KR100913860B1

KR100913860B1 - 올리고뉴클레오타이드 조성물 및 세포 분화 유도시 이의용도

Info

Publication number: KR100913860B1
Application number: KR1020037013799A
Authority: KR
Inventors: 필리온마리오씨.; 필립스니겔씨.
Original assignee: 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2009-08-26
Also published as: IL158534A0; US20070010472A1; EP1381375A2; EP1381375B1; KR20040047749A; JP4460220B2; WO2002085340A3; CA2445071A1; US20030045493A1; DE60238393D1; NZ529160A; JP2004526775A; US7087586B2; IL158534A; MXPA03009761A; WO2002085340A2; AU2002252891B2; ATE489467T1

Abstract

본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 및 4로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 3'-OH, 5'-OH를 갖고 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 세포의 분화를 유도하거나 다능성 세포의 분화 또는 생산을 자극하는 데 유용한 조성물을 제공한다. 본 발명은 골수유래 세포를 포함하는 다능성 세포의 분화를 유도하고, 백혈병, 림프종, 비악성 혈액 질병, 예를 들면 혈색소병증, 겸상적혈구병, 골수이형성 증후군, 범혈구감소증, 빈혈, 혈소판감소증 또는 백혈구감소증을 포함하되, 이에 제한되지는 않는 세포의 불충분한 분화와 관련된 동물이나 인간의 질병을 치료하기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

올리고뉴클레오타이드, 분화, 백혈병, 골수유래 세포

Description

올리고뉴클레오타이드 조성물 및 세포 분화 유도시 이의 용도{OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND THEIR USE TO INDUCE DIFFERENTIATION OF CELLS}

본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 배합된 특정 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다능성 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포 및 골수유래 세포를 포함하는 세포의 분화를 유도하는데 유용하고, 또한, 백혈병, 림프종 및 세포의 불충분 분화와 관련된 질환을 치료하는 데 유용하다.

동물 및 인간에서의 다수 질병 및 질환은 세포의 불충분한 분화 또는 세포의 불충분성과 관련되어 있다. 이들 세포 다수는 골수 세포에서 유래한다. 이러한 질병 및 질환에는 백혈병, 림프종, 및 비악성 혈액 질환, 예를 들면 혈색소병증, 겸상적혈구병, 골수이형성 증후군 및 방사선치료 및 화학치료와 같은 치료 후의 불충분한 골수유래 세포의 생산이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

급성 전골수세포성 백혈병(APL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 전골수세포성 백혈병(CPL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)과 같은 질병에서 백혈병 세포의 분화 치료는 백혈병의 치료에 대한 대안적 전략을 제공해왔다. 분화 치료에서는, 상이한 화합물을 사용하여 미성숙 백혈병 세포를 백혈병 세포의 성장을 정지시키는 성숙 표현형으로 유도한다.

다수의 분화촉진 화합물과 또한 방사선이 백혈병 세포의 분화를 유도한다고 보고되어 왔다. 헤민, 낙산, 5-아자시티딘, 시토신 아라비노사이드, 하이드록시우레아, 구아노신, 구아닌, 레틴산, 트리미독스, 감마선 조사, 미트라마이신 및 크로모마이신이 백혈병 세포의 분화를 유도한다고 보고된 바 있다(Rutherford et al., Nature 280:164, 1979; Gambari et al., Biochem. Biophys. Acta, 886:203, 1986; Bianchi et al., Cancer Res. 46:6327, 1986; Adunyah et al., Biochem. Biophys. Acta, 1263:123, 1995; Osti et al., Heamatologica 82:395, 1997; Cortesi et al., Eur. J. Haematol. 61:295, 1998; Iyamu et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 247:759, 1998; Schwenke et al., Leuk. Res. 19:955, 1995; and Bianchi et al., Br. J. Haematol. 104:258, 1999).

합성 올리고뉴클레오타이드는 세포내에 받아들여지는 다가음이온성 서열이다(Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994). 합성 올리뉴클레오타이드는 핵산(Wagner, R. Nature: 372:333, 1994), 특이적 세포 단백질(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999), 및 특이적 핵 단백질(Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)에 선택적으로 결합하여, 암 세포의 증식을 억제한다고 보고된 바 있다. 그러나, 합성 올리고뉴클레오타이드가 급성 및/또는 만성 전골수세포성 세포 및/또는 골수성 백혈병 세포에 대해 분화능을 지니는 것으로는 보고된 바 없다. CpG 모티프(5'퓨린-퓨린-시토신(C)-구아닌(G)-피리미딘-피리미딘 3')를 갖는 합성 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 B-세포 만성 림프구 성 백혈병의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다(Decker et al., Blood, 95:999, 2000). G와 다양한 양의 티민(T)을 함유하는 합성 27개 염기 서열[이후 올리고뉴클레오타이드 GTn으로 언급]은 45 kDa 핵 단백질에 서열 특이적으로 결합함으로써 백혈병 세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되어 있는데, 상기에서, n은 ≥1이거나, ≤7인 T이고(Scaggiante et al., Eur. J. Biochem, 252:207, 1998), 염기수는 >20이다(Morassutti et al., Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999). 그러나, 염기의 총 수가 15개 미만인 GTn 서열은 백혈병 세포에 불활성인 것으로 보고되어 있다(Morassutti et al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999). 스트렙토라이신 O를 사용해 10분간 가역 투과시킴으로써 세포의 세포질에 도입된 서열형 CGNNN(N=A, C, G, 또는 T)의 키메릭 메틸포스포노디에스테르/포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드는 인간 T 세포 백혈병 세포의 세포사멸을 유도한다. 그렇지만, CGNNN 올리고뉴클레오타이드는 3개의 CML 세포주(K562, LAMA84 및 KY01)에 대해서는 불활성인 것으로 보고되어 있는데, 즉 이들 세포의 성장과 생존에 대해 그다지 영향을 미치지 않았다(Tidd et al., Nucleic Acid Res. 28:2242, 2000).

방사선 치료 또는 화학치료 후의 결핍을 포함하여, 몇 가지 질환에서 골수유래 세포 결핍이 관찰되었다. 적혈구 또는 과립구가 될 운명을 가진 세포의 불충분한 생산은 세포로의 산소 공급 감소, 면역 기능 저하, 및 응집 이상과 같은 것을 포함하되, 이에 제한되지는 않는 다양한 문제와 관련되어 있다. 값비싼 화학치료를 포함하는 각종 치료법이 적혈구 및 백혈구의 생산을 자극하기 위하여 종종 요구된다.

선행 기술에서의 분화 치료의 대부분은 임상적으로 적용하기에는 부적절한 것으로 판명되었다. 이들 치료법 중 다수는 효능이 없거나 유독성이며, 심각한 역효과를 가져서, 수여자를 쇠약하게 한다. 따라서, 골수유래 백혈병 세포와 같은 세포의 분화를 유도하는 신규 조성물 및 방법이 지속적으로 요구되어 왔다. 또한, 골수유래 세포와 같은 다능성 세포의 생산과 분화를 자극하는 신규 치료 조성물과 방법 또한 요구되어 왔다. 덧붙여, 세포의 분화를 유도하는 신규 치료 조성물도 요구된다. 세포의 불충분한 분화 또는 골수유래 세포의 불충분한 생산을 특징으로 하는 질병 및 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법 또한 요구된다.

발명의 요약

본 발명은, 서열번호 1(5'GTG3'), 서열번호 2(5'GGGTGG3'), 서열번호 3(5'GGGAGG3') 및 서열번호 4(5'CCACCC3')로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 3'-OH, 5'-OH를 갖고 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 서열(이후 서열)과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 세포의 분화를 유도하는 조성물을 투여하는 것으로 구성되는 방법을 제공함으로써, 상기의 요구사항을 수행하였다. 본 발명은 성숙 표현형으로 분화되지 않은 세포의 성장과 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 세포의 최종 분화는 적혈구형 표현형, 단핵구형 표현형, 거대핵세포형 표현형의 유도, 백혈병 세포의 증식 억제 및 헤모글로빈 합성의 유도로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 1 이상의 반응을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 세포의 불충분한 분화와 관련된 질환을 치료하는 데 사 용될 수 있다. 이러한 질병은 백혈병, 림프종, 및 비악성 혈액 질환, 예를 들어 혈색소병증, 겸상적혈구병 또는 골수이형성 증후군을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물은 범혈구감소증, 빈혈, 혈소판감소증 및 백혈구감소증의 치료에 유용한 것으로 생각된다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 다른 증상으로는 림프종 및 혈색소병증, 겸상적혈구병 및 골수이형성 증후군을 포함하되, 이제 제한되지는 않는 비악성 혈액 질환을 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 백혈병을 치료하기 위한 유효량으로 백혈병에 걸린 동물이나 인간에게 투여된다.

본 발명의 조성물은 또한 병행 치료법으로서 다른 치료법과 함께 동물이나 인간에게 투여될 수도 있다. 이들 치료법은 치료 화합물 투여 또는 방사선 치료를 포함한다. 본 발명의 조성물은 다른 치료법을 적용하기 전에, 후에, 또는 다른 치료법과 동시에 투여될 수 있다. 이러한 병행 치료는 동물이나 인간에 대한 전체 치료 효과를 증대시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 화학치료제, 분화제, 면역치료제, 항생제, 항바이러스제를 포함하되, 이에 제한되지는 않는 다른 치료 양식과 병행하여 투여될 수도 있으며, 또는 방사선 치료와 병행하여 투여될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 해당 세포가 결핍된 수여자에게 다른 치료법을 적용한 후에, 세포의 생산을 자극하기 위하여 수여자에게 투여될 수도 있다. 일 비제한적 예에는, 방사선 치료 또는 화학치료 후의 골수유래 세포의 결핍이 포함된다. 본 발명의 조성물은 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 면 역 세포 전구체와 같은 세포, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포의 생산과 분화를 자극하기 위하여 수여자에게 또한 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 골수, 간, 비장, 림프절, 흉선 및 제대혈을 포함하되, 이에 제한되지는 않는 다양한 곳에서 유래한 세포의 생산과 분화를 자극하기 위하여 수여자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 면역 세포 전구체와 같은 세포, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포의 분화에 영향을 주도록 시험관내(in vitro)에서 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 의외적이고 놀라운 백혈병 세포를 포함하는 골수유래 세포의 분화 유도능은 오랫동안 느껴왔지만 수행하지 못했던 의학계의 요구사항을 만족하는 것으로서, 동물 및 인간에게 중요한 이점을 제공한다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 서열번호 1(5'GTG3'), 서열번호 2(5'GGGTGG3'), 서열번호 3(5'GGGAGG3') 및 서열번호 4(5'CCACCC3')로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 3'-OH, 5'-OH를 갖고 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 서열(이후 서열)과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 세포의 불충분한 분화를 특징으로 하는 질병을 치료하기 위해 동물과 인간에게 투여하는 것으로 구성되는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1(5'GTG3'), 서열번호 2(5'GGGTGG3'), 서열번호 3(5'GGGAGG3') 및 서열번호 4(5'CCACCC3')로 이루어지는 그룹 중에서 선택 되는, 3'-OH, 5'-OH를 갖고 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 서열(이후 서열)과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 기원 세포 성숙과 분화를 유도하기 위해 동물과 인간에게 투여하는 것으로 구성되는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 백혈병을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 백혈병 세포의 증식을 억제하고 백혈병 세포의 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 림프종을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 비악성 혈액 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 혈색소병증을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 겸상적혈구병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 골수이형성 증후군을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 범혈구감소증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 빈혈을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 혈소판감소증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 백혈구감소증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 기원 세포의 성숙 및 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 면역 세포 전구체, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포를 포함하되, 이에 제한되지는 않는 세포의 성숙과 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 골수유래 기원 세포 성숙을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 치료제를 사용하여 치료한 뒤에 골수유래 세포 수를 늘리는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 화학치료제를 사용하여 치료한 뒤에 골수유래 세포 수를 늘리는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 방사선 치료를 사용하여 치료한 뒤에 골수유래 세포의 수를 회복시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 면역억제제를 사용하여 치료한 뒤에 골수유래 세포의 수를 회복시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 수여자에게 최소한으로 독성인 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적과, 특징 및 이점은 하기에 기술된 발명의 상세한 설명과 첨부되는 청구의 범위를 검토한 후에 명백해질 것이다.

본 발명은 본원에 포함된 하기 특정 양태의 상세한 설명을 참조로 하여 더욱 쉽게 이해될 것이다.

본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 및 4로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 3'-OH, 5'-OH를 갖고 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 서열(이후 서열)과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 세포의 분화를 유도하기 위한 유효량으로 동물 또는 인간에게 투여하는 것으로 구성되는 방법을 포함한다. 본 발명의 조성물은 세포의 불충분한 분화에 관련된 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질병에는 백혈병, 림프종, 및 비악성 혈액 질환, 예를 들어 혈색소병증, 겸상적혈구병 및 골수이형성 증후군이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물은 범혈구감소증, 빈혈, 혈소판감소증 및 백혈구감소증의 치료에도 유용한 것으로 생각된다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 다른 질환에는, 림프종 및 혈색소병증, 겸상적혈구병 및 골수이형성 증후군을 포함하되, 이에 제한되지는 않는 비악성 혈액 질환이 포함된다. 본 조성물의 의외이고도 놀라운 백혈병 세포 분화유도능과 증식억제능은 의학계에서 오랫동안 느껴왔지만 수행하지 못했던 요구사항을 만족시켰고, 동물과 인간에게 중요한 이점을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 1(5'GTG3'), 서열번호 2(5'GGGTGG3'), 서열번호 3(5'GGGAGG3') 및 서열번호 4(5'CCACCC3')로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 3'-OH, 5'-OH를 갖는 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 올리고뉴클 레오타이드 서열(이후 서열)과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 기원 세포의 성숙을 유도하기 위해 동물과 인간에게 투여하는 것으로 구성되는 방법을 포함한다. 이러한 세포는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 면역 세포 전구체, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물은 골수, 간, 비장, 림프절, 흉선 및 제대혈을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 곳에서 유래하는 세포의 생산과 분화를 자극하기 위해 동물 또는 인간에 적용될 수 있다.

본원에 사용된 "서열"이라는 용어는 3'-OH와 5'-OH를 포함하고, 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열을 말하는 것으로서, 서열번호 1(5'GTG3'), 서열번호 2(5'GGGTGG3'), 서열번호 3(5'GGGAGG3') 및 서열번호 4(5'CCACCC3')로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

본원에 사용된 "반응"이라는 용어는 하기의 비제한적 반응의 예 중 1 이상을 언급한다: 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 면역 세포 전구체, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포의 분화 유도; 적혈구형 세포, 단핵구형 세포 또는 거대핵세포형 세포의 분화 유도; 최종 분화의 유도에 기인한 세포 증식의 억제; 헤모글로빈 합성의 유도; 및 헤모글로빈 합성의 자극.

본원에 사용된 "반응 세포에 효과적인"이라는 어구는 헤모글로빈의 분화 및/또는 증식의 억제 및/또는 합성을 유도하기 위한 본 발명의 조성물의 능력을 언급 하는 것이다.

본원에 사용된 "치료제 처리", "유효량" 및 "-에 유효량으로"이라는 어구는 세포의 분화를 유도하거나, 세포의 증식을 억제하거나, 골수유래 세포와 같은 다능성 세포의 생산을 자극하기에 유효한 서열의 양을 언급하는 것이다.

본원에 사용된 용어 "질병"은 신체 건강이 손상된 상태에 관련있다.

본원에 사용된 "화학치료제"라는 어구는 동물 또는 인간의 암을 치료하는 용도로 국가 또는 주정부의 관련 기관에 의해 승인받았거나, 미국 약전에 명시되어 있거나, 일반적으로 약전에 알려져있는 모든 약품이다. 본원에 사용된 "화학치료제"라는 어구는 면역억제제를 포함한다.

본 발명의 조성물의 유효량을 동물 또는 인간에게 투여하는 것은 백혈병, 범혈구감소증, 빈혈, 혈소판감소증, 백혈구감소증, 림프종, 및 비악성 혈액 질환, 예를 들면, 혈색소병증, 겸상적혈구병, 또는 골수이형성 증후군을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 질병을 예방하거나, 치료하거나, 없애는 치료제 처리이다. 백혈병의 종류에는 APL, AML, CPL 및 CML이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물의 유효량을 동물 또는 인간에게 투여하는 것은 또한 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 면역 세포 전구체, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포를 포함하되, 이에 제한되지는 않는 기원 세포의 생산을 자극하는 치료제 처리이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 골수유래 세포의 생산과 분화를 자극하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 골수, 간, 비장, 림프절, 흉선 및 제대혈을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 곳에서 유래하는 세포의 생산과 분화를 자극하기 위해 동물이나 인간에 투여될 수 있다.

본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 베히클"이라는 용어는 임의의 액체, 고체 또는 반고체상태로서, 생리학적으로 역반응을 유발하지 않고 살아있는 동물이나 인간 조직에 접촉시켜 사용하기에 적합하면서, 해로운 방식으로 조성물중의 다른 성분과 상호작용하지 않는 물 또는 식염수, 겔, 크림, 연고(salve), 용매, 희석제, 유체 연고 베이스, 연고(oinment), 페이스트, 임플란트, 리포좀, 교질입자(micelle), 거대 교질입자 등을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 당업자에게 공지되어 있는 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 베히클도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 서열을 전달하기 위한 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드 서열은 약학적으로 허용가능한 담체와 배합되어 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 조성물로서 투여될 수 있다. 투여의 형식에는 주사, 용액, 크림, 겔, 임플란트, 펌프, 연고, 에멀션, 현탁액, 마이크로스피어, 입자, 미세입자, 나노입자, 리포좀, 페이스트, 팻치, 정제, 경피 전달 장치, 스프레이, 에어로졸, 또는 당업자에게 친숙한 기타 장치가 있고, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 약학 제형물은 익히 공지되어 있고 쉽게 입수가능한 성분을 사용하는 당업계에 알려진 방법을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 이 화합물은 일반적인 부형제, 희석제, 또는 담체를 사용하여 제형되어, 정제, 캡슐, 현탁액, 분 말 등을 형성할 수 있다. 이러한 제형물에 적합한 부형제, 희석제, 및 담체의 예는 하기를 포함한다: 충진제 및 증량제(예를 들면, 녹말, 설탕, 만니톨 및 규산 유도체); 결합제(예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로스 및 기타 셀룰로스 유도체, 알긴산염, 젤라틴, 및 폴리비닐피롤리돈); 보습제(예를 들면, 글리세롤); 분해제(예를 들면, 칼슘 카보네이트 및 나트륨 비카보네이트); 용해 지연제(예를 들면, 파라핀); 재흡수 촉진제(예를 들면, 4차 암모늄 화합물); 계면활성제(예를 들면, 세틸 알콜, 글리세롤 모노스테아레이트); 흡수성 담체(예를 들면, 카올린 및 벤토나이트); 에멀션제; 보존제; 감미료; 안정제; 착색제; 향료; 풍미료; 윤활제(예를 들면, 활석, 칼슘 및 마그네슘 스테아레이트); 고체 폴리에틸 글리콜; 및 이들의 혼합물.

제형물은 활성 성분만을, 또는 바람직하게는 특정 위치에서, 가능하게는 일정 시간 동안 방출하도록 만들어질 수 있다. 이러한 배합물은 방출 역학을 조절하는 추가의 메커니즘을 제공한다. 코팅, 인벨럽, 및 보호 매트릭스는 예를 들면, 중합체 재료 또는 왁스로 만들어질 수 있다.

1 이상의 서열과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 서열과 약학적으로 허용가능한 담체를 균일하게 잘 배합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 액체 담체, 고체 담체 또는 두 가지 모두를 포함한다. 액체 담체는 수성 담체, 비수성 담체 또는 두 가지 모두이고, 수성 현탁액, 오일 에멀션, 유중수 에멀션, 수중유중수 에멀션, 부위 특이적 에멀션, 장기체류 에멀션, 점성 에멀션, 마이크로에멀션 및 나노에멀션을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 고체 담체는 생물학적 담체, 화학적 담체 또는 두 가지 모두이고, 바이러스 벡터 시스 템, 입자, 마이크로입자, 나노입자, 마이크로스피어, 나노스피어, 미니펌프, 박테리아 세포벽 추출물 및 올리고뉴클레오타이드 조성물의 방출을 허용하는 생분해가능한 또는 생분해불가능한 천연 또는 합성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에멀션, 미니펌프 및 중합체는 전달하고자 하는 공간에 이식될 수 있다(Brem et al. J. Neurosurg. 74:441, 1991). 올리고뉴클레오타이드 서열을 고체 담체와 배합하는 방법은 고체 담체의 표면에 직접 흡착시키는 법, 고체 담체의 표면에 연결잔기를 통해서, 또는 직접 공유 커플링시키는 법, 및 고체 담체를 만드는 데 사용되는 중합체에 공유 커플링시키는 법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의로는, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올리에이트(TWEEN) 또는 히알루론산과 같은 이온 중합체 또는 비이온 중합체를 첨가하여 서열을 안정화시킬 수 있다.

바람직한 수성 담체에는 물, 식염수 및 약학적으로 허용가능한 완충액이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 비수성 담체에는 미네랄 오일 또는 디글리세리드, 트리글리세리드, 포스포리피드, 리피드, 오일 및 이들의 혼합물을 포함하되 이에 제한되지는 않는 천연 오일이 포함되지만, 이에 제한되지는 않고, 상기 오일에는 적당한 양으로 다중불포화 지방산 및 포화 지방산이 혼합되어 있다. 천연 오일의 예는 지방산이 포화이거나 불포화인 대두유, 캐놀라유, 야자유, 올리브유 및 마이글리올이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 임의로는, 부형제는 세포에 올리고뉴클레오타이드 조성물을 제공하는데 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체에 관계없이 포함될 수 있다. 이들 부형제에는 항산화제, 완충액 및 항박테리아제가 포함되나, 이에 제한되지는 않으며 현탁제나 증점제를 포함할 수도 있다.

1 이상의 서열은 단독으로, 또는 화학치료제, 분화제, 면역치료제, 항생제, 항바이러스제를 포함하되, 이에 제한되지는 않는 기타 치료 양식과, 또는 방사선 치료와 병행하여 투여될 수 있다. 분화제는 헤민, 낙산, 5-아자시티딘, 시토신 아라비노사이드, 하이드록시우레아, 구아노신, 구아닌, 레틴산, 트리미독스, 감마선조사, 미트라마이신 및 크로모마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 화학치료제는 항대사제, DNA 파괴제, 미세소관 불안정화제, 미세소관 안정화제, 액틴 탈중합제, 성장 억제제, 토포이소머라아제 억제제, HMG-CoA 억제제, 퓨린 억제제, 피리미딘 억제제, 메탈로프로테이나아제 억제제, CDK 억제제, 혈관형성 억제제, 분화 향상제 및 면역치료제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 기타 치료 양식의 투여 용량 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 조성물, 또는 이러한 조성물과 다양한 형태에 특히 적절한 본 발명의 담체와 같은 기타 물질을 포함하는 제형물의 생체내 투여 방법은 하기 유형의 투여 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 구강(예를 들면, 볼 또는 설하), 항문, 직장, 좌약으로서, 국소, 비경구, 에어로졸, 흡입, 포막내, 복막내, 정맥내, 동맥내, 경피, 피내, 피하, 근육내, 자궁내, 질, 체강으로, 암이나 내상의 위치에서 암에 직접, 기관의 강이나 실질조직에, 골수에 외과학적 투여. 상기 언급된 다양한 투여 형태에 유용한 기술은 국부 적용, 복용, 외과학적 투여, 주사, 분무, 경피 전달 장치, 삼투압 펌프, 원하는 부위에 직접 전기침착, 또는 당업자에게 친숙한 기타 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적용 부위는 표피와 같은 외부, 또는 위궤양, 외과분야와 같은 내부, 또는 다른 곳일 수 있다.

본 발명의 조성물은 크림, 겔, 용액, 현탁액, 리포좀, 입자, 또는 조성물의 배합 및 전달 분야의 당업자에게 친숙한 다른 수단의 형태로 적용된다. 치료제의 흡입 전달에는 초미세 입자 크기가 사용될 수 있다. 피하 투여용으로 적합한 제형물의 일부 예는 임플란트, 디포(depot), 침(needle), 캡슐, 및 삼투압 펌프가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 질 투여용으로 적합한 제형물의 일부 예에는 크림 및 링이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 구강 투여용으로 적합한 제형물의 일부 예에는 정제(pill), 액체, 시럽 및 현탁액이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 경피 투여용으로 적합한 제형물의 일부 예에는 겔, 크림, 페이스트, 팻치, 스프레이, 및 겔이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 피하 투여용으로 적합한 전달 메카니즘의 일부 예에는 임플란트, 디포, 침, 캡슐, 및 삼투압 펌프가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 비경구 투여용으로 적합한 제형물은 항산화제, 완충액, 항박테리아제 및 제형물을 수여자의 혈액과 등장성이도록 해주는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액 및, 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 있지만 이에 제한되지는 않는다. 즉석의 주사 용액 및 현탁액은 당업자가 통상 사용하는 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 예를 들면, 1 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 배합되는 양태는 단위 용량 형태로 통상 존재할 수 있으며, 통상의 약학 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약학적 담체 또는 부형제를 함유하는 조성물을 잘 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형물은 액체 담체와 활성 성분을 균일하게 잘 혼합함으로써 제조된다. 바람직한 단위 용량 제형물은 투여되는 성분의 1회분 또는 단위량, 또는 이들의 적절한 분획을 함유하는 것들이다. 구체적으로 상기 언급한 성분 이외에, 본 발명의 조성물을 포함하는 제형물은 당업자가 통상 사용하는 다른 제제를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

투여 용량은 투여 경로에 따라 다양하다. 이러한 용량은 동물이나 인간에게 조성물을 투여하는 당업자에게 공지되어 있다. 투여 경로에 따라서, 1회분 당 용량은 바람직하게는 약 0.001 내지 100 ㎖, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 50 ㎖, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 30 ㎖이다. 예를 들면, 근육내 주사는 약 0.1 내지 1.0 ㎖ 범위의 용적이다. 단독으로 투여된 올리고뉴클레오타이드 조성물, 또는 다른 치료제와 함께 투여된 상기 조성물은 치료할 질병의 적절한 스케쥴과 기간에 따라, 또한 수여자의 상태 및 투여 경로에 따라, 1회분 처리로, 다단계 1회분 처리로, 또는 연속적 주입으로 투여하는 것이 가능하다. 또한, 다른 치료제도 올리고뉴클레오타이드 조성물의 투여 전, 이와 동시에, 또는 이후에 투여할 수도 있다.

1회분 당 투여되는 올리고뉴클레오타이드 조성물의 양은 바람직하게는 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.001 내지 10 mg/kg 및 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 5 mg/kg이다. 바람직한 양태에서, 화학치료제와 배합된 올리고뉴클레오타이드 조성물은 백혈병에 걸린 동물이나 인간에게 화학치료제의 항종양성 효과에 시너지 효과를 내거나, 약효를 증가시키는 유효 첨가량으로 투여한다. 바람직하게는 1회분당 투여되는 치료제의 양은 약 0.001 내지 1000 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 500 mg/kg이며, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 100 mg/kg이다. 투여되는 특정 서열 및 특정 치료제, 1회분량, 투여 스케쥴 및 투여 경 로는 질병의 유형, 질병의 심각도, 질병의 위치, 및 수여자의 신장, 체중 및 신체 상태와 같은 다른 임상학적 요인에 따라 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 전문의가 결정하여야 한다. 뿐만 아니라, 서열 및 서열과 치료제 투여량 합의 최적 범위를 결정하기 위하여 시험관내(in vitro) 시험을 임의로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 면역 세포 전구체와 같은 세포, 및/또는 다능성 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프성 줄기세포, 기원 세포, 및 면역 세포 전구체에서 유래한 기타 세포의 분화를 실행하기 위하여 시험관내(in vitro)에서 투여될 수도 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 반대로, 당업자가 본원의 설명을 숙독한 뒤 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 기타 다양한 양태, 변형 및 상당어구등을 제시하는 것은 가능한 것으로 명백히 이해된다.

실시예 1

서열의 제조

포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1, 2, 3 및 4)을 아바쿠스(Abacus) 절편 합성 기술을 사용하여 시그마-제노시스(Sigma-Genosys, 텍사스주 우드랜드 소재)가 제조하였다. 달리 언급하지 않으면, 서열은 사용하기 직전에 식염수와 같은(이에 제한되지는 않는다) 약학적으로 허용되는 완충액 또는 멸균 탈이온수에 분산시켜 둔 형태이다.

실시예 2

세포

모세포가 결핍된 CML 환자의 백혈병 세포로부터 유래한 K562 세포주를 신규 분화 화합물의 치료 잠재성을 시험관내(in vitro)에서 측정하기 위한 표준 모델로서 사용하였다(Rutherford et al., Nature, 280:164, 1979; Drexler et al. DSMZ Catalogue of Human and Animal Cell Lines, 6th ed, Braunschweig, Germany: DSMZ, 1997). K562 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 수득하였으며, ATCC에 의해 권장되는 배지에서 배양하였다.

실시예 3

서열번호 1, 2, 3 및 4와 함께 배양된 K562 세포에 의한 헤모글로빈 합성

6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 x 10⁵ 세포/㎖)를 100 ㎍의 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 서열과 함께 72시간 동안 접종하였다. 헤모글로빈 확인을 위해서, 포스페이트 완충 식염수(PBS)에서 2회 원심분리하여 세포를 세척했고, 10% H₂O₂로 활성화된 0.5 M 아세트산 중의 0.2% 벤지딘(온타리오, 오크빌 소재의 시그마-알드리치 캐나다)으로 염색했다(Gambari et al., Experimentia 41: 673, 1985). 10분 동안 암소에서 배양한 후에, 벤지딘 양성 세포(헤모글로빈 양성 세포)의 백분율을 혈구계측기를 사용하여 광학 현미경으로 측정하였다. 벤지딘 양성 세포의 백분율 측정시, 대략 500개의 세포가 측정되었다. 세포 크기 또한 광학 현미경을 사용하여 측정하였다. 헤모글로빈 합성에 대한 대조군으로서 헤민(20 ㎍)을 K562 세포에 72시간 동안 첨가하였다. 헤민은 시그마 알드리치 캐나다로부터 입수한 것이었다.

K562 세포의 헤모글로빈 합성(벤지딘-양성) 및 세포 크기의 측정
서열	벤지딘-양성 세포의 %	세포 크기
없음	5.4	정상
서열번호 1	17.4	증가
서열번호 2	35.8	증가
서열번호 3	11.4	증가
서열번호 4	10.1	증가
헤민	17.8	정상

표 1에서 보이듯이, 서열번호 1, 2, 3, 및 4는 K562 세포에서, 적혈구 분화의 두 가지 척도로서, 헤모글로빈의 합성을 유도하였고, 세포 크기도 증가시켰다.

실시예 4

서열번호 2 또는 서열번호 3과 함께 배양된 K562 세포에서 RhD의 상승조절(upregulation)

Rh D 항원은 Rh 혈액군 시스템에서 가장 중요한 항원이다. 인간에서, Rh D 항원은 적혈구에서만 오로지 발현된다(Cartron, Blood Rev. 6: 199, 1994). 6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 X 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 2 또는 3의 서열 2.5, 10.0, 25.0, 50.0 또는 100.0 ㎍과 함께 72시간 동안 접종하였다. 세포 표면에서의 Rh D 발현을 유동 세포계측으로 관찰하였다. 배양 후에, K562 세포를 PBS로 2회 원심분리하여 세척한 뒤, 피코에리트린(PE)-접합된 항-Rh D 모노클로널 항체(IBGRL 리서치 제품, 네덜란드 브리스톨 소재)로 4℃에서 30분 동안 표 지했다. PBS-1% 소 혈청 알부민으로 2회 세척한 뒤, 세포 형광도를 측정하였다. 유동 세포계측은 FACSCalibur 세포 구별기(미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 벡톤 디킨슨) 상에서 수행하고, 프로그램 CELLQuest(벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. 대조군(0 ㎍ 올리고뉴클레오타이드)과 비교하여 Rh D의 증가 수준을 측정하였다. 비처리된 K562 세포는 이 마커에 대해서는 본질적으로 음성이었다.

서열번호 2 및 3으로 처리된 K562에서 대조군에 비해 나타나는 Rh D 증가 수준(배)
서열	농도(㎍/㎖)
서열	2.5	10	25	50	100
서열번호 2	1.7 x	2.5 x	4.6 x	9.8 x	15.4 x
서열번호 3	2.0 x	2.2 x	2.9 x	6.5 x	4.7 x

표 2에서 보이듯이, 서열번호 2 및 3은 K562의 세포 표면에서, 적혈구 분화의 척도인 Rh D 항원의 발현을 유도하였다.

실시예 5

서열번호 2 또는 서열번호 3과 함께 배양한 K562 세포에서의 CD41a 항원의 상승조절

CD41a 항원, 또한 GpIIb/IIIa로 불리는 항원은 혈소판 및 거대핵세포 상에서 발현되는 것이다(Gruel et al., Blood 68:488, 1986). 6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 x 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열 2.5, 10.0, 25.0, 50.0 또는 100.0 ㎍과 함께 72시간 동안 접종하였다. 세표 표면에서의 CD41a 발현을 유동 세포계측으로 관찰하였다. 배양 후에, K562 세포를 PBS를 사용하여 2회 원심분리하여 세척한 뒤, 피코에리트린(PE)-접합된 항-CD41a 모노클로널 항체(캐나다 온타리오 미시소가 소재의 BD 파밍젠)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 표지하였다. PBS-1% 소 혈청 알부민으로 2회 세척한 뒤, 세포내 형광도를 측정하였다. 유동 세포계측은 FACSCalibur 세포 구별기(벡톤 디킨슨) 상에서 수행하고, 프로그램 CELLQuest(벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. 대조군(0 ㎍ 올리고뉴클레오타이드)과 비교하여 CD41a의 증가 수준을 측정하였다. 비처리된 K562 세포는 이 마커에 대해서는 본질적으로 음성이었다.

서열번호 2 또는 3으로 처리된 K562에서 대조군에 비해 나타나는 CD41a 증가 수준(배)
서열	농도(㎍/㎖)
서열	2.5	10	25	50	100
서열번호 2	3.0 x	3.9 x	12.3 x	20.6 x	18.9 x
서열번호 3	3.2 x	3.7 x	8.3 x	13.4 x	11.7 x

표 3에서 보이듯이, 서열번호 2 및 3은 K562의 세포 표면에서, 거대핵세포 분화의 척도인 CD41a 항원의 발현을 유도하였다.

실시예 6

서열번호 2 또는 서열번호 3과 함께 배양한 K562 세포에서의 CD14의 상승조절

CD14 항원은 단핵구 상에서 고수준으로 발현되는 것이다. 또한, CD14는 여포간 대식구, 망상 가지 세포 및 일부 랑게르한스 세포에서도 발현된다(Wright et al., Science 249:1434, 1990). 6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 x 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열 2.5, 10.0, 25.0, 50.0 또는 100.0 ㎍과 함께 72시간 동안 접종하였다. 세표 표면에서의 CD14의 발현을 유동 세포계측으로 관찰하였다. 배양 후에, K562 세포를 PBS를 사용하여 2회 원심분리 하여 세척한 뒤, 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 항-CD14 모노클로널 항체(BD 파밍젠)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 표지하였다. PBS-1% 소 혈청 알부민으로 2회 세척한 뒤, 세포내 형광도를 측정하였다. 유동 세포계측은 FACSCalibur 세포 구별기(벡톤 디킨슨) 상에서 수행하고, 프로그램 CELLQuest(벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. 대조군(0 ㎍ 올리고뉴클레오타이드)과 비교하여 CD14의 증가 수준을 측정하였다. 비처리된 K562 세포는 이 마커에 대해서는 본질적으로는 음성이었다.

서열번호 2 또는 3으로 처리된 K562에서 대조군에 비해 나타나는 CD14 증가 수준(배)
서열	농도(㎍/㎖)
서열	2.5	10	25	50	100
서열번호 2	1.8 x	1.9 x	3.9 x	7.2 x	9.8 x
서열번호 3	1.9 x	2.8 x	3.8 x	7.2 x	3.7 x

표 4에서 보이듯이, 서열번호 2 및 3은 K562의 세포 표면에서, 단핵구 분화의 척도인 CD14 항원의 발현을 유도하였다.

실시예 7

서열번호 2와 함께 배양한 K562 세포에서의 CD14⁺RhD⁺, CD14⁺CD41a⁺ 및 RhD⁺CD41a⁺ 표현형의 유도

6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 x 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 2의 서열 2.5, 10.0, 25.0, 50.0 또는 100.0 ㎍과 함께 72시간 동안 접종했다. 세표 표면에서의 CD14, CD41a 및 Rh D의 발현을 2차원 유동 세포계측으로 관찰하였다. 배양 후에, K562 세포를 PBS를 사용하여 2회 원심분리하여 세척한 뒤, FITC-접합된 항-CD14, PE-접합된 항-CD41a, 및/또는 PE-접합된 항-Rh D 모노클로널 항체(BD 파밍젠)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 표지하였다. PBS-1% 소 혈청 알부민으로 2회 세척한 뒤, 세포내 형광도를 측정하였다. 유동 세포계측은 FACSCalibur 세포 구별기(벡톤 디킨슨) 상에서 수행하고, 프로그램 CELLQuest(벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. 대조군(0 ㎍ 올리고뉴클레오타이드)과 비교하여 CD14⁺RhD⁺, CD14⁺CD41a⁺ 및 RhD⁺CD41a⁺ 표현형의 증가 수준을 측정하였다. 비처리된 K562 세포는 이 마커에 대해서는 본질적으로는 음성이었다.

서열번호 2로 처리한 K562에서 대조군에 비해 나타나는 CD14⁺RhD⁺, CD14⁺CD41a⁺ 및 RhD⁺CD41a⁺ 표현형의 증가 수준(배)
표현형	농도(㎍/㎖)
표현형	2.5	10	25	50	100
CD14⁺RhD⁺	4.0 x	7.0 x	16.0 x	34.0 x	41.0 x
CD14⁺CD41a⁺	2.0 x	2.0 x	4.0 x	11.0 x	22.0 x
RhD⁺CD41a⁺	20.0 x	22.0 x	45.0 x	87.0 x	100.7 x

표 5에서 보이듯이, 서열번호 2는 K562 세포가 이형 표현형 세포로 분화하는 것을 유도하였다.

실시예 8

서열번호 3과 함께 배양한 K562 세포에서의 CD14⁺RhD⁺, CD14⁺CD41a⁺ 및 RhD⁺CD41a⁺ 표현형의 유도

6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 x 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 3의 서열 2.5, 10.0, 25.0, 50.0 또는 100.0 ㎍과 함께 72시간 동안 접종했다. 세표 표면에서의 CD14, CD41a 및 Rh D의 발현을 2차원 유동 세포계측으로 관찰하였다. 배양 후에, PBS를 사용하여 2회 원심분리하여 K562 세포를 세척한 뒤, FITC-접합된 항-CD14, PE-접합된 항-CD41a, 및/또는 PE-접합된 항-Rh D 모노클로널 항체(BD 파밍젠)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 표지하였다. PBS-1% 소 혈청 알부민으로 2회 세척한 뒤, 세포내 형광도를 측정하였다. 유동 세포계측은 FACSCalibur 세포 구별기(벡톤 디킨슨) 상에서 수행하고, 프로그램 CELLQuest(벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. 대조군(0 ㎍ 올리고뉴클레오타이드)과 비교하여 CD14⁺RhD⁺, CD14⁺CD41a⁺ 및 RhD⁺CD41a⁺ 표현형의 증가 수준을 측정하였다. 비처리된 K562 세포는 이 마커에 대해서는 본질적으로는 음성이었다.

서열번호 3으로 처리한 K562에서 대조군에 비해 나타나는 CD14⁺RhD⁺, CD14⁺CD41a⁺ 및 RhD⁺CD41a⁺ 표현형의 증가 수준(배)
표현형	농도(㎍/㎖)
표현형	2.5	10	25	50	100
CD14⁺RhD⁺	7.0 x	8.0 x	9.0 x	11.0 x	10.0 x
CD14⁺CD41a⁺	2.0 x	3.0 x	4.0 x	4.0 x	3.0 x
RhD⁺CD41a⁺	6.0 x	4.0 x	7.0 x	29.0 x	31.0 x

표 6에서 보이듯이, 서열번호 3은 K562 세포가 이형 표현형의 세포로 분화하는 것을 유도하였다.

실시예 9

서열번호 2와 서열번호 3에 의한 K562 세포의 성장 억제

K562 세포의 최종 분화는 세포 성장을 정지시키는 것으로 보고되어 있다(Bianchi et al., Biochem. Pharmacol. 60:31, 2000). 6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 K562 세포 1.0 ㎖(2.0 x 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 2 또는 3의 서열 1.0, 10.0 또는 100.0 ㎍과 함께 72시간 동안 접종했다. 광학 현미경과 트립판 블루 염색약을 사용하여 배양 24, 48 및 72시간 후에 세포를 계수하였다.

서열번호 2 또는 서열번호 3으로 처리한 뒤 K562 세포의 수(x 10⁵)
시간	올리고뉴클레오타이드 비처리	서열번호 2			서열번호 3
시간	올리고뉴클레오타이드 비처리	1.0 ㎍/㎖	10.0 ㎍/㎖	100.0 ㎍/㎖	1.0 ㎍/㎖	10.0 ㎍/㎖	100.0 ㎍/㎖
24	3.6	3.1	2.5	2.6	3.3	2.7	3.2
48	7.4	7.8	6.4	2.2	8.4	7.1	3.4
72	11.5	11.3	8.5	1.7	11.2	8.4	3.3

표 7에서 보이듯이, 서열번호 2 및 서열번호 3은 용량 의존 방식으로 K562 세포의 세포 성장을 억제하였다. 트립판 블루 배제 분석은, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로의 K562 세포 처리가 트립판 블루 염색약을 K562 세포에 도입시키지 않았기 때문에 유독성이지 않음을 증명하였다.

실시예 10

서열번호 2에 의한 인간 수임 적혈구 전구체의 분화

글리코포린 A는 인간 적혈구 막의 주요 당단백질이다. 수임 인간 적혈구 전구체의 성숙은 세포 표면에서 글리코포린 A가 발현되는 것과, 세포내 과립도가 증가하는 것을 특징으로 한다(Daniel and Greens, Vox Sang. S2:149, 2000; Wheater et al., Functional Histology, a text and color atlas, 2nd edition, Churchill Livingstone, U.K., 1987). 세포 표면 당단백질 CD36에 의해 정의되는 인간 수임 적혈구 전구체를 CD36+ 세포의 양성 면역선택에 의해 인간 제대혈 CD34+ 기원 세포 증식물로부터 분리하였다(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 클로네틱스). 6-웰 편평바닥 조직 배양 플레이트에 인간 수임 적혈구 세포 1.0 ㎖(1.5 x 10⁵ 세포/㎖)를 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열 100.0 ㎍과 함께 96시간 동안 접종하였다. 세포 표면에서의 글리코포린 A의 발현과 세포내 과립도를 유동 세포계측을 통해 관찰하였다. 배양 48시간 및 96시간 후에, 인간 수임 적혈구 세포를 PBS를 사용하여 2회 원심분리로 세척하고, PE-접합된 글리코포린 A 모노클로널 항체(미국 캘리포니아주, 버링감 소재의 칼택 래보레이토리스)를 사용하여 4℃에서 30분간 표지하였다. PBS-1% 소 혈청 알부민으로 2회 세척한 뒤, 세포내 형광도를 측정하였다. 세포내 과립도를 유동 세포계측을 사용하여 측광 산란기(SSC)에 의해 측정하였다. 유동 세포계측은 FACSCalibur(벡톤 디킨슨) 상에서 수행하고, 프로그램 CELLQuest(벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. SSC^hi 글리코포린 A⁺ 및 SSC^lo 글리코포린 A⁺인 세포 %를 측정하였다. SSC^hi는 >450 유닛으로, SSC^lo는 <450 유닛으로서 정의되었다.

서열번호 2 또는 서열번호 3으로 처리한 뒤 SSC^hi 글리코포린 A⁺ 및 SSC^lo 글리코포린 A⁺인 인간 수임 적혈구 전구체 세포의 %
	비처리		서열번호 2		서열번호 3
	48시간	96시간	48시간	96시간	48시간	96시간
SSC^hi 글리코포린 A⁺	0.9	1.2	8.0	12.8	0.6	0.4
SSC^lo 글리코포린 A⁺	9.1	3.8	9.3	18.1	7.4	2.2

표 8에서 보이듯이, 서열번호 2는 인간 수임 적혈구 전구체 세포의 SSC^hi 글리코포린 A⁺ 및 SSC^lo 글리코포린 A⁺ 세포로의 분화를 유도하였다.

실시예 11

중증혼합면역결핍증 마우스에서 인간 전이형 만성 골수성 백혈병 K562 세포에 대한 서열번호 2의 효과

40마리의 암컷 중증혼합면역결핍증 마우스(SCID 마우스)를 γ원으로부터의 1.8 Gy의 방사선(속도: 7.5 Gy/h)에 노출시켰다. 전신에 쪼인 24시간 후에(0일째), 40마리의 암컷 SCID 마우스의 체중을 달고, 무작위로 4 그룹으로 나누었다(한 그룹당 10마리의 마우스). 각 그룹의 평균 체중은 다른 그룹과 통계학적으로 다르지 않았다(분산의 분석). 마우스에게 0.5 ㎖ RPMI-1640 배지 중의 2.0 x 10⁷ K562 세포를 복강내(ip) 주사하였다. 0.9% 나트륨 클로라이드 USP에 재현탁시킨 서열번호 2(5'GGGTGG3')를 1 내지 29일째까지(30일 동안) 1일에 마우스 1마리당 0.01, 0.1 및 1 mg씩 복강내 주사하였다. 베히클 그룹에는 베히클(0.9% 나트륨 클로라이드 USP)을 주사한 뒤, 상기와 동일하게 처리하였다. 처리 스케쥴을 하기 표에 요약하였다.

그룹	처리	그룹당 마우스 (마리)	투여 경로	주사량당 1회분 (mg/마우스/주사량)	용량/주사 (㎖)	처리 스케쥴
1	베히클	10	복강내	0	0.250	Q1DX30
2	서열번호 2	10	복강내	0.01	0.250	Q1DX30
3	서열번호 2	10	복강내	0.1	0.250	Q1DX30
4	서열번호 2	10	복강내	1	0.250	Q1DX30

실험을 마우스가 사망할 때인, 120일째에 중단하였다. 생존율은 주당 2회씩 기록하였다.

대조군과 비교하여 백분율(T/C%)과, 생존 증가률(ILS%)로서 표현되는 시험 결과를 확인하였다. 이들은 시험된 화합물 효능의 척도이다. 생존 시스템은 T/C 백분율이 125를 넘고, ILS 백분율이 25를 넘을 때 성공의 정도를 나타낸다. T는 약물로 처리한 동물의 생존 기간의 중앙값이고, C는 대조 동물의 생존 기간의 중앙값이다. T/C% 및 ILS%를 하기와 같이 표현하였다.

ILS%= [(T-C)/C]x 100

T/C%=[T/C]x 100

StatView^R(미국 버클리 소재의 아바쿠스 컨셉트)을 사용하여 통계 분석을 실시하였다. 치료 효능의 통계 분석은 Bonferroni/Dunn(ANOVA 비교) 시험을 사용하여 실시하였다.

서열번호 2로 처리한 인간 전이성 만성 골수성 K562 백혈병에 걸린 SCID 마우스의 생존기간
	처리
	1 그룹: 베히클	2 그룹: 0.01 mg 서열번호 2	3 그룹: 0.1 mg 서열번호 2	4 그룹: 1 mg 서열번호 2
	생존기간(일)	생존기간(일)	생존기간(일)	생존기간(일)
	38	120	85	49
	54	57	34	120
	46	54	57	41
	54	75	75	57
	34	120	34	57
	38	120	31	99
	34	120	64	61
	54	61	54	61
	75	61	64	46
	54	34	41	46
	34	38	34	49
평균±표준편차	48.6 ±12.2	78.2 ±34.9	52.1±18.7	62.4±24.6
중앙값	46	61	41	49
ILS%	-	32.6	-12.2	6.5
T/C%	-	132.6	89.1	106.5

표 10에서 보이듯이, 서열번호 2는 0.01 mg/마우스/1일에서, 인간 전이형 만성 골수성 K562 백혈병에 걸린 SCID 마우스의 생존 기간을 상당히 연장시켰다(p<0.05). 120일 후에, 서열번호 2를 0.01 mg/마우스/1일로 처리한 11마리 중 4마리는 생존한 반면, 11마리의 비처리 마우스는 한 마리도 살아남지 않았다.

실시예 12

마우스의 골수유래 세포의 분화에 대한 서열번호 1, 2, 3 및 4의 영향

C57BL/6 마우스를 10마리씩 5개 그룹으로 나누었다. 마우스에 감마선을 조사하여 골수유래 세포와 골수 전구체 세포의 수를 감소시켰다. 0일째에, 1 그룹 마우스에는 식염수를, 2 그룹 마우스에는 서열번호 1을, 3 그룹 마우스에는 서열번호 2 를, 4 그룹 마우스에는 서열번호 3을, 5 그룹 마우스에는 서열번호 4를 주사하였다. 0.9% 나트륨 클로라이드 USP에 재현탁시킨 서열을 실험 7일 동안 1일당 마우스 한마리당 0.01 mg씩 복강내 주사하였다.

처리 7일 후에, 마우스를 희생시켰다. 말초혈액과 골수에 있는 세포를 계수하고, 이들의 표현형을 유동 세포계측으로 측정하였다. 헤모글로빈 수준을 또한 측정하였다. 2, 3, 4 및 5 그룹의 마우스는 1 그룹의 마우스보다 훨씬 더 골수유래 세포가 많았다. 2, 3, 4 및 5 그룹의 마우스는 1 그룹의 마우스보다 성숙형 골수유래 세포가 더 많았다. 헤모글로빈의 수준은 1 그룹의 마우스보다 2, 3, 4 그룹의 마우스에서 훨씬 더 높았다.

실시예 13

SCID 마우스에서 CML에 대한 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 영향

K562 세포(2 x 10⁷ 세포)를 SCID 마우스(중증혼합면역결핍증 마우스)에게 전술한 바와 같이 주사하였다(Beran et al., Hematol. Pathol. 8:135, 1994). 마우스를 10마리씩 5개 그룹으로 나누었다. 0일째에, 1 그룹 마우스에는 식염수를, 2 그룹 마우스에는 서열번호 1을, 3 그룹 마우스에는 서열번호 2를, 4 그룹 마우스에는 서열번호 3을, 5 그룹 마우스에는 서열번호 4를 주사하였다. 0.9% 나트륨 클로라이드 USP에 재현탁시킨 서열을 30일 동안 1일당 1마리마다 0.01 mg씩 복강내 투여하였다.

30일 후에, 마우스를 희생시켰다. 백혈병 전이, 백혈병 세포 표현형 및 헤모 글로빈 수치를 분석하였다. 1 그룹의 마우스는 백혈병 세포가 가장 많고 전이도 가장 많이 되었다. 2, 3, 4 및 5 그룹의 마우스는 1 그룹보다 백혈병 세포 수치도 낮고 전이도 덜 되었다. 2, 3, 4 및 5 그룹의 마우스는 1 그룹의 마우스보다 훨씬 많은 수의 분화된 K562 세포를 보였다. 2, 3, 4 및 5 그룹의 마우스는 1 그룹의 마우스보다 헤모글로빈 합성이 더욱 활발했다.

상기에 제시된 모든 특허, 공개문서 및 요약은 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다. 전술한 것은 단지 본 발명의 바람직한 양태에만 관련이 있는 것이며, 하기 청구의 범위에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 벗어남이 없이 다양한 변형 또는 변경이 일어날 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

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i) 세포의 분화를 유도하기에 유효한 양의, 서열번호 1(5'GTG3'), 서열번호 2(5'GGGTGG3'), 서열번호 3(5'GGGAGG3') 및 서열번호 4(5'CCACCC3')로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 3'-OH, 5'-OH를 갖고 화학적으로 변형되지 않은 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열, 및

ii) 약학적으로 허용가능한 담체

를 포함하는,

비악성 혈액 질환, 혈색소병증, 겸상적혈구병, 골수이형성 증후군, 범혈구감소증, 빈혈, 혈소판감소증, 및 백혈구감소증으로 이루어지는 군으로 선택되는 질병 치료용 약학 조성물.
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제 3 항에 있어서, 분화 유도가 적혈구형 표현형, 단핵구형 표현형, 거대핵세포형 표현형의 유도, 증식 억제 또는 세포내 헤모글로빈 합성 유도인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서, 세포가 다능성 세포(pluripotent cells)인 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 다능성 세포가 골수로부터 유래한 약학 조성물.
삭제
제 3 항에 있어서, 화학치료 약물, 면역억제제, 분화제, 면역치료제, 항생제, 항바이러스제, 및 이들의 배합물로 이루어지는 치료제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 약학 조성물.
제 10 항에 있어서, 질병의 치료시 방사선 치료와 조합되어 사용되는 약학 조성물.
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제 7 항에 있어서, 다능성 세포가 골수, 간, 비장, 림프절, 흉선 또는 제대혈로부터 유래한 약학 조성물.