BRPI0616235A2 - acido ribonuclÉico monofilamentado imunoestimulante com cadeia principal de fosfodiÉster - Google Patents

Abstract

ÁCIDO RIBONUCLÉICO MONOFILAMENTADO IMUNOESTIMULANTE COM CADEIA PRINCIPAL DE FOSFODIÉSTER. Oligo-ribonucleotídeos de fita simples imunoestimulantes (ssORN) com cadeias centrais fosfodiéster induzem ativação imune independente de TLR7 e dependente de MyD88. Esses ssORN imunoestimulantes são úteis para induzir uma resposta imune similar a Th1 num individuo, para induzir uma resposta imune antígeno-específica num indivíduo, e para tratar um indivíduo com um câncer, uma doença infecciosa, uma condição alérgica, ou asma.

Description

"ÁCIDO RIBONUCLÉICO MONOFILAMENTADOIMUNOESTIMULANTE COM CADEIA PRINCIPAL DE FOSFODIÉSTER"

Antecedentes da Invenção

O ácido ribonucléico (RNA) foi recentemente o focode intenso interesse, devido a seu potencial recentementereconhecido como um terapêutico. Descreveu-se, recentementepor exemplo, que determinado RNA de fita dupla especificapara seqüência, geralmente de cerca de 21-23 nucleotideos decomprimento podem ser usados para silenciar a expressão ge-nética num modo seletivo, em um processo denominadointerferência de RNA (RNAi) ou silenciamento do gene pós-transcripcional. RNA de fita dupla usado para este tipo deinterferência de RNA inclui, em particular RNA interferentecurto (siRNA). Hannon GJ (2002) Nature 418:244-51. Em con-traste, foi relatado recentemente também que oRNA de fitadupla não especifico para seqüência pode induzir efeitos i-munoestimulantes, agindo através do receptor 3 semelhante aToll (TLR3). Alexopoulou L et al. (2001) Nature 413:732-8.Além disso, relatou-se recentemente também, que alguns RNAsde fita dupla, incluindo, em geral, guanosina (G) e uridina(U) e particularmente, incluindo alguns motivos da seqüênciatambém são imunoestimulantes. Lipford et al., US2003.0232074 Al. RNA de fita simples imunoestimulante foidescrito tendo ação através do receptor 7 similar a Toll(TLR7) e receptor 8 similar a Toll (TLR8).

Além da imunoestimulação que surge da interação deRNA com TLR3, TLR7 e TLR8, algumas moléculas de ácido nu-cléico contendo o dinucleotideo citosina-guanina (CpG), emparticular ácido desoxirribonucléico contendo CpG (DNA), fo-ram descritos por exercer seu efeito imunoestimulante atra-vés da interação com o receptor 9 semelhante a Toll (TLR9).Hemmi H et al. , (2000) Nature 408:740-5. TLR7, TLR8 e TLR9todos sinalizam num modo dependente de MyD88.

Moléculas de ácido desoxirribonucléico, e mais a-inda moléculas de ácido ribonucléico com ligações internu-cleotidicas de fosfodiéster de ocorrência natural em sua ca-deia central de fosfato de açúcar, são suscetíveis de degra-dação mediada por nuclease. Visto que, para indicação clíni-ca os ácidos nucléicos imunoestimulantes são freqüentementepreparados como oligonucleotídeos sintéticos, esses oligonu-cleotídeos sintéticos imunoestimulantes freqüentemente, in-cluem uma ou mais ligações internucleotídicas estabilizadasem sua cadeia central de fosfato de açúcar. Um internucleo-tídeo estabilizado comumente empregado é fosforotioato.

SÜMÁRI0 DA INVENÇÃO

Foi agora descoberto, de acordo com a invenção,que, surpreendentemente RNA de fita simples com cadeia cen-trai fosfodiéster, porém não cadeia central de fosforotioa-to, estimula imunologicamente a ativação, pelo menos em par-te através de um receptor similar a Toll dependente deMyD88, diferente de TLR7 ou TLR8. 0 receptor similar a Tolldependente de MyD88 responsável por esta resposta imune ésupostamente apontado como TLR9.

A ativação imune mediada por CpG, agindo atravésde TLR9, envolve a ativação da imunidade intrínseca e conduza uma tergiversação de uma resposta imune no sentido de umaresposta imune a Th1 ou similar a Th1. Oligonucleotideos CpGportanto, foram descritos de utilidade como adjuvantes e co-mo agentes ativos para emprego no tratamento de doença ondea estimulação de uma resposta imune a Thl é desejada, porexemplo, câncer, infecção, alergia, e asma.

Descobriu-se, surpreendentemente, agora, que deacordo com a invenção, RNA de fita simples com cadeia cen-tral de fosfodiéster, carecendo, ou de CpG ou de caracterís-ticas específicas para seqüência de RNa de fita simples imu-noestimulante anteriormente descrito, pode ser usado emqualquer aplicação que demande ativação do sistema imune me-diada por TLR9. Tais aplicações incluem, sem limitação, tra-tamento de um indivíduo com câncer, infecção, alergia ou asma.

Em um aspecto, a invenção se trata de um método deinduzir uma resposta imune similar a Thl num indivíduo. Ométodo de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapade administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um oli-gorribonucleotídeo de fita simples (ssORN) imunoestimulantede 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde o ssORN imunoes-timulante possui uma cadeia central de fosfodiéster ecompreende uma seqüência de nucleotídeo que:

(1) é isenta de guanosina (G), ou

(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos um G a seqüência de nucleotídeo é

(a) isenta de uridina (U), e(b) isenta de motivo CpG X1X2CGX3X4, onde Xi, X2, X3e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Num aspecto da invenção trata-se de um método deinduzir uma resposta antigeno-especifica num indivíduo. 0método de acordo com este aspecto da invenção inclui as eta-pas de administrar ao indivíduo um antígeno e administrar aoindivíduo uma quantidade eficaz de um oligorribonucleotídeode fita simples imunoestimulante (ssORN) de 5-100 nucleoti-deos de comprimento, onde o ssORN imunoestimulante possuiuma cadeia central de fosfodiérster compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que

(1) é isenta de guanosina (G), ou

(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotídeo é

(a) isenta de uridina (U), e

(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde Xi, X2, X3e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Num aspecto, a invenção trata-se de um método detratamento de um indivíduo com um câncer. O método de acordocom este aspecto da invenção inclui a etapa de administraçãoao indivíduo uma quantidade eficaz de um oligorribonucleotí-deo de fita simples imunoestimulante (ssORN) de 5-100 nucle-otídeos de comprimento, onde o ssORN imunoestimulante tem5 uma cadeia central de fosfodiéster e compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que:

(1) é isenta de guanosina (G), ou

(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotídeo é

(a) isenta de uridina (U), e

(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde Xi, X2, X3e X4 são nucleotídeos e CG é um dinucleotídeo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotídeo CG não é metilada,

com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Num aspecto, a invenção trata-se de um método detratamento de um indivíduo com uma doença infecciosa. O mé-todo de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapade administração ao indivíduo, de uma quantidade eficaz deum oligorribonucleotídeo de fita simples (ssORN) imunoesti-mulante, de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde o ssORNimunoestimulante possui uma cadeia central de fosfodiéster ecompreende uma seqüência de nucleotídeo que:

(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotideo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotideo é

(a) isenta de uridina (U), e

(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde Xi, X2, X3

e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,

com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Num aspecto, a invenção trata-se de um método detratamento de um indivíduo com uma condição alérgica. 0 mé-todo de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapade administração ao indivíduo, de uma quantidade eficaz deum oligorribonucleotídeo de fita simples (ssORN) imunoesti-mulante, de 5-100 nucleotideos de comprimento, onde o ssORNimunoestimulante possui uma cadeia central de fosfodiéster ecompreende uma seqüência de nucleotideo que:

(1) é isenta de guanosina (G), ou

(2) compreende pelo menos uma G com a condição de

que, quando a seqüência de nucleotideo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotideo é

(a) isenta de uridina (U), e

(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde Xi, X2, X3e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -

guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Num aspecto, a invenção trata-se de um método detratamento de um indivíduo sofrendo de asma. 0 método de a-cordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de admi-nistração ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um oli-gorribonucleotídeo de fita simples (ssORN) imunoestimulante,de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde o ssORN imunoes-

timulante possui uma cadeia central de fosfodiéster e com-preende uma seqüência de nucleotídeo que:

(1) é isenta de guanosina (G), ou

(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotídeo é

(a) isenta de uridina (U), e

(b) isenta de motivo CpG X1X2CGX3X4, onde Xi, X2, X3e X4 são nucleotídeos e CG é um dinucleotídeo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotídeo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante não

esteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Numa modalidade, o ssORN imunoestimulante tem 5-40nucleotídeos em comprimento.

Numa modalidade, o ssORN imunoestimulante tem 5-20nucleotídeos em comprimento.

Numa modalidade, o ssORN imunoestimulante tem 5-12nucleotídeos em comprimento.Numa modalidade, o ssORN imunoestimulante é umssORN sintético.

Numa modalidade, o ssORN imunoestimulante não é umpolinucleotideo selecionado do grupo consistindo de poli-U,poli-G, poli-A, ou poli-C.

Numa modalidade, a administração ao indivíduo daquantidade eficaz do ssORN imunoestimulante é feita sistemi-camente como uma quantidade eficaz do ssORN imunoestimulan-te.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOSA figura 1 é um desenho esquemático ilustrando al-guns receptores similares a Toll, seus ligantes, e aspectoscaracterísticos de seus passos de sinalização intracelula-res, como antes entendido. MyD88 está ilustrado como umaproteína de adaptação para os receptores similares a Tollsuscetíveis ao ácido nucléico, TLR7, TLR8, e TLR9, bem comopara os receptores similares a Toll suscetíveis ao ácido nu-cléico TLR2, TLR4 e TLR5.

A figura 2 é um gráfico ilustrando o reconhecimen-to independente de TLR7 de Rna fosfodiéster de fita simples.PD, cadeia central de fosfodiéster,PTO, cadeia central defosforotioato, WT, tipo selvagem, RNA63 é um oligorribonu-cleotídeo com uma seqüência de nucleotídeo proposta como 5'-CAGGUCUGUGAU-31 (SEQ ID NO: 1). SpG-ODN 1668 é um oligodeso-xinucleotídeo com uma seqüência de nucleotídeo proposta como5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-31 (SEQ ID NO: 2).A figura 3 é um grupo de três gráficos ilustrandoa secreção de várias citocinas indicadas por células dendrí-ticas (DC) em resposta a vários estímulos. LPS, lipopolissa-carideo. CpG-ODN 2216 é um oligodesoxinucleotídeo com umaseqüência de nucleotídeo proposta como 5-

'GGGGGACGATCGTCGGGGG-31 (SEQ ID NO: 3).

A figura 4 é uma série de quatro gráficos ilus-trando análises FACS para a expressão de CD69 em célulasdendríticas induzidas por FLT3-L em resposta ao ssORN indicado.

A figura 5 é um par de gráficos ilustrando a se-creção de IL-12p40 por macrófagos derivados de M-CSF e porcélulas dendríticas derivadas de GM-CSF, em resposta aos es-tímulos indicados.

A figura 6A é um gráfico ilustrando a secreção deIL-12p40 de células dendríticas induzidas por FLT3-L de ca-mundongos do tipo selvagem (WT), TLR7-nocauteados (TLR7-/-)e MyD88-nocauteados (MyD88-/-) em resposta aos estímulos in-dicados. pI:C, poliinosina/citidina.

A figura 6B é uma serie de três gráficos ilustran-do análises FACS para a expressão de CD69 por células den-dríticas induzidas de camundongos do tipo selvagem (WT) ,TLR7-nocaute(TLR7-/-), e MyD88-nocaute (MyD88-/-) em respos-ta aos estímulos indicados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A resposta imune é conceitualmente dividida em i-munidade intrínseca e adaptada. Crê-se que, a imunidade in-trínseca esteja envolvida com o reconhecimento de padrõesmoleculares associados com patógeno (PAMPs) dividida em co-mum por algumas classes de moléculas expressadas por micro-organismos infecciosos ou macromoléculas estranhas. Crê-seque os PAMPs sejam reconhecidos pelos receptores de reconhe-cimento de padrão (PRRs) em determinadas células imunes.

Os receptores similares a Toll (TLRs) são uma fa-milia de polipeptideos altamente conservados, que desempe-nham um papel critico na imunidade intrínseca de mamíferos.Atualmente dez membros da família denominados TLRl - TLR10,foram identificados. Os domínios citoplasmáticos dos váriosTLRs são caracterizados por um domínio do receptor interleu-cina 1 (IL-I) de Toll (TIR) . Medzhitov R et al. , (1998) MolCell 2:253-*.. 0 reconhecimento da invasão microbiana porTLRs aciona a ativação de uma cascata de sinalização que, éevolutivamente conservada em Drosophila e em mamíferos. Aproteína MyD88 do adaptador contendo o domínio TIR foi des-crita estar associada com muitos TLRs e a renovar quinaseassociada com o receptor de IL-I (IRAK) e fator 6 associadocom o receptor do fator de necrose tumoral (TNF), 9TRAF6) aoTLRs. 0 passo de sinalização dependente de MyD88 é conhecidopor conduzir à ativação de fatores de transcrição NF-κΒ eproteínas quinase ativada por mitógeno (Jnk) de quinase ter-minal NH2 cJun (MAPKs), etapas críticas na ativação imune eprodução de citocinas inflamatórias. Para uma pesquisa ver,Aderem A et al. , (2000) Nature 406:782-87.

Embora uma série de ligantes TLR específicos te-nham sido descritos, os ligantes para alguns TLRs permanecemsem identificação. Os ligante para T1R2 incluem peptidogli-cano e lipopeptídeos. Yoshimura A et al (1999) J Immunol163:1-5; Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163:1-5; Ali-prantis AO et al. , (1999) Science 285:736-9. RNA duplamentefilamentado com origem viral (dsRNA) e poli I:C, um análogosintético de dsRNA, foram relatados como ligantes de TLR3.Alexopoulou L et al. (2001) Nature 413:732-8.

Lipopolissacarideo (LPS) é um ligante para TLR4.Poltorak A et al. (1998) Science 282:2085-8; Hoshino K etal. (1999) J Immunol 162:3749-52. Flagelina bacteriana é umligante para TLR5. Hayashi F et al., (2001) Nature 410:1099-1103. Peptidoglican foi descrito como um ligante não apenaspara TLR2, mas também para TLR6. Ozinsky A et al., (2000)Proc Natl Acad Sci USA 97:13766-71; Takeuchi 0 et al. (2001)Int Immunol 13:933-40. Rna de fita simples contendo guanosi-na e uridina foi descrito como um ligante para TLR7 e TLR8.Pedido de Patente U.S. 2003/0232074 Al. Alguns compostossintéticos de baixo peso molecular, o imiquimod imidazoqui-nolonas (R-837) e resiquimod (R-848) também foram descritoscomo ligantes de TLR7 e TLR8. Jurk M et al., (2002) Nat im-munol 3:499; Hemmi H et al. , (2002) Nat Immunol 3:196-200.DNA bacteriano (CpG DNA) foi descrito como um ligante deTLR9. Hemmi H et al. (2000) Nature 408:740-5; Bauer s et al,(2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 9237-42. Os ligantes natu-rais para TLRl e TLRlO não são conhecidos.

TLR7, TLR8 e TLR9 todos sinalizam em resposta aoligante do ácido nucléico apropriado com a participação daproteína MyD88 adaptadora. TLR8 de murídeo, diferente deTLR8 humano é tida como não funcional. Assim, em camundon-gos, TLR7 e TLR9 são funcionais e sinalizam em resposta aoligante do ácido nucléico apropriado com a participação deMyD88. Camundongos carecendo de TLR7 funcional, portanto,possuem apenas TLR9 como um TLR funcional conhecido por sercapaz de sinalizar em resposta ao ligante do ácido nucléicoapropriado através de um passo dependente de MyD88 (Ver aFigura 1).

Foi agora surpreendentemente descoberto que, al-guns oligorribonucleotideos de fita simples com fosfodiés-ter, porém sem fosforotioato, na cadeia central são capazesde estimular células imune num modo dependente de MyD88, emcamundongos carecendo de TLR7 ou TLR8 funcional.

Oligorribonucleotideos de fita simples imunoesti-mulantes (ssORN) úteis de acordo com a presente invenção são5-100 nucleotideos de comprimento, têm uma cadeia central defosfodiéster e uma seqüência de nucleotideo que:

(1) é isenta de guanosina (G), ou

(2) inclui pelo menos uma (G), com a condição deque, quando a seqüência de nucleotideo compreende pelo menosuma G, a seqüência de nucleotideo é

(a) isenta de uridina (U), e(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde Xi, X2, X3

e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,

com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

Oligorribonucleotideo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN) útil de acordo com a presente invenção numamodalidade pode ser derivado e isolado de fontes naturais deRNA. Alternativamente e mais tipicamente, oligorribonucleo-tideo de fita simples imunoestimulante (ssORN) útil de acor-do com a presente invenção numa modalidade pode ser obtidopor métodos sintéticos conhecidos na técnica.

Os ssORN imunoestimulantes da invenção podem serde origem natural ou não natural. RNA à medida que ocorre innatura é um tipo de ácido nucléico que, em geral, refere-sea um polímero linear de determinadas unidades ribonucleosí-deo, cada unidade ribonucleosídeo compostas de uma base pu-rina ou pirimidina e um açúcar ribose, ligado por ligaçõesfosfodiéster internucleosidicas. Neste sentido, "line-ar"significa descrever a estrutura primária do RNA. O RNA emgeral, pode ser de fita simples ou fita dupla, incluindo,fita parcialmente dupla.

Como aqui empregado, "nucleosídeo" refere-se a umafração açúcar simples (por exemplo, ribose ou desoxirribose)ligado a uma base orgânica cambiável, que é ou uma pirimidi-na substituída (por exemplo, citosina, timina ou uracila) ouuma purina substituída (por exemplo, adenina ou guanina).Nucleotídeos correspondentes são citidina, timidina, uridi-na, adenosina e guanosina, que são convencionalmente indica-da como C, T, U, A, e G, respectivamente. Como aqui descri-to, o nucleosídeo pode ser um nucleosídeo de ocorrência na-tural, um nucleosídeo modificado ou um nucleosídeo sintético(artificial).

Os termos "ácido nucléico" e "oligonucleotídeo"são usados permutavelmente para significar múltiplos nucleo-tídeos (ou seja, moléculas compreendendo um açúcar (por e-xemplo, ribose ou desoxirribose) ligado a um grupo fosfato ea uma base orgânica cambiável, descrita acima. Como aqui em-pregado, os termos referem-se a oligorribonucleotideos (ORN)bem como a oligodesoxirribonucleotideos (ODN). Os termos de-vem incluir ainda polinucleosideos (ou seja, um polinucleo-tideo menos o fosfato) e qualquer outro polímero contendobase orgânica. Moléculas de ácido nucléico podem ser obtidasde fontes de ácido nucléico existentes (por exemplo, DNA ge-nômico ou cDNA), porém são preferivelmente sintéticas (por exemplo, produzidas por síntese de ácido nucléico).

Os termos ácido nucléico e oligonucleotídeo tambémabrangem ácidos nucléicos ou oligonucleotídeos com substitu-ições ou modificações, tal como nas bases e/ou açúcares. Porexemplo, eles incluem ácidos nucléicos com açúcares estrutu-rais, os quais são covalentemente ligados a grupos orgânicosde baixo peso molecular, diferentes de um grupo hidroxila naposição 3', e diferente de um grupo fosfato na posição 5'.Assim ácidos nucléicos modificados podem incluir um gruporibose 2'-alquilado. Além disso, ácidos nucléicos modifica-dos podem incluir açúcares tais como arabinose no lugar deribose. Assim, os ácidos nucléicos podem ser heterogêneos nacomposição da cadeia central, contendo portanto, qualquerpossível combinação de unidades poliméricas ligadas junto,tal como ácidos nucléicos de peptídeo (que têm cadeia cen-trai de aminoácido com bases ácido nucléico). Em algumas mo-dalidades, os ácidos nucléicos são homogêneos na composiçãoda cadeia central. Ácidos nucléicos também incluem purinas epirimidinas substituídas, tais como bases C-5 propino modi-ficadas . Wagner RW et al., (19965) Nat Biotechnol 14:840-4.Purinas e pirimidinas incluem, sem limitação, adenina, cito-sina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2, 6-diaminopu'rina, hipoxantina, e ou-tras nucleobases de ocorrência natural e de ocorrência nãonatural, frações aromáticas substituídas e não substituídas.Outras dessas modificações são conhecidas da técnica.

Uma base nucleosídica natural pode ser substituídapor uma base nucleosídica modificada, onde a base nucleosí-dica modificada é, por exemplo, selecionada de hipoxantina;diidrouracila, pseudouracila/ 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5- (C1-6) -alquiluracina, 5-(C2-6) -alqueniluracila, 5- (C2-6) -alquiniluracila, 5-(hidroximetil)uracila; 5-clorouracila, 5-fluoruracila, 5-bromouracila, 5-hidroxicitosina, 5-(C1-6)-alquilcitosina; 5-(C2-6)-alquenilcitosina, 5- (C1-6) -alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorcitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino purina, 8-azapurina (incluindo,particularmente, 8-azaguanina) um 7-deazapurina substituída(incluindo, particularmente, 7-deazaguanina), incluindo 7-deaza-7-substituída e/ou purina 7-deaza-8-substituída; ououtras modificações de uma base nucleosídica natural. Estalista pretende ser exemplar e não interpretada como limitante.

Em particular, quando há pelo menos uma guanosinapresente no ssORN imunoestimulante, pelo menos uma base gua-nina do ssORN imunoestimulante pode ser uma guanina substi-tuída ou modificada tal como 7-deazaguanina, 8-azaguanina,guanina 7-deaza-7-substituída (tal como 7-deaza-7-(C2-6)alquilnilguanina); guanina 7-deaza-8-substituida; hipoxan-tina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, guanina 8-substituida tal como 8-hidroxiguanina e 6-tioguanina. Estarelação pretende ser exemplar e não ser interpretada comolimitante.

Também, particularmente, quando há pelo menos umauridina presente no ssORN imunoestimulante, a pelo menos umabase uracila do ssORN imunoestimulante pode ser uma uracilasubstituída ou modificada tal como pseudouracila e 5-metiluracila.

Para uso na presente invenção, os ácidos nucléicosda invenção podem ser sintetizados de novo usando quaisquerde uma série de procedimentos do conhecimento da técnica.Por exemplo, o método β-cianoetil fosforamidita (Beaucage SLet al., (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); método nucleosí-deio H-fosfonato (Garegg et al. (1986), Tetrahedron Lett27:4051-4; Froehler et al. (1986) Nucl Acid Res 14:5399-407;Garegg et al (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney etal., (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Essas síntesesquímicas podem ser realizada por uma série de sintetizadoresde ácido nucléico automatizados disponíveis o mercado, essesácidos nucléicos são referidos como ácidos nucléicos sinté-ticos. Ácidos nucléicos podem ser preparados de seqüênciasde ácido nucléico existentes (por exemplo, ribossoma, mensa-geiro ou RNA transferidor), usando técnicas conhecidas taiscomo as que empregam enzimas de restrição, exonucleases ouendonucleases, Ácidos nucléicos preparados deste modo sãoreferidos como ácido nucléico isolado. Um ácido nucléico i-solado, em geral, refere-se a um ácido nucléico que é sepa-rado dos componentes com os quais, ele é normalmente associ-ado in natura. Como exemplos um ácido nucléico isolado podeser um que é separado de uma célula, de um núcleo, de mito-côndrias, ou de cromatina. 0 termo "ácido nucléico" abrange,tanto ácido nucléico sintético como isolado.

O ssORN útil de acordo com a invenção são imunoes-timulantes. Como aqui empregado, um ssORN imunoestimulanterefere-se a um ssORN que é capaz de induzir uma resposta i-mune, por exemplo, estimular uma célula do sistema imune pa-ra tornar-se ativada e proliferar, diferenciar, migrar, au-mentar a atividade citolitica, aumentar a expressão dos pro-dutos secretados associados com a ativação celular imune,aumentar a expressão dos marcadores de superfície celular,ou moléculas co-estimulantes associadas com a ativação celu-lar imune, ou quaisquer combinações destes. Produtos secre-tados associados com a ativação celular imune são do conhe-cimento da técnica e podem incluir , sem limitação, citoci-nas, quimiocinas e anticorpos.

O ssORN imunoestimulante da invenção pode ser usa-do para induzir uma resposta imune similar a Thl, tanto invitro como in vivo. Como aqui usado, uma resposta imune si-milar a Thl, refere-se à ativação de células imune para ex-pressar produtos secretados similares a Thl, incluindo algu-mas citocinas, quimiocinas e subclasses de imunoglobulinas eativação de algumas células imune. Produtos secretados simi-lares a Thl, incluem, sem limitação,as citocinas IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18, THF-α e a quimiocina I:-10 (CXCLlO). No ca-mundongo a ativação imune de Thl estimula a secreção deIgG2a. No homem, a ativação imune de Thl estimula a secreçãode IgGl. Portanto, uma resposta imune similar a Thl num ca-mundongo pode incluir secreção aumentada de IgG2a, e umaresposta imune similar a Thl um humano, pode incluir secre-ção aumentada de IgGl. Ativação imune de Thl e similar a Thltambém pode incluir ativação de células NK e células dendrí-ticas, ou seja células envolvidas na imunidade celular. Aativação imune de Thl e similar a Thl é tida por contra-regular a ativação imune de Th2.

0 ssORN imunoestimulante da invenção também podeser usado para induzir uma resposta imune antígeno-especifica, tanto in vitro como in vivo. Como aqui emprega-do, uma resposta imune antigeno-especifica é uma respostaimune adaptada proveniente do contato entre células do sis-tema imune e um antigeno.

0 ermo "antigeno" refere-se a uma molécula capazde provocar uma resposta imune. 0 ermo antigeno no sentidomais amplo, inclui qualquer tipo de molécula que seja reco-nhecida por um sistema hospedeiro como sendo estranha. Anti-genos incluem, sem limitação, antigenos microbianos, antíge-nos de câncer, e alérgenos. Antigenos incluem, sem limita-ção, células, extratos de célula, proteínas, polipeptídeos,peptídeos, polissacarideos, conjugados polissacarideos, pep-tídeo e mímicos não peptídicos de polisssacarídeos e outrasmoléculas, pequenas moléculas, lipídios, glicolipídios ecarboidratos. Muitos antigenos são proteína ou polipeptídeoin natura, como proteínas e polipeptídeos são geralmentemais antigênicos do que os carboidratos ou gorduras.

0 antígeno pode ser um antigeno que é codificadopor um vetor de ácido nucléico ou ele pode ser um antígenoper se. No primeiro caso, o vetor de ácido nucléico é admi-nistrado ao indivíduo e o antígeno é expressado in vivo. Noúltimo caso, o antígeno pode ser administrado diretamente aoindivíduo. Um antígeno não codificado num vetor de ácido nu-cléico como aqui empregado, refere-se a qualquer tipo de an-tígeno, que não seja um ácido nucléico. Por exemplo, em al-guns aspectos da invenção, o antígeno não codificado num ve-tor de ácido nucléico é um peptídeo ou um polipeptídeo. Mo-dificações secundárias das seqüências de aminoácido primá-rias dos antígenos de peptídeo ou polipeptídeo também poderesultar num pólo, que tem atividade antigênica substancial-mente equivalente, se comparado com sua contraparte não mo-dificada, polipeptídeo. Tais modificações podem ser delibe-radas por mutagênese direcionada ao sítio, ou podem ser es-pontâneas. Todos os polipeptídeos produzidos por essas modi-ficações são aqui incluídos no presente, desde que ainda e-xista a antigenicidade. 0 peptídeo ou polipeptídeo pode ser,por exemplo, de origem viral. Os antígenos úteis na invençãopodem ser de qualquer comprimento, variando desde fragmentospeptídicos pequenos de uma proteína ou polipeptídeo de com-primento total até a forma de comprimento total. Por exem-plo, o antígeno pode ter menos que 5, menos que 8, menos que-10, menos que 15, menos que 20, menos que 30, menos que 50,menos que 70, menos que 100, ou mais resíduos de aminoácidoem comprimento, contanto que ele estimule uma resposta imuneespecifica.

Em algumas modalidades, o antigeno é um antigenode câncer. Um "antigeno de câncer" como aqui empregado, é umcomposto, tal como um peptideo ou proteína, associado com umtumor ou superfície celular cancerosa, e que é capaz de pro-vocar uma resposta imune quando expressado na superfície deuma célula apresentando o antigeno no contexto de uma molé-cula MHC. Antigenos de câncer podem ser preparados de célu-Ias de câncer seja por preparação de extratos brutos de cé-lulas de câncer, por exemplo, conforme descrito em Cohen Aet al., (1994) Câncer Res 54:1055-8, por purificação parcialdo antigeno, por tecnologia recombinante ou por síntese denovo dos antígenos conhecidos. Os antígenos de câncer inclu-em, sem limitação, antígenos que são recombinantemente ex-pressados, uma parte imunogênica de, ou um tumor ou câncertotal. Tais antígenos podem ser isolados ou preparados re-combinantemente ou por qualquer outro meio conhecido da téc-nica .

Os termos "antigeno de câncer" e "antigeno de tu-mor" são usados permutavelmente e referem-se a antígenos osquais são expressados, diferencialmente por células de cân-cer e podem portanto, ser explorados de modo a alvejar célu-las cancerosas. Antigeno de câncer são antígenos que podemestimular, potencialmente,respostas imune aparentemente es-pecíficas para tumor. Alguns desses antígenos são codifica-dos, embora não necessariamente expressados, por célulasnormais. Esses antígenos podem ser caracterizados como aque-Ies que são normalmente silenciosos (ou seja, não expressa-dos) em células normais, os que são expressados apenas emalguns estágios da diferenciação e os que são expressadostemporariamente, tal como antigenos embrionários e fetais.

Outros antigenos de câncer são codificados por genes celula-res mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene rasativado), genes supressores (por exemplo, p53 mutante) pro-teínas de fusão resultantes de deleções internas ou translo-cações cromossomais. Outros antigenos de câncer ainda, podemser codificados por genes virais tais como os transportadosem vírus de tumor de RNA e DNA. Exemplos de antigenos de tu-mor incluem MAGE, MART-I/MeIan-A, gplOO, Dipeptidil peptida-se IV (DPPIV), proteína de ligação a adenosina desaminase(ADAbp) ciclofilina b, antígeno colo-retal associado (CRC)-C017-la/Ga733, antígeno carcino-embriônico (CEA) e seus epi-topos imunogênicos CAP-I e CAP-2, etv6, amll, antígeno espe-cífico da próstata (PSA) e seus epitopos imunogênicos PSA-1,PSA-2 e PSA-3, antígeno de membrana específica para próstata(PSMA), cadeia CD3-zeta receptor de célula T, família MAGEde antigenos de tumor (por exemplo, MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9,MAGE-10, MAGE-All, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGECl, MAGE-C2, MAGE-C3,MAGE-C4, MAGE-C5), família GAGE de antigenos de tumor (porexemplo, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6,GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), GABE-RAGE, LAGE-I, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2/neu, p21ras,RCASl, α-fetoproteína, E-caderina, a-catenina, β-catenina eγ-catenina, pl20ctn, gpl00Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, pro-teína polipose coli adenomatosa (APCV), fodrin, Connexin 37,Ig-idiotipo, pl5, gp75, GM2 e GD2 gangliosideos, produtosvirais tais como proteínas do papiloma vírus humano, famíliaSmad de antígeno de tumor, lmp, 1, PIA, antígeno nuclearEBV-codifiçado (EBNA)-I, fosforilase glicogênio cerebral,SSX-1, SSX-2, (HOM-MEL-4 0) SSX-1, SSX-4, SSX-5, SPC-I e CT-7e c-erbB-2.

Cânceres ou tumores e antígenos de tumor associa-dos com tais tumores (porém não exclusivamente), incluemleucemia Iinfoblástica aguda (etv6, amll, ciclofilina b) ,linfoma de célula B (Ig-idiotipo), glioma (E-caderina; a-catenina; a-catenina; γ-catenina, pl2-ctn), câncer de bexiga(p21ras), câncer biliar (p21ras) , câncer de mama (famíliaMUC; HER2/neu; c-erbB-2), carcinoma cervical (p53; p21 ras),carcinoma de cólon (p21ras, HER2/neu; c-erbB-2; famíliaMuC) , câncer colo-retal), antígeno associado a colo-retal(CRC)-C017-1A/GA733; APC) coriocarcinoma (CEA), câncer decélula epitelial (ciclofilina b), câncer gástrico (HER2/neu;c-erbB-2, glicoproteína ga733 ), câncer hepatocelular (a-fetoproteína), linfoma de Hodgkins (lmp-1; EBNA-I), câncerde pulmão (CEA; MAGE-3, NY-ES0-1), leucemia derivada de cé-lula linfóide (ciclofilina b) , melanona (proteína pl5, Gp75,antígeno oncofetal, gangliosideos GM2 e GD2) mieloma (famí-lia MUC; p21ras), carcinoma de pulmão de célula não pequena(HER2/neu; c-erB2), câncer nasofaringiano (lmp-1; EBNA-I),câncer ovariano (família MUC; HER2/neu, c-erbB-2), câncer depróstata (Antígeno Específico para Próstata (PSA) e seus e-pitopos imunogênicos PSA-1, PSA-2 e PSA-3; PSMA; HER2/neu;c-erbA-2), câncer pancreático (p21ras; família MUC,HER2/neu; c-erbB-2; glicoproteína ga733), câncer renal(HER2/neu; c-erbB-2), cânceres de célula escamosa da cérvicee esôfago (produtos virais tais como proteínas de papilomavírus humano) câncer testicular (NY-ESO-I), leucemia de cé-lula T (epitopos HTLV-I) e melanoma (Melan-A/mart-1; CDC27,MAGE-3, p2Iras, gpl00Pmelll7) ·

0 ssORN imunoestimulante da invenção é geralmentepelo menos 5 e não mais que 100 nucleotídeos em comprimento.Em varias de determinadas modalidades o ssORN imunoestimu-lante da invenção não é mais que 40 nucleotídeos em compri-mento, incluindo, de modo específico, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40nucleotídeos em comprimento.

Em algumas modalidades, o ssORN imunoestimulanteda invenção pode incluir uma seqüência poli-G incluindo pelomenos 4 nucleotídeos G consecutivos, contanto que, o ssORNnão seja totalmente composto de poli-G. Numa modalidade, umaseqüência poli-G quando presente, ocupa a extremidade 3' dossORN.

Numa modalidade, o ssORN imunoestimulante da in-venção não é composto inteiramente de poli-U. Numa modalida-de, o ssORN imunoestimulante da invenção não é composto in-teiramente de poli-A. Numa modalidade, o ssORN imunoestimu-lante da invenção não é composto inteiramente de poli-C.Os ssORN da invenção podem ser de uso particularno tratamento de indivíduo com um câncer, indivíduos com umadoença infecciosa, indivíduos com uma doença autoimune, in-divíduos com alergia, e indivíduos com asma, porém sem Iimi-tação a estes.

"Câncer" como aqui empregado, refere-se a um cres-cimento descontrolado de células que interferem com o fun-cionamento normal dos órgãos e sistemas corpóreos. Cânceresque migram de seu local original e semeiam órgãos vitais,podem conduzir, eventualmente à morte do indivíduo atravésda deterioração funcional dos órgãos afetados. Cânceres he-matopoiéticos, tais como leucemia, são capazes de competirextraordinariamente com os compartimentos hematopoiéticosnormais num indivíduos, levando, assim, à falha hematopoié-tica (na forma de anemia, trombocitopenia e neutropenia, (o-casionando finalmente, a morte).

Como aqui empregado, um indivíduo com um câncerrefere-se a um indivíduo que tem células cancerosas detectáveis.

Uma metástase é uma região de células cancerosasdistintas do local primário do tumor, resultante da dissemi-nação de células cancerosas do tumor original para outraspartes do corpo. Na ocasião da diagnose da massa tumoralprimária, o indivíduo pode ser monitorado quanto à presençade metástases. Metástases são mas freqüentemente detectadasatravés do uso único ou combinado de varreduras de imagea-mento de ressonância magnética (MRI), tomografia computado-rizada (CT) , contagens de sangue e plaquetas, análises dafunção hepática, raios-X do peito e varreduras do osso, alémde monitoração dos sintomas específicos.

Cânceres incluem sem limitação, a carcinoma de cé-lula basal, câncer do tato biliar, câncer de bexiga, câncerósseo, câncer de cérebro e do SNC, câncer de mama, câncercervical, coriocarcinoma, câncer de cólon e do reto, câncerdo tecido conjunto, câncer do sistema digestivo, câncer en-dometrial, câncer esofagiano, câncer ocular, câncer da cabe-ça e pescoço, câncer gástrico, neoplasma intra-epitelial,câncer do rim, câncer da laringe, leucemia, câncer do fíga-do, câncer do pulmão (por exemplo, célula pequena e não pe-quena, linfoma incluindo, linfomas de Hodgkin e não-Hodgkin,melanoma, mieloma, neuroblastoma, câncer da cavidade oral(por exemplo, lábios, língua, moca e faringe), câncer ovari-ano, câncer pancreático, câncer da próstata, retinoblastoma,rabdomiosarcoma,, câncer retal, câncer renal, câncer do sis-tema respiratório, sarcoma, câncer de pele, câncer de esto-mago, câncer testicular, câncer da tireóide, câncer uterino,câncer do sistema urinário, bem cimo outros carcinomas esarcomas.

Uma "doença infecciosa" como aqui empregado, refe-re-se a um distúrbio que surge da invasão de um hospedeiro,superficialmente, localmente, ou sistemicamente por um mi-croorganismo infeccioso. Microorganismos infecciosos incluembactérias, vírus, parasitas e fungos.

Como aqui empregado, um indivíduo com uma doençainfecciosa, refere-se a um indivíduo que foi exposto a umorganismo infeccioso, e tem níveis agudos ou crônicos detec-táveis do organismo no corpo. A exposição ao organismo in-feccioso, geralmente ocorrer com a superfície externa do in-divíduo, por exemplo, pele ou membranas da mucosa e/ou refe-re-se à penetração da superfície externa do indivíduo peloorganismo infeccioso.

Exemplos de vírus que foram encontrados em huma-nos, incluem, porém, sem limitação, a Retroviridaef (por e-xemplo, vírus da imunodeficiência humana, tal como HIV-I(também referido como HDTV-III, LAVE ou HTLV-III/LAV, ouHIV-III, e outros isolados, tais como HIV-LP; Picornaviridae(por exemplo, vírus da pólio, vírus da hepatite A, enteroví-rus, vírus Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus); Calcivi-ridae (por exemplo, cepas que causam gastrenterite); Togavi-ridae (por exemplo, vírus da encefalite de eqüinos, vírus darubéola); Flaviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus daencefalite, vírus da febre amarela); Coronoviridae (por e-xemplo, coronavírus); Rhabdoviradae (por exemplo, vírus daestomatite vesicular, vírus da raiva), Filoviridae (por e-xemplo, vírus ebola), Paramyxoviridae (por exemplo, vírus daparainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírussincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, ví-rus da influenza); Bungaviridae (por exemplo, vírus Hantaan,vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo)Arena viridae (vírusda febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, retrovírus,orbivíruses e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (ví-rus da hepatite Β) , Parvovirida (parvovírus) ; Papoviridae(papiloma vírus), polioma vírus); Acenoviridae (a maioriaadenovírus); Herpesviridae (vírus simplex da herpes HSV) 1 e2, vírus zoster da varicela, citomegalovírus (CMV), vírus daherpes; Poxviridae (vírus da varíola, vírus da vaccinia, ví-rus da bexiga); e Iridoviridae (por exemplo, vírus da febresuína africana), e vírus não classificados (por exemplo, oagente da hepatite delta (tido como um satélite defeituosodo vírus da hepatite Β) , o agente da hepatite não-A, não-B(classe 1 = internamente transmitida; classe 2 = parenteral-mente transmitida (ou seja, hepatite C); vírus Norwalk e re-lacionado, e astrovírus).

Bactérias, tanto gram-negativas, como gram-positivas prestam-se como antígenos em animais vertebrados.Tais bactérias gram-positivas incluem, sem limitação, a es-pécies Pasteurella, espécie Staphylococci e espécie Strepto-coccus. Bactérias gram-negativas incluem, sem limitação, Es-esherichia coli, espécies Pseudomonas e espécies Salmonella.

Exemplos específicos de bactérias infecciosas, in-cluem, sem limitação, Helicobacter pyloris, Borrelia burg-dorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por e-xemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulares, M.kansaii, M. gordonae), Spaphylococcus aureus, Neisseria go-norrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes,Streptococcus pyogenes (Streptococcus do Grupo A), Strepto-coccus agalactiaei (Streptococcus do Grupo Β),Streptococcus( grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bo-vis, Streptococcus (anaerobis sps), Streptococcus pneumonia-e, Campylobaeter sp patogênico, Enterococcus sp, Haemophilusinfluenzae, Bacillus antrhacisr Coryebaeterium diphtheriae,Corynebacterium sp, Erysipelothrix rhusiopatiae, Clostridiumperfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes,Klebsiella pneumoniae, Pasteurella multocida, Bacteróidessp, Fusobacterium nucleatum, Streptobacilus moniliformis,Treponema pallidum, Treponame pertenue, Leptospira, Richett-sia e Actinomyees israelli.

Exemplos de fungos incluem, Cryptoeoeeus neofor-mans, Histoplasma Capsulatumr Coceidioides immitis, Blas-tomyees dermatitidis, Chlamydia trachomatis r Cândida albi-eans.

Outros organismos infecciosos (ou seja protistas)incluem Plasmodium spp, tal como Plasmodium falciparum,Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium vivax eToxoplasma gondii. Parasitas que vivem no sangue ou em teci-dos incluem Plasmodium spp, Babesia mieroti, Babesia diver-gens, Leishmania tropiea, Leishmania spp, Leissmania brazi-liensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense e Trypa-nosoma rhodesiense (doença do sono africana), Trypanosonaeruzi (doença de Chagas) e Toxoplasma gondii.

Outros microorganismos relevantes do ponto de vis-ta médico, foram descritos extensivamente na literatura, porexemplo, ver C.G.A. Thomas, Medicai Microbiology BailiiereTindall, Great Britain 1993, cujo conteúdo está ora incorpo-rado por referência.

O ssORN da invenção também é útil para tratamentoe prevenção de doença autoimune. Doenças autoimunes são umaclasse de doenças, nas quais um anticorpo próprio do indiví-duo reage com o tecido hospedeiro ou em que, células T efe-toras imunes são auto-reativas para auto-peptídeos endógenose causam destruição do tecido. Assim, uma resposta imune émontada contra o próprio antigeno do indivíduo, referido co-mo um auto-antígeno. Doenças autoimunes incluem, sem limita-ção, artrite reumatóide, doença de Crohn, esclerose múlti-pia, lúpus eritematoso sistêmico, (SLE), encefalomielite au-toimune, miastenia gravis (MG), tireoidite de Hashimoto,síndrome de Goodpasture, pênfigo (por exemplo, pemphigusvulgaris), doença de Grave, anemia hemolítica autoimue, púr-pura trombocitopenica autoimune, escleroderma com anticorposanti-colágeno, doença do tecido conjuntivo misto, polimiosi-te, anemia perniciosa, doença de Addison idiopática, infer-tilidade autoimune-associada, glomerulonefrite, (por exem-plo, glomerulonefrite crescentic, glomerulonefrite prolife-rativa), penfigoide bulosa, síndrome de Sjõgren, resistênciainsulínica e diabetes melito autoimune.

Como aqui usado, uma alergia refere-se a uma hi-persensibilidade adquirida a uma substancia (alérgeno). Con-dições alérgicas incluem, sem limitação, a eczema, rinitealérgica ou coriza, febre do feno, conjuntivite alérgica,asma brônquica, urticária (qualquer erupção da epiderme) ealergias alimentares, outras condições atópicas, incluindodermatite atópica, anafilaxia, alergia a fármacos, e angioe-dema. Doenças alérgicas incluem, sem limitação, rinite (fe-bre do feno), asma, urticária e dermatite atópica.

Conforme aqui empregado, um indivíduo com uma a-lergia é um indivíduo que possui uma reação alérgica em res-posta a um alérgeno.Um alérgeno, refere-se a uma substância (antigeno)que pode induzir uma resposta alérgica ou asmática num indi-víduo suscetível. A relação de alérgenos é enorme e pode in-cluir polens, venenos de inseto, poeira de animal raivoso,esporos de fungo e fármacos (por exemplo, penicilina). Exem-plos de alérgenos vegetal e animal incluem, sem limitação, aproteínas específicas aos seguintes gêneros: Canis (Canisfamiliaris); Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoidesfarinae; Felis (Felix domesticus); Ambrosia (Ambrosia arte-miisfolia; Lolium (por exemplo, Lolium perenne ou Loliummultiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria(Altrnaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinosasa) ; Bé-tula (Bétula verrucosa); Quercus (Quercus Alba); Olea (oleaEuropa) ; Artemisia (Artemisia vulgaris) ; Plantago (por exem-pio, Plantago lanceolata); Parietaria (por exemplo, Parieta-ria officinalis ou Parietaria judaica); Blatella (por exem-plo, Blatella germânica); Apis (por exemplo, Apis multiflo-rum) ; Cupressus (por exemplo, Cupressus sempervirens, Cu-pressus arizonica e Cupressus macrocarpa); Juniperus (porexemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Junipe-rus communis e Juniperus ashei); Thuya (por exemplo, Thuyiaorientalis); Chamaecyparis (por exemplo, Chamaecyparis obtu-sa) ; Periplaneta (por exemplo, Periplaneta americana); A-gropyron (por exemplo, Agropyron repens ); Secale (por exem-pio, Secale cereale); Triticum (por exemplo, Triticum aesti-vum) ; DActylis (por exemplo, Dactylis glomerata); Festuca(por exemplo, Festuca elatior), Poa (por exemplo, Poa, pra-tensis ou Poá compressa); Avena (por exemplo, Avena sativa);Holcus (por exemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por e-xemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por exemplo,Arrhenatherum elatius); Agrostis (por exemplo, Agrostis al-ba) , Phelum (por exemplo, Phelum pratense); Phalaris (porexemplo, Phalaris arundinacea); Paspalun (por exemplo, Pas-palum notatum); Sorghum (por exemplo, Sorghum halepensis); eBromus (por exemplo, Gromus inermis).

Conforme aqui empregado, asma refere-se a um dis-túrbio do sistema respiratório, caracterizado por inflama-ção, estreitamenteo do sistema aéreo, e maior reatividade dosistema aéreo para agentes inalados. A asma está freqüente-mente, embora não exclusivamente, associada com uma condiçãoatópica ou alérgica. Sintomas de asma incluem episódios re-correntes de coriza, falta de ar e aperto η peito, e tosseresultante da obstrução do fluxo aéreo. A inflamação aéreaassociada com a asma pode ser detectada, através da observa-ção de uma série de alterações fisiológicas tais como, des-pojamento do epitélio aéreo, deposição de colágeno abaixo damembrana basal, edema, ativação de mastócitos, infiltraçãode célula inflamatória, incluindo neutrófilos, eosinófilos,e linfócitos. Como resultado da inflamação das vias aéreas,pacientes com asma experimentam, freqüentemente, hipersensi-bilidade aérea, limitação ao fluxo aéreo, sintomas respira-tórios, e estado de doença crônico. Limitações do passo aé-reo incluem bronco-constricção aguda, edema pulmonar, forma-ção de obstruções da mucosa, e remodelagem pulmonar, carac-terísticas que levam o mais das vezes, à obstrução brônqui-ca. Em alguns casos de asma, pode ocorrer fibrose da membra-na sub-básica levando a anormalidades persistentes na funçãopulmonar.

Conforme aqui empregado, um indivíduo com asma éum indivíduo que tem um distúrbio do sistema respiratório5 caracterizado por inflamação, estreitamento do fluxo aéreo eaumento da reatividade das vias aéreas a agentes inalados. Aasma é freqüentemente, embora não exclusivamente associadacom sintomas atópicos ou alérgicos. A asma também é freqüen-temente embora não exclusivamente associada com contato com10 um iniciador. Um "iniciador" conforme aqui empregado, refe-re-se a uma composição ou condição ambiental que aciona aasma. Iniciadores incluem, sem limitação, alérgenos, tempe-raturas frias, exercícios, infecções virais, SO2.

Os ssORN da invenção podem ser usados sozinhos ou15 combinados com outros agentes terapêuticos. Os outros agen-tes terapêuticos numa modalidade, é um outro ssORN da inven-ção. 0 ssORN e os outros agentes terapêuticos podem ser ad-ministrados simultaneamente ou seqüencialmente. Quando osoutros agentes terapêuticos são administrados simultaneamen-20 te, eles podem ser administrados em formulações idênticas ouseparadas, porém são administrados ao mesmo tempo. Os outrosagentes terapêuticos são administrados em seqüência com umoutro e com ssORN, quando a administração dos outros agentesterapêuticos e do ssORN é temporariamente separada. A sepa-25 ração no tempo entre a administração desses compostos podeser uma questão de minutos, podendo ser mais longa. Outrosagentes terapêuticos incluem, sem limitação, agentes anti-microbianos, agentes anticâncer, agentes antialérgicos, etc.O ssORN da invenção pode ser administrado a um in-divíduo com um agente antimicrobiano. Um agente antimicrobi-ano, conforme aqui empregado, refere-se a um composto de o-corrência natural ou sintético, que é capaz de matar ou ini-bir microrganismos infecciosos. 0 tipo de agente antimicro-biano útil de acordo com a invenção dependerá do tipo de mi-croorganismo com o qual o indivíduo é infectado ou está emrisco de tornar-se infectado. Agentes antimicrobianos inclu-em, sem limitação, agentes antibacterianos, agentes antivi-rais, agente antifúngicos, agente anti-parasitas. Sentençastais como "agente "anti-infeccioso", "agente antibacteria-no", "agente antiviral", "agente antifúngico, "agente anti-parasita"e "parasiticida" têm significados bem estabelecidosaos de prática comum na técnica e são indicados nos textosmédicos padrão. Em resumo, agentes antibacterianos matam ouinibem as bactérias e incluem antibióticos, bem como outroscompostos sintéticos ou naturais com funções similares. An-tibióticos são molécula de baixo peso molecular, os quaissão produzidos como metabólitos secundários por células taiscomo microorganismo. Em geral, os antibióticos interferemcom uma ou mais funções bacterianas ou estruturas que sãoespecíficas para os microorganismos, e que não estão presen-tes nas células hospedeiras. Agentes antivirais podem serisolados de fontes naturais ou sintetizados e são de utili-dade para matar ou inibir vírus. Agentes antifúngicos sãousados para tratar infecções fúngicas superficiais bem comoinfecções fúngicas sistêmicas oportunistas e primárias. A-gentes antiparasitários matam ou inibem os parasitas.Exemplos de agente antiparasitários, também refe-ridos como parasiticidas úteis para administração humana in-cluem, sem limitação, albendazol, anfotericina B, benzimida-zol, bitionol, cloroquina HCl, cloroquina fosfato, clindami-5 cina, desidroemetina, dietilcarbamazina, fluroato de diloxa-nida, eflornitina, furazolidona, glicocorticóides, halofan-trina, iodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, me-glumina, antimoniato, melarsoprol, metrifonato, metronida-zol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, i-10 setionato de pentamidina, piperazina, praziquantel, fosfatode primaquina, proguanil, pamoato de pirantel, pirimetamina-sulfonamidas, pirimetamina-sulfadoxina, quinacrina HCl, sul-fato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, esti-bogluconato de sódio (gluconato antimônio de sódio), surami-15 na, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, tri-metroprim-sulfametoxazol, e triparsamida, alguns dos quaissão usados sozinhos ou em combinação com outros.

Agentes antibacterianos matam ou inibem o cresci-mento ou função das bactérias. Uma grande classe de agentes20 antibacterianos são antibióticos. Antibióticos, que são efi-cazes par matar ou inibir uma grande faixa de bactérias, sãoreferidos como antibióticos de largo espectro. Outros tiposde antibióticos são predominantemente eficazes contra asbactérias da classe gram-negativa ou gram-positiva. Esses25 tipos de antibióticos são referidos como antibióticos de pe-queno espectro. Outros antibióticos eficazes contra um únicoorganismo ou doença e não contra os outros tipos de bacté-rias são referidos como antibióticos de espectro limitado.Agentes antibacterianos são algumas vezes classificados combase em seu modo primário de ação. Em geral, agentes anti-bacterianos são inibidores da síntese de parede celular, i-nibidores da membrana celular, inibidores da síntese de pro-5 teína, síntese de ácido nucléico ou inibidores funcionais einibidores competitivos.

Agentes antivirais são compostos que previnem ainfecção de células por vírus ou replicação de vírus dentroda célula. Existem muito menos fármacos antivirais do que10 fármacos antibacterianos devido ao processo de replicaçãoviral estar tão estreitamente relacionado com a replicaçãodo DNA dentro da célula hospedeira, que os agentes antivi-rais não específicos seriam, freqüentemente tóxicos ao hos-pedeiro. Há inúmeros estágios dentro do processo de infecção15 viral que podem ser bloqueado ou impedido por agentes anti-virais. Esses estágios incluem ligação do vírus à célulahospedeira (imunoglobulina ou peptídeos de ligação), desen-capeamento do vírus (por exemplo, amantadina) , síntese outradução do mRNA viral (por exemplo, interferon), replicação20 de RNA ou DNA viral (por exemplo, análogos de nucleotídeo) ,maturação de novas proteínas viróticas (por exemplo, inibi-dores de protease) e germinação e liberação do vírus.

Análogos ode nucleotídeo são compostos sintéticosque são similares aos nucleotídeos, porém que têm um grupo25 desoxirribose ou ribose incompleta ou anormal. Uma vez osanálogos de nucleotídeo estarem na célula, eles são fosfori-lados, produzindo o trifosfato formado que compete com osnucleotídeos normais para incorporação ao DNA ou RNA viral.Uma vez a forma de trifosfato do análogo de nucleotídeo sejaincorporada à cadeia do ácido nucléico em formação, ele oca-siona associação irreversível com a polimerase viral e, por-tanto, terminação da cadeia. Análogos de nucleotídeo inclu-5 em, sem limitação, aciclovir (usado para o tratamento do ví-rus da herpes simplex e vírus de varicella-zoster), ganci-clovir (útil para tratamento de citomegalovírus) , idoxirudi-na, ribavirina (útil para tratamento do vírus sincicial res-piratório) , didesoxiinosina, didesoxicitidina, zidovudina(azidotimidina(, imiquimod e resimiquimod.

Os interferons são citocinas que são secretadaspor células infectadas por vírus , bem como células imune.Os interferons funcional por ligação a receptores específi-cos em células adjacentes às células infectadas, causando a15 mudança na célula que o protege da infecção pelo vírus. In-terferons α e β induzem a expressão de moléculas MHC deClasse I e Classe II na superfície de células infecta-das , resultando em apresentação aumentada do antígeno parareconhecimento da célula imune hospedeira. Interferons α e βestão disponíveis como formas recombinantes e foram usadospara tratamento de infecção por hepatite BeC crônica. Nasdosagens que são eficazes para terapia antiviral, os inter-ferons têm graves efeitos colaterais, como febre, mal-estar,e perda de peso.

Agentes antivirais, úteis na invenção incluem, semlimitação, imunoglobulinas, amantadina, interferons, análo-gos de nucleotídeo e inibidores de protease. Exemplos espe-cíficos de antivirais incluem, sem limitação, Acemanan, Aci-clovir, Aciclovir de sódio, Adefovir, Alovudina, Alvircept,Sudotox, Cloridrato de Amantadina, Aranotina, Arildona, Me-silato de Atevirdina, Avridina, Cidofovir, Cipanfilina, Clo-ridrato de Citarabina, Mesilato de delavirdina, Desciclovir,Didanosina, Disoxaril, Edoxudina, Enviradeno, Enviroxima,Fanciclovir, Cloridrato de Famotina, Fiacitabina, Fialuridi-na, Fosarilato, Foscarnet de sódio, Fosfonet de sódio, Gan-eielovir, Gancielovir de sódio, Idoxuridina, Ketoxal, Lami-vudina, Lobucavir, Cloridrato de Memotina, Metisazona, Nevi-rapina, Penciclovir, Pirodavir, Ribavirina, Cloridrato derimantadina, mesilato de Saquinavir, Cloridrato de Somanta-dina, Sorivudina, Statolon, Stavudina, Cloridrato de Tiloro-na, Trifluridina, Cloridrato de Valaciclovir, Vidarabina,Fosfato de Vidarabina, Fosfato de Vidarabina de sódio, Viro-xima, Zalcitabina, Zidovudina e Zinviroxima.

Agentes antifúngieos são úteis para o tratamento eprevenção de fungos infecciosos. Agentes antifúngieos sãoalgumas vezes classificados por seu mecanismo de ação. Al-guns agentes antifúngieos funcional como inibidores da pare-de celular, por inibição de glicose sintase. Estes incluem,sem limitação, basiungin-ECB. Outros agente antifúngieosfuncionam por desestabilização da integridade da membrana.Estes incluem, sem limitação, imidazóis, tais como clotrima-zol, sertaconzol, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, mi-conazol, e voriconacol, bem como FK 463, anfotericina B, BAY38-9502, MK 991, ipradimicina, UK 292, butenafina, e terni-nafina. Outros agentes antifúngieos funcionam por ruptura daquitina (por exemplo, quitinase) ou imunossupressão (501creme).

O ssORN da invenção também pode ser administradoem conjunto com uma terapia anticâncer. Terapias anticâncerincluem medicamentos de câncer, radiação e procedimentos ci-rúrgicos. Conforme aqui empregado, um "medicamento de cân-cer' refere-se a um agente que é administrado a um indivíduocom a finalidade de tratar um câncer. Conforme aqui emprega-do, "tratar um câncer" inclui prevenção do desenvolvimentode um câncer, redução dos sintomas do câncer, e/ou inibiçãodo crescimento de um câncer consolidado. Em outros aspectos,o medicamento de câncer é administrado a um indivíduo emrisco de desenvolver um câncer para fins de redução do riscode desenvolver o câncer. Vários tipos de medicamentos pratratamento de câncer estão aqui descritos. Para finalidadedeste relatório descritivo, medicamentos de câncer são clas-sificados como agentes quimioterápicos, agente imunoterapêu-ticos, vacinas de câncer, terapia hormonal, e modificadoresda resposta biológica.

O agente quimioterápico, pode ser selecionado dogrupo consistindo de metotrexato, vincristina, adriamicina,cisplatina, cloroetil nitrosouréias que não contém açúcar,5-fluoruracila, mitomicina C, bleomicina, doxorubicina, da-carbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina,carmustaína e poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inibidor defarnesil transferase RAS, inibidor de famesil transferase,MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994,TNP-470, Hicantin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, No-vantrona, Mitroxantrona, Metaret/Suramin, Batimastat, ■ E7070,BCH-4 55 6, CS-682, 9AC, AG3340, AG3433, Incel/VS-710, VS-853,ZDOlOl, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat,

BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD 18305, DX8951Í, LemonalDP 2202, FK 317, iPicibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Me-tastron, derivado de estrôncio, Temodal/Temozolomida, Eva-cet/doxorrubicina lipossomal, Yewtaxan/Paclitaxel, Ta-xol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulon,Doxifluridina,Ciclopax/paclitaxei oral, Taxóide Oral SPU-077/Cisplatina,HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609(754)/inibidor de RAS oncogênico, BMS-18275/platina oral,URT (Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisol, intensificador deEniluracil/77 6C8 5/5FU , Levamisol/Camptol, Campto-

sar/Irinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribina,Paxex/Paclitaxel, Doxil/doxorubicina lipossomal, Ca-elyx/doxorubicina lipossomal, Fludara/Fludarabina, Farmaru-bicina/Epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/bis-naftalimida, LU 103793/Dolastain,a Caetyx/doxorrubicina li-possomal, Gemzar/Gemcitabina, ZD0473/Anormed,YM 116, semen-tes de iodo, inibidores de CDK4 e CDK2, inibidores de PARP,D4809/dexifosamida, Ifes/Mesnex/Ifosamida, Vumon/Teniposida,Paraplatina/Carboplatina, Plantinol/cisplatina, Vepesi-da/Etoposideo, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, prodrogas deguanina arabinosideo, Análogo do Taxano, nitrosoureias, a-gentes de alquilação, tais como melfelan e ciclofosfamida,Aminoglutetimida, Asparaginase, Busulfan, Carboplatina, Clo-rombucil, Cloridrato de Citarabina, Dactinomicina, Cloridra-to de Daunorubicina, Fosfato de estramustina de sódio, Eto-posídeo (VPl6-213), Floxuridina, Fluoruracil (5-FU),m Fluta-mida, Hidroxiuréia (hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interfe-ron alfa-2a, alfa-2b, Acetato de leuprolida (análogo do fa-tor liberador de LHRH), Lomustina (CCNU), Cloridrato de Me-cloretamina (mostarda de nitrogênio), Mercaptopurina, Mesna,Mitotato (ο.ρ'-DDD), Cloridrato de Mitoxantrona, Octreoti-deo, Plicamicina, Cloridrato de procarbazina, Estrptozocina,Citrato de Tamoxifen, Tiogranina, Tiotepa, Sulfato de Vin-blastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Eritropoietina,Hexametilmelamina (HMM), Interleucina 2, Mitograzona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanil-hidrazona; MGBG), Pentostatin(2'-desoxicoformicina), Semustina (metil-CCNU) , Teniposideo(VM-26) e Sulfato de Vindesina, não estando porém a esteslimitado.

O agente imunoterapêutico pode ser selecionado dogrupo consistindo de Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Pano-rex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMARTMl95, ATRAGEN, O-varex Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22 OV103,3622X94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2,MELIMMUNE-1 CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H,BNI-250, EMD-72000, LiymphoCide, CMA 676, Monofarm-C 4B5,ioregf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab,SMART IDlOAb, SMART ABL364 Ab e ImmuRAIT-CEA, não estando, porém, aestes limitado.

A vacina contra câncer pode ser selecionada dogrupo consistindo de EGF, vacinas do câncer anti-idiotipicas, antigeno Gp75, vacina d emelanoma GMK, vacinade conjugado MGV gangliosideo, Her2/neu, Ovarex. M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratopo, BLP25 (MUC-I), vacina idiotí-pica lipossomal, Melacina, vacinas antigênicas peptidicas,vacinas toxina/antigeno, vacina baseada em MVA, PACIS, vaci-na BCG, TA-HPV, TA-CIN,virus DISC e IMMuCyst/TheraCys, nãoestando a estes limitado.

O ssORN da invenção pode ser administrado a um in-divíduo com um medicamento asma/alergia. Um "medicamento as-ma/alergia" conforme aqui empregado, é uma composição quereduz os sintomas ou previne o desenvolvimento , ou inibeuma reação asmática ou alérgica. Vários tipos de medicamen-tos para tratamento da asma e alergia estão descritos emGuidelines For The Diagnosis and Management os Asthma, Ex-pert Panei Report 2, Publicação NIH η° 97/4051, 19 de julhode 1997, cujo conteúdo está ora incorporado por referência.O resumo dos medicamentos estão descritos na publicação HIHapresentada abaixo. Na maioria das modalidades o medicamentopara asma/alergia é útil em algum grau para tratamento, tan-to da asma como da alergia.

Medicamentos para tratamento da asma, são geral-mente separados em duas categorias, mediação de alívio ime-diato, e medicação para controle a longo prazo. Pacientes deasmas tomam a medicação para controle a longo prazo, numabase diária para adquirir e manter controle de asma persis-tente. Mediações de controle a longo prazo incluem agentesantiinflamatórios tais como corticosteróides, cromolina desódio e nedocromil; broncodilatadores de longa duração, taiscomo agonistas β2 de longa duração, e metilxantinas, e modi-ficadores leucotrienos. As medicações de alívio imediato in-cl uem agonistas β2 de curta duração, anti—colinérgicos θcorticosteróides sistêmicos. Há muitos efeitos colateraisassociados a cada um desses fármacos e nenhum dos fármacossozinhos ou em combinação é capaz de prevenir ou tratar cora-pletamente a asma.

Medicamentos de asma incluem, sem limitação, ini-bidores de PDE-4, agonistas beta-2/broncodilatadores, abri-dores do canal de potássio, antagonistas de VLA-4, antago-nisstas de neuroquina, inibidores da síntese de tromboxanoA2 (TXA2), xantinas, antagonistas do ácido araquidônico, i-nibidores de 5 lipoxigenase, antagonistas do receptor deTXA2, antagonista de TXA2, inibidor de proteínas de ativaçãode 5-lipox e inibidores de protease.

Broncodilatadores/agonistas β2 são uma classe decompostos os quais causam broncodilatação ou relaxamentomuscular liso. Agonistas β2/broncodilatadores, incluem, semlimitação, salmeterol, salbutamol, albuterol, terbutalina,D2522/formoterol, fenoterol, bitolterol, pirbuerol metilxan-tinas e orciprenalina. Agonistas β2 de longa duração e bron-codilatadores são compostos usados para prevenção a longoprazo dos sintomas alem de terapias antiinflamatórias. Ago-nistas β2 de longa duração incluem, sem limitação, salmete-rol e albuterol. Esses compostos são normalmente usados emcombinação com corticosteróides, e geralmente não são usadosem qualquer terapia inflamatória. Eles estiveram associadoscom efeitos colaterais tais como taquicardia, tremor muscu-lar esquelético, hipocalemia e prolongamento do intervaloQTc em overdose.Metilxantinas, incluindo, por exemplo, teofilina,foram empregados para controle e prevenção dos sintomas alongo prazo. Esses compostos ocasionam broncodilatação, re-sultante da inibição de fosfodiesterase e, provavelmente an-tagonismo de adenosina. Toxicidades agudas relacionadas adose são um problema particular com esses tipos de compostos. Como resultado, a concentração do soro rotineira deve sermonitorada de modo a levar em conta a toxicidade e faixa te-rapêutica estreita que surge das diferenças individuais nadepuração metabólica. Efeitos colaterais incluem taquicardi-a, taquiarritmia, náusea e vômitos, estimulação do sistemanervoso central, dor-de-carbeca, ataque, hematêmese, hiper-glicemia e hipocalemia. Agonistas β2 de curta ação, incluem,sem limitação, albuterol, bitolterol, pirbuterol, e terbuta-Iina. Alguns dos efeitos adversos associados com a adminis-tração de agonistas β2 de curta ação, incluem taquicardia,tremor muscular esquelético, hipocalemia, ácido láctico au-mentado dor-de-cabeça e hiperglicemia.

Métodos convencionais para tratamento ou prevençãode alergia envolveram o uso de anti-histaminicos ou terapiasde dessensibilização. Anti-histaminicos e outros fármacosque bloqueiam os efeitos de mediadores químicos da reaçãoalérgica ajudam a regular a gravidade dos sintomas alérgi-cos, porém não evitam a reação alérgica e não têm efeito nasrespostas alérgicas subseqüentes. Terapias de dessensibili-zação são realizadas oferecendo pequenas doses de um alérge-no, normalmente por injeção sob a pele, de modo a induziruma resposta tipo IgG contra o alérgeno. Acredita-se que, apresença do anticorpo IgG ajuda a neutralizar a produção demediadores resultantes da indução de anticorpos IgE. Inici-almente, o indivíduo é tratado com uma dose muito baixa doalérgeno para evitar indução de uma reação grave sendo a do-se lentamente aumentada. Este tipo de terapia é perigosaporque o indivíduo é realmente administrado com os compostosque ocasionam a resposta alérgica podendo resultar em gravesreações alérgicas.

Medicamentos para alergia incluem, sem limitação,anti-histamínicos, esteróides, e indutores de prostaglandi-na. Anti-histamínicos são compostos de contra-ação da hista-mina liberada por mastóctos ou basófilos. Esses compostossão do conhecimento da técnica e são usados normalmente paratratamento da alergia. Anti-histaminas incluem, sem limita-ção, a astemizol, azelastina, betastatina, buclizina, cete-rizina, análogos de cetirizina, CS 560, desloratadina, ebas-tina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, levocabastina, Io-ratidina, mizolastina, norastemizol, terfenadina e trani-Iast.

Indutores de prostaglandina são compostos que in-duzem atividade de prostaglandina. As prostaglandinas fun-cionam por regulagem do relaxamento do músculo liso. Induto-res de prostaglandina incluem, sem limitação, S-5751.

Os medicamentos asma/alergia também incluem este-róides e imunomoduladores. Os esteróides incluem, sem limi-tação, beclometasona, fluticasona, triamcinolona, budesoni-da, corticosteróides e budesonida.Corticosteróides incluem, sem limitação, dipropio-nato de beclometasona, budesonida, flunisoli,da propionatode fluticaosona e triancinolona acetonida. Embora dexameta-sona seja um corticosteróide com ação antiinflamatória, elenão é usado regularmente para o tratamento da asma/alergianuma forma de inalação, por ser altamente absorvido e terefeitos colaterais supressivos a longo prazo numa dose efi-caz. Dexametasona, contudo, pode ser usado de acordo com ainvenção para o tratamento da asma/alergia pois quando admi-nistrado em combinação com ácidos nucléicos da invenção elepode ser administrado a uma baixa dose para reduzir os efei-tos colaterais. Alguns dos efeitos colaterais associados comcorticosteróides incluem tosse, disfonia, afta, (candidía-se), e em maiores doses, efeitos sistêmicos, tais como su-pressão adrenal, osteoporose, supressão do crescimento, afi —namento da pele e facilidade em contundir-se. Barnes & Pe-terson (1993) Am Rev Respir Dis 148:S1-S26, e Kamada AK etal., (1996) Am J REspir Crit Care Med 153:1739-48.

Corticosteróides sistêmicos incluem sem limitação,metilprednisolona, prednisolona e prednisona. Corticosterói-des estão associados com anormalidades reversíveis nometabolismo da glicose, apetite aumentado, retenção defluido, ganho de peso, alteração do humor, hipertensão,úlcera péptica, e necrose asséptica do osso. Esses compostossão úteis para prevenção a longo prazo (3-10 dias) de reaçãoinflamatória em asma persistente inadequadamente controlada.Eles também funcionam numa prevenção a longo prazo desintomas em asma persistente grave para impedir e controlar,asma persistente grave para impedir e controlar, revertendo,de fato, a inflamação.

Alguns efeitos colaterais associados com uso numtempo maior incluem supressão do eixo adrenal, supressão docrescimento adelgaçamento dérmico, hipertensão, diabetes,sindrome de Cushing, cataratas, fraqueza muscular, e em ra-ros exemplos função imune prejudicada. Recomenda-se que, es-ses tipos de compostos sejam utilizados em sua menor doseeficaz (linhas de referência para o diagnóstico e gerencia-mento da asma, relatório versado do quadro a; NIH Publicaçãoη ° 97-4051, julho/1997) .

Os imunomoduladores incluem, sem limitação, aogrupo consistindo de agente antiinflamatórios, antagonistasleucotrienos, muteinas IL-4, receptores de IL-4 solúveis,imunosupressores (tais como vacina peptidica benigna), anti-corpos anit-IL-4, antagonistas de IL-4, anticorpos anti-IL-5, proteínas de fusão Fc do receptor de IL-13 solúvel, anti-corpos anti-IL-9, antagonistas de CCRF3, antagonistas deCCR5, inibidores de VLA-4, e infra-reguladores de IgE.

Modificadores de leucotrieno são freqüentementeusados para o controle e prevenção a longo prazo de todos ossintomas na asma branda persistente. Modificadores de leuco-trieno funcionam como antagonistas do receptor de leucotrie-no por competirem seletivamente para os receptores de LTD-4e LTE-4. Esses compostos incluem, sem limitação, comprimidosde zafirlukast e comprimidos de zileuton. Comprimidos de zi-leuton funcionam como inibidores de lipoxigenase 5. Essesfármacos estiveram associados com a elevação das enzimas he-páticas e alguns casos de hepatite reversível e hiperbilir-rubinemia. Leucotrienos são mediadores bioquímicos que sãoliberados de mastócitos, eosinófilos, e basófilos que causama contração do músculo liso aéreo e aumentam a permeabilida-de vascular, secreções da mucosa e ativam células inflamató-rias no trato aéreo de pacientes com asma.

Outros imunomoduladores incluem neuropeptídeos quedemonstraram ter propriedades imunomoduladoras. Testes fun-cionais demonstraram que a substância P por exemplo, podeinfluenciar a função linfocítica por mecanismos mediados pe-lo receptor específico. A substância P também demonstrou mo-dular respostas de hipersensibilidade imediata distintas porestimulação da geração de mediadores derivados do ácido ara-quidônico de mastócitos mucosais. McGillies J et al. (1987)Fed Proc 46:196-9 (1987). A substância P é um neuropeptídeoprimeiramente identificado em 1931. Von Euler e Gaddum JPhysiol (London) 72:74-87 (1931). Sua seqüência de aminoáci-do foi descrita por Chang et al. em 1971. Chang MM et al(1971) Nature New Biol 232:86-87. A atividade imunorregula-dora de fragmentos da substância P foi analisada por SiemionIZ et al. (1990) Molec Immunol 27:887-890 (1990).

Uma outra classe de compostos são os infra-reguladores de IgE. Esses compostos incluem peptídeos ou ou-tras moléculas com capacidade de ligar-se ao receptor de IgEe assim, prevenir a ligação do IgE específico para antígeno.Um outro tipo de infra-regulagem de IgE é um anticorpo mono-clonal direcionado contra a região de ligação ao receptor deIgE da molécula IgE humana. Assim um tipo de infra-regulagemde IgE trata-se de um anticorpo anti-IgE ou fragmento de an-ticorpo. Anti-IgE está sendo desenvolvido por Genentech. Operito na técnica poderia preparar fragmentos de anticorpofuncionalmente ativos de peptideos de ligação dotados de i-gual função. Outros tipos de infra-reguladores de IgE sãopolipeptideos capazes de bloquear a ligação do anticorpo IgEaos receptores de Fc nas superfícies celulares e deslocarigE de sítios de ligação com os quais IgE já está ligado.

Um problema associado com infra-reguladores de IgEé que, muitas moléculas não têm uma resistência de ligaçãoao receptor correspondente a interação muito forte entre amolécula de IgE nativa e seu receptor. As moléculas com estaresistência tendem a ligar-se irreversivelmente ao receptor.Contudo, tais substâncias são relativamente tóxicas, vistopoderem ligar-se covalentemente e bloquear outras moléculasestruturalmente similares no corpo. De interesse neste con-texto é que a cadeia α do receptor de IgE pertence a uma fa-mília de gene maior, onde, por exemplo, vários dos diferen-tes receptores Fc de IgC estão contidos, esses receptoressão absolutamente essenciais para a defesa do corpo contra,por exemplo, infecções bacterianas. Moléculas ativadas paraligação covalente, são além disso freqüentemente relativa-mente, instáveis e, portanto, elas têm provavelmente de seradministradas varias vezes ao dia, e então, em concentraçõesrelativamente altas de modo a tornar possível bloquear com-pletamente o agrupamento continuamente renovado dos recepto-res de IgE em mastócitos e leucócitos basófilos.Cromolina de sódio e nedocromil são usados comomedicações de controle a longo prazo para prevenção de sin-tomas principalmente da asma que surgem de exercício ou sin-tomas alérgicos oriundos de alérgenos. Esses compostos sãotidos por bloquear reações prematuras e tardias a alérgenos,interferindo com a função do canal de cloreto. Eles tambémestabili zam membranas de mastócitos e inibem a ativação eliberação de mediadores dos eosinófilos e células epiteli-ais. Um período de quatro a seis semanas de administração éem geral necessário para se conseguir o máximo de benefício.

Anticolinérgicos são em geral usados, para alíviodo brocoespasmo agudo. Esses compostos são tidos por funcio-narem mediante inibição competitiva dos receptores colinér-gicos muscarínicos. Anticolinérgicos incluem sem limitação abrometo de ipratrópio. Esses compostos revertem apenas bro-coespasmo colinergicamente mediados e não modificam qualquerreação ao antígeno. Efeitos colaterais incluem secura da bo-ca e secreções respiratórias, respiração ofegante aumentadaem alguns indivíduos, e visão turvada caso pulverizado nosolhos.

Para o uso in vitro e in vivo, ssORN da invençãosão em geral usados numa quantidade eficaz. Conforme aquiempregado, uma quantidade eficaz refere-se em geral, a qual-quer quantidade que seja suficiente para se conseguir um de-sejado efeito biológico. Numa modalidade, uma quantidade e-ficaz é uma quantidade clinicamente eficaz, onde uma quanti-dade clinicamente eficaz é qualquer quantiadade que seja su-ficiente para tratar um indivíduo com uma doença. Conformeaqui empregado, tratar e tratamento, referem-se a reduzir,eliminar, ou prevenir pelo menos um sinal ou sintoma de umadoença, num indivíduo com a doença ou em risco de doença.Conforme aqui empregado, um indivíduo refere-se a um humanoou a outro mamífero.

Combinado com os ensinamentos aqui proporcionados,pela escolha dentre os vários compostos ativos e fatores depeso tais como potência, biodisponibilidade relativa, pesocorpóreo do paciente, gravidade dos efeitos colaterais ad-versos e modo de administração preferido, um regime de tra-tamento profilático ou terapêutico eficaz pode ser planeja-do, de modo a não causar toxicidade substancial e ainda sereficaz para tratar o indivíduo em questão. A quantidade efi-caz para qualquer aplicação particular pode variar dependen-do de fatores tais como a doença ou condição sendo tratada,o ssORN particular sendo administrado, o tamanho do indiví-duo, ou a gravidade da doença ou condição. Um habilitado natécnica pode determinar empiricamente a quantidade eficaz deum ssORN particular, e/ou outro agente terapêutico sem pre-cisar de experimentação indevida. Prefere-se, em geral queuma dose máxima seja usada, ou seja, a maior dose segura deacordo com alguns julgamentos médicos. Doses múltiplas pordia, podem ser abrangidas para se conseguir níveis apropria-dos sistêmicos dos compostos. Níveis sistêmicos apropriadopodem ser determinados por exemplo, por medição do pico dopaciente ou nível de plasma prolongado do fármaco. "Dose" e"dosagem" são aqui empregados permutavelmente.Em geral, doses diárias orais dos compostos ativosficaram em cerca de 0,001 miligramas/ kg por dia a 1000 mi-ligramas, kg por dia. Espera-se que as doses orais na faixade 0,5 a 50 miligramas/kg em uma ou mais administrações pordia, produzam os resultados desejado. A dosagem pode ser a-justada adequadamente para se conseguir níveis do fármacodesejados, local ou sistêmico, dependendo do modo de admi-nistração. Por exemplo, espera-se que, a administração in-travenosa seja de uma a várias ordens da menor dose por dia.

No caso de que a resposta num indivíduo seja insuficientenessas doses, mesmo doses maiores (ou doses maiores eficazespor uma via de distribuição diferente, mais localizada) podeser empregado até o ponto em que seja permitida a tolerânciapor parte do paciente. Múltiplas doses por dia são vistasconseguir níveis sistêmicos apropriados dos compostos.

Para qualquer composto aqui descrito a quantidadeterapeuticamente eficaz pode ser inicialmente determinada demodelos animais. Uma dose terapeuticamente eficaz também po-de ser determinada de dados humanos para ssORN que foramtestados em humanos e para compostos os quais sejam conheci-dos por apresentarem atividades farmacológicas similares,tais como outros agentes ativos relacionados. Doses maiorespodem ser necessárias para administração parenteral. A doseaplicada pode ser ajustada com base na biodisponibilidaderelativa e potência do composto administrado. o ajuste dadose para se conseguir eficácia máxima com base nos métodosdescritos supra e outros métodos são bem conhecidos na téc-nica, dentro das capacidades do versado na prática comum datécnica.

De modo a promover distribuição de ssORN para ascélulas, o ssORN opcionalmente pode ser apresentado, formu-lado ou de outro modo combinado com um lipidio catiônico.Numa modalidade, tal lipidio catiônico é DOTAP.

Para uso na terapia, uma quantidade eficaz dossORN pode ser administrado a um indivíduo por qualquer modoque libere o ssORN até a superfície desejada. A administra-ção da composição farmacêutica da presente invenção pode serrealizada por qualquer meio conhecido na técnica. Vias pre-feridas de administração incluem, sem limitação, administra-ção oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublingual,intra-traqueal, inalação, ocular, vaginal e retal.

O ssORN da invenção pode ser fornecido a um deter-minado tecido, tipo de célula ou ao sistema imune, ou a am-bos, com auxílio de um vetor, em seu sentido mais amplo, um"vetor" é qualquer veículo capaz de facilitar a transferên-cia das composições para as células alvo. O vetor, em geral,transporta o ssOrN, anticorpo, antígeno, e/ou medicamentoespecífico ao distúrbio, para as células alvo com degradaçãoreduzida, em relação ao ponto de degradação que resultariana ausência do vetor.

Geralmente, os vetores úteis na invenção são divi-didos em duas classes: vetores biológicos e vetores quími-cos/físicos. Vetores biológicos e vetores químicos/físicossão úteis na distribuição e/ou absorção dos agentes terapêu-ticos da invenção.Conforme aqui empregado, um "vetor químico/físico'refere-se a uma molécula natural ou sintética diferente da-quela derivada de fontes bacteriológicas ou virais, capazesde distribuir o ssORN e/ou outros medicamentos.

Um vetor quimico/fisico preferido da invenção é umsistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloi-dais incluem sistemas à base de lipidio incluindo emulsõesóleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sis-tema coloidal preferido da invenção é um lipossoma. Liposso-mas são vasos de membrana artificiais que são úteis como umvetor de distribuição in vivo ou in vitro. Demonstrou-seque, vesiculas unilamelares grandes (LUVs), variando em ta-manho de 0,2 - 4,0 μπι podem encapsular grandes macromolécu-las. RNA, DNA, e virions intatos podem ser encapsulados nointerior aquoso e podem ser distribuídos a células numa for-ma biologicamente ativa. Fraley et al (1981) Trends BiochemSci 6:77.

Lipossomas podem ter em mira um dado tecido poracoplamento do lipossoma a um ligante específico tal como umanticorpo monoclonal, açúcar, glicolipídio ou proteína. Li-gantes que podem ser de utilidade para alvejamento de um li-possoma a uma célula imune incluem, sem limitação: fragmen-tos de moléculas ou moléculas intatas que interagem com re-ceptores e moléculas específicas para célula imune, tais co-mo anticorpos que interagem com os marcadores de superfíciecélular de células imune. Tais ligantes podem ser facilmenteidentificados por ensaios de ligação do conhecimento da téc-nica. Em outras modalidades ainda, o lipossoma pode ser al-vejado para o câncer por acoplamento Dele a um dos anticor-pos imunoterapêuticos descritos antes. Adicionalmente, o ve-tor pode ser acoplado a um peptideo de alvejamento nuclear,que irá direcionar o vetor ao núcleo da célula hospedeira.

Formulações lipidicas para transfecção são comer-cialmente disponíveis de QIAGEN, por exemplo, comoEFFECTENE™ (u lipidio não lipossomal com um intensificadorde condensação do DNA especial) e SUPERFECT™ (uma nova tec-nologia dendrimérica de ação).

Os lipossomas são comercialmente disponíveis deGibco BRL, e,g como LIPOFECTIN™ e LIPOFECTACE™, que são for-mados de lipídios catiônicos, tais como cloreto de N-[1-(2, 3-dioleilóxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) e bro-meto de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Métodos para pro-dução de lipossomas são do conhecimento da técnica e foramdescritos em muitas publicações. Lipossomas também foramdescritos por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

Numa modalidade, o veículo é uma micropartícula ouimplante biocompatível adequado(a) para implante ou adminis-tração ao paciente mamífero. Implantes biodegradáveis úteisde acordo com este método estão descritos no Pedido Interna-cional publicado WO 95/24929, intitulado "Polymeric Gene De-livery System" WO 95/24929 descreve uma matriz polimérica, biocompatível, preferivelmente biodegradável para conter umgene exógeno sob controle de um promotor apropriado. A ma-triz polimérica pode ser usada para conseguir liberaçãocontrolada do agente terapêutico no indivíduo.A matriz polimérica preferivelmente está na formade uma micropartícuia, tal como uma microesfera (onde o áci-do nucléico e/ou outro agente terapêutico é disperso por to-da uma matriz polimérica sólida) , ou uma microcápsula (onde5 o ácido nucléico e/ou o outro agente terapêutico é armazena-do no núcleo de um envoltório polimérico). Outras formas dematriz polimérica para contenção do agente terapêutico in-cluem filmes, revestimentos, geles, implantes e stents. 0tamanho e composição do dispositivo de matriz polimérica é10 selecionado para resultar em cinética de liberação favorávelno tecido para o qual a matriz é introduzida. 0 tamanho damatriz polimérica ainda é selecionado de acordo com o métodode distribuição que deve ser usado, tipicamente injeção a umtecido u administração de uma suspensão por aerossol às ares15 nasais e/ou pulmonares. Preferivelmente, quando uma via emaerossol é usada, a matriz polimérica e o ácido nucléicoe/ou o outro agente terapêutico são abrangidos num veiculotensoativo. A composição da matriz polimérica pode ser sele-cionada para ter, velocidades de degradação favoráveis e20 também serem formadas de um material que é bioadesivo, paraaumentar mais ainda a eficácia de transferência, quando amatriz é administrada a uma superfície nasal e/ou pulmonarque tenha sofrido uma lesão. A composição matriz também podeser selecionada para não degradar, ao contrário liberar por25 difusão durante um período prolongado de tempo., Em algumasmodalidades preferidas, o ácido nucléico é administrado aoindivíduo via um implante enquanto o outro agente terapêuti-co é administrado intensamente. Microesferas biocompatíveisadequadas para fornecimento, tais como fornecimento oral oumucosal, estão apresentadas em Chichering et al (1996) Bio-tech Bioeng 52:96-101 e Mathiowitz E et al., (1997) Nature386:410-414 e Pedido de Patente PCT WO 97/03702.

Matrizes poliméricas tanto biodegradáveis como nãobiodegradáveis, podem ser empregadas para fornecer o ácidonucléico, e/ou outro agente terapêutico ao paciente. Matri-zes biodegradáveis são preferidas. Tais polímeros podem sernaturais ou polímeros sintéticos. O polímero é selecionadocom base no período de tempo durante o qual a liberação édesejada, em geral da ordem de umas poucas horas até um anou mais. Tipicamente a liberação durante um período que variaentre umas poucas horas e três a doze meses é mais preferí-vel, particularmente para os agentes de ácido nucléico. Opolímero, opcionalmente está na forma de um hidrogel, quepode absorver até cerca de 90% de seu peso na água e aindaser, opcionalmente reticulado com íons multivalentes ou ou-tros polímeros.

Polímeros bioadesivos de interesse particular in-cluem hidrogéis biodegradáveis descritos por H.S. Sawhney,C.P. Pathak e J.A. Hubell em Macromolecules, (1993) 26:581-587, cujos ensinamentos estão ora incorporados por referên-cia. Estes incluem ácidos poli-hialurônicos, caseína, gela-tina, glutinina, polianidridos, ácido poliacrílico alginato,quitosana, poli(metacrilatos de metila), poli(metacrilatosde etila), poli(metacrialto de butila), poli(metacrilato deisobutila), poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato deisodecila), poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilatode fenila), poli(acrilato de metila) , poli(acrilato de iso-propila), poli(acrilato de isobutila) e poli(acrilato de oc-tadecila).

0 emprego de agentes de compactação também ode serdesejável. Agentes de compactação também podem ser usadossozinhos, ou em combinação com um vetor biológico ou quími-co/físico. Um "agente de compactação" conforme aqui emprega-do, refere-se a um agente, tal como uma histona, que neutra-liza as cargas negativas do ácido nucléico e, portanto, per-mite compactação do ácido nucléico a um granulo fino. A com-pactação do ácido nucléico facilita a absorção do ácido nu-cléico pela célula alvo. Os agentes de compactação podem serusados sozinhos, ou seja, fornecer um ácido nucléico na for-ma que seja mais eficientemente absorvida pela célula, ouainda mais preferivelmente, em combinação com um ou mais dosvetores supracitados.

Outras composições exemplares que podem ser usadasa fim de facilitar a absorção de um ácido nucléico incluemfosfato de cálcio e outros mediadores químicos de transporteintracelular, composições de microinjeção, eletroporação ecomposições de recombinação homóloga (por exemplo, para in-tegração de um ácido nucléico a um local pré-selecionadodentro do cromossoma da célula alvo).

Os compostos podem ser administrados sozinhos (porexemplo, em solução salina ou tampão) ou pelo uso de qual-quer vetor de distribuição conhecido da técnica. Por exem-plo, os veículos de fornecimento a seguir foram descritos:cocleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomes(Vancott et al. , 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowatet al., 1993, Calrsson et al., 1991, Hu et. al., 1998, Moreinet al., 1999); Iipossomas (Childers et al. , 1999, Michaleket al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b), vetores bacterti-anos vivos (por exemplo, Salmonella, Escherichia coli, baci-lo de Calmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus), (Hone etal., 1996, Pouwels et al, 1998, Chatfield et al., 1993, Sto-ver et al., 1991, Nugent et al., 1998); vetores virais vivos(por exemplo, Vacinia, adenovirus, Herpes Simplex), (Galli-chan et al, 1993, 1995, Mos set al. , 1996, Nugwent et al. ,1998, Flexner et al. , 1988, Morrow et al., 1999); microesfe-ras (Gupta et al. , 1998, Jones et al. , 1996, Maloy et al. ,

1994, Moore et al., 1995, 0'Hagan et al, 1994, Eldrige etal., 1989); vacinas de ácido nucléico (Fynan et al. , 1993,Kuklin et al, 1997, Sasaki et al, 1998, Okada et al, 1997,Ishii et al., 1997), polímeros (por exemplo, carboximetilce-lulose, quitosana), (Hamajima et al, 1998, Jabbal-Gill etal., 1998); anéis poliméricos (Wyatt et al., 1998); proteos-somas (Vancott et al. , 1998, Lowell et al. , 1988, 1996, 1997), fluoreto de sódio (Hashi et al., 1998), plantastransgênicas (Tacket et al, 1998, Mason et al., 1998, Haq etal., 1995), virossomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al,

1995, Cryz et al. , 1998); e partículas similares a vírus(Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998).

As formulações da invenção são administradas emsoluções farmaceuticamente aceitáveis, que podem conter, ro-tineiramente concentrações farmaceuticamente aceitáveis desal, agentes tampão, conservantes, veículos compatíveis, ad-juvantes e, opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

0 termo veículo farmaceuticamente aceitável signi-fica um ou mais cargas, diluentes ou substâncias de encapsu-5 lação sólidas ou líquidas, adequadas para administração a umhumano ou outro animal vertebrado. O termo veículo indica umingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético,com o qual o ingrediente ativo é combinado a fim de facili-tar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuti-10 cas também são capazes de ser triturados com os compostos dapresente invenção e entre si, num modo tal, que não haja in-teração, o que prejudicaria, substancialmente, a desejadaeficiência farmacêutica.

Para administração oral, os compostos (ou seja15 ssORN) e, opcionalmente outros agentes terapêuticos) podemser formulados prontamente combinando-se o composto ativocom veículos farmaceuticamente aceitáveis do conhecimento datécnica. Tais veículos permitem aos compostos da invençãoserem formulados em comprimidos, pílulas drágeas, cápsulas20 líquidos, geles, xaropes soluções aquosas, suspensões e si-milar, para ingestão oral, por um indivíduo em tratamento.Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidascomo excipiente sólido, opcionalmente triturando uma misturaresultante e processando a mistura de grânulos, após adicio-25 nar auxiliares adequados, caso desejado, ap rase obter com-primidos ou núcleos de drágeas. excipientes adequados, sãoparticularmente, cargas como açúcares, incluindo, lactose,sacarose, manitol, ou sorbitol, preparações de celulose, talcomo por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido dearroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil ce-lulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose desódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Caso desejado agen-tes de desintegração pode ser adicionados, tais como polivi-nilpirrolidona reticulada, agar-ágar ou ácido alginico ou umsal deste, tal como alginato de sódio. Opcionalmente, asformulações orais também podem ser formuladas em solução sa-lina ou tampões, por exemplo, EDTA, para neutralizar condi-ções acidas internas ou podem ser adiministradas semqualquer veiculo.

Também estão de modo especifico abrangido, formasde dosagem oral do componente ou componentes supra. O compo-nente ou componentes podem ser quimicamente modificados demodo que a distribuição oral do derivado seja eficaz. Em ge-ral, a modificação química analisada é a união de pelo menosuma fração à própria molécula do componente, onde tal fraçãopermite (a) inibição de proteólise e (b ) absorção para acorrente sangüínea do estomago ou intestino. Também é dese-jado aumentar a estabilidade global do componente ou compo-nentes e aumentar o tempo de circulação no corpo. Exemplosde tais frações incluem polietileno glicol, copolímeros deetileno glicol e propileno glicol, carboximetil celulose,dextrana, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona e poli-prolina. Abuchowski e Davis, 1981, "Soluve Polymer-EnzymeAdducts" Em: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Robets, edi-tores, Wiley-Interscience, N. Y. pa1gs. 367-383; Newmark, etal., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Outros polímeros quepodem ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano. São preferidos para uso farmacêutico como indica-do supra, frações de polietileno glicol.

Para o componente (ou derivado) , o local da Iibe-ração pode ser o estomago, o intestino delgado (o duodeno, ojejuno ou o ileo), ou o intestino grosso. Aquele habilitadona prática técnica disporá de formulações as quais não sedissolverão no estômago, ainda que liberem o material ao du-odeno, ou algures, no intestino. Preferivelmente, a libera-ção evitará os efeitos prejudiciais do meio estomacal sejapor proteção do ssORN (ou derivado) ou por liberação de seumaterial biologicamente ativo para além do meio estomacal,tal como ao intestino.

Para garantir completa resistência gástrica um re- vestimento impermeável a um pH de pelo menos 5,0 é essenci-al. Exemplos dos ingredientes inertes mais comuns empregadoscomo revestimento entéricos são trimelitato acetato de celu-lose (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP),HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato acetato de polivinila (PVAP)< Eudragit L30D, Aquateric, ftalato acetato de celulose (CAP),Eudragit L, Eudragit S, e Shelac. Esses revestimentos podemser usados como filmes mistos.

Um revestimento ou mistura de revestimentos tambémpodem ser empregados, os quais não se destinam proteção contra o estomago. Este pode incluir revestimentos de açú-car, ou revestimentos que tornam o comprimido mais fácil dedeglutir. Casulas pode ser compostas de um envoltório durotal como gelatina, para fornecimento de terapêuticos secos(ou seja, pó. Para formas líquidas, um envoltório de gelati-na mole pode ser empregado. 0 material envoltório de cachetspode ser amido espesso ou outro papel comestível. Para pílu-las, pastilhas, comprimidos moldados ou comprimidos tritura-dos, técnicas de formação de massa úmida podem ser emprega-das.

O terapêutico pode ser incluído na formulação comoparticulados múltiplos finos na forma de grânulos ou pelotasde tamanho de partícula de cerca de 1 mm. As formulações domaterial para administração de cápsula podem ser também umpó, torrões ligeiramente prensados ou até mesmo como compri-midos. O terapêutico pode ser preparado por compressão.

Colorantes e agentes aromatizantes podem tambémestar incluídos. Por exemplo, o ssORN (ou derivado) pode serformulado (tal como por encapsulação de lipossoma ou micro-esfera), e a seguir ainda encerrado dentro de um produto co-mestível, tal como uma bebida refrigerada contendo corantese agentes aromatizantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do terapêuticocom um material inerte. Esses diluentes podem incluircarboidratos, especialmente manitol, α-lactose, lactoseanidra, celulose, sacarose, dextranas e amido modificado.Alguns sais inorgânicos podem ser empregados também comocargas, incluindo trifosfato de cálcio, carbonato demagnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmentedisponíveis são Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress eAvicell. Desintegrantes podem ser incluídos na formulaçãodo terapêutico para uma forma de dosagem sólida. Materiaisusados como desintegrantes incluem, sem limitação, amido,incluindo o desintegrante comercial com base em amido, Ex-plotab. Glicolato amido de sódio, Amberlite, carboximetilce-lulose de sódio, ultramilopectina, alginato de sódio, gela-tina, casa de laranja, ácido carboximetil celulose, esponjanatural e bentonita podem ser todos empregado. Uma outraformar de desintegrantes são as resinas de troca catiônicainsolúveis. Gomas pulverizadas podem ser usadas como desin-tegrantes e como aglutinantes e estes incluem gomas pulveri-zadas tais como Agar-ágar, goma caraia ou tragacanto. Ácidoalginico e seu sal de sódio são também úteis como desinte-grantes .

Aglutinantes podem ser empregados para manter oagente terapêutico junto para formar um comprimido duro eincluem materiais de produtos naturais como acácia, traga-canto, amido e gelatina. Outros incluem metil celulose (MC),etil celulose (EC) e carboximetil celulose (CMC), polivinil-pirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetil celulose (HPMC) podemambos ser usados em soluções alcoólicas para granular o terapêutico.

Um agente anti-atrito pode ser incluído na formu-lação do terapêutico para evitar grudar durante o processoda formulação. Lubrificantes podem s empregados como uma ca-mada entre o terapêutico e a parede da matriz, e estes in- cluem, sem limitação, a ácido esteárico, incluindo seus saisde magnésio e cálcio, politetrafluoretileno (PTFE), parafinalíquida, óleos vegetais e ceras. Lubrificantes solúveis tam-bém podem ser usados tais como lauril sulfato de sódio, lau-ril sulfato de magnésio, polietileno glicol de vários pesosmoleculares, Carbowax 4000 e 6000.

Deslizantes que podem melhorar as propriedades defluxo do fármaco durante a formulação e para auxiliar o re-arranjo durante a compressão podem ser adicionados. Os des-lizantes podem incluir amido, talco, silica pirogênica e a-luminato de silício hidratado.

Para auxiliar na dissolução do terapêutico ao am-biente aquoso deve ser adicionado um tensoativo como um a-gente de umectação. Tensoativos podem incluir detergentesaniônicos tais como lauril sulfato de sódio, dioctil sulfos-sucinato de sódio, e dioctil sulfonato de sódio. Detergentescatiônicos devem ser usados e podem incluir cloreto de ben-zalcônio ou cloreto de benzetônio. A relação de detergentespotenciais não iônicos que poderiam ser incluídos na formu-lação como tensoativos são lauromacrogol 400, estearato depolioxil 40, óleo de rícino de polioxietileno hidrogenado10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60,65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose ecarboximetil celulose. Esses tensoativos poderiam se apre-sentar na formulação do ssORN ou derivado, sejam sozinhos oucomo uma mistura em diferentes coeficientes.

Preparações farmacêuticas que podem ser usadas o-ralmente incluem cápsulas de aperto feitas de gelatina, bemcomo cápsulas vedadas, moles feitas de gelatina e um plasti-ficante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de aper-to podem conter os ingredientes ativos em mistura com a car-ga tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, e/ou Iu-brificantes, tais oco talco ou estearato de magnésio e, op-cionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostosativos, pode ser dissolvidos ou suspensos em líquidos ade-quados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polieti-Ieno glicol líquido. Além disso, estabilizantes podem seradicionados também. Microesferas formuladas para administra-ção oral, também podem ser usadas. Tais microesferas forambem especificadas na técnica . Todas as formulações para ad-ministração oral devem estar em dosagens adequada para essaadministração.

Para administração bucal, as composições podem to-mar a formar de comprimidos ou pastilhas formuladas de modoconvencional.

Para administração por inalação, os compostos paraemprego de acordo com a presente invenção podem ser forneci-dos convenientemente na forma de um spray de aerossol de em-balagens pressurizadas ou um nebulizados, com o emprego deum propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluormetano,triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de car-bono, ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressu-rizado a unidade de dose pode ser determinada proporcionandouma válvula para fornecer uma quantidade medida. Cápsulas ecartuchos de, por exemplo, gelatina para emprego num inala-dor ou insuflador, podem ser formuladas para conter uma mis-tura de pó do composto e um uma base de pó adequada tal comolactose ou amido.

Também são aqui considerados um fornecimento pul-monar do ssORN (ou seus derivados) . O ssORN (ou derivado) éfornecido aos pulmões de um mamífero, quando da inalação eatravessa o revestimento epitelial do pulmão até a correntesangüínea. Outros relatos de moléculas inaladas incluem Ad-jei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjeiet ali, 1990, International Journal of Pharmaceutics,63:135-144 (acetato de leuprolida); Braquet et al. , 1989,Journal of Cardiovascular Pharmacolog, 13 (suppl. 5); 143-146 (endotelina-1); Hubbard et al., 1989, Annals of InternaiMedicine, 111:206-212 (alfa 1-antitripsina); Smith et al. ,1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-l-proteinase) ; Osweinet al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings ofSymposium on Respiratory drug Delivery II, Keystone, Colo-rado, March, (hormônio do crescimento humano recombinante) ;Debs et al. , 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (gama-interferon e fator α de necrose tumoral) e Platz et al., Pa-tente U.S. 5.284.656 (fator estimulante de colônia granuló-cito ). Um método e composição para distribuição pulmonar defármacos para efeito sistêmico está descrito na Patente U.S.5.451.569, concedida em 19 de setembro de 1995 a Wong et al.

Considera-se para uso na prática desta invençãouma ampla faixa de dispositivos mecânicos destinado sa dis-tribuição pulmonar de produtos terapêuticos, incluem, semlimitação, nebulizadores, inaladores de doses medidas, e i-naladores de pó, todos os quais sendo familiares aos peritosna técnica.

Alguns exemplos específicos de dispositivos comer-cialmente disponíveis para a prática desta invenção são onebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Ind., St.Louis, Missouri; ο nebulizador Aconrn II, fabricado por Mar-quest Medicai Produtos, Englewood, Colorado; o inalador dedose medida Ventolin, fabricado por Glaxo Ind., ResearchTriangle Park, North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler,fabricado por Fisons Corp, Bedford, Massachusetts.

Todos esses dispositivos, requerem o uso de formu-lações adequads para dispensar o ssORN ( ou derivado). Tipi-camente, cada formulação é especifica ao tipo de dispositivoempregado e pode envolver o uso de um material propelente apropriado, além dos diluentes adjuvantes e/ou veículos co-muns úteis na terapia. Também se considera o uso de liposso-mas, microcápsula ou microesferas, complexos de inclusão ououtros tipos de veículos. ssORN quimicamente modificado tam-bém pode ser preparado em diferentes formulações dependendodo tipo de modificação química ou tipo do dispositivo empre-gado .

Formulações adequadas para uso com um nebulizador,quer a jato ou ultra-sônico, compreenderão, tipicamentessORN (ou derivado) dissolvido em água a uma concentração decerca de 0,1 a 25 mg do ssORN biologicamente ativo por mL dasolução. A formulação pode ainda incluir um tampão e um açú-car simples (por exemplo, para estabilização do ssORN e re-gulagem da pressão osmótica). A formulações de nebulizadorpode conter ainda um tensoativo, para reduzir ou prevenir aagregação superficial induzida por ssORN ocasionada por ato-mização da solução formando o aerossol.

Formulações para emprego com um dispositivo inala-dor de dose medida compreenderão, em geral, um pó finamentedividido contendo o ssORN (ou derivado) suspenso num propul-sor com auxilio de um tensoativo. O propulsor pode ser qual-quer material convencional empregado para este fim, tal comoum clorofluorcarbono, um hidroclorofluorcarbono, um hidro-fluorcarbono, ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofIuor-metano, diclorodifluormetano, diclorotetrafluoretanol e1,1,1,2-tetrafluoretano ou combinações destes. Tensoativosadequados inlcluem trioletato de sorbitan e lecitina de so-ja. Ácido oléico também pode ser útil como um tensoativo.

Formulações para fornecimento de um dispositivoinalador de pó compreenderão um pó seco finametne divididocontendo ssORN (ou derivado) e também podem incluir um agen-te de volume, como lactose, sorbitol, sacarose, ou manitolem quantidaes que facilitam a disperabilidade do pó do dis-positivo, por exemplo, 50 a 90% em peso da formulação. OssORN (ou derivado) deve, ser preparado, com mais vantagem,na forma de particulado com um tamanho médio de partículainferior a 10 μL (micra), mais preferivelmente 0,5 a 5 μπι,para uma distribuição mais eficaz ao pulmão distai.

A distribuição nasal de uma composição farmacêuti-ca da presente invenção também é considerada. A distribuiçãonasal permite a passagem de uma composição farmacêutica dapresente invenção para a corrente sangüínea diretamente, a-pós administração do produto terapêutico ao nariz, sem ne-cessidade de deposição do produto no pulmão. Formulações pa-ra distribuição nasal incluem aquelas com dextrana ou ciclo-dextrana.Para administração nasal, um dispositivo útil é umfrasco duro, pequeno, ao qual é anexado um pulverizador dedose medida. Numa modalidade, a dose medida é distribuídapuxando-se a composição farmacêutica da solução da presenteinvenção para uma câmara de volume definido, cuja câmarapossui uma abertura dimensional para um aerossol e formula-ção de aerossol formando uma pulverização, quando se compri-me um líquido na câmara. A câmara é comprimida para adminis-trar a composição farmacêutica da presente invenção. Numa modalidade específica, a câmara é uma disposição em êmbolo.Tais dispositivos são comercialmente disponíveis.

Alternativamente, emprega-se um frasco de apertarde plástico, com um orifício dimensionado a aerossolizar umaformulação de aerossol formando uma pulverização quando a- pertada. A abertura é normalmente encontrada no topo dofrasco, e o topo é em geral afunilado para ajustar-se, par-cialmente nas passagens nasais para eficiência de adminis-tração da formulação em aerossol. Preferivelmente, o inala-dor nasal proporcionará uma quantidade medida da formulação em aerossol, para administração de uma dose medida do fárma-co.

Os compostos, quando se deseja fornecê-los siste-micamente, podem ser formulados para administração parente-ral, por injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infu-são contínua. As formulações para injeção podem se apresen-tar na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ouem recipientes de múltiplas doses, com um conservante aí a-dicionado. As composições pode tomar essas formas como sus-pensões, soluções, ou emulsões, em óleo ou em veículos aquo-sos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentesde suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Formulações farmacêuticas para administração pa-renteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos naforma hidrossolúvel. Adicionalmente, suspensões dos compos-tos ativos podem ser preparadas como suspensões em injeçãooleosa apropriada. Solventes lipofílicos adequados ou veícu-los incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou és-teres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etilaou trigicérides,ou lipossomas. Suspensões de injeção aquosapodem conter substâncias que aumentar a viscosidade das sus-pensão, tal como carboximetil celulose de sódio, sorbitol,ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão pode conter Aida es-tabilizantes ou agentes apropriados que aumentam a solubili-dade dos compostos para permitir a pré de soluções altamenteconcentradas.

Alternativamente, os compostos ativos podem estarna forma de pó para reconstituição com um veículo adequado,por exemplo, água isenta de pirogênio estéril antes do uso.

Os compostos também podem ser formulados em compo-sições retais ou vaginais tais como supositórios ou enemasde retenção, por exemplo, bases para supositório convencio-nais, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.Além das formulações descritas anteriormente, os

compostos também podem ser formulados como preparações dedispositivo de reserva. Formulações de longa ação podem serformuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequa-dos (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ouresinas de troca de íon, ou como derivados escassamente so-lúveis, por exemplo, como um sal escassamente solúvel.

As composições farmacêuticas também podem compre- ender veículos ou excipientes de fase sólida ou gel adequa-dos. Exemplos desses veículos o excipientes incluem, sem li-mitação, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açú-cares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímerostais como polietileno glicol.

Formas de preparação farmacêutica sólida ou líqui-da adequadas, são, por exemplo, soluções aquosa ou salinapara inalação, cocleadas ou microencapsuladas, revestidassobre partículas d ouro microscópicas, encerradas em liosso-mas, nebulizadas, aerossóis, pelotas para implante à pele,ou secas sobre um objeto pontiagudo para ser esfregado napele. AS composições farmacêuticas também incluem grânulos,pós, comprimidos, comprimidos revestidos, microcápsulas, su-positórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, gotas oupreparações com liberação controlada dos compostos ativos,em cuja preparação, os excipientes e aditivos e/ou auxilia-res, como desintegrantes, aglutinantes agentes de revesti-mento, agentes de tumefação, lubrificantes, aromatizantes,adoçantes ou solubilizantes são costumeiramente empregadoscomo descrito supra. As composições farmacêuticas são ade- quadas para uso numa série de sistemas de fornecimento defármaco. Para uma breve revisão dos métodos para fornecimen-to de fármaco, ver Langer Science 249: 1527-1533, 1990, oraincorporado por referência.O ssORN e, opcionalmente outros terapêuticos podemser administrados per se (puros) ou na forma de um sal far-maceuticamente aceitável. Quando usados na medicina os saisdeve ser farmaceuticamente aceitáveis, porém sais não farma-ceuticamente aceitáveis podem ser usados de forma convenien-te na preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis des-tes. Esses sais incluem, sem limitação, os preparados do se-guintes ácidos : ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico,nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, para-tolueno sulfônico, tartárico, cítrico, metanossulfônico,fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônico, e ben-zeno-sulfônico. Ainda, tais sais podem ser preparados comosais de metal alcalino ou alcalino terrosos, tais como saisde sódio, potássio ou cálcio do grupo do ácido carboxílico.

Agentes tampão adequados incluem ácido e um sal(1-2% peso/volume); ácido cítrico e um sal (1-3% pe-so/volume );ácido bórico e um sal (0,5-2,5% peso/volume); eácido fosfórico e um sal (0,8-2% peso/volume). Conservantesadequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003-0,03% pe-so/volume); clorobutanol (0,3-0,9% peso/volume); parabeno(0,01-0,25% peso/volume) e timerosal (0,004-0,02% pe-so/volume).

Composições farmacêuticas da invenção contém umaquantidade eficaz de um ssORN e opcionalmente, um ou maisagentes terapêuticos adicionais inclusos num veículo farma-ceuticamente aceitável.

O(s) agente(s) terapêutico(s), incluindo de modoespecífico, porém não limitado aos ssORN, podem ser provi-denciados em partículas. Partículas como aqui empregado,significa nano- ou microparticulas (ou em alguns casos mai-or) , consistindo no todo ou em parte do ssORN ou de outroagente terapêutico conforme aqui descrito. As partículas po-dem conter o agente terapêutico(s) num núcleo envolvido porum revestimento, incluem, sem limitação, um revestimento en-térico. 0(s) agente terapêutico(s) também podem ser disper-sos por toda a partículas. 0 agente terapêutico também podeser adsorvido nas partículas. As partículas podem ser de qualquer ordem de cinética de liberação, incluindo liberaçãode ordem zero, liberação de primeira ordem, liberação de se-gunda ordem, liberação prolongada, liberação controlada, li-beração imediata, e qualquer outra combinação, etc. A partí-cula pode incluir além do agente terapêutico quaisquer mate-riais rotineiramente empregados na técnica da farmácia e me-dicina, incluindo, sem limitação, materiais trituráveis, nãotrituráveis, biodegradáveis ou não biodegradáveis ou combi-nações dos mesmos. As partículas podem ser microcápsulascontendo o ssORN num solução ou num estado semi-sólido. Aspartículas podem ser, virtualmente, de qualquer formato.

Ambos os materiais poliméricos biodegradáveis enão biodegradáveis podem ser empregados na manufatura daspartículas para fornecimento do agente terapêutico. Tais po-límeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. 0 polí-mero é selecionado com base no período de tempo durante oqual se deseja a liberação. Polímeros bioadesivos de inte-resse particular incluem hidrogeis bio-desgastaveis descri-tos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak e J.A. Hubell em Macromu-lecules, (1993), 26:581-587, cujos ensinamentos estão oraincorporados.

Estes incluem ácido poli-hialurônico, caseina, ge-latina, glutina, polianidridos, ácido poliacrilico, algina-to, quitosana, poli(metacrilatos de metila), po-li (metacrilatos de etila), poli(metacrilato de butila), po-li (metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila),poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de lauri-la) , poli(metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila),poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila) epoli(acrilato de octadecila).

O(s) agente terapêutico (s) podem estar encerradosem sistemas de liberação controlados. O termo "liberaçãocontrolada" destina-se a referir-se a qualquer formulaçãocontendo o fármaco em que o modo e perfil da liberação dofármaco da formulação é controlado. Isto refere-se a formu-lações imediatas, bem como a liberação não imediata, comformulações de liberação não imediatas, incluindo, sem limi-tação, a formulações de liberação controlada e liberaçãoprolongada. O termo "liberação controlada" (também se referea "liberação prolongada") é usado em seu sentido convencio-nal para referir-se a uma formulação de fármaco que propor-ciona liberação gradual de um fármaco durante um períodoprolongado de tempo, e que preferivelmente, embora não ne-cessariamente resulte em níveis sangüíneos substancialmenteconstantes de um fármaco durante um período prolongado detempo. O termo "liberação prolongada" é usado em seu sentidoconvencional para referir-se a uma formulação de fármaco emque existe um prolongamento de tempo entre a administraçãoda formulação e a liberação do fármaco da mesma. "Liberaçãoprolongada"pode ou não envolver liberação gradual da drogadurante um periodo prolongado de tempo, e assim, pode ou não ser "liberação controlada".

o uso de um implante de liberação controlada alongo prazo pode ser particularmente adequado para tratamen-to de condições crônicas. "Liberação a longo prazo" conformeaqui empregado, significa que o implante é construído e dis-posto para fornecer níveis terapêuticos do ingrediente ativopor pelo menos 7 dias, e preferivelmente, 30-60 dias. Im-plantes de liberação controlada a longo prazo são do conhe-cimento dos de prática comum na técnica e incluem algunssistemas de liberação descritos supra.

A presente invenção está ilustrada ainda pelos E-xemplos a seguir, que de modo algum devem ser construídoscomo limitantes. Todo o conteúdo de todas as referencias(incluindo referencias na literatura, patentes concedidas,pedidos de patente publicados, e pedidos de patente copen-dentes) citados por todo este relatório estão ora incorpora-dos, expressamente, por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Reconhecimento Independente de TLR& de RNA Fosfo-diéster de Fita Simples

Células mononucleares de sangue periférico foramisoladas de camundongos do tipo selvagem e TLR-J-, transfe-ridas para um meio de crescimento adequado, e a seguir colo-cadas em alíquotas separadas em poços individuais de placasde cultura de múltiplos poços. Os seguintes agentes foramadicionados aos poços individuais de células: RNA63 PD, umORN de fita simples, com uma seqüência de nucleotídeo pro-posta como 5'-CAGGUCUGUGAU-3'(SEQ ID NO: 1), em que todas asligações internucleotídicas são fosfodiéster, exceto por umaligação fosforotioato entre o A e U na extremidade 3'do ORN;RNA63 PTO um ORN de fita simples com a mesma seqüência denucleotídeo de SEQ ID NO: 1, em que cada ligação internucle-otídica é fosforotioato; CpG-ODN 1668, um oligodesoxinucleo-tídeo com uma seqüência de nucleotídeo proposta como 5'-• TCCATGACGTTCCTGATGCT-3' (SEQ ID NO: 2); apenas DOTAP; R-848;RNA63 PTO mais DOTAP; RNA63 PD mais DOTAP; e apenas meio. Ascélulas foram mantidas em cultura por 24 horas, e a seguiros sobrenadantes dos poços individuais foram coletados e a-nalisados usando ensaio imunoabsorvente ligado à enzima(ELISA), específico para IL-12p40. Os resultados demonstram-se na Figura 2. Os dados apresentam-se como média ± SEM.

Como se vê na Figura 2, tanto RNA 6 3 PD e RNA 6 3PTO, quando adicionados com DOTAP, induziram IL-12p40 em cé-lulas do tipo selvagem. Em contraste, entretanto, RNA63 PDporém não RNA63 PTO, quando adicionado com COTAP induziu IL-12p40 em células TLR 7-/-. Este último resultado apóia o co-nhecimento de que ORN de fita simples com cadeia central defosfodiéster, porém não de fosforotioato, induz ativação i-mune num modo independente de TLR-7.

Exemplo 2RNA63 PD Induz IL-12p40 num Modo Dose-Dependente eAinda Induz IL-6 e IFN-α em Células Dendríticas Induzidaspor FLT3-L de Camundongos ILRl-/-

Células dendríticas induzidas por FLT3-L forampreparadas de camundongos tipo selvagem e TLRy-/- , sendocultivadas na presença de quantidades variadas de RNA63 PDou RNA63 PTO cada um com DOTAP. Após 2 4 horas de incubação,os sobrenadantes foram coletados e analisador por ELISA paraIL-12p40, IIL-6 e IFN-α. LPS, R-848, CpG-ODN 1668, CpG-ODN2216 (5'-GGGGGACGATCGTCGGGGG-3'SEQ ID NO: 3), apenas DOTAP eapensa meio foram testados como controles. Os resultados de-monstram-se na Figura 3. Os dados são apresentados como mé-dia ± SEM.

Como se vê na figura, tanto RNA63 PD e RNA63 PTOcada um na presença de DOTAP, induziram quantidades signifi-cativas de IL-12p40 (FIG. 3a), IL-6 (Figura 3B) e IFN-α (Fi-gura 3C) em células dendríticas tipo selvagem. Em contraste,contudo, RNA63 PD, porém não RNA63 PTO, quando adicionadocom DOTAP, induziu IL-12p40 e, embora menos poderosamente,tanto IL-6 e IFN-α em células dendríticas TLR7-I-. A quanti-dade de IL-12p40 induzido por RNA63 PD em células dendríti-cas TLR7-J- variou em proporção à concentração de RNA63 PD.

Exemplo 3

RNA63 PD, Mas não RNA63 PTO Induz CD69 em CélulasDendríticas Induzidas por FLT3-L de Camundongos TlRl-I-

Células dendríticas induzidas por FLT3-L forampreparadas de camundongos tipo selvagem e TLR7-/- e cultiva-das por 24 horas na presença de RNA 63 PD ou RNA63 PTO cadaqual com DOTAP, como no Exemplo 2. Após 24 horas de incuba-ção, as células foram coletadas e analisadas por FACS quantoa CD69. Os resultados demonstram-se na Figura 4.

Como se vê na Figura 4, tanto RNA 63 PD como RNA63PTO ,cada qual na presença de DOTAP, induziram quantidadessignificativas de CD69 em células dendriticas do tipo selva-gem (dois quadros à esquerda). Em contraste, entretanto,RNA63 PD porém não RNA63 PTO, quando adicionados com DOTAP,induziam CD69 em células dendriticas TLR7-/- (dois quadros àdireita).

Exemplo 4

RNA63 PD, Porém Não RNA63 PTO, Induz IL-12p40 emMacrófagos Derivados de M-CSF e Células Dendriticas Deriva-das de GM-CSF de Camundongos TLR7-/-

Macrófagos derivados de M-CSF e células dendriti-cas derivadas de GM-CSF foram preparadas de camundongos tiposelvagem e TLR7-/- sendo cultivadas por 24 horas na presençade RNA63 PD mais DOTAP, RNA63 PTO mais DOTAP. LPS, 5-848,CpG-ODN 1668, CpG—ODN 2216, apenas DOTAP, ou apenas meio.Os sobrenadantes da cultura foram a seguir coletados e ana-lisados usando ELISA para IL-12p40. Os resultados estão de-monstrados na Figura 5. Os dado são apresentados como média ± SEM.

Como se pode ver na Figura 5, tanto RNA 63 PD comoRNA63 PTO cada um na presença de DOTAP, induziram quantida-des significativas de IL-12p40 em, macrófagos derivados deM-CSF e células dendriticas derivadas de GM-CSF de camundon-gos tipo selvagem. Em contraste, contudo, RNA63 PD, porémnão RNA63 PTO, quando adicionados com DOTAP, induziram quan-tidades significativas de IL-12p40 em macrófagos derivadosde M-CSF TLR7-/- e células dendriticas derivadas de GM-CSFTLR7-/-.

Exemplo 5

Reconhecimento Independente de TLR7 de RNA Fosfo-diéster de Fita Simples é Dependente de MyD88

Células dendriticas induzidas por FLt3-l forampreparadas separadamente de camundongos TLR7-/- e MyD88 do10 tipo selvagem e cultivadas durante 24 horas na presença deRNA63 PD ou RNA63 PTO, cada qual com DOTAP, como no Exemplo2. Após 24 horas de incubação, as células foram coletadas eanalisadas por ELISA quanto a IL-12p40 e por FACS quanto aCD69. Os resultados demonstram-se na Figura 6.

Como se vê na Figura 6, a indução de IL-12p40 e

CD69 estava ausente em células dendriticas MyD88-/- paraRNA63 PD e para RNA63 PTO, igualmente.EXEMPLO 6

A Estimulação Imune Independente de TLR7 Acionadapor ssRNA é Dependente de TLR9 e TLR8

Visto a estimulação imune independente de TLR7 a-cionada por ssRNA ser dependente de MyD88 e maturação endos-somal, pensou-se na hipótese de estarem envolvidos outrosTLRs intracelulares. TLR3 parece um candidato fraco para oreconhecimento de ssRNA, visto ele confiar principalmente namolécula adaptadora TRIF e não em MyD88 (Hoebe, Du et al. ,2003). Não obstante, para rejeitar TLR3 como receptor parassRNA, camundongos deficientes de TLR3- e TLR7 foram cruza-dos para obter camundongos deficientes duplamente deTLR3/TLR7, e as células imune desses camundongos foram tes-tadas quanto à estimulação por ssRNA. Os resultados dessesexperimentos demonstraram, que a produção de IL-12p40 acio-nada por RNA63 e a supra-regulação de CD69 em DCs induzidospor FLT3-L deficientes duplamente de TLR3/TLR7 ainda erafuncional, sugerindo uma falta de envolvimento de TLR3 noreconhecimento de ssRNA num modo independente de TLR7. Ca-mundongos deficientes da dupla TLR7/TLR9 também foram gera-dos para investigar o envolvimento de TLR9 no reconhecimentode RNA63. Curiosamente, DCs derivados de GM-CSF deficientesda dupla TLR7/TLR9 e mDCs escolhidos falharam em produzirIL-12p40 e a supraregular CD69, sugerindo o envolvimento deTLR9 no reconhecimento de ssRNA num modo independente deTLR7. De modo geral, esses dados sugerem que TLR9 é reativocruzado a ssRNA e media a estimulação imune de ssRNA.

Exemplo 7

Papel de TLR9 no Reconhecimento de ssRNA Fosfodi-éster

Para investigar ainda mais o papel de TLR9 no re-conhecimento de PD ssRNA, foram sintetizadas várias seqüên-cias de RNA, tais como RNA41 (5'-GCCCGACAGAAGAGAGACAC-31 -SEQ ID NO: 4) e RNA42 (5'-ACCCAUCUAUUAUAUAACUC-3' ; SEQ IDNO: 5) que foram previamente descritas como não ativas emcélulas de murideo, foram sintetizadas com uma cadeia cen-tral PTO (Heil, Hemmi et al. 2004). Comparando-se a capaci-dade estimulatória de ORN com uma estrutura central PTO ouPD observou-se que, RNA41 PD e RNA42 PD estimulam IL-12 p40,IL-6 e IFN-α num modo independente de TLR7 em células de mu-rídeo e TNF-α, (porém não IFN-α) em PBMCs de humano, enquan-to que o correspondente ORN PTO-modifiçado era inativo. Cu-riosamente, quando mDC tipo selvagem, deficiente de TLR7 oudeficiente de TLR9 foram estimulados com RNA41PD e RNA42 PD,as células deficientes de TLR9 falharam em produzir IL-12p40,sugerindo que TLR9 e não TLR7 está envolvido no reconheci-mento de moléculas ssRNA que não possuem G/U. Por contraste,RNA40 rico em GU (5'-GCCCGUCUGUUGUGUGACUC-3', (SEQ ID NO: 6) induziu algum IL-12p40 em células deficientes unicamente de-TLR7 e células deficientes unicamente de TLR9, sugerindo que,TLR7 ou TLR9 podem funcionar como um receptor de ssRNA. pDCreconheceu o RNA rico em GU num modo dependente de TLR7, po-rém, surpreendentemente, o ORN RNA41 e RNA42 carentes de GU,também foram reconhecidos por células do tipo selvagem, em-bora as células deficientes unicamente de TLR7 ou deficien-tes unicamente de TLR9 tivessem falhado na resposta, suge-rindo que os complexos TLR7/TLR9 estão envolvidos no reco-nhecimento de RNAs carentes de GU.

Exemplo 8

Papel de TLR8 no Reconhecimento de ssRNA Fosfodiéster

Usando sirNA especifico para mTLR8 demonstrou-seque, TLR8 está envolvido no reconhecimento de ssRNA. DCs in-duzidos por FLT3-L tipo selvagem, foram tratados com siRNAespecifico para TLR8 ou um siRNA de controle contra eGFP eestimulados com CpG-ODN, RNA40PD, RNA41PD, e RNA42 PD. Célu-las tratadas com siRNA especifico para mTLR8 demonstraramuma redução de 75% ou 50% na secreção de IL-12, com estimu-lação de RNA41 e RNA42, respectivamente. O estimulo comRNA40 não foi influenciado por siRNA especifico para mTLR8,visto a estimulação imune acionada por RNA40 ser criticamen-te dependente de mTLR7. O siRNA especifico para eGFP de con-trole não teve efeito inibidor na produção de IL-12 e valo-res IL-12 correspondentes com a estimulação de célulastransfectadas não-siRNA. A fim de avaliar ainda mais o en-volvimento de TLR8 na estimulação imune acionada por ssRNAindependente de TLR7, DCs induzidos por FLT3-L deficientesde TLR7 foram transfectados com siRNA especifico para mTLR8-ou eGFP , determinando-se a produção de Il-12p40 induzidapor RNA63. DCs tratados com siRNA especifico para m-TLR8,demonstraram uma forte redução na produção de IL-12p40 e nainfra-regulagem de marcadores de ativação tais como CD40,enquanto siRNA especifico para eGFP não teve nenhum efeito.A redução na ativação imune acionada por RNA63 correlacio-nou-se com a infra-regulação acionada por siRNA de mTLR8 RNAConsiderados juntos, esses dados demonstram, que, TLR8 estáenvolvido no reconhecimento de ssRNA.

Exemplo 9

Heterodimeros TLR8/TLR9 Mediam o Reconhecimento de ssRNA

Visto TLR8 e TLR9 estarem envolvidos no reconheci-mento de ssRNA, investigou-se o caso de ambos os receptorescooperarem e formarem complexos na mediação do reconhecimen-to de ssRNA. Transfectando-se TLRs identificados em célulasHEK293 com subseqüente imunoprecipitação e manchamento wes-tern* TLR8-flag demonstrou estar associado com mTLR9-HA evice-versa, enquanto TLR3 e TLR9 intracelulares não intera-giram.

EQUIVALENTES

0 relatório descritivo precedente, é consideradosuficiente para permitir ao perito na técnica a prática dainvenção. A presente invenção não deve ser limitada em seuescopo, pelos exemplos fornecidos, visto tais exemplos des-tinarem-se como mera ilustração de um aspecto da invenção eoutras modalidades funcionalmente equivalentes que se encon-trem no escopo da invenção. Várias modificações da invençãoalém das demonstradas e aqui descritas, tornar-se-ão eviden-tes aos peritos na técnica, a partir da descrição precedenteque se enquadre no escopo das reivindicações apensas. Asvantagens e objetos da invenção não estão necessariamenteabrangidas em cada modalidade da invenção.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Coley Pharmaceutical GmbH

<120 > ÁCIDO RJBONUCLÉICO DE FITA SIMPLES IMUNOESTIMULANTECOM CADEIA CENTRAL FOSFODIÉSTER

<130> C1041.70052

<150> US 60/718,087

<151> 2005-09-16

<160> 6

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 12

<212> ENA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 1caggucugug au

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 2

tccatgacgt tcctgatgct

<210> 3

<2I1> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 3

gggggacgat cgtcggggg

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético<400> 4

gcccgacaga agagagacac

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 5

acccaucuau uauauaacuc

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 6

gcccgucugu ugugugacuc

Claims (12)

1. Método de induzir uma resposta imune similar aThl num indivíduo, CARACTERIZADO por compreender:administração ao indivíduo de uma quantidade efi-caz de um oligo-ribonucleotídeo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN) de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde ossORN imunoestimulante tem uma cadeia central fosfodiéster ecompreende uma seqüência de nucleotídeo que(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos um G a seqüência de nucleotídeo é(a) isenta de uridina (U) , e(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde Xi, X2, X3e X4 são nucleotídeos e CG é um dinucleotídeo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotídeo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

2. Método de induzir uma resposta antígeno-específica num indivíduo, CARACTERIZADO por compreender:administração ao indivíduo de um antígeno; eadministração ao indivíduo de uma quantidade efi-caz de um oligo-ribonucleotídeo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN_ de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde ossORN imunoestimulante possui uma cadeia central fosfodiés-ter e compreende uma seqüência de nucleotídeo que,(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos um G a seqüência de nucleotídeo é(a) isenta de uridina (U) , e(b) isenta de motivo CpG X1X2CGX3X4, onde X1, X2, X3e X4 são nucleotídeos e CG é um dinucleotídeo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotídeo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

3. Método de tratamento de um indivíduo com cân-cer, CARACTERIZADO por compreender:administração ao indivíduo de uma quantidade efi-caz de um oligo-ribonucleotídeo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN) de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde ossORN imunoestimulante possui uma cadeia central fosfodiés-ter e compreende uma seqüência de nucleotídeo que,(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos um G a seqüência de nucleotídeo é(a) isenta de uridina (U), e(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde X1, X2, X3e X4 são nucleotídeos e CG é um dinucleotídeo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotídeo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

4. Método de tratamento de um indivíduo com umadoença infecciosa, CARACTERIZADO por compreender:administração ao indivíduo de uma quantidade efi-caz de um oligo-ribonucleotídeo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN) de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde ossORN imunoestimulante possui uma cadeia central fosfodiés-ter e compreende uma seqüência de nucleotídeo que,(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotídeo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotídeo é(a) isenta de uridina (U) , e(b) isenta de motivo CpG XiX2CGX3X4, onde X1, X2, X3e X4 são nucleotídeos e CG é um dinucleotídeo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotídeo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

5. Método de tratamento de um indivíduo com umacondição alérgica, CARACTERIZADO por compreender:administração ao indivíduo de uma quantidade efi-caz de um oligo-ribonucleotídeo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN) de 5-100 nucleotídeos de comprimento, onde ossORN imunoestimulante possui uma cadeia central fosfodiés-ter e compreende uma seqüência de nucleotídeo que,(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotideo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotideo é(a) isenta de uridina (U) , e(b) isenta de motivo CpG X1X2CGX3X4, onde X1, X2, X3e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

6. Método de tratamento de um indivíduo com asma,CARACTERIZADO por compreender:administração ao indivíduo de uma quantidade efi-caz de um oligo-ribonucleotídeo de fita simples imunoestimu-lante (ssORN) de 5-100 nucleotideos de comprimento, onde ossORN imunoestimulante possui uma cadeia central fosfodiés-ter e compreende uma seqüência de nucleotideo que,(1) é isenta de guanosina (G), ou(2) compreende pelo menos uma G com a condição deque, quando a seqüência de nucleotideo compreender pelo me-nos uma G a seqüência de nucleotideo é(a) isenta de uridina (U), e(b) isenta de motivo CpG X1X2CGX3X4, onde X1, X2, X3e X4 são nucleotideos e CG é um dinucleotideo citosina (C) -guanina (G), onde a C do dinucleotideo CG não é metilada,com a condição de que o ssORN imunoestimulante nãoesteja presente como parte de uma molécula de ácido ribonu-cléico (RNA) de fita dupla.

7. Método, de acordo com quaisquer reivindicações1-6, CARACTERIZADO pelo ssORN imunoestimulante ter 5-40 nu-cleotideos em comprimento.

8. Método, de acordo com quaisquer reivindicações1-6, CARACTERIZADO pelo ssORN imunoestimulante ter 5-20 nu-cleotideos em comprimento.

9. Método, de acordo com quaisquer reivindicações1-6, CARACTERIZADO pelo ssORN imunoestimulante ter 5-12 nu-cleotideos em comprimento.

10. Método, de acordo com quaisquer reivindicações1-6, CARACTERIZADO pelo ssORN imunoestimulante ser um ssORNsintético.

11. Método, de acordo com quaisquer reivindicações1-6, CARACTERIZADO pelo ssORN imunoestimulante não ser umpolinucleotideo selecionado do grupo consistindo de poli-U,poli-G, poli-A ou poli-C.

12. Método, de acordo com quaisquer reivindicações1-6, CARACTERIZADO pela administração ao indivíduo da quan-tidade eficaz do ssORN imunoestimulante ser administradasistemicamente ao indivíduo numa quantidade eficaz do ssORNimunoestimulante.