JP2020527329A - Ｂ４ｇａｌｔ１バリアント及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本明細書において、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ核酸分子、ならびにポリペプチド、これらの分子の存在の検出方法、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ核酸分子、ならびにポリペプチドの調節方法、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ核酸分子、ならびにポリペプチドの存在または非存在の検出による心血管病態の発症リスクの確認方法、ならびに心血管病態の治療方法を提供する。

Description

政府補助金への言及
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＨＬ１２１００７に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表の参照
本出願には、ファイルサイズ１６１ＫＢを有する１８９２３８００２０２ＳＥＱという名称のテキストファイルとして、２０１８年６月４日に作成し、電子的に提出した配列表が含まれる。配列表は、参照により本明細書に援用される。
本開示は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ核酸分子、ならびにポリペプチド、これらの分子の存在の検出方法、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ核酸分子、ならびにポリペプチドの調節方法、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ核酸分子、ならびにポリペプチドの存在または非存在の検出による心血管病態の発症リスクの確認方法、ならびに心血管病態の治療方法を提供する。
特許、公開出願、登録番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物を、本明細書全体において引用する。引用する各刊行物は、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に援用する。
β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）は、様々な複合糖質及び糖構造の生合成に役割を果たすＩＩ型膜結合糖タンパク質をコードするβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｂ４ＧＡＬＴ１によってコードされる酵素は、糖タンパク質のＮ結合オリゴ糖部分のプロセシングに重要な役割を果たし、タンパク質結合糖鎖は、多くの場合、糖タンパク質の生物学的機能を調節する。したがって、Ｂ４ＧＡＬＴ１活性の欠損は、Ｎ結合型オリゴ糖を含むすべての糖タンパク質の構造を変化させる可能性がある。ロング型のＢ４ＧＡＬＴ１酵素はトランスゴルジ網に局在しており、Ｎ結合オリゴ糖の高マンノース型から複合型への生合成処理の過程で、ガラクトシル残基をＮ−アセチルグルコサミン残基へ転移させる。ガラクトシル残基の付加はシアル酸付加の前提条件であるため、Ｂ４ＧＡＬＴ１の欠損は間接的な影響を及ぼしてシアル酸残基の付加をブロックし、したがって血漿糖タンパク質の半減期を変化させ得る。グリコシル化の欠損により、ＬＤＬ受容体を含む様々な糖タンパク質の細胞内輸送が損なわれることが報告されている。さらに、Ｎ結合型オリゴ糖の構造異常は、タンパク質の折りたたみを変化させる可能性があり、それが糖タンパク質の機能及びその分泌を変化させ得る。タンパク質の大部分はＮ結合型グリコシル化を有しており、例えば、細胞表面受容体（例えば、ＬＤＬ受容体及びインスリン受容体）及び様々な循環血漿タンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ｂ及びフィブリノーゲン）が挙げられる。Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のタンパク質短縮型変異のホモ接合性に起因する遺伝性疾患の患者の報告が存在する。そのような患者の一人は、ａ）重度の神経発達異常（水頭症を含む）、ｂ）ミオパチー、及びｃ）血液凝固異常を特徴とする重度の表現型を有していた。予測通り、循環トランスフェリンに由来するオリゴ糖は、ガラクトース及びシアル酸残基を欠いていた。同じ遺伝的欠損を有する２名の追加の患者は、凝固障害、肝障害、及び異形性の形質を特徴とする、より軽い表現型を示した。
米国及びその他の西欧諸国において、心血管疾患は主要な死因である。脳卒中及び心筋梗塞などのアテローム血栓性心血管疾患の主なリスク因子として、血中コレステロールの増加及び血栓傾向が挙げられる。脂質代謝及び凝固に関与する多くのタンパク質はグリコシル化されており、したがってＢ４ＧＡＬＴ１による調節を受ける。心血管病態の発症と進行の根底にある遺伝的因子を知ることにより、リスク層別化を向上させ、新規治療戦略の基盤を提供することができるだろう。
本開示は、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型ゲノム配列（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含み、また、その核酸配列が完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチドを含むことを条件とする核酸分子を提供する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型ｍＲＮＡ配列（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含み、また、その核酸配列が完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置でセリンをコードすることを条件とする核酸分子を提供する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型ｃＤＮＡ配列（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含み、また、その核酸配列が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置でセリンをコードすることを条件とする、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を提供する。
本開示はまた、これらの核酸分子のいずれか１つ以上を含むベクターまたは外来性ドナー配列を提供する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含む単離されたポリペプチドを提供する。
本開示はまた、宿主細胞において活性な異種プロモーターに作動可能に連結したこれらの核酸分子のいずれか１つ以上を含む宿主細胞を提供する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養し、単離されたポリペプチドを回収することによる、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの産生方法を提供し、その場合、核酸分子は宿主細胞において活性な異種プロモーターに作動可能に連結しており、それによって核酸分子は発現する。
本開示はまた、これらの核酸分子またはポリペプチド、及びそれらの安定性を高めるための担体を含む組成物を提供する。
本開示はまた、ヒト対象由来の生体試料に対してアッセイを行い、生体試料中の核酸分子が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むかどうかを判定することを含む、ヒト対象におけるＢ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の存在または非存在の検出方法を提供する。
本開示はまた、ヒト対象由来の生体試料に対してアッセイを行い、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの存在を判定することを含む、ヒト対象の完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの存在の検出方法を提供する。
本開示はまた：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対してアッセイを行い、生体試料中の核酸分子が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むかどうかを判定し、ｂ）完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が生体試料中に検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、あるいは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が生体試料中に検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することを含む、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法を提供する。
本開示はまた：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対してアッセイを行い、生体試料中のＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが、３５２位に対応する位置にセリンを含むかどうかを判定し、ｂ）完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが生体試料中に検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、あるいは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが生体試料中に検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと判定することを含む、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法を提供する。
本開示はまた、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に結合するか、または切断するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡ分子を提供し、ガイドＲＮＡは、野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７の位置に対応する位置を含むか、またはそれに近接する（例えば、以下で説明するような特定の数のヌクレオチド以内で）内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするＤＮＡターゲティングセグメントを含む。
本開示はまた、細胞のゲノムを：ａ）Ｃａｓタンパク質、及びｂ）Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させることを含む、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の改変方法を提供し、その場合、ガイドＲＮＡ認識配列は、野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むか、またはそれに近接し（例えば、以下で説明するような特定の数のヌクレオチド以内で）、Ｃａｓタンパク質は内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断する。
本開示はまた、細胞のゲノムを：ａ）Ｃａｓタンパク質、及びｂ）Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡと接触させることを含む、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の改変方法を提供し、その場合、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、開始コドンから約１，０００ヌクレオチド以内に存在し、Ｃａｓタンパク質は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の発現を切断するか、または変化させる。
本開示はまた、発現ベクターを細胞に導入することを含む、細胞の改変方法を提供し、発現ベクターは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む。
本開示はまた、発現ベクターを細胞に導入することを含む、細胞の改変方法を提供し、発現ベクターは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドと少なくとも約９０％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子を含み、そのポリペプチドもまた、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含む。
本開示はまた、ポリペプチドまたはその断片を細胞に導入することを含む細胞の改変方法を提供し、ポリペプチドは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドと少なくとも９０％同一であり、そのポリペプチドもまた、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含む。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法を提供し、本方法は、対象に：ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸；ｂ）ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を導入することを含み、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、ガイドＲＮＡ認識配列は、野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むか、またはそれに近接し、本方法はまた、ｃ）野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の５’の標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の３’の標的配列にハイブリダイズする３’相同性アーム、ならびに５’相同性アーム及び３’相同性アームに隣接する、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸インサートを含む、外来性ドナー配列を導入することを含み、Ｃａｓタンパク質は、対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断し、外来性ドナー配列は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子と組み換わり、外来性ドナー配列の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子との組換え時に、野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドにセリンが挿入される。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法を提供し、本方法は、対象に：ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｂ）第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードする核酸を導入することを含み、第１のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、開始コドンから約１，０００ヌクレオチド以内に存在し、本方法はまた、ｃ）完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む発現ベクターを導入することを含み、Ｃａｓタンパク質は、対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断するかまたは発現を変化させ、発現ベクターは、対象の細胞内で組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の配列にハイブリダイズしてＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの発現を減少させるアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを対象に導入することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、発現ベクターを対象に導入することを含む、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法を提供し、発現ベクターは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含み、発現ベクターは、対象の細胞内で組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現する。
本開示はまた、発現ベクターを対象に導入することを含む、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法を提供し、発現ベクターは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、発現ベクターは、対象の細胞内でＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸を発現する。
本開示はまた、ｍＲＮＡを対象に導入することを含む、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法を提供し、ｍＲＮＡは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードし、ｍＲＮＡは、対象の細胞内でＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドを発現する。
本開示はまた、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を対象に導入することを含む、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型核酸分子またはポリペプチド（ｒｓ５５１５６４６８３と呼ばれるＳＮＰを含む）の保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法を提供する。
本明細書に記載または例示する方法のいずれかにおいて、心血管病態は、アテローム性動脈硬化症のリスクを増加させる１つ以上の血清脂質のレベルを有し得る。血清脂質には、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロール、またはその任意の亜分画（例えば、ＨＤＬ２、ＨＤＬ２ａ、ＨＤＬ２ｂ、ＨＤＬ２ｃ、ＨＤＬ３、ＨＤＬ３ａ、ＨＤＬ３ｂ、ＨＤＬ３ｃ、ＨＤＬ３ｄ、ＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３、リポタンパク質Ａ、Ｌｐａ１、Ｌｐａ１、Ｌｐａ３、Ｌｐａ４、またはＬｐａ５）の１つ以上が含まれる。心血管病態には、冠動脈石灰化レベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、心膜脂肪レベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、アテローム血栓性病態が含まれ得る。アテローム血栓性病態には、フィブリノーゲンレベルの上昇が含まれ得る。アテローム血栓性病態には、フィブリノーゲン媒介性血餅が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲンレベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲン媒介性血餅が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅が含まれ得る。フィブリノーゲン媒介性血餅またはフィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅は、体内のどの静脈または動脈にも存在し得る。
バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１とＬＤＬの代表的なゲノム全体での関連付けの結果を示す。 バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１とＬＤＬの代表的なＴＯＰＭｅｄ ＷＧＳ関連付けの結果を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１に関連する上位ＳＮＰの代表的なハプロタイプ構造の結果を示す。 エクソーム配列決定によって同定したアーミッシュにおけるＬＤＬとバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の相関性を示す。 アーミッシュでは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の出現頻度が１０００倍超濃い頻度であることを示す。 アーミッシュでは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の出現頻度が１０００倍超濃い頻度であることを示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒと血清脂質の減少との相関性を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒと血清脂質の減少との相関性を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒと血清脂質の減少及びＡＳＴの増加との高い相関性を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒと血清脂質の減少及びＡＳＴの増加との高い相関性を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒとすべての脂質亜分画との相関性を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒとフィブリノーゲンレベルの低下との相関性を示す。 示された濃度のアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを注射したゼブラフィッシュ幼虫の受精後５日でのｂ４ｇａｌｔ１転写産物の減少を示す。 示された濃度のアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを注射したゼブラフィッシュ幼虫の受精５日後でのアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドのオフターゲット効果の診断マーカーを示す。 実験ごとの受精後５日間のゼブラフィッシュ幼虫１００匹のホモジネートの平均ＬＤＬ濃度を示す。 ゼブラフィッシュにおける５０ｐｇのヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの共発現によるＬＤＬ−ｃ表現型のレスキューを示す。 標的遺伝子型判定を使用したＢ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２ＳとＬＤＬの遺伝的関連付けの結果を示す。 Ｆｌａｇ−３５２ＡｓｎまたはＦｌａｇ−３５２Ｓｅｒの細胞内局在の共焦点顕微鏡画像を示す。 トランスゴルジ網マーカーＴＧＮ４６に関連する内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１、Ｆｌａｇ−３５２Ａｓｎ、及びＦｌａｇ−３５２Ｓｅ細胞内局在の共焦点顕微鏡画像を示す。 （パネルＡ及びＢ）は、Ｂ４ＧＡＬＴ１タンパク質の定常状態レベルに対する３５２Ｓｅｒの効果を示す。（パネルＡ）３５２Ａｓｎまたは３５２Ｓｅｒ Ｆｌａｇタグタンパク質融合体のいずれかを遊離ＥＧＦＰとともに発現するＣＯＳ７細胞。（パネルＢ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって測定したＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル。 （パネルＡ及びＢ）は、Ｂ４ＧＡＬＴ１タンパク質の定常状態レベルに対する３５２Ｓｅｒの効果を示す。（パネルＡ）３５２Ａｓｎまたは３５２Ｓｅｒ Ｆｌａｇタグタンパク質融合体のいずれかを遊離ＥＧＦＰとともに発現するＣＯＳ７細胞。（パネルＢ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって測定したＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル。 （パネルＡ、Ｂ、及びＣ）は、３５２Ｓｅｒ変異が活性に及ぼす影響を示す。（パネルＡ及びＢ）ＣＯＳ７細胞で発現し、Ｂ４ＧＡＬＴ１またはＦｌａｇのウエスタンブロットで分析した３５２Ａｓｎまたは３５２Ｓｅｒ Ｆｌａｇタグタンパク質融合体を発現するＣＯＳ７細胞。（パネルＣ）免疫沈降物のＢ４ＧＡＬＴ１活性。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓ遺伝子型群ごとのトリシアロ／ジオリゴ比を示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓのマイナー（ＳＳ）及びメジャー（ＮＮ）ホモ接合体の一致ペア由来糖タンパク質のＮ−グリカン分析の代表的なＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ−ＭＳスペクトルを示す。 Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓのマイナー（ＳＳ）及びメジャー（ＮＮ）ホモ接合体の一致ペア由来糖タンパク質のＮ−グリカン分析の代表的なＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ−ＭＳスペクトルを示す。
本明細書に記載するように、配列決定研究により、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にアスパラギンの代わりにセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１のバリアントが、オールド・オーダー・アーミッシュ（ＯＯＡ）の約１１％〜１２％の個体に存在し（代替対立遺伝子出現頻度＝６％）、また、一般的な集団においては非常にまれであることが同定された。この変異は、３９８アミノ酸長のヒトタンパク質の３５２位において（Ｎ３５２Ｓ）、またはショート型アイソフォームの３１１位において、アスパラギンをセリンへ変化させる。バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、総コレステロール、ならびにフィブリノーゲン及びｅＧＦＲのレベルが低いこと、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）（ただし、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）ではない）のレベル、ならびにクレアチンキナーゼ及びクレアチニンの血清レベルが高いこと、筋肉組織（ただし、肝臓または赤血球ではない）での発現、ならびに好塩基球の減少と相関性があることが観察されている。Ｎ３５２Ｓバリアントは、１つ以上の心血管病態に対して保護作用があると考えられている。さらに、そのバリアント状態を含むＢ４ＧＡＬＴ１は、患者の心血管病態の発症リスクを診断するために使用し得ると考えられる。
所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の番号付けに関して使用する場合の語句「に対応する」とは、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する場合の指定する参照配列の残基の番号付けを指す（本明細書中の参照配列は、（野生型／完全長）Ｂ４ＧＡＬＴ１のポリヌクレオチド（ｇＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列）またはポリペプチドである）。言い換えれば、所与のポリマーの残基数または残基位置は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなく、参照配列に対して指定される。例えば、２つの配列間の残基の一致性を最適化するためにギャップを導入することにより、特定のアミノ酸配列を参照配列にアライメントすることができる。これらの場合において、ギャップは存在するものの、特定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それをアライメントした参照配列に対して行う。
本明細書中で使用する場合、単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の参照を含む。
本明細書中で使用する場合、及び文脈からそうでないことが明白でない限り、「約」は、述べられた値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
本明細書中で使用する場合、「及び／または」とは、１つ以上の関連する列挙項目のありとあらゆる可能な組み合わせ、及び代替（「または」）で解釈する場合は組み合わせの欠如を指し、また、それらを包含する。
本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」とは、列挙する要素の１つ以上が、具体的に列挙していない他の要素を含み得ることを意味する。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含み得る。移行句「本質的に〜からなる」とは、請求項の範囲が、その請求項において列挙する特定の要素、及び請求する対象の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響しない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本開示の請求項において使用する場合、用語「本質的に〜からなる」は、「含む」と同義であると解釈されることを意図していない。
本明細書中で使用する場合、「任意の」または「場合により」とは、続いて記載する事象または状況が発生する場合と発生しない場合があり、その記載が、事象または状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。
本明細書中で使用する場合、「または」とは、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
値の範囲の指定には、範囲内のまたは範囲を定義するすべての整数（２つの境界値を含む）、及び範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲が含まれる。
明確にするために別個の実施形態で記載している本開示の特定の特徴は、組み合わせて単一の実施形態として提供することもできることを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態で記載している本開示の様々な特徴は、別個にまたは任意の適切な部分組み合わせとして提供することもできる。
本開示は、単離されたＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム及びｍＲＮＡバリアント、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡバリアント、またはその任意の相補体、ならびに単離されたＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドバリアントを提供する。これらのバリアントは、血清脂質レベルの上昇、フィブリノーゲンレベルの上昇、冠動脈石灰化、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの増加（ただし、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）は増加しない）を含むがこれらに限定されない様々な心血管病態の発症リスクの低下に関連すると考えられる。理論に拘泥することを望むものではないが、これらのＢ４ＧＡＬＴ１バリアントは、実験的に観察されたＡＳＴレベルの増加とＡＬＴが増加しなかったことによって証明されるように、肝臓や赤血球ではなく筋肉組織での発現に関連すると考えられる。Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムバリアント及びｍＲＮＡバリアント、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡバリアント、及び単離されたＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドバリアントを含む組成物も本明細書において提供する。Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムバリアント及びｍＲＮＡバリアント及びＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡバリアントにハイブリダイズする核酸分子も本明細書において提供する。本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムバリアント及びｍＲＮＡバリアント、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡバリアント、及びＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドバリアントを含むベクター及び細胞も提供する。
本開示はまた、生体試料中のゲノムバリアント及び／またはｍＲＮＡバリアント、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡバリアント、またはその相補体、及び／またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドバリアントの存在及び／またはレベルの検出方法を提供する。また、心血管病態の発症に対する対象の感受性の判定方法、及び心血管病態を発症しているか、または心血管病態のリスクを有する対象の診断方法も提供する。また、ヌクレアーゼ剤、外来性ドナー配列、転写活性化因子、転写抑制因子、及び組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸を発現するための発現ベクターの任意の組み合わせの使用による細胞の改変方法も提供する。また、心血管病態を発症しているか、または心血管病態を発症するリスクを有する対象を治療するための治療及び予防方法も提供する。
野生型ヒトゲノムＢ４ＧＡＬＴ１核酸は、長さがおよそ５６．７ｋｂであり、６つのエクソンを有し、ヒトゲノムの染色体９に位置する。例示的な野生型ヒトゲノムＢ４ＧＡＬＴ１配列には、ＮＣＢＩ登録番号ＮＧ＿００８９１９．１（配列番号１）が割り当てられている。ヒトゲノムＢ４ＧＡＬＴ１のバリアントは、配列番号２に示しており、一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでいる（５３５７６位のＡからＧへ、本明細書中ではバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１と呼ばれる）。このバリアントのＳＮＰにより、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置に、野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドによってコードされるアスパラギンではなく、コードされるＢ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドのセリンが生じる。バリアント型ヒトゲノムＢ４ＧＡＬＴ１核酸は、例えば、野生型ヒトゲノムＢ４ＧＡＬＴ１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置における３つの塩基「ａａｔ」とは対照的に、野生型ヒトゲノムＢ４ＧＡＬＴ１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置におけるセリンをコードする３つの塩基（例えば「ａｇｔ」）を含む（それぞれ、配列番号２と配列番号１とを比較）。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書に開示する任意のゲノムＢ４ＧＡＬＴ１核酸分子の相補体である。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような核酸配列はまた、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のエクソン１〜６を含む配列番号２の部分と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような核酸配列は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、エクソン５を含む配列番号２の部分と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような核酸配列はまた、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含み、ただしその核酸配列は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドを含む。
核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性の割合は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用して、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用してデフォルトの設定を用いて、ルーチン的に決定することができる。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ゲノム配列全体よりも短い配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１１０００、少なくとも約１２０００、少なくとも約１３０００、少なくとも約１４０００、少なくとも約１５０００、少なくとも約１６０００、少なくとも約１７０００、少なくとも約１８０００、少なくとも約１９０００、または少なくとも約２００００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２のエクソン５の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドも含む。
例えば、いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、連続ヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の１５〜５０の連続ヌクレオチドを含み、連続ヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２の部分と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む単離された核酸を提供し、配列番号２の部分は、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含み、配列番号２の部分は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。いくつかのそのような実施形態では、配列番号２の部分は、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２の部分と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む単離された核酸を提供し、配列番号２の部分は、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含み、配列番号２の部分は、１５〜５０ヌクレオチド長である。いくつかのそのような実施形態では、配列番号２の部分は、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２の部分と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む単離された核酸を提供し、配列番号２の部分は、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含み、配列番号２の部分は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。いくつかのそのような実施形態では、配列番号２の部分は、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２の部分と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む単離された核酸を提供し、配列番号２の部分は、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含み、配列番号２の部分は、１５〜５０ヌクレオチド長である。いくつかのそのような実施形態では、配列番号２の部分は、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。
そのような単離された核酸分子は、例えば、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質を発現するために、または外来性ドナー配列として使用することができる。集団内の遺伝子配列は、ＳＮＰなどの多型により変化し得ることが理解される。本明細書において提供する例は、例示的な配列に過ぎず、他の配列も可能である。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子を含み、この遺伝子では、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対して、配列番号２の１つ以上の非必須セグメントが欠失している。いくつかの実施形態では、欠失した非必須セグメントには、１つ以上のイントロン配列が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子は、例えば、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１（配列番号２）由来のエクソン１〜６のいずれか１つ以上に対応するエクソン、またはそのようなエクソンの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子は、配列番号２のエクソン５を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子は、エクソン１〜６のいずれか１つ以上を含む配列番号２の部分、またはそのようなエクソンの任意の組み合わせと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子は、エクソン１〜６のいずれか１つ以上を含む配列番号２の部分、またはそのようなエクソンの任意の組み合わせと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子は、エクソン５を含む配列番号２の部分と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である。
本開示は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子にハイブリダイズする単離された核酸分子も提供する。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１１０００、少なくとも約１２０００、少なくとも約１３０００、少なくとも約１４０００、少なくとも約１５０００、少なくとも約１６０００、少なくとも約１７０００、少なくとも約１８０００、少なくとも約１９０００、または少なくとも約２００００ヌクレオチドを含むかそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位の、約１０００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内であるセグメントにおいて、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムまたはミニ遺伝子の部分にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムＤＮＡまたはミニ遺伝子と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸分子の少なくとも約１５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、約１５〜約１００ヌクレオチド、または約１５〜約３５ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１５ヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、単離された核酸分子は、配列番号２の配列を含む核酸にハイブリダイズし、単離された核酸分子は、配列番号２の部分にハイブリダイズし、配列番号２の部分は、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、１５〜５０ヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、単離された核酸分子は、配列番号２の配列を含む核酸にハイブリダイズし、単離された核酸分子は、配列番号２の部分にハイブリダイズし、配列番号２の部分は、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の少なくとも１５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズし、連続ヌクレオチドは、配列番号２の部分と少なくとも９０％同一であり、連続ヌクレオチドは、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置で、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、連続ヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の少なくとも１５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズし、連続ヌクレオチドは、配列番号２の部分と少なくとも９５％同一であり、連続ヌクレオチドは、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置で、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、連続ヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の少なくとも１５の連続ヌクレオチドとハイブリダイズし、連続ヌクレオチドは、配列番号２の部分と少なくとも１００％同一であり、連続ヌクレオチドは、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置で、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、連続ヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の１５〜５０の連続ヌクレオチドにハイブリダイズし、連続ヌクレオチドは、配列番号２の部分と少なくとも９０％同一であり、連続ヌクレオチドは、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置で、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、連続ヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の１５〜５０の連続ヌクレオチドにハイブリダイズし、連続ヌクレオチドは、配列番号２の部分と少なくとも９５％同一であり、連続ヌクレオチドは、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置で、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、連続ヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の１５〜５０の連続ヌクレオチドにハイブリダイズし、連続ヌクレオチドは、配列番号２の部分と少なくとも１００％同一であり、連続ヌクレオチドは、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置で、配列番号２のヌクレオチド５３５７５〜５３５７７を含む。いくつかのそのような実施形態では、連続ヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。
そのような単離された核酸分子は、例えば、ガイドＲＮＡ、プライマー、プローブ、または外来性ドナー配列として使用することができる。
代表的な野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列を、配列番号１に記載する。代表的なバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列バリアントを、配列番号２に記載する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡのバリアントを含む単離された核酸分子を提供する。例示的な野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡには、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００１４９７（配列番号３）が割り当てられており、これは４２１４ヌクレオチド塩基からなる。ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡのバリアントは、配列番号４に示されており、ＳＮＰ（１２４４位のＡからＧへ、本明細書中ではバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１と呼ばれる）を含んでおり、その結果、コードされたＢ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンが生じる。バリアント型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡは、例えば、野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応する位置に、野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位の３塩基「ａａｕ」とは対照的に、セリンをコードする３塩基「ａｇｕ」を含む（それぞれ配列番号４と配列番号３とを比較）。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は配列番号４からなる。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような核酸配列はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、エクソン１〜６を含む配列番号４の部分と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような核酸配列はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書に開示する任意のＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ分子の相補体である。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ｍＲＮＡ配列全体よりも短い配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、または少なくとも約４０００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４のエクソン１〜６の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４の部分と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、配列番号４の部分は、配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含み、配列番号４の部分は、配列番号４の少なくとも１５ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号４の部分は、配列番号４の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４の部分と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、配列番号４の部分は、配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含み、配列番号４の部分は、配列番号４の少なくとも１５ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号４の部分は、配列番号４の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４の部分と１００％同一である核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、配列番号４の部分は、配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含み、配列番号４の部分は、配列番号４の少なくとも１５ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号４の部分は、配列番号４の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４の部分と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、配列番号４の部分は、配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含み、配列番号４の部分は、配列番号４の１５〜５０ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号４の部分は、配列番号４の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４の部分と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、配列番号４の部分は、配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含み、配列番号４の部分は、配列番号４の１５〜５０ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号４の部分は、配列番号４の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４の部分と１００％同一である核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、配列番号４の部分は、配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含み、配列番号４の部分は、配列番号４の１５〜５０ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号４の部分は、配列番号４の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドである。
そのような単離された核酸分子は、例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドを発現するために、または外来性ドナー配列として使用することができる。集団内の遺伝子配列は、ＳＮＰなどの多型により変化し得ることが理解される。本明細書において提供する例は、例示的な配列に過ぎず、他の配列も可能である。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアント型Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチド（配列番号８）と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、そのポリペプチドは、３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８と少なくとも約９０％同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、そのポリペプチドは、３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８と少なくとも約９５％同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、そのポリペプチドは、３５２位に対応する位置にセリンを含む。
例えば、いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、そのアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列の部分と９０％同一であり、その部分は、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかのそのような実施形態では、核酸配列は、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸または少なくとも２５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列の部分と９５％同一であり、その部分は、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかのそのような実施形態では、核酸配列は、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸または少なくとも２５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、１０〜５０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列の部分と９０％同一であり、その部分は、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかのそのような実施形態では、核酸配列は、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸または少なくとも２５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、１０〜５０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列の部分と９５％同一であり、その部分は、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかのそのような実施形態では、核酸配列は、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸または少なくとも２５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなる。
本開示はまた、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、または少なくとも約４０００ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の１２４３〜１２４５位の、約１０００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、配列番号４の１２４３〜１２４５位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４）の部分にハイブリダイズする。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、配列番号４の１２４３〜１２４５位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４）の部分にハイブリダイズし、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズする。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、１５〜５０ヌクレオチドを含み、配列番号４の１２４３〜１２４５位を含むセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４）の部分にハイブリダイズし、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズする。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４）と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸分子の少なくとも約１５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子はまた、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、約１５〜約１００ヌクレオチド、または約１５〜約３５ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号４の１２４３〜１２４５位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４など）と少なくとも９０％同一である。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号４の１２４３〜１２４５位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４など）と少なくとも９５％同一である。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号４の１２４３〜１２４５位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４など）と少なくとも９０％同一である。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号４の１２４３〜１２４５位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４など）と少なくとも９５％同一である。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、１５〜１００ヌクレオチド、または１５〜３５ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
そのような単離された核酸分子は、例えば、ガイドＲＮＡ、プライマー、プローブ、または外来性ドナー配列として使用することができる。
代表的な野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列を、配列番号３に記載する。代表的なバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列を、配列番号４に記載する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドの全部または一部をコードするＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡのバリアントを含む核酸分子を提供する。例示的な野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、ＤＮＡとして記述されたｍＲＮＡのコード領域）は、１１９７ヌクレオチド塩基からなる（配列番号５）。ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡのバリアントは配列番号６に示されており、このバリアントはＳＮＰ（１０５５位のＡからＧへ、本明細書中ではバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１と呼ばれる）を含んでおり、その結果、コードされたＢ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンが生じる。バリアント型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、例えば、完全長／成熟型の野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位における３つの塩基「ａａｔ」とは対照的に、野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応する位置にセリンをコードする「ａｇｔ」を含む（それぞれ、配列番号６と配列番号５とを比較）。いくつかの実施形態では、核酸分子は配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は配列番号６からなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は単離される。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子はまた、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書に開示する任意のＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ分子の相補体である。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ配列全体よりも短い配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、または少なくとも約１１００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、そのようなｃＤＮＡ分子はまた、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、または少なくとも約５００の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、そのようなｃＤＮＡ分子はまた、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するヌクレオチドを含む。
例えば、いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、連続ヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含む。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の１５〜５０の連続ヌクレオチドを含み、連続ヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含む。いくつかのそのような実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６の部分と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｃＤＮＡ分子を提供し、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６の部分と少なくとも９５％同一である核酸配列を含むｃＤＮＡ分子を提供し、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６の部分と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｃＤＮＡ分子を提供し、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の１５〜５０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６の部分と少なくとも９５％同一である核酸配列を含むｃＤＮＡ分子を提供し、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の１５〜５０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含むｃＤＮＡ分子を提供し、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の部分と少なくとも９０％同一の核酸配列を含み、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含むｃＤＮＡ分子を提供し、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の部分と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含むｃＤＮＡ分子を提供し、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の部分と少なくとも９０％同一の核酸配列を含み、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の１５〜５０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含むｃＤＮＡ分子を提供し、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の部分と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号６の部分は、配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含み、配列番号６の部分は、配列番号６の１５〜５０の連続ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、配列番号６の部分は、配列番号６の、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０の連続ヌクレオチドである。
そのようなｃＤＮＡ分子は、例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントタンパク質を発現するために、または外来性ドナー配列として使用することができる。集団内の遺伝子配列は、ＳＮＰなどの多型により変化し得ることが理解される。本明細書において提供する例は、例示的な配列に過ぎず、他の配列も可能である。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、バリアント型Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチド（配列番号８）と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、そのポリペプチドは３５２位に対応する位置にセリンを含むことを条件とする。いくつの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号８と少なくとも約９０％同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、そのポリペプチドは、３５２位に対応する位置にセリンを含むことを条件とする。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号８と、少なくとも約９５％同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、そのポリペプチドは、３５２位に対応する位置にセリンを含むことを条件とする。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号８と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなる。
本開示はまた、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、または少なくとも約１１００ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子はまた、配列番号６の１０５４〜１０５６位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、そのような単離された核酸分子は、配列番号６の１０５４〜１０５６位の約６００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６）と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるｃＤＮＡ分子の少なくとも約１５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子はまた、配列番号６の１０５４〜１０５６位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、約１５〜約１００ヌクレオチド、または約１５〜約３５ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号６の１０５４〜１０５６位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６など）と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号６の１０５４〜１０５６位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６など）と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号６の１０５４〜１０５６位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６など）と１００％同一である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号６の１０５４〜１０５６位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号６の１０５４〜１０５６位にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６など）と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号６の１０５４〜１０５６位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号６の１０５４〜１０５６位にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６など）と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、配列番号６の１０５４〜１０５６位の５ヌクレオチドを含むかまたはそれ以内のセグメントにおいてバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号６の１０５４〜１０５６位にハイブリダイズし、その場合、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６など）と１００％同一である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、１５〜１００ヌクレオチド、または１５〜３５ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
そのような単離された核酸分子は、例えば、ガイドＲＮＡ、プライマー、プローブ、外来性ドナー配列、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡとして使用することができる。
代表的な野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列を、配列番号５に記載する。代表的なバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列を、配列番号６に記載する。
本明細書に開示する核酸分子には、天然のＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはｍＲＮＡ転写産物の核酸配列を含ませることができ、または非天然の配列を含ませることができる。いくつかの実施形態では、天然の配列は、同義的変異またはコードするＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドに影響を及ぼさない変異のために、非天然の配列と異なり得る。例えば、配列は、同義的変異またはコードするＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドに影響を及ぼさない変異を除いて同一であり得る。同義的変異または置換とは、生成されるアミノ酸配列を改変しないような、タンパク質をコードする遺伝子のエクソンにおけるあるヌクレオチドから別のヌクレオチドへの置換である。これは、遺伝暗号の縮重により可能となっており、いくつかのアミノ酸は複数の３塩基対コドンによってコードされる。同義的置換は、例えば、コドン最適化のプロセスで使用される。本明細書に開示する核酸分子は、コドン最適化することができる。
本明細書ではまた、開示する核酸分子と相互作用することができる機能性ポリヌクレオチドを提供する。機能性ポリヌクレオチドは、標的分子の結合または特異的反応の触媒など、特定の機能を有する核酸分子である。機能性ポリヌクレオチドの例として、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、及び外部ガイド配列が挙げられるが、これらに限定されない。機能性ポリヌクレオチドは、標的分子が有する特異的活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、及び刺激剤として作用することができるか、または機能性ポリヌクレオチドは、他の分子とは独立した新規活性を有し得る。
アンチセンス分子は、標準的または非標準的な塩基対形成のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮａｓｅ−Ｈを介したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解による標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製などの、通常であれば標的分子で起こるであろう処理機能を妨げるように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を特定することによってアンチセンス効率を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択実験及びＤＭＳ及びＤＥＰＣを使用したＤＮＡ修飾試験が挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンス分子は、一般的に、解離定数（ｋｄ）約１０−６以下、約１０−８以下、約１０−１０以下、または約１０−１２以下で標的分子に結合する。アンチセンス分子の設計及び使用を支援する方法及び技術の代表的なサンプルは、以下の非限定的な米国特許のリスト：５，１３５，９１７、５，２９４，５３３、５，６２７，１５８、５，６４１，７５４、５，６９１，３１７、５，７８０，６０７、５，７８６，１３８、５，８４９，９０３、５，８５６，１０３、５，９１９，７７２、５，９５５，５９０、５，９９０，０８８、５，９９４，３２０、５，９９８，６０２、６，００５，０９５、６，００７，９９５、６，０１３，５２２、６，０１７，８９８、６，０１８，０４２、６，０２５，１９８、６，０３３，９１０、６，０４０，２９６、６，０４６，００４、６，０４６，３１９、及び６，０５７，４３７に見出すことができる。アンチセンス分子の例として、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示する単離された核酸分子には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含ませることができる。単離された核酸分子を、ベクターまたは異種標識などの異種核酸配列に連結または融合することもできる。例えば、本明細書に開示する単離された核酸分子を、単離された核酸分子及び異種核酸配列を含むベクターまたは外来性ドナー配列中に存在させることができる。単離された核酸分子を、蛍光標識などの異種標識に連結または融合することもできる。標識の他の例は、本明細書の他の場所に開示する。
標識は、直接検出可能（例えば、フルオロフォア）または間接的に検出可能（例えば、ハプテン、酵素、またはフルオロフォア消光剤）であり得る。そのような標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能であり得る。そのような標識として、例えば、放射線計数装置で測定することができる放射性標識、分光光度計で視覚的に観察または測定することができる色素、染料、または他の色素原、スピンラベルアナライザーで測定することができるスピン標識、及び適切な分子付加物の励起によって出力シグナルが生成され、色素によって吸収される光で励起することにより視覚化することができるか、または標準的な蛍光計または画像化システムで測定することができる蛍光標識（例えば、フルオロフォア）が挙げられる。標識はまた、例えば、化学発光物質とすることもでき、その場合、出力シグナルは、シグナル化合物、金属含有物質、または酵素の化学修飾によって生成され、酵素の場合、無色の基質からの着色生成物の形成など、酵素依存性の二次シグナル生成が生じる。用語「標識」とはまた、複合体分子に選択的に結合させることができる「タグ」またはハプテンをも指し、それにより、基質を続けて添加する場合、複合体分子は検出可能なシグナルを生成するために使用される。例えば、ビオチンをタグとして使用し、次いでアビジンまたはストレプトアビジンの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを使用してタグに結合させ、次いで比色基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））または蛍光基質を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。精製を促進するためのタグとして使用することができる例示的な標識として、ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧもしくは３×ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓもしくはポリヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、エピトープタグ、または免疫グロブリンのＦｃ部分が挙げられるが、これらに限定されない。多数の標識が知られており、例えば、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素ならびにそれらの比色、蛍光及び化学発光基質ならびに他の標識が挙げられる。
開示する核酸分子は、例えば、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド置換体などの非天然または修飾ヌクレオチドから構成され得る。そのようなヌクレオチドには、修飾塩基、糖、またはリン酸基が含まれるか、またはその構造に非天然部分が組み込まれたヌクレオチドが含まれる。非天然ヌクレオチドの例として、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化、アミノ化、脱アミノ化、アルキル化、ベンジル化、及びフルオロフォア標識ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示する核酸分子にはまた、１つ以上のヌクレオチド類似体または置換を含ませることができる。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかへの修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分への修飾として、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕの天然及び合成修飾、ならびに例えばプソイドウリジン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、及び２−アミノアデニン−９−イルなどの異なるプリンまたはピリミジン塩基が挙げられるが、これらに限定されない。修飾塩基として、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及び２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、ならびに５−メチルシトシンを含むがこれらに限定されないＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンなどの特定のヌクレオチド類似体は、二本鎖形成の安定性を高めることができる。多くの場合、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖修飾と塩基修飾を組み合わせて、二本鎖安定性の増加などのユニークな特性を実現することができる。
ヌクレオチド類似体は、糖部分の修飾を含み得る。糖部分への修飾には、リボース及びデオキシリボースの天然修飾、ならびに合成修飾が含まれるが、これらに限定されない。糖の修飾には、２’位での以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルが含まれるが、これらに限定されず、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１−１０アルキルまたはＣ２−１０アルケニル、及びＣ２−１０アルキニルであり得る。例示的な２’糖修飾として、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、及び−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）も挙げられるが、これらに限定されない。
２’位の他の修飾として、Ｃ１−１０アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、及び同様の特性を有する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない。同様の修飾を、糖における他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位でも行ってよい。修飾糖には、ＣＨ２やＳなど、架橋環の酸素に修飾を含むものも含まれる。ヌクレオチド糖類似体には、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を含ませることもできる。
ヌクレオチド類似体は、リン酸部分で修飾することもできる。修飾リン酸部分には、２つのヌクレオチド間の結合に、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどの他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートなどのホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートが含まれるように修飾することができるものが含まれるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸結合または修飾リン酸結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を介するものとすることができ、結合には、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’などの逆極性が含まれ得る。様々な塩、混合塩、及び遊離酸の形態も含まれる。
ヌクレオチド置換体には、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するがリン酸部分を含まない分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ヌクレオチド置換体には、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に連結する分子が含まれる。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用する場合に二重らせん型構造に適合することができる。
ヌクレオチド置換体には、リン酸部分または糖部分が置換されているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体も含まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換体は、標準リン原子を含まない場合がある。リン酸の置換体は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは複素環ヌクレオシド間結合であり得る。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成要素部分を有する他の成分を有するヌクレオチド置換体が含まれる。
ヌクレオチド置換体では、ヌクレオチドの糖及びリン酸部分の両方が、例えば、アミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換され得ることも理解されたい。
また、他のタイプの分子（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結して、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合させることができる。そのようなコンジュゲートとして、例えば、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル、チオコレステロール、ドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなどのリン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
本開示はまた、本明細書に開示する核酸分子のいずれか１つ以上を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示する核酸分子のいずれか１つ以上及び異種核酸を含む。ベクターは、核酸分子を輸送できるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドまたはコスミド（例えば、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、それを導入する宿主細胞内で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらに作動可能に連結している遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書中では「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」と呼ばれる。そのようなベクターは、ターゲティングベクター（すなわち、外来性ドナー配列）でもあり得る。
いくつかの実施形態では、開示する遺伝子バリアントをコードする核酸分子を発現ベクターに挿入し、それによって、転写及び翻訳制御配列などの発現制御配列に遺伝子を作動可能に連結することによって、本明細書に開示する様々な遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質を発現させる。発現ベクターとして、プラスミド、コスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、エプスタイン−バー（ＥＢＶ）由来エピソームなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が遺伝子バリアントの転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、開示する遺伝子バリアントを含む核酸分子をベクターにライゲーションすることができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。開示する遺伝子バリアントを含む核酸配列は、バリアントの遺伝情報とは別個のベクターまたは同じ発現ベクターに挿入することができる。開示する遺伝子バリアントを含む核酸配列は、標準的な方法（例えば、開示する遺伝子バリアントとベクターを含む核酸上の相補的制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入することができる。
開示する遺伝子バリアントを含む核酸配列に加えて、組換え発現ベクターには、宿主細胞内での遺伝子バリアントの発現を制御する調節配列を保有させることができる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存する。哺乳類宿主細胞発現に望ましい調節配列として、例えば、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳類プロモーター、例えば、ネイティブ免疫グロブリンプロモーター及びアクチンプロモーターなどが挙げられる。細菌細胞または真菌細胞（例えば、酵母細胞）におけるポリペプチドの発現方法もまた、周知である。
プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えばＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
誘導性プロモーターの例として、例えば、化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとして、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、またはｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、またはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとして、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）及び光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋肉細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であり得る。
発生的に調節されるプロモーターとして、例えば、発生の胚段階の間のみ、または成体細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。
開示する遺伝子バリアント及び調節配列を含む核酸配列に加えて、追加の配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子を、組換え発現ベクターに保有させることができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を促進することができる（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号参照）。例えば、選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与することができる。例示的な選択マーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増殖を伴うｄｈｆｒ宿主細胞での使用）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、及びグルタミン酸合成酵素（ＧＳ）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示はまた、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチド（Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ）を含む単離されたポリペプチドを提供する。例示的な野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドにはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１５２９１（配列番号７）が割り当てられており、これは３９８アミノ酸からなる。ヒトバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチド（配列番号８）の３５２位に対応する位置にセリンを含み、野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１の同じ位置にあるアスパラギンとは対照的である（それぞれ、配列番号８と配列番号７とを比較）。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは配列番号８からなる。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、その単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、その単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、その単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ただし、その単離されたポリペプチドは、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約３５０の連続アミノ酸を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約３５０の連続アミノ酸と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約３５０の連続アミノ酸と、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の少なくとも３００の連続アミノ酸と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００の連続アミノ酸を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００の連続アミノ酸と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号８の、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００の連続アミノ酸と、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはまた、配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含む。
代表的な野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチド配列を、配列番号７に記載する。代表的なＢ４ＧＡＬＴ１バリアント型ポリペプチド配列を、配列番号８に記載する。
本明細書に開示する単離されたポリペプチドは、天然のＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含み得るか、または非天然の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、天然の配列は、保存的アミノ酸置換のために、非天然の配列と異なり得る。例えば、その配列は、保存的アミノ酸置換を除いて同一であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する単離されたポリペプチドを、異種ポリペプチドもしくは異種分子または標識に連結または融合させ、その多くの例を本明細書の他の場所に開示する。例えば、タンパク質を異種ポリペプチドに融合させて、安定性を向上または低下させることができる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはポリペプチド内部に配置することができる。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープの提供を支援することができ（免疫学的融合パートナー）、または天然の組換えポリペプチドよりも高い収率でのタンパク質の発現を支援することができる（発現エンハンサー）。特定の融合パートナーは、免疫学的及び発現増強融合パートナーの両方である。ポリペプチドの溶解度を高めるか、または所望の細胞内区画へのポリペプチドの標的化を促進する他の融合パートナーを選択してもよい。いくつかの融合パートナーは、ポリペプチドの精製を促進する親和性タグを有する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質を、異種分子に直接融合させるか、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して異種分子に連結させる。適切なペプチドリンカー配列は、例えば、以下の因子に基づいて選択してもよい：１）柔軟で拡張的な立体構造をとり得る能力、２）第１及び第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる二次構造をとることに対する抵抗性、及び３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応する可能性のある疎水性または荷電残基の欠如。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含み得る。リンカー配列には、Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸もまた、使用してもよい。リンカーとして有用に使用し得るアミノ酸配列として、例えば、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８５，４０，３９−４６、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３，８２５８−８２６２、ならびに米国特許第４，９３５，２３３号及び第４，７５１，１８０号に開示されているアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に、例えば、長さが１〜約５０アミノ酸であり得る。第１及び第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐことができる非必須のＮ末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は通常必要ない。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、細胞透過性ドメインに作動可能に連結する。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来ＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列由来であり得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０参照。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはタンパク質内のどこにでも配置することができる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結する。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。タグの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種分子は、免疫グロブリンＦｃドメイン、ペプチドタグ、形質導入ドメイン、ポリ（エチレングリコール）、ポリシアル酸、またはグリコール酸である。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、非天然もしくは修飾アミノ酸またはペプチド類似体を含む。例えば、多数のＤ−アミノ酸または天然アミノ酸とは異なる機能的置換基を有するアミノ酸が存在する。天然ペプチドとは逆の立体異性体、及びペプチド類似体の立体異性体を開示する。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に最適なアミノ酸をチャージし、例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を作出して部位特異的な方法でペプチド鎖にアミノ酸類似体を挿入することにより、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、ペプチド模倣物であり、ペプチドに類似するように生成され得るが、天然のペプチド結合を介して接続しない。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合として、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨＨ２ＳＯ−が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド類似体には、結合原子間に、ｂ−アラニン、ガミノ酪酸などの複数の原子を含ませることができる。アミノ酸類似体及びペプチド類似体は、多くの場合、増強されたまたは望ましい特性、例えば、より経済的な生産、より高い化学的安定性、より増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広範な生物活性）、抗原性の低下、及び他の望ましい特性を有する。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはＤ−アミノ酸を含み、Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼによって認識されないことから、これらを使用してより安定なペプチドを生成することができる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定したペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを環化または結合することができる。これは、ペプチドを特定の立体構造に拘束するのに有益であり得る（例えば、Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，６１，３８７参照）。
本開示はまた、本明細書に開示するポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を提供する。これには、特定のポリペプチド配列に関連するすべての縮重配列（すなわち、１つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有するすべての核酸、及びタンパク質配列の開示するバリアント及び誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸）が含まれる。したがって、各々の特定の核酸配列は本明細書に記載し得ないが、各配列はすべて、開示するポリペプチド配列を通じて本明細書に実際に開示及び記載されるものとする。
本開示はまた、核酸分子のいずれか１つ以上及び／または本明細書に開示するポリペプチドのいずれか１つ以上を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は担体を含む。いくつかの実施形態では、担体は、核酸分子及び／またはポリペプチドの安定性を高める（例えば、所定の保存条件（例えば、−２０℃、４℃、または周囲温度）下での期間を延長し、その場合、分解産物は、出発核酸またはタンパク質の重量で０．５％未満など、閾値未満で維持され；またはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を高める）。担体の例として、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、及び脂質微小管が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示はまた、本明細書に開示するＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片のいずれかの産生方法を提供する。そのようなＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片は、任意の適切な方法により産生することができる。例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片は、そのようなＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子（例えば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞から産生することができる。そのような方法は、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を産生するのに十分な条件下でＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子（例えば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞を培養し、それによりＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を産生することを含み得る。核酸を、宿主細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができ、培養は、核酸が発現する条件下で実施することができる。そのような方法は、発現するＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を回収することをさらに含み得る。回収は、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含み得る。
タンパク質発現に適した系の例として、例えば：細菌細胞発現系（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、酵母細胞発現系（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルスを介したタンパク質発現）、及び哺乳類細胞発現系などの宿主細胞が挙げられる。
Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子の例を、本明細書の他の場所でより詳細に開示する。いくつかの実施形態では、核酸分子を、宿主細胞での発現のためにコドン最適化する。いくつかの実施形態では、核酸分子を、宿主細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結する。プロモーターは、異種プロモーター（すなわち、天然のＢ４ＧＡＬＴ１プロモーターではないプロモーター）とすることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに適したプロモーターの例として、アラビノース、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに適したプロモーターの例として、Ｐ１７０及びナイシンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに適したプロモーターの例として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）またはエノラーゼ（ＥＮＯ）プロモーターなどの構成的プロモーター、またはＰＨＯ、ＣＵＰ１、ＧＡＬ１、及びＧ１０などの誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに適したプロモーターの例として、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ Ｉ）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター、及びグルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤＩ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウイルスを介した系に適したプロモーターの例は、後期ウイルスの強力なポリヘドリンプロモーターである。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、タンパク質精製を促進するために、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片とともにインフレームでタグをコードする。タグの例を、本明細書の他の場所で開示する。そのようなタグは、例えば、他のすべてのタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）からタグ付きタンパク質を単離できるように、パートナーリガンドに結合する（例えば、樹脂に固定化する）ことができる。アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、発現タンパク質の純度を向上させるために使用することができる方法の例である。
他の方法を使用して、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を産生することもできる。例えば、タンパク質化学技術により２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結することができる。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）のいずれかの化学物質を使用して、ペプチドまたはポリペプチドを化学合成することができる。そのようなペプチドまたはポリペプチドは、標準的な化学反応によって合成することができる。例えば、あるペプチドまたはポリペプチドを合成し、それはその合成樹脂から切断され得ない一方で、ペプチドまたはタンパク質の他の断片は、合成され、その後樹脂から切断され、それにより他の断片上では機能的にブロックされた末端基を露出させることができる。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片を、それぞれカルボキシル末端及びアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合することができる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを、本明細書に記載するようにｉｎ ｖｉｖｏで独立して合成することができる。一旦単離した後、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを同様のペプチド縮合反応を介して連結して、ペプチドまたはその断片を形成してもよい。
いくつかの実施形態では、クローニングしたか、または合成のペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片を連結して、より大きなペプチド断片、ポリペプチド、または全タンパク質ドメインを生成することができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，４１５１）。あるいは、合成ペプチドのネイティブな化学ライゲーションを利用して、短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は、２工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６６，７７６−７７９参照）。第１の工程は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応で、第１の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体を生成する。反応条件を変更することなく、この中間体は自発的かつ迅速な分子内反応を起こし、ライゲーション部位で天然のペプチド結合を形成することができる。
いくつかの実施形態では、化学ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合が非天然（非ペプチド）結合である場合、保護されていないペプチドセグメントを化学的に連結することができる（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５６，２２１参照）。
本開示はまた、本明細書に開示する任意の１つ以上の核酸分子及び／または任意の１つ以上のポリペプチドを有する細胞（例えば、組換え宿主細胞）を提供する。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。核酸分子をプロモーター及び他の調節配列に連結し、これを発現させてコードするタンパク質を産生することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、全能性細胞または多能性細胞（例えば、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）である。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性及び／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発生中の胚の任意の組織に寄与し得る胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来し、３つの脊椎動物の胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のいずれかの細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、初代体細胞、または初代体細胞ではない細胞である。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞とすることもできる。初代細胞には、生物、器官、または組織から直接分離した細胞または細胞の培養物が含まれる。初代細胞には、形質転換も不死化もしていない細胞が含まれる。初代細胞には、組織培養で以前に継代されていないか、または組織培養で以前に継代されているが組織培養で無期限に継代することができない生物、器官、または組織から得られた細胞が含まれる。そのような細胞は、従来技術により単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、及び平滑筋細胞が挙げられる。例えば、初代細胞は、結合組織、筋肉組織、神経系組織、または上皮組織に由来し得る。
いくつかの実施形態では、細胞は通常、無期限に増殖できないが、変異または変化により、正常な細胞老化が回避され、それどころか分裂し続けることができる。そのような変異または変化は、自然に発生し得るか、または意図的に誘発され得る。不死化細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、及びマウス胚線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。多数のタイプの不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞には、組換え遺伝子または組換えタンパク質の培養または発現に通常使用される細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）などの分化細胞である。
細胞は、任意の供給源に由来し得る。例えば、細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌（例えば、酵母）細胞とすることができる。そのような細胞は、魚類細胞または鳥類細胞であり得るか、またはそのような細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞またはラット細胞であり得る。哺乳類として、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、ウシ、去勢ウシなどのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、ならびにブタ及びイノシシなどのブタ種）が挙げられるが、これらに限定されない。鳥類として、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられるが、これらに限定されない。家畜動物及び農業動物も含まれる。用語「非ヒト動物」には、ヒトは含まれない。
本開示はまた、ヒト対象由来の生体試料中のＢ４ＧＡＬＴ１バリアント遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／またはポリペプチドの存在の検出方法を提供する。集団内の遺伝子配列、及びそのような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質は、一塩基多型などの多型により変化し得ることを理解されたい。本明細書中で提供するＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチドの配列は例示的な配列に過ぎない。Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチドの他の配列も可能である。
生体試料は、対象由来の任意の細胞、組織、または生体液に由来し得る。試料は、臨床的に適切な任意の組織、例えば、骨髄試料、腫瘍生検、細針吸引液、または体液試料、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液、もしくは尿を含み得る。いくつかの場合では、試料には口腔スワブが含まれる。本明細書に開示する方法において使用する試料は、アッセイ形式、検出方法の性質、及び試料として使用する組織、細胞、または抽出物に基づいて様々に異なる。生体試料は、用いるアッセイに応じて異なる方法で処理することができる。例えば、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１核酸分子を検出する場合、ゲノムＤＮＡの試料を単離または濃縮するように設計した予備処理を用いることができる。この目的のために、様々な公知の技術を使用してもよい。Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡのレベルを検出する場合、様々な手法を用いて、生体試料をｍＲＮＡで富化することができる。ｍＲＮＡの存在もしくはレベル、または特定のバリアント型ゲノムＤＮＡ遺伝子座の存在を検出するための様々な方法を使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、生体試料中の核酸の少なくとも部分を配列決定して、その核酸が、配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置の配列番号２のヌクレオチド５３７５７〜５３５７７を含むかどうかを判定することを含む、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１核酸分子の存在または非存在の検出方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、生体試料中の核酸の少なくとも部分を配列決定して、その核酸が、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置の配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含むかどうかを判定することを含む、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１核酸分子の存在または非存在の検出方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、生体試料中の核酸の少なくとも部分を配列決定して、その核酸が、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置の配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含むかどうかを判定することを含む、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１核酸分子の存在または非存在の検出方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ヒト対象におけるバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１核酸分子（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の存在または非存在の検出方法は：生体試料中の核酸分子が配列番号８の３５２位のセリンをコードする核酸配列を含むかどうかを判定するアッセイを、ヒト対象由来の生体試料に対して実施することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料には、細胞または細胞溶解物が含まれる。そのような方法は、例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含む対象由来の生体試料を取得し、配列番号２（遺伝子）の５３７５７〜５３５７７位、配列番号４（ｍＲＮＡ）の１２４３〜１２４５位、または配列番号６（ｃＤＮＡ）の１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡの位置が、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にアスパラギンの代わりにセリンをコードすることを判定するアッセイを生体試料に対して行うことを含み得る。そのようなアッセイは、例えば、特定のＢ４ＧＡＬＴ１核酸分子のこれらの位置の同一性を決定することを含み得る。
いくつかの実施形態では、アッセイは：ヒト対象由来の生体試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分を配列決定することを含み、配列決定する部分には、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置が含まれ、ヒト対象由来の生体試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分を配列決定することを含み、配列決定する部分には、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置が含まれ、または、ヒト対象由来の生体試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分を配列決定することを含み、配列決定する部分には、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置が含まれる。
いくつかの実施形態では、アッセイは：ａ）生体試料を：ｉ）配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分、ｉｉ）配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分、またはｉｉｉ）配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分にハイブリダイズするプライマーと接触させること、ｂ）少なくとも：ｉ）５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置、ｉｉ）１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置、またはｉｉｉ）１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置を介してプライマーを伸長すること、及びｃ）プライマーの伸長産物が：配列番号８の３５２位のセリンをコードするヌクレオチドをｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の５３５７５〜５３５７７位に対応する、ｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応する、またはｉｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応する位置に含むかどうかを判定することを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムＤＮＡのみを分析する。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡのみを分析する。いくつかの実施形態では、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡのみを分析する。
いくつかの実施形態では、アッセイは、ストリンジェントな条件下でバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１配列にはハイブリダイズしないプライマーまたはプローブに生体試料を接触させること、及びハイブリダイゼーションが生じたかどうかを判定することを含む。
いくつかの実施形態では、上記のアッセイは、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を含む。いくつかの実施形態では、アッセイはまた、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸配列に結合し、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドを特異的に検出及び／または同定するのに十分なヌクレオチド長のプローブ及びプライマーを利用する。ハイブリダイゼーション条件または反応条件は、この結果を達成するために作業者が決定することができる。この長さは、選択する検出方法において使用するのに十分な任意の長さであってよい。一般的に、例えば、約８、約１１、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、または約７００ヌクレオチド以上、または約１１〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、または約７００〜約８００、またはそれ以上の長さのヌクレオチドを使用する。そのようなプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。プローブ及びプライマーは、標的配列に対して連続ヌクレオチドの完全な核酸配列同一性を有していてもよいが、プローブは標的核酸配列とは異なっており、また、標的核酸配列を特異的に検出及び／または同定する能力を保持しており、従来の方法により設計され得る。したがって、プローブ及びプライマーは、標的核酸分子と、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性または相補性を共有することができる。
いくつかの実施形態では、特異的プライマーを使用してバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座及び／またはＢ４ＧＡＬＴ１バリアント型ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅してアンプリコンを生成することができ、それは、生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座を同定するために、もしくは特定のＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのレベルを測定するために、特異的プローブとして使用することができるか、またはそれ自体を検出することができる。Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアント型遺伝子座を使用して、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むゲノム核酸配列を示すことができる。プローブが核酸分子に結合可能な条件下でプローブが生体試料中の核酸分子とハイブリダイズする場合、この結合を検出することができ、生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座の存在またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの存在またはレベルを示すことができる。結合プローブのそのような同定は既に説明した。特異的プローブは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の特定の領域と、少なくとも約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％同一の（または相補的な）配列を含んでいてもよい。特異的プローブは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの特定の領域と、少なくとも約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％同一の（または相補的な）配列を含んでいてもよい。特異的プローブは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの特定の領域と、少なくとも約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％同一の（または相補的な）配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、生体試料の核酸相補体がバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座（配列番号２）の５３５７５〜５３５７７位にセリンをコードするヌクレオチドを含むかどうかを判定するために、５３５７５〜５３５７７位に隣接する５’隣接配列に由来する第１のプライマーと５３５７５〜５３５７７位に隣接する３’隣接配列に由来する第２のプライマーを含むプライマーペアを使用して、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座（配列番号：２）の５３５７５〜５３５７７位におけるＳＮＰの存在を診断するアンプリコンを生成する核酸増幅法に、生体試料を供してもよい。いくつかの実施形態では、アンプリコンの長さは、プライマー対と１ヌクレオチド塩基対とを合わせた長さからＤＮＡ増幅プロトコールにより生成可能なアンプリコンの任意の長さまでの範囲であってよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から増幅反応の限界、すなわち約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲とすることができる。場合により、プライマー対は、５３５７５〜５３５７７位及び５３５７５〜５３５７７位の両側の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む領域に隣接する。同様のアンプリコンを、ｍＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡ配列から生成することができる。
プローブ及びプライマーを調製及び使用するための代表的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的更新あり）（以下、「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２」）、及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、既知の配列から派生させることができ、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１０のＰＣＲプライマー分析ツール（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ）、ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及びＰｒｉｍｅｒ３（バージョン０．４．０．ＣＯＰＹＲＧＴ．，１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）など、その目的を意図したコンピュータープログラムを使用して行うことができる。さらに、既知のガイドラインを使用して、配列を視覚的にスキャンし、プライマーを手動で同定することができる。
以下でさらに詳細に説明するように、任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅または配列決定方法を使用して、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座の存在及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのレベルを特異的に検出することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子を、Ｂ４ＧＡＬＴ１核酸の領域を増幅するためのプライマーとして使用でき、あるいは核酸分子を、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座を含む核酸分子またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡを含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブとして使用することができる。
例えば、核酸配列決定、核酸ハイブリダイゼーション、及び核酸増幅を含む、様々な核酸技術が公知である。核酸配列決定技術の用例として、連鎖停止剤（サンガー）配列決定法及びダイターミネーター配列決定法が挙げられるが、これらに限定されない。
他の方法は、精製ＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、及び固定細胞調製物（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に対する標識プライマーまたはプローブの使用を含む、配列決定以外の核酸ハイブリダイゼーション方法を含む。いくつかの方法では、標的核酸を、検出の前または検出と同時に増幅してもよい。核酸増幅技術の用例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）、及び核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の方法として、リガーゼ連鎖反応、鎖置換型増幅法、及び好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
非増幅または増幅ポリヌクレオチドの検出に対して、例えば、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）、リアルタイムでの増幅プロセスの定量的評価、及びリアルタイム増幅に基づかない、試料中に最初に存在する標的配列の量の測定を含む、任意の方法を使用することができる。
配列増幅を必ずしも必要とせず、例えば、サザン（ＤＮＡ：ＤＮＡ）ブロットハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、及び適切なプローブを使用した染色体物質の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の公知の方法に基づく核酸の同定方法も提供する。サザンブロッティングを使用して、特定の核酸配列を検出することができる。そのような方法では、試料から抽出した核酸を断片化し、マトリックスゲル上で電気泳動的に分離し、メンブレンフィルターに移す。フィルターに結合した核酸を、目的の配列に相補的な標識プローブとのハイブリダイゼーションに供する。フィルターに結合したハイブリダイズしたプローブを検出する。
ハイブリダイゼーション技術において、プローブまたはプライマーがその標的に特異的にハイブリダイズするように、ストリンジェントな条件を用いることができる。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下でのポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その標的配列（例えば、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）に対し、他の配列（例えば、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）に比べて検出可能に高い程度、例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍またはバックグラウンドの１０倍でハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる状況で異なるであろう。ハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同的探索）。あるいは、より低い程度の同一性を検出するために、ストリンジェンシー条件を調整して配列の一部のミスマッチを許容することができる（非相同的探索）。一般的に、プローブは、長さが約１０００ヌクレオチド未満または長さが約５００ヌクレオチド未満である。
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後の５０℃での２×ＳＳＣの洗浄は、公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。通常、ハイブリダイゼーション及び検出のストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３での塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、通常約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成してもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件として、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液中での３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件として、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×〜１×ＳＳＣ中での５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件として、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中での６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。場合により、洗浄緩衝液には、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含ませてもよい。ハイブリダイゼーションの期間は、一般的に約２４時間未満であり、通常は約４〜約１２時間である。洗浄時間の期間は、少なくとも平衡に達するのに十分な時間である。
ハイブリダイゼーション反応において、特異性は通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＴｍはＭｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，２６７−２８４：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌの式から概算することができ、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡのグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合、ならびにＬは塩基対のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、完全に一致するプローブに対して、相補的な標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨの下で）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃ずつ低下し、したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列を探す場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列及びその相補鎖の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。しかしながら、厳密にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔｍ）より１℃、２℃、３℃、または４℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件では、熱融点（Ｔｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができる。当業者であれば、方程式、ハイブリダイゼーション組成物及び洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用いて、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に記載されることを理解するであろう。望ましい程度のミスマッチの結果、Ｔｍが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満である場合、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を上げることが最適である。
また、例えばタンパク質配列決定及びイムノアッセイを含む、生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの存在またはレベルの検出方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象におけるＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの存在の検出方法は、ヒト対象由来の生体試料に対して、その生体試料中のＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの存在を判定するアッセイを実施することを含む。
タンパク質配列決定技術の非限定的な用例として、質量分析及びエドマン分解が挙げられるが、これらに限定されない。イムノアッセイの用例として、免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、及び免疫ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。様々な公知技術（例えば、比色分析、蛍光、化学発光、または放射性）を使用して検出可能に標識したポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイでの使用に適している。
本開示はまた、対象の心血管病態の発症に対する感受性または心血管病態の発症リスクの判定方法を提供する。対象は、例えば、ヒト、非ヒト哺乳類、げっ歯類、マウス、またはラットを含む任意の生物であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡの存在を検出することを含む。集団内の遺伝子配列及びそのような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、ＳＮＰなどの多型により変化し得ることを理解されたい。Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチドについて本明細書中で提供する配列は例示的な配列に過ぎず、他のそのような配列も可能である。
心血管病態の非限定的な例として、１つ以上の血清脂質のレベルの上昇が挙げられる。血清脂質には、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロール、またはその任意の亜分画（例えば、ＨＤＬ２、ＨＤＬ２ａ、ＨＤＬ２ｂ、ＨＤＬ２ｃ、ＨＤＬ３、ＨＤＬ３ａ、ＨＤＬ３ｂ、ＨＤＬ３ｃ、ＨＤＬ３ｄ、ＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３、リポタンパク質Ａ、Ｌｐａ１、Ｌｐａ１、Ｌｐａ３、Ｌｐａ４、またはＬｐａ５）の１つ以上が含まれる。心血管病態には、冠動脈石灰化レベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、ＩＩｄ型グリコシル化（ＣＤＧ−ＩＩｄ）が含まれ得る。心血管病態には、心膜脂肪レベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、ならびに出血性素因及び凝固障害も含まれる。心血管病態には、アテローム血栓性病態が含まれ得る。アテローム血栓性病態には、フィブリノーゲンレベルの上昇が含まれ得る。アテローム血栓性病態には、フィブリノーゲン媒介性血餅が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲンレベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲン媒介性血餅が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅が含まれ得る。フィブリノーゲン媒介性血餅またはフィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅は、体内のどの静脈または動脈にも存在し得る。
いくつかの実施形態では、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法は：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対して、その生体試料中の核酸分子が、完全長／成熟型のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードする核酸配列を含むかどうかを判定するアッセイを実施し、ｂ）完全長／成熟型のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドの３５２位にセリンをコードする核酸配列を含む核酸分子が生体試料中で検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、または完全長／成熟型のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドの３５２位にセリンをコードする核酸配列を含む核酸分子が生体試料中で検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することを含む。いくつかの実施形態では、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、生体試料中の核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、本開示は、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法を提供し、方法は：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対して、その生体試料中の核酸分子が配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置に配列番号２のヌクレオチド５３７５７〜５３５７７を含むかどうかを判定するアッセイを実施し、ｂ）配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置に配列番号２のヌクレオチド５３７５７〜５３５７７を含む核酸分子が生体試料中で検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、または配列番号２の５３７５７〜５３５７７位に対応する位置に配列番号２のヌクレオチド５３７５７〜５３５７７を含む核酸分子が生体試料中で検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法を提供し、方法は：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対して、その生体試料中の核酸分子が配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置に配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含むかどうかを判定するアッセイを実施し、ｂ）配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置に配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含む核酸分子が生体試料中で検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、または配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置に配列番号４のヌクレオチド１２４３〜１２４５を含む核酸分子が生体試料中で検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法を提供し、方法は：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対して、その生体試料中の核酸分子が配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含むかどうかを判定するアッセイを実施し、ｂ）配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含む核酸分子が生体試料中で検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、または配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置に配列番号６のヌクレオチド１０５４〜１０５６を含む核酸分子が生体試料中で検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノムＤＮＡの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、対象の心血管病態の発症に対する感受性または心血管病態の発症リスクを判定することを含み、それは：ａ）対象からゲノムＤＮＡを含む生体試料を取得し、ｂ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子（例えば、配列番号２参照）の５３５７５〜５３５７７位に対応するＤＮＡの位置を占有するヌクレオチドの同一性を判定するアッセイをゲノムＤＮＡに対して実施し、ｃ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応するゲノムＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしている場合、対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類することを含む。あるいは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応するゲノムＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしていない場合、対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することができる。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、心血管病態を有する対象を診断することを含み、それは：ａ）対象からゲノムＤＮＡを含む生体試料を取得し、ｂ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子（例えば、配列番号２参照）の５３５７５〜５３５７７位に対応するＤＮＡの位置を占有するヌクレオチドの同一性を判定するアッセイをゲノムＤＮＡに対して実施し、ｃ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応するゲノムＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしている場合、対象を、心血管病態を有していると分類することを含む。あるいは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５３５７５〜５３５７７位に対応するゲノムＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしていない場合、対象を、心血管病態を有していないと分類することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、対象の心血管病態の発症に対する感受性または心血管病態の発症リスクを判定することを含み、それは：ａ）対象からｍＲＮＡを含む生体試料を取得し、ｂ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４参照）の１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡの位置を占有するヌクレオチドの同一性を判定するアッセイをｍＲＮＡに対して実施し、ｃ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしている場合、対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類することを含む。あるいは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしていない場合、対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することができる。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、心血管病態を有する対象を診断することを含み、それは：ａ）対象からｍＲＮＡを含む生体試料を取得し、ｂ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４参照）の１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡの位置を占有するヌクレオチドの同一性を判定するアッセイをｍＲＮＡに対して実施し、ｃ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしている場合、対象を、心血管病態を有していると分類することを含む。あるいは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしていない場合、対象を、心血管病態を有していないと分類することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、生体試料中のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、対象の心血管病態の発症に対する感受性または心血管病態の発症リスクを判定することを含み、それは：ａ）対象からｃＤＮＡを含む生体試料を取得し、ｂ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６参照）の１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡの位置を占有するヌクレオチドの同一性を判定するアッセイをｃＤＮＡに対して実施し、ｃ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしている場合、対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類することを含む。あるいは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしていない場合、対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することができる。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、心血管病態を有する対象を診断することを含み、それは：ａ）対象からｃＤＮＡを含む生体試料を取得し、ｂ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ（例えば、配列番号６参照）の１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡの位置を占有するヌクレオチドの同一性を判定するアッセイをｃＤＮＡに対して実施し、ｃ）バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしている場合、対象を、心血管病態を有していると分類することを含む。あるいは、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡの位置がアスパラギンではなくセリンをコードしていない場合、対象を、心血管病態を有していないと分類することができる。
いくつかの実施形態では、アッセイは：ヒト対象由来の生体試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分を配列決定することを含み、配列決定する部分には、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置が含まれ、ヒト対象由来の生体試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分を配列決定することを含み、配列決定する部分には、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置が含まれ、または、ヒト対象由来の生体試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分を配列決定することを含み、配列決定する部分には、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置が含まれる。
いくつかの実施形態では、アッセイは：ａ）生体試料を：ｉ）配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分、ｉｉ）配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分、またはｉｉｉ）配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分にハイブリダイズするプライマーと接触させること、ｂ）少なくとも：ｉ）５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置、ｉｉ）１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置、またはｉｉｉ）１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置を介してプライマーを伸長すること、及びｃ）プライマーの伸長産物が、配列番号８の３５２位のセリンをコードするヌクレオチドを：ｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の５３５７５〜５３５７７位に対応する、ｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位１２４３〜１２４５位に対応する、またはｉｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応する位置に含むかどうかを判定することを含む。
いくつかの実施形態では、アッセイは、ストリンジェントな条件下で、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１配列にはハイブリダイズしないプライマーまたはプローブに生体試料を接触させること、及びハイブリダイゼーションが生じたかどうかを判定することを含む。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、生体試料中で、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するゲノムＤＮＡ内の位置に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、生体試料中で、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するｍＲＮＡ内の位置に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、生体試料中で、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するｃＤＮＡ内の位置に特異的にハイブリダイズする。
本明細書に開示する方法で使用することができる他のアッセイとして、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。本明細書に開示する方法で使用することができるさらに他のアッセイとして、例えば、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）ならびにそれに続く生体試料中のバリアント型ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの存在及び量の決定が挙げられる。
本開示はまた、心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法または心血管病態を有する対象の診断方法を提供し、方法は：ａ）ヒト対象由来の生体試料に対して、その生体試料中のＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含むかどうかを判定するアッセイを実施し、ｂ）配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが生体試料中で検出される場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが低いと分類し、または配列番号８の３５２位に対応する位置にセリンを含むＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが生体試料中で検出されない場合、ヒト対象を、心血管病態を発症するリスクが高いと分類することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象から生体試料を取得することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、対象が、心血管病態を有しているか、または心血管病態を発症するリスクが高いと診断されている場合、心血管病態を治療または予防する治療薬または予防薬を対象に投与する。あるいは、方法は、特にＬＤＬレベルが高い患者及び／または血栓性事象があった患者または血栓性事象のリスクの高い患者において、臨床的により進行した心血管病態の段階への進行に関連する１つ以上の症状を予防または軽減するように調整された治療薬を投与することをさらに含み得る。
本開示はまた、ヌクレアーゼ剤、外来性ドナー配列、転写活性化因子、転写抑制因子、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどのアンチセンス分子、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片、ならびに組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸を発現するための発現ベクターの任意の組み合わせの使用による細胞の改変方法を提供する。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。ヌクレアーゼ剤、外来性ドナー配列、転写活性化因子、転写抑制因子、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどのアンチセンス分子、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片、ならびに発現ベクターは、本明細書の他の場所で記載するように任意の形態及び任意の手段で、ならびにすべてまたは一部を任意の組み合わせで同時にまたは連続して細胞に導入することができる。いくつかの方法は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を変化させることのみを含む。いくつかの方法は、転写活性化因子または抑制因子の使用またはアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどのアンチセンス分子の使用によって内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の発現を変化させることのみを含む。いくつかの方法は、組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドもしくはその断片をコードする核酸を細胞に導入することのみを含む。いくつかの方法は、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片（例えば、本明細書に開示するＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片のいずれかまたは任意の組み合わせ）を細胞に導入することのみを含む。他の方法は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を改変すること、及びＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドもしくはその断片、あるいは組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドもしくはその断片をコードする核酸を細胞に導入することの両方を含む。他の方法は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の発現を変化させること、及びＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドもしくはその断片、あるいは組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドもしくはその断片をコードする核酸を細胞に導入することの両方を含む。
本開示は、ヌクレアーゼ剤及び／または外来性ドナー配列の使用による、細胞（例えば、多能性細胞または分化細胞）内のゲノムの内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の改変方法を提供する。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。ヌクレアーゼ剤は、単独で、または外来性ドナー配列と組み合わせて使用することができる。あるいは、外来性ドナー配列を、単独で、またはヌクレアーゼ剤と組み合わせて使用することができる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路を介して起こる：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）（Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１１，２２，８８６−８９７参照）。外来性ドナー配列によって媒介される標的核酸（例えば、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子）の修復には、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスが含まれ得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端と外来性ドナー配列の末端との直接ライゲーション（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）を通して外来性ドナー配列の標的化された組み込みをもたらし得る。修復は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によっても生じ得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性が必要であり得る核酸修復の形態を含み、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーからターゲットへの遺伝情報の転送をもたらす。
ゲノム中の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対する標的化された遺伝子改変は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座で５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム及び内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座で３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外来性ドナー配列と細胞を接触させることにより生成することができる。外来性ドナー配列を、標的ゲノム遺伝子座と組み換えて、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対する標的化された遺伝子改変を生成することができる。一例として、５’相同性アームは、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の５’の標的配列にハイブリダイズすることができ、３’相同性アームは、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の３’の標的配列にハイブリダイズすることができる。そのような方法は、例えば、そこから産生される完全長／成熟型ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を含むＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子をもたらし得る。外来性ドナー配列の例を、本明細書の他の場所に開示する。
例えば、ゲノム中の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対する標的化された遺伝子改変を、細胞または細胞のゲノムをＣａｓタンパク質及び内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の１つ以上のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする１つ以上のガイドＲＮＡと接触させることにより生成することができる。例えば、そのような方法は、細胞をＣａｓタンパク質及び内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１のエクソン５に対応する領域内に位置する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含み得るか、またはその近傍にある。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の、約１０００以内、約５００以内、約４００以内、約３００以内、約２００以内、約１００以内、約５０以内、約４５以内、約４０以内、約３５以内、約３０以内、約２５以内、約２０以内、約１５以内、約１０以内、または約５ヌクレオチド以内とすることができる。さらに別の例として、ガイドＲＮＡ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンまたは内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の終止コドンを含むか、またはその近傍とすることができる。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、開始コドンまたは終止コドンの、約１０以内、約２０以内、約３０以内、約４０以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内とすることができる。Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡは複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質はガイドＲＮＡ認識配列を切断する。Ｃａｓタンパク質による切断は、二本鎖切断または一本鎖切断（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼの場合）を引き起こし得る。そのような方法は、例えば、配列番号１のエクソン５に対応する領域が破壊されるか、開始コドンが破壊されるか、終止コドンが破壊されるか、またはコード配列を欠失した内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子をもたらし得る。本方法で使用することができるＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質及びガイドＲＮＡの例及びバリエーションを、本明細書の他の場所に記載する。
いくつかの実施形態では、２つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができる。例えば、配列番号１のエクソン５に対応する領域内、または配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むかまたはそれに近接する領域内（例えば、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の、約１０００以内、約５００以内、約４００以内、約３００以内、約２００以内、約１００以内、約５０以内、約４５以内、約４０以内、約３５以内、約３０以内、約２５以内、約２０以内、約１５以内、約１０以内、または約５ヌクレオチド以内）のヌクレアーゼ認識配列をそれぞれ標的とする２つのヌクレアーゼ剤を使用することができる。別の例として、それぞれが開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とする２つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができる。別の例として、１つが開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とし、もう１つが終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とする２つのヌクレアーゼ剤を使用することができ、これらのヌクレアーゼ剤による切断により、２つのヌクレアーゼ認識配列間のコード領域を欠失させることができる。さらに別の例として、１つ以上（例えば２つ）が開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とし、１つ以上（例えば２つ）が終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とする３つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができ、それらのヌクレアーゼ剤による切断により、開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列と、終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列の間のコード領域を欠失させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞を、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の追加のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする１つ以上の追加のガイドＲＮＡとさらに接触させることができる。細胞を１つ以上の追加のガイドＲＮＡ（例えば、第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ）と接触させることにより、Ｃａｓタンパク質による切断で２つ以上の二本鎖切断または２つ以上の一本鎖切断（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼの場合）を生じさせることができる。
いくつかの実施形態では、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座と組み換えて、標的化された遺伝子改変を生成することができる１つ以上の外来性ドナー配列と、細胞をさらに接触させる。本方法で使用することができる外来性ドナー配列の例及びバリエーションを、本明細書の他の場所に開示する。
本明細書の他の場所に記載するような任意の形態及び任意の手段により、Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（複数可）、及び外来性ドナー配列（複数可）を細胞に導入することができ、Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（複数可）、及び外来性ドナー配列（複数可）のすべてまたは一部を、任意の組み合わせで同時にまたは連続して導入することができる。
いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列による標的核酸（例えば、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子）の修復は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して生じる。相同組換え修復は、Ｃａｓタンパク質が内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断を生成する場合、Ｃａｓタンパク質が標的核酸のＤＮＡの１本の鎖を切断して一本鎖切断を生成するニッカーゼである場合、またはＣａｓニッカーゼを使用して２つのオフセットニックによって形成される２本鎖切断を生成する場合に生じ得る。そのような方法では、外来性ドナー配列に、５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’相同性アームを含ませる。ガイドＲＮＡ認識配列（複数可）または切断部位（複数可）は、５’標的配列の近傍のもの、３’標的配列の近傍のもの、５’標的配列と３’標的配列の両方の近傍のもの、または５’標的配列にも３’標的配列にも近接させないものとすることができる。いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列に、５’及び３’相同性アームに隣接する核酸インサートをさらに含ませることができ、核酸インサートを５’及び３’標的配列の間に挿入する。核酸インサートが存在しない場合、外来性ドナー配列は、５’及び３’標的配列間のゲノム配列を欠失させるように機能することができる。外来性ドナー配列の例を、本明細書の他の場所に開示する。
あるいは、外来性ドナー配列によって媒介される内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介したライゲーションにより起こり得る。そのような方法では、外来性ドナー配列の少なくとも一方の末端は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のＣａｓを介した切断により生じる少なくとも１つのオーバーハングに相補的な短い一本鎖領域を含む。外来性ドナー配列の相補的末端は、核酸インサートに隣接させることができる。例えば、外来性ドナー配列の各末端に、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のＣａｓを介した切断により生じるオーバーハングに相補的な短い一本鎖領域を含ませることができ、外来性ドナー配列のこれらの相補領域は核酸インサートに隣接させることができる。
オーバーハング（すなわち、付着末端）は、Ｃａｓを介した切断によって生じる二本鎖切断の平滑端の切除によって作成することができる。そのような切除は、断片の結合に必要なマイクロホモロジー領域を生成することができるが、これにより、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に望ましくないまたは制御不能な変化が生じ得る。あるいは、そのようなオーバーハングは、Ｃａｓニッカーゼのペアで用いて作成することができる。例えば、細胞を、ＤＮＡの反対側の鎖を切断する第１及び第２ニッカーゼに接触させることができ、それによりゲノムを二重のニッキングによって改変する。これは、細胞を第１のＣａｓタンパク質ニッカーゼ、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ、第２のＣａｓタンパク質ニッカーゼ、及び内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させることにより達成することができる。第１のＣａｓタンパク質及び第１のガイドＲＮＡは、第１の複合体を形成し、第２のＣａｓタンパク質及び第２のガイドＲＮＡは、第２の複合体を形成する。第１のＣａｓタンパク質ニッカーゼは、第１のガイドＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、第２のＣａｓタンパク質ニッカーゼは、第２のガイドＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断し、場合により、外来性ドナー配列が、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座と組み換わり、標的化された遺伝子改変を生じる。
第１のニッカーゼは、ゲノムＤＮＡの第１の鎖（すなわち、相補鎖）を切断することができ、第２のニッカーゼは、ゲノムＤＮＡの第２の鎖（すなわち、非相補鎖）を切断することができる。第１及び第２のニッカーゼは、例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの触媒残基を変異させる（例えば、本明細書の他の場所に記載のＤ１０Ａ変異）か、またはＣａｓ９のＨＮＨドメインの触媒残基を変異させる（例えば、本明細書の他の場所に記載のＨ８４０Ａ変異）ことによって作成することができる。そのような方法では、二重のニッキングを用いて、付着末端（すなわち、オーバーハング）を有する二本鎖切断を作成することができる。切断部位を作成するように第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列を配置することができ、その結果、ＤＮＡの第１及び第２鎖上の第１及び第２のニッカーゼによって生じるニックにより、二本鎖切断が生じる。第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニックをずらす場合には、オーバーハングが作成される。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、少なくとも約１０ｂｐ、少なくとも約２０ｂｐ、少なくとも約３０ｂｐ、少なくとも約４０ｂｐ、少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約６０ｂｐ、少なくとも約７０ｂｐ、少なくとも約８０ｂｐ、少なくとも約９０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、またはそれ以上であり得る。例えば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５４，１３８０−１３８９、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１３，３１，８３３−８３８、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，３９９−４０４参照。
本明細書に記載の方法を使用して、様々なタイプの標的化された遺伝子改変を導入することができる。そのような標的化された改変には、例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、点突然変異、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０、またはそれ以上のヌクレオチドを変化させ（例えば、欠失、挿入、または置換し）、標的化されたゲノム改変を形成することができる。
そのような標的化された遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座の破壊をもたらし得る。破壊には、調節エレメント（プロモーターまたはエンハンサーなど）の変化、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、トランケーション変異、ヌル変異、または少数のヌクレオチドの挿入または欠失（例えば、フレームシフト変異を引き起こすこと）が含まれ得るが、それは不活性化（すなわち機能の喪失）または対立遺伝子の喪失をもたらし得る。例えば、標的化された改変として、開始コドンがもはや機能しないようにするための内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンの破壊が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、標的化された改変には、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列またはＣａｓ切断部位間の欠失が含まれ得る。外来性ドナー配列（例えば、修復テンプレートまたはターゲティングベクター）を使用する場合、改変には、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列またはＣａｓ切断部位間の欠失、ならびに５’及び３’標的配列間への核酸インサートの挿入が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列を単独でまたはヌクレアーゼ剤と組み合わせて使用する場合、改変には、５’及び３’標的配列間の欠失、ならびに第１及び第２の相同染色体のペアの５’及び３’標的配列間への核酸インサートの挿入、それにより、ホモ接合の改変ゲノムを生じることが含まれ得る。あるいは、外来性ドナー配列が核酸インサートのない５’及び３’相同性アームを有する場合、改変には５’及び３’標的配列間の欠失が含まれ得る。
第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列間の欠失または５’及び３’標的配列間の欠失は、欠失させる核酸が、第１及び第２のヌクレアーゼ切断部位間の核酸配列のみ、または５’及び３’標的配列間の核酸配列のみからなり、その結果、改変するゲノム標的遺伝子座に追加の欠失または挿入が存在しない正確な欠失であり得る。第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列間の欠失はまた、第１及び第２のヌクレアーゼ切断部位をはみ出す不正確な欠失であり得、それは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による不正確な修復と一致し、改変するゲノム遺伝子座における追加の欠失及び／または挿入を生じる。例えば、欠失は、第１及び第２のＣａｓタンパク質切断部位を、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、またはそれ以上はみ出し得る。同様に、改変するゲノム遺伝子座は、ＮＨＥＪによる不正確な修復と一致する追加の挿入、例えば、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、またはそれ以上の挿入を含み得る。
標的化された遺伝子改変は、例えば、二対立遺伝子改変または単一対立遺伝子改変であり得る。二対立遺伝子の改変には、対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に同じ改変を行うか（例えば、二倍体細胞の）、または対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に異なる改変を行う事象が含まれる。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子改変は、単一対立遺伝子改変である。単一遺伝子改変には、１つの対立遺伝子のみに改変を行う事象（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つのみの内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対する改変）が含まれる。相同染色体には、同じ遺伝子座に同じ遺伝子を有するが、異なる対立遺伝子である可能性のある染色体（例えば、減数分裂中にペアになる染色体）が含まれる。
単一対立遺伝子変異は、標的化されたＢ４ＧＡＬＴ１改変に関してヘテロ接合性である細胞をもたらし得る。ヘテロ接合性には、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の１つの対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）のみが標的化された改変を有する状況が含まれる。
二対立遺伝子改変は、標的化された改変のホモ接合性をもたらし得る。ホモ接合性には、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）が標的化された改変を有する状況が含まれる。あるいは、二対立遺伝子改変は、標的化された改変に対して複合ヘテロ接合性（例えば、半接合性）をもたらし得る。複合ヘテロ接合性には、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が改変されるが、異なる方法で改変される状況（例えば、一方の対立遺伝子の標的化された改変及び他方の対立遺伝子の不活性化または破壊）が含まれる。
本明細書に開示する方法は、改変されたＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を有する細胞を同定することをさらに含み得る。欠失または挿入などの標的化された遺伝子改変を有する細胞を、様々な方法を使用して同定することができる。そのような方法は、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に標的化された遺伝子改変を有する１つの細胞を同定することを含み得る。スクリーニングを実施して、改変されたゲノム遺伝子座を有するそのような細胞を同定することができる。スクリーニング工程は、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイ（例えば、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）及び／または対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイ）を含み得る。
適切な定量アッセイの他の例として、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）への定量ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ法が挙げられる。ロングレンジＰＣＲ、サザンブロッティング、またはサンガー法などの標的修飾のスクリーニングのための従来のアッセイも使用することができる。そのようなアッセイは、通常、挿入されたターゲティングベクターと標的化されたゲノム遺伝子座との間の連結のエビデンスを得るために使用される。例えば、ロングレンジＰＣＲアッセイでは、１つのプライマーが、挿入されたＤＮＡ内の配列を認識し、もう１つのプライマーが、ターゲティングベクターの相同性アームの末端をはみ出す標的ゲノム遺伝子座配列を認識する。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もスクリーニングに使用することができる。次世代シーケンシングは「ＮＧＳ」または「大規模並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、選択マーカーを使用して標的細胞をスクリーニングする必要がない。例えば、本明細書に記載のＭＯＡ及びＮＧＳアッセイは、選択カセットの使用に依拠しないことが可能である。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸の発現の変更方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載するように、ヌクレアーゼ剤による切断によって発現を変化させ、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸の破壊を引き起こす。いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインに融合または連結させたＤＮＡ結合タンパク質の使用により発現を変化させる。いくつかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉組成物の使用により発現を変化させる。
いくつかの実施形態では、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸の発現は、細胞または細胞内のゲノムを、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸内の標的ゲノム遺伝子座の認識配列に１つ以上のニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤と接触させることにより改変することができる。そのような切断は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸の発現の破壊をもたらし得る。例えば、ヌクレアーゼ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接させることができる。例えば、認識配列は、開始コドンの、約１０以内、約２０以内、約３０以内、約４０以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内とすることができ、及びヌクレアーゼ剤による切断は、開始コドンを破壊することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができ、それぞれが、開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とする。いくつかの実施形態では、２つのヌクレアーゼ剤を使用することができ、１つは開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とし、１つは終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とし、ヌクレアーゼ剤による切断は、２つのヌクレアーゼ認識配列間のコード領域の欠失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、３つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができ、１つ以上（例えば２つ）は、開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とし、１つ以上（例えば２つ）は、終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列を標的とし、ヌクレアーゼ剤による切断は、開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列と、終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ認識配列との間のコード領域の欠失をもたらし得る。内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸を改変する他の例を、本明細書の他の場所に開示する。
いくつかの実施形態では、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸の発現は、細胞または細胞内のゲノムを、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座に結合するＤＮＡ結合タンパク質と接触させることにより改変することができる。ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質であり得る。ＤＮＡ結合タンパク質の他の例として、転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインに融合したジンクフィンガータンパク質、または転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインに融合したＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質の例を、本明細書の他の場所に開示する。
ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列（例えば、ガイドＲＮＡ認識配列）は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸内の、発現を変化させるのに適した任意の場所とすることができる。いくつかの実施形態では、認識配列は、エンハンサーまたはプロモーターなどの調節エレメント内とすることができ、または調節エレメントに近接させることができる。例えば、認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接させることができる。いくつかの実施形態では、認識配列は、開始コドンの、約１０以内、約２０以内、約３０以内、約４０以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内とすることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンス分子を使用して、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸の発現を変化させることができる。アンチセンス分子の例として、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、ｍＲＮＡの任意の領域を標的とするように設計することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡに固有の領域を標的とするように設計することができる。
本明細書に開示する核酸及びタンパク質は、任意の手段により細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、導入は任意の手段によって達成することができ、１つ以上の成分（例えば、２つの成分、またはすべての成分）を任意の組み合わせで同時にまたは連続して細胞に導入することができる。例えば、外来性ドナー配列を、ヌクレアーゼ剤の導入前に導入することができ、またはヌクレアーゼ剤の導入後に導入することができる（例えば、外来性ドナー配列を、ヌクレアーゼ剤の導入の、約１、約２、約３、約４、約８、約１２、約２４、約３６、約４８、または約７２時間前または後に投与する）。細胞のゲノムをヌクレアーゼ剤または外来性ドナー配列と接触させることは、１つ以上のヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（例えば、１つ以上のＣａｓタンパク質または１つ以上のＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上のガイドＲＮＡまたは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ））及び／または１つ以上の外来性ドナー配列を細胞内へ導入することを含み得る。細胞のゲノムとの接触（すなわち、細胞との接触）は、上記の成分のうちの１つのみ、１つ以上の成分、またはすべての成分を細胞に導入することを含み得る。
ヌクレアーゼ剤は、タンパク質の形態で、またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、ＤＮＡを、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなＤＮＡを、１つ以上の発現構築物の中に存在させることができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、例えば、ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質の形態で、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなＤＮＡを、１つ以上の発現構築物の中に存在させることができる。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の成分であり得る。あるいは、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを、別々の核酸分子の成分とすることができる）。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするＤＮＡ（例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ）及び／または外来性ドナー配列をコードするＤＮＡを、ＤＮＡミニサークルを介して細胞に導入することができる。ＤＮＡミニサークルは、非ウイルス性遺伝子導入に使用することができるスーパーコイルＤＮＡ分子であり、複製起点も抗生物質選択マーカーも有していない。したがって、ＤＮＡミニサークルは通常、プラスミドベクターよりもサイズが小さい。これらのＤＮＡには細菌ＤＮＡが含まれていないため、細菌ＤＮＡに見出される非メチル化ＣｐＧモチーフがない。
本明細書に記載の方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部にアクセスすることのみが得られる。核酸及びタンパク質を様々な細胞型に導入する方法は公知であり、安定的導入法、一過性導入法、及びウイルスを介した方法が挙げられるが、これらに限定されない。
形質移入プロトコールならびに核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコールは様々に異なり得る。非限定的な形質移入法として、リポソーム、ナノ粒子、カルシウム、デンドリマー、及びＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用した化学ベースの形質移入法が挙げられる。非化学的方法としては、電気穿孔法、ソノポレーション、及び光トランスフェクションが挙げられる。粒子ベースの形質移入法として、遺伝子銃の使用、または磁石補助型トランスフェクションが挙げられる。ウイルス法も形質移入に使用することができる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、形質移入、脂質を介した形質移入、またはヌクレオフェクションによっても媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核内に送達できるようにする改良された電気穿孔法である。さらに、本明細書に開示する方法におけるヌクレオフェクションの使用は、一般的に、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞しか必要としない（例えば、通常の電気穿孔法が７００万であるのに対して約２００万で済む）。いくつかの実施形態では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）系を用いて実施する。
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、マイクロインジェクションによって達成することもできる。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは通常、細胞質内で実施し（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）、一方、タンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡのマイクロインジェクションは通常、核内で実施する。あるいは、マイクロインジェクションを、核と細胞質の両方への注射により実施することができる：針を最初に核に導入し、第１の量を注射し、細胞から針を除去しながら第２の量を細胞質に注射することができる。ヌクレアーゼ剤タンパク質を細胞質に注射する場合、確実に核／前核へ送達するために、核局在化シグナルをタンパク質に含ませてもよい。
核酸またはタンパク質を細胞に導入する他の方法として、例えば、ベクター送達、粒子を介した送達、エキソソームを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過ペプチドを介した送達、または埋め込み型装置を介した送達が挙げられる。核酸またはタンパク質を対象に投与してｉｎ ｖｉｖｏで細胞を改変する方法を、本明細書の他の場所に開示する。細胞への核酸及びタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によっても実現することができる。
核酸またはタンパク質を細胞に導入する他の方法として、例えば、ベクター送達、粒子を介した送達、エキソソームを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過ペプチドを介した送達、または埋め込み型装置を介した送達が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸またはタンパク質を、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体中で、細胞に導入することができる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回行うことができる。いくつかの実施形態では、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回行うことができる。
いくつかの実施形態では、方法及び組成物で使用する細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。そのような場合、接触は、ゲノムに既に安定的に組み込まれた構築物を有する細胞を提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法において使用する細胞は、そのゲノムに安定的に組み込まれた既存のＣａｓコード遺伝子を有していてもよい（すなわち、Ｃａｓ作動可能細胞）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組み込み、それをその子孫に遺伝させることができる。ＤＮＡ構築物または標的化されたゲノム組み込み系の様々な成分の安定した組み込みに、任意のプロトコールを使用してもよい。
所望の認識配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤または所望の認識配列に結合する任意のＤＮＡ結合タンパク質を、本明細書に開示する方法及び組成物において使用することができる。天然またはネイティブのヌクレアーゼ剤を、そのヌクレアーゼ剤が所望の認識配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、使用することができる。同様に、天然またはネイティブのＤＮＡ結合タンパク質を、そのＤＮＡ結合タンパク質が所望の認識配列に結合する限り、使用することができる。あるいは、修飾型または改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質を使用することができる。改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質は、ネイティブの天然ヌクレアーゼ剤もしくはＤＮＡ結合タンパク質に由来するものであるか、または人工的に作成もしくは合成することができる。改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質は、認識配列を認識することができ、例えば、その場合、認識配列は、ネイティブの（未改変または未修飾の）ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるであろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質の修飾は、タンパク質切断剤中のわずか１個のアミノ酸または核酸切断剤中のわずか１個のヌクレオチドとすることができる。
ヌクレアーゼ剤の認識配列には、ヌクレアーゼ剤によりニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列が含まれる。同様に、ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列には、ＤＮＡ結合タンパク質が結合するＤＮＡ配列が含まれる。認識配列は、細胞にとって内在性（すなわちネイティブ）、または細胞にとって外来性であり得る。認識配列はまた、標的遺伝子座に配置することを望む目的のポリヌクレオチドに対して外来性であり得る。いくつかの実施形態では、認識配列は、宿主細胞のゲノム中に一箇所だけ存在する。
例示する認識配列の活性型バリアント及び断片も提供する。そのような活性型バリアントは、所与の認識配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、活性型バリアントは生物活性を保持し、ヌクレアーゼ剤によって配列特異的な様式で認識され、切断され得る。ヌクレアーゼ剤による認識配列の二本鎖切断を測定するアッセイは、公知である（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０１０，４７６，２９５−３０７）。
認識配列の長さは様々に異なり得るが、例えば、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対に対して約３０〜約３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮに対して約１５〜約１８ｂｐ）、ＴＡＬＥタンパク質またはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に対して約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに対して約２０ｂｐの認識配列が挙げられる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤の認識配列は、標的ゲノム遺伝子座の内部または近傍の任意の場所に配置することができる。認識配列は、遺伝子（例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子）のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内に配置することができる。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤の認識配列は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域に配置することができる。
本明細書に開示する様々な方法及び組成物において使用することができるＤＮＡ結合タンパク質の１つのタイプは、ＴＡＬＥである。ＴＡＬＥは、例えば、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに融合させるか、または連結することができる。そのようなドメインの例は、Ｃａｓタンパク質に関して以下に記載されており、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４５１２１にも見出すことができる。それに対応して、本明細書に開示する様々な方法及び組成物において使用することができるヌクレアーゼ剤の１つのタイプはＴＡＬＥＮである。転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムの特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、ネイティブ型もしくは改変型ＴＡＬエフェクター、またはその機能部分を融合することにより作成する。ユニークなモジュラー型ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、潜在的に任意のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように設計し、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び適切なＴＡＬヌクレアーゼの調製方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号、第２０１１／０２６９２３４号、第２０１１／０１４５９４０号、第２００３／０２３２４１０号、第２００５／０２０８４８９号、第２００５／００２６１５７号、第２００５／００６４４７４号、第２００６／０１８８９８７号、及び第２００６／００６３２３１号に開示されている。
いくつかのＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する約３３〜約３５のＴＡＬリピートを含む。いくつかのＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結し、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（約１２〜約２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列において二本鎖切断を行う活性型ヌクレアーゼを生成する。
ＤＮＡ結合タンパク質の別の例は、ジンクフィンガータンパク質である。そのようなジンクフィンガータンパク質は、例えば、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに連結するか、または融合させることができる。そのようなドメインの例は、Ｃａｓタンパク質に関して以下に記載されており、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４５１２１にも見出すことができる。それに対応して、本明細書に開示する様々な方法及び組成物において使用することができるヌクレアーゼ剤の別の例はＺＦＮである。いくつかのＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐの部分部位に結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含むことができ、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれはＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結し、第１及び第２のＺＦＮは、約５〜約７ｂｐのスペーサーにより分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性型ヌクレアーゼを生成する。
本明細書に記載の方法及び組成物において使用するための他の適切なＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼ剤として、本明細書の他の場所に記載するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が挙げられる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤は、任意の公知の手段によって細胞に導入してもよい。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドを細胞に直接導入してもよい。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する場合、細胞内でＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤を、一時的に、条件的に、または構成的に発現させることができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを発現カセットに含め、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなプロモーターを、本明細書の他の場所でさらに詳細に論じる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤を、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入することができる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細胞のゲノムに安定的に組み込み、また、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、ターゲティングベクター内、またはインサートのポリヌクレオチドを含むターゲティングベクターとは別のベクターもしくはプラスミド内に存在させることができる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を介してＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤を細胞に提供する場合、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドを、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードする天然のポリヌクレオチド配列に比べて目的細胞内での使用頻度が高い置換コドンに改変することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞または任意の他の目的の宿主細胞を含む、所定の目的の原核細胞または真核細胞において天然のポリヌクレオチド配列に比べて使用頻度の高い置換コドンに改変することができる。
本明細書に開示する方法は、細胞内のゲノムを改変するために、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成要素を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を誘導する転写産物及び他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の系であり得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｖ型の系（例えば、サブタイプＶ−ＡまたはサブタイプＶ−Ｂ）であり得る。本明細書に開示する方法及び組成物は、核酸の部位特異的切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用することができる。
本明細書に開示する方法において使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、非天然である。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、天然では一緒に存在しないｇＲＮＡとＣａｓタンパク質を含む非天然のＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する。
Ｃａｓタンパク質は、一般的に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下により詳細に記載する）と相互作用することができる少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメインまたはＲＮＡ結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断のための触媒活性を保有している。切断により、平滑末端または付着末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。野生型Ｃａｓ９タンパク質は、通常、平滑切断産物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後、及び標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じた５ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に二本鎖切断（例えば、平滑末端を有する二本鎖切断）を生じる完全な切断活性を有しているか、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に一本鎖切断を生じるニッカーゼであり得る。
Ｃａｓタンパク質の例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、ならびにその相同体または改変体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＣａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に由来し、通常、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有している。モチーフ１、２、及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ種、Ｌｙｎｇｂｙａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（割り当てられたＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｑ９９ＺＷ２）は、例示的な酵素である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｊ７ＲＵＡ５）は、別の例示的な酵素である。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）であり、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様のヌクレアーゼドメインと、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチクラスターの対応物を有する。しかしながら、Ｃｐｆ１には、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインがなく、ＲｕｖＣ様ドメインは、ＨＮＨドメインを含む長いインサートを含むＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列内で連続している。例示的なＣｐｆ１タンパク質として、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亜種ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的な酵素である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然界に存在するもの）、改変型Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変型Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変型Ｃａｓタンパク質の活性型バリアントまたは断片であり得る。活性型バリアントまたは断片は、野生型もしくは改変型Ｃａｓタンパク質またはその部分と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得るが、その場合、活性型バリアントは所望の切断部位で切断する能力を保持しており、したがって、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持している。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性のアッセイは公知であり、一般的にそれは、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性と特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は一般的に、おそらくは二量体構成で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は一般的に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡの二本鎖切断を行うことができる。
Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに融合させることができる。転写活性化ドメインの例として、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１及び２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ならびにＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインが挙げられる。他の例として、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、ＳＰ１、ＡＰ−２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ−２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、ＡＲＦ−６、ＡＲＦ−７、ＡＲＦ−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ＴＲＡＢ１ＰＣ４、及びＨＳＦ１由来の活性化ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２３７４５６号、欧州特許第ＥＰ３０４５５３７号、及びＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４５１２１参照。
いくつかの実施形態では、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡテトラループに付加したアプタマー配列と、二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質を結合するように設計したステムループ２を使用して設計することができる。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１７，５８３−５８８参照。転写抑制因子ドメインの例として、誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ−Ａ）抑制因子ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチ抑制因子ドメイン、Ｓｐ１様抑制因子、Ｅ（ｓｐｌ）抑制因子、ΙκΒ抑制因子、及びＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例として、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２由来の転写抑制ドメインが挙げられるが、これらに限定されず、例えば、欧州特許第ＥＰ３０４５５３７号及びＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４５１２１参照。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合させることができる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に配置することができる。
Ｃａｓ融合タンパク質の例は、細胞内局在化を提供する異種ポリペプチドに融合したＣａｓタンパク質である。そのような異種ポリペプチドは、例えば、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、核を標的とするＳＶ４０ ＮＬＳ、ミトコンドリアを標的とするミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含み得る。そのような細胞内局在シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に配置することができる。ＮＬＳには、一連の塩基性アミノ酸を含ませることができ、一本鎖配列または二本鎖配列であり得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインに作動可能に連結することができる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来ＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列由来のものとすることができる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に配置することができる。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、モノマー型Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、モノマー型Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
また、Ｃａｓ９タンパク質を、外来性ドナー配列または標識した核酸に係留することもできる。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有相互作用または非共有相互作用を通じて達成することができ、係留は、直接的であり得るか（例えば、直接的融合によって、あるいはタンパク質のシステインもしくはリジン残基の修飾またはインテイン修飾により達成できる化学的結合によって）、またはストレプトアビジンもしくはアプタマーなどの１つ以上の介在リンカーもしくはアダプター分子を介して達成することができる。タンパク質−核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合型の戦略として、ビオチン−ストレプトアビジン法及びニッケル−ヒスチジン法が挙げられる。適切に官能化した核酸及びタンパク質を多種多様な化学を使用して結合させることにより、共有結合型のタンパク質−核酸コンジュゲートを合成することができる。これらの化学のいくつかでは、タンパク質表面のアミノ酸残基へのオリゴヌクレオチドの直接的な付加が伴う（例えば、リジンアミンまたはシステインチオール）が、一方で、他のより複雑なスキームでは、タンパク質の翻訳後修飾またはタンパク質の触媒ドメインもしくは反応性ドメインの関与が必要である。タンパク質を核酸に共有結合させる方法として、例えば、オリゴヌクレオチドと、タンパク質のリジンまたはシステイン残基との化学的架橋、発現させるタンパク質のライゲーション、化学酵素法、及び光アプタマーの使用が挙げられ得る。外来性ドナー配列または標識した核酸を、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＣａｓ９タンパク質内の内部領域に係留することができる。いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列または標識した核酸を、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留する。同様に、Ｃａｓ９タンパク質を、５’末端、３’末端、または外来性ドナー配列または標識した核酸内の内部領域に係留することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質を、外来性ドナー配列または標識した核酸の５’末端または３’末端に係留する。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質、例えば、ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡの形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物においてタンパク質へ効率的に翻訳させるために、コドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において天然のポリヌクレオチド配列に比べて高い使用頻度を有する置換コドンに改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞内で、一時的に、条件的に、または構成的に発現する。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、細胞のゲノムに安定的に組み込み、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、発現構築物のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物には、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物が含まれる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、核酸インサートを含むターゲティングベクター及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在させることができる。あるいは、核酸インサートを含むターゲティングベクターとは別個の、及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミド内に存在させることができる。発現構築物に使用することができるプロモーターとして、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体の１つ以上で活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、一方の向きへのＣａｓタンパク質と、他方の向きへのガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向性プロモーターであり得る。そのような双方向性プロモーターは：１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスを含む完全な従来型の単方向性Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、及び２）ＰＳＥ及びＤＳＥの５’末端に逆方向に融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスに隣接しており、Ｕ６プロモーター由来のＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写を制御するハイブリッドプロモーターを作成することにより、プロモーターを双方向性にすることができる。双方向性プロモーターの使用により、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させ、コンパクトな発現カセットを生成して送達を促進することができる。
本開示はまた、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ（例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子）内の特定の位置に標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ酵素を誘導して内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に結合または切断するのに有効であり、ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位を含むかまたはそれに近接する内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするＤＮＡターゲティングセグメントを含む。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位の、約５以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約３０以内、約３５以内、約４０以内、約４５以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内とすることができる。他の例示的なガイドＲＮＡは、配列番号１のエクソン５に対応する領域内にある内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするＤＮＡターゲティングセグメントを含む。他の例示的なガイドＲＮＡは、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むかもしくはそれに近接するか、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の終止コドンを含むかもしくはそれに近接する内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするＤＮＡターゲティングセグメントを含む。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、開始コドンの、約５以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約３０以内、約３５以内、約４０以内、約４５以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、もしくは約１，０００ヌクレオチド以内、または終止コドンの、約５以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約３０以内、約３５以内、約４０以内、約４５以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、もしくは約１，０００ヌクレオチド以内とすることができる。内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子は、任意の生物に由来するＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子とすることができる。例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子または非ヒト哺乳類、げっ歯類、マウス、もしくはラットなどの別の生物由来のオルソログとすることができる。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子の５’末端に存在する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に隣接している。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子の３’末端に存在する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に近接している。配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に近接する例示的なガイドＲＮＡ認識配列として、ＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴ（配列番号９）及びＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＧＴＡＴ（配列番号１０）（いずれも配列番号１の５３５７５〜５３５７７位の５’側）、ならびにＴＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＡＧＧＡ（配列番号１１）及びＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＡＧ（配列番号１２）（いずれも配列番号１の５３５７５〜５３５７７位の３’側）が挙げられるが、これらに限定されない。
ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：ＤＮＡターゲティングセグメント及びタンパク質結合セグメントを含み得る。いくつかのｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子を含む：アクチベーターＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びターゲターＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡすなわちｃｒＲＮＡ）。他のｇＲＮＡは単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド；単一分子のｇＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、すなわちｓｇＲＮＡ）である。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに（例えばリンカーを介して）融合させたｃｒＲＮＡを含み得る。例えば、Ｃｐｆ１の場合、切断を達成するためにｃｒＲＮＡのみが必要である。ｇＲＮＡには、２分子（すなわち、モジュラー型）ｇＲＮＡと単一分子のｇＲＮＡの両方が含まれる。
所定のｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡの配列（すなわち、ガイドＲＮＡ認識配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基の対合）を介して、配列特異的な様式で標的ＤＮＡ（例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子）と相互作用する。そのため、ＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は、様々に異なり得るとともに、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定付ける。対象ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる。天然のｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び生物によって異なるが、多くの場合、約２１〜約４６ヌクレオチドの長さの２つの直列反復配列（ＤＲ）が隣接する約２１〜約７２ヌクレオチド長のターゲティングセグメントを含む。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、ターゲティングセグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、対応するｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、次いでＣａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡターゲティングセグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡターゲティングセグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、または約１２ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド（例えば、約１７ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、または約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、もしくは約２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、米国出願公開第２０１６／００２４５２３号参照。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、一般的なＤＮＡターゲティングセグメントは、約１６〜約２０ヌクレオチド長または約１７〜約２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、一般的なＤＮＡターゲティングセグメントは、約２１〜約２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、一般的なＤＮＡターゲティングセグメントは、少なくとも約１６ヌクレオチド長または少なくとも約１８ヌクレオチド長である。
標的ＤＮＡ内のＤＮＡターゲティング配列とガイドＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％であり得る。標的ＤＮＡ内のＤＮＡターゲティング配列とガイドＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、約２０連続ヌクレオチドにわたって少なくとも約６０％であり得る。一例として、標的ＤＮＡ内のＤＮＡターゲティング配列とガイドＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の５’末端の約１４連続ヌクレオチドにわたって約１００％であり、また、残部にわたっては約０％と低い。そのような場合、ＤＮＡターゲティング配列は約１４ヌクレオチド長とみなすことができる。別の例として、標的ＤＮＡ内のＤＮＡターゲティング配列とガイドＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の５’末端の７連続ヌクレオチドにわたって約１００％であり、また、残部にわたっては約０％と低い。そのような場合、ＤＮＡターゲティング配列は約７ヌクレオチド長とみなすことができる。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ−ターゲティング配列内の少なくとも約１７ヌクレオチドが標的ＤＮＡに相補的である。例えば、ＤＮＡターゲティング配列を、約２０ヌクレオチド長とすることができ、標的ＤＮＡ（ガイドＲＮＡ認識配列）に対して１つ、２つ、または３つのミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態では、ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していない（例えば、ミスマッチがＤＮＡターゲティング配列の５’末端にあるか、またはミスマッチがＰＡＭ配列から、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、もしくは少なくとも１９塩基対離れている）。
ガイドＲＮＡには、追加の望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性；細胞内ターゲティング；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する修飾または配列を含ませることができる。そのような修飾の例として、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による調節された安定性及び／または調節されたアクセシビリティを可能にするための）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）；ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾または配列；追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質に対する結合部位を提供する修飾または配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）；及びその組み合わせが挙げられる。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供することができる。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかのＲＮＡの形態で、及び場合によりＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製することもできる。
ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供することができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードし得る。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別々のＤＮＡ分子として提供することができる。ｇＲＮＡをＤＮＡの形で提供する場合、ｇＲＮＡを細胞内で、一時的に、条件的に、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞のゲノムに安定的に組み込み、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、発現構築物のプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、異種核酸を含むベクター内に存在させることができる。ベクターには外来性ドナー配列をさらに含ませることができ、及び／またはベクターにはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含ませることができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、外来性ドナー配列を含むベクター及び／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドに存在させることができる。そのような発現構築物において使用することができるプロモーターとして、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹細胞、または接合体の１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向性プロモーターであり得る。適切なプロモーターの具体例として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
本開示はまた、本明細書に開示する１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）及び単離された核酸またはタンパク質の安定性を高める（例えば、所定の保管条件（例えば、−、２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解産物が閾値未満（出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満など）に留まる期間を延長するか；またはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を増加させる）担体を含む組成物も提供する。そのような担体の例として、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、及び脂質微小管が挙げられるが、これらに限定されない。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。そのような組成物は、本明細書の別の場所に開示する、１つ以上（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）の外来性ドナー配列及び／または１つ以上（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）のターゲティングベクター及び／または１つ以上（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）の発現ベクターをさらに含み得る。
ガイドＲＮＡ認識配列には、結合に十分な条件が存在する場合、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ（例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子）に存在する核酸配列が含まれる。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列には、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計した配列が含まれ、その場合、ガイドＲＮＡ認識配列とＤＮＡターゲティング配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、必ずしも完全な相補性は必要ない。ガイドＲＮＡ認識配列には、Ｃａｓタンパク質の切断部位も含まれ、これについては以下で詳しく説明する。ガイドＲＮＡ認識配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に配置することができる任意のポリヌクレオチドを含み得る。
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡにより標的化する（すなわち、結合されるか、またはハイブリダイズされるか、または相補的である）ことができる。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は公知である。
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の内部または外部の部位で核酸を切断することができる。「切断部位」には、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生じる核酸の位置が含まれる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するｇＲＮＡを含む）の形成により、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列内もしくはその近傍（例えば、１以内、２以内、３以内、４以内、５以内、６以内、７以内、８以内、９以内、１０以内、２０以内、もしくは５０以内、またはそれ以上の塩基対）において、一方または両方の鎖が切断される。切断部位は、核酸の片方の鎖のみ、または両方の鎖上にあり得る。切断部位は、核酸の両方の鎖の同じ位置とすることができるか（平滑末端を生成）、または各鎖の異なる部位に存在させることができる（付着末端（すなわち、オーバーハング）を生成）。いくつかの実施形態では、第１鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列は、第２鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列から、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、または少なくとも１，０００塩基対、離れている。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡ内の、ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対相補性及びｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭはガイドＲＮＡ認識配列に隣接させることができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列に、ＰＡＭを３’末端で隣接させることができる。あるいは、ガイドＲＮＡ認識配列に、ＰＡＭを５’末端で隣接させることができる。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位を、ＰＡＭ配列の上流または下流における約１〜約１０、または約２〜約５塩基対（例えば３塩基対）とすることができる。いくつかの場合（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９を使用する場合）では、非相補鎖のＰＡＭ配列は５’−Ｎ１ＧＧ−３’とすることができ、式中、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の直近の３’側である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は５’−ＣＣＮ２−３’であるだろうが、式中、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の直近の５’側である。いくつかのそのような場合では、Ｎ１とＮ２を相補的とすることができ、Ｎ１−Ｎ２塩基対を任意の塩基対とすることができる（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、及びＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴ（配列番号１３）またはＮＮＧＲＲ（配列番号１４）とすることができ、式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴとすることができ、Ｒは、ＧまたはＡとすることができる。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流に存在し、配列５’−ＴＴＮ−３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ認識配列の例として、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントに相補的なＤＮＡ配列、またはＰＡＭ配列に加えてそのようなＤＮＡ配列が挙げられる。例えば、標的モチーフは、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号１５）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号１６）などのＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり得る（例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１６５８２５参照）。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ認識配列の他の例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号１７）を含み得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０６５５９６参照。他のガイドＲＮＡ認識配列は、５’ＧまたはＧＧ及び３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、約４〜約２２ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、約１４〜約２０ヌクレオチド長を有し得る。
ガイドＲＮＡ認識配列は、細胞に対して内在性または外来性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コーディング配列（例えば、調節配列）とすることができ、またはその両方を含ませることができる。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列を、配列番号１のエクソン５に対応する領域内に存在させることができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位を含むことができるか、またはそれに近接する。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の、約１０００以内、約５００以内、約４００以内、約３００以内、約２００以内、約１００以内、約５０以内、約４５以内、約４０以内、約３５以内、約３０以内、約２５以内、約２０以内、約１５以内、約１０以内、または約５ヌクレオチド以内とすることができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンまたは内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の終止コドンを含むか、またはそれに近接させることができる。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、開始コドンまたは終止コドンの、約１０以内、約２０以内、約３０以内、約４０以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内とすることができる。
本明細書に開示する方法及び組成物は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断することなく、またはヌクレアーゼ剤による内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の切断後に、外来性ドナー配列（例えば、ターゲティングベクターまたは修復テンプレート）を利用して内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を改変することができる。外来性ドナー配列とは、標的配列との部位特異的組換えを可能にするために必要なエレメントを含む任意の核酸またはベクターを指す。ヌクレアーゼ剤と組み合わせて外来性ドナー配列を使用することにより、相同組換え修復の促進による内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のより正確な改変がもたらされ得る。
そのような方法においては、ヌクレアーゼ剤が内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断して一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断を生じさせ、外来性ドナー配列が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介したライゲーション、または相同組換え修復事象によって内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子と組み換わる。外来性ドナー配列による修復は、ヌクレアーゼ切断部位を除去または破壊する場合があり、それにより、標的化された対立遺伝子はヌクレアーゼ剤によって再標的化され得ない。
外来性ドナー配列には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含ませることができ、それらは一本鎖または二本鎖とすることができ、それらは直鎖または環状形態とすることができる。例えば、外来性ドナー配列を、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）とすることができる。例示的な外来性ドナー配列は、長さが約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂ、長さが約５０ヌクレオチド〜約３ｋｂ、または長さが約５０〜約１，０００ヌクレオチドである。他の例示的な外来性ドナー配列は、長さが約４０〜約２００ヌクレオチドである。例えば、外来性ドナー配列を、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０、約１５０〜約１６０、約１６０〜約１７０、約１７０〜約１８０、約１８０〜約１９０、または約１９０〜約２００ヌクレオチド長とすることができる。あるいは、外来性ドナー配列を、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、約７００〜約８００、約８００〜約９００、または約９００〜約１，０００ヌクレオチド長とすることができる。あるいは、外来性ドナー配列を、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ〜約５ｋｂ長とすることができる。あるいは、外来性ドナー配列を、例えば、約５ｋｂ以下、約４．５ｋｂ以下、約４ｋｂ以下、約３．５ｋｂ以下、約３ｋｂ以下、約２．５ｋｂ以下、約２ｋｂ以下、約１．５ｋｂ以下、約１ｋｂ以下、約９００ヌクレオチド以下、約８００ヌクレオチド以下、約７００ヌクレオチド以下、約６００ヌクレオチド以下、約５００ヌクレオチド以下、約４００ヌクレオチド以下、約３００ヌクレオチド以下、約２００ヌクレオチド以下、約１００ヌクレオチド以下、または約５０ヌクレオチド以下の長さとすることができる。
いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列は、長さが約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド（例えば、長さが約１２０ヌクレオチド）のｓｓＯＤＮである。別の例では、外来性ドナー配列は、長さが約８０ヌクレオチド〜約３ｋｂのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮには、例えば、それぞれ約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの長さの相同性アームを含ませることができる。そのようなｓｓＯＤＮにはまた、例えば、それぞれ約３０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さの相同性アームを含ませることもできる。相同性アームは、対称的（例えば、それぞれ約４０ヌクレオチド長またはそれぞれ約６０ヌクレオチド長）または非対称的（例えば、長さが約３６ヌクレオチドの１つの相同性アーム、及び長さが約９１ヌクレオチドの１つの相同性アーム）とすることができる。
外来性ドナー配列には、追加の望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性；蛍光標識による追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する修飾または配列を含ませることができる。外来性ドナー配列は、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはそれらの組み合わせを含ませることができる。例えば、外来性ドナー配列には、１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質もしくは他のフルオロフォアまたは色素）、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識を含ませることができる。例示的な蛍光標識として、フルオレセイン（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するために、広範囲の蛍光色素が市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）を使用して、例えば、外来性ドナー配列の末端と適合する突出末端を有する切断された内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に直接組み込まれた外来性ドナー配列を検出することができる。標識またはタグは、５’末端、３’末端、または外来性ドナー配列の内部に配置することができる。例えば、外来性ドナー配列は、５’末端でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）と結合することができる。
外来性ドナー配列にはまた、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に組み込ませるＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含ませることができる。内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に核酸インサートを組み込むことにより、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子における目的の核酸配列の追加、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子における目的の核酸配列の欠失、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子における目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失及び挿入）をもたらすことができる。いくつかの外来性ドナー配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の対応する欠失を伴わずに内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に核酸インサートを挿入するように設計される。他の外来性ドナー配列は、対応する核酸インサートの挿入を伴わずに、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の目的の核酸配列を欠失させるように設計される。他の外来性ドナー配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の目的の核酸配列を欠失させ、それを核酸インサートで置換するように設計される。
核酸インサート、及び内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の欠失及び／または置換させる対応する核酸は、様々な長さであり得る。例示的な核酸インサート、または欠失及び／または置換させる内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の対応する核酸は、約１ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さまたは約１ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、核酸インサート、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の欠失及び／または置換させる対応する核酸は、約１〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０、約１５０〜約１６０、約１６０〜約１７０、約１７０〜約１８０、約１８０〜約１９０、または約１９０〜約２００ヌクレオチド長とすることができる。同様に、核酸インサート、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子中の欠失及び／または置換させる対応する核酸は、約１〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、約７００〜約８００、約８００〜約９００、または約９００〜約１，０００ヌクレオチド長とすることができる。同様に、核酸インサート、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の欠失及び／または置換させる対応する核酸は、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ〜約５ｋｂ長とすることができる。
核酸インサートには、ゲノムＤＮＡまたは任意の他のタイプのＤＮＡを含ませることができる。例えば、核酸インサートにｃＤＮＡを含ませることができる。
核酸インサートには、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の全部または一部（例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの特定のモチーフまたは領域をコードする遺伝子の部分）に相同な配列を含ませることができる。例えば、核酸インサートに、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子における置換のために標的化された配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の点変異または１つ以上のヌクレオチド挿入もしくは欠失を含む配列を含ませることができる。
核酸インサート、または内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の欠失及び／または置換させる対応する核酸は、エクソンなどのコード領域、イントロン、非翻訳領域、もしくは調節領域などの非コード領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写抑制因子結合エレメント）、またはその任意の組み合わせとすることができる。
核酸インサートにはまた、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含ませることもできる。あるいは、核酸インサートには、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含ませないこともできる。選択マーカーには、選択カセットを含ませることができる。いくつかの実施形態では、選択カセットを自己欠失性カセットとすることができる。一例として、自己欠失性カセットには、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結したＣｒｅ遺伝子（イントロンにより分断された、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含む）、及びヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結したネオマイシン耐性遺伝子を含ませることができる。例示的な選択マーカーとして、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、またはその組み合わせが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを、標的化されている細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例を、本明細書の他の場所に記載する。
核酸インサートにはまた、レポーター遺伝子を含ませることもできる。例示的なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。そのようなレポーター遺伝子を、標的化されている細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例を、本明細書の他の場所に記載する。
核酸インサートにはまた、１つ以上の発現カセットまたは欠失カセットを含ませることができる。特定のカセットには、発現に影響を及ぼす様々な調節成分とともに、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及びレポーター遺伝子の１つ以上を含ませることができる。含ませることができる選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の例を、本明細書の他の場所で詳細に論じる。
核酸インサートには、部位特異的組換え標的配列に隣接する核酸を含ませることができる。あるいは、核酸インサートには、１つ以上の部位特異的組換え標的配列を含ませることができる。そのような部位特異的組換え標的配列は核酸インサート全体に隣接させることができるが、核酸インサート内の目的の任意の領域または個々のポリヌクレオチドも、そのような部位に隣接させることができる。核酸インサートまたは核酸インサート内の目的のポリヌクレオチドに隣接させることができる部位特異的組換え標的配列として、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはその組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、部位特異的組換え部位を、核酸インサート内に含まれる選択マーカー及び／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接させる。内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子への核酸インサートの組み込みに続いて、部位特異的組換え部位間の配列を除去することができる。いくつかの実施形態では、それぞれが部位特異的組換え部位を含む核酸インサートを含む２つの外来性ドナー配列を使用することができる。外来性ドナー配列は、目的の核酸に隣接する５’及び３’領域を標的とすることができる。標的ゲノム遺伝子座への２つの核酸インサートの組み込みに続いて、挿入された２つの部位特異的組換え部位の間の目的の核酸を除去することができる。
核酸インサートにはまた、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）の１つ以上の制限酵素部位を含ませることができる。Ｉ型及びＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識配列を認識するが、通常、ヌクレアーゼ結合部位からの様々な位置で切断し、これは、切断部位（認識配列）から数百塩基対離れている場合がある。ＩＩ型系では、制限酵素活性はメチラーゼ活性とは無関係であり、通常、切断は結合部位内またはその近くの特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素はパリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は非パリンドローム認識配列を認識し、認識配列の外側を切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識配列の外側の両方の部位で二重に配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称の認識配列を認識し、認識配列から約１〜約２０ヌクレオチドの定義された距離で一方の側で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。
いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列は、５’末端及び／または３’末端に、標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内）におけるヌクレアーゼを介した、またはＣａｓタンパク質を介した切断により生じる１つ以上のオーバーハングに相補的な短い一本鎖領域を有する。これらのオーバーハングは、５’及び３’相同性アームとも呼ばれる。例えば、いくつかの外来性ドナー配列は、５’末端及び／または３’末端に、標的ゲノム遺伝子座の５’及び／または３’標的配列におけるＣａｓタンパク質を介した切断によって作成される１つ以上のオーバーハングに相補的な短い一本鎖領域を有する。いくつかの実施形態では、そのような外来性ドナー配列は、５’末端のみまたは３’末端のみに相補的領域を有する。例えば、そのような外来性ドナー配列のいくつかは、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列に作成されるオーバーハングに相補的な５’末端にのみ、または標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列に作成されるオーバーハングに相補的な３’末端にのみ相補的な領域を有する。他のそのような外来性ドナー配列は、５’及び３’末端の両方に相補的な領域を有する。例えば、他のそのような外来性ドナー配列は、５’及び３’末端の両方に、例えば、標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓを介した切断により生成される、それぞれ第１及び第２のオーバーハングに相補的な相補的領域を有する。例えば、外来性ドナー配列が二本鎖である場合、一本鎖相補領域は、ドナー配列の上側鎖の５’末端及びドナー配列の下側鎖の５’末端から延伸し、それぞれの末端に５’オーバーハングを形成することができる。あるいは、一本鎖相補領域は、ドナー配列の上側鎖の３’末端及び鋳型の下側鎖の３’末端から延伸し、３’オーバーハングを形成することができる。
相補的領域は、外来性ドナー配列と内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子とのライゲーションを促進するのに十分な任意の長さとすることができる。例示的な相補的領域は、長さが約１〜約５ヌクレオチド、長さが約１〜約２５ヌクレオチド、または長さが約５〜約１５０ヌクレオチドである。例えば、相補的領域は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、または少なくとも約２５ヌクレオチド長とすることができる。あるいは、相補的領域は、約５〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０ヌクレオチド長、またはそれ以上とすることができる。
そのような相補的領域は、ニッカーゼの２つのペアによって作成されるオーバーハングに相補的にすることができる。ＤＮＡの正反対の側の鎖を切断する第１及び第２のニッカーゼを使用して第１の二重鎖切断を作成し、ＤＮＡの正反対の側の鎖を切断する第３及び第４のニッカーゼを使用して第２の二重鎖切断を作成することにより、付着末端を有する２つの二重鎖切断を作成することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、及び第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、及び第４のガイドＲＮＡ認識配列にニックを導入することができる。ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第１及び第２のニッカーゼによって作成されるニックが二本鎖切断を作成するように第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列を配置して、第１の切断部位を作成することができる（すなわち、第１の切断部位には、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列内のニックが含まれる）。同様に、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第３及び第４のニッカーゼによって作成されるニックが二本鎖切断を作成するように第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列を配置して、第２の切断部位を作成することができる（すなわち、第２の切断部位には、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックが含まれる）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列及び／または第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックは、オーバーハングを作成するオフセットニックとすることができる。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、少なくとも約１０ｂｐ、少なくとも約２０ｂｐ、少なくとも約３０ｂｐ、少なくとも約４０ｂｐ、少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約６０ｂｐ、少なくとも約７０ｂｐ、少なくとも約８０ｂｐ、少なくとも約９０ｂｐ、もしくは少なくとも約１００ｂｐまたはそれ以上とすることができる。そのような実施形態では、二本鎖外来性ドナー配列を、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列内のニックによって、及び第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックによって作成されるオーバーハングに相補的な一本鎖相補領域を用いて設計することができる。次いで、そのような外来性ドナー配列を、非相同末端結合を介したライゲーションにより挿入することができる。
いくつかの実施形態では、外来性ドナー配列（すなわち、ターゲティングベクター）は相同性アームを含む。外来性ドナー配列が核酸インサートも含む場合、相同性アームを核酸インサートに隣接させることができる。参照を容易にするために、相同性アームを、本明細書では５’及び３’（すなわち、上流及び下流）相同性アームと呼ぶ。この用語は、外来性ドナー配列内の核酸インサートに対する相同性アームの相対的位置に関するものである。
相同性アームと標的配列は、その２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに対して共有している場合、互いに対応する。特定の標的配列と、外来性ドナー配列に見出される対応する相同性アームとの間の配列同一性は、相同組換えの発生を可能にする任意の程度の配列同一性とすることができる。例えば、外来性ドナー配列の相同性アーム（またはその断片）及び標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性とすることができ、その結果、配列は相同組換えを受ける。さらに、相同性アームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さとすることができる。例示的な相同性アームは、約２５ヌクレオチド〜約２．５ｋｂの長さ、約２５ヌクレオチド〜約１．５ｋｂの長さ、または約２５〜約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所定の相同性アーム（または各相同性アーム）及び／または対応する標的配列には、約２５〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約２５０、約２５０〜約３００、約３００〜約３５０、約３５０〜約４００、約４００〜約４５０、または約４５０〜約５００ヌクレオチド長の対応する相同性領域を含ませることができ、それにより、相同性アームは、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の対応する標的配列と相同組換えを行うのに十分な相同性を有する。あるいは、特定の相同性アーム（または各相同性アーム）及び／または対応する標的配列には、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、または約２ｋｂ〜約２．５ｋｂの長さの対応する相同性領域を含ませることができる。例えば、相同性アームを、それぞれ約７５０ヌクレオチド長とすることができる。相同性アームは、対称（長さがほぼ同じサイズ）とすることも、非対称（一方が他方より長い）とすることもできる。
相同性アームは、細胞に固有の遺伝子座（例えば、標的遺伝子座）に対応させることができる。あるいは、それらを、例えば導入遺伝子、発現カセット、またはＤＮＡの異種または外来性領域を含む、細胞のゲノムに組み込んだＤＮＡの異種または外来性セグメントの領域に対応させることができる。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターの相同性アームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、または適切な宿主細胞に含まれる他の改変した領域に対応させることができる。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、もしくはＰ１ファージライブラリーの領域に対応するか、もしくはそれに由来するものとすることができ、または合成ＤＮＡに由来するものとすることができる。
外来性ドナー配列と組み合わせてヌクレアーゼ剤を使用する場合、５’及び３’標的配列は一般的に、ヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して位置しており、それにより、ヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断時の標的配列と相同性アームとの間の相同組換え事象の発生を促進する。ヌクレアーゼ切断部位には、ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が生じるＤＮＡ配列が含まれる。外来性ドナー配列の５’及び３’相同性アームに対応する内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の標的配列は、距離が、ヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断または二本鎖切断時の５’及び３’標的配列と相同性アームとの間の相同組換え事象の発生を促進するようなものである場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。したがって、外来性ドナー配列の５’及び／または３’相同性アームに対応する標的配列は、例えば、所定のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１ヌクレオチド以内、または特定のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１０ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド以内とすることができる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を、標的配列の少なくとも一方または両方に直接隣接させることができる。
外来性ドナー配列の相同性アーム及びヌクレアーゼ切断部位に対応する標的配列の空間的関係は様々に異なり得る。いくつかの実施形態では、標的配列をヌクレアーゼ切断部位の５’に位置させることができるか、標的配列をヌクレアーゼ切断部位の３’に位置させることができるか、または標的配列をヌクレアーゼ切断部位に隣接させることができる。
本開示はまた、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の発現を改変または変化させるための本明細書に開示する方法を用いた、疾患を有するかまたは有するリスクのある対象における心血管病態の治療方法及び処置または予防方法を提供する。本開示はまた、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの発現を低下させる方法を使用するか、または対象にＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする組換え核酸を提供するか、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供するか、もしくはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドを提供する方法を使用して、疾患を有するかまたは有するリスクのある対象における心血管病態の治療方法及び処置または予防方法を提供する。本方法は、１つ以上の核酸分子またはタンパク質を対象内に、対象の器官内に、または対象の細胞内に（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで）導入することを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療に使用するためのＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（例えば、本明細書で論じるポリヌクレオチド、例えば配列番号４の配列を含むｍＲＮＡ）を提供する。いくつかのそのような実施形態では、療法は、心血管病態を治療するかまたは予防することである。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療に使用するためのＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチド（例えば、本明細書で論じるポリペプチド、例えば配列番号８の配列を含むポリペプチド）を提供する。いくつかのそのような実施形態では、療法は、心血管病態を治療するかまたは予防することである。
対象には、予防的または治療的処置を受けるヒト及び他の哺乳類対象（例えば、ネコ、イヌ、げっ歯類、マウス、またはラット）または非哺乳類対象（例えば、家禽類）が含まれる。そのような対象は、例えば、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象（例えば、ヒト）であり得る。
心血管病態の非限定的な例として、１つ以上の血清脂質のレベルの上昇が挙げられる。血清脂質には、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロール、またはその任意の亜分画（例えば、ＨＤＬ２、ＨＤＬ２ａ、ＨＤＬ２ｂ、ＨＤＬ２ｃ、ＨＤＬ３、ＨＤＬ３ａ、ＨＤＬ３ｂ、ＨＤＬ３ｃ、ＨＤＬ３ｄ、ＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３、リポタンパク質Ａ、Ｌｐａ１、Ｌｐａ１、Ｌｐａ３、Ｌｐａ４、またはＬｐａ５）の１つ以上が含まれる。心血管病態には、冠動脈石灰化レベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、ＩＩｄ型グリコシル化（ＣＤＧ−ＩＩｄ）が含まれ得る。心血管病態には、心膜脂肪のレベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、アテローム血栓性病態が含まれ得る。アテローム血栓性病態には、フィブリノーゲンレベルの上昇が含まれ得る。アテローム血栓性病態には、フィブリノーゲン媒介性血餅が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲンレベルの上昇が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲン媒介性血餅が含まれ得る。心血管病態には、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅が含まれ得る。フィブリノーゲン媒介性血餅またはフィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅は、体内のどの静脈または動脈にも存在し得る。
そのような方法は、ゲノム編集または遺伝子治療を含み得る。例えば、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ではない内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を改変して、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１に関連する変異（すなわち、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置でのアスパラギンからセリンへの置換）を含ませることができる。別の例として、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ではない内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子をノックアウトまたは不活性化することができる。同様に、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ではない内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子をノックアウトまたは不活性化することができ、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１に関連する改変を含むＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子（例えば、完全なバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１または改変を含むミニ遺伝子）を導入して発現させることができる。同様に、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ではない内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子をノックアウトまたは不活性化することができ、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを導入し、発現させることができ、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入し、発現させることができ（例えば、細胞内タンパク質置換療法）、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドを導入することができる（例えば、タンパク質置換療法）。
いくつかの実施形態では、方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ではない内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子をノックアウトまたは不活化することなく、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｒｓ５５１５６４６８３バリアント（例えば、完全なバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１または改変を含むミニ遺伝子）に関連する改変を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を導入し、発現させること、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入し、発現させること、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする１つ以上のｍＲＮＡを導入し、発現させること（例えば、細胞内タンパク質置換療法）、またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を導入すること（例えば、タンパク質置換療法）を含む。いくつかの実施形態では、そのような方法を、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡの使用などにより、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ではない内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡを発現低下させるための標的とする方法と組み合わせて実施することもできる。
Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子もしくはミニ遺伝子もしくはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその断片は、ゲノムを改変しない発現ベクターの形態で導入し、発現させることができ、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座にゲノム的に組み込むようにターゲティングベクターの形態で導入することができ、またはセーフハーバー遺伝子座などの内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子座以外の遺伝子座にゲノム的に組み込むように導入することができる。ゲノムに組み込むＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子は、Ｂ４ＧＡＬＴ１プロモーターまたは組み込み部位における内在性プロモーターなどの別のプロモーターに作動可能に連結することができる。セーフハーバー遺伝子座は、遺伝子構造または発現に悪影響を与えることなく、目的のすべての組織で導入遺伝子を安定かつ確実に発現させることができる染色体部位である。セーフハーバー遺伝子座は、例えば、次の特徴の１つ以上またはすべてを有し得る：１）任意の遺伝子の５’末端から約５０ｋｂを上回る距離、がん関連遺伝子から約３００ｋｂを超える距離、マイクロＲＮＡから約３００ｋｂを超える距離、遺伝子転写ユニットの外側、及び超保存領域の外側。適切なセーフハーバー遺伝子座の例として、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、及びマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオーソログが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象の治療方法を含み、方法は、対象内へ、または対象の細胞内へ：ａ）内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のヌクレアーゼ認識配列に結合するヌクレアーゼ剤（またはそれをコードする核酸）を導入することを含み、その場合、ヌクレアーゼ認識配列は、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位を含むかまたはそれに近接しており、ならびにｂ）配列番号１の５３５７５〜５３５７７位の５’の標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、ならびにセリンをコードする核酸配列を含み、５’相同性アーム及び３’相同性アームに隣接する核酸インサートを含む外来性ドナー配列を導入することを含む。ヌクレアーゼ剤は、対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断することができ、外来性ドナー配列は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子と組み換わることができ、外来性ドナー配列の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子との組換え時に、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドにおいて、セリンをコードする核酸配列が挿入される。そのような方法で使用することができるヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ）の例を、本明細書の他の場所に開示する。
いくつかの実施形態では、方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象の治療方法を含み、方法は、対象内へ、または対象の細胞内へ、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の５’の標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位の３’の標的配列にハイブリダイズする３’相同性アーム、ならびにセリンをコードするヌクレオチド配列を含み、５’相同性アーム及び３’相同性アームに隣接する核酸インサートを含む外来性ドナー配列を導入することを含む。外来性ドナー配列は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子と組み換わることができ、外来性ドナー配列の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子との組換え時に、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドにおいて、セリンをコードするヌクレオチド配列が挿入される。
いくつかのそのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象の治療方法を含み、方法は、対象内へ、または対象の細胞内へ：ａ）内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のヌクレアーゼ認識配列に結合するヌクレアーゼ剤（またはそれをコードする核酸）を導入することを含み、その場合、ヌクレアーゼ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンの、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、または約１，０００ヌクレオチド以内であるか、または配列番号９〜１２から選択される。ヌクレアーゼ剤は、対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断し、発現を破壊することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象の治療方法を含み、方法は、対象内へ、または対象の細胞内へ：ａ）内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のヌクレアーゼ認識配列に結合するヌクレアーゼ剤（またはそれをコードする核酸）を導入することを含み、その場合、ヌクレアーゼ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの、約１０以内、約２０以内、約３０以内、約４０以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内コドンであるか、または配列番号９〜１２から選択され、ｂ）完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置でセリンをコードするヌクレオチド配列を５３５７５〜５３５７７位に含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む発現ベクターを導入することを含む。発現ベクターは、ゲノムに組み込まれないベクターとすることができる。あるいは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置でセリンをコードするヌクレオチド配列を５３５７５〜５３５７７位に含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含むターゲティングベクター（すなわち、外来性ドナー配列）を導入することができる。ヌクレアーゼ剤は、対象の細胞内のＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子内を切断し、発現を破壊することができ、発現ベクターは、対象の細胞内で組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現することができる。あるいは、ゲノムに組み込んだ組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を、対象の細胞内で発現させることができる。そのような方法で使用することができるヌクレアーゼ剤（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ）の例を、本明細書の他の場所に開示する。適切なガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡ認識配列の例もまた、本明細書の他の場所に開示する。工程ｂ）は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含み、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む発現ベクターまたはターゲティングベクターを導入することを代替的に含み得る。同様に、工程ｂ）はまた、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補的ＤＮＡ（またはその部分）を有するＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２ＳｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することを含み得る。同様に、工程ｂ）はまた、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を導入することを含み得る。
いくつかの実施形態では、さらに第２のヌクレアーゼ剤を対象へ、または対象の細胞内へ導入し、第２のヌクレアーゼ剤は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第２のヌクレアーゼ認識配列に結合し、第２のヌクレアーゼ認識配列は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の終止コドンを含むか、または終止コドンの、約１０以内、約２０以内、約３０以内、約４０以内、約５０以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、または約１，０００ヌクレオチド以内であるか、または配列番号９〜１２から選択され、その場合、ヌクレアーゼ剤は、細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を、第１のヌクレアーゼ認識配列及び第２のヌクレアーゼ認識配列の両方において切断し、第１のヌクレアーゼ認識配列と第２のヌクレアーゼ認識配列との間に欠失を含むように細胞が改変される。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼ剤を、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡとすることができる。終止コドンに近接した適切なガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡ認識配列を、本明細書の他の場所に開示する。
いくつかの実施形態では、方法はまた、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象の治療方法を含むことができ、方法は、対象内へ、または対象の細胞内へ：内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ内の領域内の配列にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを導入することを含む。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号３（Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ）のエクソン５の領域内の配列にハイブリダイズし、対象の細胞内でのＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる。いくつかの実施形態では、そのような方法は、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に挿入されたセリンをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む発現ベクターを対象に導入することをさらに含み得る。発現ベクターは、ゲノムに組み込まれないベクターとすることができる。あるいは、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置にセリンをコードする核酸配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含むターゲティングベクター（すなわち、外来性ドナー配列）を導入することができる。発現ベクターを使用する方法では、発現ベクターは、対象の細胞内で組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現することができる。あるいは、組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子をゲノムに組み込む方法では、組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を対象の細胞内で発現させることができる。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸（例えばＤＮＡ）を含み、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む発現ベクターまたはターゲティングベクターを導入することを代替的に含み得る。同様に、そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補的ＤＮＡ（またはその部分）を有する、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することを代替的に含み得る。同様に、そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むポリペプチドを導入することを代替的に含み得る。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１の保因者ではなく（またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のヘテロ接合保因者に過ぎず）、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象の治療方法を含むことができ、方法は、対象内へ、または対象の細胞内へ発現ベクターを導入することを含み、その場合、発現ベクターは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を５３５７５〜５３５７７位に含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含み、発現ベクターは、対象の細胞内で組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現する。発現ベクターは、ゲノムに組み込まれないベクターとすることができる。あるいは、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含むターゲティングベクター（すなわち、外来性ドナー配列）を導入することができる。発現ベクターを使用する方法では、発現ベクターは、対象の細胞内で組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現することができる。あるいは、組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子をゲノムに組み込む方法では、組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を対象の細胞内で発現させることができる。
そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む発現ベクターまたはターゲティングベクターを導入することを代替的に含み得る。同様に、そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、及び／またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補的ＤＮＡ（またはその部分）を有する、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することを代替的に含み得る。同様に、そのような方法は、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むタンパク質を導入することを代替的に含み得る。
上記の方法のいずれかで使用するのに適した発現ベクター及び組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を、本明細書の他の場所に開示する。例えば、組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子は、完全なＢ４ＧＡＬＴ１バリアント遺伝子であり得るか、または対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対して遺伝子の１つ以上の非必須セグメントを欠失させたＢ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子であり得る。例として、欠失させるセグメントには１つ以上のイントロン配列を含ませることができ、ミニ遺伝子にはエクソン１〜６を含ませることができる。完全なＢ４ＧＡＬＴ１バリアント遺伝子の例は、配列番号２と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である遺伝子である。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、心血管病態を発症しているか、または心血管病態を発症しやすい対象の細胞の改変方法を含む。そのような方法では、ヌクレアーゼ剤及び／または外来性ドナー配列及び／または組換え発現ベクターを、発症を遅らせ、重症度を軽減し、さらなる悪化を抑制し、及び／または治療中の心血管病態の少なくとも１つの徴候または症状を改善する用量、投与経路及び投与頻度を意味する有効なレジームでの投与を介して、細胞内に導入することができる。用語「症状」とは、対象によって知覚される疾患の主観的エビデンスを指し、「徴候」とは、医師によって観察される疾患の客観的エビデンスを指す。対象が既に疾患に罹患している場合、そのレジームは治療有効レジームと呼ばれ得る。対象が、一般的な集団に比べて疾患のリスクが高いが、まだ症状を経験していない場合、レジームは予防有効レジームと呼ばれ得る。いくつかの例では、同じ対象の過去の対照または過去の経験と比較して、個々の患者における治療または予防の有効性を観察することができる。他の例では、治療または予防の有効性を、未治療の対象の対照集団に対する、治療対象の集団における前臨床試験または臨床試験において示すことができる。
送達は、本明細書の他の箇所で開示するように、任意の適切な方法とすることができる。例えば、ヌクレアーゼ剤または外来性ドナー配列または組換え発現ベクターは、例えば、ベクター送達、ウイルス送達、粒子を介した送達、ナノ粒子を介した送達、リポソームを介した送達、エキソソームを介した送達、脂質を介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過性ペプチドを介した送達、または埋め込み可能装置を介した送達により送達することができる。特定の例には、流体力学的送達、ウイルスを介した送達、及び脂質ナノ粒子を介した送達が含まれる。
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によるものとすることができる。例えば、タンパク質補充療法によく使用される特定の例は、静脈内注入である。投与頻度及び投与回数は、数ある要因の中でも、ヌクレアーゼ剤または外来性ドナー配列または組換え発現ベクターの半減期、対象の病態、及び投与経路に依存し得る。投与用の医薬組成物は、望ましくは無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位投与形態（すなわち、単回投与の用量）で提供することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択した投与経路に依存する。用語「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
他のそのような方法は、心血管病態を発症しているかまたは発症しやすい対象由来の細胞におけるｅｘ ｖｉｖｏ法を含む。標的化された遺伝子改変を施した細胞を、その後、対象に移植して戻すことができる。
本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより、内在性の野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１の発現を低下させるか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの発現を増加させることにより、ＬＤＬの低下を必要とする対象のＬＤＬを低下させる方法を提供する。本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより、内在性の野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１の発現を低下させるか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの発現を増加させることにより、総コレステロールの低下を必要とする対象の総コレステロールを低下させる方法を提供する。本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより、内在性の野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１の発現を低下させるか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの発現を増加させることにより、フィブリノーゲンの低下を必要とする対象のフィブリノーゲンを低下させる方法を提供する。本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより、内在性の野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１の発現を低下させるか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの発現を増加させることにより、対象のｅＧＦＲを低下させる方法を提供する。本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより、内在性の野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１の発現を低下させるか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの発現を増加させることにより、ＡＳＴの増加を必要とする対象のＡＳＴを増加させるがＡＬＴは増加させない方法を提供する。本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより、内在性の野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１の発現を低下させるか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの発現を増加させることにより、クレアチニンの増加を必要とする対象のクレアチニンを増加させる方法を提供する。
本開示はまた、心血管病態の発症リスクの診断、または心血管病態の発症リスクの診断及び治療を必要とする対象における心血管病態の発症リスクの診断方法、または心血管病態の発症リスクの診断方法及び治療方法を提供し、方法は：本明細書に記載のバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはポリペプチドの存在または非存在に関する対象由来試料の分析結果を提供する試験を要求し、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはポリペプチドを有さない対象において、本明細書に記載するような治療薬を対象に投与することを含む。バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはポリペプチドの存在または非存在を判定する本明細書に記載の試験のいずれかを使用することができる。
本開示はまた、ＬＤＬの低下、総コレステロールの低下、フィブリノーゲンの低下、ｅＧＦＲの低下、ＡＳＴの増加、及びクレアチニンの増加を必要とする対象において、ＬＤＬを低下させ、総コレステロールを低下させ、フィブリノーゲンを低下させ、ｅＧＦＲを低下させ、ＡＳＴを増加させ（ただしＡＬＴは増加させない）、及びクレアチニンを増加させるための医薬品の製造における、本明細書に開示するバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。本開示はまた、冠動脈疾患、冠動脈石灰化、及び関連障害を治療するための医薬品の製造における、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
本開示はまた、ＬＤＬの低下、総コレステロールの低下、フィブリノーゲンの低下、ｅＧＦＲの低下、ＡＳＴの増加、及びクレアチニンの増加を必要とする対象において、ＬＤＬを低下させ、総コレステロールを低下させ、フィブリノーゲンを低下させ、ｅＧＦＲを低下させ、ＡＳＴを増加させ（ただしＡＬＴは増加させない）、及びクレアチニンを増加させるための、本明細書に開示するバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
本開示はまた、冠動脈疾患、冠動脈石灰化、ＩＩｄ型グリコシル化（ＣＤＧ−ＩＩｄ）、及び関連障害を治療するための、バリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の改変を必要とする対象の細胞においてＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を改変するための、本明細書に開示するバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
本開示はまた、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の発現の変化を必要とする対象の細胞においてＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子の発現を変化させるための、本明細書に開示するバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
本開示はまた、本明細書に開示する心血管病態のいずれかの発症リスクを診断するための、本明細書に開示するバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
本開示はまた、本明細書に開示する心血管病態のいずれかを発症している対象を診断するための、本明細書に開示するバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
上記または下記で引用するすべての特許文書、ウェブサイト、他の刊行物、登録番号などは、あたかも個々の項目をそのように参照により援用することを具体的かつ個別に示すことと同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体を参照により援用するものとする。異なるバージョンの配列が異なる時点で登録番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日における登録番号に関連付けられているバージョンを意図するものとする。有効出願日とは、実際の出願日または優先出願の出願日のうち早い方を意味し、該当する場合は登録番号が参照される。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが異なる時間に公開される場合、特に明記しない限り、出願の有効出願日において最後に公開されたバージョンを意味するものとする。本開示の任意の特徴、工程、要素、実施形態、または態様は、特に明記しない限り、他の特徴、工程、要素、実施形態、または態様と組み合わせて使用することができる。本開示を、明確化及び理解を目的として、例示及び例としてある程度詳細に説明してきたが、特定の変更及び改変を添付の特許請求の範囲内で実施し得ることは明らかであろう。
本明細書に挙げるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、及びアミノ酸の１文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で始まり、３’末端へ向かって前方に進む（すなわち、各行の左から右へ）という標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみを示すが、表示する鎖の参照によって相補鎖が含まれるものと理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、カルボキシ末端へ向かって前方に進む（すなわち、各行の左から右へ）という標準的な慣習に従う。
２０１８年４月１８日に出願された米国出願第６２／６５９，３４４号、２０１７年８月２５日に出願された米国出願第６２／５５０，１６１号、及び２０１７年６月５日に出願された米国出願第６２／５１５，１４０号は、各々、その全体を参照により本明細書に援用する。
以下の実施例は、実施形態をより詳細に説明するために提供する。それらは、特許請求する実施形態を例示することを意図しており、限定することを意図していない。
実施例１：ゲノムワイドの統計的有意性での血清脂質形質に関連する染色体９ｐ．２１上の新規遺伝子座の決定
材料及び方法：
チップ・ジェノタイピング及びＱＣ：ＯＯＡの個体の全血からゲノムＤＮＡを抽出し、ｐｉｃｏｇｒｅｅｎを使用して定量した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ５００Ｋ及び６．０チップを使用してゲノムワイド・ジェノタイピングを実施した。遺伝子型判定にＢＲＬＭＭアルゴリズムを使用した。判定率＜０．９３、高レベルのメンデルの法則のエラー、または性別の不一致のサンプルは除外した。判定率＜０．９５、ＨＷＥｐｖａｌ＜１．０Ｅ−６、またはＭＡＦ＜０．０１のＳＮＰは除外した。Ｘ染色体及びＹ染色体、ならびにミトコンドリアゲノム上のＳＮＰも除外した。
ＷＧＳ及びＱＣ：ライブラリー調製及び全ゲノム配列決定を、ＭＩＴ及びハーバードのブロード研究所によって実施した。ミシガン大学のＮＨＬＢＩ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｒｅは、すべてのＴＯＰＭｅｄサンプルのアライメント、塩基判定、及び配列品質スコアリングを実行し、分析に使用した少なくとも１０の読み取り深度を有するすべての品質フィルターを通過するすべてのバリアントのｂｃｆファイルを配信した。ＬＣＲまたはＸ染色体のすべての部位を除去することを含めて、このファイルにさらなるＱＣを適用した。＞５％の欠損率、ＨＷＥ ｐ値＜１．０Ｅ−０９、及びＭＡＦ＜０．１％のバリアントも削除した。サンプルのＱＣを実行して、＞５％の欠損率、高レベルのメンデルの法則のエラー（いくつかの場合では）、または同一の（ＭＺ）双生児（各ペアの１つ）のサンプルを削除した。
ＷＥＳ及びＱＣ：エクソームの捕捉及び配列決定を、以下により詳細に記載するように、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＧＣ）において実施した。簡潔に述べると、捕捉したライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００プラットフォーム上で、ｖ４ケミストリーで７５ｂｐのペアエンドリードを使用して配列決定した。捕捉した塩基のペアエンド配列決定を、塩基の＞８５％が２０倍以上でカバーされるように実施したが、これは、ほとんどの標的化された塩基でヘテロ接合バリアントを判定するのに十分である。ＲＧＣ ＤＮＡｓｅｑ分析パイプラインで実装されているＢＷＡ−ＭＥＭ及びＧＡＴＫを使用して、リードアライメント及びバリアント判定を実施した。判定率＜０．９０、高レベルのメンデルの法則のエラー、同一の（ＭＺ）双生児（各ペアの１つ）、または性別の不一致のサンプルは除外した。判定率＜０．９０のＳＮＰ、及び単形性のＳＮＰも除外した。染色体Ｘ及びＹ、及びミトコンドリアゲノムのＳＮＰも除外した。
相関解析：空腹時血液試料を採取し、脂質分析に用いた。フリーデヴァルト式を用いてＬＤＬを計算し、脂質低下薬の対象を対象としたいくつかの分析では、ＬＤＬレベルを０．７で除算して調整した。血統に基づく血縁関係マトリックス及び／またはＷＥＳから血縁関係を推定する家族性補正を用いた家族相関を説明するために線形混合モデルを使用して遺伝的相関解析を実施した。分析はまた、年齢、年齢の二乗、性別、コホート、及びＡＰＯＢ Ｒ３５２７Ｑ遺伝子型について調整した。ＡＰＯＢ Ｒ３５２７Ｑはアーミッシュにおいて濃縮されており、ＬＤＬレベルに強い影響を与える（５８ｍｇ／ｄｌ）ことが以前に特定されており（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２０１０，１７０，１８５０−１８５５）、したがってＬＤＬ分析におけるこのバリアントの影響を考慮した。ゲノムワイドの補正されたｐ値５．０Ｅ−０８を有意性の閾値として使用した。
ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）を用いた染色体９ｐ領域とＬＤＬとの相関性の特定：
心血管リスク因子に関連する新規遺伝子の原因バリアントを同定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ５００Ｋ及び６．０チップを用いて遺伝子型決定した１８５２名のオールド・オーダー・アーミッシュの対象を使用して、ゲノムワイド相関解析を実施した。これらの参加者の基本的な特徴を表１に示す。
図１に示すように、ＬＤＬと染色体９ｐ上の遺伝子座との間の強力な新規相関性シグナルが発見された。リード関連ＳＮＰはｒｓ８５５４５３（ｐ＝２．２Ｅ−０８）であり、出現頻度はアーミッシュで１５％、一般集団で２５％であった。マイナーな「Ｔ」対立遺伝子は、１０ｍｇ／ｄｌ低いＬＤＬレベルと関連していた。したがって、このＧＷＡＳ ＳＮＰはアーミッシュと非アーミッシュの両方で一般的であり、効果のサイズは大きいが、大規模なＧＷＡＳメタ分析のいずれにおいても同定されなかった。これらの特徴は、以前の研究（ＡＰＯＣ３及びＬＩＰＥ）の特徴と一致しており、これに基づき、このＧＷＡＳ ＳＮＰはこの領域における原因／機能的バリアントではなく、一般的な集団ではまれであるがアーミッシュ集団では一般的である、別のバリアントとの連鎖不平衡（ＬＤ）であると結論付けられた。さらに、複数の系統の５つの独立した交配に基づく複数の研究により、ラット第５染色体上に位置するラットゲノムのシンテニー領域が、血清コレステロール及びトリグリセリドレベルのＱＴＬを保有していることが見出された（Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲＧＤ）．Ｓｃｌ１２．２６．３５．４４，５４及びＳｔｌ２８）。
全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を用いた確認：
次いで、基本的な特徴を表１に示す４，５６５名のアーミッシュ個体の高品質ＱＣのＷＥＳを使用した。ＬＤＬの混合モデル全エクソーム分析の結果、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｒｓ５５１５６４６８３ミスセンスバリアントが３．３Ｅ−１８のｐ値と１４．７ｍｇ／ｄｌ低いＬＤＬの効果量との最も重要な相関性として同定された。ｒｓ５５１５６４６８３バリアントのアーミッシュのＭＡＦは６％であったが、一般集団では極めてまれであった。バリアントは、出現頻度または集団に関する情報のないｄｂＳＮＰにあり、ＥｘＡＣデータベース（６０，０００サンプル）には存在せず、ＮＨＬＢＩ Ｔｒａｎｓ−Ｏｍｉｃｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＯＰＭｅｄ）データセットの１５，３８７名の非アーミッシュ由来のＷＧＳにおいて１コピーのみしか見出されなかった。さらに、研究者が利用できる他の集団コホートの集合データセット（合計１２５，４０１名）では、このバリアントのヘテロ接合体は７９体、ホモ接合体は５体しか見出されなかった（アーミッシュ集団において１，０００倍超の濃縮を示す）。このミスセンスバリアントは、ＧＷＡＳバリアントから５００Ｋｂ離れており、ＬＤのｒ２推定値は０．５である。ｒｓ５５１５６４６８３と完全に相関するバリアントは存在せず、実際、次に重要なＳＮＰは、ｐ値がＥ−１４のｒｓ１４９５５７４９６である。したがって、ｒｓ５５１５６４６８３の相関性の強さから、第９染色体ＧＷＡＳ遺伝子座が本物であることだけでなく、ｒｓ５５１５６４６８３が原因バリアントに期待されるすべての特徴を備えていることが確認される。
全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を使用した染色体９ｐ領域の微細マッピング：
より小さいサンプルで利用可能なＷＧＳを使用して、エクソーム配列決定のギャップを埋め、ｒｓ５５１５６４６８３が原因であるというさらなるエビデンスを提供した。１０８３個のＯＯＡのＷＧＳデータを、ＴＯＰＭｅｄプログラムの一部として生成した。ＷＧＳサンプルの基本的な特徴を表１に示す。ＷＧＳは、目的の領域の上位のバリアントと相関する可能性のあるコーディング及び非コーディングの両方のすべてのＳＮＰ及びインデル（挿入／削除）を捕捉する。上位のバリアントの出現頻度は約６％であるため、配列読み取りが不十分でバリアントの判定元がバリアントの見逃しを引き起こすことはほとんどないであろう。しかしながら、ＱＣ手順中に除外されるバリアントが存在し得る。ＱＣに合格しなかったバリアントを調査することにより、２つの追加のバリアントを分析に追加した。相関解析により、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のミスセンスＳＮＰ（Ｎ３５２Ｓ）ｒｓ５５１５６４６８３が、この領域においてＬＤＬと最も有意に相関するバリアントとして同定され、ｐ値は２．９Ｅ−０６、効果量は−１６．４ｍｇ／ｄｌであった（表２参照）。
ＴＯＰＭｅｄ ＷＧＳデータセットは、２．９Ｅ−０６〜２．５Ｅ−０５のｐ値を有するＬＤＬに相関する２０個のバリアントを提供し、上位ヒットｒｓ５５１５６４６８３（ｒ２＝０．８３〜０．９４）と完全にではないが高度に相関している（図２の赤色参照）。ｒｓ５５１５６４６８３を調整する条件分析は、２０のバリアントの相関シグナルを完全に消失させ、この領域の他のシグナルを明らかにせず、単一の原因バリアントを強く示唆した。
これらの２０個のバリアント（図２の赤色参照）を注意深く調査することにより、バリアントを２つの群：影付きの三角形内の７個の赤色のバリアント及び１３個の影付きではない赤色のバリアントに分割した。影付きの三角形内の７個の赤色のバリアントは、互いにほぼ完全に相関しており、ｒ２は０．８３であり、上位ヒットはｒｓ５５１５６４６８３であった。これらの７個のバリアントは、３つの理由に基づいて原因／機能バリアントとしては安全に除外された：１）それらはＯＯＡ以外では比較的一般的であり（ｍａｆ＞１％）、２）ＴＯＰＭｅｄ内のフレーミンハム心疾患研究（ＦＨＳ）由来の３８７７サンプルにおいて、それらはＬＤＬとの相関を示さず、そして３）これら７個のバリアントの１つは、４，５６５名のＯＯＡ対象のＷＥＳデータにおける上位ヒットｒｓ５５１５６４６８３での３．３Ｅ−１８に対して、６．３Ｅ−１４のＬＤＬ相関性のｐ値を有していた。
図２の影付き長方形内の別のバリアント群も、相関性のｐ値は約１０Ｅ−６に過ぎず、互いに完全に相関しており、ｒ２は０．６８であり、上位ヒットはｒｓ５５１５６４６８３であった。この群もまた、ＯＯＡ以外では一般的であり（ｍａｆは約４％）、また、ＴＯＰＭｅｄ内のＦＨＳ由来の３８７７サンプルにおいてＬＤＬとの相関性を示さなかったため、原因／機能バリアントとしては除外された。
第９染色体の３１．５Ｍｂ〜３５．５Ｍｂの短いアーム上で４Ｍｂにわたって延在する図２の上位ヒットｒｓ５５１５６４６８３及び１３個の影付きではない赤色のバリアントが残った。上記のように、これらの１３個のバリアントは互いにほぼ完全に相関しており、ｒ２は０．９１〜０．９４であり、上位ヒットはｒｓ５５１５６４６８３であった。これらのバリアントの中で、上位ヒットのｒｓ５５１５６４６８３が唯一のコーディングバリアントであり、タンパク質機能に対するバリアントの影響を予測する９つのアルゴリズムのうち５つにより、損傷性または有害性として分類された。上位ヒットのｒｓ５５１５６４６８３及びこれらの１３個のバリアントは、ＯＯＡにおいて６％のｍａｆを有していたが、一般集団ではほとんど存在していなかった。
ハプロタイプ分析：
別個の遺伝子座間の不完全なｒ２は、組換え事象の結果である。主要な１４−ＳＮＰハプロタイプの詳細な分析を行った。図３は、この４Ｍｂ領域の３つの主要なハプロタイプを示す。１４個のＳＮＰで同一の遺伝子型を有していたハプロタイプＡの１１５の対象（１つのホモ接合体、及び１１４のヘテロ接合体）が存在し、どのＳＮＰが原因であるかについての情報は提供されなかった。６つの対象は、ｒｓ５５１５６４６８３と４つの上流のＳＮＰでヘテロ接合遺伝子型を含むハプロタイプＢを有し、７つの対象は、ｒｓ５５１５６４６８３と９つの下流のＳＮＰでヘテロ接合遺伝子型を含むハプロタイプＣを有していた。組換えハプロタイプＢ及びＣは、関連する対象にクラスター化され、遺伝子型判定エラーの人為的結果ではないというエビデンスを提供した。表３は、ハプロタイプＢ及びＣの個体を単一の群に追加した後のｒｓ５５１５６４６８３のｐ値を、ハプロタイプＡの個体と比較して示す。
ハプロタイプＢ及びＣを個々に追加すると、ｐ値が向上し、両方を追加するとｐ値がさらに向上した。ｐ値の向上は、ハプロタイプＢとＣの両方が原因対立遺伝子を保有していることを示した。ＢとＣに共通する唯一のＳＮＰがｒｓ５５１５６４６８３であり、これが原因バリアントであると考えた。
グリコシル化のＢ４ＧＡＬＴ１先天性障害は、ｒｓ５５１５６４６８３の機能的役割をサポートする：
フェノムワイド相関解析（ＰｈｅＷＡＳ）を実施して、ｒｓ５５１５６４６８３とアーミッシュデータベースのすべての形質との相関性を試験した。ＬＤＬ（ｐ＝３．３Ｅ−１８）及び総コレステロール（ｐ＝３．０Ｅ−１８）の後の最も強い相関性は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）（ｐ＝３．０Ｅ−８）で見出され、その場合、マイナー対立遺伝子のホモ接合体は、野生型のホモ接合体に対してＡＳＴレベルが２倍増加していた。高いＡＳＴは、Ｂ４ＧＡＬＴ１においてフレームシフト挿入によって短縮型の機能不全のタンパク質が生じたことにより引き起こされる先天性グリコシル化障害（ＣＧＤ）の症例で以前に報告された。さらに、フィブリノーゲンレベルとの強い相関性が観察され（ｐ＝５．０Ｅ−４）、マイナーホモ接合体レベルは野生型よりも約２０％低く、同じＣＤＧ患者の血液凝固不全と一致していた。さらに、小規模な実験では、１３のマイナー対立遺伝子のホモ接合体において、１３の野生型ホモ接合体に比べて、クレアチンキナーゼ血清レベルの５０％の増加（ｐ＝０．０２）が認められた。Ｂ４ＧＡＬＴ１におけるミスセンスＳＮＰに関連し、トランケート挿入に起因する表現型のこの一貫性は、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｒｓ５５１５６４６８３ ＳＮＰがこの領域の原因／機能遺伝子及びバリアントであるというエビデンスをさらに増強する。
脂質亜分画とｒｓ５５１５６４６８３との相関性を、７５９名のアーミッシュ個体のサブセットで試験し、表４に示すように、有意または有意でないｐ値を有するほぼすべての亜分画の低いレベルとの相関性が見出された。
冠動脈石灰化スコア、大動脈石灰化スコア、及び心膜脂肪は、低いレベルと相関する傾向を示したが、有意なｐ値ではなかった。
ＰｈｅＷＡＳはまた、ｒｓ５５１５６４６８３が、高いクレアチニン及び低いｅＧＦＲ、ならびに高いヘマトクリット及び低い好塩基球と相関することを見出した。
実施例２：試料調製及び配列決定
アーミッシュの対象からゲノムＤＮＡの試料濃縮物を取得し、その後、社内施設に移し、配列分析まで−８０℃（ＬｉＣＯＮｉＣ ＴｕｂｅＳｔｏｒｅ）で保管した。蛍光（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって試料の量を測定し、１００ｎｇの試料を２％プレキャストアガロースゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で電気泳動することによって品質を評価した。
ＤＮＡ試料を正規化し、それぞれの試料を、集束音響エネルギー（Ｃｏｖａｒｉｓ ＬＥ２２０）を使用して１５０塩基対の平均断片長にせん断した。せん断したゲノムＤＮＡを、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのカスタム試薬キットを用い、社内開発した完全自動化アプローチを使用して、エクソーム捕捉用に調製した。ライブラリーの調製中に、固有の６塩基対のバーコードを各ＤＮＡ断片に追加し、多重化エクソーム捕捉及び配列決定を容易にできるようにした。いくつかの修正を加えた、ＩＤＴから入手可能なｘＧｅｎ ｄｅｓｉｇｎ上でのエクソーム捕捉の前に等量の試料をプールした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｖ４ ＨｉＳｅｑ２５００上で７５ｂｐのペアエンド配列決定法を使用して、多重化試料を配列決定した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２５００プラットフォーム上で生成した生配列データを、ＤＮＡｎｅｘｕｓ（ＤＮＡｎｅｘｕｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の高性能コンピューティングリソースにアップロードし、自動化ワークフローによって生の．ｂｃｌファイルから注釈付きバリアント判定結果へと処理した。試料特異的バーコードに基づいた分析のために、生の読み取り結果を、ＣＡＳＡＶＡソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して適切な試料に割り当てた。
次いで、試料特異的読み取り結果を、ＢＷＡ−ｍｅｍ（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５，１７５４−１７６０）を使用して参照配列にアライメントした。これにより、特定の試料の読み取り結果すべてと、各読み取り結果をマッピングしたゲノム座標を含む各試料のバイナリアライメントファイル（ＢＡＭ）を生成した。アライメント完了後、試料の読み取り結果を評価し、Ｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓツール（ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用して重複した読み取り結果を識別してフラグを立て、重複した各読み取り結果がマークされたアライメントファイル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓＭａｒｋｅｄ．ＢＡＭ）を作成した。
次いで、ゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫ）（Ｖａｎ ｄｅｒ Ａｕｗｅｒａ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１３，１１，１１−３３、ＭｃＫｅｎｎａ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０１０，２０，１２９７−１３０３）を使用して、アライメントして重複をマークした各試料の読み取り結果のローカルリアライメントを実施した。次いで、ＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用して、リアライメントして重複をマークした読み取り結果を処理し、単一ヌクレオチド変異及びＩＮＤＥＬを含めて、試料がゲノム参照と異なっているすべてのエクソン位置、ならびに特定の試料が参照と異なっている任意の位置での試料中のバリアントの接合性を同定した。
参照及び代替対立遺伝子の両方に割り当てられた読み取りカウント、遺伝子型判定の信頼性を表す遺伝子型品質、及びその位置でのバリアント判定の全体的な品質を含む、関連する測定基準を、すべてのバリアント部位で出力した。次いで、ＧＡＴＫのＶａｒｉａｎｔ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ Ｒｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ（ＶＱＳＲ）を使用して、トレーニングデータセットを用いて試料のバリアントの全体的な品質スコアを評価し、このスコアを評価し、再計算して特異性を高めた。各試料のメトリック統計を捕捉して、捕捉性能、アライメント性能、及びバリアント判定を評価した。コホートの配列決定の完了後、ＧＡＴＫを使用したジョイントジェノタイピングによりプロジェクトレベルのＶＣＦを生成し、コホート内の試料が参照ゲノムのバリアントを保持している部位におけるすべての試料の遺伝子型及び関連するメトリック情報を生成した。下流の統計解析に使用したのは、このプロジェクトレベルのＶＣＦであった。ＶＱＳＲに加えて、ＧＡＴＫを使用したＱｕａｌｉｔｙ Ｂｙ Ｄｅｐｔｈ（ＱＤ）メトリックを用いてバリアントに注釈を加え、ＱＤ＞２．０、欠損率＜１％、及びＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡ｐ値＞１．０×１０−６を有する両対立遺伝子のバリアントを、さらなる分析のために保持した。
下流の配列データ解析の前に、遺伝的に判定した性別と報告された性別が不一致の試料、高いヘテロ接合率、低い配列カバレッジ（標的化された塩基の７５％未満の２０×カバレッジとして定義される）、またはあいまいな相関性の程度が異常に高い試料、及び遺伝的に同定された試料の重複は除外した。
ＡＮＮＯＶＡＲ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１０，３８，ｅ１６４）及び注釈及び解析のための他のカスタマイズされたアルゴリズムを使用する注釈パイプラインを使用して配列バリアントに注釈を加えた。バリアントを、それらの潜在的な機能的効果に従って分類し、その後、一般的に利用可能な集団対照データベース、及び一般的な多型と高頻度の、おそらく良性のバリアントを除外するためのデータベースにおいて観察された頻度でフィルタリングした。複数種のアライメントに基づく保存スコアとともに、バリアントの機能的効果の生物情報学的予測のためのアルゴリズムを、バリアントの注釈プロセスの一部として組み込み、同定された候補バリアントの潜在的な有害性について通知するために使用した。
実施例３：Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｒｓ５５１５６４６８３ Ｎ３５２Ｓ出現頻度はアーミッシュで濃縮されている
約４７００名のアーミッシュの対象におけるエクソーム配列決定及び相関性解析により、第９染色体上のｒｓ５５１５６４６８３は総コレステロール値と高い相関性があることが見出された（ｐ＝１．３Ｅ−１０）（図４参照）。ＲＳ５５１５６４６８３は、Ｂ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位でセリンがアスパラギンに変化するミスセンスバリアントをコードしている。この領域における次の最も高いＬＤＬ関連バリアントはｒｓ１４９５５７４９６であり、ｐ値はわずか１０−５であったが、このことはＮ３５２Ｓバリアントが最も可能性の高い原因バリアントであることを示唆している。特に図４を参照すると、エクソーム配列データにおいて、Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ Ｂ４ＧＡＬＴ１とともに最も高いＬＤのバリアントは、ＨＲＣＴ１のｒｓ１４９５５７４９６であり、２．８Ｍｂの距離、Ｒ２は０．７８、アーミッシュにおけるＬＤＬのＰ値が１０−５であった。アーミッシュの全ゲノム配列データ（ＴＯＰＭＥＤ）からは、この領域においてＬＤＬ−Ｃとより相関性の高いバリアントを同定することができなかった。
さらなる解析により、Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓバリアントの出現頻度はアーミッシュ集団において１０００倍超濃い頻度であることが明らかになった（図５参照）。データからは、４７２５のアーミッシュのコホートにおいて、ｒｓ５５１５６４６８３を含む対立遺伝子の５４８のヘテロ接合体保因者が同定され、１３の保因者が対立遺伝子に関してホモ接合体であることが示された（図５参照）。これに対して、研究者が利用できる他の集団コホートの合計１２５，４０１名の集合データセットを解析し、この集合データセットでは７９のヘテロ接合体と５つのホモ接合体のみが同定された。アーミッシュコホートの対立遺伝子の出現頻度は、集合データセットの約０．００２５に対して、約０．０６と推定された（図５参照）。アーミッシュにおけるこの対立遺伝子のより高い出現頻度は、遺伝的浮動が原因であり得ると考えられる。
実施例４：Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓは、血清脂質の減少及びＡＳＴの増加と相関する
Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓ変異と、血清脂質、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び肝形質を含む様々な表現型との相関性を評価した。参照対立遺伝子についてホモ接合性、代替対立遺伝子についてヘテロ接合性、及び代替対立遺伝子についてホモ接合性の個体を含むアーミッシュのコホートに基づいて、関連付けを行った。脂質及び肝臓の形質に対する遺伝子型の平均ならびにＣＡＤのリスクを測定し、対象の年齢及び年齢の二乗、対象の性別、及び研究（一定年数の期間にわたるいくつかの研究から表現型データを収集したため）の影響を除去することにより、効果の測定値を調整した。心膜脂肪の場合、遺伝子型の平均をＢＭＩに対してさらに調整した。測定した表現型に対する変異の効果量を、９５％の信頼区間で測定した。形質及び結果を図６、図７、及び図８に示す。
図６に示すように、Ｎ３５２Ｓ変異の存在は、一般的に、血清脂質、特に、強力な統計的有意性を達成した総コレステロール（ｐ値１．３×１０−１０）及びＬＤＬ（ｐ値１．８×１０−９）レベルの低下と相関していた。この変異に関してヘテロ接合性及びホモ接合性である個体は、ＬＤＬレベルについてそれぞれ１７．３ｍｇ／ｄＬ及び３１．２ｍｇ／ｄＬの低下を示した。このバリアントには冠動脈石灰化の減少傾向が認められた。さらに、この変異の存在は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの増加と相関していた（ｐ値６．０×１０−８）。ＡＳＴレベルの劣性モデルのｐ値は、９×１０−２３であると測定された。この変異は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アルカリホスファターゼレベル、または肝臓脂肪レベルの増加と相関しているようには思われなかった。コレステロール、ＬＤＬ、及びＡＳＴのレベルを図７にグラフで示す。図７では、参照対立遺伝子についてホモ接合（ＴＴ）、代替対立遺伝子についてヘテロ接合（ＣＴ）、及び代替対立遺伝子についてホモ接合（ＣＣ）である対象について、コレステロール、ＬＤＬ、及びＡＳＴのレベルを示す。表示の値は未調整である。対象の年齢及び年齢の二乗、性別、及び研究の調整に基づいて、値を再計算した（図７の下部に集計）。
脂質亜分画に対するＮ３５２Ｓ変異の影響も評価した。これらの結果を図８に示す。参照対立遺伝子についてホモ接合性、代替対立遺伝子についてヘテロ接合性、及び代替対立遺伝子についてホモ接合性の個体を含むアーミッシュコホートに基づいて、関連付けを行った。図８の結果は、Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓ変異が、試験したすべての脂質亜分画の減少と相関していることを示す。
実施例５：Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓはフィブリノーゲンレベルの低下と相関する
試料のサブセットにおいてＢ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓ変異とフィブリノーゲンレベルとの相関性も評価した。実施例４で評価した血清脂質、ＣＡＤ、及び肝臓形質に関して、フィブリノーゲンレベルとの関連付けを、代替対立遺伝子についてホモ接合性、参照対立遺伝子についてヘテロ接合性、及び代替対立遺伝子についてホモ接合性の個体を含むアーミッシュコホートに基づいて行った。フィブリノーゲンレベルの遺伝子型の平均を、クロピドグレルのレジメン下にない個体（薬物未投与）及びクロピドグレルのレジメン下の個体（クロピドグレル投与）の２つの部分群で測定し、分析の一環として、各群の平均レベルを、対象の年齢及び年齢の二乗、対象の性別、研究の影響を除去することにより調整した。フィブリノーゲンレベルに対する変異の効果量を、９５％の信頼区間で測定した。図９に示すように、Ｎ３５２Ｓ変異の存在は、薬物未投与（ｐ値１．１５×１０−３）群及びクロピドグレル投与（ｐ値２．７４×１０−５）群それぞれのフィブリノーゲンレベルの低下と相関していた。薬剤未投与の部分群は、フィブリノーゲンのおよそ２４ｍｇ／ｄＬの低下を示した（図９参照）。クロピドグレル投与の部分群は、フィブリノーゲンのおよそ３２．５ｍｇ／ｄＬの低下を示した（図９参照）。
実施例６：さらなるＢ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓ相関性
アーミッシュのコホート内で、Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓ変異と、クレアチニンレベル、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、好塩基球レベル、及びヘマトクリット割合を含む他の形質との相関性の評価も行った。図９に示すように、バリアントは、クレアチニンレベルのわずかな増加と弱く相関していたが、ｅＧＦＲ、好塩基球レベル、またはヘマトクリット割合とは有意に相関していなかった。
実施例７：ゼブラフィッシュにおけるｂ４ｇａｌｔ１オルソログノックダウン
細胞ベースのアッセイのエビデンスと並行して、Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｐ．Ａｓｎ３５２ＳｅｒのＬＤＬへの影響を調べるためにゼブラフィッシュモデルを探求した。
ゼブラフィッシュ飼育、モルホリノ注射及び検証
野生型（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ）ゼブラフィッシュストックを使用して、モルホリノ注射用の胚を生成した。成魚は２７〜２９℃で維持及び繁殖させ、胚は２８．５℃で発育させた。すべての動物は、メリーランド大学実験動物委員会によって承認されたプロトコールに従って飼育及び維持した。モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＯ）は、ｂ４ｇａｌｔ１を標的とした以前に公開されたＭＯ（Ｍａｃｈｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００６，２９７，４７１−４８２）に基づいて取得した（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．）。１〜２細胞期にＭＯを注射し、野生型ｂ４ｇａｌｔ１転写産物のｑＲＴ−ＰＣＲ定量により検証した。オフターゲット毒性を、ｐ５３のΔ１１３アイソフォームのｑＲＴ−ＰＣＲ定量化によって評価した（Ｒｏｂｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，２００７，３，ｅ７８）。ｍＲＮＡレスキュー実験のために、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡを、その遺伝子の野生型またはＮ３５２Ｓバリアントのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するｐＣＳ２＋プラスミドベクターから転写させた。ｍＲＮＡを様々な濃度でＭＯと混合し、１〜２細胞期の胚に共注射した。各注射実験では、合計２００〜４００個の胚に注射し、各実験を最低３回繰り返した。
ゼブラフィッシュにおけるＬＤＬ定量化
受精後（ｄｐｆ）５日の幼虫１００匹を、実験ごとに、氷冷した１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン４００μｌで均質化した。ホモジネートを、脂質抽出の準備として、０．４５μｍ Ｄｕｒａ ＰＶＤＦメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。ＨＤＬ及びＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールアッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、製造業者のプロトコールに従ってホモジネートを処理した。沈殿及び希釈後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏマイクロプレートデータ取得及び分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した蛍光定量的分析により試料を分析した。
ゼブラフィッシュオルソログ（ｂ４ｇａｌｔ１）のゲノムノックアウトを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したエクソン２のターゲティングを使用して生成した。ノックアウト動物における胚の致死性のマウス報告と一致して、注射したＦ０動物は成体まで生存することができず、幼若期で一貫して死亡した。生存率の欠如を回避するために、以前に報告された、胚内に注射したスプライスブロッキングアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）を使用したノックダウンアプローチ（Ｍａｃｈｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００６，２９７，４７１−４８２）を採用した。ＭＯの有効性を、２つの異なる濃度でｑＲＴ−ＰＣＲによって検証し（図１０参照）、オフターゲット毒性の可能性を排除した（図１１参照）。ＬＤＬレベルの変化を定量化するために、８ｎｇのＭＯを注射し、注射した胚を受精後（ｄｐｆ）５日間まで培養し、その段階で以前に公開されたプロトコール（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，２０１４，５５，２２４２−２２５３）に従って幼虫の総ＬＤＬを分析した。対照幼虫に比べて、ＭＯを注射した幼虫においてＬＤＬの有意な低下が観察され、このことはＬＤＬ恒常性におけるｂ４ｇａｌｔ１の役割と一致する（図１２参照）。この結果は、エクソン２を標的とする第２のスプライスブロッキングＭＯを使用して確認され、２ｎｇのＭＯを注射するとＬＤＬ濃度が低下した（データは示さず）。これらの観察の特異性を検証し、ゼブラフィッシュにおけるヒトＢ４ＧＡＬＴ１の機能を試験するために、ヒト遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を保有するｐＣＳ２＋プラスミドからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、ヒト遺伝子をコードする完全長キャップｍＲＮＡを生成させた。ノックダウン表現型をレスキューする野生型ヒトｍＲＮＡの能力を評価するために、ｂ４ｇａｌｔ１ ＭＯとともに胚に共注射し、未給餌幼虫のＬＤＬを評価した。３種類の濃度のｍＲＮＡ（１０ｐｇ、２５ｐｇ、及び５０ｐｇ）を８ｎｇのＭＯと共注射した。５０ｐｇのＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの共注射により、対照ＭＯのみを注射した幼虫と統計的に見分けがつかないＬＤＬレベル（ｐ値＝０．１４）が得られ、このことは、ヒトｍＲＮＡがゼブラフィッシュ遺伝子のノックダウンの効果をレスキューすることができたことを示唆している（図１２参照；幼虫をｂ４ｇａｌｔ１に対するＭＯで処置し、ＭＯをＷＴヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡと共注射するか（ＷＴレスキュー）、またはＭＯを、Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ変異をコードするＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡと共注射した（Ｎ３５２Ｓレスキュー））。
これらのデータは、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１のバリアントの機能的解釈のためのこの系の使用をサポートするものであり、ヒト野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡが全身性ＬＤＬレベルの調節に関してゼブラフィッシュにおいて機能的であることを示唆している。Ｂ４ＧＡＬＴ１機能に対するｐ．Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの影響をさらに調べた。部位特異的変異誘発を使用して（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１７，６５，１５２６−１５４２）、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ ＯＲＦ構築物のコーディング配列にＴからＣへの変異を導入し、完全長ｍＲＮＡを生成した。Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｐ．３５２Ｓｅｒ ｍＲＮＡとＭＯの共注射により、ＬＤＬ表現型のレスキュー能力が低下した。結果として得られたＬＤＬ濃度は、野生型ｍＲＮＡとＭＯの共注射から得られたものより１５％低く、統計的に有意な効果であった（４６．６μＭに対して３９．９μＭ、ｐ値＝０．０２）。しかしながら、このレベルのＬＤＬはまた、ｂ４ｇａｌｔ１ ＭＯ単独よりも統計的に大きく（ｐ値＝０．０１）（図１２参照）、このことはミスセンスバリアントによって導入される機能の部分的な欠陥を示唆している。
実施例８：標的化された遺伝子型判定
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した標的化されたＳＮＰ遺伝子型判定を、３，２３６名のＯＯＡ対象に対して実施した。１４個のＳＮＰのＬＤ構造に基づいて、７つのＳＮＰを遺伝子型判定用に選択し、ｒｓ５５１５６４６８３の相関性のエビデンスは４．１Ｅ−１３であり、一方、他のＳＮＰについては約Ｅ−１０であったことから（図１４）、ｒｓ５５１５６４６８３がこの領域における原因バリアントであることが確認された。
実施例９：Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓは、タンパク質安定性または細胞局在性を変化させずに酵素活性の低下を引き起こす
Ｂ４ＧＡＬＴ１の特性の調査を、ヒトエピトープタグ標識Ｆｌａｇ−Ｂ４ＧＡＬＴ１ ３５２Ａｓｎまたはエピトープタグ標識Ｆｌａｇ−Ｂ４ＧＡＬＴ１ ３５２Ｓｅｒを過剰発現しているＣＯＳ−７及びＨｕｈ７細胞で行った（図１５及び１６）。図１５に示すように、Ｂ４ＧＡＬＴ１またはＦｌａｇ抗体を使用したＦｌａｇ−３５２ＡｓｎまたはＦｌａｇ−３５２Ｓｅｒの共焦点顕微鏡画像は、同一の染色パターンを示す（スケールバー＝１０μｍ）。図１６に示すように、Ｈｕｈ７細胞の間接免疫蛍光による細胞内局在性は、内在的に発現するＢ４ＧＡＬＴ１とゴルジ体マーカーであるＴＧＮ５６の共局在を示した。ヒトエピトープタグ標識Ｆｌａｇ−Ｂ４ＧＡＬＴ１ ３５２Ａｓｎまたはエピトープタグ標識Ｆｌａｇ−Ｂ４ＧＡＬＴ１ ３５２Ｓｅｒを過剰発現させた場合でも、同様の共局在パターンが観察された（図１６）。図１６に示すように、ヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞において過剰発現させた内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１、Ｆｌａｇ−３５２Ａｓｎ、及びＦｌａｇ−３５２ｓｅｒは、トランスゴルジネットワークマーカーＴＧＮ４６と共局在していた。トランスゴルジネットワークマーカーＴＧＮ４６と関連する内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１、Ｆｌａｇ−３５２Ａｓｎ、及びＦｌａｇ−３５２Ｓｅの細胞内局在の共焦点顕微鏡画像をスケールバー＝１０μｍで示す。
ＣＯＳ−７細胞は、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１の含有量が低いことが観察されたため（図１７、パネルＢ）、この細胞株を使用して、タンパク質安定性及び／または定常状態レベルに対するミスセンス変異の影響、及びガラクトシルトランスフェラーゼ活性を評価した。結果からは、ミスセンス変異がタンパク質の安定性及び／または定常状態レベルに影響を及ぼさないことが示された（ウエスタンブロットによる）（図１７）。図１７に、タンパク質の安定性及び／または定常状態レベルに対する３５２Ｓｅｒの影響を示す。パネルＡは、ＣＯＳ７細胞内で発現させた３５２Ａｓｎまたは３５２Ｓｅｒ Ｆｌａｇタグタンパク質融合体のいずれかを遊離ＥＧＦＰとともに発現しているＣＯＳ７細胞を示す。細胞溶解物を、市販の抗体を使用して、Ｂ４ＧＡＬＴ１、バクチン、及びＥＧＦＰのウエスタンブロットによって分析した。４つの類似した実験のうちの１つを示す。パネルＢは、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって測定したＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは４つの実験の平均±標準誤差を表す。
３５２Ｓｅｒの触媒活性を測定するために、非形質移入ＣＯＳ−７細胞、及び発現ベクター単独を形質移入したか、野生型またはバリアント型Ｂ４ＧＡＬＴ１のｃＤＮＡインサートを保有するＣＯＳ−７細胞の溶解物を、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性について分析した。ＦＬＡＧタグ標識タンパク質の発現に対して正規化した場合（図１８、パネルＡ及びＢのイムノブロッティング実験）、３５２Ｓｅｒの酵素活性は３５２Ａｓｎに比べておよそ５０％低下した（図１８、パネルＣ）。図１８に、活性に対する３５２Ｓｅｒ変異の影響を示す。パネルＡ及びＢは、ＣＯＳ７細胞内で発現させた３５２Ａｓｎまたは３５２Ｓｅｒ Ｆｌａｇタグタンパク質融合体のいずれかを発現しているＣＯＳ７細胞を示す。細胞溶解物をウサギ抗Ｆｌａｇ ＩｇＧまたはウサギ前免疫対照ＩｇＧの存在下でインキュベートした。免疫沈降物を、市販の抗体を使用してＢ４ＧＡＬＴ１またはＦｌａｇに対するウエスタンブロットにより分析した。４つの類似した実験のうちの１つを示す。パネルＣは、市販キット（Ｒ＆Ｄ）で測定した免疫沈降物のＢ４ＧＡＬＴ１活性を示す。各データポイントは、免疫沈降物において回収された３５２Ａｓｎまたは３５２Ｓｅｒタンパク質の量とのＢ４ＧＡＬＴ１特異的活性の計算した比率の平均を表す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したデンシトメトリーにより、ウエスタンブロットＥＣＬのシグナルを定量化した。データは、４つの実験の平均±標準誤差を表す（＊、ｐ＜０．０５、３５２Ａｓｎ対３５２Ｓｅｒ）。
これらの実験は、このミスセンス変異がタンパク質発現のレベル及びその局在化に影響を及ぼさないが、酵素活性を低下させることを示している。
実施例１０：先天性グリコシル化障害（ＣＤＧ）試験のための炭水化物欠損トランスフェリン
３つの遺伝子型群（８つのマイナーなホモ接合体、８つのヘテロ接合体、８つのメジャーなホモ接合体）の２４名の対象由来の血清試料０．１ｍｌを使用してＣＤＧ試験を実施した。マイナーなホモ接合体のそれぞれを、親類または親縁係数に基づく近縁同性個体であるヘテロ接合体及びメジャーなホモ接合体と一致させた。年齢、及び保因者の状態もまた、ＡＰＯＢＲ３５２７Ｑにおけるメジャーな脂質改変遺伝子の対立遺伝子と一致させた。
水で希釈した試料を、免疫親和性カラムを使用して二重洗浄した。溶出タンパク質のグリコシル化プロファイリングを、ＡＰＯＣＩＩＩ及びトランスフェリンに固有の２つのスキャン範囲で動作する質量分析計を使用して実施した。各タンパク質のグリコフォーム比を使用して、グリコシル化欠損を判定した。ＣＤＧ試験は、Ｍａｙｏ病院のＭａｙｏ医学研究所で実施した。
結果からは、２４個の試料すべてが、正常レベルのモノオリゴ糖／ジオリゴ糖トランスフェリン比、ａ−オリゴ糖／ジオリゴ糖トランスフェリン比、ＡｐｏＣＩＩＩ−１／ＡｐｏＣＩＩＩ−２比、及びＡｐｏＣＩＩＩ−０／ＡｐｏＣＩＩＩ−２比を有していたことが示された。しかしながら、すべての野生型試料が正常レベルのトリシアロ／ジオリゴ糖トランスフェリン比を有していたが、すべてのヘテロ接合体のレベルは中間範囲にあり、すべてのマイナーなホモ接合体のレベルは異常であり、一致する野生型及びヘテロ接合体よりも有意に高かった（ｐ＝７．６ Ｅ−１０）（図１９）。これらの結果は、このミスセンス変異が、Ｂ４ＧＡＬＴ１の酵素活性の低下の結果として、グリコシル化の欠損と相関していることを示している。
実施例１１：血漿糖タンパク質の網羅的Ｎ結合グリカン分析
デシアリル化及び低ガラクトシル化がトランスフェリンのみに影響を及ぼしているのか、他の糖タンパク質に及ぶのかを判定するために、Ｒｅｇｎｅｒｏｎの分析化学グループが網羅的Ｎ−グリカン分析を実施した。レクチン濃縮糖タンパク質を、５組のメジャー及びマイナーホモ接合体の血清から２連で抽出し、親水性相互作用クロマトグラフィーを使用して標識グリカンの網羅的Ｎ結合グリカン分離を実施し、蛍光によって検出し、質量分析（ＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ−ＭＳ）によって分析した（図２０及び表５）。図２０に示すように、Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓのマイナー（ＳＳ）及びメジャー（ＮＮ）ホモ接合体の一致ペア由来の糖タンパク質のＮ−グリカン分析の代表的なＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ−ＭＳスペクトルを示す。結果からは、マイナーなホモ接合体が、１つのガラクトースと１つのシアル酸だけを含む二分岐グリカン（ｐ＝３．１ Ｅ−５）、１つのガラクトースを含む非シアル酸付加二分岐グリカン（ｐ＝０．００１）、及びガラクトースとシアル酸の両方が欠落したトランケート型二分岐グリカン（ｐ＝０．００５）を含む低ガラクトシル化及び低シアル酸付加グリカンのレベルが有意に高いことが示された。他方、マイナーなホモ接合体は、２つのガラクトースと２つのシアル酸を有する二分岐グリカンのレベルが有意に低い（ｐ＝０．００１）（表５）。マイナーなホモ接合体では、全体的なガラクトシル化（ｐ＝９．２ Ｅ−５）及びシアル酸付加（ｐ＝０．００１）が有意に低かったが、一方、フコシル化レベルには差異がなかった（ｐ＝０．５）。血清のＣＤＴ及び網羅的Ｎ−グリカン分析の両方が、マイナーなホモ接合体の炭水化物欠損糖タンパク質のレベルの有意な増加を示したが、このことはＢ４ＧＡＬＴ１ Ｎ３５２Ｓがタンパク質グリコシル化の欠損をもたらすことを示している。
本開示は、上記で記載及び例示した実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲内で変更及び修正が可能である。本開示はまた、本明細書に挙げる任意のヘッダーの使用によるいかなる様式にも限定されるべきではない。

Claims (215)

  1. 配列番号１と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む単離された核酸分子であって、前記核酸配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応してセリンをコードするコドンを含むことを条件とする、前記単離された核酸分子、またはその相補体。
  2. 前記核酸配列が、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 前記核酸配列が、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のエクソン１〜６を含む配列番号２の部分と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
  4. 前記核酸配列が、配列番号２を含む、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
  6. 外来性ドナー配列をさらに含む、請求項５に記載のベクター。
  7. 前記ベクターが、プラスミドを含む、請求項５または６に記載のベクター。
  8. 前記ベクターが、ウイルスを含む、請求項５または６に記載のベクター。
  9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子と担体とを含む、組成物。
  10. 請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターと担体とを含む、組成物。
  11. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
  12. 請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  13. 前記単離された核酸分子が、前記宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
  14. 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  17. 少なくとも約１５ヌクレオチドを含み、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブであって、前記プローブが、配列番号１または配列番号２の５３５７５〜５３５７７位にハイブリダイズすることを条件とする、前記核酸プローブ、またはその相補体。
  18. 配列番号４と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む単離された核酸分子であって、前記核酸配列が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードするコドンを含むことを条件とする、前記単離された核酸分子、またはその相補体。
  19. 前記核酸配列が、Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子のエクソン１〜６を含む配列番号４の部分と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である、請求項１８に記載の単離された核酸分子。
  20. 前記核酸配列が、配列番号４を含む、請求項１８または１９に記載の単離された核酸分子。
  21. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
  22. 外来性ドナー配列をさらに含む、請求項２１に記載のベクター。
  23. 前記ベクターが、プラスミドを含む、請求項２１または２２に記載のベクター。
  24. 前記ベクターが、ウイルスを含む、請求項２１または２２に記載のベクター。
  25. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子と担体とを含む、組成物。
  26. 請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のベクターと担体とを含む、組成物。
  27. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
  28. 請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  29. 前記単離された核酸分子が、前記宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項２７または２８に記載の宿主細胞。
  30. 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項２９に記載の宿主細胞。
  31. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  32. 前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  33. 少なくとも約１５ヌクレオチドを含み、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブであって、前記プローブが、配列番号４の１２４３〜１２４５位にハイブリダイズすることを条件とする、前記核酸プローブ、またはその相補体。
  34. 配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドが、３５２位にセリンを含むことを条件とする、前記核酸分子、またはその相補体。
  35. 前記核酸配列が、配列番号８のポリペプチド配列をコードする、請求項３４に記載の単離された核酸分子。
  36. 請求項３４または３５に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
  37. 外来性ドナー配列をさらに含む、請求項３６に記載のベクター。
  38. 前記ベクターが、プラスミドを含む、請求項３６または３７に記載のベクター。
  39. 前記ベクターが、ウイルスを含む、請求項３６または３７に記載のベクター。
  40. 請求項３４または３５に記載の単離された核酸分子と担体とを含む、組成物。
  41. 請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のベクターと担体とを含む、組成物。
  42. 請求項３４または３５に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
  43. 請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  44. 前記単離された核酸分子が、前記宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項４２または４３に記載の宿主細胞。
  45. 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項４４に記載の宿主細胞。
  46. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  47. 前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  48. 少なくとも約１５ヌクレオチドを含み、請求項３４または３５に記載の核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブであって、前記プローブが、３５２位でセリンをコードする核酸配列の部分にハイブリダイズすることを条件とする、前記核酸プローブ、またはその相補体。
  49. 配列番号６と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含み、ヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）タンパク質をコードするｃＤＮＡであって、前記核酸配列が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置でセリンをコードすることを条件とする、前記ｃＤＮＡ、またはその相補体。
  50. 前記核酸配列が、配列番号６を含む、請求項４９に記載のｃＤＮＡ。
  51. 請求項４９または５０に記載のｃＤＮＡを含む、ベクター。
  52. 外来性ドナー配列をさらに含む、請求項５１に記載のベクター。
  53. 前記ベクターが、プラスミドを含む、請求項５１または５２に記載のベクター。
  54. 前記ベクターが、ウイルスを含む、請求項５１または５２に記載のベクター。
  55. 請求項４９または５０に記載のｃＤＮＡと担体とを含む、組成物。
  56. 請求項５１〜５４のいずれか一項に記載のベクターと担体とを含む、組成物。
  57. 請求項４９または５０に記載のｃＤＮＡを含む、宿主細胞。
  58. 請求項５１〜５４のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  59. 前記ｃＤＮＡが、前記宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項５７または５８に記載の宿主細胞。
  60. 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項５９に記載の宿主細胞。
  61. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  62. 前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  63. 少なくとも約１５個のヌクレオチドを含み、請求項４９または５０に記載のｃＤＮＡにハイブリダイズする核酸プローブであって、前記プローブが、配列番号６の１０５４〜１０５６位にハイブリダイズすることを条件とする、前記核酸プローブ、またはその相補体。
  64. 配列番号８を有するＢ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号８の３５２位に対応するセリンを含むことを条件とする、前記単離されたポリペプチド。
  65. 前記Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントポリペプチドが、配列番号８を含む、請求項６４に記載のポリペプチド。
  66. 前記ポリペプチドが、異種ペプチドにさらに融合している、請求項６４または６５に記載のポリペプチド。
  67. 前記異種分子が、免疫グロブリンＦｃドメイン、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、または形質導入ドメインを含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
  68. 前記ポリペプチドが、さらに標識に結合している、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  69. 前記標識が、ポリエチレングリコール、ポリシアル酸、またはグリコール酸を含む、請求項６８に記載のポリペプチド。
  70. 前記標識が、検出可能な蛍光標識または放射性標識を含む、請求項６８に記載のポリペプチド。
  71. 請求項６４〜７０のいずれか一項に記載のポリペプチドと担体または賦形剤とを含む、組成物。
  72. 請求項６４〜７０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する、宿主細胞。
  73. 前記ポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養し、それにより前記細胞に前記ポリペプチドを発現させ、前記発現させたポリペプチドを回収することを含む、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。
  74. 前記核酸分子が、異種プロモーターの制御下にある、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記核酸分子が、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項７３または７４に記載の方法。
  76. ヒト対象におけるＢ４ＧＡＬＴ１バリアント核酸分子の検出方法であって、前記対象から採取した試料をアッセイして、前記試料中の核酸分子が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードする核酸配列を含むかどうかを判定することを含む、前記検出方法。
  77. 前記アッセイが：
    前記試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分を配列決定することであって、配列決定される前記部分が、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含む、前記配列決定すること、
    前記試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分を配列決定することであって、配列決定される前記部分が、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置を含む、前記配列決定すること、または
    前記試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分を配列決定することであって、配列決定される前記部分が、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置を含む、前記配列決定すること、を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記アッセイが：
    ａ）前記試料を：ｉ）配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分、ｉｉ）配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分、またはｉｉｉ）配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分にハイブリダイズするプライマーと接触させること、
    ｂ）少なくとも：ｉ）５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置、ｉｉ）１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置、またはｉｉｉ）１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置を介して前記プライマーを伸長すること、及び
    ｃ）前記プライマーの伸長産物が：配列番号８の３５２位でセリンをコードするヌクレオチドをｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の５３５７５〜５３５７７位に対応する、ｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応する、またはｉｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応する位置に含むかどうかを判定することを含む、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記アッセイが、前記試料を、ストリンジェントな条件下で、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１配列にはハイブリダイズしないプライマーまたはプローブと接触させること、及びハイブリダイゼーションが生じたかどうかを判定することを含む、請求項７６に記載の方法。
  80. ヒト対象におけるＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒの存在の検出方法であって、前記ヒト対象から採取した試料に対してアッセイを行い、前記試料中のＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質が３５２位にセリン残基を含むかどうかを判定することを含む、前記検出方法。
  81. 心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法であって：
    ａ）前記対象から採取した試料をアッセイして、前記試料中の核酸分子が、完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードする核酸配列を含むかどうかを判定すること、及び
    ｂ）前記核酸分子が完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードする核酸配列を含む場合、前記心血管病態を発症するリスクが低いと前記ヒト対象を分類するか、または前記核酸分子が完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンをコードする核酸配列を含まない場合、前記心血管病態を発症するリスクが高いと前記ヒト対象を分類することを含む、前記判定方法。
  82. 前記アッセイが：
    前記試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分を配列決定することであって、配列決定される前記部分が、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含む、前記配列決定すること、
    前記試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分を配列決定することであって、配列決定される前記部分が、配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応する位置を含む、前記配列決定すること、または
    前記試料中の核酸分子のＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分を配列決定することであって、配列決定される前記部分が、配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応する位置を含む、前記配列決定すること、を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記アッセイが：
    ａ）前記試料を：ｉ）配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の部分、ｉｉ）配列番号４の１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡ配列の部分、またはｉｉｉ）配列番号６の１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置に近接するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡ配列の部分にハイブリダイズするプライマーと接触させること、
    ｂ）少なくとも：ｉ）５３５７５〜５３５７７位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の位置、ｉｉ）１２４３〜１２４５位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの位置、またはｉｉｉ）１０５４〜１０５６位に対応するＢ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの位置を介して前記プライマーを伸長すること、及び
    ｃ）前記プライマーの伸長産物が：配列番号８の３５２位でセリンをコードするヌクレオチドをｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ゲノム配列の５３５７５〜５３５７７位に対応する、ｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｍＲＮＡの１２４３〜１２４５位に対応する、またはｉｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ ｃＤＮＡの１０５４〜１０５６位に対応する位置に含むかどうかを判定することを含む、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記アッセイが、前記試料を、ストリンジェントな条件下で、Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１配列にはハイブリダイズしないプライマーまたはプローブと接触させること、及びハイブリダイゼーションが生じたかどうかを判定することを含む、請求項８１に記載の方法。
  85. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. ｃ）心血管病態を発症するリスクが高い対象に対して、前記心血管病態を治療または阻害する治療薬を投与することをさらに含む、請求項８１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 心血管病態の発症に対するヒト対象の感受性の判定方法であって：
    ａ）前記ヒト対象から採取した試料に対してアッセイを行い、前記試料中のＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質が３５２位にセリン残基を含むかどうかを判定すること、及び
    ｂ）Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含む場合、前記心血管病態を発症するリスクが低いと前記ヒト対象を分類するか、またはＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが完全長／成熟型Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの３５２位に対応する位置にセリンを含まない場合、前記心血管病態を発症するリスクが高いと前記ヒト対象を分類することを含む、前記判定方法。
  96. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項９５に記載の方法。
  99. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項９５に記載の方法。
  100. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項９５に記載の方法。
  101. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項９５に記載の方法。
  104. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１０３に記載の方法。
  105. ｃ）心血管病態を発症するリスクが高い対象に対して、前記心血管病態を治療または阻害する治療薬を投与することをさらに含む、請求項９５〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
  106. 内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に結合または切断するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡであって、前記ガイドＲＮＡが、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むかまたはそれに近接する前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、前記ガイドＲＮＡ。
  107. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号９〜１２から選択される、請求項１０６に記載のガイドＲＮＡ。
  108. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の約１０００ヌクレオチド以内にある、請求項１０６に記載のガイドＲＮＡ。
  109. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含む、請求項１０８に記載のガイドＲＮＡ。
  110. 前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子が、配列番号１を含む、請求項１０９に記載のガイドＲＮＡ。
  111. 前記ガイドＲＮＡが、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１０６〜１１０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
  112. 請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、単離された核酸分子。
  113. 請求項１１２に記載の単離された核酸分子と異種核酸とを含む、ベクター。
  114. 請求項１０６〜１１２のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含む、組成物。
  115. 請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを含む、細胞。
  116. 細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の改変方法であって、前記細胞のゲノムを：
    ａ）Ｃａｓタンパク質、及び
    ｂ）前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させることを含み、前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むかまたはそれに近接し、前記Ｃａｓタンパク質が前記Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断する、前記改変方法。
  117. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号９〜１２から選択される、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の約１０００ヌクレオチド以内にある、請求項１１６に記載の方法。
  119. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記ゲノムを、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の５’の標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、及び配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の３’の標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外来性ドナー配列と接触させることであって、前記外来性ドナー配列を前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子と組み換える、前記接触させることをさらに含む、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記外来性ドナー配列が、前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームに隣接する核酸インサートをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記核酸インサートが、セリンをコードする核酸配列を含み、前記外来性ドナー配列の前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子との組換え時に、前記核酸インサートが前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に挿入され、前記セリンをコードする前記核酸配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の位置に挿入される、請求項１１６に記載の方法。
  123. 前記外来性ドナー配列が約５０ヌクレオチド〜約１ｋｂの長さである、請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記外来性ドナー配列が約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの長さである、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記外来性ドナー配列が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１２０〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の改変方法であって、前記細胞のゲノムを：
    ａ）Ｃａｓタンパク質、及び
    ｂ）前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡと接触させることを含み、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列が、前記Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンの約１，０００ヌクレオチド以内にあるか、または配列番号９〜１２から選択され、前記Ｃａｓタンパク質が、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断するか、または発現を変化させる、前記改変方法。
  127. 前記第１のガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号９〜１２から選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１２６または１２７に記載の方法。
  129. 前記Ｃａｓタンパク質が、転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインと融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１２６または１２７に記載の方法。
  130. 前記細胞のゲノムを、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させることをさらに含み、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列が、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の終止コドンを含むか、または終止コドンの約１，０００ヌクレオチド以内にあるか、または配列番号９〜１２から選択され、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列と前記第２のガイドＲＮＡ認識配列との間に欠失を含むように前記細胞が改変される、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記細胞に発現ベクターを導入することをさらに含み、前記発現ベクターが、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置に挿入されたセリンをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む、請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子が、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対して前記遺伝子の１つ以上の非必須セグメントを欠失させたＢ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子である、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記欠失セグメントが、１つ以上のイントロン配列を含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記細胞に発現ベクターを導入することをさらに含み、前記発現ベクターが、配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、配列番号８に対応する３５２位にセリンを含む、請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記細胞にＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を導入することをさらに含み、前記タンパク質またはその断片が、配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、配列番号８に対応する３５２位にセリンを含む、請求項１２６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項１２６〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 細胞に発現ベクターを導入することを含む、前記細胞の改変方法であって、前記発現ベクターが、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置に挿入されたセリンをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む、前記改変方法。
  138. 前記組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子が、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対して前記遺伝子の１つ以上の非必須セグメントを欠失させたＢ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子である、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記欠失セグメントが、１つ以上のイントロン配列を含む、請求項１３８に記載の方法。
  140. 細胞に発現ベクターを導入することを含む、前記細胞の改変方法であって、前記発現ベクターが、配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、配列番号８に対応する３５２位にセリンを含む、Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、前記改変方法。
  141. 細胞にＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたはその断片を導入することを含む、前記細胞の改変方法であって、前記Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが、配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、配列番号８に対応する３５２位にセリンを含む、前記改変方法。
  142. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象に：
    ａ）Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、
    ｂ）ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含むかまたはそれに近接する、前記ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸、及び
    ｃ）配列番号１の５３５７５〜５３５７７に対応する位置の５’の標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の３’の標的配列にハイブリダイズする３’相同性アーム、ならびに前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームに隣接し、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸インサートを含む外来性ドナー配列、を導入することを含み、
    前記Ｃａｓタンパク質が、前記対象の細胞内の前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断し、前記外来性ドナー配列が、前記細胞内の前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子と組み換わり、前記外来性ドナー配列の前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子との組換え時に、前記セリンが配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応するヌクレオチドに挿入される、前記治療方法。
  143. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号９〜１２から選択される、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置の約１０００ヌクレオチド以内にある、請求項１４２に記載の方法。
  145. 前記ガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号１の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置を含む、請求項１４２に記載の方法。
  146. 前記外来性ドナー配列が、約５０ヌクレオチド〜約１ｋｂの長さである、請求項１４２〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記外来性ドナー配列が、約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの長さである、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記外来性ドナー配列が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１４２〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項１４２〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項１４２〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項１４２〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項１４２〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１４２〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１５６に記載の方法。
  158. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象に：
    ａ）Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、
    ｂ）第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記第１のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列が、内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１，０００ヌクレオチド以内にあるか、または配列番号９〜１２から選択される、前記第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードする前記核酸、及び
    ｃ）配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含む発現ベクター、を導入することを含み、前記Ｃａｓタンパク質が、前記対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を切断するかまたは発現を変化させ、前記発現ベクターが、前記対象の前記細胞内で前記組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現する、前記治療方法。
  159. 前記第１のガイドＲＮＡ認識配列が、配列番号９〜１２から選択される、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１５８または請求項１５９に記載の方法。
  161. 前記Ｃａｓタンパク質が、転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１５８または１５９に記載の方法。
  162. 前記対象に第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含み、前記第２のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列が、前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子の終止コドンを含むか、または終止コドンの約１，０００ヌクレオチド以内にあるか、または配列番号９〜１２から選択され、前記Ｃａｓタンパク質が、前記細胞の前記内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子を、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列及び前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の両方の内部で切断し、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列と前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の間に欠失を含むように前記細胞が改変される、請求項１５８〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項１５８〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項１５８〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項１５８〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項１５８〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１５８〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項１４２〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
  173. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象の細胞の内在性Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子内の配列にハイブリダイズしてＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドの発現を低下させるアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを前記対象に導入することを含む、前記治療方法。
  174. 前記対象に発現ベクターを導入することをさらに含み、前記発現ベクターが、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含み、前記発現ベクターが、前記対象の細胞内で前記組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現する、請求項１７３に記載の方法。
  175. 前記対象に発現ベクターを導入することをさらに含み、前記発現ベクターが、配列番号８（Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ）と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、前記発現ベクターが、前記対象の前記細胞内で前記Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする前記核酸を発現する、請求項１７３に記載の方法。
  176. 前記対象にｍＲＮＡを導入することをさらに含み、前記ｍＲＮＡが、配列番号８（Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ）と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードし、前記ｍＲＮＡが、前記対象の前記細胞内で前記Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドを発現する、請求項１７３に記載の方法。
  177. 前記対象にＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒポリペプチドまたはその断片を導入することをさらに含み、前記ポリペプチドが、配列番号８と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、配列番号８に対応する３５２位にセリンを含む、請求項１７３に記載の方法。
  178. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項１７３〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
  179. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項１７３〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
  181. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項１７３〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
  182. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項１７３〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
  183. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１８２に記載の方法。
  184. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１７３〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
  186. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１８５に記載の方法。
  187. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象に発現ベクターを導入することを含み、前記発現ベクターが、配列番号２の５３５７５〜５３５７７位に対応する位置にセリンをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を含み、前記発現ベクターが、前記対象の細胞内で前記組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子を発現する、前記治療方法。
  188. 組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子が、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である、請求項１８７に記載の方法。
  189. 前記組換えＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子が、対応する野生型Ｂ４ＧＡＬＴ１遺伝子に対して前記遺伝子の１つ以上の非必須セグメントを欠失させたＢ４ＧＡＬＴ１ミニ遺伝子である、請求項１８７または請求項１８８に記載の方法。
  190. 前記欠失セグメントが、１つ以上のイントロン配列を含む、請求項１８７に記載の方法。
  191. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項１９１に記載の方法。
  193. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
  194. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
  195. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
  196. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１９５に記載の方法。
  197. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１９６に記載の方法。
  198. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
  199. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項１９８に記載の方法。
  200. 前記発現ベクターが、請求項５〜８、２１〜２４、３６〜３９、及び５１〜５４のいずれか１つのベクターである、請求項１８７〜１９９のいずれか一項に記載の方法。
  201. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象に発現ベクターを導入することを含み、前記発現ベクターが、配列番号８（Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ）と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする核酸を含み、前記発現ベクターが、前記対象の細胞内で前記Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードする前記核酸を発現する、前記治療方法。
  202. 前記発現ベクターが、請求項５〜８、２１〜２４、３６〜３９、及び５１〜５４のいずれか１つのベクターである、請求項２０１に記載の方法。
  203. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象にｍＲＮＡを導入することを含み、前記ｍＲＮＡが、配列番号８（Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ）と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一であるＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドをコードし、前記ｍＲＮＡが、前記対象の細胞内で前記Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドを発現する、前記治療方法。
  204. Ｂ４ＧＡＬＴ１バリアントの保因者ではなく、心血管病態を発症しているか、または発症しやすい対象の治療方法であって、前記対象にＢ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒタンパク質またはその断片を導入することを含み、前記Ｂ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドが、配列番号８（Ｂ４ＧＡＬＴ１ Ａｓｎ３５２Ｓｅｒ）と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である、前記治療方法。
  205. 前記ポリペプチドが、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項２０４に記載の方法。
  206. 前記対象への前記導入が、流体力学的送達、ウイルスを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、または静脈内注入を含む、請求項１４２〜２０５のいずれか一項に記載の方法。
  207. 前記心血管病態が、１つ以上の血清脂質レベルの上昇を含む、請求項２０１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
  208. 前記血清脂質が、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、及び非ＨＤＬコレステロールの１つ以上を含む、請求項２０７に記載の方法。
  209. 前記心血管病態が、冠動脈石灰化レベルの上昇を含む、請求項２０１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
  210. 前記心血管病態が、心膜脂肪レベルの上昇を含む、請求項２０１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
  211. 前記心血管病態が、アテローム血栓性病態を含む、請求項２０１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
  212. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項２１１に記載の方法。
  213. 前記アテローム血栓性病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記心血管病態が、フィブリノーゲンレベルの上昇を含む、請求項２０１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
  215. 前記心血管病態が、フィブリノーゲン活性の関与から形成される血餅を含む、請求項２１４に記載の方法。
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