JP2004528851A - 上皮成長因子受容体のアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照として全体が本明細書に組み入れられる2001年5月7日に出願された米国仮特許出願第60/289,055号、および2001年5月7日に出願された米国特許仮出願第60/289,149号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、細胞生物学、医学、および癌の分野に関する。具体的には本発明は、アンチセンス法による細胞増殖の制御に関する。
【０００３】
先行技術の説明
ペプチド成長因子は、正常細胞および癌細胞の増殖ならびに分化の重要な制御因子である（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。トランスフォーミング成長因子α（TGFα）などの上皮成長因子（EGF）遺伝子ファミリーの成長因子は、乳房、結腸、卵巣、腎臓、前立腺、および肺を含むヒト上皮の癌に対する自己分泌型および傍分泌型の分裂促進因子として作用する（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。TGFαは、上皮成長因子受容体（EGFR）の細胞外ドメインに結合し、その細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化する（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。TGFαおよび/またはEGFRの発現の増加は、ヒトの癌の大部分で検出されており、予後不良と関連する（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。したがってTGFα-EGFRの自己分泌経路は、治療の標的になるのではないかと提案されている（Mendelsohn （1997） J.Natl.Cancer Inst. 89：341-343、Mendelsohn （1997） Clin.Cancer Res. 3：2703-2707）。
【０００４】
癌細胞におけるEGFRの活性化および/または機能を阻害するために、さまざまな薬理学的および生物学的な方法が開発されている。例えば、毒素を融合させたTGFαまたはEGFを含む組換えタンパク質である多様な抗EGFRの阻止モノクローナル抗体（MAb）、およびEGFRチロシンキナーゼ阻害物質が作製されており、その生物学的、および潜在的な治療特性が調べられている（Fanら （1998） Curr.Opin.Oncol. 10：67-73）。キメラヒト-マウスIgG1MAbであるMAb C225は、癌患者を対象に第II〜III相の臨床試験が行われている（Fanら、前掲）。リガンドによって誘導される、EGFRチロシンキナーゼの活性化を選択的に抑制する化合物（ZD1839などのEGFRチロシンキナーゼ阻害物質）（Ciardielloら、（2000） Clin.Cancer Res. 6（5）：2053-2063）も癌患者を対象に臨床評価が現在行われている（Noonberg （2000） Drugs 59：753-67）。過去の研究で、MAb C225などの薬剤がEGFRの活性化に干渉し、白金誘導体、タキサン化合物、トポイソメラーゼIおよびIIの阻害物質（Mendelsohn （1997） J.Natl.Cancer Inst.、89：341-343；Mendelsohn （1997） Clin.Cancer Res. 3：2703-2707；Ciardielloら （1999） Clin.Cancer Res. 5：909-916）、またはEGFRチロシンキナーゼ阻害物質（Ciardielloら （2000）、前掲）を含む細胞毒性薬の抗腫瘍活性を強化することがわかっている。
【０００５】
しかし残念ながら、このような方法はいずれも有効な治療法とはなっていない。したがって、癌細胞のEGFR活性を抑制する新しい方法が求められている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、癌細胞のEGFR活性を抑制する新しい方法を提供する。
【０００７】
EGFRに特異的なmRNAに対するオリゴヌクレオチドは、EGFRの発現を低下させ、またインビトロにおける癌細胞の成長を抑制することがわかっている。またハイブリッドDNA/RNA混合型バックボーンオリゴヌクレオチド（MBO）として修飾されたオリゴヌクレオチドが、機能性EGFRを発現する癌細胞系列で、EGFR mRNA配列を特異的に標的とし、EGFRの合成を抑制し、細胞の成長を抑制し、またアポトーシス（プログラム細胞死）を促進することもわかっている。さらに、上記のEGFRアンチセンスMBOを、ヒトの上皮悪性腫瘍の内科的治療に現在使用されている、さまざまな既知の細胞毒性物質を併用する処置により、癌細胞に対する成長抑制作用が強化されることが認められている。以上のことおよび他の認められていることから、EGFR核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド、およびその使用法を含む本発明が得られた。
【０００８】
具体的には、1つの局面で本発明は、245〜1117位、2407〜3201位、3786〜4102位、および4574〜4633位からなる群より選択される、EGFR mRNA領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、2407〜2476位、4040〜4102位、および4574〜4633位からなる群より選択される、EGFR mRNA領域に相補的である。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは約12〜30ヌクレオチドである。好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは約15〜約25ヌクレオチドである。最も好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドの長さは約20ヌクレオチドである。
【００１０】
好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。ある態様では、このようなヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合である。
【００１１】
好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個つの2'-修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも1個の2'-修飾リボヌクレオチドを含む。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも3個の2'-修飾リボヌクレオチド、または少なくとも4個の2'-修飾リボヌクレオチドを含む。ある態様では、2'-修飾リボヌクレオチドは2'-アルキルリボヌクレオチドである。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも3個の連続したデオキシリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートを含む。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも4個の連続したデオキシリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートを含む。
【００１２】
特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、および22からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
別の局面では、本発明は、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する細胞におけるEGFR合成を抑制する方法も提供する。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する悪性細胞の成長を抑制する方法を提供する。いくつかの態様では、癌細胞は、結腸癌細胞、乳癌細胞、または卵巣癌細胞である。
【００１５】
別の局面では、本発明は、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する癌細胞のアポトーシスを促進する方法を提供する。
【００１６】
さらに別の局面では、本発明は、上述のように癌細胞に本発明のオリゴヌクレオチドおよび細胞毒性物質を接触させる段階を含む、癌細胞に対する細胞毒性物質の成長抑制作用を強化する方法を提供する。特定の態様では、細胞毒性物質は、シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、トポテカン（topotecan）、カンプトサール（camptosar）、およびタキソテール（taxotere）からなる群より選択される。いくつかの態様では、癌細胞は、結腸癌、乳癌、または卵巣癌の細胞である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書で言及される公開特許および科学論文は、当業者が利用可能な知見である。本明細書で引用された米国公開特許、許可された出願、公開された外国特許出願、および参考文献（GenBankデータベース配列を含む）は、それぞれが具体的かつ個別に参照として組み入れられるように示されているのと同程度に参照として本明細書に組み入れられる。これらの出願と特許開示の間に矛盾点がある場合は、本開示を優先する。
【００１８】
本発明は、細胞生物学、医学、および癌の分野に関する。具体的には本発明は、アンチセンス法による細胞増殖の制御に関する。
【００１９】
EGFRに特異的なmRNAに対するオリゴヌクレオチドは、EGFRの発現を低下させること、およびインビトロにおける癌細胞の成長を抑制することがわかっている。加えて、ハイブリッドDNA/RNA混合型バックボーンオリゴヌクレオチド（MBO）として修飾されたオリゴヌクレオチドが、機能性EGFRを発現する癌細胞系列で、EGFR mRNA配列を特異的に標的とし、EGFRの合成を抑制し、細胞の成長を抑制し、アポトーシス（プログラム細胞死）を促進することもわかっている。さらに、上記のEGFRアンチセンスMBOを、ヒトの上皮悪性腫瘍の内科的治療に現在使用されている、さまざまな既知の細胞毒性薬を併用する処置により、癌細胞に対する成長抑制作用が強化されることが認められている。以上のことおよび他の認められていることから、EGFR核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド、およびその使用法を含む本発明が得られた。
【００２０】
本発明の目的上、「オリゴヌクレオチド」という表現は、2個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはこれらの任意の組み合わせの重合体を含む。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは約6〜約50ヌクレオシド残基であり、より好ましくは約12〜約30ヌクレオシド残基であり、また最も好ましくは約15〜約25ヌクレオシド残基である。ヌクレオシド残基は、任意の数多い既知のヌクレオシド間結合で相互に結合させることができる。このようなヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミダイト、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセタミデート（acetamidate）、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンのヌクレオチド間結合を含むがこれらに限定されない。このようなヌクレオシド間結合は、好ましくはホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合、もしくはホスホラミデート結合、またはこれらの組み合わせである。好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合を含む。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という表現は、PNAやLNAなどの重合体も含み、また2'-O-置換リボヌクレオチドを含む核酸分子を含む場合もある。本発明の目的上、「2'-O-置換」という表現は、ペントース部分の2'位と、1-6飽和炭素原子または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基との置換、または2-6炭素原子を有する-O-アリール基もしくはアリル基との置換を意味する（このようなアルキル基、アリール基、またはアリル基は置換されない場合があるほか、例えばハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル（carbalkoxyl）基、またはアミノ基と置換される場合がある。または、このような2'位における置換はヒドロキシ基（リボヌクレオシドとなる）、アミノ基、またはハロ基との間で生じるが2'-H基とは生じない）。本明細書で用いる「アルキル」という表現は、1個、2個、または3個の置換基と任意選択で置換される、1〜12個の炭素原子、好ましくは1〜8個の炭素原子、またより好ましくは1〜6個の炭素原子を有する直鎖状および分枝状の鎖の脂肪族基を意味する。特に明記しない限り、「アルキル」という表現は、飽和、不飽和、および部分的に不飽和の脂肪族基を含むことを意味する。不飽和基を特に示す場合は、「アルケニル」または「アルキニル」という表現を用いる。飽和基のみを示す場合は、「飽和アルキル」という表現を用いる。好ましい飽和アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、およびヘキシルを含むがこれらに限定されない。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」という表現は、化学的に修飾された塩基、または糖を有する重合体、および/または親油性基、インターカレート（挿入）剤、ジアミン、およびアダマンタン（adamantane）を含むがこれらに限定されない付加的な置換基を有する重合体も含む。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、EGFRをコードする核酸に相補的である。本発明の目的上、「相補的」という表現は、生理的条件でゲノム領域、遺伝子、またはそのRNA転写物とハイブリッドを形成する能力を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間における塩基特異的な水素結合の結果であり、好ましくはワトソン-クリック塩基対、またはフーグスティン塩基対が生じることであるが、他の様式の水素結合、ならびに塩基スタッキングがハイブリッドを形成する場合がある。実際問題としては、このようなハイブリダイゼーションは、転写もしくは翻訳（または両方）のレベルで生じる場合がある、特異的な遺伝子発現の抑制の観察から推測することができる。有用なオリゴヌクレオチドには、キメラオリゴヌクレオチド、およびハイブリッドオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２４】
本発明の目的上、「キメラオリゴヌクレオチド」は、複数の型のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなキメラオリゴヌクレオチドの1つの好ましい態様は、ヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびホスホジエステルを含むオリゴヌクレオチド、好ましくは約2〜約12ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。このような有用な本発明のオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート連結領域、およびアルキルホスホノチオエート領域を有する（例えば米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照）。好ましくは、有用なキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、もしくはホスホロチオエート結合、またはこれらの組み合わせである、少なくとも1つ、またはより好ましくは少なくとも3つもしくは4つの連続したヌクレオシド間結合を含む。米国特許第5,652,356号、第5,973,136号、および第5,773,601号に記載されているインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドも対象となる。
【００２５】
本発明の目的上、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、複数の型のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの1つの好ましい態様は、好ましくは約2〜約12か所の2'-O-置換ヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含むリボヌクレオチド領域、または2'-O-置換リボヌクレオチド領域を含む。好ましくは、このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも3個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、またはこれらの組み合わせを含む（例えばMetelevおよびAgrawal、米国特許第5,652,355号および第5,652,356号を参照）。米国特許第5,652,356号に記載されているインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドも対象となる。
【００２６】
いくつかの好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、中央部または末端部が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジエステル、および修飾オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのセグメントなどの修飾ヌクレオチド間結合が適切に配置されたセグメントで修飾されたヌクレオシドを含む混合型バックボーンオリゴヌクレオチド（MBO）である（Agrawal （1997）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA） 94：2620〜2625；Agrawal （1999） Biochem.Biophys.Acta 1489：53-67）。
【００２７】
上述したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、EGFRの少なくとも一部をコードするRNA、DNA、cDNA、または2本鎖DNA、また好ましくはmRNAの任意の領域に相補的である。EGFR mRNAの配列は既知である（GenBankアクセッション番号M34309）。本発明のオリゴヌクレオチドは、AgrawalおよびKandimalla（2000） Molecular Medicine Today 6：72-81に記載された選択基準を元に設計された。
【００２８】
本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列、および化学構造は、オリゴヌクレオチドが標的EGFR配列の発現を調節する能力を保持する限りにおいては多様である。これは、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性を有するか否かを、既知のEGFR-特異的オリゴヌクレオチドによる作用を受けることがわかっている癌細胞培養物に含まれるEGFR mRNAの量を定量するか、またはEGFR量を定量して検討することで容易に決定できる。また、オリゴヌクレオチドが、インビトロまたはインビボにおける細胞成長アッセイ法で癌細胞の成長を抑制する能力（詳細を本明細書に記載）を検討することもできる。本明細書で使用する「発現を抑制する」という表現、および類似の表現は、任意の1つもしくは複数の上記パラメータを含むことを意図している。
【００２９】
EGFR mRNAのさまざまな領域に対するオリゴヌクレオチドの22種類の非制限的な例を表1に示し、配列番号：1〜22および25〜28として配列表に記載する。
【００３０】
（表1）
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、既知の方法、例えば適切な固相支持体上でH-ホスホネート化学法、ホスホラミダイト化学法、またはH-ホスホネート化学法とホスホラミダイト化学法の組み合わせ（すなわち数サイクルのH-ホスホネート化学法と数サイクルのホスホラミダイト化学法）を含む既知の任意の化学的方法によって簡便に合成することができる。適切な固相支持体には、多孔性球状ガラスビーズ（controlled-pore glass；CPG）などの、固相オリゴヌクレオチド合成に使用される任意の標準的な固相支持体などがある（例えばPon （1993） Meth.Molec.Biol. 20：465-496を参照）。また、このような修飾オリゴヌクレオチドの調製は当技術分野で周知である（総説としてAgrawal （1992） Trends Biotechnol. 10：152-158；Agrawalら （1995） Curr.Opin.Biotechnol. 6：12〜19）。例えばヌクレオチドは、ホスホラミデート化学法、H-ホスホネート化学法、またはメチルホスホラミデート化学法などの当技術分野で周知の手法で共有結合的に連結することができる。オリゴマーのホスホロチオエート類似体は、メトキシホスホラミダイト化学法（例えばAgrawalら （1988） Proc.Natl.Acad.Sci. （USA） 85：7079-7083を参照）、またはH-ホスホネート化学法（Froehler （1986） Tetrahedron Lett. 27：5575-5578）（例えば米国特許第5,149,798号を参照）などの当技術分野で周知の方法で調製することができる。ヒトのEGFR mRNAのさまざまな領域を標的とするホスホロチオエート、または混合型バックボーン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、Agrawal（1997） Proc.Natl.Acad.Sci. （USA） 94：2620〜2625に記載された手順で実施することができる。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、正常に、または通常EGFRを発現している細胞におけるEGFR遺伝子の発現の抑制、ならびに癌細胞に対する酸化剤および細胞毒性物質の毒性作用の強化または促進を含む、さまざまな目的に有用である。これらは、実験的な細胞培養系または動物系におけるEGFR関連タンパク質の分裂促進活性を抑制するために、またこのような特異的なEGFR活性を抑制する作用を評価するために使用することで、EGFRタンパク質の生理機能のプローブとして使用することもできる。これは、本発明のEGFRタンパク質の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または動物に投与して、何らかの表現型効果を観察することで達成される。この場合、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは従来の「遺伝子ノックアウト」法である。というのは、使用が容易なためであり、また特異的なEGFR関連タンパク質の活性の抑制に使用できるためである。
【００３３】
また、本発明のEGFRに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖抑制能力は、非同期的に成長している細胞集団を同期させることができる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、インビトロで成長する非悪性のEGFR発現細胞の集団を細胞周期のG1期またはG2期で停止させることができる。このような同期によって例えば、細胞周期のG1期またはG2期で発現される遺伝子および/または遺伝子産物の同定が可能となる。培養細胞のこのような同期は、トランスフェクション効率が変動し、またトランスフェクション対象細胞の細胞周期の特定の相に依存する新しいトランスフェクションプロトコルの効率を検討する上でも有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することで、細胞集団の同期が可能となることによってトランスフェクション効率の上昇が検出しやすくなる。
【００３４】
本発明のEGFRに特異的なオリゴヌクレオチドは、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する細胞におけるEGFRの合成を抑制する方法を含む、本発明のさまざまな方法に有用である。これらを用いて、機能性EGFRを発現する悪性細胞または癌細胞の成長を抑制するために、または機能性EGFRを発現する癌細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進することもできる。
【００３５】
「悪性細胞」または「癌細胞」という表現は、異常な細胞成長を示す細胞を示すために用いる。好ましくは、悪性細胞の異常な細胞成長は、細胞成長の亢進である。悪性細胞は、インビトロにおいて成長の接触阻害の欠損を示す細胞である過形成細胞、インビボにおいて転移不可能な良性腫瘍細胞、またはインビボにおいて転移可能であって、除去を試みた後に再発する恐れのある癌細胞の場合がある。「腫瘍形成」という表現は、悪性成長または癌性成長の進行に至る細胞増殖の誘導を示すために用いられる。癌細胞の成長または増殖の評価は、接触細胞および非接触細胞を、Coulter Cell Counter （Coulter、Miami、FL）、または血球計算盤を用いてカウントすることで行われる場合がある。細胞が固体状の成長を示す場合（例えば固形腫瘍または固形臓器）、細胞増殖の上記のような評価は、成長をカリパスで測定し、接触細胞と非接触細胞の成長の規模を比較することで行うことができる。好ましくは同表現は、非接触細胞が少なくとも50%である細胞増殖の遅延を含む。より好ましくは同表現は、非接触細胞が100%である（すなわち接触細胞が、数または大きさに関して大きくならない）細胞増殖の遅延を含む。より好ましくは同表現は、非接触細胞と比較して、接触細胞の数および大きさの低下を含む。したがって、接触細胞の増殖を抑制する、本発明のEGFRに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、接触細胞の成長遅延、成長停止、プログラム細胞死（アポトーシス）、または壊死を誘導する可能性がある。これは以下のように決定することができる。
【００３６】
配列番号：1〜10のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、ヒトGEO結腸癌細胞の足場依存性の成長を抑制する能力の評価を行った。この調査に有用なヒト癌細胞はGEO細胞である。得られた結果を表2に示す。
【００３７】
（表2）抗EGFR 20-merホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがGEO癌細胞の成長に及ぼす作用：
【００３８】
表2のEGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも、軟寒天上におけるGEO細胞のコロニー形成能力を抑制する。同様に、ウェスタンブロット解析の結果、個々のEGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理後にEGFRの発現が有意に低下することがわかった（図1A）。このオリゴヌクレオチドのもつ、軟寒天上におけるGEO細胞の成長を抑制する能力はIC50として約0.5 μM（AS10（配列番号：10））〜約3.5 μM（AS1（配列番号：1））である。
【００３９】
アンチセンス法の、より効率的な標的となるEGFR mRNA領域をさらに絞り込むために、3つの最も活性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（AS5（配列番号：9）、AS9（配列番号：9）、およびAS10（配列番号：10））と連続するか重複する、3つの一連の4種類の20-merのホスホロチオエート配列を対象に、軟寒天上におけるGEO細胞の成長抑制能力の検討を行った。得られた結果を表3に示す。
【００４０】
（表3）抗EGFR 20-merホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがGEO細胞の成長に及ぼす作用：
【００４１】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置によって決定されたIC50は0.1〜0.7 μMの値であった。ヌクレオチド配列、および成長抑制活性に基づき、2種類の配列（AS14（配列番号：14）およびAS22（配列番号：22）に対応）のバックボーンの構造を、DNA-RNAハイブリッドの20-merのオリゴヌクレオチド（AS23（配列番号：23）およびAS24（配列番号：24））として修飾し、さらに、その生物学的特徴を調べた。GEO細胞を軟寒天上でコロニーとして成長させ、表に示すように、さまざまな濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。IC50の値は3回の異なる実験を各3回実施して得た。MBOのもつ、ヒト癌細胞の成長を抑制する能力を表4に示す。
【００４２】
（表4）抗EGFR 20-merのアンチセンスMBOがGEO細胞の成長に及ぼす作用：
【００４３】
この表では、2種類のオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合（各位置に隣接するヌクレオシドについて通常の書体）および2'-O-メチル-リボヌクレオシド修飾（イタリック書体）を含む。
【００４４】
次にAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドによる処理が、複数の癌細胞系列（GEO結腸癌、ZR-75-1、MCF-10A Ha-ras乳癌、およびOVCAR-3卵巣癌）の軟寒天上における成長に及ぼす作用の評価を行った。図2Aおよび2Bに示すように、両方のEGFRアンチセンスMBOによる処理の結果、軟寒天上におけるコロニーの形成が用量依存的に抑制されることがわかった（IC50は検討したすべての癌細胞系列で0.1〜0.5 μM）。これとは対照的に、対照であるスクランブル配列オリゴヌクレオチドで処理した後には、成長抑制はほとんど認められないか、全く認められなかった（図2C）。図1Bに示すように、スクランブルオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較して、EGFRタンパク質の発現のほぼ完全な抑制がAS23またはAS24（0.1 μMまたは0.5 μM）で3日間処理したGEO細胞で検出された。
【００４５】
抗EGFR阻止MAbなどの、EGFRを選択的に抑制する薬剤による処理は、細胞分裂抑制作用を示し、主にCDK阻害物質p27の発現が付随して上昇するために細胞周期がG1期で停止し、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）-2の活性が抑制される（Mendelsohn、1997、前掲）。したがってEGFRアンチセンス処理によるp27の誘導能力を調べた。図3に示すように、AS23でGEO細胞とZR-75-1癌細胞を処理した結果、p27の発現が用量依存的に上昇することがわかった。
【００４６】
EGFRアンチセンス処理のもつ、プログラム細胞死誘導能力についても調べた。図4に示すように、AS23またはAS24による処理の結果、対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞、またはスクランブルオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較して、GEO細胞およびZR-75-1癌細胞でアポトーシスの用量依存的な上昇が誘導された（1〜2.5 μMで最大2〜3倍の上昇）。この作用は、MAb C225による処理後に観察された作用に似ていた。
【００４７】
本発明は、細胞毒性物質の癌細胞に対する成長抑制作用を強化する方法も提供する。この方法では、癌細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを、細胞毒性物質とともに接触させる。例えば、AS23およびAS24が癌細胞に及ぼす成長抑制作用は、4種類の異なる細胞毒性物質（シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、およびトポテカン）を組み合わせて調べた。得られた結果を図5および図6に示す。超相加的な成長抑制作用（軟寒天上で成長させたGEO細胞を使用した場合）は、全用量のEGFRアンチセンスMBO、および検討した各4種類の細胞毒性薬について認められた。以上の薬剤を低用量で使用した場合、抗増殖作用は明らかに協同的であった。例えばGEO細胞を0.25 μg/mlのシスプラチン、または0.05 μMのAS23 MBOで処理したところ、約20%の成長抑制が認められたが、細胞毒性物質とアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせて処理したところ、軟寒天上におけるコロニー形成率に70%の抑制が認められた（図5A）。シスプラチンと、その後のAS23 MBOによって得られた実際の成長抑制と、各薬剤で達成された成長抑制の合計の比として定義される協同性の商（cooperativity quotient）は、上記の処理の場合は約1.8であった。
【００４８】
したがって、本発明の合成EGFR特異的オリゴヌクレオチドは、治療用製剤の状態の場合は、癌が関与する疾患、障害、および条件を治療する際にも有用である。このような方法では、治療量の本発明の合成オリゴヌクレオチドであり、EGFR核酸の発現の抑制に有効な本発明の合成オリゴヌクレオチドを、ある場合においては別の抗腫瘍薬を共に用いて細胞に投与する。このような細胞は、細胞培養物、組織培養物の一部の可能性があるほか、ヒトまたは他の哺乳類などの動物の一部または全体の場合がある。
【００４９】
本発明の方法で処理対象となる細胞が動物細胞の場合、本発明のオリゴヌクレオチド（治療法の一部の場合は任意の付加的な抗癌剤）を、薬学的に許容される担体に含まれる治療的組成物として従来の手順で投与する。例えば、シスプラチンおよびシスプラチン類似体、ならびに他の白金化合物および細胞毒性物質を、Slapakら （Harrison's Principles of Internal Medicine）、第14版、McGraw-Hill、NY （1998）、第86章に記載された手順で癌患者に投与することができる。
【００５０】
担体の特徴は、後述するように投与経路の影響を受ける。このような組成物は、合成オリゴヌクレオチドおよび担体に加えて、当技術分野で周知の希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および他の材料を含む場合がある。本発明の薬学的組成物は、EGFR遺伝子またはmRNAの発現の抑制を促進したり、癌細胞の増殖を低下させたりする他の活性因子および/または活性薬剤を含む場合もある。例えば、合成オリゴヌクレオチドの組み合わせ（各オリゴヌクレオチドはEGFR核酸のさまざまな領域に対応する）を、本発明の薬学的組成物に使用することができる。本発明の薬学的組成物は、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどのヌクレオチド類似体をさらに含む場合がある。このような付加的な因子および/または薬剤を薬学的組成物中に含めることで、本発明の合成オリゴヌクレオチドによる相乗効果が得られる、または本発明の合成オリゴヌクレオチドに起因する副作用を最小限に抑えることができる。逆に、本発明の合成オリゴヌクレオチドを、特定の抗EGFR遺伝子、または遺伝子産物の因子および/もしくは薬剤の製剤に含めることで、抗EGFR遺伝子の因子および/または薬剤に起因する副作用を最小限に抑えることができる。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、本発明の合成オリゴヌクレオチドが、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、液晶、またはラメラ層として凝集状態で存在する脂質などの両親媒性の薬剤と組み合わされたリポソーム状とすることが可能である。リポソーム製剤に適した脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などがあるがこれらに限定されない。1つの特に有用な脂質担体はリポフェクチンである。このようなリポソーム製剤の調製は当技術分野で周知であり、例えば米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、および第4,737,323号に記載されている。本発明の薬学的組成物は、Zhaoら、Antisense Research & Development5：185-192 （1995）に記載されているように、細胞中へのオリゴヌクレオチドの輸送を促進するシクロデキストリン、または徐放性重合体などの化合物を含む場合がある。
【００５２】
本明細書で用いる「治療的有効量」という表現は、患者にとって意味のある利益（すなわち腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の成長の抑制、または癌細胞の増殖速度の抑制）を十分に示す薬学的組成物の各活性成分の総量または方法を意味する。この表現は、単独で投与される個々の活性成分について使用する場合、成分のみを意味する。また組み合わせについて使用する場合、治療効果をもたらす活性成分の総量を意味する（併用投与、連続投与、または同時投与のいずれかの場合がある）。「治療的有効量」および「治療的有効期間」という表現は、悪性細胞の成長の低下に有効な用量および期間における既知の治療法について用いる。
【００５３】
本発明の治療法または用途を実施する際には、治療的有効量の1種、2種、またはそれ以上の本発明の合成オリゴヌクレオチドを、癌に関連した疾患または障害のある被験者に投与する。本発明の合成オリゴヌクレオチドは本発明の方法により単独で、または酸化剤もしくは細胞毒性物質を始めとするが、これらに限定されない、さまざまな抗癌剤を組み合わせて、および/または他の既知の癌治療法で投与することができる。1種類または複数の他の治療法を同時に行う場合は、本発明の合成オリゴヌクレオチドを他の治療法と同時に、または連続的に投与することができる。連続的に投与する場合は、担当医師が、他の治療法と組み合わせる本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与の適切な順序を決定する。
【００５４】
薬学的組成物に使用される本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与、または本発明の方法の実施は、眼内投与、経口摂取、吸入、または塗布、皮下注射、筋肉内注射、もしくは静脈内注射などの、さまざまな従来の方法で行われる。投与は、当業者によって判断される条件および反応に応じて、ボーラス投与、間欠投与、または連続投与とすることができる。上述した本発明の方法のいくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドを局所的に投与する（例えば眼内投与または病巣内投与）ほか、および/または全身的に投与する。「局所投与」という表現は、身体の特定の部位または領域に輸送することを意味する。一方、「全身投与」という表現は、経口摂取、または筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、もしくは腹腔内注射によって生物体全体に輸送することを意味する。
【００５５】
治療的有効量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを経口的に投与する場合、合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシルの形状をとる。錠剤として投与する場合、本発明の薬学的組成物は、ゼラチンやアジュバントなどの固体担体を付加的に含む。錠剤、カプセル、および粉末は、約5〜95%の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約25〜90%の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体として投与する場合は、水、石油、動物性油、または植物性油（ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油、ゴマ油、または合成油）などの液体担体を添加することができる。液体の薬学的組成物は、生理的食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含む場合がある。液体として投与する場合、本発明の薬学的組成物は、約0.5〜90%（重量%）の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約1〜50%の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【００５６】
治療的有効量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、眼内注射、または腹腔内注射で投与する場合、合成オリゴヌクレオチドは、パイロジェンを含まない状態の非経口的に許容される水溶液中に存在する状態とする。相応のpH、等張性、安定性などをもつ、このような非経口的に許容される溶液の調製は当技術分野の範囲に含まれる。静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または眼内注射に好ましい薬学的組成物は、合成オリゴヌクレオチドに加えて、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加注射液などの等張性溶媒、または当技術分野で周知の他の溶媒を含むべきである。本発明の薬学的組成物は、当技術分野で周知の安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、または他の付加物を含む場合もある。
【００５７】
本発明の薬学的組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、治療対象の条件の性質および重症度に、また患者が受けた事前の処置の内容に依存する。最終的には担当医師が、各患者を治療する際の合成オリゴヌクレオチド量を決定する。最初に担当医師は低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、患者の反応を観察する。最適な治療効果が患者にみられるまで、高用量の合成オリゴヌクレオチドを投与することが可能であり、その時点で用量の増加を止める。本発明の方法を実施するために用いられる、さまざまな薬学的組成物は、約10 μg〜約20 mgの合成オリゴヌクレオチド（体重または臓器重量（kg）あたり）を含むことが想定されている。
【００５８】
本発明の薬学的組成物を用いる静脈内療法の期間は、治療対象の細胞増殖性疾患の重症度、ならびに各患者の状態および潜在的な特異体質反応に応じて変動する。最終的には担当医師が、本発明の薬学的組成物を用いた静脈内療法の適切な期間を決定する。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドを全身的ではなく病巣に対して局所的（例えば腹腔内）に投与する場合、正常組織による取込みを減少させるべきである。また、オリゴヌクレオチドをリポソームに封入し、このようなリポソームを、タンパク質をリポソーム表面に挿入することで、選択された組織に標的化する方法は現在一般的に行われている。
【００６０】
本発明は、細胞毒性物質の、癌細胞に対する毒性作用を強化したり促進したりする方法を含む、さまざまな治療法を提供する。癌細胞は、化学療法薬に耐性を示したり、耐性を示すようになったりする場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、このような細胞に、抗癌治療に対する感受性を付与する。本発明の方法の治療対象となる癌細胞は、成長が制御不能な任意の細胞を含み、また卵巣癌細胞、乳癌細胞、および結腸癌細胞を含むがこれらに限定されない。化学療法薬に耐性を示す癌細胞は、本発明の方法に特に良好に反応する。
【００６１】
好ましくは、本発明の癌治療法、または癌細胞成長の抑制法は、本発明のEGFRをコードする核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド、またはその発現を抑制可能な合成オリゴヌクレオチドを含む第1の薬剤を細胞に接触させる段階、または新生物のある組織または個人に投与する段階、および細胞毒性物質を含む第2の薬剤を投与する段階を含む。オリゴヌクレオチドおよび細胞毒性物質は同時に使用したり投与したりすることができる。また、このような細胞毒性物質を、オリゴヌクレオチドの使用前または投与前に使用したり投与したりすることもできる。
【００６２】
ある好ましい態様では、細胞毒性物質は、タキサン化合物、白金由来薬剤、細胞微小管ネットワークの破壊物質、またはトポイソメラーゼIまたはII選択薬である。有用な細胞毒性物質は、パクリタキセルやドセタキセルを含むがこれらに限定されないタキサン化合物である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、Sigma（St.Louis、MO）から購入することができる。有用な白金由来薬剤には、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ならびにこれらの類似体および誘導体などがある。シスプラチン（シス-ジアンミンジクロロ白金）は、例えばBristol-Meters Squibb（Princeton、NJ）、またはSigma（St.Louis、MO）から購入することができる。オキサリプラチンは、例えばSigma（St. Louis、MO）から購入することができる。カルボプラチン（白金、ジアンミン［1,1-シクロブタン-ジカルボキシラト（2-）-0,0'］-,（SP-4-2）は、例えばBristol-Myers Squibb（Princeton、NJ）から購入することができる。有用なトポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカンおよびカンプトサールを含むがこれらに限定されない。トポテカンは、例えばSmith-Kline Beechman Italiaから購入することができる。カンプトサール（塩酸イリノテカン）は、Pharmacia & Upjohn（Peapack、NJ）から購入することができる。細胞微小管ネットワーク破壊化合物の非制限的な例には、Rhone-Poulenc、Rorer Pharmaceuticals社（Collegeville、PA）から購入することができるタキソテール（（2R,3S）-N-カルボキシ-3-フェニルイソセリン,N-tert-ブチルエステル、13-エステル）がある。
【００６３】
上記のような細胞毒性物質は、例えば「Harrison's Principles of Internal Medicine」、第14版、McGraw-Hill、NY（1998）、および「Physicians Desk Reference」、第54版、Medical Economics社、Montvale、NJ （2000）に記載された手順で癌患者に投与することができる。例えばパクリタキセルは好ましくは、最大300 mg/m2/回の用量で静脈内注射（1〜24時間）により、21日毎またはこれ未満の頻度で投与される。好ましくはドセタキセルは、最大300 mg/m2/回の用量で静脈内注射（1〜24時間）により、21日毎またはこれ未満の頻度で投与される。本発明の方法で細胞に投与される細胞毒性物質の量は、EGFR遺伝子に対するオリゴヌクレオチドで治療が行われていない癌細胞を対象に用量反応実験を行って決定することもできる。
【００６４】
本明細書に記載された、遺伝学的および分子生物学的な手法の一般原理が記載された標準的な参考文献には、OttおよびHoh、「Statistical Approaches to Genetic Mapping」、Am.J.Hum.Genet. 67：289-294（2000）；Zubay G.、GeneticsThe Benjamin/Cummings Publishing社、Menlo Park、CA（1987）；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、NY（1999）；Sambrookら、Molecular Cloning ： A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、NY（1989）；Kaufmanら（編）、Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine、CRC Press、Boca Raton、LA（1995）；およびMcPherson編、Directed Mutagenesis ： A Practical Approach、IRL Press、Oxford（1991）などがある。免疫学および炎症分野の一般原理について記載された標準的な参考文献には、Gallinら、「Inflammation ： Basic Principles and Clinical Correlates」、Raven Press、New York（1988）；Kuby, J.、「Immunology」第3版、W.H.Freeman、New York（1997）；Coliganら（編）、「Current Protocols in Immunology」、John Wiley & Sons、New York（1991）；およびHurley, J.V.、Acute Inflammation、第2版、Churchill Livingstone、New York（1983）などがある。
【００６５】
以下に示す実施例は、本発明の好ましい態様をさらに説明することを目的としており、性質の制限を受けない。当業者であれば、常用の実験法だけでなく、本明細書に記載された特定の物質および手順に同等の多くの方法を理解したり確認したりすることができる。このような同等物は、本発明の範囲に含まれるとみなされ、また添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００６６】
実施例
1．アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
EGFR mRNA（GenBankアクセッション番号M34309）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、文献に記載された選択基準を元に設計した（AgrawalおよびKandimalla、Molecular Medicine Today（2000） 6：72-81）。ヒトEGFR mRNAのさまざまな領域を標的とする、20-merのホスホロチオエート、または混合型バックボーン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は標準的な手順で実施した（例えばAgrawal （1997） Proc.Natl.Acad.Sci.（USA） 94：2620〜2625を参照）。オリゴヌクレオチドの同定および純度は、従来の31P核磁気共鳴法、キャピラリーゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション溶解温度、A269/およびMALDI/TOF質量比スペクトル分析で確認した（例えばAgrawal（1997） Proc.Natl.Acad.Sci.（USA） 94：2620〜2625を参照）。
【００６７】
2．細胞
GEOヒト結腸癌、OVCAR-3ヒト卵巣癌、およびZR-75-1ヒト乳癌細胞の系列は、American Type Culture Collection、Manassas、VAから入手した（OVCAR、ATCC No.HTB-161；ZR-75-1、ATCC No.CRL-1500）。MCF-10A Ha-ras細胞は、ヒトの非形質転換MCF-10A細胞を対象に、ヒト活性化c-Ha-ras前癌遺伝子を含む発現プラスミド、およびネオマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミドを用いた同時トランスフェクション法で得た（Ciardielloら（1990） Cell Growth Differ. 1：407-420）。いずれの細胞系列とも、細胞あたり約20,000か所（ZR-75-1）〜40,000か所（GEO）、150,000か所（OVCAR-3）、250,000か所（MCF-10A Ha-ras）のEGF結合部位をもつ機能性EGFRを発現し、高レベルのTGFαを放出する（Ciardielloら （1999） Clin.Cancer Res.5：909-916）。GEO細胞、OVCAR-3細胞、およびZR-75-1細胞は、加湿空気（95%空気＋5% CO2）中で37℃で10%熱不活性化ウシ胎児血清、20 mM HEPES（pH 7.4）、ペニシリン（100 UI/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、および4 mM グルタミン（ICN、Irvine、UK）を添加したDMEM中で維持した。MCF-10A Ha-ras細胞は、加湿空気（95%空気＋5% CO2）中で37℃で、1：1（v/v）のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、および5%熱不活性化ウマ血清、20 mM Hopes（pH 7.4）、4 mM グルタミン、0.5 μg/mlヒドロコルチゾン（Sigma、St.Louis、MO）、10 ng/ml EGF、10 μg/mlインスリン（Collaborative Research Products、Bedford、MA）、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを添加したHam's F12混合培地中で成長させた。
【００６８】
細胞（104個/ウェル）を、完全培地を添加した0.5 mlの0.3% Difco Noble寒天（Difco、Detroit、MI）中に懸濁した。この懸濁物を24マルチウェルクラスターディッシュ（Becton Dickinson、Lincoln Park、NJ）中で0.5 mlの0.8%寒天培地ベース層に重層し、1日目、2日目、および3日目に、さまざまな濃度のさまざまなEGFR-ASオリゴヌクレオチド単独、および/または1日目に各濃度の細胞毒性薬を組み合わせて処理した。10〜14日後に細胞をニトロブルーテトラゾリウム（Sigma、St.Louis、MO）で染色し、0.05 mmを上回るコロニー数をカウントした。
【００６９】
3．ウェスタンブロット解析
各濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間毎日処理したGEO細胞に由来する50 μgの総細胞溶解物を、7.5%または12%のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで分画し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗ヒトEGFRマウスMAbと、または抗ヒトp27マウスMAb（両抗体ともTransduction Laboratories、Lexington、KYから購入）とそれぞれインキュベートした後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗血清（Bio-Rad Laboratories、Milano、Italy）とインキュベートした。免疫反応タンパク質は、増強化学発光試薬（Amersham International、England）で可視化した。
【００７０】
4．アポトーシスアッセイ法
プログラム細胞死の誘導は、De Lucaら（Int.J.Cancer （1999） 8：589-594）に記載された手順で、Cell Death Detection ELISA Plusキット（Boheringher Mannheim、Indianapolis、IN）を用いて判定した。簡単に説明すると、5×104細胞/ウェルを6-マルチウェルクラスターディッシュに添加した。さまざまな濃度のオリゴ（0日目、1日目、および2日目）、および/または細胞毒性薬（2日目）で処理した後に、4日目に細胞をPBSで洗浄し、0.5 mlの溶解緩衝液を添加した。30分間のインキュベーション後に上清を回収し、DNA断片のアッセイ法を、製造業者が推奨する手順通りに405 nmでMicroplate Reader（モデル3550-UV；Bio-Rad、Milan、Italy）を用いて行った。各処理は4回行った。同様に処理した別のプレートを対象に、細胞数の解析を血球計算盤を用いて行い、細胞数の値を規格化し、得られた結果を、無処理の対照試料に対する値として表した。
【００７１】
同等物
本発明が関連する当技術分野の当業者には明らかなように、本発明は、上記のように特異的に開示された以外の状態で、本発明の精神または本質的特性から逸脱することなく具体化することができる。したがって上述した本発明の特定の態様は、説明を目的とするものであって制限する意図はない。本発明の範囲は、以上の説明に含まれる実施例に制限されるのではなく、添付の特許請求の範囲で規定される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO癌細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、0.5 μMの各オリゴヌクレオチド（AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10）、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図１Ｂ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、それぞれAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチド（0.1 μMまたは0.5 μM）で、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図１Ｃ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、それぞれAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチド（0.1 μMまたは0.5 μM）で、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRアクチビンモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図２Ａ】AS23オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する成長抑制作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図２Ｂ】AS24オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する成長阻害作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図２Ｃ】スクランブル配列を有する対照オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図３Ａ】スクランブル配列オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン1）；AS23オリゴヌクレオチド（0.1 μM、レーン2）；AS23オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン3）；MAb C225（1 μg/ml、レーン4）；またはMAb C225（5 μg/ml、レーン5）で3日間処理したGEO癌細胞におけるp27の発現を示すウェスタンブロット。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を12% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトp27 MAbで選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図３Ｂ】スクランブル配列オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン1）；AS23オリゴヌクレオチド（0.1 μM、レーン2）；AS23オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン3）；MAb C225（1 μg/ml、レーン4）；またはMAb C225（5 μg/ml、レーン5）で3日間処理したZR-75-1癌細胞におけるp27の発現を示すウェスタンブロット。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を12% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトp27 MAbで選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬で可視化した。
【図４Ａ】ヒトGEO癌細胞をAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドで処理したときのプログラム細胞死の用量依存的な誘導を示す棒グラフ。GEO細胞を、各用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモノクローナル抗体で3日間毎日処理した（0.1 μM AS23（バー1）；0.5 μM AS23（バー2）；1 μM AS23（バー3）；2.5 μM AS23（バー4）；0.1 μM AS24（バー5）；0.5 μM AS24（バー6）；1 μM AS24（バー7）；2.5 μM AS24（バー8）、0.25 μg/ml MAb C225（バー9）；0.5 μg/ml MAb C225（バー10）；1 μg/ml MAb C225（バー11）；5 μg/ml MAb C225（バー12）。C＝無処理対照、S＝2.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで処理した細胞）。アポトーシスの解析は、処置を開始してから4日後に実施した。データは、4回の実験の平均（±標準偏差）を示す。
【図４Ｂ】ヒトZR-75-1癌細胞をAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドで処理したときのプログラム細胞死の用量依存的な誘導を示す棒グラフ。GEO細胞を、各用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモノクローナル抗体で3日間毎日処理した（0.1 μM AS23（バー1）；0.5 μM AS23（バー2）；1 μM AS23（バー3）；2.5 μM AS23（バー4）；0.1 μM AS24（バー5）；0.5 μM AS24（バー6）；1 μM AS24（バー7）；2.5 μM AS24（バー8）、0.25 μg/ml MAb C225（バー9）；0.5 μg/ml MAb C225（バー10）；1 μg/ml MAb C225（バー11）；5 μg/ml MAb C225（バー12）。C＝無処理対照、S＝スクランブル配列オリゴヌクレオチド（2.5 μM）で処理した細胞）。アポトーシスの解析は、処置を開始してから4日後に実施した。データは、4回の実験の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ａ】シスプラチンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｂ】ドキソルビシンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｃ】パクリタキセルと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｄ】トポテカンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ａ】シスプラチンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｂ】ドキソルビシンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｃ】パクリタキセルと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｄ】トポテカンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照として全体が本明細書に組み入れられる2001年5月7日に出願された米国仮特許出願第60/289,055号、および2001年5月7日に出願された米国特許仮出願第60/289,149号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、細胞生物学、医学、および癌の分野に関する。具体的には本発明は、アンチセンス法による細胞増殖の制御に関する。
【０００３】
先行技術の説明
ペプチド成長因子は、正常細胞および癌細胞の増殖ならびに分化の重要な制御因子である（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。トランスフォーミング成長因子α（TGFα）などの上皮成長因子（EGF）遺伝子ファミリーの成長因子は、乳房、結腸、卵巣、腎臓、前立腺、および肺を含むヒト上皮の癌に対する自己分泌型および傍分泌型の分裂促進因子として作用する（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。TGFαは、上皮成長因子受容体（EGFR）の細胞外ドメインに結合し、その細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化する（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。TGFαおよび/またはEGFRの発現の増加は、ヒトの癌の大部分で検出されており、予後不良と関連する（Salomonら （1995） Crit.Rev.Oncol.Hematol. 19：183-232）。したがってTGFα-EGFRの自己分泌経路は、治療の標的になるのではないかと提案されている（Mendelsohn （1997） J.Natl.Cancer Inst. 89：341-343、Mendelsohn （1997） Clin.Cancer Res. 3：2703-2707）。
【０００４】
癌細胞におけるEGFRの活性化および/または機能を阻害するために、さまざまな薬理学的および生物学的な方法が開発されている。例えば、毒素を融合させたTGFαまたはEGFを含む組換えタンパク質である多様な抗EGFRの阻止モノクローナル抗体（MAb）、およびEGFRチロシンキナーゼ阻害物質が作製されており、その生物学的、および潜在的な治療特性が調べられている（Fanら （1998） Curr.Opin.Oncol. 10：67-73）。キメラヒト-マウスIgG1MAbであるMAb C225は、癌患者を対象に第II〜III相の臨床試験が行われている（Fanら、前掲）。リガンドによって誘導される、EGFRチロシンキナーゼの活性化を選択的に抑制する化合物（ZD1839などのEGFRチロシンキナーゼ阻害物質）（Ciardielloら、（2000） Clin.Cancer Res. 6（5）：2053-2063）も癌患者を対象に臨床評価が現在行われている（Noonberg （2000） Drugs 59：753-67）。過去の研究で、MAb C225などの薬剤がEGFRの活性化に干渉し、白金誘導体、タキサン化合物、トポイソメラーゼIおよびIIの阻害物質（Mendelsohn （1997） J.Natl.Cancer Inst.、89：341-343；Mendelsohn （1997） Clin.Cancer Res. 3：2703-2707；Ciardielloら （1999） Clin.Cancer Res. 5：909-916）、またはEGFRチロシンキナーゼ阻害物質（Ciardielloら （2000）、前掲）を含む細胞毒性薬の抗腫瘍活性を強化することがわかっている。
【０００５】
しかし残念ながら、このような方法はいずれも有効な治療法とはなっていない。したがって、癌細胞のEGFR活性を抑制する新しい方法が求められている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、癌細胞のEGFR活性を抑制する新しい方法を提供する。
【０００７】
EGFRに特異的なmRNAに対するオリゴヌクレオチドは、EGFRの発現を低下させ、またインビトロにおける癌細胞の成長を抑制することがわかっている。またハイブリッドDNA/RNA混合型バックボーンオリゴヌクレオチド（MBO）として修飾されたオリゴヌクレオチドが、機能性EGFRを発現する癌細胞系列で、EGFR mRNA配列を特異的に標的とし、EGFRの合成を抑制し、細胞の成長を抑制し、またアポトーシス（プログラム細胞死）を促進することもわかっている。さらに、上記のEGFRアンチセンスMBOを、ヒトの上皮悪性腫瘍の内科的治療に現在使用されている、さまざまな既知の細胞毒性物質を併用する処置により、癌細胞に対する成長抑制作用が強化されることが認められている。以上のことおよび他の認められていることから、EGFR核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド、およびその使用法を含む本発明が得られた。
【０００８】
具体的には、1つの局面で本発明は、245〜1117位、2407〜3201位、3786〜4102位、および4574〜4633位からなる群より選択される、EGFR mRNA領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、2407〜2476位、4040〜4102位、および4574〜4633位からなる群より選択される、EGFR mRNA領域に相補的である。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは約12〜30ヌクレオチドである。好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは約15〜約25ヌクレオチドである。最も好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドの長さは約20ヌクレオチドである。
【００１０】
好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。ある態様では、このようなヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合である。
【００１１】
好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個つの2'-修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも1個の2'-修飾リボヌクレオチドを含む。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも3個の2'-修飾リボヌクレオチド、または少なくとも4個の2'-修飾リボヌクレオチドを含む。ある態様では、2'-修飾リボヌクレオチドは2'-アルキルリボヌクレオチドである。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも3個の連続したデオキシリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートを含む。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも4個の連続したデオキシリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートを含む。
【００１２】
特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、および22からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
別の局面では、本発明は、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する細胞におけるEGFR合成を抑制する方法も提供する。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する悪性細胞の成長を抑制する方法を提供する。いくつかの態様では、癌細胞は、結腸癌細胞、乳癌細胞、または卵巣癌細胞である。
【００１５】
別の局面では、本発明は、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する癌細胞のアポトーシスを促進する方法を提供する。
【００１６】
さらに別の局面では、本発明は、上述のように癌細胞に本発明のオリゴヌクレオチドおよび細胞毒性物質を接触させる段階を含む、癌細胞に対する細胞毒性物質の成長抑制作用を強化する方法を提供する。特定の態様では、細胞毒性物質は、シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、トポテカン（topotecan）、カンプトサール（camptosar）、およびタキソテール（taxotere）からなる群より選択される。いくつかの態様では、癌細胞は、結腸癌、乳癌、または卵巣癌の細胞である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書で言及される公開特許および科学論文は、当業者が利用可能な知見である。本明細書で引用された米国公開特許、許可された出願、公開された外国特許出願、および参考文献（GenBankデータベース配列を含む）は、それぞれが具体的かつ個別に参照として組み入れられるように示されているのと同程度に参照として本明細書に組み入れられる。これらの出願と特許開示の間に矛盾点がある場合は、本開示を優先する。
【００１８】
本発明は、細胞生物学、医学、および癌の分野に関する。具体的には本発明は、アンチセンス法による細胞増殖の制御に関する。
【００１９】
EGFRに特異的なmRNAに対するオリゴヌクレオチドは、EGFRの発現を低下させること、およびインビトロにおける癌細胞の成長を抑制することがわかっている。加えて、ハイブリッドDNA/RNA混合型バックボーンオリゴヌクレオチド（MBO）として修飾されたオリゴヌクレオチドが、機能性EGFRを発現する癌細胞系列で、EGFR mRNA配列を特異的に標的とし、EGFRの合成を抑制し、細胞の成長を抑制し、アポトーシス（プログラム細胞死）を促進することもわかっている。さらに、上記のEGFRアンチセンスMBOを、ヒトの上皮悪性腫瘍の内科的治療に現在使用されている、さまざまな既知の細胞毒性薬を併用する処置により、癌細胞に対する成長抑制作用が強化されることが認められている。以上のことおよび他の認められていることから、EGFR核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド、およびその使用法を含む本発明が得られた。
【００２０】
本発明の目的上、「オリゴヌクレオチド」という表現は、2個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはこれらの任意の組み合わせの重合体を含む。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは約6〜約50ヌクレオシド残基であり、より好ましくは約12〜約30ヌクレオシド残基であり、また最も好ましくは約15〜約25ヌクレオシド残基である。ヌクレオシド残基は、任意の数多い既知のヌクレオシド間結合で相互に結合させることができる。このようなヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミダイト、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセタミデート（acetamidate）、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンのヌクレオチド間結合を含むがこれらに限定されない。このようなヌクレオシド間結合は、好ましくはホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合、もしくはホスホラミデート結合、またはこれらの組み合わせである。好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合を含む。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という表現は、PNAやLNAなどの重合体も含み、また2'-O-置換リボヌクレオチドを含む核酸分子を含む場合もある。本発明の目的上、「2'-O-置換」という表現は、ペントース部分の2'位と、1-6飽和炭素原子または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基との置換、または2-6炭素原子を有する-O-アリール基もしくはアリル基との置換を意味する（このようなアルキル基、アリール基、またはアリル基は置換されない場合があるほか、例えばハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバルコキシル（carbalkoxyl）基、またはアミノ基と置換される場合がある。または、このような2'位における置換はヒドロキシ基（リボヌクレオシドとなる）、アミノ基、またはハロ基との間で生じるが2'-H基とは生じない）。本明細書で用いる「アルキル」という表現は、1個、2個、または3個の置換基と任意選択で置換される、1〜12個の炭素原子、好ましくは1〜8個の炭素原子、またより好ましくは1〜6個の炭素原子を有する直鎖状および分枝状の鎖の脂肪族基を意味する。特に明記しない限り、「アルキル」という表現は、飽和、不飽和、および部分的に不飽和の脂肪族基を含むことを意味する。不飽和基を特に示す場合は、「アルケニル」または「アルキニル」という表現を用いる。飽和基のみを示す場合は、「飽和アルキル」という表現を用いる。好ましい飽和アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、およびヘキシルを含むがこれらに限定されない。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」という表現は、化学的に修飾された塩基、または糖を有する重合体、および/または親油性基、インターカレート（挿入）剤、ジアミン、およびアダマンタン（adamantane）を含むがこれらに限定されない付加的な置換基を有する重合体も含む。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、EGFRをコードする核酸に相補的である。本発明の目的上、「相補的」という表現は、生理的条件でゲノム領域、遺伝子、またはそのRNA転写物とハイブリッドを形成する能力を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間における塩基特異的な水素結合の結果であり、好ましくはワトソン-クリック塩基対、またはフーグスティン塩基対が生じることであるが、他の様式の水素結合、ならびに塩基スタッキングがハイブリッドを形成する場合がある。実際問題としては、このようなハイブリダイゼーションは、転写もしくは翻訳（または両方）のレベルで生じる場合がある、特異的な遺伝子発現の抑制の観察から推測することができる。有用なオリゴヌクレオチドには、キメラオリゴヌクレオチド、およびハイブリッドオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２４】
本発明の目的上、「キメラオリゴヌクレオチド」は、複数の型のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなキメラオリゴヌクレオチドの1つの好ましい態様は、ヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびホスホジエステルを含むオリゴヌクレオチド、好ましくは約2〜約12ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。このような有用な本発明のオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート連結領域、およびアルキルホスホノチオエート領域を有する（例えば米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照）。好ましくは、有用なキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、もしくはホスホロチオエート結合、またはこれらの組み合わせである、少なくとも1つ、またはより好ましくは少なくとも3つもしくは4つの連続したヌクレオシド間結合を含む。米国特許第5,652,356号、第5,973,136号、および第5,773,601号に記載されているインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドも対象となる。
【００２５】
本発明の目的上、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、複数の型のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの1つの好ましい態様は、好ましくは約2〜約12か所の2'-O-置換ヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含むリボヌクレオチド領域、または2'-O-置換リボヌクレオチド領域を含む。好ましくは、このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも3個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、またはこれらの組み合わせを含む（例えばMetelevおよびAgrawal、米国特許第5,652,355号および第5,652,356号を参照）。米国特許第5,652,356号に記載されているインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドも対象となる。
【００２６】
いくつかの好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、中央部または末端部が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジエステル、および修飾オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのセグメントなどの修飾ヌクレオチド間結合が適切に配置されたセグメントで修飾されたヌクレオシドを含む混合型バックボーンオリゴヌクレオチド（MBO）である（Agrawal （1997）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA） 94：2620〜2625；Agrawal （1999） Biochem.Biophys.Acta 1489：53-67）。
【００２７】
上述したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、EGFRの少なくとも一部をコードするRNA、DNA、cDNA、または2本鎖DNA、また好ましくはmRNAの任意の領域に相補的である。EGFR mRNAの配列は既知である（GenBankアクセッション番号M34309）。本発明のオリゴヌクレオチドは、AgrawalおよびKandimalla（2000） Molecular Medicine Today 6：72-81に記載された選択基準を元に設計された。
【００２８】
本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列、および化学構造は、オリゴヌクレオチドが標的EGFR配列の発現を調節する能力を保持する限りにおいては多様である。これは、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性を有するか否かを、既知のEGFR-特異的オリゴヌクレオチドによる作用を受けることがわかっている癌細胞培養物に含まれるEGFR mRNAの量を定量するか、またはEGFR量を定量して検討することで容易に決定できる。また、オリゴヌクレオチドが、インビトロまたはインビボにおける細胞成長アッセイ法で癌細胞の成長を抑制する能力（詳細を本明細書に記載）を検討することもできる。本明細書で使用する「発現を抑制する」という表現、および類似の表現は、任意の1つもしくは複数の上記パラメータを含むことを意図している。
【００２９】
EGFR mRNAのさまざまな領域に対するオリゴヌクレオチドの22種類の非制限的な例を表1に示し、配列番号：1〜22および25〜28として配列表に記載する。
【００３０】
（表1）
本発明のオリゴヌクレオチドは、既知の方法、例えば適切な固相支持体上でH-ホスホネート化学法、ホスホラミダイト化学法、またはH-ホスホネート化学法とホスホラミダイト化学法の組み合わせ（すなわち数サイクルのH-ホスホネート化学法と数サイクルのホスホラミダイト化学法）を含む既知の任意の化学的方法によって簡便に合成することができる。適切な固相支持体には、多孔性球状ガラスビーズ（controlled-pore glass；CPG）などの、固相オリゴヌクレオチド合成に使用される任意の標準的な固相支持体などがある（例えばPon （1993） Meth.Molec.Biol. 20：465-496を参照）。また、このような修飾オリゴヌクレオチドの調製は当技術分野で周知である（総説としてAgrawal （1992） Trends Biotechnol. 10：152-158；Agrawalら （1995） Curr.Opin.Biotechnol. 6：12〜19）。例えばヌクレオチドは、ホスホラミデート化学法、H-ホスホネート化学法、またはメチルホスホラミデート化学法などの当技術分野で周知の手法で共有結合的に連結することができる。オリゴマーのホスホロチオエート類似体は、メトキシホスホラミダイト化学法（例えばAgrawalら （1988） Proc.Natl.Acad.Sci. （USA） 85：7079-7083を参照）、またはH-ホスホネート化学法（Froehler （1986） Tetrahedron Lett. 27：5575-5578）（例えば米国特許第5,149,798号を参照）などの当技術分野で周知の方法で調製することができる。ヒトのEGFR mRNAのさまざまな領域を標的とするホスホロチオエート、または混合型バックボーン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、Agrawal（1997） Proc.Natl.Acad.Sci. （USA） 94：2620〜2625に記載された手順で実施することができる。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、正常に、または通常EGFRを発現している細胞におけるEGFR遺伝子の発現の抑制、ならびに癌細胞に対する酸化剤および細胞毒性物質の毒性作用の強化または促進を含む、さまざまな目的に有用である。これらは、実験的な細胞培養系または動物系におけるEGFR関連タンパク質の分裂促進活性を抑制するために、またこのような特異的なEGFR活性を抑制する作用を評価するために使用することで、EGFRタンパク質の生理機能のプローブとして使用することもできる。これは、本発明のEGFRタンパク質の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または動物に投与して、何らかの表現型効果を観察することで達成される。この場合、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは従来の「遺伝子ノックアウト」法である。というのは、使用が容易なためであり、また特異的なEGFR関連タンパク質の活性の抑制に使用できるためである。
【００３３】
また、本発明のEGFRに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖抑制能力は、非同期的に成長している細胞集団を同期させることができる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、インビトロで成長する非悪性のEGFR発現細胞の集団を細胞周期のG1期またはG2期で停止させることができる。このような同期によって例えば、細胞周期のG1期またはG2期で発現される遺伝子および/または遺伝子産物の同定が可能となる。培養細胞のこのような同期は、トランスフェクション効率が変動し、またトランスフェクション対象細胞の細胞周期の特定の相に依存する新しいトランスフェクションプロトコルの効率を検討する上でも有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することで、細胞集団の同期が可能となることによってトランスフェクション効率の上昇が検出しやすくなる。
【００３４】
本発明のEGFRに特異的なオリゴヌクレオチドは、上述したように細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する細胞におけるEGFRの合成を抑制する方法を含む、本発明のさまざまな方法に有用である。これらを用いて、機能性EGFRを発現する悪性細胞または癌細胞の成長を抑制するために、または機能性EGFRを発現する癌細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進することもできる。
【００３５】
「悪性細胞」または「癌細胞」という表現は、異常な細胞成長を示す細胞を示すために用いる。好ましくは、悪性細胞の異常な細胞成長は、細胞成長の亢進である。悪性細胞は、インビトロにおいて成長の接触阻害の欠損を示す細胞である過形成細胞、インビボにおいて転移不可能な良性腫瘍細胞、またはインビボにおいて転移可能であって、除去を試みた後に再発する恐れのある癌細胞の場合がある。「腫瘍形成」という表現は、悪性成長または癌性成長の進行に至る細胞増殖の誘導を示すために用いられる。癌細胞の成長または増殖の評価は、接触細胞および非接触細胞を、Coulter Cell Counter （Coulter、Miami、FL）、または血球計算盤を用いてカウントすることで行われる場合がある。細胞が固体状の成長を示す場合（例えば固形腫瘍または固形臓器）、細胞増殖の上記のような評価は、成長をカリパスで測定し、接触細胞と非接触細胞の成長の規模を比較することで行うことができる。好ましくは同表現は、非接触細胞が少なくとも50%である細胞増殖の遅延を含む。より好ましくは同表現は、非接触細胞が100%である（すなわち接触細胞が、数または大きさに関して大きくならない）細胞増殖の遅延を含む。より好ましくは同表現は、非接触細胞と比較して、接触細胞の数および大きさの低下を含む。したがって、接触細胞の増殖を抑制する、本発明のEGFRに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、接触細胞の成長遅延、成長停止、プログラム細胞死（アポトーシス）、または壊死を誘導する可能性がある。これは以下のように決定することができる。
【００３６】
配列番号：1〜10のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、ヒトGEO結腸癌細胞の足場依存性の成長を抑制する能力の評価を行った。この調査に有用なヒト癌細胞はGEO細胞である。得られた結果を表2に示す。
【００３７】
（表2）抗EGFR 20-merホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがGEO癌細胞の成長に及ぼす作用：
表2のEGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも、軟寒天上におけるGEO細胞のコロニー形成能力を抑制する。同様に、ウェスタンブロット解析の結果、個々のEGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理後にEGFRの発現が有意に低下することがわかった（図1A）。このオリゴヌクレオチドのもつ、軟寒天上におけるGEO細胞の成長を抑制する能力はIC50として約0.5 μM（AS10（配列番号：10））〜約3.5 μM（AS1（配列番号：1））である。
【００３９】
アンチセンス法の、より効率的な標的となるEGFR mRNA領域をさらに絞り込むために、3つの最も活性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（AS5（配列番号：9）、AS9（配列番号：9）、およびAS10（配列番号：10））と連続するか重複する、3つの一連の4種類の20-merのホスホロチオエート配列を対象に、軟寒天上におけるGEO細胞の成長抑制能力の検討を行った。得られた結果を表3に示す。
【００４０】
（表3）抗EGFR 20-merホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがGEO細胞の成長に及ぼす作用：
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置によって決定されたIC50は0.1〜0.7 μMの値であった。ヌクレオチド配列、および成長抑制活性に基づき、2種類の配列（AS14（配列番号：14）およびAS22（配列番号：22）に対応）のバックボーンの構造を、DNA-RNAハイブリッドの20-merのオリゴヌクレオチド（AS23（配列番号：23）およびAS24（配列番号：24））として修飾し、さらに、その生物学的特徴を調べた。GEO細胞を軟寒天上でコロニーとして成長させ、表に示すように、さまざまな濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。IC50の値は3回の異なる実験を各3回実施して得た。MBOのもつ、ヒト癌細胞の成長を抑制する能力を表4に示す。
【００４２】
（表4）抗EGFR 20-merのアンチセンスMBOがGEO細胞の成長に及ぼす作用：
この表では、2種類のオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合（各位置に隣接するヌクレオシドについて通常の書体）および2'-O-メチル-リボヌクレオシド修飾（イタリック書体）を含む。
【００４４】
次にAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドによる処理が、複数の癌細胞系列（GEO結腸癌、ZR-75-1、MCF-10A Ha-ras乳癌、およびOVCAR-3卵巣癌）の軟寒天上における成長に及ぼす作用の評価を行った。図2Aおよび2Bに示すように、両方のEGFRアンチセンスMBOによる処理の結果、軟寒天上におけるコロニーの形成が用量依存的に抑制されることがわかった（IC50は検討したすべての癌細胞系列で0.1〜0.5 μM）。これとは対照的に、対照であるスクランブル配列オリゴヌクレオチドで処理した後には、成長抑制はほとんど認められないか、全く認められなかった（図2C）。図1Bに示すように、スクランブルオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較して、EGFRタンパク質の発現のほぼ完全な抑制がAS23またはAS24（0.1 μMまたは0.5 μM）で3日間処理したGEO細胞で検出された。
【００４５】
抗EGFR阻止MAbなどの、EGFRを選択的に抑制する薬剤による処理は、細胞分裂抑制作用を示し、主にCDK阻害物質p27の発現が付随して上昇するために細胞周期がG1期で停止し、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）-2の活性が抑制される（Mendelsohn、1997、前掲）。したがってEGFRアンチセンス処理によるp27の誘導能力を調べた。図3に示すように、AS23でGEO細胞とZR-75-1癌細胞を処理した結果、p27の発現が用量依存的に上昇することがわかった。
【００４６】
EGFRアンチセンス処理のもつ、プログラム細胞死誘導能力についても調べた。図4に示すように、AS23またはAS24による処理の結果、対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞、またはスクランブルオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較して、GEO細胞およびZR-75-1癌細胞でアポトーシスの用量依存的な上昇が誘導された（1〜2.5 μMで最大2〜3倍の上昇）。この作用は、MAb C225による処理後に観察された作用に似ていた。
【００４７】
本発明は、細胞毒性物質の癌細胞に対する成長抑制作用を強化する方法も提供する。この方法では、癌細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを、細胞毒性物質とともに接触させる。例えば、AS23およびAS24が癌細胞に及ぼす成長抑制作用は、4種類の異なる細胞毒性物質（シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、およびトポテカン）を組み合わせて調べた。得られた結果を図5および図6に示す。超相加的な成長抑制作用（軟寒天上で成長させたGEO細胞を使用した場合）は、全用量のEGFRアンチセンスMBO、および検討した各4種類の細胞毒性薬について認められた。以上の薬剤を低用量で使用した場合、抗増殖作用は明らかに協同的であった。例えばGEO細胞を0.25 μg/mlのシスプラチン、または0.05 μMのAS23 MBOで処理したところ、約20%の成長抑制が認められたが、細胞毒性物質とアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせて処理したところ、軟寒天上におけるコロニー形成率に70%の抑制が認められた（図5A）。シスプラチンと、その後のAS23 MBOによって得られた実際の成長抑制と、各薬剤で達成された成長抑制の合計の比として定義される協同性の商（cooperativity quotient）は、上記の処理の場合は約1.8であった。
【００４８】
したがって、本発明の合成EGFR特異的オリゴヌクレオチドは、治療用製剤の状態の場合は、癌が関与する疾患、障害、および条件を治療する際にも有用である。このような方法では、治療量の本発明の合成オリゴヌクレオチドであり、EGFR核酸の発現の抑制に有効な本発明の合成オリゴヌクレオチドを、ある場合においては別の抗腫瘍薬を共に用いて細胞に投与する。このような細胞は、細胞培養物、組織培養物の一部の可能性があるほか、ヒトまたは他の哺乳類などの動物の一部または全体の場合がある。
【００４９】
本発明の方法で処理対象となる細胞が動物細胞の場合、本発明のオリゴヌクレオチド（治療法の一部の場合は任意の付加的な抗癌剤）を、薬学的に許容される担体に含まれる治療的組成物として従来の手順で投与する。例えば、シスプラチンおよびシスプラチン類似体、ならびに他の白金化合物および細胞毒性物質を、Slapakら （Harrison's Principles of Internal Medicine）、第14版、McGraw-Hill、NY （1998）、第86章に記載された手順で癌患者に投与することができる。
【００５０】
担体の特徴は、後述するように投与経路の影響を受ける。このような組成物は、合成オリゴヌクレオチドおよび担体に加えて、当技術分野で周知の希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および他の材料を含む場合がある。本発明の薬学的組成物は、EGFR遺伝子またはmRNAの発現の抑制を促進したり、癌細胞の増殖を低下させたりする他の活性因子および/または活性薬剤を含む場合もある。例えば、合成オリゴヌクレオチドの組み合わせ（各オリゴヌクレオチドはEGFR核酸のさまざまな領域に対応する）を、本発明の薬学的組成物に使用することができる。本発明の薬学的組成物は、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどのヌクレオチド類似体をさらに含む場合がある。このような付加的な因子および/または薬剤を薬学的組成物中に含めることで、本発明の合成オリゴヌクレオチドによる相乗効果が得られる、または本発明の合成オリゴヌクレオチドに起因する副作用を最小限に抑えることができる。逆に、本発明の合成オリゴヌクレオチドを、特定の抗EGFR遺伝子、または遺伝子産物の因子および/もしくは薬剤の製剤に含めることで、抗EGFR遺伝子の因子および/または薬剤に起因する副作用を最小限に抑えることができる。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、本発明の合成オリゴヌクレオチドが、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、液晶、またはラメラ層として凝集状態で存在する脂質などの両親媒性の薬剤と組み合わされたリポソーム状とすることが可能である。リポソーム製剤に適した脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などがあるがこれらに限定されない。1つの特に有用な脂質担体はリポフェクチンである。このようなリポソーム製剤の調製は当技術分野で周知であり、例えば米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、および第4,737,323号に記載されている。本発明の薬学的組成物は、Zhaoら、Antisense Research & Development5：185-192 （1995）に記載されているように、細胞中へのオリゴヌクレオチドの輸送を促進するシクロデキストリン、または徐放性重合体などの化合物を含む場合がある。
【００５２】
本明細書で用いる「治療的有効量」という表現は、患者にとって意味のある利益（すなわち腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の成長の抑制、または癌細胞の増殖速度の抑制）を十分に示す薬学的組成物の各活性成分の総量または方法を意味する。この表現は、単独で投与される個々の活性成分について使用する場合、成分のみを意味する。また組み合わせについて使用する場合、治療効果をもたらす活性成分の総量を意味する（併用投与、連続投与、または同時投与のいずれかの場合がある）。「治療的有効量」および「治療的有効期間」という表現は、悪性細胞の成長の低下に有効な用量および期間における既知の治療法について用いる。
【００５３】
本発明の治療法または用途を実施する際には、治療的有効量の1種、2種、またはそれ以上の本発明の合成オリゴヌクレオチドを、癌に関連した疾患または障害のある被験者に投与する。本発明の合成オリゴヌクレオチドは本発明の方法により単独で、または酸化剤もしくは細胞毒性物質を始めとするが、これらに限定されない、さまざまな抗癌剤を組み合わせて、および/または他の既知の癌治療法で投与することができる。1種類または複数の他の治療法を同時に行う場合は、本発明の合成オリゴヌクレオチドを他の治療法と同時に、または連続的に投与することができる。連続的に投与する場合は、担当医師が、他の治療法と組み合わせる本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与の適切な順序を決定する。
【００５４】
薬学的組成物に使用される本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与、または本発明の方法の実施は、眼内投与、経口摂取、吸入、または塗布、皮下注射、筋肉内注射、もしくは静脈内注射などの、さまざまな従来の方法で行われる。投与は、当業者によって判断される条件および反応に応じて、ボーラス投与、間欠投与、または連続投与とすることができる。上述した本発明の方法のいくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドを局所的に投与する（例えば眼内投与または病巣内投与）ほか、および/または全身的に投与する。「局所投与」という表現は、身体の特定の部位または領域に輸送することを意味する。一方、「全身投与」という表現は、経口摂取、または筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、もしくは腹腔内注射によって生物体全体に輸送することを意味する。
【００５５】
治療的有効量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを経口的に投与する場合、合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシルの形状をとる。錠剤として投与する場合、本発明の薬学的組成物は、ゼラチンやアジュバントなどの固体担体を付加的に含む。錠剤、カプセル、および粉末は、約5〜95%の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約25〜90%の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体として投与する場合は、水、石油、動物性油、または植物性油（ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油、ゴマ油、または合成油）などの液体担体を添加することができる。液体の薬学的組成物は、生理的食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含む場合がある。液体として投与する場合、本発明の薬学的組成物は、約0.5〜90%（重量%）の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約1〜50%の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【００５６】
治療的有効量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、眼内注射、または腹腔内注射で投与する場合、合成オリゴヌクレオチドは、パイロジェンを含まない状態の非経口的に許容される水溶液中に存在する状態とする。相応のpH、等張性、安定性などをもつ、このような非経口的に許容される溶液の調製は当技術分野の範囲に含まれる。静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または眼内注射に好ましい薬学的組成物は、合成オリゴヌクレオチドに加えて、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加注射液などの等張性溶媒、または当技術分野で周知の他の溶媒を含むべきである。本発明の薬学的組成物は、当技術分野で周知の安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、または他の付加物を含む場合もある。
【００５７】
本発明の薬学的組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、治療対象の条件の性質および重症度に、また患者が受けた事前の処置の内容に依存する。最終的には担当医師が、各患者を治療する際の合成オリゴヌクレオチド量を決定する。最初に担当医師は低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、患者の反応を観察する。最適な治療効果が患者にみられるまで、高用量の合成オリゴヌクレオチドを投与することが可能であり、その時点で用量の増加を止める。本発明の方法を実施するために用いられる、さまざまな薬学的組成物は、約10 μg〜約20 mgの合成オリゴヌクレオチド（体重または臓器重量（kg）あたり）を含むことが想定されている。
【００５８】
本発明の薬学的組成物を用いる静脈内療法の期間は、治療対象の細胞増殖性疾患の重症度、ならびに各患者の状態および潜在的な特異体質反応に応じて変動する。最終的には担当医師が、本発明の薬学的組成物を用いた静脈内療法の適切な期間を決定する。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドを全身的ではなく病巣に対して局所的（例えば腹腔内）に投与する場合、正常組織による取込みを減少させるべきである。また、オリゴヌクレオチドをリポソームに封入し、このようなリポソームを、タンパク質をリポソーム表面に挿入することで、選択された組織に標的化する方法は現在一般的に行われている。
【００６０】
本発明は、細胞毒性物質の、癌細胞に対する毒性作用を強化したり促進したりする方法を含む、さまざまな治療法を提供する。癌細胞は、化学療法薬に耐性を示したり、耐性を示すようになったりする場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、このような細胞に、抗癌治療に対する感受性を付与する。本発明の方法の治療対象となる癌細胞は、成長が制御不能な任意の細胞を含み、また卵巣癌細胞、乳癌細胞、および結腸癌細胞を含むがこれらに限定されない。化学療法薬に耐性を示す癌細胞は、本発明の方法に特に良好に反応する。
【００６１】
好ましくは、本発明の癌治療法、または癌細胞成長の抑制法は、本発明のEGFRをコードする核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド、またはその発現を抑制可能な合成オリゴヌクレオチドを含む第1の薬剤を細胞に接触させる段階、または新生物のある組織または個人に投与する段階、および細胞毒性物質を含む第2の薬剤を投与する段階を含む。オリゴヌクレオチドおよび細胞毒性物質は同時に使用したり投与したりすることができる。また、このような細胞毒性物質を、オリゴヌクレオチドの使用前または投与前に使用したり投与したりすることもできる。
【００６２】
ある好ましい態様では、細胞毒性物質は、タキサン化合物、白金由来薬剤、細胞微小管ネットワークの破壊物質、またはトポイソメラーゼIまたはII選択薬である。有用な細胞毒性物質は、パクリタキセルやドセタキセルを含むがこれらに限定されないタキサン化合物である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、Sigma（St.Louis、MO）から購入することができる。有用な白金由来薬剤には、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ならびにこれらの類似体および誘導体などがある。シスプラチン（シス-ジアンミンジクロロ白金）は、例えばBristol-Meters Squibb（Princeton、NJ）、またはSigma（St.Louis、MO）から購入することができる。オキサリプラチンは、例えばSigma（St. Louis、MO）から購入することができる。カルボプラチン（白金、ジアンミン［1,1-シクロブタン-ジカルボキシラト（2-）-0,0'］-,（SP-4-2）は、例えばBristol-Myers Squibb（Princeton、NJ）から購入することができる。有用なトポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカンおよびカンプトサールを含むがこれらに限定されない。トポテカンは、例えばSmith-Kline Beechman Italiaから購入することができる。カンプトサール（塩酸イリノテカン）は、Pharmacia & Upjohn（Peapack、NJ）から購入することができる。細胞微小管ネットワーク破壊化合物の非制限的な例には、Rhone-Poulenc、Rorer Pharmaceuticals社（Collegeville、PA）から購入することができるタキソテール（（2R,3S）-N-カルボキシ-3-フェニルイソセリン,N-tert-ブチルエステル、13-エステル）がある。
【００６３】
上記のような細胞毒性物質は、例えば「Harrison's Principles of Internal Medicine」、第14版、McGraw-Hill、NY（1998）、および「Physicians Desk Reference」、第54版、Medical Economics社、Montvale、NJ （2000）に記載された手順で癌患者に投与することができる。例えばパクリタキセルは好ましくは、最大300 mg/m2/回の用量で静脈内注射（1〜24時間）により、21日毎またはこれ未満の頻度で投与される。好ましくはドセタキセルは、最大300 mg/m2/回の用量で静脈内注射（1〜24時間）により、21日毎またはこれ未満の頻度で投与される。本発明の方法で細胞に投与される細胞毒性物質の量は、EGFR遺伝子に対するオリゴヌクレオチドで治療が行われていない癌細胞を対象に用量反応実験を行って決定することもできる。
【００６４】
本明細書に記載された、遺伝学的および分子生物学的な手法の一般原理が記載された標準的な参考文献には、OttおよびHoh、「Statistical Approaches to Genetic Mapping」、Am.J.Hum.Genet. 67：289-294（2000）；Zubay G.、GeneticsThe Benjamin/Cummings Publishing社、Menlo Park、CA（1987）；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、NY（1999）；Sambrookら、Molecular Cloning ： A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、NY（1989）；Kaufmanら（編）、Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine、CRC Press、Boca Raton、LA（1995）；およびMcPherson編、Directed Mutagenesis ： A Practical Approach、IRL Press、Oxford（1991）などがある。免疫学および炎症分野の一般原理について記載された標準的な参考文献には、Gallinら、「Inflammation ： Basic Principles and Clinical Correlates」、Raven Press、New York（1988）；Kuby, J.、「Immunology」第3版、W.H.Freeman、New York（1997）；Coliganら（編）、「Current Protocols in Immunology」、John Wiley & Sons、New York（1991）；およびHurley, J.V.、Acute Inflammation、第2版、Churchill Livingstone、New York（1983）などがある。
【００６５】
以下に示す実施例は、本発明の好ましい態様をさらに説明することを目的としており、性質の制限を受けない。当業者であれば、常用の実験法だけでなく、本明細書に記載された特定の物質および手順に同等の多くの方法を理解したり確認したりすることができる。このような同等物は、本発明の範囲に含まれるとみなされ、また添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００６６】
実施例
1．アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
EGFR mRNA（GenBankアクセッション番号M34309）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、文献に記載された選択基準を元に設計した（AgrawalおよびKandimalla、Molecular Medicine Today（2000） 6：72-81）。ヒトEGFR mRNAのさまざまな領域を標的とする、20-merのホスホロチオエート、または混合型バックボーン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は標準的な手順で実施した（例えばAgrawal （1997） Proc.Natl.Acad.Sci.（USA） 94：2620〜2625を参照）。オリゴヌクレオチドの同定および純度は、従来の31P核磁気共鳴法、キャピラリーゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション溶解温度、A269/およびMALDI/TOF質量比スペクトル分析で確認した（例えばAgrawal（1997） Proc.Natl.Acad.Sci.（USA） 94：2620〜2625を参照）。
【００６７】
2．細胞
GEOヒト結腸癌、OVCAR-3ヒト卵巣癌、およびZR-75-1ヒト乳癌細胞の系列は、American Type Culture Collection、Manassas、VAから入手した（OVCAR、ATCC No.HTB-161；ZR-75-1、ATCC No.CRL-1500）。MCF-10A Ha-ras細胞は、ヒトの非形質転換MCF-10A細胞を対象に、ヒト活性化c-Ha-ras前癌遺伝子を含む発現プラスミド、およびネオマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミドを用いた同時トランスフェクション法で得た（Ciardielloら（1990） Cell Growth Differ. 1：407-420）。いずれの細胞系列とも、細胞あたり約20,000か所（ZR-75-1）〜40,000か所（GEO）、150,000か所（OVCAR-3）、250,000か所（MCF-10A Ha-ras）のEGF結合部位をもつ機能性EGFRを発現し、高レベルのTGFαを放出する（Ciardielloら （1999） Clin.Cancer Res.5：909-916）。GEO細胞、OVCAR-3細胞、およびZR-75-1細胞は、加湿空気（95%空気＋5% CO2）中で37℃で10%熱不活性化ウシ胎児血清、20 mM HEPES（pH 7.4）、ペニシリン（100 UI/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、および4 mM グルタミン（ICN、Irvine、UK）を添加したDMEM中で維持した。MCF-10A Ha-ras細胞は、加湿空気（95%空気＋5% CO2）中で37℃で、1：1（v/v）のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、および5%熱不活性化ウマ血清、20 mM Hopes（pH 7.4）、4 mM グルタミン、0.5 μg/mlヒドロコルチゾン（Sigma、St.Louis、MO）、10 ng/ml EGF、10 μg/mlインスリン（Collaborative Research Products、Bedford、MA）、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを添加したHam's F12混合培地中で成長させた。
【００６８】
細胞（104個/ウェル）を、完全培地を添加した0.5 mlの0.3% Difco Noble寒天（Difco、Detroit、MI）中に懸濁した。この懸濁物を24マルチウェルクラスターディッシュ（Becton Dickinson、Lincoln Park、NJ）中で0.5 mlの0.8%寒天培地ベース層に重層し、1日目、2日目、および3日目に、さまざまな濃度のさまざまなEGFR-ASオリゴヌクレオチド単独、および/または1日目に各濃度の細胞毒性薬を組み合わせて処理した。10〜14日後に細胞をニトロブルーテトラゾリウム（Sigma、St.Louis、MO）で染色し、0.05 mmを上回るコロニー数をカウントした。
【００６９】
3．ウェスタンブロット解析
各濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間毎日処理したGEO細胞に由来する50 μgの総細胞溶解物を、7.5%または12%のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで分画し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗ヒトEGFRマウスMAbと、または抗ヒトp27マウスMAb（両抗体ともTransduction Laboratories、Lexington、KYから購入）とそれぞれインキュベートした後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗血清（Bio-Rad Laboratories、Milano、Italy）とインキュベートした。免疫反応タンパク質は、増強化学発光試薬（Amersham International、England）で可視化した。
【００７０】
4．アポトーシスアッセイ法
プログラム細胞死の誘導は、De Lucaら（Int.J.Cancer （1999） 8：589-594）に記載された手順で、Cell Death Detection ELISA Plusキット（Boheringher Mannheim、Indianapolis、IN）を用いて判定した。簡単に説明すると、5×104細胞/ウェルを6-マルチウェルクラスターディッシュに添加した。さまざまな濃度のオリゴ（0日目、1日目、および2日目）、および/または細胞毒性薬（2日目）で処理した後に、4日目に細胞をPBSで洗浄し、0.5 mlの溶解緩衝液を添加した。30分間のインキュベーション後に上清を回収し、DNA断片のアッセイ法を、製造業者が推奨する手順通りに405 nmでMicroplate Reader（モデル3550-UV；Bio-Rad、Milan、Italy）を用いて行った。各処理は4回行った。同様に処理した別のプレートを対象に、細胞数の解析を血球計算盤を用いて行い、細胞数の値を規格化し、得られた結果を、無処理の対照試料に対する値として表した。
【００７１】
同等物
本発明が関連する当技術分野の当業者には明らかなように、本発明は、上記のように特異的に開示された以外の状態で、本発明の精神または本質的特性から逸脱することなく具体化することができる。したがって上述した本発明の特定の態様は、説明を目的とするものであって制限する意図はない。本発明の範囲は、以上の説明に含まれる実施例に制限されるのではなく、添付の特許請求の範囲で規定される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO癌細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、0.5 μMの各オリゴヌクレオチド（AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10）、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図１Ｂ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、それぞれAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチド（0.1 μMまたは0.5 μM）で、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図１Ｃ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、それぞれAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチド（0.1 μMまたは0.5 μM）で、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRアクチビンモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図２Ａ】AS23オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する成長抑制作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図２Ｂ】AS24オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する成長阻害作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図２Ｃ】スクランブル配列を有する対照オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図３Ａ】スクランブル配列オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン1）；AS23オリゴヌクレオチド（0.1 μM、レーン2）；AS23オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン3）；MAb C225（1 μg/ml、レーン4）；またはMAb C225（5 μg/ml、レーン5）で3日間処理したGEO癌細胞におけるp27の発現を示すウェスタンブロット。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を12% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトp27 MAbで選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図３Ｂ】スクランブル配列オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン1）；AS23オリゴヌクレオチド（0.1 μM、レーン2）；AS23オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン3）；MAb C225（1 μg/ml、レーン4）；またはMAb C225（5 μg/ml、レーン5）で3日間処理したZR-75-1癌細胞におけるp27の発現を示すウェスタンブロット。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を12% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトp27 MAbで選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬で可視化した。
【図４Ａ】ヒトGEO癌細胞をAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドで処理したときのプログラム細胞死の用量依存的な誘導を示す棒グラフ。GEO細胞を、各用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモノクローナル抗体で3日間毎日処理した（0.1 μM AS23（バー1）；0.5 μM AS23（バー2）；1 μM AS23（バー3）；2.5 μM AS23（バー4）；0.1 μM AS24（バー5）；0.5 μM AS24（バー6）；1 μM AS24（バー7）；2.5 μM AS24（バー8）、0.25 μg/ml MAb C225（バー9）；0.5 μg/ml MAb C225（バー10）；1 μg/ml MAb C225（バー11）；5 μg/ml MAb C225（バー12）。C＝無処理対照、S＝2.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで処理した細胞）。アポトーシスの解析は、処置を開始してから4日後に実施した。データは、4回の実験の平均（±標準偏差）を示す。
【図４Ｂ】ヒトZR-75-1癌細胞をAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドで処理したときのプログラム細胞死の用量依存的な誘導を示す棒グラフ。GEO細胞を、各用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモノクローナル抗体で3日間毎日処理した（0.1 μM AS23（バー1）；0.5 μM AS23（バー2）；1 μM AS23（バー3）；2.5 μM AS23（バー4）；0.1 μM AS24（バー5）；0.5 μM AS24（バー6）；1 μM AS24（バー7）；2.5 μM AS24（バー8）、0.25 μg/ml MAb C225（バー9）；0.5 μg/ml MAb C225（バー10）；1 μg/ml MAb C225（バー11）；5 μg/ml MAb C225（バー12）。C＝無処理対照、S＝スクランブル配列オリゴヌクレオチド（2.5 μM）で処理した細胞）。アポトーシスの解析は、処置を開始してから4日後に実施した。データは、4回の実験の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ａ】シスプラチンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｂ】ドキソルビシンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｃ】パクリタキセルと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｄ】トポテカンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ａ】シスプラチンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｂ】ドキソルビシンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｃ】パクリタキセルと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｄ】トポテカンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
Claims (18)
- 上皮成長因子受容体（EGFR）をコードする核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドであって、245〜1117位、2407〜3201位、3786〜4102位、および4574〜45633位からなる群より選択されるEGFR mRNA領域に相補的なオリゴヌクレオチド。
- 約12〜25ヌクレオチドを有する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- 長さが約20ヌクレオチドである、請求項2記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- 2'-修飾リボヌクレオチドを含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- 2'-修飾リボヌクレオチドを含む、請求項4記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも4個の2'-修飾リボヌクレオチドを含む、請求項4記載のオリゴヌクレオチド。
- 2'-修飾リボヌクレオチドが2'-アルキルリボヌクレオチドである、請求項4記載のオリゴヌクレオチド。
- 2407〜2476位、4040〜4102位、および4574〜4633位からなる群より選択されるEGFR mRNA領域に相補的である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- 上皮成長因子受容体（EGFR）をコードする核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドが、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22を有する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- 細胞に請求項1記載のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性EGFRを発現する細胞における上皮成長因子受容体（EGFR）の合成を抑制する方法。
- 細胞に請求項1記載のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性の上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する癌細胞の成長を抑制する方法。
- 癌細胞が結腸癌、卵巣癌、または乳癌の細胞である、請求項12記載の方法。
- 細胞に請求項1記載のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を含む、機能性の上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する癌細胞のアポトーシスを促進する方法。
- 癌細胞が結腸癌、卵巣癌、または乳癌の細胞である、請求項14記載の方法。
- 細胞に請求項1記載のオリゴヌクレオチド、および細胞毒性物質を接触させる段階を含む、細胞毒性物質の癌細胞に対する成長抑制作用を強化する方法。
- 癌細胞が結腸癌、卵巣癌、または乳癌の細胞である、請求項16記載の方法。
- 細胞毒性物質が、シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、トポテカン、カンプトサール、およびタキソテールからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
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