KR0171210B1 - 암치료용 항감작 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RIα항감작 올리고뉴클레오티드 및 이의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 유효량의 RIα항감작 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적 조성물을 동물에 투여하여 동물의 특정한 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

암치료용 항감작 올리고뉴클레오티드
제1도는 HL-60 백혈병 세포의 기초 성장속도(A) 및 cAMP 동족체 또는 TPA로 처리할 경우, 이들 세포 성장에 대한 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드의 영향(B)을 그래프로 나타낸 도면이다.
(a) 세포를 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드(15μM)의 부재(○) 또는 존재(●)하에 성장시킨다(실시예 참조). 지정된 시간에 세포의 수를 이중으로 확인한다. 데이터는 4번의 실험의 평균치 ±SD로 나타낸다.
(b) 실험 (A) 후 4일째 되는 날에 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출되거나 노출되지 않은 세포를 5×105세포/디쉬로 다시 시딩(seed)하고 (0일), RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 미리 노출시킨 세포를 올리고머로 0일 및 2일에 추가로 처리한다. cAMP 동족체 및 TPA는 0일에 한 번 가한다. 세포수는 4일에 컬터(Coulter) 계측기로 센다. 8-Cl, 8-Cl-cAMP(10μM) ; 8-Cl+N6-B, 8-Cl-cAMP (5μM)+N6-벤질-cAMP(5μM) ; TPA(10-8M). 데이터는 4번의 실험의 평균치 ±SD로 나타낸다.
제2도는 HL-60 세포의 형태학적 형질전환에 대한 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드의 영향을 그래프로 나타낸 도면이다. RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출되거나 노출되지 않는 세포를 제1b도에서 기재한 바와 같이 cAMP 동족체 '또는 TPA로 처리한다. 4일째 되는 날(제1b도 참조), 세포를 둘베고(Dulbecco)의 인산염 완충 생리식염액으로 2회 세척하고, 세포 원심분리하여 유리 슬라이드 위에 펠릿화시킨다. 생성된 세포준비물을 고정시키고, Wright 색소로 염색한다(배율은 x180).
제3도는 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 HL-60 백혈병 세포에 감소된 RIαmRNA 발현을 보여주는 노던 블롯트(Northern blot)결과를 나타내고 있는 도면이다. 세포를 RIα항감작 올리고 데옥시누클레오티드(15μM)에 8시간 동안 노출시키거나 노출시키지 않는다. 전체 RNA의 분리 및 노던 블롯트 분석은 실시예에 기재된 방법에 따른다.
(a) RNA의 에티디움 브로마이드 염색 ; M, 리보솜 RNA의 마커 ; 레인 1, 2 세포들을 RIα항감작 올리고머에 노출시키거나 노출시키지 않는다.
(b) 노던 블롯트 분석 ; 동일한 니트로셀룰로오즈 필터를 순차적 방법으로 RIα및 액틴 프로브(probe)에 하이브리드시킨다. 레인 1, 2 세포를 RIα항감작 올리고머에 노출시키거나 노출시키지 않는다.
제4도는 HL-60 백혈병 세포에 있어서, RIα및 RllβcAMP 수용체 단백질의기초적 수준 및 유도된 수준에 대한 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드의 영향을 나타내는 SDS-PAGE 결과를 도시한 도면이다. 세포를 RIα항감작 올리고데옥시누클레이티드(15μM)에 노출시키거나, 제1도에 기재된 바와 같이 cAMP 동족체로 처리한다. 세포 추출물 준비, 8-N3-[32P]cAMP의 광활성 도입, 및 항-RIα또는 항-RIIβ항혈청 및 단백질 A 세파로즈를 사용한 면역침전, 그리고 용해화된 항원-항체 복합체의 SDS-PAGE는 실시예에 기재된 방법에 따른다. 이미 면역화시킨 혈청 대조군에 대하여 동시에 수행한 방, 면역침전 밴드가 검출되지 않는다. M, 공지된 분자량의 표지된 마커단백질 ; RIα분자량이 48,000인 RI(시그마) ; RIIα, 분자량이 56,000인 RII(시그마). 레인 RIα및 RIIβ는 8-N3-[32P]cAMP로만 광친화성 표지하고, 레인 1 내지 3은 8-N3-[32P]cAMP로 광친화성 표지한 다음, 항-RIα또는 항-RIIβ항혈청으로 면역침전시킨다. 8-CI, 8-CI-cAMP(5μM) ; N6-벤질, N6-벤질-cAMP(5μM). 도표상의 데이터는 자동방사선 사진의 농도계측 스캐닝으로 정량화하여 나타낸 것이다. 데이터는 RIα항감작 올리고머에 노출되지 않고, cAMP 동족체로 처리하지 않은 대조 세포 내에서의 수준에 대해 상대적으로 표시한 것이다. 이 수준을 임의의 단위 1과 동일한 것으로 한다. 데이터는 3번의 실험의 평균 ±SD로 한 것이다. A와 B는 각각 항-RIα및 항-RIIβ항혈청으로 면역침전시킨 것이다.
제5도는 서열확인 번호 1(O-올리고 및 S-올리고 유도체)인 RIα항감작 올리고데옥시누클레이티드에 의한 인간 암세포주의 성장 억제를 대조군과 비교하여 그래프로 도시한 도면이다. 세포주 ; SK-N-SH, 신경아세포종 ; LS-174T, 결장암 ; MCF-7, 유방암 ; TMK-1, 위암, E2, 에스트라디올-17β.
제6도는 서열확인 번호 1인 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 SK-N-SH 인간 신경아세포종 세포의 형태학적 변화를 나타낸 도면이다.
제7도는 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드 및 이것의 포스포로티오에이트 동족체가 무의식의 마우스에서 LS-174T 인간 결장암의 생체내 성장을 억제하는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면이다. 제7a도는 올리고데옥시누클레오티드 농도 의존적인 종양 성장의 억제를 보여준다. O-올리고, RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드 ; S-올리고, RIα항감작 올리고머의 포스포로티오에이트 동족체. O-올리고 또는 S-올리고의 지시량을 함유하는 콜레스테롤 펠릿(총 중량 20㎎)을 0시간에 한 번 피하주사하고, 종양 크기를 측정한다. 종양 체적(재료 및 방법은 실시예 3 참조)은 7개 종양의 평균 ±S.D.를 나타낸 것이도. 제7b도는 종양 성장에 대한 항감작 올리고데옥시누클레오티드 포스포로티오에이트 동족체의 일시적 영향을 보여준다. 콜레스테롤 펠릿(총 중량 20㎎)내의 0.3㎎ 투여량으로 지시된 S-올리고를 주당 2회 피하주사하였으며, 종양 체적(재료 및 방법은 실시예 3 참조)은 7개 종양의 평균 ±S.D.를 나타낸 것이다.
본 발명은 의약품 화학 분야에 속한다. 특히, 본 발명은 특정한 항감작 올리고누클레오티드 및 암치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
세포 성장 및 분화를 위한 조절 메카니즘은 종양세포에서 파괴된다[참조 ; Potter, V.R. (1988) Adv. Oncol. 4, 1-8 ; Strife, A. Clarkson, B(1988) Semin. Hematol. 25, 1-19 ; Sachs, L. (1987) Cancer Res. 47, 1981-1986]. 세포내의 조절인자인 cAMP는 세포 증식 및 분화를 조절하는 역할을 한다고 생각되었다[참조 ; Pastan, I., Johnson, G.S. Anderson, W.B. (1975) Ann. Rev. Biochem. 44, 491-522 ; Prasad, K.N. (1975) Biol. Rev. 50, 129-165 ; Cho-Chung, Y.S. (1980) J. Cyclic Nucleotide Res. 6, 163-177 ; Puck, T.T (1987) Somatic Cell Mot. Genet. 13, 451-457].
세포 성장에 대한 cAMP의 억제 또는 자극 효과는 N6-O2'-디부티릴아데노신 3', 5'-시클릭 모노포스페이트와 같은 cAMP 동족체 또는 비정상적이고 연속적인 높은 수준으로 세포내 cAMP를 증가시키는 약제가 사용된 연구에서 이미 보고되었고, 이용가능한 데이터는 매우 다르게 해석된다[참조 ; Chapowski, F.J., Kelly, L.A. Butcher, R.W. (1975) Adv. Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylat. Res. 6, 245-338; Cho-Chung, Y.S. (1979) in Influence of Hormones on Tumor Development, eds. Kellen, J.A. Hilf, R.(CRC, Boca Raton, FL), pp. 55-93); Prasad, K.N. (1981) in The Transformed Cell, eds. Cameron, L.L. Pool, T.B.(Academic, New York), pp. 235-266; Boynton, A.L. Whitfield, J.F. (1983) Adv. cyclic Nucleotide Res. 15, 193-294].
최근, 부위 선택적인 cAMP 동족체가 발견되었고, 이는 시험관내에서 I형 cAMP 의존성 단백질 키나제보다 II형의 정제된 제제와의 결합을 보다 선호함을 보여주고 있으며[참조 ; Robihson-Steiner, A.M. Corbin, J.D. (1983) J. Biol. Chem. 258, 1032-1040 ; Φgreid, D., Ekanger, R., Suva, R.H., Miller, J.P., Sturm, P., Corbin, J. D. DΦskeland, S.O. (1985) Eur. J. Biochem. 150, 219-227], 인간 및 설치류의 광범위한 암세포 세포주에 걸쳐 강력한 성장 억제, 분화 및 역형질전환을 유발시킨다[참조 ; Katsaros, D., Tortora, G., Tagliaferri, P., Clair, T., Ally, S., Neckers, L., Robins, R.K. Cho-Chung, Y.S. (1987) FEBS Lett. 223, 97-103; Tortora, G., Tagliaferri, P., Clair, T., Colamonici, O., Neckers, L.M., Robins, R.K. Cho-Chung, Y.S. (1988) Blood, 71, 230-233; Tagliaferri, P., Katsaros, D., Clair, T., Robins, R.K. Cho-Chung, Y.S. (1988) J. Biol. Chem. 263, 409-416]. I형과 II형 단백질 키나제는 이들의 조절 서브유니트(각각 RI 및 RII)에 의해 구별된다[참조 ; Corbin, J.D., Keely, S.L. Park, C.R. (1975) J. Biol. Chem. 250, 218-225 ; Hofmann, F., Beavo, J.A. Krebs, E.G. (1975) J.Biol. Chem. 250, 7795-7801]. sp 개의 상이한 조절 서브유니트인 RIα, RIβRIIα(RII54) 및 RIIβ(RII51)는 유전자/mRNA 수준에서 현재 확인되었다 [참조 ; RIα(이전에는 RI으로 표시)(Lee, D., Carmichael., D.F., Krebs, E.G. McKnight, G.S. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3608-3612), RIβ(Clegg, C.H., Cadd, G.G. McKnight, G.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3703-3707), RIIα(RII54)(Scott, J.D., Glaccum, M.B., Zoller, M.J., Uher, M.D., Hofmann, D.M., Mcknight, G.S. Krebs, E.G. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5192-5196) 및 RIIβ(RII51)(Jahnsen, T., Hedin, L., Kidd, V.J., Beattie, W.G., Lohmann, S.M., Walter, U., Durica, J., Schulz, T.Z., Schlitz, E., Browner, M., Lawrence, C.B., Goldman, D., Ratoosh, S.L. Richards, J.S. (1986) J. Biol. Chem. 261, 12352-12361)]. 또한, 두 개의 상이한 촉매 서브유니트인 Cα와 Cβ가 확인되었다. [Cα(Uhler, M.D., Carmichael, D.F., Lee, D.C. Chrivia, J.C., Krebs, E.G. McKnight, G.S. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1300-1304) 및 Cβ(Uhler, M.D., Chrivia, J.C. McKnight, G.S. (1986) J. Biol. Chem. 261, 15360-15363; Showers, M.O. Maurer, R.A. (1986) J. Biol. Chem. 261, 16288-16291)]. 그런, I형 또는 II형 단백질 키나제 조절 서브유니트와 이들 촉매 서브유니트 중 하나의 선택적인 공동 발현은 발견되지 않았다[참조 ; Shower, M.O. Maurer, R.A. (1986) J. Biol. Chem. 261, 16288-16291].
부위 선택적인 cAMP 동족체에 의한 성장 억제는 암세포에 있어서 RIIβ의 증가와 함께 RIα를 동등하게 감소시켜 RIIβ/RIα의 증가를 초래한다[참조 ; Ally, S., Tortora, G., Clair, T., Grieco., D., Merlo, G., Katsaros, D., Φgreid, D., DΦskeland, S.o., Jahnsen, T. Cho-Chung, Y.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6319-6322; Cho-Chung, Y.S. (1989) J. Natl. CancerInst. 81. 982-987].
이러한 RIα대 RIIβ의 선택 변조는 이전에 연구된 cAMP 동족체인 N6, O2'-디부티릴아데노신 3', 5'-시클릭 모노포스페이트에 의한 처리에 의해 모방되지 않는다[참조 ; Ally, S., Tortora, G., Clair, T., Grieco, D., Merlo, G., Katsaros, D., Φgreid, D., DΦskeland, S.O., Jahnsen, T. Cho-Chung, Y.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6319-6322]. 추가로 성장 억제는 핵으로의 RIIβ의 빠른 이동 및 RIIβ유전자의 전사에 있어서의 증가와 연관되어 있다[참조 ; Ally, S., Tortora, G., Clair, T., Grieco., D., Merlo, G., Katsaros, D., øgreid, D., Døskeland, S.O., Jahnsen, T. Cho-Chung, Y.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6319-6322]. 이러한 결과는 RIIβ가 cAMP 성장 조절 기능에 있어서 중요한 역할을 한다는 가설을 지지한다[참조 ; Cho-Chung, Y.S. (1989) J. Natl, Cancer Inst. 81, 982-987].
항감작 RNA 서열은 원핵세포[참조 ; Mizuno, T., Chou, M-Y, 및 Inouye, M. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, (1966-1970] 및 진핵세포[참조 ; Heywood, S.M. Ncleic Acids Res., 14, 6771-6772 (1986)] 양쪽에서 자연발생적인 생물학적 유전자 발현 억제제로서 기재되어 있고, 이들 서열은 아마도 상보적인 mRNA 서열에 하이브리드하는 기능을 하여 하이브리드에 의한 번역정지를 유발시킨다[참조 ; Paterson, B.M., Roberts, B.E., 및 Kuff, E.L., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4370-4374]. 항감작 올리고데옥시누클레오티드는 특이적 유전자 또는 RNA 메시지에 상보적인 제제화된 짧은 합성 누클레오티드 서열이다. 비록 표적 DNA 또는 mRNA 서열에 이들 올리고머가 결합하지만, 상기 유전자의 전사 또는 번역은 선택적으로 막을 수 있으며, 이러한 유전자에 의해 발생되는 질병 과정을 중지시킬 수 있다. mRNA의 세포질내 위치는 세포로 들어가는 항감작 올리고데옥시누클레오티드가 쉽게 접근 가능한 것으로 간주되는 표적을 제공하고, 따라서, 당해 분야에서의 많은 연구들의 표적으로서의 RNA에 집중되고 있다. 일반적으로, 항감작 올리고데옥시누클레오티드의 사용은 시험관내에서 및 조직배양에서 유전자 발현의 조절을 조사하는 유용한 수단을 제공한다.[참조 ; Rothenberg, M., Johnson, G., Laughlin, C., Green, I., Craddock, J., Sarver, N., 및 Cohen, J.S. (1989) J. Natl. Cancer Inst., 81, 1539-1544].
본 발명은 RIα에 대한 항감작 O-올리고누클레오티드 및 S-올리고누클레오티드를 접촉시킴으로써 백혈병 세포 내에서의 RIα의 발현을 억제하는 것은 세포증식의 억제 및 세포분화의 자극을 유발한다는 사실의 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 RIα항감작 오릴고누클레오티드 및 이의 암치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 RIα의 첫 번째 100 N-말단 코돈내의 영역에 상보적인 15량체 내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드에 관한 것이다(서열확인 번호 : 6).
본 발명은 또한 RIα에 대해 상보적인 항감적 DNA의 단편인 15량체 내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드에 관한 것이다(서열확인 번호 : 5).
본 발명은 또한 RIα의 첫 번째 100 N-말단 코돈내의 영역에 상보적인 하나이상의 15량체 내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 : 6) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 성장 억제에 민감한 암세포의 성장을 억제시켜 암을 치료하는 방법 및 치료가 필요한 동물에게 암세포 성장 억제량의 RIα항감작 올리고누클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 동물에 있어서 암세포 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
항감작 요법은 세포내에 위치한 표적 폴리누클레오티드에 결합하는 외인성 올리고누클레오티드를 투여하는 것이다. 용어 항감작(antisense)은 이러한 올리고누클레오티드가 이것의세포내 표적, 예를 들면 RIα에 상보적임을 의미한다[참조 ; Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989 ; 및 Synthesis 1 ; 1-5(1988)]. 본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드는 암세포 성장 억제 활성을 향상시키는(제5도 및 제7a도 참조) S-올리고누클레오티드(포스포로티오에이트 유도체 또는 S-올리고, 참조 ; Jack Cohen, supra)와 같은 유도체를 포함한다.
S-올리고(누클레오시드 포스포로티오에이트)는 인산염 그룹의 비가교성 산소원자가 황원자로 대체된, 올리고누클레오티드(O-올리고)의 등전자 동족체이다. 본 발명의 S-올리고는 황전이제인 3H-1,2-벤조디티올-3온-1,1-디옥사이드로, 상응하는 O-올리고를 처리하여 제조할 수 있다[참조 ; Iyer, R.P. et al., J. Org. Chem. 55 : 4693-4698 (1990) ; 및 Iyer, R.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112 : 1253-1254 (1990), 한편, 이들의 내용은 본원에서 참고문헌으로 통합된다].
본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드는 RIα게놈 또는 상응하는 mRNA의 첫 번째 100N-말단 코돈에 상보적인 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 상기 코돈과 안정하게 하이브리드할 수 있다. 이 영역에 상보적인 올리고누클레오티드는 단백질 키나제의 RIαmRNA에 대한 선택적인 하이브리드 형성을 허용하며, 단백질 키나제의 다른 조절 서브유니트를 특정하는 mRNA와는 하이브리드하지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드는 RIαmRNA와 하이브리드하는, 서열확인 번호 5인 항감작 DNA 분자의 15 내지 30량체 단편이다. 다른 방법으로, RIα항감작 올리고누클레오티드는 RIα의 첫 번째 100 N-말단 코돈내의 영역에 상보적인 15 내지 30량체 올리고누클레오티드이다(서열확인 번호 : 6). 가장 바람직하게, RIα항감작 올리고누클레오티드는 서열확인 번호 1, 서열확인 번호 2, 서열확인 번호 3 또는 서열확인 번호 4이다.
또한, 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된, 하나이상의 본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드를 유효량 포함하는 약제학적 조성물이 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 단일의 RIα항감작 올리고누클레오티드가 사용된다. 다른 구체예에서는 RIα게놈의 인접한 영역에 상보적인 두 개의 RIα항감작 올리고누클레오티드가 사용된다. RIα게놈 또는 상응하는 mRNA의 인접한 영역에 상보적인 두 개의 RIα항감작 올리고누클레오티드의 투여는 RIα게놈 전사 또는 mRNA 번역을 보다 효과적으로 억제하여, 암세포 성장을 보다 유효하게 억제할 수 있다.
바람직하게는, RIα항감작 올리고누클레오티드는 세포에 의한 항감작 분자의 섭취를 향상시키는 약제와 함께 동시 투여한다. 예를 들면, RIα항감작 올리고누클레오티드는 리포좀 형태일 수 있는 친유성 양이온 화합물과 조합될 수 있다. 누클레오티드를 세포내로 도입하는 리포좀의 사용은, 예를 들면, 미합중국 특허 제 4,897,355 호 및 제 4,394,448호에 기재되어 있고, 이러한 내용 전체는 본 명세서의 참조문헌으로 통합된다. 또한, 생물학적 물질을 포함하는 리포좀의 일반적인 제조 방법은 미합중국 특허 제 4,235,871 호, 제 4,231,877 호, 제 4,224,179 호, 제 4,753,788 호, 제 4,673,567 호, 제 4,247,411 호, 제 4,814,270 호를 참조로 한다.
다른 방법으로, RIα항감작 올리고누클레오티드는 친유성 담체(예를 들어, 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 포함하는 다수의 스테롤 중 하나)와 조합될 수 있다. 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.
또한, RIα항감작 올리고누클레오티드는 세포에 의해 섭취되는 펩티드에 콘쥬게이트될 수 있다. 유용한 펩티드의 예로는 펩티드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩티드 독소가 있다. 종양세포에 의해 선택적으로 섭취되는 펩티드를 선택함으로써, 항감작 제제의 특이적인 전달이 달성될 수 있다. RIα항감작 올리고누클레오티드는 활성화된 아미노알킬 유도체의 형성에 의해 5'OH 기를 통해 공유결합될 수 있다. 그런 다음, 선택된 펩티드는 아미노 및 술프히드릴 반응성 헤테로 이작용기성 시약에 의하여 활성화된 RIα항감작 올리고누클레오티드에 공유결합할 수 있다. 후자는 펩티드내에 존재하는 시스테인 잔기에 결합한다. 펩티드에 결합된 RIα항감작 올리고누클레오티드를 세포에 노출시키면, 펩티딜 항감작 인자는 엔도사이토시스(endocytosis)되고, RIα항감작 올리고누클레오티드는 표적 RIαmRNA에 결합하여 번역을 억제한다[참조 ; PCT 공개공보 제 PCT/US89/02363 호].
항종양 억제로서 본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드는 위암, 췌장암, 폐암, 유방암, 항문암, 결장직장암, 머리 및 목의 종양, 신경아세포종, 흑색종 및 각종 백혈병을 포함하는 다양한 암(이로써 한정되지는 않는다)의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드는 하기의 종양 시스템에 대하여도 활성이 있다 : F9 기형종, SK-N-SH 신경아세포종, TMK-1 위암, HL-60 전골수세포 백혈병, 백혈병 L-1210, 백혈병 P388, P1534 백혈병, 프렌드(Friend) 바이러스 백혈병, 백혈병 L4946, 멕카(Mecca) 임파육종, 가드너(Gardner) 임파육종, 리지웨이(Ridgway) 골육종, 육종 180(복수증), 바그너(Wagner) 골육종, 육종 T241, 루이스(Lewis) 폐암, 암 755, CD8F, MCF-7 유방암, 결장 38, LS-174T 결장암, 암 1025, 에를리히(Ehrlich) 암(복수증 및 충실성 종양), 크룹스(Krubs)2 암(복수증), 바쉬폴드(Bashford) 암 63, 선암 E 0771, B16 흑색종, 하딘-파시(Hardin-Passey) 흑색종, 길로마(Giloma) 26, 미요나(Miyona) 신암, 워커(Walker) 암육종 256, 플렉스너-조블링(Flexner-Jobling) 암, 젠센(Jensen) 육종, 이글레시아스(Iglesias) 육종, 이글레시아스 난소 종양, 머피-스턴(Murphy-Sturn) 임파육종, 요시다(Yoshida) 육종, 던닝(Dunning) 백혈병, 라우스 치킨(Rous Chicken) 육종 및 크랩(Crabb) 햄스터 육종.
본 발명의 RIα항감작 올리고누클레오티드 및 약제학적 조성물은 의도하는 목적을 달성하기 위한 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 비경구, 피하, 정맥, 근육내, 복강내 또는 경피성 루트에 의해 투여될 수 있다. 1회 투여량은 수용자의 연령, 건강상태 및 체중, 동시치료의 종류에 따라 다르고, 경우에 따라 치료 빈도 및 원하는 효과의 성질에 따라 다르다.
본 발명의 범주내의 조성물은 RIα항감작 올리고누클레오티드가 목적하는 암세포의 증식을 억제하고/하거나 분화를 자극하는데 효과적인 양으로 함유되어 있는 모든 조성물을 포함한다. 개인에 요구에 따라 가변적이지만, 각 성분의 유효량의 적절한 범위는 당업자에 의해 결정가능하다. 전형적으로, RIα항감작 올릴고누클레오티드는 포유동물, 예를 들면 사람에 0.005 내지 1㎎/㎏/일의 투여량으로 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 당량을 치료되는 포유동물의 체중을 기준으로 하루에 투여할 수 있다.
용액 속의 원료 화학약제로서 RIα항감작 올리고누클레오티드를 투여하는 것외에, 부형제 및 RIα항감작 올리고누클레오티드를 약제학적으로 사용 가능한 제제로 가공하기 쉽게 하기 위한 보조제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 적합한 담체를 함유하는 약제학적 제제의 일부로서 RIα항감작 올리고누클레오티드를 투여할 수 있다.
비경구 투여용으로 적합한 제제는 수용성 형태, 예를 들면 수용성 염내의 RIα항감작 올리고누클레오티드의 수용액을 포함한다. 또한, 적당한 유성의 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들면 참깨유 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면 나트륨 카르복 시메틸 셀룰로오즈, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 항감작 올리고누클레오티드는 당해 분야의 통상의 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직하게는, 항감작 올리고누클레오티드는 고체상 합성에 의해 제조된다. 올리고누클레오티드의 화학합성을 알아보기 위해 Goodchild, J., Bioconjugate Chemistry, 1 : 165-167 (1990)을 참조한다. 다른 방법으로, 항감작 올리고누클레오티드는 통상의 올리고누클레오티드의 합성을 전문으로 하는 다수의 회사로부터 입수할 수 있다.
이하, 본 발명을 일반적으로 설명하며, 단지 설명의 목적으로 본 명세서에 삽입된 실시예를 참조하여 동일한 내용이 이해되어야 하며, 특별한 언급이 없는 한, 이는 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 모든 특허출원, 특허 및 공보, 경우에 따라 상기 및 하기에 언급한 모든 것들은 참고문헌으로 통합된다..
[실시예]
[실시예1]
[올리고데옥시누클레오티드]
본 연구에 사용된 21량체 올리고데옥시누클레오티드는 Midland Certified Reagent 회사(Midland, TX)에서 합성되었고, 하기의 서열을 갖는다 : 인간 RIα[참조 ; Sandberg, M., Tasken, K., Oyen, O., Hansson, V. Jahnsen, T. (1987) Biochem. Biophy. Res. Commun. 149, 939-945] 항감작, 5'-GGC-GGT-ACT-GCC-AGA-CTC-CAT-3'(서열확인 번호 1) ; 인간 RIIβ[참조 ; Levy, F.O., Oyen, O., Sandberg, M., Tasken, K., Eskild, W., hansson, V. Jahnsen, T. (1988) Mol. Endocrinol., 2, 1364-1373] 항감작, 5'-CGC-CGG-GAT-CTC-GAT-GCT-CAT-3' ; 인간 RIIα[참조 ; Oyen, O., Myklebust, F., Scott, J.D., Hansson, V. Jahnsen, T. (1989) FEBS Lett. 246, 57-64] 항감작, 5'-CGG-GAT-CTG-GAT-GTG-GCT-CAT-3' ; 및 무작위 서열의 올리고누클레오티드가 모든 위치에서 모든 4개의 누클레오티드의 혼합물로 제조되었다.
[세포 성장 실험]
10% 가열-불활성화된 우태아 혈청, 페니실린(50U/㎖), 스트렙토마이신(500㎍/㎖) 및 1mM 글루타민(Gibco, Grand Istand, NY)이 보충된 RPM1 1640 배지 속의 현탁액 배양중에 성장한 세포를 5×105세포/디쉬로 시딩한다. 시딩 후, 그리고 매 48시간마다 올리고데옥시누클레오티드를 가한다. 세포수는 컬터 계측기로 센다. 4일 동안 올리고데옥시누클레오티드에 노출시키거나 노출시키지 않은 세포를 5×105세포/디쉬로 다시 시딩하고(0일), 올리고데옥시누클레오티드에 미리 노출시킨 세포를 0일 및 2일에 상기 올리고머로 추가처리한다. cAMP 동족체 [제공 ; Dr. R.K. Robins, Nucleic Acid Research Institue, Costa Mesa, CA] 또는 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA)를 0일에 한 번 가한다. 세포수를 4일째 되는 날 확인한다.
[8-N3-[32P]cAMP로 광친화성 표지한 후 RIα및 RIIβcAMP 수용체 단백질의 면역 침전]
세포 추출물을 0 내지 4℃에서 준비한다. PBS 2회 세척한 후 세포 펠릿(2×106세포)을 단백질 가수분해 역제제 [참조 ; Tortora, G., Clair, T. Cho-Chung, Y.S. (1990) Proc. natl. Acad. Sci. USA 87, 705-708]를 함유하는 0.5㎖의 완충액 텐(Ten) (0.1M NaCl, 5mM MaCl2, 1% Nonidet P-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 2KIU/㎖ 소의 아프로티닌(aprotinin) 및 20mM 트리스-HCI, pH 7.4)에 현탁시키고, 와동(vortex)-혼합한 다음, 22-게이지 니들을 통해 10회 통과시키고, 4℃에서 30분동안 방치한 다음, 750×g에서 20분 동안 원심분리시킨다. 생성된 상청액을 세포 용해물로 사용한다. 8-N3-[32P]cAMP (60.0 Ci/mmol)의 광활성화 혼입, 항-RIα또는 항-RIIβ항혈청 [제공 ; Dr. S.O. DΦskeland, University of Bergen, Bergen, Norway] 및 단백질 A 세파로즈를 이용한 면역 침전 및 용해된 항원-항체 복합체의 SDS-PAGE는 이미 기재된 방법에 따른다[참조 ; Tortora, G., Clair, T. Cho-Chung, Y.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 705-708 ; Ekanger, R., Sand, T.E., Ogreid, D., Christoffersen, T. DΦskeland, S.O. (1985) J. Biol. Chem. 260, 3393-3401].
[cAMP 의존적인 단백질 키나제 분석]
돌베코 인산염 완층 생리식염액으로 2회 세척한 후, 세포 펠릿(2×106세포)을 둔스(Dounce) 호모제나이저 100 스트로크를 사용하여 0.5㎖의 20mM 트리스(pH 7.5), 0.1mM 나트륨 EDTA, 1mM 디티오트레이톨, 0.1mM 펩스타틴, 0.1mM 안티파인, 0.1mM 키모스타틴, 0.2mM 류펩틴, 0.4㎎/㎖ 아프로티닌 및 0.5㎎/㎖ 대두 트립신 억제제에 용해시킨다. 5분 동안 원심분리시킨 후(Eppendorf 5412), 상청액을 0.7㎎ 단백질/㎖로 조절하고 즉시 분석한다 [참조 ; Uhler, M.D. McKnight, G.S. (1987) J. Biol. Chem. 262, 15202-15207]. 분석(40㎍의 전체 체적)은 30℃에서 10분동안 수행하고, 이는 200μM ATP, 2.7×106cpm γ[32P]ATP, 20mM MgCl2, 100μM 켐프티드(Sigma K-1127)[참조 ; Kemp, B.E., Graves, D.J., Benjamin, E. Krebs, E.G. (1977) J. Biol. Chem. 252, 4888-4894], 40mM 트리스(pH 7.5), ±100μM 단백질 키나제 역제제(Sigma P-3294) [참조 ; Cheng, H.-C., Van Patten, S.M., Smith, A.J. Walsh, D.A. (1985) Biochem. J. 231, 655-661], ±8μM cAMP 및 7㎍의 세포 추출물을 함유한다. 켐프티드의 인산화는 포스포셀룰로오즈 필터(Whatman, P81) 상에 20㎕의 배양 혼합물을 스폿팅하여 결정하고, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 인산으로 세척한다[참조 ; Roskoski, R. (1983) Methods Enzymol. 99, 3-6]. 방사능을 에코노플루어(Econofluor)-2(NEN Research Products NEF-969)를 사용하여 액체 신틸레이션에 의해 측정한다.
[전체 RNA의 분리 및 노던 블롯트 분석]
세포(인산염 완충 생리식염액으로 2회 세척한 것, 108)를 25mM 구연산 나트륨(pH 7.0), 0.5% 사르코실(N-라우로일사르코신 Na＋) 및 0.1M β-메르캅토에탄올을 함유하는 4.2M 구아니딘 이소티오시아네이트에 용해시키고, 용해물을 균질화시킨 다음, 전체 세포성 RNA를 하기 문헌에 기재된 바와 같이 CsCl 큐션(5.7M CsCl, 10mM EDTA)을 통해 침전시킨다[참조 ; Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.Y. Rutter, W.J. (1977) Biochemistry 18, 5284-5288]. 20mM 3-[N-모르폴린]프로판-술폰산(pH 7.0), 50% 포름아미드 및 6% 포름알데히드를 함유하는 전체 세포성 RNA를 65℃에서 10분 동안 변성시키고, 변성 1.2% 아가로즈-2.2M 포름알데히드 겔을 통해 전기영동 시킨다. 이어서, 상기 겔을 비오트랜스(Biotrans) 나일론 맴브레인(ICN Biomedicals)에 토마스 방법[참조 ; Thomas, P.s. (1980) Proc. natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205]으로 옮기고, 다음과 같은32P로 표지된 두 개의 니크-번역된(nick-translated) cDNA 프로브에 하이브리드시킨다. : 인간 cAMP 의존적인 단백질 키나제 I형 조절 서브유니트, RIα[참조 ; Sandberg, M., Tasken, K., Oyen, O., Hansson, V. Jahnsen, T. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 939-945, 제공 ; Dr. T. Jahnsen, Institute of Pathology, Rikshospitalet, Oslo, Norway] 및 인간 β 액틴(Oncor p7000 β액틴)에 대한 전체 코딩 영역을 함유하는 1.5킬로베이스(kb) cDNA 클론.
[결과]
RIα항감작 올리고누클레오티드는 15μM 농도에서 HL-60 세포의 증식 속도에 대해 즉각적인 영향을 준다. 배양 4 내지 5일째 되는 날까지 RIα항감작 올리고머에 노출되지 않은 세포는 지수형 성장속도를 나타내는 반면, 항감작 올리고머에 노출시킨 세포는 성장 속도가 감소되고, 마침내 복제가 멈추게 된다(제1a도). 이러한 세포증식에 대한 억제 효과는 배양 기간에 걸쳐 지속된다. 성장 억제는 세포사멸에 기인한 것이 아니고, 세포는 RIα항감작 올리고머(15μM)에 7일 동안 노출된 후에 90% 이상이 살아 있으며, 이는 전방 및 측면 스캐터를 이용하여 유동 세포계수법으로 평가한 것이다. RIα감작, RIIα또는 RIIβ항감작 또는 무작위 서열 올리고데옥시누클레오티드는 이러한 성장 억제 효과가 없다.
배양중 4일 동안 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출되거나 노출되지 않은 세포를 다시 시딩하고, cAMP 동족체 도는 TPA에 의한 처리에 대한 이들의 반응을 조사한다. RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출되지 않은 세포에서 8-CI-cAMP(10μM)는60% 성장 억제시키고, 80% 성장 억제는 8-CI-cAMP(5μM)+N6-벤질-cAMP(5μM)에 의해 이루어지며(제1b도)[참조 ; Tortora, G., Tagliaferri, P., Clair, T., Colamonici, O. Neckers, L.M., Robins, R.K. Cho-Chung, Y.s. (1988) Blood 71, 230-233], TPA(10-8M)는 60% 성장 억제시킨다(제1b도). 이에 비해 항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 세포는 성장지연을 나타내고(항감작 올리고머에 노출되지 않은 세포의 성장 속도의 25%), cAMP 동족체 또는 TPA 어느 것도 추가의 성장지연을 초래하지 않는다(제1b도).
HL-60 세포는 부위 선택적인 cAMP 동족체로 처리시, 단핵세포 분화를 진행한다. cAMP 동족체로 처리 전 및 후에 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출되거나 노출되지 않은 세포의 형태학적 변화를 조사한다. 제2도에 도시한 바와 같이, RIα항감작 올리고머에 노출된 세포에서, 8-CI-cAMP+N6-벤질-cAMP는 핵 대 세포질 비율 감소, 많이 주름지고 액포화된 세포질 및 인의 손실로 특성화되는 단핵세포의 형태학적 변화를 유도한다. 놀랍게도, 동일한 형태학적 변화는 세포가 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출될 때 유도된다(제2도). 더욱이, 항감작 올리고머에 의해 유도된 형태학적 변화는 TPA에 의해 유도된 것과 구별할 수 없다(제2도).
RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 HL-60 세포에서 유도된 성장 억제 및 단핵세포 분화가 세포내 올리고머의 영향으로 인한 것임을 증명하기 위해 RIαmRNA 수준을 결정한다. 제3도에 도시한 바와 같이, 3.0kb RIαmRNA [참조 ; Sanderg, M., Tasken, K., Oyen, O., Hansson, V. Jahnsen, T. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 939-945]는 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 8시간 동안 노출된 세포에서 사실상 감지할 수 없고(제3b도, 레인 2), RIαmRNA의 감소는 에티디움 브로마이드 염색에 의해 나타난 바와 같이, 전체 RNA의 양이 감소된 것으로 인한 것은 아니다(제3a도의 레인 1과 레인 2를 비교). 역으로, 액틴 mRNA 수준의 상승은 RIα항감작 올리고머에 노출된 세포에서 감지된다(제3b도). 액틴 mRNA 수준의 증가가 세포골격 구조의 변화를 나타내는지 여부에 대해서는 얄려져 있지 않다.
이들 세포에 있어서 cAMP 수용체 단백질의 수준은 8-N3-[32P]cAMP로 이들 수용체 단백질을 광친화성 표지한 후, 항-RIα및 항-RIIβ항혈청을 사용한 면역침전에 의해 측정한다 [참조 ; Tortora, G., Clair, T. Cho-Chung, Y.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 705-708 ; Ekanger, R., Sand, T.E., Ogreid, D., Christoffersen, T. DΦskeland, S.O. (1985) J. Biol. Chem. 260, 3393-3401]. 대조권 세포에 있어서, 8-CI-cAMP+N6-벤질-cAMP에 의한 처리는 RIIβ의 3배 증가와 함께 RIα의 약 70% 감소를 가져오고, RIIβ/RIα의 비를 10배 증가시킨다(제4도)[참조 ; Cho-Chung, Y.S. (1989) J. Natl. Cancer Inst. 81, 982-987]. 이들 세포를 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 4일 동안 노출시키면 RIα및 RIIβ수준에 모두 뚜렷한 변화를 초래하게 된다. 즉, RIIβ의 5배 증가와 함께 RIα의 80% 감소가 일어나 RIIβ/RIα의 비가 대조권 세포에 비해 25배 증가한다(제4도). 성장 억제 및 분화는 RIα항감작 올리고머에 노출 3내지 4일 후 감지될 수 있기 때문에, RIα및 RIIβ단백질 수준의 변화는 분화가 시작되기 위한 필수적인 초기 변화라 할 수 있다.
제4도에서 데이터는 항감작 올리고데옥시누클레오티드에 의한 RIα억제가 RIIβ수준의 보상적 증가를 가져온다는 것을 보여준다. C 서브유니트의 양의 변화가 없는 이러한 RI 및 RII의 조화된 발현은 이미 증명되었다[참조 ; Hofman, F., Bechtel, P.J. Krebs, E.G. (1977) J. Biol. Chem. 252, 1441-1447 ; Otten, A.D. McKnight, G.S. (1989) J. Biol. Chem. 264, 20255-20260]. RIβ의 증가는 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 후, 이들 세포에서 유도된 분화의 원인이 될 수 있다. RIIβmRNA 또는 RIIβ단백질 수준의 증가는 K-562 만성 골수구 백혈병 세포에서의 cAMP 동족체-유도 분화[참조 ; Tortora, G., Clair, T., Katsaros, D., Ally, S., Colamonici, O., Neckers, L.M., Tagliaferri, P., Jahnsen, T., Robins, R.K. Cho-Chung, Y.S. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2849-2852] 및 포렌드 적혈구 백혈병 세포의 적혈구 분화 [참조 ; Schwartz, D.A Rubin, C.S. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6296-6303]와 관련이 있다. 최근 보고에서 [참조 ; Tortora, G., Clair, T. Cho-Chung, Y.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 705-708], 본 발명자들은 RIIβ가 HL-60 세포의 cAMP-유도 분화에 필수적이라는 직접적인 증가를 제공하였다. RIIβ항감적 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 HL-60 세포는 cAMP 동족체의 처리에 반응하지 않고 계속 성장하였다.
HL-60 세포의 분화에 있어서 RIIβ의 필수적인 역할은, 이들 세포를 RIα및 RIIβ항감적 올리고데옥시누클레오티드에 동시에 노출시킬 경우 추가로 설명될 수 있다. 표 1에 나타낸 바와 같이, RIα항감적 올리고데옥시누클레오티드는 단핵세포 표면항원의 발현에서 뚜렷한 증가를 유도하고[참조 ; Leu 15(Landay, A., Gartland, L., Clement, L.T. (1983) J. Immunol. 131. 2757-2761) and Leu M3 (Dimitriu-Bona, A., Burmester, G.R., Waters, S.J. Winchester, R.J. (1983) J. Immunol. 130, 145-152)], 미성숙 골수성 세포와 관련된 마커(marker)의 감소가 따른다 [참조 ; My9 (Talle, M.A., Rao, P.E., Westberg, E., Allegar, N., Makowski, M., Mittler, R.S. Goldstein, G. (1983) Cell. Immunol. 78, 83 ; Todd, R.F. III, Griffin, J.D., Ritz, J., Nadler, L.M. Abrams, T. Schlossman, S.F. (1981) Leuk. Res. 5, 491)]. 표면 카커 발현에 있어서 이러한 변화는 세포가 RIα및 RIIβ항감작 올리고데옥시누클레오티드 모두에 동시 노출된 경우 사라진다(표 1). RIIβcAMP 수용체는 HL-60 세포에서 감지되지 않고[참조 ; Cho-Chung, Y.S., Clair, T., Tagliaferri, P., Ally, S., Katsaros, D., Tortora, G., Neckers, L., Avery, T.L., Crabtree, G.W. Robins, R.K. (1989) Cancer Invest. 7(2), 161-177], RIIα항감작 올리고데옥시누클레오티드는 RIα항감작 올리고머의 효과를 간섭하지 않는다(표 1).
RIα및 RIIβ항감작 올리고데옥시누클레오티드 모두에 노출된 세포는 cAMP 동족체에 의한 처리에 상관없이 성장이 억제되지도 않고 분화되지도 않는다. 이러한 결과는 cAMP 의존적인 성장 조절 경로가 차단되었음을 반영한 것이다. 이러한 조건하에 세포들은 더 이상 cAMP에 의존하지 않지만, 아마도 또 다른 경로를 통해 생존 및 분화할 것이다. 따라서, RIα및 RIIβ유전자 발현의 억제는 돌연변이 세포주에서와 유사한 비정상인 세포 성장 조절을 유도하고 [참조 ; Gottesman, M.M. (1980) Cell 22, 329-330]. 이들은 불완전하거나 결함이 있는 cAMP 의존적인 단백질 키나제의 조절 서브유니트를 함유하며, 더 이상 cAMP 자극에 반응하지 않는다.
이러한 결과는 cAMP가 RIα또는 RIIβ수용체 단백질의 이용가능성에 의존하여, 세포 증식에 대한 양성 또는 음성의 이중 제어 시그날을 도입한다는 것을 입증하고 있다. RIIβ발현의 향상과 함께 RIα의 억제를 초래하는 RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드는 세포 독성없이 백혈병 HL-60의 말단 분화를 유도한다.
RIIβ항감작 또는 RIα및 RIIβ항감작 올리고데옥시누클레오티드 모두에 노출된 세포는 유리된 C 서브유니트를 생성하는 조건에서 계속 성장하고, cAMP 자극에 방응하지 않게 되기 때문에, RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 세포에서의 유리된 C 서브유니트의 증가가 분화의 원인은 아닌 듯하다. 이러한 사실을 직접 증명하기 위해, 항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출되거나 노출되지 않는 세포의 포스포트랜스퍼라제 활성을, 기질로서 켐프티드를 사용하여[참조 ; Kemp, B.E., Graves, D.J., Benjamin, E. Krebs, E.G. (1977) J. Biol. Chem. 252, 4888-4894], cAMP의 포화 농도의 존재 및 부재하에, 그리고 열안정성 단백질 키나제 역제제의 존재 및 부재하에 측정한다[참조 ; Cheng, H.-C., Van Patten, S.M., Smith, A.J. Walsh D.A. (1985) Blochem. J. 231, 655-661]. 이러한 분석 방법은 해리된 C 및 전체 C 활성의 상대적 수준을 정확히 결정해 준다. 미처리된 HL-60 세포로부터의 세포 추출물은 해리된 C 수준이 매우 낮고, cAMP에 의해 36배 자극받는다(표 2). 이러한 cAMP-자극 활성은 열안정성 단백질 키나제 억제제에 의해 거의 완전히 억제되고(표 2), 이는 측정한 전체 C 활성이 cAMP 의존적인 단백질 키나제임을 보여준다. RIα항감작, RIIβ항감작 또는 RIα및 RIIβ항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출된 세포에서, 유리된 C 활성은 비록 전체 cAMP-자극 활성에서 작은 차이가 존재하지만, 노출되지 않은 대조군 세포에 비해 증가되지 않았다(표 2). 이러한 결과는 유리된 촉매 서브유니트가 HL-60 세포에서 관찰되는 분화의 원인이 아니라는 직접적인 증거가 된다.
또한, RIαcAMP 수용체 단백질의 과도한 발현이 조사된 대부분의 인간 유방 및 결장의 원발암에서 발견되었고[참조 ; Bradbury, A.W., Miller, W.R., Clair, T., Yokozaki, H. Cho-Chung, Y.S. (1990) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 31, 172], 이는 종양 성장에 있어서 cAMP 수용체의 중요한 생체내 역할을 암시한다. 그러나, 세포 증식에 있어서 RIα의 정확한 역할은 현재 알려져 있지 않다. RIα는 C 서브유니트를 적정해 냄으로써 RIIβ생산을 억제할 수 있거나, 세포 증식을 유도하는 유사분열 시그날의 변환기(transducer)일 수 있다. 이러한 결과로서, RIα항감작 올리고데옥시누클레오티드가 세포 증식 및 분화에서의 cAMP 수용체 단백질의 역할에 대한 연구를 위해 유용한 유전자적 도구를 제공하고, 악성 종양을 치료하는 새로운 시도에 기여함을 알 수 있다.
표면 항원 분석은 단핵세포 또는 골수성 세포와 반응하는 단일클론성항체를 사용한 유동 세포계수법에 의해 수행된다. 사용된 단일클론성 항체는 Leu15, LeuM3, 및 My9이다. 2×10 세포가 각 샘플에 대해 분석되고, 세포 게이팅(gating)은 전방 및 측면 스캐터를 이용하여 수행한다. 숫자는 양성 % 및 3번의 실험의 평균 수치를 나타낸다.
세포를 제1a도에 도시된 바와 같이, 15μM 농도의 RI, RII, 또는 RI및 RII항감작 올리고데옥시누클레오티드 각각에 4일 동안 노출시킨다. 데이터는 3번의 동일한 실험의 이중 측정의 평균 ±SD로 나타낸 것이다.
*피코몰(picomole) 인산염이 분/㎎ 단백질마다 캠프티드에 전이되었다.
[실시예 2]
다음에, 서열확인 번호 1의 RI항감작 올리고누클레오티드를 실험적 종양을 가진 마우스에 투여한다. 인산염 완충 생리식염액에 현탁시킨 LS-174T 인간 결장암 세포(2×10 세포)가 오른쪽 옆구리에 이미 주입된, 무의식의 마우스의 왼쪽 옆구리 피하에 RI항감작 올리고누클레오티드의 펠릿(25㎎/㎏) 및 콜레스테롤(1000㎎/㎏)을 주사한다. 종양 측정 및 마우스 무게를 처리한 첫째날(시행일)과 처리 마지막날(시행일+5)에 기록한다. 평균 종양 무게 변화(△)는 밀리미터단위의 길이 및 너비 측정에 기초를 두고 있다. 몇일 후, 종양 성장은 대조군 세포에 비해 억제되었다(표 3 참조). 대조권 및 처리동물에 있어서 체중의 변화는 없었다.
기타 시험관내 실험에서, 서열확인 번호 1의 RI항감작 올리고누클레오티드를 신경아세포종, 결장암, 유방암 및 위암 세포를 함유하는 디쉬에 가한다. 제5도에 나타낸 바와 같이, 서열확인 번호 1의 RI항감작 올리고누클레오티드는 대조군 세포와 비교하였을 때 모든 형태의 암세포 증식을 억제하였다. 또한 서열확인 번호 1의 RI항감작 올리고누클레오티드는 인간 신경아세포종 세포의 분화를 유발하였다(제6도 참조).
[실시예 3]
다음에, 무의식의 마우스에서 LS-174T 인간 결장암 성장에 대한 O-올리고 및 S-올리고 RI항감작 올리고누클레오티드의 영향을 비교한다.
[재료 및 방법]
21량체 항감작 올리고데옥시누클레오티드 및 첫 번째 코돈으로부터 출발하는 인간 RI, 인간 RIImRNA 전사물에 상보적인 이들의 포스포로티오에이트 동족체, 및 동일한 크기의 짝이 안맞는(무작위) 서열 올리고머를 합성한다[Milligen Biosearch 870 DNA synthesizer (Bedford, MA)].
상기 올로고머는 하기의 서열을 갖는다 :
RI항감작, 5'-GGC-GGT-ACT-GCC-AGA-CTC-CAT-3' ; RII항감작, 5'-CGC-CGG-GAT-CTC-GAT-GCT-CAT-3' ; 및 무작위 올리고, 5'-CTA-TCG-ATC-GAT-CGA-TCG-TAC-3'.
LS-174T 인간 결장암 세포(2×10 )를 무의식의 마우스에 피하 주사하고, 콜레스테롤 펠릿 또는 50% 참깨유 에멀션 형태로 항감작 올리고데옥시누클레오티드를 1주일 후, 평균 종양 크기가 일반적으로 25-50㎎일 때 피하 투여한다. 종양 체적은 길이와 너비를 측정하고, 식 4/3πr (여기서 r=(길이+너비)/4이다)으로 계산한다.
[결과 및 토의]
제7도는 콜레스테롤 펠릿으로 0.2 및 0.5㎎ 투여량으로 한 번에 피하투여한 (0시간), RI항감작 올리고데옥시누클레오티드(O-올리고)의 투여량 및 시간 의존적인 영향을 보여주고 있다. 7일째 되는 날, 대조(비처리) 종양과 비교할 때 각각 약 20 및 46%로 성장을 억제하였다(제7a도). 놀랍게도, 0.2㎎ 투여량(콜레스테롤 펠릿, 피하투여)으로 RI항감작 포스포로티오에이트 동족체(S-올리고)를 투여하였을 때, 7일째 60%로 성장을 억제하여, O-올리고 항감작보다 3배나 더 효능이 컸다(제7a도). RI항감작 S-올리고의 성장 억제 효과는 동물을 오랜기간 처치할 경우, 보다 큰 효과가 있다. RI항감작 S-올리고 0.3㎎을 콜레스테롤 펠릿으로 1주당 2번씩 3주간 피하 주사하면 80% 성장을 억제시키고, 종양성장은 처리 2주후 거의 멈춘다(제7b도). RI항감작 O-올리고 또는 S-올리고를 50% 참깨유 에멀션으로 피하 투여하여도 유사한 결과를 얻는다. RI항감작 S-올리고는 동물에 있어서 뚜렷한 독성은 없으며, 체중 감소 또는 기타 중독증상은 처리 3주 동안 관찰되지 않는다.
RI항감작 S-올리고에 의해 유도된 성장 억제효과는 상기 올리고머의 고유한 효과이다 : RII항감작 또는 RI항감작 올리고머와 동일한 크기의 무작위 서열(짝이맞지 않는 서열) S-올리고는 종양 성장에 대해 영향을 미치지 않는다(제7b도).
RI항감작 올리고데옥시누클레오티드로 처리한 무의식 마우스의 결장암에서 관찰된 성장 억제가 올리고머의 세포내 효과 때문이라는 사실을 보다 확실히 하기 위해, 이들 종양내의 RI및 RIIcAMP 수용체 단백질 수준을 측정한다. RI수준은 인간 RI에 대항하는 단일클론성 항체[제공 ; Drs. T. Lea, University of Oslo, Oslo, Norway 및 S.O. DΦskeland, University of Bergen, Bergen, Norway]를 사용하여 면역 블롯팅하여 측정하고[참조 ; Ally, S., Proc. natl. Acad. Sci. USA 85 : 6319-6322 (1988)]. RII는[ P] 8-N-cAMP로 RII를 광친화성 표지한 후, 항-RII항혈청[제공 ; Dr. S. O. DΦskeland]으로 면역 침전시켜 측정한다[참조 ; Tortora, G., et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87 : 705-708 (1990)]. 표 4에 나타낸 바와 같이, RI항감작 S-올리고머 처리는 비처리 대조군 종양과 비교할 때, 종양내의 RI수준을 뚜렷이 감소(80% 감소)시킨다. RI항감작 S-올리고머에 의한 RI발현의 이러한 억제는 RII수준을 2배로 증가시킨다(표 4). 단백질 키나제의 촉매 서브유니트의 양의 변화가 없는 이러한 RI및 RII의 조화된 발현은 RI항감작 올리고데옥시누클레오티드에 노출시 성장억제와 분화를 나타내는 HL-60 백혈병 세포에서 입증되었다. 한편, 종양 성장에 영향을 주지 않는 RII항감작 S-올리고머(표 4)로 처리 후, RII수준의 80% 억제와 함께 RI수준의 50% 증가가 종양에서 관찰되었다(제7도). 또한, 종양 성장에 영향을 미치지 않는 부작위(짝이 맞지 않는 서열) S-올리고머는 RI수준에 영향을 미치지 않는다(표 4). 따라서, RI항감작 올리고머로 처리시 RI발현의 감소는 종양 성장을 감소시키거나 중지시킨다. 이러한 결과는 cAMP가 RI또는 RII수용체 단백질의 이용가능성에 의존하여, 세포 증식에 대한 양성 또는 음성의 이중 조절 시그날을 변환한다는 것을 설명하고 있다. RI를 억제시키고, RII발현을 향상시키는 RI항감작 올리고데옥시누클레오티드는 동물에 있어서 중독증상 없이 무의식의 마우스의 충실성 결장암의 생체내 성장을 억제시킨다. RI항감작 올리고머의 포스포로티오에이트 동족체(S-올리고)는 변형되지 않은 올리고데옥시누클레오티드(O-올리고)의 항감작보다 더 큰 효능을 갖는다. O-올리고에 비해 보다 쉽게 세포속으로 들어가는 S-올리고는 엔도뉴클레아제에 대한 내성이 있고, 목표는 mRNA 또는 DNA와의 하이브리드 형성에 있어서 높은 효율을 갖는다[참조 ; Stein, C.A., et al., In : J.S. Cohen (ed.), Oligodeoxynucleotides : Antisense Inhibitors of Gene Expression, pp.97-117. Boca Raton, FL. CRC Press, Inc. (1989)].
이러한 결과는 악성 종양의 억제에 있어서 항감작 올리고데옥시누클레오티드의 놀라운 생체내 효과를 처음으로 시사해 주는 것이다. 항감작 올리고데옥시투클레오티드, 특히 이것의 포스포로티오에이트 동족체에 의한 cAMP 의존적인 단백질 키나제의 I형 조절 서브유니트 RI의 고갈은 중독 증상없이 종양 성장을 생체내에서 성공적으로 중지시키고, 임상적용을 위한 항감작 올리고데옥시누클레오티드의 커다란 가능성을 암시한다.
지적된 바와 같이 S-올리고의 처리는 제7b도에서와 동일하다. 실험 종료시(3주후), 종양 추출물을 이미 언급한 바와 같이 제조하고[참조 ; Ally, S. et al., Cancer Res. 49 : 5650-5655 (1980)], RI및 RII각각에 대한 면역블롯팅 및 면역침전을 이미 언급한 바와 같이 수행한다[참조 ; Ally, S., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 85 : 6319-6322 (1988) 및 Tortora, G et. al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87 : 705-708 (1990)]. 데이터는 자동방사선 사진의 농도 스캐닝에 의해 정량화하여 나타낸 것이다. 데이터는 임의의 단위 1로 설정한 대조군 조양(미처리) 수준에 대해 상대적으로 표현한 것이다.
데이터는 7개 종양의 평균 ±SD로 나타낸 것이다.
하기의 서열 목록에서, 서열확인 번호 1은 RI에 대한 첫 번째 7N-말단 코돈에 상응하는 항감작 서열이다. 서열확인 번호 2는 RI에 대한 8 -13 코돈에 상응하는 항감작 서열이다.
서열확인 번호 3은 RI에 대한 14 -20 코돈에 상응하는 항감작 서열이다. 서열확인 번호 4는 RI에 대한 94 -100 코돈에 상응하는 항감작 서열이다. 서열확인 번호 5는 RI에 대한 1 -100 코돈에 상응하는 항감작 서열이다. 서열확인 번호 6은 RI에 대한 1 -100 코돈에 상응하는 항감작 서열이다.
[서열목록]
서열확인 번호 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 : 21 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 1 :
서열확인 번호 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 2 :
서열확인 번호 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 3 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 4 :
서열확인 번호 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 300 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 5 :
서열확인 번호 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 300 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 6 :
서열확인 번호 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21 염기
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA
(iv) 안티센스 : 예
(ix) 서열 : 서열확인 번호 7 :

Claims (34)

  1. RIα의 첫 번째 100 N-말단 코돈내의 영역에 상보적인 15내지 30량체의 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 6).
  2. 제1항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 DNA인 항감작 올리고누클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체인 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 1).
  4. 제1항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 18량체인 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 2).
  5. 제1항에 있어서, 항감작 올릴고누클레오티드가 21량체인 항감각 올리고누클레오티드(서열확인 번호 3).
  6. 제1항에 있어서, 항감작 올릴고누클레오티드가 21량체인 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 4).
  7. RIα에 상보적인 항감작 DNA의 단편인 15내지 30량체의 항감작 올릴고누클레오티드(서열확인 번호 5).
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 O-올리고누클레오티드인 항감작 올리고누클레오티드.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 S-올리고누클레오티드인 항감작 올리고누클레오티드.
  10. RIα의 첫 번째 100 N-말단 코돈내의 영역에 상보적인 하나이상의 15내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 6) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암치료용 악제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서 RIα의 첫 번째 100 N-말단 코돈내의 인접한 영역에 상보적인 두 개의 15 내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 6)를 포함하는 암치료용 약제학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 스테롤인 암치료용 약제학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 리포좀인 암치료용 약제학적 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 항감작 올릴고누클레오티드가 DNA인 암치료용 약제학적 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체(서열확인 번호 1)인 암치료용 약제학적 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 18량체(서열확인 번호 2)인 암치료용 약제학적 조성물.
  17. 제10항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체(서열확인 번호 3)인 암치료용 약제학적 조성물.
  18. 제10항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체(서열확인 번호 4)인 암치료용 약제학적 조성물.
  19. 제10항에 있어서, 상기 15내지 30량체의 항감작 올리고누클레오티드는 RIα에 상보적인 항감작 DNA의 단편(서열확인 번호 5)인 것을 특징으로 하는 암치료용 약제학적 조성물.
  20. 제10항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 O-올리고누클레오티드인 암치료용 약제학적 조성물.
  21. 제10항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 S-올리고누클레오티드인 암치료용 약제학적 조성물.
  22. RIα의 첫 번째 100N-말단 코돈내의 영역에 상보적인 하나이상의 15 내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드(서열확인 번호 6)의 암세포 성장 억제량으로 치료가 필요한 인간을 제외한 동물에 이를 투여하여, 성장억제에 민감한 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 DNA인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  24. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체(서열확인 번호 1)인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  25. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 18량체(서열확인 번호 2)인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  26. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체(서열확인 번호 3)인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  27. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 21량체(서열확인 번호 4)인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 15 내지 30량체 항감작 올리고누클레오티드가 RIα코돈에 상보적인 항감작 DNA의 단편(서열확인 번호 5)인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 흑색종, 육종 및 암종으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  30. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 투여됨을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  31. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 O-올리고누클레오티드인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  32. 제22항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 S-올리고누클레오티드인 인간을 제외한 동물 속의 암세포 성장을 억제시키는 암치료 방법.
  33. 제7항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 O-올리고누클레오티드인 항감작 올리고누클레오티드.
  34. 제7항에 있어서, 항감작 올리고누클레오티드가 S-올리고누클레오티드인 항감작 올리고누클레오티드.
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