BRPI0612408A2

BRPI0612408A2 - terapia para tratamento de cáncer em combinação com anticorpo anti-ctla-4 e oligodesoxinucleotìdeo sintético contendo o motivo cpg

Info

Publication number: BRPI0612408A2
Application number: BRPI0612408-9A
Authority: BR
Inventors: David Robert John Readett; Jarl Ulf Birger; Jesus Gomes-Navarro; Douglas C Hanson; Arthur M Krieg
Original assignee: Pfizer; Coley Pharm Group Inc
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2010-11-03
Also published as: TW200801042A; IL188588A0; AR054536A1; US20090117132A1; SG163583A1; JP2009500412A; EA200800268A1; AU2006269555A1; WO2007008463A3; NZ565311A; US20120003179A1; MX2008000379A; CA2614320A1; KR20080030656A; CN101268101A; WO2007008463A2; EP1904530A2; ZA200801190B

Abstract

TERAPIA PARA TRATAMENTO DE CáNCER EM COMBINAçãO COM ANTICORPO ANTI-CTLA-4 e OLIGODESOXINUCLEOTIDEO SINTéTICO CONTENDO O MOTIVO CPG. A invenção refere-se à administração de um anticorpo anti-CTLA-4, particularmente anticorpos humanos para CTLA-4 humano, tais como aqueles tendo seqúências de aminoácidos dos anticorpos 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 1171.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, e MDX-010, em combinação com um nucleotídeo imunoestimulante, i.e. CpG ODN PF35126?6, para o tratamento de câncer. A invenção refere-se à administração de uma combinação de um anticorpo anti-CTLA-4 e CpG ODN PE3512676 como terapia de câncer neoadjuvante, adjuvante, de primeira linha, de segunda linha e de terceira linha, se localizado ou com metástase, e em qualquer(quaisquer) ponto(s) ao longo do contínuo da doença (por exemplo, em qualquer estágio do câncer).

Description

"TERAPIA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER EM COMBINAÇAOCOM ANTICORPO ANTI-CTLA-4 e OLIGODESOXINUCLEOTÍDEO SINTÉTICOCONTENDO O MOTIVO'CPG"

Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica a prioridade do Pedido Pro-visório US 60/697082, intitulado "TERAPIA PARA TRATAMENTO DECÂNCER EM COMBINAÇÃO COM ANTICORPO ANTI-CTLA-4 e OLIGODESO-XINUCLEOTÍ DEO SINTÉTICO CONTENDO O MOTIVO CpG", e depositadoem 7 de julho de 2005, cujo inteiro teor é aqui incorporadoa titulo de referência.

Campo da Invenção

A invenção refere-se ao uso de anticorpo anti-CTLA-4 em combinação com oligonucleotideos CpG para trata-mento de câncer.

Antecedentes da Invenção

Uma abordagem alternativa para terapia de câncer éalvejar o sistema imunológico ("imunoterapia") em vez dee/ou além de alvejar o próprio tumor. Um beneficio potencialda imunoterapia é proporcionar eficácia aperfeiçoada por in-tensificação da própria imunorresposta do paciente aos tumo-res, enquanto os efeitos deletérios às células normais sãominimizados.

Antigeno 4 associado ao linfócito T citotóxico (C-TLA-4; CD152) é um receptor de superfície celular expressonas células T ativadas. Os ligantes naturais para CTLA-4 sãoB7-1 (CD80) e B7.2 (CD86), que estão presentes nas célulasapresentadoras de antígenos (APCs, incluindo células dendrí-ticas, células B ativadas, e monócitos). CTLA-4 é um membroda super-familia de imunoglobulina (Ig) de proteínas que agepara infra-regular a ativação de células T e manter a home-ostasia imunológica. Em particular, acredita-se que CD28 eCTLA-4 distribuem sinais opositores que são integrados pelacélula T na determinação da resposta ao antígeno. 0 resulta-do da estimulação de receptor de célula T por antígenos éregulado por sinais co-estimuladores de CD-28, bem como si-nais inibidores derivados de CTLA-4. É também determinadopela interação de CD28 ou CTLA-4 nas células T com moléculasB7 expressas nas células apresentadoras de antígenos.

Evidência experimental indica que a ligação de B7a CTLA-4 distribui um sinal regulador negativos para as cé-lulas T, e que o bloqueio deste sinal negativo resulta emfunção imune das células T e atividade tumoral intensifica-,das em modelos animais (Thompson e Allison, Immunity 7:445-450; McCoy e LeGros, 1999, Immunol. & Cell Biol. 77:1-10).Vários estudos demonstraram que o tratamento de camundongoscom mAb bloqueador de CTLA-4 anti-murino intensifica acentu-adamente a destruição mediada por células T de vários tumo-res sólidos murinos, incluindo tumores estabelecidos, e podeinduzir imunidade antitumoral (Leach et al. , 1996, Science271:1734-1736; Kwon et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA94:8099-8103; Kown et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA96:15074-15079; Yang et al., 1997, Câncer Res. 57:4036-4041;Patente US 6.682.736 (Hanson et al. ) . Ainda, polimorfismosde CTLA-4 em humanos têm sido associados ao risco aumentadode doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide e dia-betes melito tipo I.Adicionalmente, a Patente US 5.811.097 de Allisonet al. refere-se à administração de agentes bloqueadores deCTLA-4 para diminuir o crescimento de células tumorais. APublicação Internacional WO 00/37504 (publicado em 29 de ju-nho de 2000) refere-se a anticorpos anti-CTLA-4 humanos, eao uso de tais anticorpos no tratamento de câncer. WO01/14424 (publicado em 1 de março de 2001) refere-se a adi-cionais anticorpos anti-CTLA-4 humanos, e ao uso de tais an-ticorpos no tratamento de câncer. WO 93/00431 (publicado em7 de janeiro de 1993) refere-se à regulação de interaçõescelulares com um anticorpo monoclonal reativo com uma prote-ína de fusão de CTLA-4-Ig. WO 00/32231 (publicado em 8 dejunho de 2000) refere-se à combinação de um agente bloquea-dor de CTLA-4 com uma vacina contra tumor para estimular ascélulas T. WO 03/086459 refere-se a um método para promoveruma resposta de memória usando anticorpos CTLA-4. Assim, opotencial para desenvolvimento de substâncias terapêuticascompreendendo inibir ligação de CTLA-4 para intensificare/ou prolongar uma resposta antitumoral tem sido demonstradona técnica.

DNA bacteriano tem efeitos imunoestimuladores paraativar células B e células destruidoras naturais (Tokunaga,T., et al., 1988, Jpn. J. Câncer Res. 79:682-686; Tokunaga,T., et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., et al., J.Immunol. 147:1759-1769; e revisão por Krieg, 1988, em: Ap-plied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein e A.M. Krieg,(Eds.), John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, NI, pp. 431-448). Os efeitos imunoestimuladores de DNA bacteriano são oresultado da presença de dinucleotídeos CpG não metilados emcontextos básicos particulares (motivos CpG), que são comunsem DNA bacteriano, mas metilados e sub-representados em DNAde vertebrados (Krieg et al., 1995, Nature 374:546-549; Kri-eg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Os efeitos imu-noestimuladores do DNA bacteriano podem ser mimetizados comoligodesoxinucleotideos (ODN) sintéticos contendo esses mo-tivos CpG. Tal CpG ODN tem efeitos altamente estimuladoresem leucócitos humanos e murinos, induzindo a proliferação decélulas B, secreção de citocina e imunoglobulina, atividadelitica de células destruidoras naturais (NK), secreção deIFN-γ, e ativação de células dendriticas (DCs) e outras cé-lulas apresentadoras de antigenos para expressar moléculasco-estimuladores e secretar citocinas, especialmente as ci-tocinas Thl-Iike que são importantes em promover o desenvol-vimento das respostas de células T Thl-Iike. Os efeitos imu-noestimuladores de CpG 0DN, nativo, de cadeia principal defosfodiéster são altamente específicos em CpG em que os e-feitos são dramaticamente reduzidos se o motivo CpG é meti-lado, alterado para um GpC, ou de outro modo eliminado oualterado (Krieg et al. , 1995, Nature 374:546-549; Hartmannet al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:9305-10).

Pensou-se anteriormente que os efeitos imunoesti-muladores requeriam o motivo CpG no contexto de uma seqüên-cia de purina-purina-CpG-pirimidina-pirimidina (Krieg etal., 1995, Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol.156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lip-ford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Contudo,está agora claro que linfócitos de camundongos respondembastante bem aos motivos CpG fosfodiéster, não neste contex-to (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) e o mesmo éverdade para células B humanas e células dendriticas (Hart-mann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Li-ang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).

Uma classe de CpG ODN é potente para ativar célu-las B, mas é relativamente fraca para induzir ativação deIFN-α e células NK; essas classe tem sido denominada de aclasse B. Os oligonucleotideos CpG de classe B são típica einteiramente estabilizados e incluem um dinucleotídeo CpGnão metilado dentro de certos contextos básicos preferidos.Vide, por exemplo, as Patentes US 6.194.388; US 6.207.646;US 6.214.806; US 6.218.371; US 6.239.116; e US 6.339.068.

Embora, o uso individual de anticorpos anti-CTLA-4ou ODNs para induzir uma resposta antitumoral ser altamentepromissor no tratamento de câncer, ainda permanece a neces-sidade de desenvolver novas terapias para tratamento de tu-mores, mais particularmente, tumores sólidos, com tais abor-dagens imunoterapêuticas.

Sumário da Invenção

É necessário o desenvolvimento de novos regimesterapêuticos, particularmente aqueles capazes de aumentar oupotencializar a atividade antitumoral do sistema imunológicodo paciente, enquanto os efeitos colaterais citotóxicos doscorrentes produtos quimioterapêuticos são reduzidos. A pre-sente invenção proporciona tais regimes.

Assim, em uma modalidade, a invenção proporcionaum método para o tratamento de câncer em um paciente que ne-cessite de tal tratamento, em que o método compreende admi-nistrar ao dito paciente uma quantidade eficazmente terapêu-tica de um anticorpo anti-CTLA-4, ou uma porção de ligaçãode antigeno deste, em combinação com uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de CpG ODN PF3512676 (também conhecido comoProMune); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT; SEQ ID NO:37). Emuma modalidade, o método é um método de não-vacina.

Em uma modalidade, o dito CpG ODN é administradodiariamente, dia sim dia não, duas vezes na semana ou sema-nalmente.

Em uma modalidade, o dito tratamento é uma terapiaselecionada do grupo que consiste em terapia neoadjuvante,terapia adjuvante, terapia de primeira linha, terapia de se-gunda linha, e terapia de terceira linha.

Dependendo da modalidade, o dito câncer é selecio-nado do grupo que consiste em câncer do cérebro, câncer damama, câncer cervical, carcinoma colorretal, linfoma de cé-lula T cutâneo, câncer gástrico, câncer da cabeça e do pes-coço, câncer do fígado, melanoma, leucemia mielóide aguda,linfoma de não-Hodgkin, câncer ovariano, câncer pancreático,câncer da próstata, carcinoma de célula renal, e sarcoma.

Em outras modalidades, a dita quantidade terapeu-ticamente eficaz do dito anticorpo anti-CTLA-4 humano variade cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou de cerca de0,3 mg/kg a 20 mg/kg, incluindo, mas sem limitação, umaquantidade terapeuticamente eficaz do dito anticorpo anti-CTLA humano selecionada do grupo que consiste em pelo menos1 mg/kg, pelo menos 3 mg/kg, pelo menos 6 mg/kg, pelo menos10 mg/kg, e pelo menos 15 mg/kg.

Em uma modalidade, o dito anticorpo anti-CTLA-4,ou porção de ligação de antigeno deste, é de pelo menos umanticorpo selecionado do grupo que consiste em (a) um anti-corpo humano tendo uma afinidade de ligação por CTL4-4 decerca de IO"8 ou mais, e que inibe ligação entre CTLA-4 eB7-1, e ligação entre CTLA-4 e B7-2; (b) um anticorpo humanotendo uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menosuma seqüência de CDR humana que corresponde a uma seqüênciade CDR de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1,11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, e 10D1; (c) um anticorpohumano tendo a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesadae/ou leve de um anticorpo selecionado do grupo que consisteem 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1,11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, e 10D1; (d) um anticor-po, ou uma porção de ligação de antigeno deste, que competepor ligação com CTLA-4 com pelo menos um anticorpo tendo aseqüência de aminoácidos de um anticorpo selecionado do gru-po que consiste em 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3,6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, e 10D1;e (e) um anticorpo, ou porção de ligação de antigeno deste,que compete cruzado por ligação com CTLA-4 com pelo menos umanticorpo tendo o aminoácido de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3,6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, e 10D1.

Em uma outra modalidade, o dito anticorpo é um an-ticorpo humano tendo a seqüência de aminoácidos de um anti-corpo selecionado do grupo que consiste em 4.1.1, 4.13.1,11.2.1, e IODl. Em modalidades relacionadas, o dito anticor-po, ou porção de ligação de antigeno deste, compreende umacada pesada e uma cadeia leve, em que as seqüências de ami-noácidos de domínio variável de cadeia pesada da dita cadeiapesada e o domínio variável de cadeia leve da dita cadeialeve são selecionadas do grupo que consiste em (a) a seqüên-cia de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e a seqüência de aminoáci-dos da SEQ ID NO:9; (b) a seqüência de aminoácidos da SEQ IDNO: 15 e a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:21; (c) aseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e a seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO:33; (d) a seqüência de aminoácidoscodificada pela seqüência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO:le a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência deácidos nucléicos da SEQ ID NO:7; (e) a seqüência de aminoá-cidos codificada pela seqüência de ácidos nucléicos da SEQID NO:13 e a seqüência de aminoácidos codificada pela se-qüência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO:19; (f) a seqüênciade aminoácidos codificada pela seqüência de ácidos nucléicosda SEQ ID NO:25 e a seqüência de aminoácidos codificada pelaseqüência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO: 31; e (g) a se-qüência de aminoácidos de um domínio variável do anticorpo10D1.

Em uma outra modalidade relacionada, o dito anti-corpo, ou porção de ligação de antigeno deste, é um anticor-po selecionado do grupo que consiste em (a) um anticorpo quecompreende as seqüências de aminoácidos estabelecidas em SEQID NO: 4, SEQ ID Ν0:5, SEQ ID ΝΟ:β, SEQ ID Ν0:10, SEQ IDΝ0:11 e SEQ ID Ν0:12; (b) um anticorpo que compreende as se-qüências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:16, SEQID NO:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ IDNO: 24; e (c) um anticorpo que compreende as seqüências deaminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQID NO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36.

Em ainda uma outra modalidade relacionada, o ditoanticorpo, ou porção de ligação de antigeno deste, compreen-de uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:27 e uma região de ca-deia variável leve tendo a seqüência de aminoácidos estabe-lecida na SEQ ID NO:33.

Em ainda uma outra modalidade relacionada, o ditoanticorpo é selecionado do grupo que consiste em (a) um an-ticorpo que compreende as seqüências de aminoácidos estabe-lecidas nas SEQ ID N0:2 e SEQ ID N0:8; (b) um anticorpo com-preendendo as seqüências de aminoácidos estabelecidas nasSEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:20; e (c) um anticorpo compreenden-do as seqüências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ IDNO:26 e SEQ ID NO:32.

Em uma modalidade, o dito anticorpo é administrado1 a 7 dias antes da administração do dito CpG ODN. Nessa eem outras modalidades, o dito CpG ODN é administrado de cer-ca de um a cerca de cem dias depois do dito anticorpo.

Em uma modalidade, o dito CpG ODN é administradosubcutaneamente.

Em uma outra modalidade, o dito CpG ODN é adminis-trado em uma quantidade de 1 mg - 50 mg por dia.

Em um aspecto, a invenção proporciona uma composi-ção farmacêutica para o tratamento de câncer, em que a ditacomposição que compreende uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um anticorpo anti-CTLA-4, ou uma porção de ligaçãode antigeno deste, e uma quantidade terapeuticamente eficazde CpG ODN PF3512676, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Essas e outras modalidades da invenção serão des-critas em mais detalhes aqui.

Cada uma das limitações pode englobar várias moda-lidades da invenção. É, portanto, antecipado que cada umadas limitações da invenção envolvendo qualquer elemento oucombinações de elementos pode ser incluída em cada aspectoda invenção. Essa invenção não está limitada em sua aplica-ção aos detalhes de construção e arranjo de componentes es-tabelecidos na descrição ou ilustrados nos desenhos. A in-venção é capaz de outras modalidades e de ser praticada oude ser efetuada de várias maneiras.

A fraseologia e a terminologia usadas aqui são pa-ra fins de descrição e não devem ser consideradas como Iimi-tativas. 0 uso de "incluindo", ou "tendo", "contendo", "en-volvendo", e suas variações, deve ser entendido como englo-bando os itens listados depois disso e equivalentes destes,bem como itens adicionais.

Breve Descrição dos Desenhos

0 sumário acima e a seguinte descrição detalhadada invenção serão mais bem entendidas quando lidas em con-junto com os desenhos apensos. Para o propósito de ilustrara invenção, os desenhos mostram modalidade(s), que é(são)presentemente preferida(s). Contudo, deve ser entendido quea invenção não está limitada às disposições precisas e ins-trumentalidades mostradas.

Nos desenhos:

A Figura 1, compreendendo as Figuras 1A-1D, mostraas seqüências de nucleotideos e de aminoácidos de anticorpoanti-CTLA-4 4.1.1.. A Figura IA mostra a seqüência de nucle-otideos inteira para a cadeia pesada de 4.1.1 (SEQ ID NO:l).

A Figura IB mostra a seqüência de aminoácidos inteira para acadeia pesada de 4.1.1 (SEQ ID NO:2), e a seqüência de ami-noácidos para a região variável de cadeia pesada de 4.1.1(SEQ ID NO:3) designada entre colchetes "[]"· A seqüência deaminoácidos de cada CDR de cadeia pesada de 4.1.1 está sub-linhada. As seqüências de CDR são como a seguir: CDRl:GFTFSSHGMH (SEQ ID NO: 4) ; CDR2 VIWYDGRNKYYADSV (SEQ IDNO:5); e CDR3: GGHFGPFDY (SEQ ID N0:6). A Figura IC mostra aseqüência de nucleotideos para a cadeia leve de 4.1.1 (SEQID N0:7) . A Figura ID mostra a seqüência de aminoácidos dacadeia leve de 4.1.1. inteira (SEQ ID NO: 8), e a região va-riável conforme indicada entre colchetes "[]" (SEQ ID N0:9).A seqüência de aminoácidos de cada CDR é indicada como a se-guir: CDRl: RASQSISSSFLA (SEQ ID NO:10); CDR2: GASSRAT (SEQID NO:11); e CDR3: CQQYGTSPWT (SEQ ID NO:12).

A Figura 2, compreendendo as Figuras 2A-2D, mostraas seqüências de nucleotideos e aminoácidos do anticorpo an-ti-CTLA-4 4.13.1. A Figura 2A mostra a seqüência de núcleo-tideos inteira para a cadeia pesada de 4.13.1 (SEQ IDNO:13). A Figura 2B mostra a seqüência de aminoácidos para acadeia pesada de 4.13.1 (SEQ ID N0:14), e a seqüência de a-minoácidos para a região variável de cadeia pesada de 4.13.1(SEQ ID NO:15) designada entre colchetes "[]"· A seqüênciade aminoácidos de cada CDR de cadeia pesada de 4.13.1 estásublinhada. As seqüências de CDR são como a seguir: CDRl:GFTFSSHGIH (SEQ ID N0:16); CDR2: VIWYDGRNKDYADSV (SEQ IDNO:12); e CDR3: VAPLGPLDY (SEQ ID N0:18). A Figura 2C mostraa seqüência de nucleotideos para a cadeia leve de 4.13.1(SEQ ID NO:19) A Figura 2D mostra a seqüência de aminoácidosda cadeia leve de 4.13.1 inteira (SEQ ID N0:20), e a regiãovariável como indicada entre colchetes "[]" (SEQ ID NO:21).A seqüência de aminoácidos de cada CDR é indicada como a se-guir: CDRl: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:22). CDR2: GASSRAT (SEQID NO:23); e CDR3: CQQYGRSPFT (SEQ ID NO:24).

A Figura 3, compreendendo as Figuras 3A-3D, mostraas seqüências de nucleotideos e de aminoácidos do anticorpoanti-CTLA 11.2.1. A Figura 3A mostra a seqüência de nucleo-tideos inteira para a cadeia pesada de 11.2.1 (SEQ ID NO:25)A Figura 3B mostras a seqüência de aminoácidos inteira paraa cadeia pesada de 11.2.1 (SEQ ID NO:26), e a seqüência deaminoácidos para a região variável de cadeia pesada de11.2.1 (SEQ ID NO\21) designada entre colchetes "[]"· A se-qüência de aminoácidos de cada CDR de cadeia pesada de11.2.1 está sublinhada. As seqüências de CDR são como a se-guir: CDRl: GFTFSSYGMH (SEQ ID NO:28); CDR2: VIWYDGSNKYYADSV(SEQ ID NO:29); e CDR3: DPRGATILYYYYYGMDV (SEQ ID N0:30). AFigura 3C mostra a seqüência de nucleotideos para a cadeialeve de 11.2.1 (SEQ ID N0:31). A Figura 3D mostra-a seqüên-cia de aminoácidos da cadeia leve de 11.2.1 (SEQ ID NO:32),e a região variável como indicada entre colchetes "[]" (SEQID NO:33). A seqüência de aminoácidos de cada CDR é indicadacomo a seguir: CDRl: RASQSINSYLD (SEQ ID NO: 34); CDR2 :AASSLQS (SEQ ID NO:35); e CDR3: QQYYSTPFT (SEQ ID NO:36).

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se a novos métodos terapêuticoscompreendendo co-administrar uma combinação de um anticorpoanti-CTLA-4 e um CpG ODN (i.e. CpG ODN PF3512676), para otratamento de câncer. Cânceres a serem tratados de acordocom a invenção incluem, mas sem limitação, câncer da bexiga,tumores cerebrais, câncer da mama, câncer cervical, câncercolorretal, câncer gastrintestinal, câncer da cabeça e dopescoço, carcinoma hepatocelular, doença de Hogkin, sarcomade Kaposi, leucemias agudas e crônicas, leucemia de célula Tcutânea, leucemias mielóides e linfóides, câncer do pulmão(incluindo carcinoma do pulmão de não pequenas células), me-lanoma, Linfoma de Não-Hodgkin, câncer ovariano, câncer pan-creático, câncer da próstata, carcinoma de células renais,carcinoma de célula escamosa da pele, câncer da tireóide, ecarcinomas e sarcomas de outros tipos (por exemplo, lipos-sarcoma, osteossarcoma) entre muitos outros. Em várias moda-lidades, o método compreende administrar CpG ODN PF3512676em combinação com o anticorpo para a terapia neoadjuvante,adjuvante, de primeira linha, de segunda linha, ou de ter-ceira linha para câncer.Anticorpos empregáveis na presente invenção, e mé-todos para produzi-los, são mostrados no Pedido Internacio-nal PCT/US99/30895, publicado em 29 de junho de 2000 como WO00/37504, Pedido de Patente EP 1262193 Al, publicado em 12de abril de 2002, Pedido de Patente US 09/472.086, agoraconcedido como Patente US 6.682,736, Pedido de Patente US09/948.939, agora publicado como Pedido de Patente PublicadoUS 2002/0086014 (por exemplo, MDX-010, Medarex, Princenton,NJ), cada um dos quais é aqui incorporado a titulo de refe-rência em sua totalidade. Embora informação sobre as seqüên-cias de aminoácidos e ácidos nucléicos tenha sido fornecidaaqui, mais informação pode ser encontrada na Patente US6.682.736, bem como nos pedidos publicados WO 00/37504, EP1262193, e US 2002/008 6014; em que as seqüências estabeleci-das nestes documentos são aqui incorporadas a titulo de re-ferência.

Certos usos para esses anticorpos para tratar vá-rios cânceres foram discutidos no Pedido de Patente US10/153.382, agora publicado como Publicação de Pedido de Pa-tente US 2 003/008 6930, que é aqui incorporado a titulo dereferência como se estabelecido aqui em sua totalidade.

O oligonucleotideo imunoestimulador de CpG usadona presente invenção é um oligonucleotideo imunoestimuladorCpG classe B. Oligonucleotideos imunoestimuladores de CpGclasse B foram descritos nas Patentes US 6.194.388 Bl e US6.239.116 BI, expedidas em 27 de fevereiro de 2001 e 29 demaio de 2001, respectivamente. O oligonucleotideo imunoesti-mulador de CpG da invenção é denominado CpG ODN PF3512 67 6 eé definido pela seguinte seqüência de nucleotideos5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT 3' (SEQ ID NO:37).

CpG ODN PF351267 6 ativa fortemente as células Bhumanas e tem mínimos efeitos na indução de interferon-a.Como descrito em muitos detalhes aqui, CpG ODN PF3512676 po-de ter uma cadeia principal homogênea ou quimérica, incluin-do, mas sem limitação, ligações da cadeia principal de fos-fodiéster e fosforotioato.

Em uma outra modalidade, a combinação de anticor-po-CpG ODN PF3512676 é administrada com pelo menos uma agen-te terapêutico adicional, tais como, mas sem limitação, ou-tros anticorpos monoclonais não direcionados a CTLA-4 (porexemplo, AVASTIN (bevacizumabe), MYE0L0TARG (gentuzumabe),BEXXAR (tositumomabe), RITUXAN (rituximabe), HERCEPTIN(trastuzumabe)), ou ligantes de proteína tendo efeitos simi-lares; agentes que ativam células apresentadoras de antíge-nos (células dendríticas, macrófagos, células B, monócitos),incluindo interferons tipo 1 (por exemplo, interferon alfa ebeta); interferon gama; BCG; agentes que proporcionam antí-genos tumorais em qualquer uma e em todas as formas, inclu-indo antígenos de proteínas, antígenos de peptídeos, lisadosde células integrais e derivados destes; antígenos genetica-mente codificados (por exemplo, antígenos codificados poradenovírus); componentes celulares do sistema imunológicoque tenham sido alterados ou in vivo ou ex vivo para inten-sificar suas propriedades imunes (por exemplo, células den-dríticas autólogas, linfócitos, proteínas de choque térmico,etc.); agentes quimioterapêuticos tais como, mas sem limita-ção, ciclofosfamida, metotrexato, etoposideo, adriamicina,taxanos, fluoruracila, citosina arabinosideo (AraC), e agen-tes contendo platina, entre inúmeros outros. Exemplos de an-tigenos incluem antigenos PSA (por exemplo,

PROSTAVAC/TRICON) e antigenos gplOO derivados de melanoma. Acombinação pode ser também administrada em combinação comcitocina ou fator de crescimento tal como, mas sem limitação, GM-CSF.

Em uma modalidade, o método de tratamento é um mé-todo de não-vacina. Como usado aqui, um método de não vacinasignifica que a combinação de CpG ODN PF351267 6 e anticorpoanti-CTLA-4 não é usada juntamente com um antigeno exógenode modo a estimular uma imunorresposta ao antigeno. Um méto-do de não-vacina, contudo, pode englobar a estimulação deimunorrespostas a antigenos endógenos. Antigenos endógenosincluem aqueles expressos, liberados ou emitidos por uma cé-lula ou massa cancerosa in vivo.

I. Definições

A menos que de outro modo definido, os termos ci-entíficos e técnicos usados em conexão com a presente inven-ção terão os significados que são comumente entendidos poraqueles com conhecimento ordinário da técnica. Ainda, a me-nos que de outro modo requerido pelo contexto, termos nosingular deverão incluir o plural e termos no plural deverãoincluir o singular. Genericamente, as nomenclaturas usadasem conexão com e técnicas de cultura de células e tecidos,biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética,química da proteína e do ácido nucléico e hibridização des-critas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas natécnica.

Os métodos e técnicas da presente invenção são ge-ralmente realizadas de acordo com os métodos bem conhecidosda técnica e conforme descritos em várias referências geraise específicas que são citadas e discutidas por todo o pre-sente relatório descritivo, a menos que de outro modo indi-cado. Tais referências incluem, por exemplo, Sambrook e Rus-sei, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, NI (2001), Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Jonh Wiley & Sons,NI (2002) e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI(1990), que são aqui incorporadas a título de referência. Asreações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadasde acordo com as especificações do fabricante, como comumen-te obtidas na técnica ou como descritas aqui. As nomenclatu-ras usadas em conexão com e os procedimentos e técnicas delaboratório de química analítica, química orgânica sintéti-ca, e química medicinal e farmacêutica descritas aqui sãoaquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Técni-cas padrão são usadas para sínteses químicas, análises quí-micas, preparação, formulação e distribuição farmacêuticas,e tratamento de pacientes.

Como usado aqui, cada um dos seguintes termos temo significado associado a ele nesta seção.

Os artigos "um" e "uma" são usados aqui com refe-rência a um ou mais que um (i.e. a pelo menos um) do objetogramatical do artigo. A titulo de exemplo, "um elemento"significa um elemento ou mais que um elemento.

Como usados aqui, os vinte aminoácidos convencio-nais e suas abreviações seguem o uso convencional. Vide Im-munology—A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren,Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que éaqui incorporado a titulo de referência.

Notação convencional é usada aqui para descreverseqüências de polipeptideos: a extremidade esquerda de umaseqüência de polipeptideos é a terminação araino; a extremi-dade direita de uma seqüência de polipeptideos é a termina-ção carboxila.

Uma "substituição de aminoácido conservativa" éuma onde o resíduo de aminoácido é substituído por um outroresíduo de aminoácido tendo um grupo R de cadeia lateral compropriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hi-drofobicidade) . Em geral, uma substituição de aminoácidoconservativa não alterará substancialmente as propriedadesfuncionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais se-qüências de aminoácidos diferem uma da outra por substitui-ções conservativas, a identidade de seqüência percentual ougrau de similaridade pode ser ajustado para cima para corri-gir a natureza conservativa da substituição. Meios para fa-zer esse ajuste são bem conhecidos daqueles versados na téc-nica. Vide, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol.243:307-31 (1994).

Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeiaslaterais com propriedades químicas similares incluem 1) ca-deias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leuci-na, e isoleucina; 2) cadeias laterais com hidroxila alifáti-cas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida:asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fe-nilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais bá-sicas: lisina, arginina, e. histidina; 6) cadeias lateraisácidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias la-terais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos desubstituições de aminoácidos conservativas preferidas são:valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e arparagina-glutamina.

Alternativamente, uma reposição conservativa équalquer alteração tendo um valor positivo na matriz de pro-babilidade Iog PAM250 descrita por Gonnet et al. , Science256:1443-45 (1992) (1992), aqui incorporado a título de re-ferência. Uma substituição "moderadamente conservativa" équalquer alteração tendo um valor não negativo na matriz deprobabilidade Iog PAM250.

Substituições.de aminoácidos preferidas são aque-las que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (.2) re-duzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidadepor ligação para formar complexos de proteínas, e (4) confe-rem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou fun-cionais de tais análogos. Análogos que compreendem substitu-ições, deleções, e/ou inserções podem incluir várias muteí-nas de uma seqüência diferente da seqüência de peptídeos queocorre naturalmente. Por exemplo, substituições de aminoáci-dos simples ou múltiplas (preferivelmente, substituições deaminoácidos conservativas) podem ser feitas na seqüência queocorre naturalmente (preferivelmente na porção do polipeptí-deo fora do(s) domínios que forma(m) contatos intermolecula-res). Uma substituição de aminoácido conservativa não devealterar substancialmente as características estruturais daseqüência parente (por exemplo, um aminoácido de substitui-ção não deve ter tendência a quebrar uma hélice que ocorrena seqüência parente, ou romper outros tipos de estruturasecundária que caracteriza a seqüência parente) . Exemplos deestruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reco-nhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structuresand Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman andCompany, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Struc-ture (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, NovaIorque, NI (1991)); e Thornton et al., Nature 354:105(1991), que são aqui incorporados, cada um, a título de re-ferência.

Similaridade de seqüência para polipeptídeos, queé também referida como identidade de seqüência, é tipicamen-te medida usando um software para análise de seqüências.Software para análise de proteínas faz a correspondência dasseqüências similares usando medidas de similaridade designa-das para várias substituições, deleções e outras modifica-ções, incluindo substituições de aminoácidos conservativas.

Por exemplo, GCG contém programas, tais como "Gap" e "Bes-tiff", que podem ser usados com parâmetros padrão para de-terminar homologia de seqüências ou identidade de seqüênciasentre polipeptideos intimamente relacionados, tais como po-lipeptideos homólogos de diferentes espécies de organismosou entre uma proteína tipo selvagem e uma muteína desta. Vi-de, por exemplo, GCG, Versão 6.1. As seqüências de polipep-tideos podem ser também comparadas usando FASTA empregandoparâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão6.1. FASTA (por exemplo, FASTA 2 e Fasta 3) proporciona ali-nhamentos e identidade de seqüência percentual das regiõesda melhor sobreposição entre a seqüências de indagação e debusca (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson,Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Um outro algoritmopreferido quando está se comparando uma seqüência da inven-ção a uma base de dados contendo um grande número de seqüên-cias de diferentes organismos é o programa de computadorBLAST, especialmente blastp ou tblastn usando parâmetros pa-drão. Vide, por exemplo, Altschul et al. , J. Mol. Biol.215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-402 (1997); aqui incorporados a título de referência.

Um "anticorpo" intacto compreende pelo menos duascadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadaspor ligações dissulfeto. Vide, genericamente, FundamentalImmunology, Capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a Ed., Raven Press,NY, (1989)) (incorporado a título de referência em sua tota-lidade, para todos os propósitos). Cada cadeia pesada é com-preendida de uma região variável de cadeia pesada (HCVR ouVH) e uma região constante de cadeia pesada (Ch) . A regiãoconstante de cadeia pesada é compreendida de três domínios,CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma regi-ão variável de cadeia leve (LCVR ou Vl) e uma região cons-tante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve écompreendida de um domínio, Cl. As regiões Vh e Vl podem serainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denomi-nadas regiões determinantes de complementaridade (CDR) , en-tremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadasregiões de estrutura (FR) . Cada Vh e Vl é composta de trêsCDRs e quatro FRs, dispostas a partir da terminação aminopara a terminação carboxila na seguinte ordem: FRl, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A designação de aminoácidos paracada domínio está de acordo com as definições de Kabat, Se-quences of Proteins of Immunological Interest (National Ins-titutes of Health, Bethesda, MD (1987 e 1991)), ou Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Na-ture 342:878-883 (1989).

As regiões variáveis das cadeias pesadas e levescontêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligaçãoda imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluin-do várias células do sistema imunológico (por exemplo, célu-las efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema com-plementar clássico.

0 termo "anticorpo" pode incluir porções de antí-geno-anticorpo de um anticorpo intacto, que retêm a capaci-dade de se ligar especificamente ao antígeno do anticorpointacto, por exemplo, CTLA-4. Porções de ligação de antígenopodem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou porclivagem enzimática ou química dos anticorpos intactos.

Exemplos de porções de ligante de antígeno incluem(i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consistenos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, umfragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab liga-dos por uma ponte de dissulfeto na região hinge; (iii) umfragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iv) umfragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um braçosimples de um anticorpo: (v) um anticorpo de domínio simples("dAb"), que consiste em um domínio VH conforme descrito porWard et al. , Nature 341:544-546 (1989); e (vi) uma regiãodeterminante de complementaridade (CDR) isolada. Além disso,embora os dois domínios do fragmento Fv, VH e Vl são codifi-cados por genes separados, eles podem ser unidos, usando mé-todos recombinantes, por um ligante sintético que permiteque sejam feitos como uma cadeia de proteína simples, naqual o par de regiões Vh e Vl para formar moléculas monova-lentes (conhecidas como Fv de cadeia simples); Vide, por e-xemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); e Huston etal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988)). Taisanticorpos de cadeia simples são incluídos por referência aotermo "anticorpo".

Um "anticorpo biespecífico" tem duas especificida-des de ligação diferentes, vide, por exemplo, a Patente US5.922.845 e a Patente US 5.837.243 e a Patente US 5.837.243;Zeilder J. Immunol. 163:1246-1252 (1999); Somasundaram Hum.Antibodies 9:47-54 (1999); Keler Câncer Res. 57:4008-4014(1997). Por exemplo, a invenção proporciona anticorpos bies-pecificos tendo um sitio de ligação para um antigeno de su-perfície de célula, tal como CTLA-4 humano e um segundo sí-tio de ligação para um receptor de Fc sobre a superfície deuma célula efetora. A invenção também proporciona anticorposmultiespecíficos, que têm pelo menos três sítios de ligação.

O termo "anticorpos biespecíficos" ainda inclui"diacorpos". Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecí-ficos, nos quais os domínios Vh e VL, são expressos em umacadeia de polipeptídeo simples, mas usando um ligante que émuito curto para permitir o pareamento entre os dois domí-nios na mesma cadeia, forçando, assim, os domínios a empare-lharem com domínios complementares de uma outra cadeia ecriando dois sítios de ligação de antigeno (Vide, por exem-pio, Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)).

Os termos "anticorpo humano" ou "anticorpo de se-qüência humana", como usados intercambiavelmente aqui, in-cluem anticorpos tendo regiões variáveis e constantes (sepresentes) derivados de seqüências de imunoglobulina da ger-me-linha humana. Os anticorpos de seqüência humana da inven-ção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificadospor seqüências de imunoglobulina da germe-linha humana (porexemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ousitio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo) .Contudo, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, nãotem a intenção de incluir anticorpos "quiméricos" nos quaisas seqüências de CDR derivadas da germe-linha de uma outraespécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxerta-das nas seqüências de estruturas humanas (por exemplo, anti-corpos "humanizados" ou PRIMATIZADOS™) .

0 termo "anticorpo quimérico", como usado aqui,significa um anticorpo que compreende regiões provenientesde dois ou mais anticorpos diferentes. Em uma modalidade,uma ou mais CDRs são derivadas de um anticorpo anti-CTLA-4humano. Em uma outra modalidade, todas as CDRs são derivadasde um anticorpo anti-CTILA-4. Em uma outra modalidade, asCDRs de mais que um de anticorpos anti-CTLA-4 humanos sãocombinadas em um anticorpo humano quimérico. Por exemplo, umanticorpo quimérico pode compreender uma CDRl da cadeia levede um primeiro anticorpo anti-CD40 humano, uma CDR2 da ca-deia leve de uma segundo anticorpo anti-CTLA-4 humano e umaCDR3 e CDR3 da cadeia leve de um terceiro anticorpo anti-CTLA-4 humano, e as CDRs da cadeia pesada podem ser deriva-das de um ou mais outros anticorpos anti-CD40. Ainda, a re-giões de estrutura podem ser derivadas de um dos mesmos an-ticorpos anti-CTLA-4 ou de um ou mais humanos diferentes.

Além disso, como discutido previamente aqui, anti-corpo quimérico incluir um anticorpo que compreende uma por-ção derivada das seqüências de germe-linha de mais que umaespécie.

0 termo "competir", como usado aqui com respeito aum anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou umaporção de anticorpo de antígeno deste, compete por ligaçãocom um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação de antí-geno deste, onde a ligação do primeiro anticorpo com seu e-pítopo cognato é detectavelmente diminuída na presença dosegundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiroanticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa,onde a ligação do segundo anticorpo a seu epitopo é tambémdetectavelmente diminuída em presença do primeiro anticorpo,pode, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anti-corpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo a seuepitopo sem que o segundo anticorpo que iniba a ligação deprimeiro anticorpo a seu respectivo epitopo. Contudo, ondecada anticorpo inibe detectavelmente a ligação do outro an-ticorpo com seu epitopo cognato ou ligante, se na mesma,maior ou menor extensão, os anticorpos são ditos "competiremcruzado" um com o outro por ligação de seu(s) respectivo(s)epitopo(s).

Por exemplo, anticorpos de competição cruzadapodem ser ligar ao epitopo, ou porção do epitopo, ao qual osanticorpos da invenção (por exemplo, 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1,12.3.1.1, e 12.9.1.1) se ligam. Ambos os anticorpos de com-petição e de competição cruzada são englobados pela presenteinvenção. Independentemente do mecanismo pelo qual tal com-petição ou competição cruzada ocorre (por exemplo, impedi-mento estérico, alteração conformacional, ou ligação a umepitopo comum, ou porção deste e similares), aquele versadona técnica apreciaria, com base nos ensinamentos proporcio-nados aqui, que tais anticorpos de competição e/ou de compe-tição cruzada são englobados e podem ser úteis para os méto-dos descritos aqui.

O termo "epitopo" inclui qualquer determinante deproteína capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina oureceptor de célula T. Determinantes epitópicos consistem u-sualmente em grupamentos quimicamente tensoativos de molécu-las, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, etêm, usualmente, características estruturais tridimensionaisespecíficas, bem como características de carga específicas.Epítopos conformacionais e não conformacionais são distin-guidos em que a ligação ao primeiro, mas não ao último, éperdida em presença de solventes desnaturantes.

A frase "se liga especificamente", como usada a-qui, significa um composto, por exemplo, uma proteína, umácido nucléico, um anticorpo, e similar, que reconhece ou seliga a uma molécula específica, mas não reconhece substanci-almente ou se liga a outras moléculas em uma amostra. Porexemplo, um anticorpo ou um inibidor de peptídeo, que reco-nhece e se liga a um ligante cognato (por exemplo, um anti-corpo anti-CTLA-4 que se liga com seu antígeno cognato,CTLA-4) em uma amostra, mas não reconhece substancialmenteou se liga a outras moléculas na amostra. Sob condições deamostras designadas, a fração de ligação especificada (porexemplo, um anticorpo ou uma porção de ligação de antígenodeste) se liga preferencialmente a uma molécula alvo parti-cular e não se liga em uma quantidade significante a outroscomponentes em uma amostra de teste. Uma variedade de forma-tos de ensaio pode ser usada para selecionar um anticorpoque se liga especificamente a uma molécula de interesse. Porexemplo, imunoensaio ELISA em fase sólida, imunoprecipita-ção, análise BIAcore e Western blot são usados para identi-ficar um anticorpo que reage especificamente com CTLA-4. Ti-picamente, uma reação especifica ou seletiva será pelo menosduas vezes um sinal de fundo ou ruido e mais tipicamentemais que 10 vezes sinal de fundo, ainda mais especificamenteum anticorpo é dito se "ligar especificamente" a um antigenoquando a constante de dissociação de equilíbrio (K0) é >ΙμΜ, preferivelmente < IOOnM e mais preferivelmente < 10 nM.

O termo "KD" refere-se à constante de dissociaçãode equilíbrio de uma interação particular de anticorpo-antigeno.

Como usado aqui, "substancialmente puro" significauma espécie objeto que é a espécie predominantemente presen-te (i.e. em uma base molar ela é mais abundante que qualqueroutra espécie individual na composição), e, preferivelmente,uma fração substancialmente purificada é uma composição, emque a espécie objeto (por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4)compreende pelo menos cerca de 50% (em uma base molar) detodas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente,uma composição substancialmente pura compreenderá mais quecerca de 80% de toda a espécie macromolecular presente nacomposição, mais preferivelmente mais que cerca de 85%, 90%,95%, e 99%. Mais preferivelmente, a espécie objeto é purifi-cada para homogeneidade essencial (espécie contaminante nãopode ser detectada na composição por métodos de detecçãoconvencionais), em que a composição consiste essencialmenteem uma espécie macromolecular.

O termo "quantidade eficaz", ou "quantidade tera-peuticamente eficaz", como usado aqui, significa uma quanti-dade que quando administrada a um mamífero, preferivelmenteum humano, medeia uma resposta terapêutica detectável emcomparação com a resposta detectada na ausência do composto.

Uma resposta terapêutica, tais como, mas sem limitação, ini-bição de e/ou crescimento de tumor diminuído (inclusive es-tase de tamanho de tumor), tamanho de tumor, metástase, esimilares, pode ser prontamente avaliada por uma pletora demétodos reconhecidos da técnica, incluindo, por exemplo,tais métodos como descritos aqui.

Aquele versado na técnica entenderia que a quanti-dade eficaz do composto ou composição administrada aqui va-ria e pode ser prontamente determinada com base em váriosfatores, tais como a doença ou condição que está sendo tra-tada, o estágio da doença, a idade e saúde e condição físicado mamífero que está sendo tratado, a gravidade da doença, ocomposto particular que está sendo administrado, e similar.

Uma "quantidade terapêutica eficaz", ou "quantida-de eficaz", tem o objetivo de qualificar a quantidade de umagente requerido para reduzir em alguma extensão um ou maisdos sintomas de um distúrbio de neoplasia, incluindo, massem limitação: 1) redução do número de células cancerosas;2) redução do tamanho do tumor; 3) inibição (i.e. retarda-mento em alguma extensão, preferivelmente interrupção) dametástase do tumor; 4) inibição, em alguma extensão, docrescimento do tumor; 5) alívio ou redução em alguma exten-são dos sintomas associados ao distúrbio; e/ou 6) alívio ouredução dos efeitos colaterais associados à administração deagentes anticâncer.Em combinação com os ensinamentos proporcionadosaqui, por escolha dentre os vários compostos ativos e fato-res ponderáveis tais como potência, biodisponibilidade rela-tiva, peso corporal do paciente, gravidade dos efeitos cola-terais adversos e modo preferido de administração, um regimede tratamento profilático ou terapêutico pode ser planejado,que não provoque toxidez substancial e seja ainda eficaz pa-ra tratar o paciente particular.. A quantidade eficaz paraqualquer aplicação particular pode variar dependendo de taisfatores como a doença ou condição que está sendo tratada, agravidade da doença ou da condição, e a saúde e o tamanho dopaciente. Aquele com conhecimento ordinário da técnica podedeterminar empiricamente a quantidade eficaz de CpG ODNPF3512676, anticorpos anti-CTLA-4, e/ou outro agente tera-pêutico sem necessidade de experimentação indevida.

A quantidade terapeuticamente eficaz de ODN e/ouanticorpos sozinhos ou juntos pode ser inicialmente determi-nada a partir de modelos animais. Uma dose terapeuticamenteeficaz pode ser também determinada de dados humanos para oODN especifico e/ou anticorpos específicos que são conheci-dos por exibirem atividades farmacológicas similares. Dosesmais altas podem ser requeridas para administração parente-ral. A dose aplicada pode ser ajustada com base na biodispo-nibilidade e potências relativas do composto administrado.Ajuste da dose para obtenção de eficácia máxima com base nosmétodos descritos acima e outros métodos como são bem conhe-cidos da técnica estão bem dentro das capacidades daquele com conhecimento ordinário da técnica."Material instrucional", como aquele termo usadoaqui, inclui uma publicação, uma gravação, um diagrama, ouqualquer outro meio de expressão que pode ser usado para co-municar a utilidade do composto, combinação e/ou composiçãoda invenção no kit para afetar, aliviar, ou tratar as váriasdoenças ou distúrbios citados aqui. Opcionalmente, ou alter-nativamente, o material instrucional pode descrever um oumais métodos para aliviar as doenças e distúrbios em uma cé-lula, um tecido, ou um mamífero, incluindo aqueles descritosem algum lugar aqui.

O material instrucional do kit pode, por exemplo,ser afixado a um recipiente que contém o composto e/ou com-posição ou ser expedido juntamente com um recipiente quecontém o composto e/ou composição. Alternativamente, o mate-rial instrucional pode ser expedido separadamente do recipi-ente com o objetivo de o usuário utilizar o material instru-cional e o composto cooperativamente.

O ODN e/ou anticorpo da invenção podem ser propor-cionados em um dispensador medicinal. Um dispensador medici-nal é uma embalagem que define uma pluralidade de comparti-mentos de armazenagem medicinal, cada compartimento paraconter uma unidade individual do medicamento. Um curso medi-cinal inteiro de tratamento é contido em uma pluralidade decompartimentos de armazenagem medicinal.

Uma embalagem que define uma pluralidade de com-partimentos de armazenagem medicinal pode ser qualquer tipode embalagem farmacêutica ou cartão, descartáveis, que man-tenha os medicamentos em compartimentos "individuais. Por e-xemplo, a embalagem é uma embalagem de blister construída deum cartão que pode ser feito de material de papel rígido,uma lâmina de blister e folha de revestimento. Tais cartõessão bem conhecidos daquele com conhecimento ordinário datécnica.

Como exemplo, um dispensador medicinal pode conterum curso medicinal de tratamento inteiro. 0 dispensador podeincluir marcações de dias para indicar que dia as unidadesindividuais do medicamento devem ser tomadas. Essas podemser marcadas ao longo de um primeiro lado da embalagem medi-cinal. Indicadores de doses podem ser marcados também, porexemplo, ao longo do segundo lado da embalagem medicinalperpendicular ao primeiro lado da embalagem medicinal, indi-cando, assim o tempo que a unidade individual do medicamentodeve ser tomada. As doses unitárias podem estar contidas nodispensador, que é uma embalagem de blister.

Exceto quando mencionado, os termos, "paciente" ou"sujeito", são usados intercambiavelmente e referem-se a ma-míferos tais como, pacientes humanos e primatas não humanos,bem como pacientes veterinários, tais como coelhos, ratos, ecamundongos, e outros animais. Preferivelmente, paciente re-fere-se a um humano.

Como usado aqui, "tratar" significa reduzir a fre-qüência com a qual os sintomas de uma doença (i.e., cresci-mento de tumor e/ou metástase, ou outro efeito mediado pelosnúmeros e/ou atividade das células imunes, e similares) sãosofridos por um paciente. O termo inclui a administração doscompostos ou agentes da presente invenção para prevenir ouretardar o início dos sintomas, complicações, ou indicaçõesbioquímicas de uma doença (por exemplo, elevação do nível dePSA em câncer de próstata) , aliviar os sintomas ou interrom-per ou inibir posterior desenvolvimento da doença, condição,ou distúrbio. O tratamento pode ser profilático (para preve-nir ou retardar o início da doença, ou para prevenir a mani-festação de sintomas clínicos ou subclínicos desta) ou su-pressão terapêutica ou alívio de sintomas depois da manifes-tação da doença.

"Terapia de combinação" engloba a administração deum CpG ODN PF3512676 e um anticorpo CTLA-3 como parte de umregime de tratamento específico tendo o objetivo de propor-cionar um efeito benéfico da co-ação destes agentes tera-pêuticos. 0 efeito benéfico da combinação inclui, mas semlimitação, co-ação farmacocinética ou farmacodinâmica resul-tante da combinação de agentes terapêuticos. A administraçãodesses agentes terapêuticos em combinação é tipicamente efe-tuada por um período de tempo definido (usualmente minutos,horas, dias ou semanas, dependendo da combinação seleciona-da). "Terapia de combinação" em geral não tem o objetivo deenglobar a administração de dois ou mais desses agentes te-rapêuticos, como parte de regimes monoterapêuticos separadosque incidental e arbitrariamente resulta nas combinações dapresente invenção.

"Terapia de combinação" engloba a administraçãodesses agentes terapêuticos em um modo seqüencial, ou seja,em que cada agente terapêutico é administrado em um tempodiferente, bem como a administração desses agentes terapêu-ticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, em ummodo substancialmente simultâneo. A administração substanci-almente simultânea pode ser obtida, por exemplo, por admi-nistração ao paciente, de uma cápsula única tendo uma razãofixada de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulasúnicas para cada um dos agentes terapêuticos. Administraçãoseqüencial ou substancialmente simultânea de cada agente te-rapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada in-cluindo, mas sem limitação, vias orais, vias intravenosas,vias intramusculares, vias subcutâneas, e a absorção diretaatravés de tecidos de membrana mucosa. Os agentes terapêuti-cos podem ser administrados pela mesma via ou por vias dife-rentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico (por e-xemplo, CpG ODN PF3512676) pode ser administrado por injeçãosubcutânea, e um segundo agente (por exemplo, anticorpo an-ti-CTLA-4) pode ser administrado intravenosamente. Ainda, umprimeiro agente terapêutico da combinação selecionada podeser administrado por injeção intravenosa, enquanto que osoutros agentes terapêuticos da combinação podem ser adminis-trados oralmente. Alternativamente, por exemplo, ambos osagentes terapêuticos podem ser administrados oralmente ouambos os agentes terapêuticos podem ser administrados porinjeção intravenosa.

"Terapia de combinação" engloba também a adminis-tração dos agentes terapêuticos como descritos acima em pos-terior combinação com outros ingredientes biologicamente a-tivos (tais como, mas sem limitação, um segundo e diferenteagente antineoplásico, uma vacina dendritica ou outra vacinacontra tumor) e terapias sem uso de fármacos (tais como, massem limitação, cirurgia ou tratamento com radiação) . Quandoa terapia de combinação compreende ainda tratamento com ra-diação, o tratamento com radiação pode ser conduzido emqualquer tempo desde que o efeito benéfico da co-ação dacombinação dos agentes terapêuticos e tratamento com radia-ção seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o e-feito benéfico é ainda obtido quando o tratamento com radia-ção é temporariamente removido da administração dos agentesterapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.

II. Anticorpos Anti-CTLA-4

Como estabelecido previamente em algum lugar aqui,o anticorpo anti-CTLA-4 preferido é um anticorpo humano quese liga especificamente a CTLA-4 humano. Exemplos de anti-corpos anti-CTLA-4 humanos são descritos detalhadamente noPedido Internacional PCT/US99/30895, publicado em 29 de ju-nho de 2000, como WO 00/37504, Pedido de Patente EP 1262193Al, publicado em 12 de abril de 2002, e Pedido de Patente US09/472.087, agora patente concedida US 6.682.736 (Hansol etal.), bem como o Pedido de Patente US 09/948.939, publicadocomo US 2 002/008 6014, cuja inteira exposição é aqui incorpo-rada a titulo de referência. Tais anticorpos incluem, massem limitação, 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3,6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, e 12.9.1.1, bemcomo MDX-010. Anticorpos humanos proporcionam uma vantagemsubstancial nos métodos de tratamento da presente invenção,já que se espera que eles minimizem as respostas imunogêni-cas e alérgicas que estão associadas ao uso de anticorposnão humanos em pacientes humanos.

As características dos anticorpos anti-CTLA-4 hu-manos úteis da invenção são extensivamente discutidas em WO00/37504, EP 1262193, e a Patente US 6.682.736, bem como asPublicações de Pedidos de Patente US 2002/0086014 e US2003/008 6930, e as seqüências de aminoácidos e ácidos nu-cléicos estabelecidas aqui são incorporadas, aqui, a títulode referência, em sua totalidade. Em resumo, os anticorposda invenção incluem anticorpos tendo seqüências de aminoáci-dos de um anticorpo, tais como, mas sem limitação, anticor-pos 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1.,11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, e 12.9.1.1 e MDX-010. Ainvenção refere-se também a anticorpos tendo as seqüênciasde aminoácidos das CDRs das cadeias pesadas e leves dessesanticorpos, bem como aquelas tendo alterações nas regiões deCDR, conforme descrição nos pedidos e patente citados acima.

A invenção refere-se ainda a anticorpos tendo as regiões va-riáveis das cadeias pesadas e leves desses anticorpos. Emuma outra modalidade, o anticorpo é selecionado de um anti-corpo que tem as seqüências inteiras de aminoácidos da regi-ão variável, ou CDR, das cadeias pesadas e leves dos anti-corpos 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1.,11.2.1/11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, e 12.9.1.1, e MCD-010.

Em uma modalidade, a invenção compreende uma com-binação de anticorpo-agente terapêutico contendo um anticor-po anti-CTLA-4 humano descrito nos Pedidos de Patente US09/948.939, publicado como Publicação de Pedido de PatenteUS 2002/0086014 e US 2003/008 69030, e as referências citadasneles, incluindo, mas sem limitação, MAb IODl (MDX-010, Me-darex, Princeton, NJ) . Ainda mais preferivelmente, o anti-corpo anti-CTLA-4 é MDX-010. Alternativamente, o anticorpoanti-CTLA-4 é 11.2.1 (Ticilimumabe; CP-657.206).

Em uma outra modalidade, a seqüência de aminoáci-dos da Vh compreende as seqüências de aminoácidos estabele-cidas nas SEQ ID Nos:3, 15 e 27. Em ainda uma outra modali-dade, a Vl compreende as seqüências de aminoácidos estabele-cidas nas SEQ ID Nos:9, 21 e 33. Mais preferivelmente, as Vhe Vl compreendem as seqüências de aminoácidos estabelecidasna SEQ ID NO:3 (VH 4.1.1) e SEQ ID NO:9 (VL 4.1.1), respec-tivamente; as seqüências de aminoácidos estabelecidas na SEQID NO:15 (VH 4.13.1) e SEQ ID N0:21 (VL 4.13.1), respectiva-mente; e as seqüências de aminoácidos estabelecidas na SEQID NO:27 (VH 11.2.1) e SEQ ID NO:33 (VL 11.2.1), respectivamente.

Em ainda uma outra modalidade, a seqüência de ami-noácidos da cadeia pesada compreende a seqüência de aminoá-cidos codificada por um ácido nucléico que compreende as se-qüências de ácidos nucléicos estabelecidas nas SEQ ID Nos:13, e 25. Em ainda uma outra modalidade, a cadeia leve com-preende a seqüência de aminoácidos codificada por um ácidonucléico que compreende as seqüências de ácidos nucléicosestabelecidas nas SEQ ID NOs:7, 19 e 31. Mais preferivelmen-te, as cadeias pesadas e leves compreendem as seqüências deaminoácidos codificadas por ácidos nucléicos que compreendemas seqüências de ácidos nucléicos estabelecidas na SEQ IDNO: 1 (cadeia pesada 4.1.1) e na SEQ ID NO:7 (cadeia leve4.1.1), respectivamente; as seqüências de ácidos nucléicosestabelecidas na SEQ ID NO:13 (cadeia pesada 4.13.1) e naSEQ ID NO:19 (cadeia leve 4.13.1), respectivamente; e as se-qüências de ácidos nucléicos estabelecidas na SEQ ID NO:25(cadeia pesada 11.2.1) e SEQ ID N0:31 (cadeia leve 11.2.1),respectivamente.

Além disso, o anticorpo pode compreender uma se-qüência de aminoácidos de cadeia pesada que contém seqüên-cias de aminoácidos de CDR humanas derivadas do gene de Vh3-30 ou 3-33, ou substituições conservativas ou mutações so-máticas nelas. 0 anticorpo pode compreender também regiõesde CDR em sua cadeia leve derivada do gene A27 ou 012, i.e.de menos que cinco, ou de menos que dez de tais mutações. 0anticorpo pode compreender também regiões de estrutura da-queles genes, incluindo aqueles que diferem de menos quecinco, ou de menos que dez aminoácidos. Também incluídos es-tão anticorpos com regiões de estrutura descritas aqui queforam mutadas para refletir a seqüência de germe-linha original.

Em outras modalidades da invenção, o anticorpo i-nibe a ligação entre CTLA-4 e B7-1, B7-2, ou ambos. Preferi-velmente, o anticorpo pode inibir a ligação com B7-1 com umaIC50 de cerca de IOOnM ou menor, mais preferivelmente cercade IOnM ou menor, por exemplo, cerca de 5nM ou menor, aindamais pref erivelmente, cerca de 2nM ou menor, ou mesmo maispreferivelmente, por exemplo, cerca de InM ou menor. Igual-mente, o anticorpo pode inibir a ligação com B7-2 com umaIC50 de cerca de IOOnM ou menor, mais preferivelmente, IOnMou menor, por exemplo, ainda mais preferivelmente, cerca de5nM ou menor, ainda mais pref erivelmente, cerca de 2nM oumenor, ou ainda mais preferivelmente, cerca de InM ou menor.

Adicionalmente, em uma outra modalidade, o anti-corpo anti-CTLA-4 tem uma afinidade de ligação por CTLA-4 decerca de IO"8, ou afinidade maior, mais preferivelmente,cerca de IO"9 ou afinidade maior, mais preferivelmente, cer-ca de IO"10 ou afinidade maior, e ainda mais pref erivelmente,cerca de IO"11 ou afinidade maior.

0 anticorpo anti-CTLA-4 pode competir por ligaçãocom um anticorpo tendo seqüências de aminoácidos de cadeiasleves e pesadas selecionadas de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em 4.1.1, 6.1.1., 11.2.1, 4.13.1 e4.14.3. Ainda, o anticorpo anti-CTLA-4 pode competir cruzadocom um anticorpo MDX-010.

Em uma outra modalidade, o anticorpo preferivel-mente compete cruzado com um anticorpo tendo uma seqüênciade cadeias pesadas e leves, uma seqüência de cadeia pesadavariável e leve variável, e/ou as seqüências de CDR pesada eleve de anticorpo 4.11, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1. ou 11.2.1.

Por exemplo, o anticorpo pode se ligar ao epitopo ao qual seliga um anticorpo que tem seqüências de aminoácidos de ca-deias pesadas e leves, seqüências variáveis e/ou seqüênciasde CDR, de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em4.1.1, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, ou 11.2.1. Em uma outra moda-lidade, o anticorpo compete cruzado com um anticorpo tendoseqüências de cadeias pesadas e leves, ou seqüências de li-gação de antigeno, de MDX-10.Em uma outra modalidade, a invenção é praticadausando um anticorpo-CTLA-4 que compreende uma cadeia pesadaque compreende as seqüências de aminoácidos de CDR-I, CDR-2,e CDR-3, e uma cadeia leve que compreende as seqüências deaminoácidos de CDR-1, CDR-2, e CDR-3, de um anticorpo sele-cionado do grupo que consistem em 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1,12.3.1.1, e 12.9.1.1, ou seqüências tendo alterações prove-nientes das ditas seqüências de CDR selecionadas do grupoque consiste em alterações conservativas, em que as altera-ções conservativas são selecionadas do grupo que consiste emreposição de resíduos apolares por outros resíduos apolares,reposição de resíduos carregados polares por outros resíduosnão carregados polares, reposição de resíduos carregados po-lares por outros resíduos carregados polares, e substituiçãode resíduos estruturalmente similares; substituições nãoconservativas, em que as substituições não conservativas sãoselecionadas do grupo que consiste em substituição de resí-duo polar carregado para resíduos não carregados polares esubstituição de resíduos apolares para resíduos polares, a-dições e deleções.

Em uma outra modalidade da invenção, o anticorpocontém menos que 10, 7, 5, ou 3 alterações de aminoácidos daseqüência de germe-linha na regiões de estrutura ou CDR. Emuma outra modalidade, o anticorpo contém menos que 5 aminoá-cidos nas regiões de estrutura e menos que 10 alterações nasregiões CDR. Em uma modalidade preferida, o anticorpo contémmenos que 3 alterações de aminoácidos nas regiões de estru-tura e menos que 7 alterações nas regiões CDR. Em uma moda-lidade preferida, as alterações nas regiões de estrutura sãoconservativas e aquelas nas regiões CDR são mutações somáticas.

Em uma outra modalidade, o anticorpo tem pelo me-nos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, ainda maispreferivelmente, pelo menos 90%, mesmo mais preferivelmente,pelo menos 95%, e de maior preferência, pelo menos 99%, deidentidade de seqüências sobre as seqüências de CDR-1, CDR-2, e CDR-3 de cadeia pesada e leve com as seqüências de CDRde anticorpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3,6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, e 12.9.1.1. Aindamais preferivelmente, o anticorpo compartilha uma identidadede seqüência de 100% sobre as CDR-1, CDR-2 e CDR-3 de cadeiapesada e leve com a seqüência de anticorpo 3.1.1, 4.1.1,4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1,11.7.1, 12.3.1.1, e 12.9.1.1.

Em uma outra modalidade, o anticorpo tem pelo me-nos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, ainda maispreferivelmente, pelo menos 90%, mesmo mais preferivelmente,pelo menos 95%, e de maior preferência, pelo menos 99%, deidentidade de seqüências sobre as seqüências de regiões va-riáveis de cadeia pesada e leve com as seqüências de regiõesvariáveis de anticorpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1,4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, e12.9.1.1. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo comparti-lha uma identidade de seqüência de 100% sobre as seqüênciasde regiões variáveis de cadeia pesada e leve com as seqüên-cias de anticorpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1,4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, e12.9.1.1.

Embora os anticorpos anti-CTLA-4 discutidos previ-amente aqui possam ser preferidos, aquele versado na técni-ca, com base na descrição dada aqui, apreciaria que a inven-ção engloba uma grande variedade de anticorpos anti-CTLA-4 enão está limitada a esses anticorpos particulares. Mais par-ticularmente, embora os anticorpos humanos sejam preferidos,a invenção não está de modo algum limitada a anticorpos hu-manos; mais exatamente, a invenção engloba anticorpos úteisindependentemente da origem da espécie, e inclui, entre ou-tros, anticorpos humanizados quiméricos e/ou primatizados.

Também, embora os anticorpos exemplificados aqui tenham sidoobtidos usando mamífero transgênico, por exemplo, um camun-dongo compreendendo um repertório imune humano, aquele ver-sado na técnica, com base na descrição dada aqui, entenderiaque a presente invenção não está limitada a um anticorpoproduzido por este ou por qualquer outro método particular.

Em vez disso, a invenção inclui um anticorpo anti-CTLA-4produzido por qualquer método, incluindo, mas sem limitação,um método conhecido da técnica (por exemplo, seleção de bi-blioteca de exposição em fagos ("phage display"), e similar)ou a ser desenvolvido no futuro para produzir um anticorpo-anti-CTLA-4 da invenção. Com base na descrição extensivapropiciada aqui, e em, por exemplo, a Patente US 6.682.736(Bedian et al. ) e Publicação de Pedido de Patente US2002/0088014, aquele versado na técnica pode prontamenteproduzir e identificar um anticorpo útil para o tratamentode câncer da mama em combinação com um agente terapêuticousando os novos métodos descritos aqui.

A presente invenção engloba anticorpos humanos u-sando um mamífero não humano transgênico, i.e. XenoMouse™(Abgenix, Inc., Fremont, CA) conforme descrito na Patente US6.682, 736 (Hanson et al. ).

Um outro sistema de camundongo transgênico para aprodução de anticorpos "humanos" é referido como "HuMAb-Mouse™ (Medarex, Princenton, NJ) , que contêm minilocais degene de imunoglobulina humana que codificam seqüências deimunoglobulina de cadeias pesadas humana (mu e gama) e leveskappa, nãp rearranjada, juntamente com as mutações alvejadasque inativam os locais de cadeias um e kappa endógenas (Lon-berg et al., Nature 368:856-859 (1994), e a Patente US5.770.429).

Contudo, a invenção usa anticorpos anti-CTLA-4 hu-manos produzidos usando qualquer mamífero transgênico, taiscomo, mas sem limitação, Kirin TC Mouse™ (Kirin Beer Kabu-shiki Kaisha, Tóquio, Japão) conforme descrito por, por e-xemplo, Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722(2000); Kuroiwa et al., Nature Biotechnol 18:1086 (2000);Publicação de Pedido de Patente US 2004/0120948 (Mikayama etal.; e a HuMAb-Mouse™ (Medarex, Princeton, NJ) e XenoMouse™(Abgenix, Inc., Fremont, CA), supra. Assim, a invenção en-globa o uso de um anticorpo anti-CTLA-4 produzido usandoqualquer animal transgênico ou não-humano.

Além disso, embora o método preferido para produ-zir um anticorpo-CTLA-4 humano compreenda a geração dos an-ticorpos usando um mamífero transgênico não-humano compreen-dendo um repertório imune humano, a presente invenção nãoestá, de modo nenhum, limitada a esta abordagem. Mais exata-mente, como seria apreciado por aquele versado na técnicauma vez de posse da descrição proporcionada aqui, a invençãoengloba usar qualquer método para a produção de um anticorpohumano ou de qualquer outro anticorpo específico para CTLA-4produzido de acordo com qualquer método conhecido na técnicaou a ser desenvolvido no futuro para a produção de anticor-pos que se ligam especificamente a um antígeno de interesse:.

Anticorpos humanos podem ser desenvolvidos por mé-todos que incluem, mas sem limitação, o uso de bibliotecasde anticorpos de exposição em fagos. Usando essas técnicas,os anticorpos podem ser gerados para células que expressamCTLA-4, o próprio CTLA-4, formas de CTLA-4, epítopos ou pep-tídeos destes, e bibliotecas de expressão para estes (vide,por exemplo, Patente US 5.703.057), que podem, depois disso,ser selecionados para as atividades descritas acima.

Em uma outra modalidade, os anticorpos empregadosnos métodos da invenção não são inteiramente humanos, mas"humanizados". Em particular, anticorpos murinos ou anticor-pos de outras espécies podem ser "humanizados" ou "primati-zados" usando técnicas bem conhecidas da arte. Vide, por ex-emplo, Winter e Harris Immunol. Today 14:43-46 (1993),Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992), ea Patente US 4.816.567 (Cabilly et al. , e Mage e Lamoyl emMonoclonal Antibody Production Techniques and Applicationspp. 79-97, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, NI (1987).

Como será apreciado com base na exposição forneci-da aqui, anticorpos para uso na invenção podem ser obtidosde um mamífero não-humano transgênico, e hibridomas deriva-dos dele, mas podem também ser expresso em linhagens de cé-lulas diferentes de hibridomas.

Linhagens de células de mamíferos disponíveis comohospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica eincluem muitas linhagens de células imortalizadas da Ameri-can Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas sem limi-tação células de ovário de hamster chinês (CHO), NSO, célu-las HeLa, células de rins de filhotes de hamster (BKH) , cé-lulas de rim de macaco (COS), e células de carcinoma hepato-celular humano (por exemplo Hep G2) . Células procarióticasnão mamíferas e eucarióticas, incluindo células bacterianas,de levedura, de insetos, e vegetais.

Vários sistemas de expressão podem ser usados, bemcomo conhecidos da técnica, tais como, mas sem limitação,aqueles descritos, por exemplo, por Sambrook e Russel, Mole-cular Cloningr A Laboratory Approach, Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, NI (2001), e Ausubel et al., Cur-rent Protocols in Molecular Biology, Jonh Wiley & Sons, NI(2002). Esses sistemas de expressão incluem sistemas com ba-se em diidrofolato redutase (DHFR), dentre muitos outros. 0sistema de glutamina sintetase de expressão é discutido in-tegralmente ou em parte em conexão com as Patentes EP 216846, EP 256 055 e EP 323 997 e o Pedido de Patente EP89303964. Em uma modalidade, o anticorpo usado é feito emcélulas NSO usando um sistema de glutamina sintetase (GS-NSO). Em uma outra modalidade, o anticorpo é feito em célu-las CHO usando um sistema DHFR. Ambos os sistemas são bemconhecidos na técnica e são descritos, entre outros, porBarnes et al. Biotech & Bioengineering 73:261-270 (2001), ereferências citadas nele.

Mutagênese sitio-direcionada do domínio CH2 do an-ticorpo para eliminar glicosilação pode ser preferida de mo-do a impedir alterações na imunogenicidade, farmacocinética,e/ou nas funções efetoras resultantes da glicosilação nãohumana. Ainda, o anticorpo pode ser desglicosilado por méto-dos enzimáticos (vide, por exemplo, Thotakura et al. Meth.Enzymol. 138:350 (1987)) e/ou químicos (vide, por exemplo,Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)).

Além disso, a invenção engloba o uso de um anti-corpo anti-CTLA-4 que compreende um padrão de glicosilaçãoalterado. Aquele versado na técnica apreciaria, com base naexposição proporcionada aqui, que um anticorpo anti-CTLA-4pode ser modificado para compreender, menos, ou diferentessítios de glicosilações adicionais em comparação com o anti-corpo que ocorre naturalmente. Tais modificações estão des-critas, por exemplo, na Publicação de Pedidos de Patente US2003/0207336, e US 2003/0157108, e Publicação dos Pedidos dePatente Internacional WO 01/81405 e WO 00/24893.

Adicionalmente, a invenção compreende o uso de umanticorpo anti-CTLA-4 independentemente da glicoforma, sealguma, presente no anticorpo. Ademais, os métodos para re-modelar extensivamente a glicoforma presente em uma glico-proteína são bem conhecidos da técnica e incluem, por exem-plo, aqueles descritos na Publicação de Pedido de PatenteInternacional WO 03/031464, WO 98/58964, e WO 99/22764, ePublicação de Pedidos de Patente US 2004/0063911, US2004/0132640, US 2004/0142856, US 2004/00722 90, e Patente US6.602.684 (Umana et al.).

A invenção engloba ainda o uso de um anticorpo an-ti-CTLA-4 com qualquer modificação covalente e não covalenteconhecida da técnica, incluindo, mas sem limitação, ligar opolipeptídeo a um de uma variedade de polímeros não protéi-cos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol,ou polioxialquilenos, do modo estabelecido, por exemplo, nasPublicações de Pedidos de Patente US 2003/0207346 e US2004/0132640, e nas Patentes US 4.640.835; US 4.496.689; US4.301.144; US 4.670.417; US 4.791.192; US 4.179.337.

Adicionalmente, a invenção engloba o uso de um an-ticorpo anti-CTLA-4, ou uma porção de ligação de antígenodeste, proteína quimérica compreendendo, por exemplo, um po-lipeptídeo de albumina sérica humana, ou fragmento deste. Sea proteína quimérica é produzida usando-se métodos recombi-nantes, por exemplo, por clonagem de um ácido nucléico qui-mérico que codifica a proteína quimérica, ou por ligaçãoquímica das duas porções peptídicas, o versado na técnicaentenderia uma vez de posse dos ensinamentos proporcionadosaqui que tais proteínas quiméricas são bem conhecidas datécnica e podem conferir propriedades biológicas desejadastais como, mas sem limitação, estabilidade e meia-vida au-mentadas do anticorpo da invenção e tais são, portanto, in-cluídas aqui.

Os anticorpos que são gerados para uso na invençãonão precisam possuir inicialmente um isótipo particular de-sejado. De preferência, o anticorpo conforme gerado podepossuir qualquer isótipo e pode ser deslocado do isótipo porquaisquer técnicas convencionais. Essas incluem técnicas re-combinantes diretas (vide, por exemplo, a Patente US4.816.397), e as técnicas de fusão célula-célula (vide, porexemplo, a Patente US 5.916.771).

A função efetora dos anticorpos da invenção podeser alterada por deslocamento de isótipo para um IgGl, IgG2,IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM para vários usos terapêu-ticos. Além disso, dependência de complemento para destruiras células pode ser evitada através do uso de, por exemplo,bioespecificos, imunotoxinas, ou radiomarcadores .

Portanto, embora os anticorpos preferidos usadosna invenção sejam exemplificados por anticorpos tendo as se-qüências de aminoácidos de 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1,12.9.1.1, e MDX-010, ou, por exemplo, as seqüências das re-giões V ou CDRs destas, a presente invenção não está limita-da, de nenhum modo, ao uso destes, ou de quaisquer outrosanticorpos particulares. A invenção engloba combinar a admi-nistração de qualquer anticorpo anti-CTLA-4 da invenção compelo menos um agente de terapia hormonal. Preferivelmente, oanticorpo é 4.1.1, 4.13.1, 11.2.1, e/ou MDX-010. Contudo,qualquer anticorpo anti-CTLA-4, ou porção de ligação de an-tigeno deste, conforme descrito em algum lugar aqui, ou comoconhecido na técnica ou desenvolvido no futuro, pode ser u-sado em um método da invenção. Mais particularmente, anti-corpos quiméricos humanizados, anticorpos anti-CTLA-4 deri-vados de quaisquer espécies (inclusive anticorpos de cadeiaúnica obtidos de camelideos conforme descrição, por exemplo,nas Patentes US 5.759.808 e US 6.765.087 (Casterman e Ha-mers)), bem como qualquer anticorpo humano, podem ser combi-nados com um agente terapêutico para realizar os novos méto-dos descritos aqui.

A invenção engloba também tais anticorpos conformedescritos, entre muitos outros, nas Publicações dos Pedidosde Patente Internacional WO 00/37504 (publicado em 29 de ju-nho de 2000); WO 01/14424 (publicado em 1 de março de 2001);WO 93/00431 (publicado em 7 de janeiro de 1993); e WO00/32231 (publicado em 8 de junho de 2000).

Embora os anticorpos 4.1.1, 4.13.1 e 11.2.1 sejamanticorpos IgG2 e as seqüências das regiões variáveis dosanticorpos sejam fornecidas aqui (Figuras 1 a 3), e nos pe-didos e patentes referenciados e incorporados aqui, deve serentendido que a seqüências inteiras destes anticorpos sãoenglobadas aqui, bem como o uso de qualquer anticorpo com-preendendo as seqüências estabelecidas nas SEQ ID Nos:1-36,e ainda compreendendo qualquer região constante, independen-temente do isótipo conforme integralmente discutido em algumlugar aqui. Igualmente, qualquer anticorpo compreendendo aseqüência inteira do MDX-010, ou qualquer porção desta,incluindo uma seqüência que codifique uma porçãode ligação de antigeno de MDX-010 pode ser administrada emcombinação com pelo menos dois agentes de terapia hormonal,tratando, assim câncer da próstata.

Assim, aquele versado na técnica, uma vez providodos ensinamentos daqui, apreciaria prontamente que a combi-nação de anticorpo anti-CTLA-4-agente terapêutico da inven-ção pode compreender um amplo leque de anticorpos anti-CTLA-4.

Ainda, aquele versado na técnica, com base na des-crição proporcionada aqui, entenderia que a invenção não es-tá limitada à administração de somente um único anticorpo;mais exatamente, a invenção engloba a administração de pelomenos um anticorpo anti-CTLA-4, por exemplo, 4.1.1, 4.13.1 e11.2.1, em combinação com um agente terapêutico. Além disso,a invenção engloba administrar qualquer combinação de qual-quer anticorpo anti-CTLA-4 conhecido, incluindo, mas sem li-mitação, administrar um agente terapêutico com, por exemplo,4.1.1, 4.13.1, 11.2.1 e MDX-010. Assim, qualquer combinaçãode anticorpos anti-CTLA-4 pode ser combinada com pelo menosum agente terapêutico aceitável e a presente invenção englo-ba tais combinação e permutação desta.

III. CpG ODN

Verificou-se que os oligonucleotideos CpG contêmseqüências especificas que elicitam uma imunorresposta. Es-sas seqüências especificas são referidas como "motivos imu-noestimulantes", e os oligonucleotideos que contêm os moti-vos imunoestimulantes são referidos como "moléculas de oli-gonucleotideos imunoestimulantes" e, por equivalência, "oli-gonucleotideos imunoestimulantes". Os oligonucleotideos imu-noestimulantes incluem pelo menos um motivo imunoestimulan-te, e, preferivelmente que esse motivo é um motivo interno.O termo "motivo imunoestimulante interno" refere-se à posi-ção da seqüência de motivos dentro de uma seqüência de oli-gonucleotideos, que é pelo menos um nucleotideo mais longo(em ambas as extremidades 5' e 3') que a seqüência de motivos.

Oligonucleotideos CpG incluem pelo menos um dinu-cleotideo CpG não metilado. Um oligonucleotideo contendo pe-lo menos um dinucleotideo CpG não metilado é uma molécula deoligonucleotideo que contém uma seqüência de dinucleotideoscitosina-guanina (i.e. "CpG DNA " ou DNA contendo uma 5' ci-tosina ligada por uma ligação de fosfato a uma 3' guanina) eativa o sistema imunológico. 0 oligonucletideo CpG inteiropode ser não metilado ou porções podem ser não metiladas,mas pelo menos o C do 5' CG 3' deve ser não metilado.

A classe B dos oligonucleotideos CpG é representa-da pela fórmula:

<formula>formula see original document page 52</formula>

em que Xi e X2 são nucleotideos. Em algumas modali-dades, Xi pode ser adenina, guanina, ou timina e/ou X2 podeser citosina, adenina, ou timina.

A classe B dos oligonucleotideos CpG é também re-presentada pela fórmula:

<formula>formula see original document page 52</formula>

em que X1, X2, X3, e X4 são nucleotideos. X2 podeser adenina, guanina, ou timina. X3 pode ser citosina, ade-nina, ou timina.A classe B dos oligonucleotideos CpG inclui oligo-nucleotideos representados por pelo menos a fórmula:

5' N1X1X2CGX3X4N2 3'

em que Xi, X2, X3, e X4 são nucleotideos e N équalquer nucleotideo e N1 e N2 são seqüências de oligonucle-otideos compostas de cerca de 0-25 Ns cada. X1X2 pode ser umdinucleotideo selecionado do grupo que consiste em: GpT,GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT, e TpG; eX3X4 pode ser um dinucleotideo selecionado do grupo que con-siste em: TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, e CpA.

A classe B de oligonucleotideos CpG está descritanos Pedidos de Patente PCT/US95/01570 e PCT/US97/19791, enas Patentes US 6.194.388 Bl e US 6.239.116 BI, expedidas em27 de fevereiro de 2001 e 29 de maio de 2001, respectivamente.

As moléculas de oligonucleotideos imunoestimulan-tes podem ter uma cadeia principal homogênea (por exemplo,inteiramente fosfodiéster ou inteiramente fosforotioato) ouuma cadeia principal quimérica. Para os propósitos da pre-sente invenção, uma cadeia principal quimérica refere-se auma cadeia principal parcialmente estabilizada, em que pelomenos uma ligação entre nucleotideos é fosfodiéster ou simi-lar a fosfodiéster, e em que pelo menos uma outra ligaçãoentre nucleotideos é uma ligação entre nucleotideos estabi-lizada, em que a pelo menos uma ligação de fosfodiéster ousimilar a fosfodiéster e a pelo menos uma ligação estabili-zada são diferentes. Já que as ligações de boranofosfatosforam reportadas como sendo estabilizadas com relação às li-gações de fosfodiéster, para os propósitos da natureza qui-mérica da cadeia principal, as ligações de boranofosfonatopodem ser classificadas ou como similares a de fosfodiésterou como estabilizadas, dependendo do contexto. Por exemplo,uma cadeia principal quimérica de acordo com a presente in-venção poderia, em uma modalidade, incluir pelo menos umaligação de fosfodiéster (fosfodiéster ou similar a fosfodi-éster) e pelo menos uma ligação (estabilizada) de boranofos-fonato. Em uma outra modalidade, uma cadeia principal quimé-rica de acordo com a presente invenção poderia incluir liga-ções (estabilizadas) de boranofosfonato (fosfodiéster ou si-milar a fosfodiéster) e fosforotioato. Uma "ligação entrenucleotideos estabilizada" deve significar uma ligação entrenucleotideos que é relativamente resistente à degradação invivo (por exemplo, via uma exo- ou endonuclease) , em compa-ração com uma ligação entre nucleotideos fosfodiéster. Liga-ções entre nucleotideos estabilizadas preferidas incluem,sem limitação, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfona-to e metilfosforotioato. Outras ligações entre nucleotideosestabilizadas incluem, sem limitação, ligações peptidicas,alquilicas, e do tipo desfosfo, e outras conforme descritasacima.

Cadeias principais modificadas, tais como fosforo-tionatos, podem ser sintetizadas usando técnicas automatiza-das empregando tanto a química de fosforamidato como a de H-fosfonato. Fosfonatos de arila e de alquila podem ser fei-tos, por exemplo, conforme descrição na Patente US4.469.863; e fosfonotriésteres de alquila (nos quais a fra-ção de oxigênio carregada é alquilada), por exemplo, confor-me descrição nas Patentes US 5.023.243 e EP 092.574, podemser preparados por síntese de fase sólida automatizada usan-do reagentes comercialmente disponíveis. Os métodos parapreparar outras modificações e substituições na cadeia prin-cipal do DNA foram descritas. Uhlmann E et al. (1990) ChemRev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Mé-todos para preparar oligonucleotídeos quiméricos são tambémconhecidos. Por exemplos patentes concedidas para Uhlmann etal. descrevem tais técnicas.

ODN modificado de cadeia principal mista pode sersintetizado usando-se um sintetizador de DNA comercialmentedisponível e química padrão de fosforamidita (F. E. Eckste-in, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach"IRL Press, Oxford, GB, 1991, e M. D. Matteucci e Μ. H. Caru-thers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)). Depois de acopla-mento, a ligações PS são introduzidas por sulfurização usan-do o reagente de Beaucage (R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regane S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soe. 112, 1253 (1990))(0,075M em acetonitrila) ou dissulfeto de fenil acetila(PADS) seguido por capeamento com anidrito acético, 2,6-lutidina em tetraidrofurano (1:1:8; ν:ν:ν) e N-metilimidazol(16% em tetraidrofuano). Essa etapa de capeamento é realiza-da depois da reação de sulfurização para minimizar a forma-ção de ligações de fosfodiéster (PO) indesejadas 'em posiçõesonde uma ligação de fosforotioato deve ser localizada. Nocaso da introdução de uma ligação de fosfodiéster, por exem-pio, em um dinucleotídeo CpG, o intermediário fósforo-III éoxidado por tratamento com uma solução de iodo em á-gua/piridina. Depois da clivagem do suporte sólido e despro-teção final por tratamento com amônia concentrada (15 h a50°C), o ODN é analisado por HPLC em uma coluna Gen-Pak Fax(Millipore-Waters) usando um gradiente de NaCl (por exemplo,tampão A: NaH2PO4 10 mM em acetonitrila/água = l:4/v:v pH6,8; tampão B: NaH2PO4 IOmM, NaCl 1,5M em acetonitrila/água= l:4/v:v; 5 a 60% de B em 30 minutos em 1 mL/min) ou poreletroforese em gel capilar. 0 ODN pode ser purificado porHPLC ou por FPLC em uma coluna Source High Performance (A-mersham Pharmacia). Frações homogêneas para HPLC são combi-nadas e dessalgadas via uma coluna C18 ou por ultrafiltra-ção. 0 ODN foi analisado por espectroscopia de massas MALDI-TOF para confirmar a massa calculada.

Os oligonucleotideos da invenção podem incluirtambém outras modificações. Essas incluem análogos de DNAnão iônicos, tais como fosfatos de alquila e de arila (ondeo oxigênio do fosfonato carregado é reposto por um grupo al-quila ou arila), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, ondea fração de oxigênio carregado é alquilada. Oligonucleoti-deos que contêm diol, tal como tetraetilenoglicol ou hexae-tilenoglicol, e um ou ambos os terminais têm sido tambémmostrados como sendo substancialmente resistentes à degrada-ção por nuclease.

Em algumas modalidades, os oligonucleotideos podemser oligonucleotideos macios ou semi-macios. Um oligonucleo-tideo semi-macio é um oligonucleotideo imunoestimulante ten-do uma cadeia principal parcialmente estabilizada, onde asligações entre nucleotideos fosfodiéster ou similares a fos-fodiéster ocorrem somente dentro e imediatamente adjacentesa pelo menos um dinucleotideo pirimidina-purina interno(YZ). Preferencialmente, YS é YG, um dinucleotideo pirimidi-na-guanosina (YG) . 0 pelo menos um dinucleotideo interno YZtem, ele mesmo, uma ligação entre nucleotideos fosfodiésterou similar a fosfodiéster. Uma ligação entre nucleotideosfosfodiéster e similar a fosfodiéster que ocorre imediata-mente adjacente ao pelo menos um dinucleotideo interno YZpode ser 5', 3', ou ambos 5' e 3' , ao pelo menos um dinucle-otideo interno YZ.

Em particular, as ligações entre nucleotideos fos-fodiéster ou similar a fosfodiéster envolvem "dinucleotídeosinternos". Um dinucleotideo interno deve, em geral, signifi-car qualquer par de nucleotideos adjacentes conectados poruma ligação entre nucleotideos, na qual nenhum nucleotideono par de nucleotideos é um nucleotideo terminal, i.e., ne-nhum nucleotideo no par de nucleotideos é um nucleotideo quedefine a extremidade 5' ou 3' do oligonucleotideo. Assim, umoligonucleotideo linear que é de comprimento de η nucleoti-deos tem um total de n-1 nucleotideos e somente n-3 dinucle-otideos internos. Cada ligação entre nucleotideos em um di-nucleotideo interno é uma ligação entre nucleotideos inter-na. Assim, um oligonucleotideo linear que é de η nucleoti-deos tem um total de n-1 ligações entre nucleotideos e so-mente n-3 ligações entre nucleotideos. Portanto, as ligaçõescolocadas estrategicamente entre nucleotideos fosfodiésterou similares'a fosfodiéster referem-se a ligações entre nu-cleotideos fosfodiéster ou similares a fosfodiéster posicio-nadas entre qualquer par de nucleotideos na seqüência de o-ligonucleotideos. Em algumas modalidades, as ligações entrenucleotideos fosfodiéster ou similares a fosfodiéster nãosão posicionadas entre qualquer par de nucleotideos próximosà extremidade 5' ou 3'.

Preferivelmente, uma ligação entre nucleotideosfosfodiéster ou similar a fosfodiéster que ocorre imediata-mente adjacente ao pelo menos um dinucleotideo interno YZ é,ela mesma, uma ligação entre nucleotideos interna. Assim,para uma seqüência Ni YZ N2, em que Nx e N2 são, cada um, in-dependentemente do outro, qualquer nucleotideo simples, odinucleotideo YZ tem uma ligação entre nucleotideos fosfodi-éster ou similar a fosfodiéster, e, além disso, (a) Ni e Ysão ligados por uma ligação entre nucleotideos fosfodiésterou similar a fosfodiéster quando Ni é um nucleotideo inter-no, (b) Z e N2 são ligados por uma ligação entre nucleoti-deos fosfodiéster ou similar a fosfodiéster quando N2 é umnucleotideo interno, ou (c) Ni e Y são ligados por uma liga-ção entre nucleotideos fosfodiéster ou similar a fosfodiés-ter quando Ni é um nucleotideo interno e Z e N2 são ligadospor uma ligação entre nucleotideos fosfodiéster ou similar afosfodiéster, quando N2 é um nucleotideo interno.

Acredita-se que os oligonucleotídeos macios de acordo com a presente invenção sejam relativamente suscetí-veis à clivagem por nuclease em comparação com os oligonu-cleotídeos completamente estabilizados. Sem pretender estarligado a qualquer teoria ou mecanismo particular, acredita-se que oligonucleotideos macios da invenção sejam suscetí-veis à clivagem resultando em fragmentos com reduzida ou ne-nhuma atividade imunoestimulante com relação aos oligonucle-otideos macios inteiros. Acredita-se que a incorporação depelo menos uma ligação entre nucleotídeos sensíveis à nucle-ase, particularmente próxima ao meio do oligonucleotídeo,proporcione um "desligamento (switch off) " que altera afarmacocinética do oligonucleotídeo de modo a reduzir a du-ração da atividade imunoestimulante máxima do oligonucleotídeo.

Isso pode ser de particular valor em tecidos e em apli-cações clínicas, nas quais se deseja evitar lesões relacio-nadas à inflamação local crônica ou imunoestimulação, porexemplo, o rim.

Um oligonucleotídeo semi-macio é um oligonucleotí-deo imunoestimulante tendo uma cadeia principal parcialmenteestabilizada, na qual as ligações entre nucleotídeos fosfo-diéster ou similares a fosfodiéster ocorrem somente dentrode pelo menos um dinucloetídeo interno (YZ) pirimidina-purina.

Oligonucleotideos semi-macios possuem geralmente po-tência imunoestimulante aumentada com relação aos oligonu-cleotideos imunoestimulantes inteiramente estabilizados,correspondentes. Devido à potência maior dos oligonucleoti-deos semi-macios, os oligonucleotideos semi-macios podem serusados, em alguns casos, em concentrações mais baixas efica-zes e têm doses mais baixas eficazes que os oligonucleoti-deos imunoestimulantes inteiramente estabilizados convencio-nais de modo a obter um efeito biológico desejado.Acredita-se que as propriedades acima dos oligonu-cleotideos semi-macios aumentem geralmente com uma "dose"crescente de ligações entre nucleotideos fosfodiéster ou si-milares a fosfodiéster envolvendo os dinucleotideos internosYZ. Assim acredita-se que, por exemplo, em geral, para umadada seqüência de oligonucleotideos com quatro dinucleoti-deos internos YZ, um oligonucleotideo com quatro ligaçõesentre nucleotideos internos YZ de fosfodiéster ou similaresa fosfodiéster é mais imunoestimulante que um oligonucleoti-deo com três ligações entre nucleotideos internos YZ de fos-fodiéster ou similar a fosfodiéster, que, por sua vez, émais imunoestimulante que um oligonucleotideo com duas liga-ções entre nucleotideos internos YZ de fosfodiéster ou simi-lares a fosfodiéster, que, por sua, vez, é mais imunoestimu-lante que um oligonucleotideo com uma ligação entre nucleo-tideos internos de fosfodiéster ou similar a fosfodiéster.Importantemente, a inclusão de mesmo uma ligação entre nu-cleotideos internos de fosfodiéster ou similar a fosfodiés-ter pode ser freqüentemente não vantajosa em uma ligação en-tre nucleotideos internos YZ de fosfodiéster ou similar afosfodiéster. Além do número de ligações entre nucleotideosfosfodiéster ou similares a fosfodiéster, a posição ao longodo comprimento de oligonucleotideos pode afetar também a po-tência.

Os oligonucleotideos macios e semi-macios inclui-rão geralmente, além das ligações entre nucleotideos fosfo-diéster ou similares a fosfodiéster nas posições internaspreferidas, extremidades 5' e 3' que são resistentes à de-gradação. Tais extremidades resistentes à degradação podemenvolver qualquer modificação adequada que resulta em umaresistência aumentada contra digestão com exonuclease sobreextremidades não modificadas correspondentes. Por exemplo,as extremidades 5' e 3' podem ser estabilizadas pela inclu-são nelas de pelo menos uma modificação de fosfato de cadeiaprincipal. Em uma modalidade preferida, a pelo menos uma mo-dificação de fosfato da cadeia principal em cada extremidadeé independentemente uma ligação entre nucleotideos fosforo-tioato, fosforoditioato, metilfosfonato, ou metilfosforotio-ato. Em uma outra modalidade, a extremidade resistente à de-gradação inclui uma ou mais unidades de nucleotideo conecta-das por ligações peptidicas ou de amida na extremidade 3'.

Uma ligação entre nucleotideos fosfodiéster é otipo de ligação característica dos oligonucleotídeos encon-trados na natureza. A ligação entre nucleotideos fosfodiés-ter inclui um átomo de fósforo flanqueado por dois átomos deoxigênio ligados em ponte e ligados também por dois átomosde oxigênio adicionais, um carregado e o outro não carrega-do. A ligação entre nucleotideos fosfodiéster é particular-mente preferida quando ela é importante para reduzir a meia-vida tecidual do oligonucleotideo.

Uma ligação entre nucleotideos similar a fosfodi-éster é um grupo em ponte contendo um fósforo que é quimica-mente e/ou diastereomericamente similar ao fosfodiéster. Me-dições de similaridade a fosfodiéster incluem suscetibilida-de à digestão por nuclease e a capacidade de ativar RNase H.

Assim, por exemplo, oligonucleotídeos fosfodiéster, mas nãofosforotioato, são suscetíveis de digestão com nuclease, em-bora ambos os oligonucleotídeos fosfodiéster e fosforotioatoativam RNase H. Em uma modalidade preferida, a ligação entrenucleotídeos similar a fosfodiéster é ligação de boranofos-fato (ou de modo equivalente, boranofosfonato). As PatentesUS 5.177.198; US 5.859.231; Patente US 6.160.109; Patente US6.207.819; Sergueev et al. , (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. Em uma outra modalidade, a ligação entre nucleotídeossimilar a fosfodiéster é fosforotioato Rp diastereomerica-mente puro. Acredita-se que fosforotioato Rp diastereomeri-camente puro é mais suscetível à digestão com nuclease e émelhor na ativação de RNase H que fosforotioato Sp misto oudiastereomericamente puro. Estereoisômeros de oligonucleotí-deos CpG são ao assunto do Pedido publicado PCT/US99/17100(WO 00/06588) . É para ser observado que para os propósitosda presente invenção, o termo "ligação entre nucleotídeossimilar a fosfodiéster" exclui especificamente ligações en-tre nucleotídeos fosforoditioato e metilfosfonato.

Conforme descrição acima, os oligonucleotídeos ma-cios ou semi-macios da invenção podem ter ligações similaresa fosfodiéster entre CeG. Um exemplo de uma ligação simi-lar a fosfodiéster é uma ligação fosforotioato em uma con-formação Rp. A p-quiralidade do oligonucleotídeo por ter a-parentemente efeitos opostos na atividade imune de um oligo-nucleotídeo CpG, dependendo do ponto de tempo no qual a ati-vidade é medida (Krieg et al. , 2003, Oligonucleotides13 (6): 491-499). Em um ponto de tempo cedo de 40 minutos, oestereoisômero Rp, mas não o Sp de oligonucleotídeo fosforo-tioato CpG induz a fosforilação JNK em células de baço decamundongos. Em contraste, quando ensaiado em um ponto detempo 44 h mais tarde, o estereoisômero Sp, mas não o Rp éativo na estimulação de proliferação de células do baço. Es-sa diferença na cinética e bioatividade dos estereoisômerosRp e Sp não resulta de qualquer diferença na captura celu-lar, porém é preferivelmente mais provável devido aos doispapéis biológicos opostos da p-quiralidade. Em primeiro lu-gar, a atividade intensificada do estereoisômero Rp em com-paração com o Sp na estimulação de células imunes nos pontosde tempos cedo indica que o Rp pode ser mais eficaz na inte-ração com receptor de CpG, TLR9, ou induzir vias de sinali-zação a jusante. Por outro lado, a degradação mais rápidados oligonucleotideos Rp PS em comparação com o Sp resultaem uma duração de sinalização muito mais curta, de modo queos oligonucleotideos Sp PS parecem ser mais biologicamenteativos que os testados em pontos de tempo mais tarde.

Um efeito surpreendentemente forte é obtido pelap-quiralidade no próprio dinucleotideo CpG. Em comparaçãocom um oligonucleotideo CpG estéreo-randômico, o congênereno qual o dinucleotideo CpG simples era ligado no Rp eramais levemente ativo, embora o congênere contendo uma liga-ção Sp tenha sido quase inativo para induzir a proliferaçãode células do baço.

Assim, os oligonucleotideos podem ser heterogêneosna composição da cadeia principal, contendo, assim, qualquercombinação possível de unidades de polímeros ligadas juntas.

O termo "oligonucleotideo" engloba também oligonu-cleotídeos com substituições ou modificações, tais como nosaçúcares. Por exemplo, eles incluem oligonucleotideos tendoaçúcares de cadeia principal que são covalentemente ligadasa grupos orgânicos de baixo peso molecular em vez de um gru-po hidroxila na posição 2' e em vez de um grupo fosfato ougrupo hidróxi na posição 5'. Assim, oligonucleotideos modi-ficados podem incluir uma grupo de ribose 2'-O-alquilada.Além disso, os oligonucleotideos modificados podem incluiraçúcares tais como arabinose ou 2'-fluorarabinose em vez deribose.

Os oligonucleotideos imunoestimulantes da presenteinvenção podem englobar várias modificações e substituiçõesquímicas, em comparação com RNA e DNA naturais, envolvendouma ponte entre nucleotídeos fosfodiéster, ou uma unidade β-D-ribose. Exemplos de modificações químicas são conhecidosdaqueles versados na técnica e são descritos, por exemplo,por Uhlmann E. et al. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols forOligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties &Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, HumanaPress, Totowa, E.U.A. 1993; Crooke ST et al. , (1996) AnnuRev Pharmacol Toxicol 36:107-124; e Hunziker J et al. (1995)Mod Synth Methods 7:331-417. Um oligonucleotídeo, de acordocom a invenção, pode ter uma ou mais modificações, em quecada modificação está localizada em uma ponte entre nucleo-tídeos fosfodiéster particular e/ou em uma unidade β-D-ribose particular em comparação com um oligonucleotídeo damesma seqüência, que é composta de DNA ou RNA natural.

Por exemplo, a invenção refere-se a um oligonucle-otideo que pode compreender uma ou mais modificações e emque cada modificação é independentemente selecionada de:

a)a reposição de uma ponte entre nucleotideos fos-fodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleo-tideo por uma ponte entre nucleotideos modificada, e

b)a reposição da ponte de fosfodiéster localizadana extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotideo por uma ponte dedefosfo,

c)a reposição de um unidade de açúcar-fosfato dacadeia principal do açúcar-fosfato por uma outra unidade, e

d) a reposição de uma unidade β-D-ribose por umaunidade de açúcar modificada.

Exemplos mais detalhados para a modificação quími-ca de um oligonucleotídeo são como a seguir:

Uma ponte entre nucleotideos de fosfodiéster loca-lizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotideo pode serreposta por uma ponte entre nucleotideos modificada, em quea ponte entre nucleotideos modificada é, por exemplo, sele-cionada de pontes de fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, fosfonato de α-hidroxibenzila,éster de fosfato (Ci-C2i) -O-alquila, éster de fosfato-[ (aril (C6-Ci2) - (C1-C21) O-alquila] , fosfonato de alquila (Ci-C8) e/ou fosfonato de arila (Ci6-Ci2), (C7-Ci2)- _hidroximetil-arila (por exemplo, descrito em WO 95/01363),em que arila (C6-Ci2), arila (C6-C2o) e arila (C6-Ci4) são op-cionalmente substituídas por halogênio, alquila, alcóxi, ni-tro, ciano, e onde R1 e R2 são, independentemente um do ou-tro, hidrogênio, alquila (Ci-Cig) , arila (C6-C2o) , aril (C6-Ci4)-alquila (Ci-C8), preferivelmente hidrogênio, alquila(Ci-Cs) , preferivelmente alquila (Ci-C4) e/ou metoxietila, ouR1 e R2 formam, juntamente com o átomo de nitrogênio que ostransporta, um anel heterociclico de 5 a 6 membros, que podeconter adicionalmente um outro heteroátomo selecionado dogrupo 0, SeN.

A reposição de uma ponte de fosfodiéster localiza-da na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotideo por uma pontede desfosfo (pontes de desfosfo são descritas, por exemplo,por Uhlmann E e Peyman A em "Methods in Molecular BiologyVol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S .Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capitulo 16, pp.355 ff), em que uma ponte de desfosfo é, por exemplo, sele-cionada das pontes de desfosfo formacetal, 3'-tioformacetal,metilhidroxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimeti-lenossulfona. e/ou grupos silila.

A unidade de açúcar-fosfato (i.e. uma β-D-ribose eponte entre nucleotideos de fosfodiéster juntas formando umaunidade de açúcar-fosfato) da cadeia principal de açúcar-fosfato (i.e. cadeia principal de açúcar-fosfato é compostade unidades açúcar fosfato) pode ser reposta por uma outraunidade, em que a outra unidade é, por exemplo, adequada pa-ra construir um oligômero de "derivado de morfolino" (con-forme descrição, por exemplo, de Stirchak EP et al. (1989)Oligonucleotides Res 17:6129-41), que é, por exemplo, a re-posição por uma unidade de derivado de morfolino; ou paraconstruir um oligonucleotideo de poliamida ("PNA"; conformedescrito, por exemplo, por Nielsen PE et al. (1994), que é,por exemplo, a reposição por uma unidade da cadeia principalde PNA, por exemplo, por 2-aminoetilglicina.

Uma unidade β-ribose ou uma unidade β-Ό-2'-desoxirribose pode ser reposta por uma unidade de açúcar mo-dificada, em que a unidade de açúcar modificada é, por exem-plo, selecionada de β-D-ribose, a-D-2'-desoxirribose, L-2'-desoxirribose, 2'-F-2'-desoxirribose, 2'-F-arabinose, 2'-0-alquil (Ci-C6)-ribose, preferivelmente 2'-0-alquil (Ci-C6)-ribose é 2'-O-metilribose, 2'-O-alquenil (C2-C6)-ribose, 2'-[O-alquil (Ci-C6) -O-alquil (C1-C6) ]-ribose, 2'-NH2-2'-desoxirribose, β-D-xilo-furanose, α-arabinofuranose, 2,4-didesóxi-p-D-eritro-hexo-piranose, e carbociclicos (descri-tos, por exemplo, por Froehler J (1992) Am Chem Soc114:8320) e/ou análogos de açúcar de cadeia aberta (descri-tos, por exemplo, por Vandendriessche et al. (1993) Tetrahe-dron 49:7223) e/ou análogos de bicicloaçúcares (descritos,por exemplo, por Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta76: 481).

Em algumas modalidades, o açúcar é 2'-0-metilribose, particularmente para um ou ambos os nucleotí-deos ligados por uma ligação entre nucleotideos de fosfodi-éster ou similar a fosfodiéster.

Em seqüências particulares descritas aqui, é defi-nido um conjunto de bases modificadas. Por exemplo, a letraY é usada com referência a um nucleotideo contendo uma cito-sina ou uma citosina modificada. Uma citosina modificada,como usada aqui, é um análogo de base pirimidinica, que o-corre tanto naturalmente como não naturalmente, de citosina,que pode repor esta base sem comprometer a atividade imuno-estimulante do oligonucleotideo. Cistinas modificadas inclu-em, mas sem limitação, citosinas 5-substituídas (por exem-plo, 5-metil-citosina, 5-flúor-citosina, 5-cloro-citosina,5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluormetil-citosina, e 5-alquinil-citosina não substituída ou 5-substituida), citosi-nas 6-substituídas, citosinas N4-substituídas (por exemplo,N4-etil-citosina) , 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, iso-citosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sis-temas de anéis condensados (por exemplo, N,N'-propileno ci-tosina ou fenoxazina) , e uracila e seus derivados (por exem-plo, 5-flúor-uracila, 5-bromo-uracila, 5-bromovinil-uracila,4-tio-uracila, 5-hidróxi-uracila, 5-propinil-uracila). Algu-mas das citosinas preferidas incluem 5-metil-citosina, 5-flúor-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina,e N4-etil-citosina. Em uma outra modalidade da invenção, abase citosina é substituída por uma base universal (por e-xemplo, 3-nitropirrol, P-base), um sistema de anéis aromáti-cos (por exemplo, fluorbenzeno ou difluorbenzeno) ou um áto-mo de hidrogênio (dSpacer).

A letra Z é usada com referência à guanina ou umabase de guanina modificada. Uma guanina modificada como usa-da aqui é um análogo de base purina, que ocorre naturalmenteou não naturalmente, de guanina, que pode repor esta basesem comprometer a atividade imunoestimulante do oligonucleo-tideo. Guaninas modificadas incluem, mas sem limitação, 7-desazaguanina, 7-desaza-guanina 7-substituída (tal como 7-desaza-7-alquinil (C2-C6) guanina) , 7-desaza-guanina 8-substituída, hipoxantina, guaninas N2 substituídas (por e-xemplo, N2-metil-guanina) , 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidina-2, 7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas substituídas(por exemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina), guanina 8-substituída (por exemplo, 8-hidroxiguanina e 8-bromoguanina), e 6-tioguanina. Em uma outra modalidade dainvenção, a base guanina é substituída por uma base univer-sal (por exemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol, e K-base),um sistema de anéis aromáticos (por exemplo, benzimidazol oudicloro-benzimidazol, amida do ácido 1-metil-lH-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) ou um átomo de hidrogênio (dS-pacer).

Os oligonucleotídeos podem ter uma ou mais extre-midades 5' acessíveis. É possível criar oligonucleotídeosmodificados tendo duas de tais extremidades 5' . Isso podeser obtido, por exemplo, por ligação de dois oligonucleotí-deos através de uma ligação 3'-3' para gerar um oligonucleo-tídeo tendo uma ou duas extremidades 5' acessíveis. A liga-ção 3'3' pode ser um fosfodiéster, um fosforotioato ou qual-quer outra ponte entre nucleotídeos modificada. Métodos paraobtenção de tais ligações são conhecidos da técnica. Por e-xemplo, tais ligações têm sido descritas por Seliger, H., etal., Oligonucleotides analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotides linkages as antisense inhibitors of vi-ral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1—3), 469-77 e Jiang et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Che-mistry (1999), 7(12), 2727-2735.

Adicionalmente, os oligonucleotideos ligados em3'3', onde a ligação entre os nucleotideos de terminal 3'não é fosfodiéster, fosforotioato ou outra ponte modificada,podem ser preparados usando um espaçador adicional, tais co-mo uma fração fosfato de tri- ou tetra-etilenoglicol (Du-rand, M. et al. , Triple-helix formation by an oligonucleoti-de containing one (Da) 12 and two (dT) 12 sequences bridged bytwo hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38),9197-204, Patente US 5.658.738, e Patente US 5.668.265). Al-ternativamente, o ligante não nucleotidico pode ser derivadode etanodiol, propanodiol, ou de uma desoxirribose abásica(dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recog-nition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moie-ties 5'-attached to oligonucleotides; Oligonucleotides Rese-arch (1994), 22(11), 2022-7) usando química padrão de fosfo-amidita. Os ligantes não nucleotídicos podem ser incorpora-dos uma vez ou múltiplas vezes, ou combinados um com ou ou-tro, permitindo qualquer distância desejável entre as extre-midades 3' dos dois ODNs a serem ligados.

Os oligonucleotideos são parcialmente resistentesà degradação (por exemplo, são estabilizados). Uma "moléculade oligonucleotídeo estabilizada" deve significar um oligo-nucleotideo que é relativamente resistente à degradação invivo (por exemplo, via uma exo- ou endonuclease) . A estabi-lização dos oligonucleotideos pode ser obtida via modifica-ções na cadeia principal. Os oligonucleotideos tendo liga-ções de fosforotioato proporcionam atividade máxima, e pro-tegem o oligonucleotideo da degradação por exo- e endonucle-ases intracelulares. Outros oligonucleotideos modificadosincluem oligonucleotideos modificados fosfodiéster, combina-ções de oligonucleotideo fosfodiéster e fosforotioato, me-tilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditionato, p-etóxi,e combinações destes. Os oligonucleotideos que contêm diol,tais como tetraetilenoglicol ou hexaetilenoglicol, em uma ouambas as terminações têm mostrado serem substancialmente re-sistentes à degradação por nuclease.

Os oligonucleotideos imunoestimulantes podem con-ter também uma ou mais ligações incomuns entre o nucleotideoou frações análogas ao nucleotideo. A ligação entre nucleo-tideos usuais é uma ligação 3'5' . Todas as outras ligaçõessão consideradas como ligações entre nucleotideos não usu-ais, tais como ligações 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'~, 2'3'. Anomenclatura 2' a 5' é escolhida de acordo com o átomo decarbono da ribose. Contudo, se as frações de açúcar não na-turais são empregadas, tais como análogos de açúcar expandi-das com anel (por exemplo, hexanose, cicloexeno ou piranose)ou análogos de açúcar bi- ou triciclicos, então essa nomen-clatura altera de acordo com a nomenclatura do monômero. Nosanálogos de 3'-desóxi-p-D-ribopiranose (também chamados p-DNA) , os mononucleotideos são, por exemplo, conectados viauma ligação 4'2'.

Se o oligonucleotideo contém uma ligação 3'3', en-tão este oligonucleotideo pode ter duas extremidades 5' nãoligadas. Similarmente, se o oligonucleotideo contém uma li-gação 5'5', então este oligonucleotídeo pode ter duas extre-midades 3'. A acessibilidade das extremidades não ligadas denucleotideos pode ser mais bem acessível por seus recepto-res. Ambos os tipos de ligações incomuns (3'3'- e 5'5') fo-ram descritos por Ramalho Ortigao et al. (Antisense Researchand Development (1992) 2, 129-46), por meio de que foi re-portado que os oligonucleotídeos tendo uma ligação 3'3' mos-tram estabilidade na clivagem por nucleases.

Diferentes tipos de ligações podem ser também com-binados em uma molécula que pode levar à ramificação do oli-gômero. Se uma parte do oligonucleotídeo é conectada na ex-tremidade 3' via uma ligação 3'3' para uma segunda parte dooligonucleotídeo e na extremidade 2' via uma ligação 2'3'para uma terceira parte da molécula, isso resulta, por exem-plo, em um oligonucleotídeo ramificado com três extremidades5' (3'3'-, 2'3'-ramificado).

<formula>formula see original document page 72</formula>X é, por exemplo:

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X é, por exemplo:

<formula>formula see original document page 73</formula>Y é, por exemplo:

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IV. Terapia de Combinação com ODN PF3512676 e An-ticorpo anti-CTLA-4

A presente invenção refere-se à terapia de combi-nação que compreende co-administrar CpG ODN PF3512676 e umanticorpo anti-CTLA-4, preferivelmente, um anticorpo quecompreende uma porção de ligação de antigeno do anticorpo4.1.1, 4.13.1, e 11.2.1, IODl (MDX-010), entre outros. Emuma modalidade, uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e umCpG ODN PF3512676 é co-administrada a um paciente para tra-tar câncer.

Tipos de Câncer

A combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e CpG ODNPF3512676 é útil para o tratamento de cânceres primários esecundários (i.e. metastáticos). Mais especificamente, entremuitas opções de tratamentos potenciais, a terapia de combi-nação de anticorpo anti-CTLA-4 e CpG ODN PF3512676 pode serusada para tratar, entre outros, carcinoma de células re-nais, câncer da mama, câncer colorretal, câncer ovariano,câncer do pulmão de não pequena célula, melanoma, linfoma decélula T cutâneo, e NHL (inclusive indolente e agressivo).Embora esses cânceres sejam preferidos, a presente invençãorefere-se ao tratamento de uma ampla variedade de distúrbiosproliferativos de células malignas, incluindo, mas sem limi-tação, carcinomas e sarcomas. Outros exemplos incluem sarco-ma de Kaposi, sarcoma sinovial, eritroblastoma, mesotelioma,hepatobiliar (duto hepático e duto biliar), um tumor cere-bral primário ou secundário, câncer do pulmão (NSCLC eSCLC), câncer ósseo, câncer de pele, câncer da cabeça e dopescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocülar, cânceres ósseos,câncer da região anal, câncer do estômago, câncer gastrin-testinal (gástrico, colorretal, e duodenal), cânceres do có-lon, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, car-cinoma do endométrio, carcinoma de cérvice, carcinoma da va-gina, carcinoma de vulva, Doença de Hodgkin, câncer do esô-fago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endó-crino, câncer da glândula da tireóide, câncer da glândulaparatireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma do tecidoliso, câncer de uretra, cânceres da próstata, câncer do pê-nis, câncer testicular, leucemia mielóide crônica ou aguda,leucemia linfocitica crônica ou aguda, linfomas linfociti-cos, câncer da bexiga, câncer do rim ou do ureter, carcinomada pelve renal, cânceres pancreáticos, neoplasmas do sistemanervoso central (SNC), incluindo tumor do SNC primário e se-cundário, linfoma do SNC primário, tumores do eixo espinal,glioma do tronco cerebral, gliobastoma, meningioma, mioblas-toma, astrocitoma, adenoma pituitário, câncer adrenocorti-cal, câncer da vesicula biliar, mieloma múltiplo, colangio-carcinoma, fibrossarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, ouuma combinação de um ou mais dos seguintes cânceres.

Os cânceres a serem tratados podem ser cânceresrefratários. Um câncer refratário, como usado aqui, é umcâncer que é resistente ao padrão ordinário de tratamentoprescrito. Esses cânceres podem parecer inicialmente respon-sivos a um tratamento (e então há recorrência), ou eles po-dem ser completamente não responsivos ao tratamento. 0 pa-drão ordinário de tratamento variará dependendo do tipo decâncer, e o grau de progressão no paciente. Ele pode ser umaquimioterapia, uma imunoterapia, cirurgia, ou radiação, ouuma combinação destas. Aqueles com conhecimento ordinário datécnica estão cientes de tais padrões de tratamento. Portan-to, os pacientes que estão sendo tratados, de acordo com ainvenção, de um câncer refratário podem já ter sido expostosa um outro tratamento para seu câncer. Alternativamente, seo câncer tem a probabilidade de ser refratário (por exemplo,em vista de uma análise das células cancerosas ou do histó-rico do paciente), então o paciente pode já não ter sido ex-posto a um outro tratamento.

Exemplos de cânceres refratários incluem, mas semlimitação, leucemias, melanomas, carcinomas de células re-nais, câncer do cólon, cânceres do figado (hepáticos), cân-cer pancreático, linfoma de Não-Hodgkin, e câncer do pulmão.

Tipo de Terapia

Aquele versado na técnica apreciaria, uma vez pro-vidos os ensinamentos descritos aqui, que a invenção englobaa terapia de CpG ODN combinada com um anticorpo anti-CTLA-4com, ou seqüencialmente (precedente ou seguinte) cirurgia,radioterapia, ou ambos, para tratar câncer. Ou seja, váriostratamentos podem ser combinados com a terapia de combinaçãode anticorpo anti-CTLA-4-CpG ODN PF3512676, como seria en-tendido por aquele versado na técnica uma vez de posse dosensinamentos propiciados aqui.

Os métodos da invenção, em certos casos, podem serúteis para reposição dos procedimentos cirúrgicos ou terapi-as com fármacos existentes, embora, em alguns casos, a pre-sente invenção seja útil para aperfeiçoar a eficácia das te-rapias existentes para tratar tais condições. Por conseguin-te, a terapia de combinação pode ser usada para tratar ospacientes que estão se submetendo ou que se submeterão a umtratamento para, entre outros, câncer. Por exemplo, os agen-tes podem ser administrados a um paciente em combinação comuma outra terapia antiproliferativa (por exemplo, anticân-cer). Terapias anticâncer adequadas incluem tratamentos ci-rúrgicos para remover a massa tumoral, quimioterapia ou ra-diação localizada. A outra terapia antiproliferativa podeser administrada antes, concorrente com, ou depois do trata-mento com a combinação de CpG ODN PF3512676/anticorpo anti-CTLA-4 da invenção. Pode também haver uma demora de váriashoras, dias e em algumas situações semanas entre a adminis-tração dos diferentes tratamentos, de modo que a combinaçãode CpG ODN PF3512676/anticorpo anti-CTLA-4 pode ser adminis-trada antes ou depois do outro tratamento. A invenção con-templa ainda o uso da combinação de CpG ODNPF3512676/anticorpo anti-CTLA-4 em pacientes com câncer an-tes ou seguinte à cirurgia, radiação ou quimioterapia.

Assim, a invenção engloba o uso de um anticorpoanti-CTLA-4 com CpG ODN PF3512 67 6 como um tratamento neoad-juvante, adjuvante, de primeira linha, terapia de segundalinha e/ou de terceira linha, na indução de remissão ou ma-nutenção da terapia para câncer. Ou seja, em uma modalidade,a combinação de anticorpo-CpG ODN PF3512676 pode ser co-administrada como uma terapia neoadjuvante antes de, por e-xemplo, a ressecção cirúrgica de um tumor (por exemplo, cân-cer da próstata, da mama e do pulmão) . Em uma outra modali-dade, a combinação de anticorpo-CpG ODN PF3512676 pode seradministrada tanto como uma terapia neoadjuvante (i.e. antesda cirurgia) e também seguinte à cirurgia como uma terapiaadjuvante. A combinação pode ser usada como um tratamento deprimeira linha em vez de um outro agente (por exemplo, in-terferon alfa).

Os métodos e composições da invenção são úteis nãosomente para pacientes não tratados, mas também para o tra-tamento de pacientes parcial ou completamente não responsi-vos a outras terapias anticâncer, tal como, mas sem limita-ção, CpG ODN PF3512676 administrado sozinho (ou em combina-ção com uma outro agente anticâncer) ou anticorpo anti-CTLA-4 administrado sozinho (ou em combinação com um outro agenteanticâncer). Em várias modalidades, a invenção proporcionamétodos e composições úteis para o tratamento de doenças oudistúrbios em pacientes que mostraram ser ou poderem ser re-fratários ou não responsivos a terapias, compreendendo a ad-ministração de ou um ou ambos de anticorpo anti-CTLA-4 e/ouCpG ODN PF3512676, e em que o tratamento é aperfeiçoado poruma imunorresposta intensificada. Em uma modalidade, o méto-do compreende combinar um CpG ODN PF3512676 e um anticorpoanti-CTLA-4 (preferivelmente, um anticorpo 4.1.1, anticorpo4.13.1, anticorpo 11.2.1, anticorpo MDX-010, ou qualquercombinação destes).

Assim, por exemplo, a combinação pode ser usadapara tratar carcinoma de células renais metastáticas comouma terapia de segunda linha em pacientes refratários à ci-tocina, como uma terapia de segunda linha em NHL indolenteem combinação também com rituximabe, e como uma terapia desegunda linha em CHOP-R (ciclofosfamida, doxorrubicina, vin-cristina, e prednisona, com rituximabe) em NHL agressivo,entre muitos outros. As combinações dessas terapias, onde acombinação de anticorpo anti-CTLA-4-CpG ODN PF3512676 é co-administrada, são também englobadas pela presente invenção,tais como, mas sem limitação, quando a combinação é usadapara terapia neoadjuvante, adjuvante, de primeira linha, desegunda linha, e de terceira linha, ou qualquer combinaçãodestas.

CpG ODN PF3512 67 6 pode ser usado juntamente com umanticorpo anti-CTLA-4 (como descrito acima) para indução porremissão, seguida por CpG ODN PF3512676 sozinho para terapiade manutenção. Assim, a terapia por indução de remissão poderequerer um ou mais ciclos repetidos de combinação de tera-pia de CpG ODN PF3512676/anticorpo anti-CTLA-4. Contudo, umavez que remissão é observada (como será aparente para um mé-dico), ο paciente pode ser colocado na terapia de manuten-ção. Tal terapia de manutenção pode envolver monoterapia comCpG ODN PF3512676. Com a finalidade da terapia de manuten-ção, CpG ODN PF3512676 pode ser administrada uma vez ou duasvezes semanalmente ou bi-semanalmente, preferivelmente sub-cutaneamente.

Embora a presente invenção seja exemplificada pormétodos relativos à terapia adjuvante, de primeira linha, desegunda linha e/ou de terceira linha compreendendo adminis-trar uma combinação que compreende a co-administração de umCpG ODN PF3512676 e um anticorpo anti-CTLA-4, o versado natécnica, de posse dos ensinamentos proporcionados aqui, de-veria entender que a invenção não está limitada a qualquerterapia particular. Preferivelmente, os métodos compreenden-do a terapia combinada de CpG ODN PF3512676 e anticorpo an-ti-CTLA-4 englobam o uso da combinação ao longo da doençainteira e continuação do tratamento. Mais especificamente,os novos métodos descritos aqui podem proporcionar um bene-ficio terapêutico antes e depois da metástase, bem como parapacientes que tenham se tornado refratários a um agente qui-mioterapêutico, em que o anticorpo pode intensificar uma i-munorresposta, incluindo qualquer resposta mediada por tera-pia, bem como qualquer resposta mediada por CpG ODNPF3512 676.

Assim, a presente invenção não é limitada ao usodas combinações da invenção somente para terapia neoadjuvan-te; em vez disso, a invenção inclui o espectro do tratamentointeiro, incluindo, mas sem limitação, terapia adjuvante, deprimeira linha, de segunda linha e/ou terceira linha paracâncer. Isso é porque os dados descritos aqui sugerem que aimunoterapia compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 podeproporcionar um beneficio terapêutico ou sozinho ou combina-do com pelo menos um agente adicional, em qualquer ponto du-rante o tratamento. Ou seja, a eficácia de um método que me-deia a liberação de antigenos específicos de tumor, tais co-mo terapias citotóxicas (por exemplo, radiação, substânciasquimioterapêuticas, e similares), onde tais antigenos sãoexpostos ao sistema imunológico, pode ser intensificada poradministração de um anticorpo anti-CTLA-4 da invenção. Cer-tamente, os dados referidos aqui sugerem ainda que um efeitosinergístico seja mediado por administração combinada do an-ticorpo com CpG ODN PF3512676 para tratamento, mais particu-larmente, cânceres da próstata, da mama, CRC, melanoma, pan-creáticos, pulmonares, NSCLC, NHL, RCC, entre outros. Por-tanto, a presente invenção proporciona novas substâncias te-rapêuticas importantes para o tratamento de câncer, pelo queo sistema imunológico do paciente é intensificado para pro-porcionar um efeito antitumoral.

Em uma outra modalidade, a combinação de CpG ODNPF3512676 e um anticorpo anti-CTLA-4 é co-administrada paraintensificar e/ou prolongar uma imunorresposta a um tumor.Isso é porque pode haver uma interação entre o efeito anti-tumoral de CpG ODN PF3512676 como, entre outros, um agonistae o bloqueio mediado por anticorpo anti-CTLA-4 de sinaliza-dor de CTLA-4/B7 da invenção que leva ao efeito antitumoralmais eficaz que um agente sozinho. Assim, sem desejar estarligado a qualquer teoria particular, a combinação de CpG ODNPF3512676 e anticorpo anti-CTLA-4 pode induzir uma respostaimunológica mais robusta dentro do esperado. Sem desejar es-tar ligado a qualquer teoria particular, a liberação do(s)antígeno(s) tumorais mediados pelos efeitos antitumorais deCpG ODN PF3512676 mediados por, por exemplo, a ativação delinfócitos B e função aperfeiçoada das células apresentado-res de antigenos (por exemplo, DCs) e outros efeitos inten-sificadores imunes mediados por ativação de TLR9, pode au-mentar o efeito imunoterapêutico de um anti-CTLA-4, incluin-do reduzir ou romper a tolerância imunológica a tais antige-nos. Isso é provável em que o bloqueio de CTLA-4 usando umanticorpo e imunoativação por CpG ODN PF3512676 demonstraramromper tolerância (por exemplo, reverter ou prevenir energiaou tolerização aos antigenos tumorais), tornando, assim, ascélulas tumorais mais suscetíveis de ataque imune. Inversa-mente, os efeitos inibidores de células T reguladoras (Treg)que dependem em parte do CTLA-4 podem limitar a eficácia daimunoterapia com CpG, de modo que o bloqueio desses efeitoscom um anti-CTLA-4 Ab deve aperfeiçoar a eficácia do CpG.Portanto, a combinação de CpG ODN PF3512676 com um anticorpoanti-CTLA-4 pode proporcionar um aditivo potencial ou efeitosinergistico, proporcionando, assim, um novo tratamento te-rapêutico para câncer.

Em uma modalidade, a invenção proporciona composi-ções e métodos para produzir ou aumentar um resposta antitu-moral usando uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4-CpG ODNPF3512676, em que o CpG ODN PF3512676 intensifica um respos-ta antitumoral de uma quantidade de anticorpo que é, de ou-tro modo, sub-ótima para induzir o mesmo nível de respostaantitumoral, quando usado sozinho. Em certas modalidades,quando o CpG ODN PF3512 67 6 não é usado em conjunção com umanticorpo para elicitar uma resposta antitumoral, adminis-tração de CpG ODN PF3512676 sozinho não produz nem aumenta aresposta antitumoral. Em modalidades alternativas, ambos oCpG ODN PF3512676 e o anticorpo anti-CTLA-4 podem elicitarum resposta antitumoral sozinhos e/ou quando administradosem combinação.

Em certas modalidades, o CpG ODN PF3512676 podeintensificar os efeitos do anticorpo anti-CTLA-4 (ou vice-versa) em um modo aditivo. Em uma modalidade preferida, oCpG ODN PF3512676 intensifica os efeitos do anticorpo anti-CTLA-4 (ou vice-versa) em um modo sinergistico. Em uma outramodalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 intensifica o efeito deCpG ODN PF3512676 em um modo aditivo. Preferivelmente, osefeitos são intensificados em um modo sinergistico. Assim,em certas modalidades, a invenção engloba métodos de trata-mento ou prevenção de doenças que proporcionam melhores per-fis terapêuticos que a administração de CpG ODN PF3512676sozinho e anticorpo anti-CTLA-4 sozinho.

Englobadas pela invenção são terapias de combina-ção que têm potência aditiva ou um efeito terapêutico aditi-vo, e ao mesmo tempo reduzem ou evitam efeitos não desejadosou adversos. A invenção também engloba combinações sinergis-ticas, onde a eficácia terapêutica é maior que a aditiva,enquanto os efeitos não desejados ou adversos são reduzidosou evitados. Em certas modalidades, os métodos da invençãopermitem tratamento ou prevenção de doenças e distúrbios, emque o tratamento é aperfeiçoado por uma reposta antitumoralintensificada usando doses mais baixas e/ou menos freqüentesde anticorpo anti-CTLA-4 e/ou CpG ODN PF3512676 para reduzira incidência de efeitos indesejados ou adversos causados pe-la administração de anticorpo anti-CTLA-4 e/ou CpG ODNPF3512676 sozinha, enquanto mantém ou intensifica a eficáciade tratamento, preferivelmente aumentando a complacência dopaciente, aperfeiçoando a terapia e/ou reduzindo efeitos nãodesejados ou adversos.

V. Terapia de combinação adicional

Com base na exposição proporcionada aqui, incluin-do o efeito imunointensificador de administrar um anticorpoanti-CTLA-4 a um paciente, e o aditivo combinado ou efeitosinergistico de co-administrar tal anticorpo em combinaçãocom CpG ODN PF3512676, seria apreciado por aquele versado natécnica que a invenção engloba inúmeras terapias de combina-ção, em que o anticorpo-CpG ODN PF3512676 é administrado aopaciente em combinação com pelo menos um outro agente tera-pêutico, proporcionando, assim, um beneficio terapêutico.

Embora muitas de tais combinações tornar-se-ão prontamenteaparentes para um versado na técnica uma vez de posse dosensinamentos providos aqui, várias combinações são agoradiscutidas. Contudo, a presente invenção não é de modo ne-nhum limitada a essas combinações, que são estabelecidas a-qui meramente para fins ilustrativos.

Co-administração do anticorpo-CpG ODN PF3512676com um agente terapêutico adicional (terapia de combinação)engloba co-administrar ambos os anticorpo anti-CTLA-4, CpGODN PF3512676, e um ou mais agentes terapêuticos adicionais,e também engloba co-administra duas ou mais composições far-macêuticas separadas, uma compreendendo o anticorpo anti-CTLA-4 e a (s) outra(s) compreendendo o CpG ODN PF3512676, eoutra(s) compreendendo pelo menos um agente terapêutico adi-cional. Ainda, embora a co-administração ou terapia de com-binação (conjunção) signifique geralmente que o anticorpo,CpG ODN PF3512676, e agentes terapêuticos adicionais são ad-ministrados ao mesmo tempo como um e o outro, ela também en-globa dosagem simultânea, seqüencial ou separada dos compo-nentes individuais do tratamento. Adicionalmente, quando umanticorpo é administrado intravenosamente e o agente anti-câncer é administrado oralmente (por exemplo, agente quimio-terapêutico), ou por injeção subcutânea ou intramuscular, épara ser entendido que a combinação é, preferivelmente, ad-ministrada como duas, três, ou mais composições farmacêuti-cas separadas.

Quando um mamífero é submetido à quimioterapia a-dicional, agentes quimioterapêuticos bem conhecidos da téc-nica podem ser usados em combinação com um anti-CTLA-4 e CpGODN PF3512676. Adicionalmente, inibidores de fator de cres-cimento, modificadores de resposta biológica, agentes alqui-lantes, antibióticos intercaladores, alcalóides da vinca,modulares receptores de estrogênio seletivos (SERMs), inibi-dores de angiogênese, entre muitos agentes terapêuticos, al-guns dos quais são descritos abaixo, podem ser usados.Inibidores de angiogênese

O uso de um inibidor de angiogênese em combinaçãocom um anticorpo anti-CTLA-4 foi previamente discutido emalgum lugar aqui. Além disso, um inibidor de angiogênese in-clui, mas sem limitação, bevacizumabe (AVASTIN; Genentech),um anticorpo humanizado para VEGF. Ele pode ser usado emcombinação com 5FU, e é indicado como tratamento de primeiralinha de pacientes com carcinoma metastático do cólon ou re-to. Os agentes que diretamente alvejam fatores angiogênicosou seus receptores oferecem o prospecto para maior atividadeem malignidades hematológicas competentes de receptores porinterrupção da sinalização de receptor autócrino. Bevacizu-mabe produz neutralização constante de VEGF circulante e po-de ser útil por tratamento de sindrome mielodisplásica(MDS), linfoma, leucemia mielóide aguda (AML), e tumores só-lidos. Receptores tirosina quinases (RTKIs), incluindoPTK787/ZK222584 (Novartis), estão sendo avaliados para tra-tar AML e outras malignidades hematológicas competentes dereceptor. A invenção também inclui o tratamento de câncer,por exemplo, carcinoma renal, câncer da mama, linfoma deNão-Hodgkin, carcinoma colorretal, e similares, usando umacombinação de um anticorpo anti-CTLA-4 e CpG ODN PF3512676,e pelo menos um inibidor de angiogênese adicional, pois taisinibidores são bem conhecidos na técnica ou podem ser desen-volvidos no futuro.

Assim, agentes antiangiogênese, tais como inibido-res da MMP-2 (matriz-metaloproteinase 2), inibidores de MMP-9 (matriz-metaloproteinase 9) , e inibidores da COX-II (ci-clooxigenase II), podem ser usados em conjunto com a combi-nação de anticorpo-CpG ODN PF3512676 da invenção. Exemplosde inibidores da COX-II incluem CELEBREX™ (celecoxibe),valdecoxibe, rofecoxibe, parecoxibe, deracoxibe, SD-8381,ABT-963, etoricoxibe, lumiracoxibe, BMS-347070, NS-398, RS57067, meloxicam. Exemplos de inibidores de matriz metalo-proteinase úteis são descritos nas Publicações dos Pedidosde Patente Internacional WO 96/33172; WO 96/27583; WO98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO98/33768, WO 98/30566, WO 90/05719, WO 99/52910, WO99/52889, WO 99/29667, Pedidos de Patente EP 780386 (publi-cado em 25 de junho de 1997), EP 97304971.1 (depositado em 8de julho de 1997), EP 99308617.2 (depositado em 29 de outu-bro de 1999), EP 606046 (publicado em 13 de julho de 1994),EP 931788 (publicado em 28 de julho de 1999), EP 99302232.1(depositado em 25 de março de 1999), Pedido de Patente In-ternacional PCT/IB98/01113 (depositado em 21 de julho de1998), Pedido de Patente GB 9912961.1 (depositado em 3 dejunho de 1999), Pedido de Patente Provisório US 60/148.464(depositado em 12 de agosto de 1999) e Patentes US 5.863.949e US 5.861.510.

Inibidores de MMP-2 e MMP-9 preferidos são aquelesque têm pouca ou nenhuma atividade inibidora de MMP-I. Maispreferidos são aqueles que inibem seletivamente MMP-2 e/ouMMP-9 com relação às outras matriz-metaloproteinases (i.e.MMP-I, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10,MMP-11, MMP-12, e MMP-13).

Inibidor de Transduçâo de SinalOs tratamentos descritos aqui podem também ser u-sados com inibidores de transdução de sinal tais como agen-tes que podem inibir respostas de EGFR (receptor de fator decrescimento epidérmico), tais como anticorpos EGFR, anticor-pos EGF, e moléculas que são inibidoras de EGFR; inibidoresde VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), tais co-mo receptores de VEGF e moléculas que inibem VEGF; e inibi-dores de receptores de erbB2, tais como moléculas orgânicasque se ligam ao receptor de erbB2, por exemplo, HERCEPTIN(Genentech, Inc., San Francisco, CA).

Inibidores de EGFR são descritos, por exemplo, nasPublicações de Pedidos de Patente Internacional WO 95/19970,WO 98/14451, WO 98/02434, e Patente US 5.747.498, e taissubstâncias podem ser usadas na presente invenção conformedescrição aqui. Agentes inibidores de EGFR incluem, mas semlimitação, os anticorpos monoclonais C225, anti-EGFR 22Mab(ImClone Systems Inc., Nova Iorque, NI), e ABX-EGF (AbgenixInc., Remont, CA), os compostos ZD-1839 (AstraZeneca), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), MDX-447 (Medarex, Inc., Annan-dale, NJ), e OLX-103 (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ),VRCTC-310 (Ventech Research) e toxina de fusão EGF (SeragenInc., Hopkinton, MA). Esses e outros inibidores de EGFR po-dem ser usados na presente invenção.

Os compostos direcionados na inibição do receptorde fator de crescimento epidérmico (EGFR)-tirosina quinase(TK), representam uma classe relativamente nova de fármacosque é útil no método da presente invenção. Muitos câncereshumanos expressam a família de EGFR na superfície da célula.Quando um ligante se liga ao EGFR, ele desencadeia uma cas-cata de reações celulares que resultam em divisão celularaumentada e influenciam outros aspectos do desenvolvimento eprogressão do câncer, incluindo angiogênese, difusão metas-tática e inibição da apoptose. Inibidores de EGFR-TK podemalvejar seletivamente um dos membros da família de EGFR(EGFR (também conhecido como HERl ou ErbB-1), HER2/neu (tam-bém conhecido como ErbB-2), HER3 (também conhecido comoErbB-3), ou HER4 (também conhecido como ErbB4)), ou podemalvejar dois ou mais deles. Inibidores de EGFR-TK adequadospara uso na presente invenção incluem gefitinibe (IRESSA),erlotinibe (TARCEVA) , CI-1033 (Pfizer), GW2016 (GlaxoSmith-Kline), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), CP-724,714(Pfizer), e BIBX-1382 (Boeringer-Ingelheim). Inibidores deEGFR-TK adicionais são descritos no Pedido de Patente US09/883.752, depositado em 18 de junho de 2001.

Inibidores de VEGF, além do SU11248 (Sugen Inc.,San Francisco, CA), podem ser também empregados em combina-ção com a combinação de anticorpo e CpG ODN PF3512676. Ini-bidores de VEGF são descritos, por exemplo, no Pedido de Pa-tente Internacional PCT/IB99/00797 (depositado em 3 de maiode 1999), Publicações de Pedidos de Patente Internacional WO99/24440; WO 95/21613; WO 99/61422; WO 98/50356; WO99/10349; WO 97/32856; WO 97/22596; WO 98/54093; WO98/02438; WO 99/16755; WO 98/02437; Patentes UDD 5.834.504;US 5.883.113; US 5.886.020; e US 5.792.783. Outros exemplosde alguns inibidores de VEGF específicos úteis na presenteinvenção são IM862 (Cytran Inc., Kirkland, WA); anticorpoIMC-ICll Imclone, anticorpo monoclonal anti-VEGF da Genente-ch, Inc., San Francisco, CA; e angiozima, uma ribozima sin-tética da Ribozima (boulder, CO), e Chiron (Emeryville, CA).

Inibidores de receptor de ErbB2, tais como GW-282974 (Glaxo Welcome plc), e os anticorpos monoclonais AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc., Woodlands, TX) e 2B-1(Chiron), podem, além disso, ser combinados com a combinaçãode anticorpo-CpG ODN PF3512676, por exemplo, aqueles indica-dos nas Publicações de Pedido de Patente Internacional WO98/02434; WO 99/35146; WO 99/35132; WO 98/02437; WO97/13760; WO 95/19970; Patentes US 5.587.458 e US 5.877.305.Inibidores de receptor de ErbB2 úteis na presente invençãosão também descritos em EP 1029853 (publicado em 23 de agos-to de 2000) e na Publicação de Pedido de Patente Internacio-nal WO 00/44728 (publicado em 3 de agosto de 2000) . Os com-postos e substâncias de inibidor de receptor de erbB2 des-critos nos pedidos PCT, patentes norte-americanas e pedidosprovisórios norte-americanos mencionados acima, bem como ou-tros compostos e substâncias que inibem o receptor de erbB2,podem ser usados com o anticorpo de acordo com a presenteinvenção.

Os tratamentos da invenção podem ser também usadoscom outros agentes úteis no tratamento do crescimento celu-lar anormal ou câncer, incluindo, mas sem limitação, outrosagentes capazes de intensificarem imunorrespostas antitumo-rais, tais como adicionais e diferentes anticorpos CTLA4, eoutros agentes também capazes de bloquear CTLA4; e agentesantiproliferativos tais como inibidores de farnesil proteínatransferase (por exemplo, BMS 214662), e inibidores de ανβ3,tal como o anticorpo para ανβ3 VITAXIN, inibidores de ανβ5,inibidores de p53, e similares.

Quando o anticorpo da invenção é administrado emcombinação com um outro agente imunomodulador, o agente imu-nomodulador pode ser selecionado, por exemplo, do grupo queconsiste em um ativador de células dendriticas, bem como in-tensificadores apresentadores de antigenos, intensificadoresde tropismo de células T, inibidores de fatores imunossu-pressores relacionados a tumores, tais como TGF-β (fatortransformador do crescimento - beta), e IL-IO.

Inibidor de IGF-IR

A presente invenção engloba métodos que compreen-dem a combinação de CpG ODN PF3512676 com imunoterapia (an-ti-CTLA-4) ainda em combinação com agentes e terapias adi-cionais. Ou seja, aquele versado na técnica, com base na ex-posição da descrição proporcionada aqui, apreciaria que aterapia com CpG ODN PF3512676 e terapia de combinação comanticorpo anti-CTLA-4 podem ainda ser combinadas com uma am-pia faixa de agentes terapêuticos, cirurgia, radiação, e ou-tros agentes terapêuticos, para tratar um paciente. Agentesterapêuticos são inúmeros e foram descritos, por exemplo,nas Publicações de Pedidos de Patente US 2004/0005318, US2003/0086930, US 2002/0086014, e a Publicação de Pedido In-ternacional WO 03/086459, todos os quais são aqui incorpora-dos a titulo de referência, entre muitos outros. Tais agen-tes terapêuticos incluem, mas sem limitação, inibidores detopoisomerase I; outros anticorpos (rituximabe, trastuzuma-be, e similares); agentes quimioterapêuticos, tais como, massem limitação, imatinibe, (GLEEVEC, GLIVEC, ou STI571; No-vartis), sorafenibe (BAY 43-9006; Bayer PharmaceuticalsCorp./Onyx Pharmaeeuticals) , inibidores de receptores tiro-sina quinase, moduladores de receptores de estrogênio sele-tivos (SERMs) , taxanos, alcalóides da vinca, temozolomida,inibidores de angiogênese, inibidores de EGFR, inibidores deVEGF, inibidores de receptor de ErbB2, agentes antiprolife-rativos (por exemplo, inibidores de farnesil proteína trans-ferase, e inibidores de ανβ3, inibidores de ανβ5, inibidoresde p53, e similares), imunomoduladores, citocinas, vacinastumorais; antígenos específicos de tumor; terapias com célu-las dentríticas e com células-tronco; agentes alquilantes,antagonistas de folato; antagonistas de pirimidina; antibió-ticos de antraciclina; compostos de platina; moléculas coes-timulantes (por exemplo, CD4, CD25, PD-1, B7-H3, 4-1BB,0X40,ICOS, CD30, HLA-DR, MHCII, e LFA) .

Radioterapia

Terapia de radiação pode ser co-administrada com20 terapia de combinação de CpG ODN PF3512676/anticorpo anti-CTLA-4. A radioterapia é administrada de acordo com métodosde radioterapia bem conhecidos para o tratamento de câncerda mama. A dose e o regime para a radioterapia podem serprontamente determinados por aquele versado na técnica e combase no estágio da doença, e outros fatores bem conhecidosda técnica.

Agentes Paliativos

A presente invenção engloba também a administraçãode outros agentes terapêuticos além de o primeiro e o segun-do componentes, tanto concorrentemente com um ou mais daque-les componentes, como seqüencialmente. Tais agentes terapêu-ticos incluem analgésicos, vacinas contra câncer, agentesantivasculares, agentes antiproliferativos, agentes antiemé-ticos, e agentes antidiarréicos. Agentes antieméticos prefe-ridos incluem cloridrato de ondansetrona, cloridrato de gra-nisetrona, e metoclopramida. Agentes antidiarréicos preferi-dos incluem difenoxilato e atropina (LOMOTIL), loperamida(IMMODIUM)f e octreotida (SANDOSTATIN).

Terapia com base em células-tronco

A combinação de terapia de anticorpo-CpG ODNPF3512676 descrita aqui pode ser combinada com transplantede células-tronco para proporcionar um beneficio terapêuticoa um paciente que sofre de câncer. 0 transplante de células-tronco pode ser realizado de acordo com os métodos conheci-dos na técnica. Alguns de tais métodos são descritos em Ap-pelbaum em Harrison's Principies of Internai Medicine, Capi-tulo 14, Braunwald et al, Eds., 15a Edição, McGraw-Hill Pro-fessional (2001), que é aqui incorporado a titulo de refe-rência. Assim, os métodos da presente invenção referem-se aotratamento de câncer em um mamífero que tenha se submetido atransplante de células-tronco, em que os métodos compreendemadministrar ao mamífero uma quantidade de um anticorpo anti-CTLA-4 humano em combinação com CpG ODN PF3512676, cuja com-binação de terapia de anticorpo- CpG ODN PF3512676 é eficazpara o tratamento de câncer em posterior combinação comtransplante de células tronco.Quando o método compreende transplante de células-tronco, a primeira dose da combinação dos agentes terapêuti-cos anticorpo-CpG ODN PF3512676 pode ser administrada depoisde o sistema imunológico do mamífero ter se recuperado dotransplante, por exemplo, no período de um a doze meses pós-transplante. Em certas modalidades, a primeira dose é admi-nistrada no período de um a três, ou um a quatro meses pós-transplante. 0 paciente pode ser submetido ao transplante decélulas-tronco e tratamento(s) preparatório (s).

A invenção também se refere a um método para otratamento de câncer em um mamífero que compreende as etapasde (i) realizar o transplante de células-tronco no mamífero,e (ii) administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo an-ti-CTLA-4 humano em combinação com uma quantidade eficaz deCpG ODN PF3512676. Preferivelmente, o mamífero é um humano.0 transplante de células-tronco pode ser alogênico ou autó-logo. Assim, transplante de células engloba a transferênciaadotiva de linfócitos, do mesmo paciente e/ou de um doadoremparelhado com HLA.

Ainda, os métodos da invenção podem ser combinadoscom terapia de radiação e transplante de células-tronco, equalquer combinação de quaisquer dos tratamentos descritosaqui, conhecidos da técnica, ou a serem desenvolvidos no futuro.

Como previamente indicado aqui em algum lugar,quando um anticorpo anti-CTLA-4 é combinado com um tratamen-to de câncer padrão, tais como, entre outros, regimes quimi-oterapêuticos, pode ser possível reduzir a dose administradado regime quimioterapêutico (Mokyr, M. et al. Câncer Resear-ch 58:5301-5304 (1998)). Isso porque o uso combinado de umanticorpo anti-CTLA-4 e um nucleotideo imunointensificador,tal como CpG ODN PF3512676 conforme descrito aqui para otratamento de cânce.r, pode mediar a morte celular, ou de ou-tro modo proporcionar um efeito sinergistico entre o blo-queio de CTLA-4 e a ação agonista de TLR9 do nucleotideo.Sem desejar estar ligado a qualquer teoria particular, amorte de células tumorais mediadas pela imunorrespota aumen-tada ou prolongada pelo anticorpo anti-CTLA-4, CpG ODNPF3512676, ou a combinação destes, provavelmente resulta emniveis aumentados de antigeno especifico de tumor na via a-presentadora de antigenos, e o anticorpo anti-CTLA-4 medeiauma imunorresposta aumentada para o mesmo de modo que a co-administração de CpG ODN PF3512676 com o anticorpo medeia umaumento aditivo ou sinergistico da imunorresposta direciona-da ao antigeno tumoral. Outras terapias de combinação quepodem resultar em sinergia com anti-CTLA-4-CpG ODNPF3512676, intensificação da imunorresposta através da Iibe-ração da morte celular de antigenos específicos de tumor sãoradiação, cirurgia, quimioterapia, e administração de umaampla pletora de agentes antitumorais bem conhecidos da téc-nica e como exemplificados aqui, entre muitos outros. Cadaum desses protocolos e os outros descritos aqui, em algumlugar, criam uma fonte de antigenos específicos de tumor nohospedeiro por morte das células tumorais que pode alimentaro antigeno de tumor nas vias apresentadores de antigenoshospedeiros. Portanto, as terapias de combinação descritasaqui podem proporcionar uma fonte aumentada de antigenos es-pecíficos de tumor, proporcionando assim uma imunorrespostaaumentada ao tumor, que, por sua vez, proporciona um benefí-cio terapêutico ao paciente.

VI. Regimes de Dosagens

Os regimentos de dosagens podem ser ajustados paraproporcionar a resposta desejada ótima. Por exemplo, um úni-co bolo pode ser administrado, várias doses divididas podemser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcio-nalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exi-gências da situação terapêutica. É especialmente vantajosoformular composições parenterais em forma de dosagem unitá-ria para facilidade de administração e uniformidade de dosa-gem. A forma de dosagem unitária, conforme usada aqui, refe-re-se a unidades fisicamente separadas adequadas como dosa-gens unitárias para os pacientes mamíferos a serem tratados;em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada decomposto ativo calculada para produzir o efeito terapêuticodesejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.

A especificação para as formas unitárias de dosagem da in-venção é ditada por e diretamente dependente de (a) as ca-racterísticas únicas do anticorpo e do efeito terapêutico ouprofilático a ser obtido, e (b) as limitações inerentes àtécnica de formulação, tal como um composto ativo para otratamento de sensibilidade em indivíduos.

Assim, aquele versado na técnica apreciaria, combase na descrição proporcionada aqui, que a dose e regime dedosagem são ajustados de acordo com os métodos bem conheci-dos nas técnicas terapêuticas. Ou seja, a dose máxima tole-rada pode ser prontamente estabelecida, e a dose eficaz queproporciona um beneficio terapêutico detectável para um pa-ciente pode também ser determinada, bem como as exigênciastemporais para administração de cada agente para proporcio-nar um beneficio terapêutico detectável para o paciente. Porconseguinte, embora certa dose e regimes de administraçãosejam exemplificados aqui, esses exemplos não limitam de ne-nhum modo a dose e o regime de administração que podem serproporcionados a um paciente na prática da presente inven-ção. Ainda, aquele versado na técnica, uma vez de posse dosensinamentos proporcionados aqui, entenderia que um efeitoterapêutico, tais como, mas sem limitação, decréscimo detec-tável do tamanho do tumor e/ou metástase, e tempo aumentadopara recorrência, entre outros parâmetros, pode ser avaliadopor uma ampla variedade de métodos conhecidos da técnica pa-ra avaliar a eficácia do tratamento de câncer, e estes méto-dos são englobados aqui, bem como métodos a serem desenvol-vidos no futuro.

Deve ser observado que os valores de dosagem podemvariar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada, epodem incluir doses simples e múltiplas. É ainda para serentendido que para qualquer paciente particular, os regimesde dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo, deacordo com a necessidade individual e o julgamento profis-sional da pessoa que está administrando ou

supervisionando a administração das composições, eque as faixas de dosagens estabelecidas aqui são apenas e-xemplificativas e não têm o objetivo de limitar o escopo ouprática da composição reivindicada. Por exemplo, as dosespodem ser ajustadas com base em parâmetros farmacocinéticose farmacodinâmicos, que podem incluir efeitos clínicos taiscomo efeitos tóxicos e/ou valores laboratoriais. Assim, apresente invenção engloba escalação de doses intrapacientecomo determinada por aquele versado na técnica. Determinaçãode dosagens apropriadas e regimes para administração do an-ticorpo são bem conhecidos da técnica relevante e devem serentendidos como estando englobados pelo versado na técnicauma vez que provido dos ensinamentos expostos aqui.

Dosagem de ODN

CpG ODN PF3512676 pode ser administrado de acordocom regimes de dosagem padrão bem conhecidos na técnica. Do-ses individuais de CpG ODN PF3512676 para distribuição namucosa ou no local variam de cerca de 1 μς a 100 mg por ad-ministração, que dependendo da aplicação pode ser dada dia-riamente, semanalmente, ou mensalmente e qualquer outro pe-ríodo de tempo entre estes. Mais tipicamente, as doses paramucosa e local variam de cerca de 100 μg a 50 mg por admi-nistração, e, mais tipicamente, de cerca de 1 a 10 mg, com 2- 4 administrações sendo em dias ou semanas separados.

As presentes doses dos compostos descritos aquipara distribuição parenteral com a finalidade de induzir umaimunorresposta sistêmica podem variar tipicamente de 2 a1.000 vezes mais que a dose eficaz para mucosa e, mais tipi-camente, 2 a 100 vezes mais, e mais tipicamente 5 a 50 vezesmais.Doses de CpG ODN PF3512676 para distribuição pa-renteral (incluindo subcutânea) para induzir uma imunorres-posta, quando o CpG ODN PF3512676 é administrado em combina-ção com outros agentes terapêuticos, tais como os anticorposda invenção, ou em veículos de distribuição especializadavariam tipicamente de 10 μg a 1.000 mg por administração,que dependendo da aplicação podem ser dada diariamente, se-manalmente, ou mensalmente e qualquer outro período de tempoentre estes. Mais tipicamente, as doses parenterais para es-ses propósitos variam de cerca de 1 a 500 mg por administra-ção, e mais tipicamente de cerca de 5 a 100 mg, com 2-4administrações sendo separadas por dias ou semanas. Contudo,em algumas modalidades, doses parenterais para esses propó-sitos podem ser usadas em uma faixa de 5 a 10.000 vezes mai-or que as doses típicas descritas acima.

Em algumas modalidades, o ODN é administrado umavez na semana em quantidades que variam de 10-40 mg totais.ODN pode ser administrado em dose de 5 ou 10 mg cada, resul-tando assim em múltiplos bolos ou injeções dependendo daquantidade total a ser administrada. Por exemplo, se a quan-tidade total a ser administrada é de 10 mg, esta pode seradministrada por, por exemplo, doses de injeção de 2 χ 5 mg.Como um outro exemplo, se a quantidade total a ser adminis-trada é de 40 mg, esta pode ser administrada por, por exem-pio, doses de injeção de 4 χ 10 mg.

Dosagem de Anticorpo

Uma faixa não limitativa exemplificativa para umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo adminis-trado de acordo com a invenção é pelo menos cerca de 0,1mg/kg, pelo menos cerca de 0,3 mg/kg, pelo menos cerca de 1mg/kg, pelo menos cerca de 5 mg/kg, pelo menos cerca de 6mg/kg, pelo menos cerca de 10 mg/kg, pelo menos cerca de 15mg/kg, pelo menos cerca de 20 mg/kg, pelo menos cerca de 30mg/kg, ou pelo menos cerca de 50 mg/kg. Por exemplo, umaquantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode variarde cerca de 0,1-30 mg/kg, ou, por exemplo, de cerca de 0,3-25 mg/kg, ou, por exemplo, cerca de 1-20 mg/kg, ou, por e-xemplo, cerca de 3-20 mg/kg, ou, por exemplo, cerca de 5-20mg/kg, ou, por exemplo, cerca de 10-20 mg/kg, ou cerca de 3-15 mg/kg, ou cerca de 5-15 mg/kg, ou cerca de 10-15 mg/kg.

Em uma outra modalidade, o anticorpo é administra-do em uma dose de pelo menos 0,3 mg/kg, preferivelmente, pe-Io menos 1 mg/kg, mais preferivelmente, pelo menos 3 mg/kg,ainda mais preferivelmente, pelo menos 5 mg/kg, preferivel-mente, pelo menos 6 mg/kg, mesmo mais preferivelmente, pelomenos 10 mg/kg, também mais preferivelmente, pelo menos 15mg/kg, e de mais preferência ainda, pelo menos 20 mg/kg.

Adicionalmente, o anticorpo é administrado por in-fusão IV em uma dose que varia de cerca de 0,1 mg/kg a 50mg/kg, mais pref erivelmente, de cerca de 0,3 mg/kg a 20mg/kg, mais preferivelmente, de cerca de 1 mg/kg a 15 mg/kg,ainda mais preferivelmente, de cerca de 3 mg/kg a 15 mg/kg,mesmo mais preferivelmente, de cerca de 6 mg/kg a 15 mg/kg.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado em uma formu-lação intravenosa como uma solução aquosa estéril contendocerca de 5 a 20 mg/mL de anticorpo, em um sistema de tampãoapropriado.

Ainda, um protocolo de escalação de doses exempli-ficativo que pode ser usado para determinar a dose máximatolerada (MTD), para avaliar a toxicidade limitativa de dose(DLT), se alguma, associada à administração da terapia decombinação de anticorpo-CpG ODN PF3512676, e similares, com-preende administrar doses crescentes, tais como, mas sem li-mitação, de cerca de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg,6 mg/kg, 7 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, oumais que 15 mg/kg, ou qualquer combinação destas, mais pre-ferivelmente doses sucessivas de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, oumais que 15 mg/kg, ou qualquer combinação destas, mais pre-ferivelmente, dose sucessivas de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, ou 20 mg/kg sãoadministradas e o paciente é avaliado quanto à toxicidade,se alguma, bem como quanto à eficácia de tratamento, entreoutros parâmetros. Tais estudos para determinar a toxicidadee eficácia de regimes de dose são bem conhecidos da técnica.

Tempo de Administração

CpG ODN PF3512676 pode ser administrado de formasubstancialmente simultânea ou seqüencial com anticorpos an-ti-CTLA-4 da invenção. Quando a administração é simultânea,o ODN e o anticorpo podem estar nas mesmas formulações ouseparadas embora eles sejam administrados ao mesmo tempo. Otermo "de forma substancialmente simultânea" significa queos compostos são administrados dentro de minutos uns dos ou-tros (por exemplo, dentro de 10 minutos uns dos outros) etem o objetivo de englobar administração associada bem comoconsecutiva, mas se a administração é consecutiva ela é se-parada em tempo por somente um curto período (por exemplo, otempo seria aquele que o médico levaria para administrar osdois compostos separadamente). Como usadas aqui, administra-ção concorrente e administração de forma substancialmentesimultânea são empregadas intercambiavelmente. Administraçãoseqüêncial refere-se à administração temporariamente separa-da de o ODN e o anticorpo. A separação de tempo entre a ad-ministração desses compostos é deliberadamente mais longaque o tempo que leva para administrar dois medicamentos se-paradamente, um depois do outro, sem demora pretendida. As-sim, a co-administração engloba qualquer combinação temporalde administração de o anticorpo e o CpG ODN PF3512676 de mo-do que a administração dos dois medeia um benefício terapêu-tico ao paciente que é detectavelmente maior que a adminis-tração de cada agente na ausência do outro.

CpG ODN pode ser administrado antes, concorrente-mente com, ou depois (ou qualquer combinação destas) da ad-ministração do anticorpo, e vice-versa. 0 CpG ODN pode seradministrado diariamente (incluindo uma ou mais administra-ções por dia) , dia sim dia não, a cada três dias, a cadaquatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cadasemana, a cada mês, a cada dois meses, a cada três meses, acada quatro meses, a cada cinco meses, a cada seis meses, oua cada ano. 0 anticorpo pode ser administrado diariamente,dia sim dia não, a cada três dias, a cada quatro dias, a ca-da cinco dias, a cada seis dias, a cada semana, a cada duassemanas, mensalmente, ou a cada vinte dias, a cada 25 dias,a cada 28 dias, a cada 30 dias, a cada 40 dias, a cada 50dias, a cada dois meses, a cada 70 dias, a cada 80 dias, acada três meses, a cada seis meses ou anualmente. Uma doseúnica ou doses múltiplas do anticorpo podem ser administra-das. Alternativamente, pelo menos uma dose, ou pelo menostrês, seis ou 12 doses podem ser administradas. Por.exemplo,as doses podem ser administradas. A administração de o ODN eo anticorpo pode ser alternada.

Em uma modalidade, para da dose é administrada porum bolo intravenoso e o restante por infusão da formulaçãode anticorpo. Por exemplo, uma injeção intravenosa do anti-corpo pode ser dada como um bolo, e o restante de uma dosepredeterminada de anticorpo pode ser administrado por inje-ção intravenosa. Uma dose predeterminada do anticorpo podeser administrada, por exemplo, por um período de cerca deuma hora e meia a cerca de cinco horas.

Em uma modalidade, CpG ODN PF351267 6 e o anticorposão co-administrados em que CpG ODN PF3512676 é administradonas doses citadas aqui, preferivelmente parenteralmente (porexemplo, por via subcutânea ou IV) . Em uma outra modalidade,o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado inicialmente parabloquear os efeitos inibidores que limitariam a eficácia doCpG ODN. Nessa modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é dadoprincipalmente de 1 semana a 1 dia antes do CpG ODN, e, maispreferivelmente, de 2 a três antes do CpG ODN.

Em uma outra modalidade, o CpG ODN é dado inicial-mente para sensibilizar o sistema imunológico para ter umamelhor resposta de ativação imunológica ao anticorpo anti-CTLA-4 e a quaisquer outras imunoterapias ou outra terapiaque podem ser dadas em conjunto com esta (por exemplo, vaci-na contra tumor, etc.) . Nessa modalidade, o CpG ODN é dadopreferivelmente de 1 semana a 1 dia antes do anticorpo anti-CTLA-4, e mais pref erivelmente de 2 a 3 dias antes do anti-corpo anti-CTLA-4.

Embora qualquer periodo restante adequado possaser usado entre a administração de CpG ODN PF3512676 e anti-corpo anti-CTLA-4, a presente invenção não requer um periodode espera e o anticorpo e o CpG ODN PF3512676 podem ser co-administrados de forma substancialmente simultânea Assim, emuma modalidade, o anticorpo é administrado como uma injeçãosimples e CpG ODN PF3512676 é administrado cerca de 1 a 7dias ou antes ou depois do anticorpo.

0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser ad-ministrado com o CpG ODN PF3512676 em um ciclo de multi-diasou de multi-semanas. 0 ciclo de multi-dias pode ser um ciclode 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias, ou um ciclo de2, 3, 4 ou mais semanas. 0 anticorpo ou fragmento deste podeser administrado no primeiro dia de tal ciclo, seguido por.administração do CpG ODN PF3512676 no primeiro dia de cadasemana de um ciclo de multi-semanas. Por exemplo, o CpG ODNPF3512676 pode ser administrado nos dias 1, 7 e 14 de um ci-clo de três semanas. 0 ciclo de três semanas pode ser repe-tido uma, duas, três ou mais vezes. 0 tratamento inteiro po-de ser precedido da administração ou do ODN ou do anticorposozinho, por exemplo, de modo a sensibilizar o sistema imu-nológico ou tornar o paciente mais responsivo à terapia sub-seqüente.

Ciclos adicionais de anticorpo e CpG ODN PF3512676podem ser proporcionados conforme determinado por métodosreconhecidos na técnica. Contudo, a presente invenção nãoestá limitada a estes ou a qualquer dosagem particular ou aregimes de administração para administrar CpG ODN PF351267 6em combinação com um anticorpo anti-CTLA-4. Mais exatamente,a dose ótima, via e regime de administração do anticorpo eCpG ODN PF3512676 podem ser prontamente determinados por a-quele com conhecimento ordinário da técnica relevante usandométodos bem conhecidos.

A combinação de anticorpo anti-CTLA-4-CpG ODNPF3512676 pode ser administrada como uma terapia neoadjuvan-te antes da cirurgia, terapia de radiação, ou qualquer outrotratamento, de modo a sensibilizar as células tumorais ou,de outro modo, conferir efeito terapêutico ao paciente. Adi-cionalmente, a combinação pode ser co-administrada como te-rapia neoadjuvante seguinte ao tratamento localizado (porexemplo, cirurgia, radiação, ou ambos).

Ainda, a combinação pode ser administrada como umaterapia de segunda linha, tal como, mas sem limitação, umavez que qualquer terapia de primeira linha tenha falhado.

Alternativamente, a combinação pode ser administrada concor-rentemente com a terapia de primeira linha, e/ou em qualquerponto durante a terapia de primeira linha, que pode ser ad-ministrada seguinte ao tratamento inicial.

Isso é porque uma combinação de um anticorpo anti-CTLA-4 e CpG ODN PF3512676 pode proporcionar um beneficioterapêutico uma vez que a terapia de primeira linha tenhafalhado, uma vez que a terapia adjuvante sistêmica tenha fa-lhado, e similar. Assim, a invenção engloba a administraçãode um anticorpo e CpG ODN PF3512676 em combinação, com ousem terapia adicional, incluindo, mas sem limitação, agentehormonal (por exemplo, anti-androgênio, inibidor de aromata-se, e similares), radioterapia, e qualquer agente terapêuti-co adicional (por exemplo, quimioterapia, terapia de inibi-ção de sinal, entre outras), e similares, como seria apreci-ado por aquele versado na técnica com base na descrição pro-porcionada aqui.

VII. Composições Farmacêuticas

A invenção refere-se também a um artigo de fabri-cação (por exemplo, uma forma de dosagem adaptada para admi-nistração IV) que compreende um anticorpo anti-CTLA-4 humanona quantidade eficaz para tratar câncer (por exemplo, pelomenos 1 mg/kg, pelo menos 3 mg/kg, pelo menos 5 mg/kg, pelomenos 10 mg/kg, pelo menos 15 mg/kg, ou pelo menos 20 mg/kg)e uma quantidade terapeuticamente eficaz de CpG ODNPF3512676. Em certas modalidades, o artigo de fabricaçãocompreende um recipiente ou recipientes compreendendo um an-ticorpo anti-CTLA-4 humano, CpG ODN PF3512676, rótulo e/ouinstruções de uso para tratar câncer.

A invenção engloba a preparação e uso de composi-ções farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4humano da invenção como ingrediente ativo em combinação come sem CpG ODN PF3512676. Tal composição farmacêutica podeconsistir em cada ingrediente ativo sozinho, como uma combi-nação de pelo menos um ingrediente ativo (por exemplo, umadose eficaz de um anti-CTLA-4, uma dose eficaz de CpG ODNPF3512676) em uma forma adequada para administração a um pa-ciente, ou a composição farmacêutica pode compreender o in-grediente ativo e um ou mais veículos farmaceuticaraente a-ceitáveis, um ou mais ingredientes adicionais (ativos e/ouinativos), ou alguma combinação destes.

CpG ODN PF3512676 pode ser diretamente administra-do ao paciente ou pode ser administrado em conjunção com umcomplexo de distribuição de ácido nucléico. Um complexo dedistribuição de ácido nucléico deve significar uma moléculade ácido nucléico, associada (por exemplo, ionicamente oucovalente ligada; ou encapsulada dentro) a um meio para al-vejar, por exemplo, uma molécula que resulta em ligação comafinidade maior à célula alvo. Exemplos de complexos de dis-tribuição de ácido nucléico incluem oligonucleotideos asso-ciados a um esterol (por exemplo, colesterol), um lipidio(por exemplo, um lipidio catiônico, virossoma ou lipossoma),um agente de ligação específico para célula alvo (por exem-pio, um ligante reconhecido por receptor específico de célu-la alvo). Complexos preferidos podem ser suficientemente es-táveis in vivo para prevenir significante desacoplamento an-tes da internalização pela célula alvo. Contudo, o complexopode ser clivável sob condições apropriadas dentro da célulade modo que o ácido nucléico é liberado em uma forma funcional.

Veículos de distribuição ou dispositivos de dis-tribuição para distribuir antígeno e oligonucleotídeos paraas superfícies têm sido descritos. O CpG ODN PF3512676 e/ouantigeno e/ou outras substâncias terapêuticas podem ser ad-ministrados sozinhos (por exemplo, em solução salina ou tam-pão) ou usando quaisquer veículos de distribuição conhecidosda técnica. Por exemplo, os seguintes veículos de distribui-ção foram descritos: Cocleatos; Emulsomas, ISCOMs; Liposso-mas; Vetores bacterianos vivos (por exemplo, Salmonella, Es-cherichia coli, Bacillus calamtte-guerin, Shigella, Lactoba-cillus); Vetores virais vivos (Por exemplo, vacínia, adeno-vírus, herpes simples); Microesferas; Vacinas de oligonucle-otídeos; Polímeros; Anéis poliméricos; Proteossomas; Fluore-to de Sódio; Plantas transgênicas; Virossomas; Partículassemelhantes a vírus ("vírus-like"), e lipídios catiônicos,peptídeos, ou outros veículos que têm uma interação de cargacom o oligonucleotídeo polianiônico. Outros veículos de dis-tribuição são conhecidos da técnica e alguns exemplos adi-cionais são proporcionados abaixo na discussão de vetores.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado pa-renteralmente (por exemplo, intravenosamente) em uma soluçãoaquosa, enquanto o CpG ODN PF3512676 é administrado por in-jeção subcutânea. Formulações e formas de dosagens preferi-das do CpG ODN PF3512676 estão descritas na Publicação dePedido de Patente US 2004/0198680, . cuja exposição é aqui in-corporada, a título de referência, em sua totalidade. Contu-do, o versado na técnica entenderia, com base na exposiçãoproporcionada aqui, que a invenção não está limitada a es-tas, ou a quaisquer outras, formulações, doses, vias de ad-ministração, e similares. Mais exatamente, a invenção englo-ba qualquer formulação ou método para administrar um anti-corpo em combinação com um CpG ODN PF3512676, incluindo, massem limitação, administrar cada agente separadamente em umaformulação diferente via uma rota diferente de administração(por exemplo, administração de um anticorpo anti-CTLA-4 IV),enquanto se co-administra CpG ODN PF3512676 subcutaneamente,entre muitas outras. Assim, a seguinte discussão descrevevárias formulações para praticar os métodos da invenção com-preendendo a administração de qualquer anticorpo anti-CTLA-4em combinação com CpG ODN PF3512676, mas a invenção não estálimitada a estas formulações, porém compreende qualquer for-mulação como pode ser prontamente determinada por aqueleversado na técnica uma vez de posse dos ensinamentos propor-cionados aqui, para uso nos métodos da invenção.

Os anticorpos empregados na invenção podem ser in-corporados em composições farmacêuticas para administração aum paciente. Tipicamente, a composição farmacêutica compre-ende o anticorpo e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Como usado aqui, "veiculo farmaceuticamente aceitável" in-clui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, re-vestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentesisotônicos e retardadores de absorção, e similares, os quaissão fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos far-maceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solu-ção salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose,trealose, glicerol, etanol e similares, bem como combinaçõesdestes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes i-sotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como ma-nitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Substân-cias farmaceuticamente aceitáveis tais como quantidades me-nores de substâncias molhantes ou auxiliares, tais como a-gentes molhantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões,que intensificam a vida de prateleira ou eficácia do anti-corpo ou porção de anticorpo.

Os anticorpos podem estar em uma variedade de for-mas. Essas incluem, por exemplo, formas de dosagens líqui-das, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas(por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersõesou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supo-sitórios. A forma preferida depende do modo pretendido deadministração e aplicação terapêutica. As composições típi-cas preferidas estão na forma de soluções injetáveis ou in-fusíveis, tais como composições similares àquelas usadas pa-ra imunização passiva de humanos com outros anticorpos. 0modo preferido de administração é parenteral (por exemplo,intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Emuma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por in-fusão ou injeção intravenosa. Em uma outra modalidade prefe-rida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscularou subcutânea.

As composições terapêuticas devem ser tipicamenteestéreis e estáveis sob as condições da fabricação e armaze-nagem. A composição pode ser formulada como uma solução, mi-croemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordena-da adequada para alta concentração de fármacos. Soluções in-jetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação doanticorpo na quantidade requerida em um solvente apropriadocom um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima,conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Emgeral, as dispersões são preparadas por incorporação do com-posto ativo em um veiculo estéril que contém um meio de dis-persão básico e os outros ingredientes requeridos daquelesenumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparaçãode soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos depreparação são secagem a vácuo e liofilização que produz umpó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejadoadicional de uma solução deste estéril previamente filtrada.

A fluidez própria de uma solução pode ser mantida, por exem-plo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela ma-nutenção do tamanho requerido de partícula no caso de dis-persão e pelo uso de tensoativos. Absorção prolongada decomposições injetáveis pode ser efetuada por inclusão nacomposição de um agente que retarda a absorção, por exemplo,sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos e/ou CpG ODN PF3512676 podem ser ad-ministrados por uma variedade de métodos conhecidos da téc-nica, incluindo, sem limitação, oral, parenteral, mucosa,por inalação, tópica, bucal, nasal, e retal. Para muitas a-plicações terapêuticas, via/modo preferido de aplicação ésubcutânea, intramuscular, intravenosa ou por infusão. Inje-ção sem agulha pode ser empregada, se desejado. Como seráapreciado por aquele versado na técnica, a via e/ou modo deadministração variará dependendo dos resultados desejados.

Regimes de dosagens podem ser ajustados para pro-porcionar a resposta desejada ótima. Por exemplo, um boloúnico pode ser administrado, várias doses divididas podemser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcio-nalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exi-gências da situação terapêutica. É especialmente vantajosapara formular composições parenterais em forma unitária dedosagem para facilitar a administração e uniformidade da do-sagem. A forma unitária de dosagem, conforme usada aqui, re-fere-se a unidades fisicamente separadas para os pacientesmamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quan-tidade predeterminada do composto ativo, calculada para pro-duzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veí-culo farmacêutico requerido. A especificação para as formasunitárias de dosagem da invenção é ditada por e diretamentedependente de (a) as características únicas do anticorpo e oefeito terapêutico e profilático particular a ser alcançado,e (b) as limitações inerentes à técnica de formulação de talcomposto ativo para o tratamento de sensibilidade em indiví-duos.

É para ser mencionado que valores de dosagem podemvariar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada, epodem incluir doses simples e múltiplas. É para ser entendi-do que para qualquer paciente particular, regimes de dosa-gens específicas devem ser ajustadas com o tempo, de acordocom a necessidade individual e

o julgamento profissional da pessoa que está admi-nistrando ou supervisionando as composições, e que as faixasde dosagem estabelecidas aqui são somente exemplificativas enão têm o objetivo de limitar o escopo ou a prática da com-posição requerida.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado emum uma formulação intravenosa como uma solução aquosa esté-ril contendo 5 ou 10 mg/mL de anticorpo, com acetato de só-dio, polissorbato 80, e cloreto de sódio em um pH que variade cerca de 5 a 6. Preferivelmente, a formulação intravenosaé uma solução aquosa estéril contendo 5 ou 10 mg/mL de anti-corpo, como acetato de sódio 20mM, 0,2 mg/mL de polissorbato80, e cloreto de sódio 140mM em pH 5,5.

Em uma modalidade, parte da dose é administradapor um bolo intravenoso e o restante por infusão da formula-ção de anticorpo. Por exemplo, 0,01 mg/kg de injeção intra-venosa do anticorpo pode ser dado como um bolo, e o restantede uma dose predeterminada de anticorpo pode ser administra-do por injeção intravenosa. Uma dose predeterminada do anti-corpo pode ser administrada, por exemplo, por um período deuma hora e meia a duas horas a cinco horas.

As formulações das composições farmacêuticas des-critas aqui podem ser preparadas por qualquer método conhe-cido ou depois daqui desenvolvido no campo da farmacologia.

Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de co-locar o ingrediente ativo em associação com um veículo ou umou mais de outros ingredientes acessórios, e então, se ne-cessário ou desejável, conformar ou embalar o produto em umaunidade desejada de doses simples ou múltiplas.

Uma composição farmacêutica da invenção pode serpreparada, embalada, ou vendida a granel, como uma dose uni-tária simples, ou uma pluralidade de doses unitárias sim-ples. Como usada aqui, uma "dose unitária" é uma quantidadeseparada da composição farmacêutica que compreende uma quan-tidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade doingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingredien-te ativo, que seria administrada a um paciente ou uma fraçãoconveniente de tal dosagem, tal como, por exemplo, uma meta-de e um terço de tal dosagem.

As quantidades relativas do ingrediente ativo, oveiculo farmaceuticamente aceitável, e quaisquer ingredien-tes adicionais em uma composição farmacêutica da invençãovariarão, dependendo da identidade, tamanho, e condição dopaciente tratado e ainda dependendo da via pela qual a com-posição deve ser administrada. A titulo de exemplo, a compo-sição pode compreender entre 0,1% e 100% (p/p) do ingredien-te ativo.

Além do ingrediente ativo, uma composição farma-cêutica da invenção pode ainda compreender um ou mais agen-tes farmaceuticamente ativos adicionais. Os agentes adicio-nais particularmente contemplados incluem agentes antieméti-cos, antidiarréicos, quimioterapêuticos, citocinas, e simi-lares.

Formulações de liberação controlada ou constantede uma composição farmacêutica da invenção podem ser feitasusando tecnologia convencional.

Como usada aqui, "administração parenteral" de umacomposição farmacêutica inclui qualquer via de administraçãocaracterizada por abertura física de tecido de um paciente eadministração da composição farmacêutica através da aberturano tecido. A administração parenteral inclui assim, mas semlimitação, a administração de uma composição farmacêuticapor injeção da composição, por aplicação da composição atra-vés de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composiçãoatravés de um ferimento, não cirúrgico, que penetra o teci-do, e similar. Em particular, a administração parenteral en-globa, mas sem limitação, injeção subcutânea, intraperitone-al, intramuscular, injeção intraesternal, e técnicas de in-fusão dialitica do rim.

As formulações de uma composição farmacêutica ade-quada para administração parenteral compreendem o ingredien-te ativo em combinação com um veiculo farmaceuticamente a-ceitável, tal como água estéril ou solução isotônica esté-ril. Tais formulações podem ser preparadas, embaladas, emba-ladas, ou vendidas em uma forma adequada para administraçãodo bolo ou para administração continua. As formulações inje-táveis podem ser preparadas, embaladas, ou vendidas em umaforma de dosagem unitária, tal como em ampola ou em recipi-entes de multi-doses contendo um conservante. As formulaçõespara administração parenteral incluem, mas sem limitação,suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquo-sos, pastas e formulações implantáveis de liberação constan-te, ou biodegradáveis, como discutidas abaixo. Tais formula-ções podem compreender ainda um ou mais ingredientes adicio-nais incluindo, mas sem limitação, agentes de suspensão, es-tabilizantes, ou dispersantes. Em uma modalidade de uma for-mulação para administração parenteral, o ingrediente ativo éproporcionado na forma seca (i.e. pó ou granular) para re-constituição com um veiculo adequado (por exemplo, água es-téril, isenta de pirogênio) antes da administração parente-ral da composição reconstituída.

Uma composição da presente invenção pode ser admi-nistrada por uma variedade de métodos conhecida da técnica.A via e/ou o modo de administração variam dependendo dos re-sultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparadoscom veículos que protegem o composto contra a liberação rá-pida, tal como uma formulação de liberação controlada, in-cluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas dedistribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis,biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno-acetatode vinila, polianidridos, poli(ácido glicólico), colágeno,poliortoésteres, e poli(ácido láctico). Vários métodos paraa preparação de tais formulações estão descritos, por exem-plo, em Sustaíned and Controlled Release Drug Delivery Sys-tems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc. Nova Iorque(1978). Composições farmacêuticas são, preferivelmente, fa-bricadas sob condições GMP.

As composições farmacêuticas podem ser preparadas,embaladas, ou vendidas na forma de uma suspensão ou solução,estéril, injetável, aquosa ou oleosa. Essa suspensão ou so-lução pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida,e pode compreender, além do ingrediente ativo, ingredientesadicionais, tais como os agentes dispersantes, agentes mo-lhantes, ou agentes de suspensão descritos aqui. Tais formu-lações estéreis injetáveis podem ser preparadas usando umdiluente, ou solvente, parenteralmente aceitável, atóxico,tal como, por exemplo, água ou 1,3-butano. Outros diluentese solventes aceitáveis incluem, mas sem limitação, soluçãode Ringer, solução isotônica de cloreto de sódio, e óleosfixados tais como mono ou diglicerideos sintéticos. Outrasformulações parenteralmente administráveis, que são úteis,incluem aquelas que compreendem o ingrediente ativo na formamicrocristalina, em uma preparação lipossômica, ou como umcomponente de um sistema polimérico biodegradável. As compo-sições para liberação constante ou para implante podem com-preender materiais poliméricos ou hidrofóbicos farmaceutica-mente aceitáveis, tal como uma emulsão, uma resina de trocaiônica, um polímero moderadamente solúvel, ou um sal modera-damente solúvel.

A combinação de ingredientes ativos de anticorpoanti-CTLA-4/CpG ODN PF3512676 da invenção pode ser adminis-trada a um animal, preferivelmente um humano. Embora a dosa-gem precisa administrada de cada ingrediente varie dependen-do de vários fatores, incluindo, mas sem limitação, o tipode animal e o tipo de doença que está sendo tratada, a idadedo animal e a(s) via(s) de administração.

Uma combinação de anticorpo-CpG ODN PF3512 67 6 dainvenção pode ser co-administrada com vários outros compos-tos (agentes de terapia anti-hormonal, citocinas, fármacosquimioterapêuticos e/ou antivirais, entre muitos outros).

Alternativamente, o(s) composto(s) pode(m) ser administra-do (s) uma hora, um dia, uma semana, um mês, ou mesmo mais,em avanço da combinação de anticorpo-CpG ODN PF3512676, ouqualquer permutação destas. Ainda, o(s) composto(s) pode(m)ser administrado (s) uma hora, um dia, uma semana ou mesmomais, depois da administração de radiação, transplantes decélulas-tronco, ou administração de qualquer agente terapêu-tico (por exemplo, citocina, composto quimioterapêutico, esimilares), ou qualquer permutação destes. A freqüência e oregime de administração serão prontamente aparentes para a-quele versado na técnica e dependerão de vários fatores,tais como, mas sem limitação, o tipo e gravidade da doençaque está sendo tratada, a idade e o estado de saúde do ani-mal, a identidade do composto ou compostos que estão sendoadministrados, a via de administração dos vários compostos,e similares. São proporcionados vários exemplos demonstrandométodos de co-administração de um anticorpo-CpG ODNPF3512676 para tratar câncer, mas a invenção não está limi-tada, de nenhum modo, a estes exemplos, que servem, meramen-te, para ilustrar os métodos englobados pela invenção.

VIII. Kits

A invenção inclui vários kits para tratamento decâncer. Os kits compreendem uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um anticorpo anti-CTLA-4 humano de invenção e umaquantidade terapeuticamente eficaz de CpG ODN PF3512676,juntamente com um aplicador e materiais de instrução, quedescrevem o uso da combinação para efetuar os métodos da in-venção. Embora kits exemplificativos estejam descritos abai-xo, o conteúdo de outros kits úteis tornar-se-ão aparentespara aquele versado na técnica da presente exposição. Cadaum desses kits está incluído na invenção.A invenção inclui um kit para o tratamento de car-cinoma de células renais em um paciente que necessite domesmo. 0 kit inclui um anticorpo anti-CTLA-4 humano da in-venção e CpG ODN PF3512676. 0 kit compreende ainda um apli-cador incluindo, mas sem limitação, uma seringa para admi-nistração dos componentes do kit a um paciente. Adicional-mente, o kit compreende um material de instrução que mostraa informação pertinente para o uso do kit para tratar câncerda mama no paciente.

Mais preferivelmente, o kit compreende pelo menosum anticorpo anti-CTLA-4 selecionado de 4.1.1, 4.8.1,4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1,12.3.1.1, e 12.9.1.1 e MDX-010, ainda mais preferivelmente,o anticorpo é 4.13.1, 11.2.1, e MDX-010.

A invenção engloba um kit que compreende qualquercombinação de um anticorpo anti-CTLA-4 e CpG ODN PF3512676.Embora tal kit seja preferido, a invenção não está limitadaa essa combinação particular. Ainda, o kit pode compreenderuma ampla faixa de agentes adicionais para o tratamento decâncer. Tais agentes estão estabelecidos previamente e in-cluem compostos quimioterapêuticos, vacina contra câncer,agonistas de TLR diferentes de um CpG ODN PF3512676, outrosCpG ODNs, inibidores de receptor tirosina quinase (tal como,mas sem limitação, SU11248), agentes úteis para o tratamentode crescimento celular anormal ou câncer, anticorpos ou ou-tros ligantes que inibem o crescimento tumoral por ligação aIGF-1R, um agente quimioterapêutico (taxano, alcalóide davinca, composto de platina, antibióticos de intercalação,entre muitos outros), e citocinas, entre muitas outras, bemcomo agente paliativos para tratar, por exemplo quaisquertoxicidades que surjam durante o tratamento, tais como, massem limitação, um antidiarréico, um antiemético, e similares.

A invenção é também descrita detalhadamente comreferência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exem-plos são proporcionados somente para propósitos de ilustra-ção, e não têm o objetivo de serem limitativos, a menos quede outro modo especificado. Assim, a invenção não deve, denenhum modo, ser interpretada como sendo limitada pelos e-xemplos seguintes, mas preferivelmente, deve ser interpreta-da como englobando quaisquer e todas as variações que setornarem evidentes, como resultado do ensinamento provido aqui.

EXEMPLO 1;

Anticorpo Anti-CTLA-4 em Combinação com CpG ODNPF3512676 para Tratamento de Câncer da Mama

Seguinte à cirurgia/radioterapia, se alguma, àspacientes tendo câncer da mama metastático com pelo menosuma lesão que pode ser medida com precisão em duas dimensõespor varredura CR ou por varredura CT espiral são dados CpGODN PF3512676 por protocolos estabelecidos. Em resumo, ,CpGODN PF3512676 é administrado subcutaneamente ou por IV emdoses de 0,02 a 20 mg/kg, e mais pref erivelmente cerca de0,2 mg/kg SC e 2 mg/kg IV.

À paciente é ainda administrada uma infusão IVsimples (100 mL/h) de anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1, comodescrito aqui, em uma dose de cerca de 10 mg/kg, dada entre7 dias antes ou 7 dias depois do tratamento com CpG ODNPF3512676. 0 tratamento com anticorpo é repetido depois de28 dias sem escalação da dose de anticorpo anti-CTLA-4, acada 28 depois disso para o máximo de 12 ciclos em ausênciade toxicidade intolerável ou progressão da doença.

A paciente pode ser pré-medicada com anti-histaminico (Hl) pelo menos uma meia hora antes da infusãocom anti-CTLA-4. Contudo, embora pré-medicação possa ser ad-ministrada, preferivelmente a paciente não é tipicamentepré-tratada. Mais preferivelmente, a administração de anti-histamina (Hl), e/ou outras medidas terapêuticas são propor-cionadas às pacientes que sofrerem de reações à infusão.

Antieméticos e antidiarréicos, entre outros trata-mentos paliativos, são dados conforme apropriados, durante edepois do tratamento.

CpG ODN PF3512676 é administrado seqüencial ou si-multaneamente com anticorpo anti-CTLA-4 humano 11.2.1, ouuma vez, ou repetidamente, conforme determinado.

0 anticorpo anti-CTLA-4 é provido em frascos devidro transparente de 10 mL com rolha de borracha e uma ve-dação de alumínio. Cada frasco contém 5 mg/mL (com uma carganominal de 50 mg/frasco) de anticorpo anti-CTLA-4, em umasolução aquosa estéril compreendendo acetato de sódio 20mM,0,2 mg/mL de polissorbato 80, e cloreto de sódio 140mM, empH 5,5.

CpG ODN PF3512676 é provido em uma solução salina,tamponada com fosfato, isenta de conservante, estéril, emvárias concentrações para administração parenteral.

Para todas as pacientes, o status de desempenho emECOG, sinais vitais e peso corporal são avaliados pré-dose,e os sinais vitais podem ser repetidos pós-dose, conformeclinicamente indicado. Um exame físico (incluindo avaliaçãooftalmológica e sinais de auto-imunidade) é realizado no Dia1. São. obtidas amostras para o painel de hematologia (hema-tócritos, contagem de RBC, contagem de WBC, diferencial),química (Fosfatase Alcalina, cálcio, cloreto, GGT, LDH, mag-nésio, fósforo, glicose randômica, sódio, uréia, ácido úri-co), urinálise (sangue, proteína), outros (tempo de trombo-plastina parcial ativada [APTT]), tempo de protrombina (PT),painel auto-anticorpo, proteína C reativa, TSH, T3, T4, ami-lase, lipase, C3 sérico, C4, nível de Ig no soro.

0 título do anticorpo anti-CTLA-4 humano (HAHA) dalinha de base é determinada e o espécime farmacocinético(PK) é obtido pré-dose.

Os seguintes pontos finais são medidos: parâmetrosPK, HAHA, taxa de resposta e tempo para progressão. 0 tempopara progressão e sobrevivência global são calculados usandoo método de limite de produto de Kaplan-Meier.

Equivalentes

Embora a invenção tenha sido descrita com referên-cia às modalidades específicas, fica aparente que outras mo-dalidades e variações desta invenção podem ser visualizadaspor outros versados na técnica, sem se desviar do espírito eescopo reais da invenção. As reivindicações apensas são paraserem interpretadas como incluindo tais modalidades e varia-ções equivalentes.

As descrições de cada patente, pedido de patente,e publicação citados aqui são incorporadas aqui a titulo dereferência em sua totalidade.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Coley Pharmaceutical Group, Inc.Pfizer Inc.

<120> TERAPIA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER EM COMBINAÇÃO COM

ANTICORPO ANTI-CTLA-4 e OLIGODESOXINUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<130> C1037.70063w000

<140> n^o designado<141> aqui

<150> US 60/697082<151> 2005-07-07

<160> 37

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético

<400> 1

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020

aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200

gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380

<210> 2<211> 463<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45

Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Sex Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95

Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser140Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val195 200 205

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His210- 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys225 230 235 240

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu275 280 '285

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser305 310 315 320

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys LeU

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn385 390 395 400Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455 460

<210> 3<211> 167<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptídeo Sintético<400> 3

Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser1 5 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Arg Asn35 40 45

Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp50 55 60

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu65 70 75 80

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe85 90 95

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr100 105 110

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser115 120 125

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro GluPro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hia145 150 155 160

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165

<210> 4<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gl.y Met His1 5 10

<210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 5

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val15 10 15

<210> 6<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 6

Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp Tyr1 5

<210> 7

<211> 708

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético<400> 7 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga 180cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc 360caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgca.c catctgtctt catcttcccg 420ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600acgctgagca aagcagacta cgagaaacac I aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708

<210> 8

<211> 235

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético

<400> 8

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 .15

Asp Thr-Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser35 40 45

Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile85 90 95

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln TyrGly Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235

<210> 9

<211> 141

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético

<400> 9

Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu1 5 10 15

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

35 40 45

Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Selr Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala65 70 75 80

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140

<210> 10<2ll> 12<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 10

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala1 5 10

<210> 11<211> 7<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 11

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

<210> 12<211> 10<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 12

Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Trp Thr15 10<210> 13

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético

<400> 13

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agtcatggca tccactgggt ccgccaggct 120ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagaaa taaagactat 180gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtggcc 300ccactggggc cacttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 540tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600tgcaacgtag atcacaagcc cagçaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 720cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 840tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca 900gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct 960ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc 1020gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca 1080gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 1140atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc gacggctcct 1200tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct 1260catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt 1320ctccgggtaa atga 1334

<210> 14

<211> 444

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Peptídeo Sintético<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser" Ser180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu PhePro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300

Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440

<210> 15

<211> 153

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Peptídeo Sintético<400> 15

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe1 5 10 15

Ser Ser His Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu20 25 30

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Aap Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala35 40 45

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn50 55 60

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly85 90 95

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser100 105 110

•Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala115 120 125

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val130 135 140

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser145 150

<210> 16<211> 10<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 16

Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Ile His1.5 10

<210> 17<211> 15<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220> Peptideo Sintético<223>

<400> 17

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val1 5 10 15

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético

<400> 18

Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr1 5

<210> 19

<211> 645

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético

<400> 19

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgtcagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240gaggattttg cagtgtatta ctgtcaacag tatggtaggt caccattcac tttcggccct 300gggaccaaag tagatatcaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccáatcggg taactcccag 480gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Phe85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210<210> 21 <211> 146 <212> PRT <213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 21

Gln Ser Pxo Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu1 5 10 15

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln20 25 30

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser35 40 45

50 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly85 90 95

Thr Lys Val Asp Xle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile100 105 110

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val115 120 ' 125

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys130 135 140

Val Asp 145 <210> 22<211> 11<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<4Q0> 22

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala15 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético

<400> 23

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5

<210> 24<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 24

Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr15 10

<210> 25<211> 1413<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético<400> 25

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg 360ggagctaccc tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413;

<210> 26<211> 451<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser. Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met100 105 HO

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu210 215 220

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln ValTyr Xhr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser435 440 445

Pro Gly Lys450

<210> 27<211> 167<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 27

t

Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser1 5 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn35 40 45

Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp50 55 60

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu65 70 75 80Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu85 90 95

Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His165

<210> 28<211> 10<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 28

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His15 10

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético

<400> 29

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val1 5 10 15

<210> 30<211> 16<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 30Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1 5 10 15

<210> 31

<211> 714

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo Sintético

<400> 31

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacagct atttagattg gtatcagcag 180aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagtatt acagtactcc attcactttc 360ggccctggga ccaaagtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtga 714

<210> 32<211> 214<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Sintético<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala35 40

Pro Lys Leu Leu Ile45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 105 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 33<211> 139<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 33

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys1 5 10 15

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys20 25 30Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln35 40 45

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe50 55 60

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr65 70 75 80

Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys85 90 95

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro100 105 110

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu115 120 125

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val130 135

<210> 34<211> 11<21.2> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 34

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp15 10

<210> 35<211> 7<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptideo Sintético<400> 35

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência Artificial<400> 36

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr1 5

<210> 37<211> 24<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220> <223> Oligonucleotideo Sintético<400> 37

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

Claims

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficazde um anticorpo anti-CTLA-4, ou uma porção de ligação de an-tigeno deste, em combinação com uma quantidade terapeutica-mente eficaz de CpG ODN PF3512676 (SEQ ID NO:37),CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um medica-mento para o tratamento de câncer

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito CpG ODN PF3512676 (SEQID NO:37) é formulado para administração diária, dia sim dianão, duas vezes na semana, ou semanal.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia é selecionada dogrupo que consiste em terapia neoadjuvante, terapia adjuvan-te, terapia de primeira linha, terapia de segunda linha, eterapia de terceira linha.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a dita. quantidade terapeuti-camente eficaz do dito anticorpo anti-CTLA-4 humano varia decerca de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade terapeuti-camente eficaz do dito anticorpo anti-CTLA-4 varia de cercade 0,3 mg/kg a 20 mg/kg.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade terapeuti-camente eficaz do dito anticorpo anti-CTLA-4 é selecionadado grupo que consiste em pelo menos 1 mg/kg, pelo menos 3mg/kg, pelo menos 6 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg, e pelo menos 15 mg/kg.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 a 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido câncer é sele-cionado do grupo que consiste em câncer da mama, câncer dapróstata, câncer do ovário, câncer pancreático, melanoma,câncer do pulmão, leucemia mielóide aguda, carcinoma color-retal, carcinoma de célula renal, linfoma de célula T cutâ-nea, linfoma de não-Hodgkin, cânceres gástricos, câncer dacabeça e do pescoço, câncer do figado, câncer cervical, cân-cer do cérebro, e sarcoma.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1 a 6 ou 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo anti-CTLA-4,ou porção de ligação de antigeno deste, é pelo menos um an-ticorpo selecionado do grupo que consiste em:(a) um anticorpo humano tendo uma afinidade de li-gação com CTLA-4 de cerca de 10~8 ou maior, e que inibe aligação entre CTLA-4 e B7-1, e a ligação entre CTLA-4 e B7-2;(b) um anticorpo humano tendo uma seqüência de a-minoácidos que compreende pelo menos uma seqüência de CDRhumana que corresponde a uma seqüência de CDR proveniente deum anticorpo selecionado de 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1,-4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1,e IODl;(c) um anticorpo humano tendo a seqüência de ami-noácidos de cadeias leve e pesada selecionado do grupo queconsiste em 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1.,-11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, e 10D1;(d) um anticorpo ou porção de ligação de antigenodeste, que compete cruzado para ligação com CTLA-4 com pelomenos um anticorpo tendo a seqüência de aminoácidos de umanticorpo selecionado do grupo que consiste em 4.1.1, 4.8.1,-4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1,-12.3.1.1, 12.9.1.1, e 10D1; e(e) um anticorpo, ou porção de ligação de antigenodeste, que compete cruzado para ligação com CTLA-4 com pelomenos um anticorpo tendo o aminoácido de ura anticorpo sele-cionado do grupo que consiste em 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,-4.13.1, 4.14.3, 6.1.1., 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1,-12.9.1.1, e IODl.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1 a 7 ou 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um anti-corpo humano tendo a seqüência de aminoácidos de um anticor-po selecionado do grupo que consiste em 4.1.1, 4.13.1,-11.2.1, e IODl.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo, ou porçãode ligação de antigeno deste, compreende uma cadeia pesada euma cadeia leve, em que as seqüências de aminoácidos de odomínio variável de cadeia pesada da dita cadeia pesada e odomínio variável de cadeia leve da dita cadeia leve são se-lecionadas do grupo que consiste em:(a) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e aseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9;(b) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ea seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:21;(c) a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:27 e aseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:33;(d) a seqüência de aminoácidos codificada pela se-qüência de ácidos nucléicos da SEQ ID N0:1 e a seqüência deaminoácidos codificada pela seqüência de ácidos nucléicos daSEQ ID NO:7 ;(e) a seqüência de aminoácidos codificada pela se-qüência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO:13 e a seqüência deaminoácidos codificada pela seqüência de ácidos nucléicos daSEQ ID NO:19;(f) a seqüência de aminoácidos codificada pela se-qüência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO:25 e a seqüência deaminoácidos codificada pela seqüência de ácidos nucléicos daSEQ ID NO:31; e(g) a seqüência de aminoácidos de um domínio vari-ável do anticorpo IODl.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo, ou porçãode ligação de antígeno deste, é um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em:(a) um anticorpo que compreende as seqüências deaminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQID NO:β, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11 e SEQ ID N0:12;(b) um anticorpo que compreende as seqüências deaminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQID NO:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24; e(c) um anticorpo que compreende as seqüências deaminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQID NO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo, ou porçãodeste, compreende uma região variável de cadeia pesada tendoa seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:27 euma região variável de cadeia leve tendo a seqüência de ami-noácidos estabelecida na SEQ ID NO:33.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é seleciona-do do grupo que consiste em:(a) um anticorpo que compreende as seqüências deaminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 8;(b) um anticorpo que compreende as seqüências deaminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:14 e SEQ ID N0:20; e(c) um anticorpo que compreendfe as seqüências deaminoácidos estabelecidas na SEQ IND NO:26 e SEQ ID NO:32.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1 a 12 ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é formu-lado para administração 1 a 7 dias antes da administração dodito CpG ODN PF3512676 (SEQ ID NO:37).

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1 a 13 ou 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito CpG ODN PF3512 67 6(SEQ ID NO:37) é formulado para administração de cerca de uma cem dias depois do dito anticorpo.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 1 a 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito CpG ODN PF3512676(SEQ ID NO:37) é formulada para administração subcutânea.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 1 a 15 ou 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito CpG ODN PF3512 67 6(SEQ ID NO:37) é formulado para administração em uma quanti-dade de 1 mg a 50 mg por dia.

18. Composição farmacêutica para o tratamento decâncer, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CTLA-4,ou porção ligante de antigeno deste, e uma quantidade tera-peuticamente eficaz de CpG ODN PF3512676 (SEQ ID NO:37), eum veiculo farmaceuticamente aceitável.