JP4460220B2 - オリゴヌクレオチド組成物、および細胞の分化を誘導するためのオリゴヌクレオチド組成物の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた特定のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供し、ここで組成物は、多分化能細胞、白血病性細胞、リンパ腫細胞および骨髄由来細胞を含む細胞の分化を誘導するのに、ならびに白血病、リンパ腫および細胞の不完全な分化に関連した障害のような疾患を治療するのに有用である。
動物およびヒトにおける数多くの疾患および状態は、細胞の不完全な分化、または細胞の機能不全に関連している。これらの細胞の多くが骨髄に由来している。かかる疾患および状態としては、白血病、リンパ腫および非悪性血液障害(例えば、異常血色素症、鎌状赤血球疾患、脊髄形成異常症候群)、ならびに放射線および化学療法のような治療後の骨髄由来細胞の不十分な産生が挙げられるが、これらに限定されない。
J. Biol. Chem. 274:26369, 1999)、および特定の核タンパク質 (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)に選択的に結合し、癌細胞の増殖を阻害すると報告されている。合成オリゴヌクレオチドは、急性および/または慢性前骨髄球性細胞ならびに/あるいは骨髄性白血病性細胞に対して分化活性を保有することは報告されていない。CpGモチーフ(5’プリン−プリン−シトシン(C)−グアニン(G)−ピリミジン−ピリミジン3’)を有する合成ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、B細胞慢性リンパ性白血病の増殖を誘導することがわかっている(Decker et al., Blood 95:999, 2000)。Gおよび可変量のチミン(T)(これ以降、オリゴヌクレオドGTnと称する)(ここで、nは1以上7以下のTであり(Scaggiante et al., Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)、塩基数が20を超える(Morassutti et al., Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999))を含有する合成27塩基配列は、45kDaの核タンパク質への配列特異的結合により白血病性細胞の増殖を阻害すると報告されている。対照的に、GTn配列(ここで、塩基の総数は15未満である)は、白血病細胞に対して不活性であると報告されている(M
orassutti et al., Nucleosides and Nucleotides 18:1711,1999)。ストレプトリシンOを用いた10分間の可逆透過処理により細胞の細胞質に導入される配列型CGNNN(N=A、C、G、またはT)のキメラであるメチルホスホノジエステル/ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、ヒトT細胞白血病性細胞のアポトーシスを誘導する。それにもかかわらず、CGNNNオリゴヌクレオチドは、3つのCML細胞系(K562、LAMA84およびKYO1)に対して不活性であり、これらの細胞の成長および生存に対して有意な影響を示さないことが報告されている(Tidd et al., Nucleic Acid Res. 28:2242, 2000)。
本発明は、配列番号1(5’GTG3’)、配列番号2(5’GGGTGG3’)、配列番号3(5’GGGAGG3’)および配列番号4(5’CCACCC3’)からなる群から選択される、3’−OH、5’−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチド配列(これ以降、配列と称する)、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む、細胞の分化を誘導する組成物の投与を含む方法を提供することにより、これらの必要性を満たす。本発明は、成熟表現型に分化されない細胞の成長に関連した疾患を治療する方法を提供する。細胞の終末分化(terminal differentiation)は、赤血球様表現型、単球様表現型、巨核球様表現型の誘導、白血病性細胞の増殖阻害およびヘモグロビン合成の誘導からなる群から選択される1つまたは複数の応答を包含し得る。
剤を含むがこれらに限定されない他の治療様式と組み合わせて、または放射線療法と併用して投与され得る。
本発明は、本明細書中に包含される特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することでより容易に理解され得る。
組成物は、細胞の不完全な分化に関連した疾患を治療するのに使用され得る。かかる疾患としては、白血病、リンパ腫、非悪性血液障害(例えば、異常血色素症、鎌状赤血球疾患および脊髄形成異常症候群)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、汎血球減少症、貧血症、血小板減少症および白血球減少症の治療に有用であると考えられる。本発明の組成物により治療され得る他の状態としては、異常血色素症、鎌状赤血球疾患および脊髄形成異常症候群を含むがこれらに限定されない非悪性血液障害ならびにリンパ腫が挙げられる。白血病性細胞の分化を誘導し、かつ白血病性細胞の増殖を阻害する、これらの組成物の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療分野における長い間の切実な、かついまだ実現されていない必要性に対処し、動物およびヒトにとって重要な有益性を提供する。
含する。
薬学的に許容可能なキャリアを均一かつ緊密に会合させることにより調製される。薬学的に許容可能なキャリアとしては、液体キャリア、固体キャリアまたはその両方が挙げられる。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キャリアまたはその両方であり、また水性懸濁液、油エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期残留エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョンおよびナノエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリアまたはその両方であり、またウイルスベクター系、粒子、微粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、およびオリゴヌクレオチドの組成物の持続的放出を可能にする生分解性もしくは非生分解性の天然または合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョン、ミニポンプおよびポリマーは、送達が必要とされる部位の近傍に移植することができる(Brem et al., J. Neurosurg. 74:441, 1991)。固体キャリアに1または複数のオリゴヌクレオチド配列を複合体形成させるのに使用される方法としては、固体キャリアの表面への直接的吸着、固体キャリアの表面への共有結合(直接的に、あるいは結合部分を介して)、および固体キャリアを作製するのに使用されるポリマーへの共有結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意選択で、1または複数の配列(複数可)は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN)もしくはヒアルロン酸のような非イオン性ポリマーまたはイオン性ポリマーの添加により安定化することができる。
が、これらに限定されない。適用部位は、表皮上のような外部、または内部(例えば、胃潰瘍、手術フィールドまたは他の箇所)であり得る。
であり、疾患のタイプ、疾患の重篤性、疾患の部位、ならびにレシピエントの大きさ、体重および健康状態のような他の臨床的要因によって決定される。さらに、配列、および配列+治療剤投与に関する最適な量の範囲を同定するために、in vitroアッセイを任意選択的に使用することもできる。
配列の調製
ホスホジエステルヌクレオチド配列(配列番号1、2、3、および4)は、Abacus Segmented Synthesis Technologyを用いて、Sigma-Genosys(Woodlands, TX)により調製された。別記しない限り、配列は、使用直前に、高圧滅菌した脱イオン水中または薬学的に許容可能な緩衝液(例えば、生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない)中に分散させた。
細胞
芽球発症(blastic crisis)のCML患者の白血病性細胞に由来するK562細胞系を、新規分化化合物(new differentiating compounds)の治療上の潜在性をin vitroで決定するための標準モデルとして使用する(Rutherford et al., Nature, 280:164,
1979; Drexler et al. DSMZ Catalogue of Human and Animal Cell Lines, 6th ed., Braunschweig, Germany: DSMZ, 1997)。K562細胞は、American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD)から得られ、ATCCが推奨する培地中で培養した。
配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4とともに培養したK562細胞によるヘモグロビン合成
K562細胞を、100μgの配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。ヘモグロビン測定するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で遠心分離することにより2回細胞を洗浄し、10%H2O2で活性化させた0.5M酢酸中で0.2%ベンジジン(Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario)で染色した。暗所で10分間インキュベートした後に、ベンジジン陽性細胞(ヘモグロビン陽性細胞)の割合を、血球計を用いて光学顕微鏡により決定した。およそ500個の細胞を、ベンジジン陽性細胞の割合の決定に関して計数した。細胞の大きさもまた、光学顕微鏡により決定した。ヘモグロビン合成に関する対照として、ヘミン(20μg)を72時間K562細胞に添加した。ヘミンは、Sigma-Aldrich Canadaから得られた。
配列番号2または配列番号3とともに培養したK562細胞におけるRh Dのアップレギュレーション
Rh D抗原は、Rh血液型系のうちで最も重要な抗原である。ヒトでは、Rh D抗原は、赤血球においてのみ発現される(Cartron, Blood Rev. 6:199, 1994)。K562細胞を、2.5μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、または100.0μgの配列番号2または配列番号とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。細胞表面でのRh Dの発現を、フローサイトメトリーによりモニタリングした。インキュベーション後、PBSによる遠心分離によりK562細胞を2回洗浄し、4℃で30分間、フィコエリトリン(PE)結合抗Rh Dモノクローナル抗体(IBGRL research product, Bristol, Netherlands)で標識した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで2回洗浄した後、続いて細胞蛍光を測定した。FACSCalibur細胞選別機(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)でフローサイトメトリーを実施して、プログラムCELLQuest(Becton Dickinson)を用いて解析した。対照(オリゴヌクレオチド0μg)に対するRh Dレベルの増加倍数を決定した。未処置のK562細胞はこのマーカーに関して本質的に陰性であった。
配列番号2または配列番号3とともに培養したK562細胞におけるCD41a抗原のアップレギュレーション
GpIIb/IIIaとも言われるCD41a抗原は、血小板および巨核球において発現される(Gruel et al., Blood 68:488, 1986)。K562細胞を、2.5μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、または100.0μgの配列番号2、または配列番号3とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。細胞表面でのCD41aの発現を、フローサイトメトリーによりモニタリングした。インキュベーション後、PBSによる遠心分離によりK562細胞を2回洗浄し、4℃で30分間、フィコエリトリン(PE)結合抗CD41aモノクローナル抗体(BD Pharmingen, Mississauga, Ontario, Canada)で標識した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで2回洗浄した後、続いて細胞蛍光を測定した。FACSCalibur細胞選別機(Becton Dickinson)でフローサイトメトリーを実施して、プログラムCELLQuest(Becton Dickinson)を用いて解析した。対照(オリゴヌクレオチド0μg)に対するCD41aレベルの増加倍数を決定した。未処置のK562細胞はこのマーカーに関して本質的に陰性であった。
配列番号2または配列番号3とともに培養したK562細胞におけるCD14のアップレギュレーション
CD14抗原は、単球において高レベルで発現される。さらに、CD14は、濾胞間マクロファージ、細網樹状細胞およびLangherans細胞において発現される(Wright et al, Science 249:1434, 1990)。K562細胞を、2.5μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、または100.0μgの配列番号2または配列番号3とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。細胞表面でのCD14の発現を、フローサイトメトリーによりモニタリングした。インキュベーション後、PBSによる遠心分離によりK562細胞を2回洗浄し、4℃で30分間、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗CD14モノクローナル抗体(BD Pharmingen)で標識した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで2回洗浄した後、続いて細胞蛍光を測定した。FACSCalibur細胞選別機(Becton Dickinson)でフローサイトメトリーを実施して、プログラムCELLQuest(Becton Dickinson)を用いて解析した。対照(オリゴヌクレオチド0μg)に対するCD14レベルの増加倍数を決定した。未処置のK562細胞はこのマーカーに関して本質的に陰性であった。
配列番号2とともに培養したK562細胞におけるCD14+Rh D+、CD14+CD41a+およびRh D+CD41a+表現型の誘導
K562細胞を2.5μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、または100.0μgの配列番号2とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。細胞表面でのCD14、CD41aおよびRh Dの発現を、2次元フローサイトメトリーによりモニタリングした。インキュベーション後、PBSによる遠心分離によりK562細胞を2回洗浄し、4℃で30分間、FITC結合抗CD14、PE結合抗CD41aおよび/またはPE結合抗Rh Dモノクローナル抗体(BD Pharmingen)で標識した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで2回洗浄した後、細胞蛍光を測定した。FACSCalibur細胞選別機(Becton Dickinson)でフローサイトメトリーを実施して、プログラムCELLQuest(Becton Dickinson)を用いて解析した。対照(オリゴヌクレオチド0μg)に対するCD14+Rh D+、CD14+CD41a+およびRh D+CD41a+レベルの増加倍数を決定した。未処置のK562細胞はこれらのマーカーに関して本質的に陰性であった。
配列番号3とともに培養したK562細胞におけるCD14+Rh D+、CD14+CD41a+およびRh D+CD41a+表現型の誘導
K562細胞を、2.5μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、または100.0μgの配列番号3とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。細胞表面でのCD14、CD41aおよびRh Dの発現を、2次元フローサイトメトリーによりモニタリングした。イ
ンキュベーション後、PBSによる遠心分離によりK562細胞を2回洗浄し、4℃で30分間、FITC結合抗CD14、PE結合抗CD41aおよび/またはPE結合抗Rh
Dモノクローナル抗体(BD Pharmingen)で標識した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで2回洗浄した後、続いて細胞蛍光を測定した。FACSCalibur細胞選別機(Becton Dickinson)でフローサイトメトリーを実施して、プログラムCELLQuest(Becton Dickinson)を用いて解析した。対照(オリゴヌクレオチド0μg)に対するCD14+Rh D+、CD14+CD41a+およびRh D+CD41a+レベルの増加倍数を決定した。未処置のK562細胞はこのマーカーに関して本質的に陰性であった。
配列番号2および配列番号3によるK562細胞成長の阻害
K562細胞の終末分化は、それらの細胞成長を停止させると報告されている(Bianchi
et al., Biochem. Pharmacol. 60:31, 2000)。K562細胞を、1.0μg、10.0μg、または100.0μgの配列番号2または配列番号3とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、2.0×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、72時間培養した。24時間、48時間、および72時間インキュベートした後に、光学顕微鏡およびトリパンブルー色素を用いて細胞を計数した。
配列番号2によるヒト拘束(committed)赤血球前駆体の分化
グリコホリンAは、ヒト赤血球膜の主な糖タンパク質である。拘束ヒト赤血球前駆体の成熟は、細胞表面でのグリコホリンAの発現、および細胞内顆粒症(granulosity)の増加を特徴とする(Daniel and Greens, Vox Sang. S2:149, 2000; Wheater et al., Functional Histology, a text and color atlas, 2nd edition, Churchill Livingstone, U.K., 1987)。細胞表面糖タンパク質CD36により規定されるヒト拘束赤血球前駆体を、展開させたヒト臍帯血CD34+前駆体から、CD36+細胞(Clonetics, San Diego, CA,
USA)の陽性免疫選択により単離した。ヒト拘束赤血球細胞を、100.0μgの配列番号2または配列番号3とともに、6ウェル平底組織培養プレートに、1.5×105細胞/mlで1.0ml中に播種し、96時間培養した。細胞表面上でのグリコホリンAの発現、および細胞内顆粒症を、フローサイトメトリーによりモニタリングした。48時間および96時間インキュベートした後に、PBSによる遠心分離によりヒト拘束赤血球細胞を2回洗浄し、4℃で30分間、PE結合グリコホリンAモノクローナル抗体(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)で標識した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで2回洗浄した後、細胞蛍光を測定した。細胞内顆粒症は、フローサイトメーターを用いた側方光散乱(SSC)の測定により決定した。FACSCalibur (Becton Dickinson)でフローサイトメトリーを実施して、プログラムCELLQuest(Becton Dickinson)を用いて解析した。SSChiグリコホリンA+およびSSCloグリコホリンA+の細胞の割合を測定した。SSChiは、450ユニットを上回るものとして定義され、SSCloは、450ユニットを下回るものとして定義される。
重症複合免疫不全マウスにおけるヒト播種性慢性骨髄性白血病K562細胞に対する配列番号2の影響
40匹の雌重症複合免疫不全マウス(SCIDマウス)をγ源からの1.8Gyの放射線(速度:7.5Gy/h)に暴露させた。24時間全身照射した後(0日目)に、40匹の雌SCIDマウスの重さを量り、無作為に4つの群(10匹のマウス/群)を形成した。各群の平均体重は他の群と統計学的に異ならなかった(分散の解析)。マウスに、RPMI−1640培地0.5ml中の2.0×107個のK562細胞を腹腔内(ip)注射した。0.9%塩化ナトリウムUSP中に再懸濁させた配列番号2(5’GGGTGG3’)を、1日目から29日目まで(30日)、1日につきマウス1匹当たり0.01mg、0.1mg、および1mgでip投与した。媒体群には、同じスケジュールに従って、媒体(0.9%塩化ナトリウムUSP)をip注射した。処置スケジュールを以下の表に概要する。
ILS%=[(T−C)/C]×100
T/C%=[T/C]×100
マウス由来の骨髄由来細胞の分化に対する、配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4の影響
C57BL/6マウスを、10匹の5群に分ける。マウスにγ放射線を照射して、骨髄由来細胞および骨髄前駆細胞の数を減少させる。0日目に、群1のマウスに生理食塩水を与え、群2に配列番号1を与え、群3に配列番号2を与え、群4に配列番号3を与え、群5に配列番号4を与える。0.9%塩化ナトリウムUSP中に再懸濁させた配列を、1日につきマウス1匹当たり0.01mgで7日間ip投与する。
SCIDマウスにおけるCMLに対する、配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4の影響
K562細胞(2×107個の細胞)を、先に記載するように、SCIDマウス(重症複合免疫不全マウス)に接種する(Beran et al., Hematol. Pathol. 8:135, 1994)。マウスを、10匹の5群に分ける。0日目に、群1のマウスに生理食塩水を与え、群2に配列番号1を与え、群3に配列番号2を与え、群4に配列番号3を与え、群5に配列番号4を与える。0.9%塩化ナトリウムUSP中に再懸濁させた配列を、1日につきマウス1匹当たり0.01mgで30日間ip投与する。
Claims (18)
- 配列番号1、配列番号3、および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む、骨髄由来細胞の分化を誘導するための組成物。
- 前記骨髄由来細胞の分化の誘導は白血病性細胞の分化の誘導である、請求項1に記載の組成物。
- 配列番号1、配列番号3、および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む、骨髄由来細胞の不十分な分化に関連する疾患を治療するための組成物であって、動物またはヒトの骨髄由来細胞の分化を誘導するための組成物。
- 前記疾患は、白血病、リンパ腫、非悪性血液障害、異常血色素症、鎌状赤血球疾患、脊髄形成異常症候群、汎血球減少症、貧血症、血小板減少症または白血球減少症である、請求項3に記載の組成物。
- 前記疾患は白血病である、請求項3に記載の組成物。
- 配列番号2の塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチドを含む、リンパ腫、非悪性血液障害、異常血色素症、鎌状赤血球疾患、脊髄形成異常症候群、汎血球減少症、貧血症、血小板減少症または白血球減少症の疾患を治療するための組成物であって、動物またはヒトの骨髄由来細胞の分化を誘導するための組成物。
- 前記分化の誘導は、赤血球様表現型、単球様表現型、もしくは巨核球様表現型の誘導、増殖の阻害、または細胞におけるヘモグロビン合成の誘導である、請求項3〜6のいずれか
一項に記載の組成物。 - 配列番号1、配列番号3、および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む、骨髄由来細胞の不十分な分化に関連する疾患を治療するための組成物であって、動物またはヒトの多分化能細胞の分化を増加させるための組成物。
- 配列番号2の塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチドを含む、リンパ腫、非悪性血液障害、異常血色素症、鎌状赤血球疾患、脊髄形成異常症候群、汎血球減少症、貧血症、血小板減少症または白血球減少症を治療するための組成物であって、動物またはヒトの多分化能細胞の分化を増加させるための組成物。
- 前記多分化能細胞は骨髄に由来する、請求項8または9に記載の組成物。
- 前記動物またはヒトは、化学療法または放射線療法を施された、請求項8〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療剤と共に使用される、請求項8〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療剤は、化学療法剤、免疫抑制剤、分化剤、免疫療法剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、もしくはそれらの組合せ、または放射線療法である、請求項12に記載の組成物。
- 骨髄由来細胞の不十分な分化に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、配列番号1、配列番号3および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチドの使用であって、該薬剤は、動物またはヒトに投与されると、骨髄由来細胞の分化を誘導する、使用。
- 前記薬剤は、白血病、リンパ腫、非悪性血液障害、異常血色素症、鎌状赤血球疾患、脊髄形成異常症候群、汎血球減少症、貧血症、血小板減少症または白血球減少症を治療するためのものである、請求項14に記載の使用。
- 前記薬剤は、白血病を治療するためのものである、請求項15に記載の使用。
- 前記薬剤は、白血病を有する動物またはヒトに投与されると、白血病性細胞の終末分化を誘導する、請求項14〜16のいずれか一項に記載の使用。
- リンパ腫、非悪性血液障害、異常血色素症、鎌状赤血球疾患、脊髄形成異常症候群、汎血球減少症、貧血症、血小板減少症または白血球減少症を治療するための薬剤の調製における、配列番号2の塩基配列からなる、3'−OH、5'−OHが化学的に未修飾である合成ホスホジエステルヌクレオチドの使用であって、該薬剤は、動物またはヒトに投与されると、骨髄由来細胞の分化を誘導する、使用。
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