного иммунного ответа или для увеличения АОСС, или для индукции антиген-специфического иммунного ответа, когда иммуностимулирующие СрСолигонуклеотиды вводят в сочетании с другими лекарственными средствами, обычно находятся в диапазоне приблизительно от 100 мкг до 10 г на введение, в зависимости от того, что возможно ежедневное, еженедельное или ежемесячное применение, или с любым другим количеством времени между применениями, или как необходимо иначе. Более типично парентеральные дозы для данных целей находятся в диапазоне приблизительно от 1 мг до 5 г на введение и наиболее типично приблизительно от 1 мг до 1 г, с 2-4 введениями, разделенными друг от друга сутками или неделями. Однако в некоторых вариантах осуществления парентеральные дозы для данных целей можно применять в диапазоне, в 5-10000 раз превышающем обычные дозы, описанные выше.
Для любого описанного здесь соединения терапевтически эффективное количество можно сначала определить на модельных животных. Терапевтически эффективную дозу можно определить также по данным для человека для других СрС-олигонуклеотидов, которые тестировали для людей (для людей проводят клинические испытания), и для соединений, известных как показывающие похожие фармакологические активности, таких как другие адъюванты, например, ЬТ и другие антигены, для целей вакцинации. Более высокие дозы могут требоваться для парентерального введения. Применяемую дозу можно уточнить на основе относительной биодоступности и активности вводимого соединения. Так как уточнение дозы для достижения максимальной эффективности, основанное на описанных выше способах, и другие способы хорошо известны в данной области, они полностью в компетенции обычных специалистов в данной области.
Композиции по изобретению вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые в общепринятой практике содержат фармацевтически приемлемые концентрации соли, буферных веществ, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и, необязательно, других терапевтических ингредиентов.
Для применения в лечении эффективное количество иммуностимулирующих СрСолигонуклеотидов или других лекарственных средств можно вводить субъекту любым способом, доставляющим соединение к желаемой поверхности, например местным, на слизистую оболочку, системным. Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно осуществлять любыми способами, известными специалистам в данной области. Предпочтительные пути введения включают в
- 26 008741 себя в качестве неограничивающих примеров оральный, парентеральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутриочаговый, внутриопухолевый, интраназальный, подъязычный, интратрахеальный, вдыхание, глазной, вагинальный и ректальный.
Для орального введения соединения (т.е. иммуностимулирующие СрО-олигонуклеотиды, антигены и/или другие терапевтические агенты) можно легко составить сочетанием активного соединения (соединений) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют составлять соединения по изобретению в форме таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и подобного для орального введения подлежащему лечению субъекту. Фармацевтические препараты для орального применения можно получить в виде твердого наполнителя, необязательно, размалывая полученную смесь и обрабатывая смесь гранул, после добавления подходящих добавок, если желательно, для получения оболочек таблеток или драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, такие наполнители, как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия и/или поливинилпирролидон (РУР). Если желательно, можно добавлять распадающиеся вещества, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или их соль, такую как альгинат натрия. Оральные составы можно составлять также в солевом растворе или буферах для нейтрализации внутренних кислых условий или можно вводить без каких-либо носителей.
Оболочки драже обеспечивают подходящими покрытиями. С данной целью можно применять концентрированные растворы сахара, необязательно содержащие гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты можно добавлять к покрытиям таблеток или драже для идентификации или для обозначения различных сочетаний доз активных соединений.
Фармацевтические препараты, которые можно применять орально, включают в себя заполненные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Заполненные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующих, таких как крахмалы, и/или скользящие вещества, такие как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы. Можно применять также микросферы, составленные для орального введения. Такие микросферы хорошо определены в данной области. Все составы для орального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения.
Для буккального введения композиции могут принимать форму таблеток или пастилок, составленных обычным способом.
Соединения можно вводить ингаляцией в легочный тракт, особенно в бронхи, и более конкретно, в альвеолы в глубине легкого с применением обычных устройств для ингаляции. Соединения можно доставлять в форме подачи аэрозольного спрея из упаковок под давлением или из распылителя с применением подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, углекислого газа или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением, единицу дозирования можно определять предоставлением клапана для доставки измеренного количества. Для доставки соединений субъекту можно применять аппараты для ингаляции. Аппарат для ингаляции, как применяют здесь, представляет собой любое приспособление для введения аэрозоля, так же как сухих порошковых форм соединений. Данный тип оборудования хорошо известен в данной области и описан в деталях, как в описании, найденном в Кештдои: ТНе 8с1еисе аиб Ргасбсе о£ Рйагтасу, 19'1' Ε6ίΐίοη, 1995, Мас РиЫ18Ыид Сотрат·, Еак(ощ Реиику1νаша, радек 1676-1692. Приспособления для ингаляции описаны также во многих патентах США, таких как патент США № 6116237.
«Порошок», как применяют здесь, относится к композициям, состоящим из тонко измельченных твердых частиц. Соединения предпочтительно относительно свободно пересыпаются, и их можно распределять в приспособлении для ингаляции с последующей ингаляцией субъекту, так что соединения достигают легких, что позволяет проникновение в альвеолы. «Сухой порошок» относится к порошковой композиции, обладающей таким содержанием влаги, что частицы легко распределяются в приспособлении для ингаляции для формирования аэрозоля. Содержание влаги, как правило, составляет менее 10% по массе (мас.%) воды, а в некоторых вариантах осуществления составляет ниже приблизительно 5 мас.% и предпочтительно менее чем 3 мас.%. Порошок можно составлять с полимерами и, необязательно, можно составлять с другими веществами, такими как липосомы, альбумин и/или другие носители.
Специалисты в данной области могут выбирать дозировку и системы доставки аэрозоля для конкретного терапевтического применения, такие как описаны, например, в СоЮз, I. Аегоко1к £ог бейуегу о£ (йегареибс анб бха^^^ю адеШк (о (йе гекрпа(огу (гас(, ίη Спбса1 Кеу1етек ίη Тйегареибс Эгид Сатег 8ук(етк, 6:273-313 (1990), и в Могещ Аегоко1 бокаде £огтк ааб (огтЫабощ, ίη Аегоко1к ίη Мебюше. РгшсЕ р1ек, ^^адηοк^к авб Тйегару, Могещ е( а1., Ебк., Е1кеу1ег, Атк(егбат, 1985.
- 27 008741
Соединения, если желательно доставлять их системно, можно составлять для парентерального введения посредством инъекции, например, посредством болюсного вливания или постоянных вливаний. Составы для инъекций можно представлять в форме однократной дозы, например, ампулы, или в контейнерах для множественных доз, с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать формулирующие средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или дисперсионные средства.
Фармацевтические составы для парентерального введения содержат водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений можно приготовить как соответствующие масляные суспензии для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Суспензия, необязательно, может также содержать подходящие стабилизаторы или средства, увеличивающие растворимость, что позволяет получение высоко концентрированных растворов.
В качестве альтернативы активные соединения могут присутствовать в форме порошка для составления перед применением с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой.
Соединения можно составлять также в ректальные или вагинальные композиции, такие как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие общепринятые основы для суппозитория, такие как кокосовое масло или другие глицериды.
В дополнение к описанным выше составам, соединения можно составлять также как препаратыдепо. Такие составы длительного действия можно составлять с подходящими полимерными или гидрофобными веществами (например, как эмульсию в подходящем масле) или ионообменными смолами или в виде труднорастворимых производных, например труднорастворимой соли.
Фармацевтические композиции могут содержать также подходящие твердофазные или гель-фазные носители или наполнители. Такие носители или наполнители включают в себя в качестве неограничивающих примеров карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Подходящими жидкими или твердыми формами фармацевтических препаратов являются, например, водные или солевые растворы для ингаляции, микроинкапсулированные, в составе кохлеатов, покрывающие микроскопические частицы золота, содержащиеся в липосомах, распыляемые, аэрозоли, осадки для имплантации в кожу или высушенные на остром предмете для процарапывания в кожу. Фармацевтические композиции также включают в себя гранулы, порошки, таблетки, покрытые таблетки (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с длительным высвобождением активных соединений, в которых обычно, как описано выше, применяют наполнители и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как разрыхлители, связующие, покрывающие средства, набухающие средства, скользящие вещества, ароматизаторы, подсластители или солюбилизаторы. Фармацевтические композиции пригодны для применения во множестве систем доставки лекарственных средств. Краткий обзор способов доставки лекарственных средств см. в Ьапдег К (1990) 8с1епсе 249:1527-33, что приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Иммуностимулирующие СрС-олигонуклеотиды и, необязательно, другие лекарственные средства и/или антигены можно вводить самостоятельно (чистыми) или в форме фармацевтически приемлемой соли. При применении в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, однако, фармацевтически не приемлемые соли можно легко применять для получения из них фармацевтически приемлемых солей. Такие соли включают в себя в качестве неограничивающих примеров полученные из следующих кислот: соляной, бромисто-водородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, п-толуолсульфоновой, винно-каменной, лимонной, метансульфоновой, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфоновой и бензолсульфоновой. Такие соли можно получить также как соли щелочных металлов или щелочно-земельные соли, такие как соли натрия, калия или кальция с группой карбоновой кислоты.
Пригодные буферные агенты включают в себя уксусную кислоту и соль (1-2% мас./об.); лимонную кислоту и соль (1-3% мас./об.); борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас./об.) и фосфорную кислоту и соль (0,8-2% мас./об.). Пригодные консерванты включают в себя хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимеросал (0,004-0,02% мас./об.).
Фармацевтические композиции по изобретению содержат эффективное количество иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида и, необязательно, антигены и/или другие терапевтические средства, необязательно, заключенные в фармацевтически приемлемый носитель. Термин фармацевтически приемлемый носитель означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, пригодных для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин носитель означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты
- 28 008741 фармацевтических композиций также способны смешиваться с соединениями по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что не возникает взаимодействия, существенно снижающего желаемую фармацевтическую эффективность.
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, которые никаким образом не следует рассматривать как ограничивающие.
Примеры
Пример 1. Аналоги О1)\ С-класса индуцируют секрецию ΙΡΝ-α и активность ТБК9 человека ΐη νΐίΐΌ.
В данных сериях экспериментов аналоги О1)\ С-класса по изобретению тестировали ΐη νίΐΐΌ по их способности стимулировать периферические мононуклеарные клетки крови человека (РВМС) для секреции ΙΡΝ-α и стимулировать клетки НЕК293, стабильно трансфицированные репортерной конструкцией с ТБК9 человека и ΝΡ-кВ для демонстрации передачи сигнала ТБК9.
О)[)\ приобретены в Вюзргшд (РгаикЕш!, Сегтапу) и проверены на идентичность и чистоту в Со1еу Ρ1ι;·ιπιι;·κ'υιι1κ'ίΐ1 СтЪН (ВапдепИбб, Сегтапу). О1)\ растворяли в фосфатно-солевом буфере (81§ша, Сегтапу) и хранили при -20°С. Все разведения проводили с апирогенными реагентами. В тест О1)\ включа ли следующие:
128
611
614
620
331
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
Т*С_О*Т*С*О*Т*Т*Т*Т*А*С*С*О*С*О*Т*С*О*Т*С*С*С*О Т*С*С*Т*С*6*Т*Т*Т*Т*А*С_0*0*С_0*С*С_6*Т*6*С*С*0 Т*С*О*Т*С*С*Т*Т*Т*Т*А*С_6*0*С*0*С*С_С*Т*0*С*С*6 Т*С*О*Т*С_О*Т*Т*Т*Т*А*С_О*О*С*О*С*С_О*Т*О*С*С*О Т*С*О*С_О*А*С*О*Т*Т*С_6*С*С*О*С_С*С*Т*С*С*С*О Т*С*С*С_С*Т*С*0*Т*Т*С_0*0*С*6*С_С*С*Т*С*С*С*С Т*С*0*С_0*А*С*6*Т*Т*С_0*0*С*6*С_6*Т*С*0*С*С*С Т*С*С*С_О*А*С*О*Т*Т*С_С*а*С*О*О*С_Т*С*О*С*С*О т*с*о_с*о*т*с*о*т*т*с_о*о*с*о*с_с*с*т*о*с*с*о т*с*о*с*о_т*с*о*т*т*с_о*о*с*б*с_о*с*т*о*с*с*о Т*С*6*С*0_А*С*0*Т*Т*С_0*С*С*6*С_С*Т*С*0*С*С*0 Т*С*С*С*0_А’*С*0*Т*Т*С_0*0*С*0*0*С_Т*С*0*С*С*0 Т*С*0_С*0*А*С*0*Т*Т*С_0*0*С*6*С_0*Т*С*6*С*С*0 Т*С*О_С*С*А*С*О*Т*Т*С_С*О*С*О*О*С_Т*С*О*С*С*6 Т*С*0*С_6*Т*С*0*Т*Т*С_0*0*С*С*С_0*Т*С*0*С*С*0 Т*С*6*С_0*Т*С*0*Т*Т*С_0*6*С*0*6*С_Т*С*0*С*С*0 Т*С*6*С*О_Т*С*6*Т*Т*С_С*О*С*О*С_О*Т*С*О*С*С*С т*с*о*с*о__т*с*о*т*т*с_с*о*с*о*о*с_т*с*о*с*с*о (8Ε9ΙϋΝΟ:48) (8Ε(2ΙΟΝΟ:43) (8Е<3 Ю N0:43) (8Ε(2ΙϋΝΟ:43) (8Е() ГО N0:27) (8Εζ) ГО N0:30) (8Ε(}ΙΟΝΟ:28) (8Е<2 Ιϋ N0:29) (8Ε(2Π)ΝΟ:30) (8Ε(2ΙΟΝΟ:30) (8Е(2ГОМ):28) (8ΕΟΙϋΝΟ:29) (8ΕρΐϋΝΟ:28) (8Ε9ΙΟΝΟ:29) (8Ε9ΙϋΝΟ:31) (8Εζ) ГО N0:32) (8ΕΡΙΌΝΟ:31) (8ΕΡΙΟΝΟ:32) где * означает фосфоротиоатную связь, и _ означает фосфодиэфирную связь. СрС-О^N 2006 (ТССТССТТТТСТССТТТТСТССТТ, 8ΕΡ И) NО:56) применяли в качестве положительного контроля для активации сигнала ТБК9. СрС-О^N С-класса 2429 (ТССТССТТТТСССССССССССС, 8Ер И) №: 53) применяли в качестве положительного контроля для индукции ΙΡΝ-α. Не-СрС-О^N 1982 (ТССАССАСТТСТСТСАССТТ, 8ЕР И) NО:18) применяли в качестве отрицательного контроля.
Препараты лейкоцитной пленки периферической крови здоровых доноров мужского и женского пола получены из В1ооб Вапк о£ Фе ипгуегзйу о£ Ой88е1бог£ (Сегтапу) и из них выделены РВМС центрифугированием на Фиколл-Гипаке (81§та). Выделенные: РВМС ресуспендировали в культуральной среде ΚΡΜΙ 1640 (В1о\АФиакел, Ве1дшт), дополненной 5% (об./об.) инактивированной нагреванием АВ сывороткой человека (Вю^РФакег) или 10% (об./об.) инактивированной нагреванием РС8, 2 мМ Вглутамином (ВюАФ Факел), 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (!пу|1годеп, Каг1згиРе, Сегтапу).
Свежие РВМС пересевали в 96-луночные круглодонные плашки и инкубировали 48 ч с О1)\ в концентрации, как указано, во влажном инкубаторе при 37°С. Культуральные супернатанты собирали и, если не использовали немедленно, замораживали при -20°С пока не потребуются.
Количества ΙΡΝ-α в супернатантах оценивали с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А), разработанного с применением коммерчески доступных антител (А1ех18 СтРН, СгипРегд, Сегтапу). О1)\ 128, 331-344, 611 и 620 тестировали с РВМС четырех различных доноров, а О1)\ 614 тестировали с РВМС трех различных доноров.
Стабильно трансфицированные клетки НЕК293 применяли для анализа ТБК9 человека по репортерному гену, экспрессируя репортерную генетическую конструкцию с рецептором ТБК9 человека и ΝΡ
- 29 008741 кВ. Клетки инкубировали с ΟΏΝ 16 ч при 37°С во влажном инкубаторе. Каждую точку данных получали в трех повторах. Клетки лизировали и анализировали активность репортерного гена. Индексы стимуляции рассчитывали по отношению к активности репортерного гена в среде без добавления ΟΏΝ.
Результаты. Типичные результаты представлены на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 показано, что ΟΏΝ Скласса 332, 333 и 334 индуцируют большие количества ΙΕΝ-α (обычно приблизительно 2000-2500 пг/мл), когда присутствуют в концентрации 1 мкМ. Количество ΙΕΝ-α, индуцированного данными ΟΏΝ, значительно превосходит количество ΙΕΝ-α, индуцированное такой же концентрацией ΟΏΝ 2006 или 1982. На фиг. 1 показано также, что ΟΏΝ С-класса 332, 333 и 334 индуцируют значительные величины сигнальной активности ТЬК9 (обычно с индексом стимуляции приблизительно 15), когда присутствуют в концентрации 10 мкМ. Величина сигнальной активности ТЙК9, индуцируемой данными ΟΏΝ, составляла около половины сигнальной активности ТЬК9, индуцируемой такой же концентрацией ΟΏΝ 2006. По существу, такие же результаты получены для ΟΏΝ 128 и 335-344.
На фиг. 2 показано, что ΟΏΝ С-класса 611, 614 и 620 индуцируют даже более значительные количества ΙΕΝ-α (обычно приблизительно 3000-4000 пг/мл), когда присутствуют в концентрации 1 мкМ. Количество ΙΕΝ-α, индуцированного данными ΟΏΝ, значительно превосходит количество ΙΕΝ-α, индуцированное ΟΏΝ 2006 или 1982 в такой же концентрации. На фиг. 2 показано также, что ΟΏΝ С-класса 611, 614 и 620 индуцируют значительные величины сигнальной активности ТЙК9 (обычно с индексом стимуляции приблизительно 10-20), когда присутствуют в концентрации 10 мкМ. Величина сигнальной активности ТЬК9, индуцируемой данными ΟΏΝ, снова составляла около половины сигнальной активности ТЬК9, индуцируемой ΟΏΝ 2006 в такой же концентрации.
ΟΏΝ 611 (8Ер ΙΟ ΝΟ:43), 614 (8Ер ΙΟ ΝΟ:43) и 620 (8Ер ΙΟ ΝΟ:43) также сравнивали с ΟΏΝ 2429 (одним из первых описанных олигонуклеотидов С-класса, содержащих палиндром). Данные новые ΟΏΝ С-класса показали более высокую активность в анализе ТЬК9 человека, тогда как индукция ΙΕΝ-α была такой же, как и для 2429 (фиг. 3).
Вместе взятые, результаты данных экспериментов показывают, что аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению эффективно индуцируют секрецию ΙΕΝ-α и активность ТЬК9 человека ш уйго.
Пример 2. Дополнительные аналоги ΟΏΝ С-класса индуцируют секрецию ΙΕΝ-α ш νίΐΐΌ.
В данных сериях экспериментов дополнительные аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению тестировали 1п уйго по их способности индуцировать секрецию ΙΕΝ-α. Аналоги ΟΏΝ С-класса в данных экспериментах частично характеризуются присутствием АТ-богатых прерывистых ров, содержащих остатки б-спейсера вместо обычных нуклеотидных остатков.
ΟΏΝ получали, как в примере 1. В тест ΟΏΝ включали следующие:
645
646 инвертированных повтоТ*С*Сг*Т*С Ο*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Α*Α*Τ*Α*Τ*Τ*Τ*Α*Τ*Τ*Α Т*С*О*Т*С О*Т*Т*Т*Т*С*А*А*Т*А*Т*Т*Т*А*Т*Т*С Т*С*(3*Т*С О*Т*Т*Т*Т*Т*А*А*Т*А*Т*С*С*А*Т*Т*А Т*С*6*Т*С_0*Т*Т*Т*Т*А*С*0*0*С*0*Ь*Ь*Ь*Т*0*С*С*0 Т*С*6*Т*С_0*Т*Т*Ь*Ь*А*С*0*0*С*0*Ь*Ь*Ь*Т*0*С*С*0 Т*С*6*Т*С о*т*т*т*т*с*о*о*с*с*о*ь*ь*с*с*о*с*с*о
8ΕΡΠ)ΝΟ:59 8Ε(2ΙΙ)ΝΟ:50 8ΕΡΠ)ΝΟ:58 8ΕρΐϋΝΟ:45 8Ε<3ΙΟΝΟ:38 8Ε9Π)ΝΟ:54
647
649
650
651 где * означает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь, _ означает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь и Ь представляет собой б-спаейсер.
РВМС человека получали и обрабатывали способом, аналогичным примеру 1.
Количества ΙΕΝ-α в супернатантах оценивали с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ΈΕΙ8Α) способом, аналогичным примеру 1.
Результаты. ΟΏΝ С-класса 645, 646 и 647, частично характеризующиеся присутствием АТ-богатых прерывистых инвертированных повторов, индуцируют умеренные количества ΙΕΝ-α (обычно приблизительно 1200-1500 пг/мл), когда присутствуют в концентрации 1 мкМ. Количество ΙΕΝ-α, индуцированного данными ΟΏΝ, значительно превосходит количество ΙΕΝ-α, индуцированное такой же концентрацией ΟΏΝ 2006 или 1982. ΟΏΝ С-класса 649, 650 и 651, частично характеризующиеся присутствием АТбогатых прерывистых инвертированных повторов, индуцируют большие количества ΙΕΝ-α (обычно приблизительно 2000-2500 пг/мл), когда присутствуют в концентрации 1 мкМ. Количество ΙΕΝ-α, индуцированного данными ΟΏΝ, значительно превосходит количество ΙΕΝ-α, индуцированное такой же концентрацией ΟΏΝ 2006 или 1982.
Вместе взятые результаты данных экспериментов показывают, что аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению, частично характеризующиеся присутствием АТ-богатых прерывистых инвертированных повторов, содержащих остатки б-спейсера вместо обычных нуклеотидных остатков, эффективно индуцируют секрецию ΙΕΝ-α ш νίΐΐΌ.
Пример 3. Дополнительные аналоги ΟΏΝ С-класса индуцируют секрецию ΙΕΝ-α и активность ТЬК9 человека ш уйго.
- 30 008741
В данных сериях экспериментов аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению тестировали т уйго по их способности стимулировать РВМС для секреции ΙΡΝ-α и стимулировать клетки НЕК293, стабильно трансфицированные репортерной конструкцией с ТБК9 человека и ΝΡ-кВ, для демонстрации передачи сигнала ТБК9. Основной протокол описан в примере 1, за исключением того, что в тест ΟΏΝ включали следующие:
664
376
801
893
894
882
2290
2292
2337
2341
2357
Т*С*С*А*С*6*Т*С*6*А*С*С;*Т*(3*А*С*6*Т*С
Т*С*С*А*С*С*Т*С*С*А*С*(3*Т*С*А*С*С
Т*С_С*Т*С_6*А*С_С*Т*Т*С_С*С*С*С*С*С_е*Т*(3*С*С*С
Т*С*С*Т*С_6*Т*А*С_С*(;*С*С*С*С_С*Т*С*С*С*С
Т*С*С*Т*С_С*Т*Т*А*С_С*С*С*С*С*С_С*Т*6*С*С*С
Т*С*С*А*С*6*Т*С*6*А*С*0*Т*С*А*С*6*Т*Т
Т*С*С*Т*С__С*А*С_С*А*Т*С_С*С*С*С*С*С_С*Т*6*С*С*С
Т*С*6*Т*С*б*А*С*6*А_Т_С*С*С*С*(3*С*С*е*Т*С*С*С*С
Т*С*С*А*С_С*Т*С*С*А*С_С*Т*(3*А*С*С*Т*Т
Т*С*С*А*С_С*Т*С*6*А*С*С*Т_(3*А*С*6*Т*Т т*с*с*т*с_с*т*т*т*А*с_е*с*с*б*с*с_е*т*с*с*с*с*т (8Е(2 ГО N0:62) (8Εζ)ΙΟΝΟ:61) (8Е() ГО N0:65) (8Ε(2ΙΏΝΟ:66) (8Е<2 ГО N0:67) (8ЕС2 ГО N0:63) (8ΕΟΙϋΝΟ:64) (8ΕΟΙϋΝΟ:64) (8Е0 ГО N0:63) (5Ε(2Π)ΝΟ:63) (8Е(2 ГО N0:68) где * означает фосфоротиоатную связь, и _ означает фосфодиэфирную связь.
ΟΏΝ в различных концентрациях тестировали анализом ТБК9 по репортерному гену. ЕС 50 (концентрацию ΟΏΝ, при которой эффект составляет 50% от максимального эффекта) рассчитывали с применением 81дтаР1о! (81дтаР1о! 2002 для Штбомз версии 8.0). Максимальный индекс стимуляции (тах 8Ι) рассчитывали как частное между наивысшим значением для всех концентраций, тестированных для любого ΟΏΝ, и средним контрольным. Результаты показаны в табл. 1, где видно, что обычно индексы стимуляции лежали в диапазоне 10-30.
Таблица 1
СрО-ΟΏΝ С-класса по изобретению активируют ТРК9 человека
ΟϋΝ ЕС50 (нМ) тах 81
801 130 29
2341 2900 27
2357 1900 19
882 2700 15
893 3500 11
894 2800 11
2290 1200 11
2337 3900 11
664 1290 5
2292 2700 5
376 230 2
РВМС человека при 48-часовой инкубации с данными СрО-ΟΏΝ С-класса секретируют большие количества ΙΡΝ-α. Типичные количества ΙΡΝ-α после инкубации с ΟΏΝ в концентрациях, меньших или равных 1 мкМ, лежали в диапазоне 3000-4000 пг/мл. Кривые ответа для ΙΡΝ-α в данных экспериментах очень похожи на кривые, показанные на фиг. 2.
Пример 4. Аналоги ΟΏΝ С-класса индуцируют антиген-специфический иммунный ответ т у1уо.
В данных сериях экспериментов аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению тестировали т у1уо одновременно с вакцинацией мышей. Обнаружено, что ΟΏΝ С-класса по изобретению увеличивают титры общих антиген-специфических ^О и ^О2а (ТН1-подобных ^О у мышей), так же как ответы антигенспецифических цитотолитических Т-лимфоцитов (СТБ) до некоторой степени, по меньшей мере, сравнимой с СрО-ΟΏΝ В-класса 2006.
ΟΏΝ получали, как в примере 1.
Для всех экспериментов применяли самок мышей ВАБВ/с (в возрасте 6-8 недель). Животных приобретали в СНаг1ез КХег Сапаба ХиеЬес, Сапаба) и содержали в микроизоляторах в отделе ухода за животными ΟΡπαπ Нозрйа1 КезеагсН ШзИШе, Стс 8йе.
- 31 008741
Для всех анализов ίη νίίτο применяли наивные спленоциты мышей ВАЬВ/с. Животных анестезировали изофлуораном и умерщвляли смещением шейных позвонков. Селезенки удаляли в асептических условиях и помещали в фосфатно-солевой буфер (РВ8) + 0,2% бычьего сывороточного альбумина (81дша С11С1шса1 Сотрапу). Селезенки гомогенизировали и спленоциты ресуспендировали в среде для культивирования клеток ВРМ1 1640 (ЫГс Тсс11по1ощс5. Стапб Ιδίαηά. ΝΥ), дополненной 2% нормальной мышиной сывороткой (Себаг1апе ЬаЬота1от1ек, Θηίατίο, Сапаба), раствором пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация 1000 Ед./мл и 1 мг/мл, соответственно; 81дта С11е1шса1 Сотрапу) и 5х10-5 М (βмеркаптоэтанолом (8щта С.’11е1шса1 Сотрапу).
Мышей ВАЬВ/с (п=10/группу) иммунизировали 1 мкг поверхностного антигена гепатита В (НВкАд) субтипа аб (1п1етпабопа1 Еп/ушек, СА) самостоятельно или в сочетании с 1-100 мкг СрС-ΘΌΝ 2006, 608, 611, 618 или СрС-ΘΌΝ 620. У животных отбирали кровь и проводили вторичную иммунизацию через 4 недели после первичной иммунизации. Через 2 недели после вторичной иммунизации 5 животных из каждой группы умерщвляли и удаляли селезенки для анализов СТЬ.
Антитела (тотальные 1дО, 1дС1 и 1дС2а), специфические к НВкАд (анти-НВк) детектировали и определяли количественно анализом ЕЬ18А с конечными разведениями, который проводили в трех повторах на образцах от отдельных животных. Конечные титры определяли как наибольшее разведение плазмы, дающее значение оптической плотности (ΘΌ 450) в два раза выше, чем для неиммунной плазмы со значением отсечки 0,05. Это представлено как средние групповые титры (СМТ)±8ЕМ.
Анализы СТЬ проводили в соответствии с обычным способом. Коротко, селезенки удаляли через 4 недели после иммунизации и гомогенизировали до суспензии отдельных клеток в среде для культивирования клеток ВРМ1 1640 (Ь1Ге Тесйпо1од1ек, Отапб 1к1апб, ΝΥ), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЫГе Тесйпо1од1ек), раствором пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация 1000 Ед./мл и 1 мг/мл, соответственно; 81дта, 1Мпе, ИК), и 5х10-5 М β-меркаптоэтанолом (8щта) (Полная среда КРМ1 1640). НВкАд-специфичные лимфоциты в суспензиях спленоцитов (3х106 клеток/мл) рестимулировали в течение 5 суток инкубацией с линией мышиных клеток (р815-8), экспрессирующей НВкАд. После рестимуляции способность лимфоцитов убивать клетки, экспрессирующие НЬкАд, определяли с применением анализа высвобождения 51 Сг. Результаты представлены как % специфического лизиса при различных соотношениях эффектор:мишень (Е:Т).
Результаты. Типичные результаты представлены на фиг. 4-6. Как показано на фиг. 4, титры тотальных 1дС для ΘΌΝ 2006 и ΘΌΝ 620 являлись дозозависимыми и обнаружено, что они составляли приблизительно 5х103 и 6,5х103, соответственно, при дозе ΘΌΝ 1 мкг. Обнаружено, что титры тотальных 1дО для ΘΌΝ 2006 и ΘΌΝ 620 составляют приблизительно 1х104 при дозе ΘΌΝ 100 мкг. Как показано на фиг. 5, ΘΌΝ 2006 и ΘΌΝ 620, оба, значительно повышают 1дО2а (ТЫ-подобные 1дО у мышей) по сравнению с контрольными не-Срб-ΟΌΝ 2137 (Т6СТ0СТТТТ6Т6СТТТТ6Т0СТТ; 8ЕО ΙΌ ΝΟ:60). Конкретно, титры 1дО2а для ΟΌΝ 2006, 620 и 2137, при введении каждого в дозах 10 мкг, составляли приблизительно 3х103, 6х103 и 3х102 соответственно. Как показано на фиг. 6, активность СТЬ при соотношении Е:Т 100:1 для ΟΌΝ 2006 и 620 значительно превышала контрольную при вводимых дозах 10 и 100 мкг. Например, процент специфического лизиса для ΟΌΝ 2006, 260 и 2137, при введении каждого в дозе 10 мкг, составлял приблизительно 26, 24 и 12%.
Вместе взятые, результаты данных экспериментов показывают, что аналоги ΟΌΝ С-класса по изобретению эффективно индуцируют антиген-специфические иммунные ответы ш νί\Ό.
Пример 5. Аналоги ΟΌΝ С-класса улучшают выживаемость и уменьшают объем опухоли на модели опухоли ш νί\Ό.
В данных сериях экспериментов аналоги ΟΌΝ С-класса по изобретению тестировали ш νί\Ό на мышиной модели нейробластомы. Обнаружено, что аналоги ΟΌΝ С-класса по изобретению значительно улучшают и общую выживаемость, и тяжесть опухоли.
ΟΌΝ получали, как в примере 1.
Мышей ВАЬВ/с получали, как в примере 4.
Мышам ВАЬВ/с подкожно инъецировали в левый бок на сутки 0 1х106 клеток нейробластомы (№ито-2а) (например, АТСС ССЬ-131, Атепсап Туре СиНите Со11ес1юп, Мапаккак, УА). С 10-25 суток мышам ежедневно делали инъекции подкожно РВ8, СрО 2006, СрО 620 или контрольного не-СрО-ΟΌΝ 2137. Измеряли процент выживания и объем опухоли.
Результаты. Типичные результаты представлены на фиг. 7. Как показано на фиг. 7А, мыши, обработанные 100 мкг ΟΌΝ 620, через 80 суток имели степень выживаемости 50% по сравнению с соответствующими степенями выживаемости 0-20% для ΟΌΝ 2006, ΟΌΝ 2137 или РВ8. Кроме того, как показано на фиг. 7В, мыши, обработанные 100 мкг ΟΌΝ 620, имели объем опухоли с острым максимумом приблизительно 1000 мм3 на 28 сутки и снижением до 0 мм3 на 38 сутки. Для сравнения, мыши, обработанные ΟΌΝ 2137 или РВ8, имели более быстрый, монотонный рост опухоли.
Вместе взятые, результаты данных экспериментов показывают, что аналоги ΟΌΝ С-класса по изобретению эффективно улучшают выживаемость и уменьшают объем опухоли на модели опухоли ш νί\Ό.
- 32 008741
Пример 6. Тканевой обмен и распределение аналогов ΟΏΝ С-класса.
Исследования поглощения/распределения аналогов ΟΏΝ С-класса по изобретению показали благоприятный метаболизм и клиренс из органов, таких как почки и печень, после подкожной обработки мышей.
Мышей разделяли на группы по 5, и каждой мыши вводили 250 мкг ΟΏΝ в однократной подкожной дозе на 0 сутки. В различные моменты времени органы (печень, почки и селезенку) удаляли и выделяли олигонуклеотиды и их метаболиты для количественного определения содержания.
Результаты. ΟΏΝ по настоящему изобретению (например, 611 и 620) показали меньшее накопление в органах по сравнению с известными полностью фосфоротиоатными палиндромными ΟΏΝ, такими как 2429. Например, на 3 сутки уровни в почках ΟΏΝ 611, 620 и 2429 составляли приблизительно 70±28, 30±18 и 90±10 мг/кг соответственно. Подобным образом, на 3 сутки уровни в печени ΟΏΝ 611, 620 и 2429 составляли приблизительно 45±15, 28±12 и 150±15 мг/кг соответственно.
Вместе взятые, результаты данных экспериментов показывают, что аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению обладают благоприятным метаболизмом и клиренсом из органов, где в других обстоятельствах ΟΏΝ могут накапливаться.
Пример 7. Физические характеристики аналогов ΟΏΝ С-класса.
В данной серии экспериментов ΟΏΝ 2429, 611, 620, 608 (Т*С*6*Т*С_С*Т*Т*Т*Т*С_С*С*С_С*С*6*С_С*С*С*С; ЗЕО Ю ΝΟ: 51) /то (Т*С*й*Т*Г с:*т*Ф*т*Т*С’ ίΐ*(Ζ*Γ*ίΊ*ί3*Γ*Γ Я*С*С*й ЯКО ТП ΝΟ* 53) и 618 1 с. и, ϋ ч и с (л, ш ми. зз) характеризовали с применением эксклюзионной хроматографии, капиллярного электрофореза в геле (ССЕ), УФ термической денатурации и жидкостной хроматографии высокого давления (НРЕС). Когда ΟΏΝ 611 и ΟΏΝ 620 исследовали эксклюзионной хроматографией (225 мкМ в РВ8), для каждого соединения наблюдали только один пик, т.е. каждый олигонуклеотид элюировали как мономер. Напротив, когда ΟΏΝ 608 и 618 (содержащие каждый палиндромную последовательность) исследовали эксклюзионной хроматографией, для каждого олигонуклеотида наблюдали два пика, согласно с присутствием межмолекулярного димера помимо мономера. Однако исследования УФ термической денатурацией показали, что ΟΏΝ 611 и ΟΏΝ 620 обладают вторичной структурой в растворе, согласно с внутримолекулярной структурой шпильки. Считают, что структура шпильки возникает из-за инвертированного повтора в последовательностях 611 и 620. При НРБС и ССЕ, как правило, наблюдали более острые пики по сравнению с ΟΏΝ 2429 и ΟΏΝ 608.
Вместе взятые, результаты данных экспериментов показывают, что аналоги ΟΏΝ С-класса по изобретению проявляют тенденцию к формированию внутримолекулярных вторичных структур и не формируют межмолекулярных комплексов ΐη νίίτο в рассматриваемой концентрации, тогда как палиндромсодержащие ΟΏΝ С-класса по изобретению проявляют тенденцию к ассоциации в комплексы посредством межмолекулярных взаимодействий. Однако, по-видимому, ΐη νΐνο концентрации ΟΏΝ, достигаемые во внутриэндосомальной среде, достаточно высоки для поддержания дуплексов или даже комплексов ΟΏΝ высшего порядка, включая дуплексы или даже комплексы высшего порядка аналогов ΟΏΝ Скласса по изобретению.
Эквиваленты
Приведенное выше письменное описание считают достаточным, чтобы позволить специалисту в данной области практически использовать изобретение. Различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным здесь, становятся очевидными специалистам в данной области из приведенного выше описания и попадают в рамки прилагаемой формулы изобретения. Преимущества и объекты изобретения необязательно охвачены в каждом варианте осуществления по изобретению.

Claims (33)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая
    ТСОТСОТТТТАСООСОССОТТОССО (8Е(2 ГО N0:44).
  2. 2. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по π. 1, по существу, состоящая из ТСОТСОТТТТАСООСОССОТТОССО (8Е(2 ГО N0:44).
  3. 3. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по π. 1, где по меньшей мере одна межнуклеотидная связь модифицирована фосфоротиоатом.
  4. 4. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по π. 1, где каждая межнуклеотидная связь модифицирована фосфоротиоатом.
  5. 5. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по п.1, где по меньшей мере один нуклеотид в олигонуклеотиде представляет собой замещенный или модифицированный пурин или пиримидин.
  6. 6. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по и. 5, где замещенный пиримидин представляет собой С5- или Сб-замещенный пиримидин.
  7. 7. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по п.5, где замещенный пурин представляет собой С8- или С7-замещенный пурин.
  8. 8. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по п.5, где замещенный или модифицированный
    -33 008741 пурин или пиримидин выбран из группы, состоящей из 5-замещенных цитозинов, 6-замещенных цитозинов, Ш-замещенных цитозинов, 5-азацитозина, 2-меркаптоцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, аналогов цитозина с конденсированными кольцевыми системами и производных урацила, производных тимина, 7-деазагуанина, 7-деаза-7-замещенного гуанина, 7-деаза-8-замещенного гуанина, 7-деаза-8азагуанина, гипоксантина, №-замещенных гуанинов, 5-амино-3-метил-3Н,6Н-тиазоло[4,5-0]пиримидин2,7-диона, 2,6-диаминопурина, 2-аминопурина, пурина, индола, замещенных аденинов, 8-замещенного гуанина и 6-тиогуанина.
  9. 9. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по п.5, где замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, состоящей из 5-метилцитозина, 5-фторцитозина, 5хлорцитозина, 5-бромцитозина, 5-йодцитозина, 5-гидроксицитозина, 6-гидроксицитозина, 5гидроксиметилцитозина, 5-дифторметилцитозина и незамещенного или замещенного 5алкинилцитозина, №-этилцитозина, Ν,Ν'-пропиленцитозина, феноксазина, 5-фторурацила, 5бромурацила, 5-бромвинилурацила, 4-тиоурацила, 5-гидроксиурацила, 5-пропинилурацила, 2-тиотимина, 4-тиотимина, 6-замещенных тиминов, 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанина, №-метилгуанина, Ν6метиладенина, 8-оксоаденина, 8-гидроксигуанина и 8-бромгуанина.
  10. 10. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по п.5, где замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, состоящей из универсального основания, ароматической циклической системы и атома водорода (0-спейсер).
  11. 11. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота по п.5, где замещенный или модифицированный пурин или пиримидин выбран из группы, состоящей из 4-метилиндола, 5-нитроиндола, 3-нитропиррола, Р-основания и К-основания, бензимидазола, дихлорбензимидазола, амида 1-метил-1Н-[1,2,4]триазол-3карбоновой кислоты, фторбензола и дифторбензола.
  12. 12. Вакцина, содержащая иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-11 и антиген.
  13. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый носитель.
  14. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-11 и противораковое лекарственное средство.
  15. 15. Способ лечения рака, предусматривающий введение субъекту, страдающего раком или подверженному риску его развития, иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-11 в количестве, эффективном для лечения или предупреждения рака.
  16. 16. Способ по п.15, где рак выбран из базально-клеточной карциномы, рака желчных путей, рака мочевого пузыря, рака кости, рака мозга и центральной нервной системы, рака молочной железы, рака шейки матки, хориокарциномы, рака ободочной и прямой кишки, рака соединительной ткани, рака пищеварительной системы, эндометриального рака, рака пищевода, злокачественной опухоли глаза, злокачественной опухоли головы и шеи, рака желудка, интраэпителиальной неоплазии, рака почки, рака глотки, лейкоза, рака печени, рака легкого, лимфомы, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, меланомы, миеломы, нейробластомы, рака полости рта, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака прямой кишки, рака почки, злокачественной опухоли респираторной системы, саркомы, рака кожи, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, рака матки, злокачественной опухоли мочевыделительной системы или других карцином и сарком.
  17. 17. Способ по п.15, где рак представляет собой рак, чувствительный к лечению интерфероном альфа (ΙΕΝ-α).
  18. 18. Способ по п.17, где рак, чувствительный к лечению ΙΕΝ-α, выбран из лейкоза ворсистых клеток, хронического миелолейкоза, кожного Т-клеточного лейкоза, множественной миеломы, фолликулярной лимфомы, злокачественной меланомы, плоскоклеточной карциномы, связанной со СПИДом саркомы Капоши, почечно-клеточной карциномы, карциномы предстательной железы, дисплазии шейки матки или карциномы толстой кишки.
  19. 19. Способ по п.15, где субъекту проводят противораковое лечение.
  20. 20. Способ по п.19, где противораковое лечение представляет собой облучение.
  21. 21. Способ по п.19, где противораковое лечение представляет собой хирургическое вмешательство.
  22. 22. Способ по п.19, где противораковое лечение представляет собой противораковое лекарственное средство.
  23. 23. Способ по п.22, где противораковое лекарственное средство представляет собой химиотерапевтическое средство.
  24. 24. Способ по п.23, где химиотерапевтическое средство представляет собой метотрексат, винкристин, адриамицин, цисплатин, не содержащие сахаров хлорэтилнитрозомочевины, 5-фторурацил, митомицин С, блеомицин, доксорубицин, дакарбазин, таксол, фрагилин, Мегламин СЬА, валрубицин, кармустин и полифепросан, ΜΜΙ270, ВАΥ 12-9566, ингибитор КА8-фарнезилтрансферазы, ингибитор фарнезилтрансферазы, ММР, ΜΤΛ/ΕΥ231514, ^Υ264618/Лометрексол, Гламолек, 04-994, Т№-470, Гикам
    - 34 008741 тин/Топотекан, РКС412, Валсподар/Р8С833, Новантрон/Митроксантрон, Метарет/Сурамин, Батимастат, Е7070, ВСН-4556, С8-682, 9-АС, АС3340, АС3433, Инцел/УХ-710, УХ-853, ΖΌ0101, Г8Г641, ΟΌΝ 698, ТА 2516/Мармистат, ВВ2516/Мармистат, СОР 845, Ό2163, ΡΌ183805, ΌΧ8951Ε, Лемонал ΌΡ2202, РК 317, Пицибанил/ОК-432, АО 32/Валрубицин, Метастрон/производное стронция, Темодал/Темозоломид, Эвацет/липосомальный доксорубицин, Ютаксан/Паклитаксел, Таксол/Паклитаксел, Кселод/Капецитабин, Фуртулон/Доксифлуридин, Циклопакс/оральный паклитаксел, Оральный Таксоид, 8Ри-077/Цисплатин, НМК 1275/Флавопиридол, СР-358(774)/ЕСРК, СР-609(754)/ингибитор онкогена КА8, ВМ8182751/оральную платину, ИЕТ(Тегафур/Урацил), Эргамизол/Левамизол, Енилурацил/776С85/5ЕИэнхансер, Кампто/Левамизол, Камптозар/Иринотекан, Томудекс/Ралтитрексед, Лейстатин/Кладрибин, Паксекс/Паклитаксел, Доксил/липосомальный доксорубицин, Келикс/липосомальный доксорубицин, Флудара/Флударабин, Фармарубицин/Эпирубицин, ДепоЦит, ΖΌ1839, ЬИ 79553/Бис-Нафталимид, ЬИ 103793/Доластин, Келикс/липосомальный доксорубицин, Гемзар/Гемцитабин, ΖΌ 0473/Анормед, УМ 116, семена лодина, ингибиторы ί.ΌΚ4 и СЭК2, ингибиторы РАКР, 04809/Дексифосфамид, Ифес/Меснекс/Ифосфамид, Вумон/Тенипозид, Параплатин/Карбоплатин, Плантинол/цисплатин, Вепезид/Этопозид, ΖΌ 9331, Таксотер/Доцетаксел, пролекарство гуанина арабинозид, Аналог Таксана, нитрозомочевины, алкилирующие агенты, такие как мелфелан и циклофосфамид, Аминоглутетимид, Аспарагиназу, Бусульфан, Карбоплатин, Хлоромбуцил, Цитарабин НС1, Дактиномицин, Даунорубицин НС1, Эстрамустин фосфат натрия, Этопозид (УР16-213), Флоксуридин, Фторурацил (5-Ρϋ), Флутамид, Гидроксимочевину (гидроксикарбамид), Ифосфамид, Интерферон Альфа-2а, Альфа-2Ь, Лейпролида ацетат (аналог фактора высвобождения ЬНКН), Ломустин (ССХи), Мехлорэтамин НС1 (азотный аналог горчичного газа), Меркаптопурин, Месну, Митотан, Митоксантрон НС1, Октреотид, Пликамицин, Прокарбазин НС1, Стрептозоцин, Тамоксифена цитрат, Тиогуанин, Тиотепу, Винбластина сульфат, Амсакрин (тАМ8А), Азацитидин, Эритропоэтин, Гексаметилмеламин (НММ), Интерлейкин 2, Митогуазон (метилСАС; метилглиоксаль-бис-гуанилгидразон; МСВС), Пентостатин (2'-дезоксикоформицин), Семустин (метил-ССNυ), Тенипозид (УМ-26) или Виндезина сульфат.
  25. 25. Способ по п.22, где противораковое лекарственное средство представляет собой иммунотерапевтическое средство.
  26. 26. Способ по п.25, где иммунотерапевтическое средство представляет собой Ритуксан, Рибутаксин, Герцептин, Квадрамет, Панорекс, ГПЕС-У2В8, ВЕС2, С225, Онколим, 8МАКТ М195, АТК.АСЕН Оварекс, Бексар, ЬПР-03, иор т6, МПХ-210, МПХ-11, МОХ-22, ОУ103, 3622А94, анти-УЕСР, Зенапакс, М ЭХ-220, МОХ-447, МЕЫММиХЕ-2, МЕЬГММиХЕ-1, СЕ АС 11)12 Претаргет, NονοМАЬ-С2, ЮТ, С11отаЬ-Н, СМ-250, ЕМЭ-72000, ЛимфоЦид, СМА 676, Монофарм-С, 4В5, иор е§Б.г3, иор с5, ВАВ8, анти-ЕЬК-2, МОХ-260, АNА АЬ, 8МАКТ 1Ό10 АЬ, 8МАКТ АВЬ 364 АЬ или ГттиКАГТ-СЕА.
  27. 27. Способ по п.22, где противораковое лекарственное средство представляет собой противораковую вакцину.
  28. 28. Способ по п.27, где противораковая вакцина представляет собой ЕСР, антиидиотипические противораковые вакцины, антиген Ср75, СМК-вакцину против меланомы, конъюгированную с ганглиозидом вакцину МСУ, Нег2/пеи, Оварекс, М-Уах, О-Уах, Ь-Уах, тератоп 8Тп-КНЬ, ВБР25 (МИС-1), липосомальную идиотипическую вакцину, Мелацин, вакцины с пептидными антигенами, токсин/антигенные вакцины, вакцину на основе МУА, РАСГ8, ВСС-вакцину, ТА-НРУ, ТА-ΟΝ, ЭГ8С-вирус или ГттиСукСТЬегаСук.
  29. 29. Способ по п.15, где субъекту проводят более чем одну противораковую терапию.
  30. 30. Способ индукции экспрессии интерферона Г типа (ГРЩ, предусматривающий контактирование клетки, способной экспрессировать !ΕΝ Г типа, с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-11 в количестве, эффективном для индукции экспрессии [ΕΝ Г типа.
  31. 31. Способ по п.30, где ^Ν Г типа представляет собой интерферон альфа (ГЕМа).
  32. 32. Способ индукции экспрессии интерферона гамма (ГЕМу), предусматривающий контактирование клетки, способной экспрессировать ГЕМу, с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-11 в количестве, эффективном для индукции экспрессии ГЕМу.
  33. 33. Способ активации природной клетки-киллера (ΝΚ), предусматривающий контактирование ΝΚклетки с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-11 в количестве, эффективном для активации ΝΚ-клетки.
EA200600865A 2003-10-30 2004-10-29 Аналоги олигонуклеотидов с-класса с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью EA008741B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51619303P 2003-10-30 2003-10-30
PCT/US2004/036240 WO2005042018A2 (en) 2003-10-30 2004-10-29 C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600865A1 EA200600865A1 (ru) 2006-10-27
EA008741B1 true EA008741B1 (ru) 2007-08-31

Family

ID=34549500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600865A EA008741B1 (ru) 2003-10-30 2004-10-29 Аналоги олигонуклеотидов с-класса с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью

Country Status (23)

Country Link
US (1) US8188254B2 (ru)
EP (2) EP1678303A2 (ru)
JP (1) JP2007509983A (ru)
KR (1) KR101107818B1 (ru)
CN (1) CN101454451A (ru)
AP (1) AP2006003611A0 (ru)
AU (2) AU2004285561C1 (ru)
BR (1) BRPI0416079A (ru)
CA (1) CA2540949A1 (ru)
CR (1) CR8423A (ru)
EA (1) EA008741B1 (ru)
EC (1) ECSP066589A (ru)
GE (1) GEP20094767B (ru)
IL (2) IL174428A0 (ru)
MA (1) MA28182A1 (ru)
NO (1) NO20061857L (ru)
NZ (2) NZ546475A (ru)
OA (1) OA13278A (ru)
SG (2) SG122973A1 (ru)
TN (1) TNSN06123A1 (ru)
UA (1) UA88457C2 (ru)
WO (1) WO2005042018A2 (ru)
ZA (2) ZA200602352B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2477753C2 (ru) * 2008-12-09 2013-03-20 Коули Фармасьютикал Груп, Инк. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP1733735B1 (en) 1998-05-22 2017-03-22 Ottawa Hospital Research Institute Methods and products for inducing mucosal immunity
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
EP2204186B1 (en) 1999-02-17 2016-04-06 CSL Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
WO2002022809A2 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
EP2423335B1 (en) * 2001-06-21 2014-05-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
SG177000A1 (en) 2001-08-17 2012-01-30 Coley Pharm Gmbh Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
EP3006043B1 (en) 2002-04-04 2019-05-29 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
ZA200503511B (en) * 2002-10-29 2006-10-25 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
US7956043B2 (en) * 2002-12-11 2011-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5′ CpG nucleic acids and methods of use
AU2004275876B2 (en) * 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
CN101454451A (zh) 2003-10-30 2009-06-10 科勒制药有限公司 具有增强免疫刺激能力的c类寡核苷酸类似物
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
CA2567789A1 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US7781478B2 (en) 2004-07-14 2010-08-24 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis C
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
KR20080072934A (ko) 2005-11-25 2008-08-07 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역자극성 올리고리보뉴클레오티드
AU2006325225B2 (en) 2005-12-14 2013-07-04 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
EP1991678B2 (en) * 2006-02-15 2020-07-15 Rechtsanwalt Thomas Beck Compositions and methods for oligonucleotide formulations
US8541559B2 (en) 2006-06-12 2013-09-24 Cytos Biotechnology Ag Process for producing aggregated oligonucleotides
MX2009003398A (es) * 2006-09-27 2009-08-12 Coley Pharm Gmbh Analogos de oligonucleotidos cpg que contienen analogos t hidrofobos con actividad inmunoestimuladora mejorada.
EA200900983A1 (ru) * 2007-01-26 2010-02-26 Айрм Ллк Соединения и композиции в качестве ингибиторов киназы
EP2573176B1 (en) * 2007-05-04 2016-04-06 InDex Pharmaceuticals AB Tumour growth inhibitory compounds and methods of their use
EP2167662A2 (en) * 2007-05-14 2010-03-31 Technische Universität München Pharmaceutical compounds comprising abasic oligonucleotides
PT2170353E (pt) * 2007-05-18 2015-09-16 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Análogos de oligonucleotídeo modificados por fosfato com atividade imunoestimulante
EP2190440A1 (en) * 2007-08-13 2010-06-02 Pfizer Inc. Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
CN101820908A (zh) * 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
CA2710534C (en) * 2008-01-31 2018-09-04 Curevac Gmbh Nucleic acids of formula (i) (nuglxmgnnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agent/adjuvant
KR101881596B1 (ko) 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
CA3033133C (en) 2009-03-25 2021-11-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions for stimulation of mammalian innate immune resistance to pathogens
SG177564A1 (en) 2009-07-06 2012-02-28 Ontorii Inc Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
EP2459231B1 (de) * 2009-07-31 2016-06-08 Ethris Gmbh Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression
AU2011258156B2 (en) 2010-05-26 2016-11-24 Selecta Biosciences, Inc. Multivalent synthetic nanocarrier vaccines
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
US9994443B2 (en) 2010-11-05 2018-06-12 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
AU2011325956B2 (en) 2010-11-12 2016-07-14 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
GB201021867D0 (en) 2010-12-23 2011-02-02 Mologen Ag Non-coding immunomodulatory DNA construct
EP2734208B1 (en) 2011-07-19 2017-03-01 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
AU2012290306B2 (en) 2011-07-29 2017-08-17 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers that generate humoral and cytotoxic T lymphocyte (CTL) immune responses
CA2848753C (en) 2011-09-14 2022-07-26 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
EP2809807B1 (en) 2012-02-01 2019-04-10 Gen-Probe Incorporated Asymmetric hairpin target capture oligomers
WO2013173598A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating atp2a2 expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
JP2015518713A (ja) 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｕｔｒｎ発現を調節するための組成物及び方法
EA201492116A1 (ru) 2012-05-16 2015-05-29 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2
EP2850188A4 (en) 2012-05-16 2016-01-20 Rana Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF THE MULTIGENIC FAMILY OF HEMOGLOBIN
CA2873794A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
WO2014010718A1 (ja) * 2012-07-13 2014-01-16 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
EP2872485B1 (en) 2012-07-13 2020-12-16 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
CA2884608A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
AR095882A1 (es) 2013-04-22 2015-11-18 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra csf-1r humano con un agonista de tlr9
CN103233011B (zh) * 2013-04-22 2014-11-05 中国科学技术大学 PEG-PLA纳米材料包被的HBV-CpG在乙肝预防和/或治疗中的应用
WO2015024992A2 (en) * 2013-08-22 2015-02-26 Cytos Biotechnology Ag Treatment of asthma
CN105925583B (zh) * 2013-11-08 2019-05-17 上海交通大学 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
JPWO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
AU2015207773B2 (en) 2014-01-16 2021-06-17 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
GB2523187A (en) 2014-02-18 2015-08-19 Mologen Ag Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct
CN106535876B (zh) 2014-06-04 2020-09-11 埃克西奎雷股份有限公司 免疫调节剂通过脂质体球形核酸的多价递送以用于预防或治疗应用
US10286065B2 (en) 2014-09-19 2019-05-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
CA2966044A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
WO2016130943A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Rana Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
US10900036B2 (en) 2015-03-17 2021-01-26 The General Hospital Corporation RNA interactome of polycomb repressive complex 1 (PRC1)
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
JP7412079B2 (ja) * 2015-12-23 2024-01-12 レプルカ プロプライアタリー リミティド 核酸オリゴマーとその用途
WO2017193087A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Exicure, Inc. Liposomal spherical nucleic acid (sna) constructs prsenting antisense oligonucleotides(aso) for specific knockdown of interleukin 17 receptor mrna
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11806364B2 (en) 2017-09-28 2023-11-07 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Method for producing myeloid-derived suppressor cells, myeloid-derived suppressor cells produced thereby, and methods thereof
JP2021506246A (ja) * 2017-12-15 2021-02-22 バイエル・アニマル・ヘルス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｍｂｈ 免疫刺激性オリゴヌクレオチド

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
RU2185819C1 (ru) * 2001-10-18 2002-07-27 Дорофеенко Алла Ивановна Средство, обладающее противоопухолевым действием
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5004810A (en) * 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
ATE171210T1 (de) 1992-07-02 1998-10-15 Hybridon Inc Selbststabilisierte oligonukleotide als therapeutika
US5523389A (en) 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
CA2194761C (en) * 1994-07-15 2006-12-19 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030050263A1 (en) * 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US5856462A (en) * 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
ATE292980T1 (de) * 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
AU7890598A (en) 1996-12-27 1998-07-31 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Fused pyrimidine compounds and medicinal use thereof
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
WO1998037919A1 (en) * 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
EP1003531B1 (en) * 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
US5939421A (en) 1997-07-01 1999-08-17 Signal Pharmaceuticals, Inc. Quinazoline analogs and related compounds and methods for treating inflammatory conditions
ATE408422T1 (de) * 1997-07-03 2008-10-15 Donald E Macfarlane Methode zur hemmung immunstimulatorischer mit dna assoziierter antworten
ES2284247T3 (es) * 1998-04-03 2007-11-01 University Of Iowa Research Foundation Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos.
AU3884199A (en) 1998-05-06 1999-11-23 Ottawa Health Research Institute Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
IL139646A0 (en) * 1998-05-14 2002-02-10 Coley Pharm Group Inc Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
EP1733735B1 (en) 1998-05-22 2017-03-22 Ottawa Hospital Research Institute Methods and products for inducing mucosal immunity
US6562798B1 (en) * 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
CA2341338A1 (en) 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
WO2000015645A1 (fr) 1998-09-11 2000-03-23 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Derives d'esters phosphoniques et leur procede de production
US6207819B1 (en) * 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
WO2000054803A2 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1177439B1 (en) 1999-04-29 2004-09-08 Coley Pharmaceutical GmbH Screening for immunostimulatory dna functional modifiers
CA2412345A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
EP2314693A3 (en) 1999-08-13 2012-11-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
AP1775A (en) 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ATE378348T1 (de) * 2000-01-14 2007-11-15 Us Health Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
AU3108001A (en) 2000-01-20 2001-12-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
CA2398432C (en) 2000-01-26 2012-06-19 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide cpg-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
WO2001057112A1 (fr) * 2000-02-01 2001-08-09 Nippon Steel Chemical Co., Ltd. Resine polyimide adhesive et stratifie adhesif
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
EP1259264A4 (en) 2000-02-23 2005-08-31 Univ California METHOD FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY ENDURANCE AND OTHER FORMS OF GASTROINTESTINAL DEFICIENCY
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
CA2407942A1 (en) 2000-05-01 2001-11-08 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide cpg-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
AU2001259706A1 (en) 2000-05-09 2001-11-20 Reliable Biopharmaceutical, Inc. Polymeric compounds useful as prodrugs
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
WO2002022809A2 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
WO2002026757A2 (en) 2000-09-26 2002-04-04 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
AU4433702A (en) 2000-10-18 2002-04-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP1985702A3 (en) 2000-12-08 2010-08-18 Coley Pharmaceutical GmbH CPG-like nucleic acids and methods of use thereof
AU2002248185A1 (en) * 2000-12-14 2002-07-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7176296B2 (en) * 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7785610B2 (en) 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
EP2423335B1 (en) 2001-06-21 2014-05-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US20030003970A1 (en) * 2001-06-28 2003-01-02 Alan Johnson Portable communications device
AU2002318944A1 (en) 2001-08-01 2003-02-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
AU2002361468A1 (en) * 2001-08-14 2003-03-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human S Method for rapid generation of mature dendritic cells
SG177000A1 (en) 2001-08-17 2012-01-30 Coley Pharm Gmbh Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
US20030067902A1 (en) * 2001-09-21 2003-04-10 Skeba Kirk W. Method for providing multiple certified radio modules with a baseband
BR0213097A (pt) 2001-10-05 2005-02-01 Coley Pharm Gmbh Agonistas e antagonistas sinalizadores do receptor 3 similar a toll
US20030139364A1 (en) 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US20030232443A1 (en) 2002-06-18 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of centromere protein B expression
EP3006043B1 (en) 2002-04-04 2019-05-29 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
DK2264172T3 (da) 2002-04-05 2017-11-27 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligomerforbindelser til modulering af HIF-1á-ekspression
US20040009949A1 (en) * 2002-06-05 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory CpG nucleic acids
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
CN1468957A (zh) 2002-07-19 2004-01-21 中国人民解放军第二军医大学 一种用作人用治疗性疫苗佐剂的质粒
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
WO2004026888A2 (en) 2002-09-19 2004-04-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
ZA200503511B (en) 2002-10-29 2006-10-25 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
US7956043B2 (en) 2002-12-11 2011-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5′ CpG nucleic acids and methods of use
US7625872B2 (en) 2002-12-23 2009-12-01 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
WO2004064782A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
AU2004226605A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
KR101137572B1 (ko) * 2003-06-11 2012-05-30 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 안정화된 면역조절 올리고뉴클레오티드
BRPI0411514A (pt) 2003-06-20 2006-08-01 Coley Pharm Gmbh antagonistas de receptor toll-like de molécula pequena
AU2004275876B2 (en) 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
CN101454451A (zh) 2003-10-30 2009-06-10 科勒制药有限公司 具有增强免疫刺激能力的c类寡核苷酸类似物
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
KR101138131B1 (ko) 2003-12-08 2012-04-23 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극특성의 조절
EP1720568A2 (en) 2004-02-19 2006-11-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral rna oligonucleotides
AU2005243250A1 (en) * 2004-04-02 2005-11-24 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory nucleic acids for inducing IL-10 responses
CA2567789A1 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
AU2005257938B2 (en) 2004-06-15 2010-11-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
US7427405B2 (en) * 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
CA2574090A1 (en) * 2004-07-18 2006-12-21 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
EP2484374A1 (en) 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
JP2008531018A (ja) * 2005-02-24 2008-08-14 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激性オリゴヌクレオチド
JP2008535859A (ja) 2005-04-08 2008-09-04 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 感染症によって悪化した喘息を治療するための方法
WO2006116458A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhances immunostimulatory activity
US20090117132A1 (en) * 2005-07-07 2009-05-07 Pfizer, Inc. Anti-Ctla-4 Antibody and Cpg-Motif-Containing Synthetic Oligodeoxynucleotide Combination Therapy for Cancer Treatment
WO2007088423A2 (en) 2005-09-16 2007-08-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
US20090306177A1 (en) 2005-09-16 2009-12-10 Coley Pharmaceutical Gmbh Modulation of Immunostimulatory Properties of Short Interfering Ribonucleic Acid (Sirna) by Nucleotide Modification
KR20080072934A (ko) 2005-11-25 2008-08-07 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역자극성 올리고리보뉴클레오티드
EP1991678B2 (en) * 2006-02-15 2020-07-15 Rechtsanwalt Thomas Beck Compositions and methods for oligonucleotide formulations
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
MX2009003398A (es) 2006-09-27 2009-08-12 Coley Pharm Gmbh Analogos de oligonucleotidos cpg que contienen analogos t hidrofobos con actividad inmunoestimuladora mejorada.
CA2664156A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Compositions of tlr ligands and antivirals
BRPI0718182A2 (pt) 2006-10-26 2014-02-25 Coley Pharm Gmbh Oligorribonucleotídeos e seus usos.
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
CA2687441A1 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Class a oligonucleotides with immunostimulatory potency

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
RU2185819C1 (ru) * 2001-10-18 2002-07-27 Дорофеенко Алла Ивановна Средство, обладающее противоопухолевым действием

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2477753C2 (ru) * 2008-12-09 2013-03-20 Коули Фармасьютикал Груп, Инк. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды
RU2610690C2 (ru) * 2008-12-09 2017-02-14 Коули Фармасьютикал Груп, Инк. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды

Also Published As

Publication number Publication date
US8188254B2 (en) 2012-05-29
AP2006003611A0 (en) 2006-06-30
UA88457C2 (ru) 2009-10-26
KR20060109443A (ko) 2006-10-20
AU2004285561B2 (en) 2011-11-24
ZA200603212B (en) 2008-03-26
NZ546475A (en) 2008-08-29
NZ546275A (en) 2009-05-31
NO20061857L (no) 2006-07-31
CR8423A (es) 2007-09-03
BRPI0416079A (pt) 2007-01-02
AU2004285561A1 (en) 2005-05-12
ZA200602352B (en) 2007-09-26
CN101454451A (zh) 2009-06-10
IL174428A0 (en) 2006-08-01
IL175215A0 (en) 2006-09-05
SG123799A1 (en) 2006-07-26
EA200600865A1 (ru) 2006-10-27
ECSP066589A (es) 2006-10-17
TNSN06123A1 (en) 2007-11-15
US20050239734A1 (en) 2005-10-27
EP1678303A2 (en) 2006-07-12
EP1728863A2 (en) 2006-12-06
JP2007509983A (ja) 2007-04-19
SG122973A1 (en) 2006-06-29
MA28182A1 (fr) 2006-09-01
EP1728863A3 (en) 2006-12-20
CA2540949A1 (en) 2005-05-12
KR101107818B1 (ko) 2012-01-31
AU2006201495A1 (en) 2006-04-27
AU2004285561C1 (en) 2012-06-21
WO2005042018A3 (en) 2005-07-21
OA13278A (en) 2007-01-31
WO2005042018A2 (en) 2005-05-12
GEP20094767B (en) 2009-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA008741B1 (ru) Аналоги олигонуклеотидов с-класса с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью
US7956043B2 (en) 5′ CpG nucleic acids and methods of use
JP4383534B2 (ja) 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
JP5473336B2 (ja) オリゴヌクレオチドの処方に関する組成物および方法
CN101517082B (zh) 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
JP4989225B2 (ja) 核酸親油性接合体
JPWO2015108047A1 (ja) 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JP2008516634A (ja) セミソフトｃクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド
MX2008008279A (es) Actividad inmunoestimuladora de oligonucleotidos inmunoestimuladores palindromicos que contienen diferentes longitudes de segmentos palindromicos.
JP2008502713A (ja) 皮膚疾患に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの治療学的用途
JP5755827B2 (ja) 強化された免疫刺激活性を有するリン酸が修飾されたオリゴヌクレオチド類似体
JP2007151536A (ja) 免疫刺激力が増強されたｃ−クラスのオリゴヌクレオチドアナログ
MXPA06004891A (en) C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU