JP7094963B2 - Hsd17b13バリアントおよびその使用 - Google Patents
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- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
- G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
Description
本願は、2017年1月23日に出願された米国出願第62/449,335号、2017年3月17日に出願された米国出願第62/472,972号、および2017年11月6日に出願された米国出願第62/581,918号の利益を主張し、これらの文献それぞれの全体が、全ての目的のために参照によって本明細書において援用される。
ファイル507242SEQLIST.txtに記載された配列表は507キロバイトであり、2018年1月19日に作成され、これにより参照により組み込まれる。
慢性肝疾患および肝硬変は、米国における罹患率および死亡率の主な原因であり、2014年には38,170件の死亡(全死亡の1.5%)の原因となった(Kochanekら(2016年)Natl Vital Stat Rep、65巻:1~122頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。米国における肝硬変の最も一般的な病因は、アルコール性肝疾患、慢性C型肝炎、および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)であり、合わせて、2004年から2013年の間に肝移植を待つ患者の約80%を占めた(Wongら(2015年)Gastroenterology、148巻:547~555頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。米国におけるNAFLDの推定有病率は19~46パーセントの間であり(Browningら(2004年)Hepatology、40巻:1387~1395頁;Lazoら(2013年)Am J Epidemiol、178巻:38~45頁;およびWilliamsら(2011年)Gastroenterology、140巻:124~131頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる)、おそらく、その主な危険因子である肥満症の率の上昇と併せて(Cohenら(2011年)Science、332巻:1519~1523頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる)、経時的に上昇している(Younossiら(2011年)Clin Gastroenterol Hepatol、9巻:524~530頁 e1;quiz e60(2011年)、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。C型肝炎の処置は著しく進歩しているが(Morganら(2013年)Ann Intern Med、158巻:329~337頁およびvan der Meerら(2012年)JAMA、308巻:2584~2593頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる)、現在のところアルコール性または非アルコール性肝疾患および肝硬変に対する証拠に基づく処置は存在しない。
慢性肝疾患の発症および進行の基礎をなす遺伝因子に関する知見により、リスク層別化を改善し、新規の治療戦略の土台をもたらすことができた。肝疾患に関するリスク層別化を改善し、新規の治療法を生じさせるためには、基礎をなす遺伝因子のよりよい理解が必要である。
HSD17B13 rs72613567バリアント遺伝子、バリアントHSD17B13転写産物、およびバリアントHSD17B13タンパク質アイソフォームに関する方法および組成物が提供される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
HSD17B13遺伝子に結合させるかまたはHSD17B13遺伝子を切断するようにCas酵素を方向付けるのに有効なガイドRNAであって、前記HSD17B13遺伝子内のガイドRNA標的配列を標的とするDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA。
(項目2)
前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、項目1に記載のガイドRNA。
(項目3)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、配列番号226~239および264~268のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記DNA標的化セグメントが、配列番号1629~1642および1648~1652のいずれか1つを含み、かつ/または
(c)前記ガイドRNAが、配列番号706~719;936~949;1166~1179、1396~1409、725~729、955~959、1185~1189、および1415~1419のいずれか1つを含む、項目2に記載のガイドRNA。
(項目4)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のエクソン6および/またはイントロン6および/またはエクソン7に対応する領域内であり、かつ/または
(b)前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置から約1000、500、400、300、200、100、50、45、40、35、30、25、20、15、10、または5ヌクレオチドの範囲内であり、必要に応じて、前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置を含む、項目2または3に記載のガイドRNA。
(項目5)
前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接している、項目1に記載のガイドRNA。
(項目6)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、配列番号20~81および259~263のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記DNA標的化セグメントが、配列番号1423~1484および1643~1647のいずれか1つを含み、かつ/または
(c)前記ガイドRNAが、配列番号500~561、730~791、960~1021、1190~1251、720~724、950~954、1180~1184、および1410~1414のいずれか1つを含む、項目5に記載のガイドRNA。
(項目7)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のエクソン1に対応する領域内であり、かつ/または
(b)前記ガイドRNA標的配列が、前記開始コドンから約1000、500、400、300、200、100、50、45、40、35、30、25、20、15、10、または5ヌクレオチドの範囲内である、項目5または6に記載のガイドRNA。
(項目8)
前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接している、項目1に記載のガイドRNA。
(項目9)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、配列番号82~225のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記DNA標的化セグメントが、配列番号1485~1628のいずれか1つを含み、かつ/または
(c)前記ガイドRNAが、配列番号562~705、792~935、1022~1165、および1252~1395のいずれか1つを含む、項目8に記載のガイドRNA。
(項目10)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のエクソン7に対応する領域内であり、かつ/または
(b)前記ガイドRNA標的配列が、終止コドンから約1000、500、400、300、200、100、50、45、40、35、30、25、20、15、10、または5ヌクレオチドの範囲内である、項目8または9に記載のガイドRNA。
(項目11)
前記HSD17B13遺伝子が、ヒトHSD17B13遺伝子またはマウスHsd17b13遺伝子であり、必要に応じて、前記HSD17B13遺伝子が、前記ヒトHSD17B13遺伝子であり、配列番号2を含む、項目1から10までのいずれか一項に記載のガイドRNA。
(項目12)
前記DNA標的化セグメントを含むクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)RNA(crRNA)およびトランス活性化型CRISPR RNA(tracrRNA)を含む、項目1から11までのいずれか一項に記載のガイドRNA。
(項目13)
前記crRNAおよび前記tracrRNAが、互いにハイブリダイズする別々の分子であるモジュラーガイドRNAであり、必要に応じて、前記crRNAが、配列番号1421に記載の配列を含み、前記tracrRNAが、配列番号1422に記載の配列を含む、項目12に記載のガイドRNA。
(項目14)
前記crRNAが前記tracrRNAとリンカーを介して融合している単一ガイドRNAであり、必要に応じて、配列番号1420および256~258のいずれか1つに記載の配列を含む、項目12に記載のガイドRNA。
(項目15)
細胞内のHSD17B13遺伝子を改変する方法、または細胞内のHSD17B13遺伝子の発現を変更するための方法における、項目1から14までのいずれか一項に記載のガイドRNAの使用。
(項目16)
項目1から14までのいずれか一項に記載のガイドRNAをコードするDNAを含む単離された核酸。
(項目17)
配列番号4(HSD17B13転写産物A)内の配列とハイブリダイズし、細胞におけるHSD17B13転写産物Aの発現を低減するアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNA。
(項目18)
(a)配列番号7(HSD17B13転写産物D)には存在しない、配列番号4(HSD17B13転写産物A)に存在する配列とハイブリダイズし、かつ/または
(b)配列番号4(HSD17B13転写産物A)のエクソン6とエクソン7との境界にまたがる配列とハイブリダイズする、項目17に記載のアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNA。
(項目19)
細胞内のHSD17B13遺伝子の発現を変更するための方法における、項目17または18に記載のアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAの使用。
(項目20)
項目17または18に記載のアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAをコードするDNAを含む単離された核酸。
(項目21)
項目16または20に記載の単離された核酸および異種核酸を含むベクター。
(項目22)
項目1から14までのいずれか一項に記載のガイドRNAおよび前記ガイドRNAの安定性を増大させる担体を含む組成物であって、必要に応じて、Casタンパク質をさらに含み、必要に応じて、前記Casタンパク質がCas9である、組成物。
(項目23)
項目17または18に記載のアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAと、前記アンチセンスRNA、前記siRNA、または前記shRNAの安定性を増大させる担体とを含む組成物。
(項目24)
項目1から14までのいずれか一項に記載のガイドRNAを含む細胞。
(項目25)
項目17または18に記載のアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAを含む細胞。
(項目26)
ヒト細胞であり、必要に応じて、肝細胞である、項目24または25に記載の細胞。
(項目27)
齧歯類細胞、マウス細胞、またはラット細胞であり、必要に応じて、多能性細胞または肝細胞である、項目24または25に記載の細胞。
(項目28)
細胞内のHSD17B13遺伝子を改変する方法であって、前記細胞のゲノムを、
(a)Casタンパク質;および
(b)前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記HSD17B13遺伝子内のガイドRNA標的配列を標的とするガイドRNAであって、前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ガイドRNA
と接触させるステップを含み、
前記Casタンパク質が、前記HSD17B13遺伝子を切断する、方法。
(項目29)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、配列番号226~239および264~268のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記DNA標的化セグメントが、配列番号1629~1642および1648~1652のいずれか1つを含み、かつ/または
(c)前記ガイドRNAが、配列番号706~719;936~949;1166~1179、1396~1409、725~729、955~959、1185~1189、および1415~1419のいずれか1つを含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
(a)前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のエクソン6および/またはイントロン6および/またはエクソン7に対応する領域内であり、かつ/または
(b)前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置から約1000、500、400、300、200、100、50、45、40、35、30、25、20、15、10、または5ヌクレオチドの範囲内であり、必要に応じて、前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置を含む、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
前記ゲノムを、配列番号2の12666位に対応する位置の5’側の標的配列とハイブリダイズする5’相同アームおよび配列番号2の12666位に対応する位置の3’側の標的配列とハイブリダイズする3’相同アームを含む外因性ドナー配列と接触させるステップをさらに含み、前記外因性ドナー配列が、前記HSD17B13遺伝子と組換えられる、項目28から30までのいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記外因性ドナー配列が、前記5’相同アームと前記3’相同アームとに挟まれた核酸挿入物をさらに含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記核酸挿入物がチミンを含み、前記外因性ドナー配列が前記HSD17B13遺伝子と組換えられると、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に前記チミンが挿入される、項目32に記載の方法。
(項目34)
(a)前記外因性ドナー配列が、約50ヌクレオチド~約1kbの長さであり、必要に応じて、前記外因性ドナー配列が、約80ヌクレオチド~約200ヌクレオチドの長さであり、かつ/または
(b)前記外因性ドナー配列が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、項目31から33までのいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
細胞内のHSD17B13遺伝子を改変する方法であって、前記細胞のゲノムを、
(a)Casタンパク質;および
(b)前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記HSD17B13遺伝子内の第1のガイドRNA標的配列を標的とする第1のガイドRNAであって、前記第1のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の開始コドンを含むか、または前記開始コドンから約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、または1,000ヌクレオチドの範囲内である、第1のガイドRNA
と接触させるステップを含み、
前記Casタンパク質が、前記HSD17B13遺伝子を切断するかまたは前記HSD17B13遺伝子の発現を変更する、方法。
(項目36)
(a)前記第1のガイドRNA標的配列が、配列番号20~81および259~263のいずれか1つを含み、必要に応じて、前記第1のガイドRNA標的配列が、配列番号20~41のいずれか1つ、配列番号21~23、33、および35のいずれか1つ、または配列番号33および35のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第1のガイドRNAが、配列番号1423~1484および1643~1647のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、必要に応じて、前記第1のガイドRNAが、配列番号1447~1468のいずれか1つ、配列番号1448~1450、1460、および1462のいずれか1つ;または配列番号1460および1462のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第1のガイドRNAが、配列番号500~561、730~791、960~1021、1190~1251、720~724、950~954、1180~1184、および1410~1414のいずれか1つを含み、必要に応じて、前記第1のガイドRNAが、配列番号524~545、754~775、984~1005、および1214~1235のいずれか1つ、または配列番号295~297、525~527、755~757、985~987、1215~1217、307、309、537、539、767、769、997、999、1227、および1229のいずれか1つ、または配列番号307、309、537、539、767、769、997、999、1227、および1229のいずれか1つを含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
(a)前記Casタンパク質が、ヌクレアーゼ-活性Casタンパク質である;または
(b)前記Casタンパク質が、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメインと融合したヌクレアーゼ-不活性Casタンパク質である、項目35または36のいずれかに記載の方法。
(項目38)
前記細胞のゲノムを、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記HSD17B13遺伝子内の第2のガイドRNA標的配列を標的とする第2のガイドRNAと接触させるステップをさらに含み、前記第2のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の終止コドンを含むか、または前記終止コドンから約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、または1,000ヌクレオチドの範囲内であり、前記細胞が、前記第1のガイドRNA標的配列と前記第2のガイドRNA標的配列との間に欠失を含むように改変されている、項目35から37までのいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
(a)前記第2のガイドRNA標的配列が、配列番号82~225のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第2のガイドRNAが、配列番号1485~1628のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第2のガイドRNAが、配列番号562~705、792~935、1022~1165、および1252~1395のいずれか1つを含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
細胞内のHSD17B13遺伝子の発現を低減するための方法であって、前記細胞のゲノムを、配列番号4(HSD17B13転写産物A)内の配列とハイブリダイズし、HSD17B13転写産物Aの発現を低減するアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAと接触させるステップを含む、方法。
(項目41)
前記アンチセンスRNA、前記siRNA、または前記shRNAが、配列番号7(HSD17B13転写産物D)には存在しない配列番号4(HSD17B13転写産物A)に存在する配列とハイブリダイズし、必要に応じて、前記アンチセンスRNA、前記siRNA、または前記shRNAが、配列番号4(HSD17B13転写産物A)のエクソン6とエクソン7との境界にまたがる配列とハイブリダイズする、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記細胞に発現ベクターを導入するステップをさらに含み、前記発現ベクターが、組換えHSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えHSD17B13遺伝子を含み、必要に応じて、前記組換えHSD17B13遺伝子がヒト遺伝子である、項目35から41までのいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記組換えHSD17B13遺伝子が、前記遺伝子の1つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型HSD17B13遺伝子に対して欠失しているHSD17B13ミニ遺伝子であり、必要に応じて、前記欠失したセグメントが、1つまたは複数のイントロン配列を含み、必要に応じて、前記HSD17B13ミニ遺伝子が、配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のイントロン6に対応するイントロンを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記細胞に発現ベクターを導入するステップをさらに含み、前記発現ベクターが、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるHSD17B13タンパク質をコードする核酸を含み、必要に応じて、前記HSD17B13タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号7と最適にアラインメントした場合、配列番号7(HSD17B13転写産物D)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、項目35から41までのいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記細胞にHSD17B13タンパク質またはその断片を導入するステップをさらに含み、前記HSD17B13タンパク質またはその断片が、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、項目35から41までのいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記Casタンパク質がCas9である、項目28から45までのいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
細胞を改変するための方法であって、前記細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、組換えHSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えHSD17B13遺伝子を含み、必要に応じて、前記組換えHSD17B13遺伝子がヒト遺伝子である、方法。
(項目48)
前記組換えHSD17B13遺伝子が、前記遺伝子の1つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型HSD17B13遺伝子に対して欠失しているHSD17B13ミニ遺伝子であり、必要に応じて、前記欠失したセグメントが、1つまたは複数のイントロン配列を含み、必要に応じて、前記HSD17B13ミニ遺伝子が、配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のイントロン6に対応するイントロンを含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
細胞を改変するための方法であって、前記細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるHSD17B13タンパク質をコードする核酸を含み、必要に応じて、前記HSD17B13タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号7と最適にアラインメントした場合、配列番号7(HSD17B13転写産物D)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、方法。
(項目50)
細胞を改変するための方法であって、前記細胞にHSD17B13タンパク質またはその断片を導入するステップを含み、前記HSD17B13タンパク質またはその断片が、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、方法。
(項目51)
前記細胞が、齧歯類細胞、マウス細胞、またはラット細胞であり、必要に応じて、前記細胞が、多能性細胞または肝細胞である、項目28から50までのいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記細胞が、ヒト細胞であり、必要に応じて、前記細胞が、肝細胞である、項目28から50までのいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記細胞が、ex vivoまたはin vivoにある、項目28から52までのいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に、
(a)Casタンパク質または前記Casタンパク質をコードする核酸;
(b)ガイドRNAまたは前記ガイドRNAをコードする核酸であって、前記ガイドRNAが、前記Casタンパク質と複合体を形成し、HSD17B13遺伝子内のガイドRNA標的配列を標的とし、前記ガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ガイドRNAまたは前記ガイドRNAをコードする核酸;および
(c)配列番号2の12666位に対応する位置の5’側の標的配列とハイブリダイズする5’相同アーム、配列番号2の12666位に対応する位置の3’側の標的配列とハイブリダイズする3’相同アーム、および前記5’相同アームと前記3’相同アームに挟まれたチミンを含む核酸挿入物を含む外因性ドナー配列
を導入するステップを含み、
前記Casタンパク質が、前記対象の肝細胞内で前記HSD17B13遺伝子を切断し、前記外因性ドナー配列が、前記肝細胞内で前記HSD17B13遺伝子と組換えられ、前記外因性ドナー配列が前記HSD17B13遺伝子と組換えられると、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に前記チミンが挿入される、方法。
(項目55)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に、
(a)Casタンパク質または前記Casタンパク質をコードする核酸;
(b)第1のガイドRNAまたは前記第1のガイドRNAをコードする核酸であって、前記第1のガイドRNAが、前記Casタンパク質と複合体を形成し、HSD17B13遺伝子内の第1のガイドRNA標的配列を標的とし、前記第1のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の開始コドンを含むか、または前記開始コドンから約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、または1,000ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号20~81から選択される、第1のガイドRNAまたは前記第1のガイドRNAをコードする核酸;および
(c)組換えHSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えHSD17B13遺伝子を含む発現ベクター
を導入するステップを含み、
前記Casタンパク質が、前記対象の肝細胞内で前記HSD17B13遺伝子を切断するか、またはその発現を変更し、前記発現ベクターが、前記対象の前記肝細胞内で前記組換えHSD17B13遺伝子を発現する、方法。
(項目56)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に、前記対象の肝細胞内で配列番号4(HSD17B13転写産物A)内の配列とハイブリダイズし、HSD17B13転写産物Aの発現を低減するアンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAを導入するステップを含む、方法。
(項目57)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、組換えHSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えHSD17B13遺伝子を含み、前記発現ベクターが、前記対象の肝細胞内で前記組換えHSD17B13遺伝子を発現する、方法。
(項目58)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるHSD17B13タンパク質をコードする核酸を含み、前記発現ベクターが、前記対象の肝細胞内で前記HSD17B13タンパク質をコードする前記核酸を発現する、方法。
(項目59)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象にメッセンジャーRNAを導入するステップを含み、前記メッセンジャーRNAが、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるHSD17B13タンパク質をコードし、前記mRNAが、前記対象の肝細胞内で前記HSD17B13タンパク質を発現する、方法。
(項目60)
HSD17B13 rs72613567バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象の肝臓にHSD17B13タンパク質またはその断片を導入するステップを含み、前記HSD17B13タンパク質またはその断片が、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、方法。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。
I.概要
アラニンおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼレベルの低下;非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌を含めた慢性肝疾患のリスクの低下;ならびに単純な脂肪症からより臨床的に進行した段階の慢性肝疾患への進行の低減に関連することが発見されたHSD17B13バリアントが本明細書において提示される。以前に同定されていない、バリアントに関連するHSD17B13遺伝子の転写産物も本明細書において提示される。
HSD17B13のバリアントに関連する単離された核酸およびタンパク質(水酸化ステロイド17-ベータデヒドロゲナーゼ13、17-ベータ-水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ13、17β-水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ-13、17β-HSD13、短鎖デヒドロゲナーゼ/レダクターゼ9、SCDR9、HMFN0376、NIIL497、およびSDR16C3としても公知)が本明細書において提示される。ヒトHSD17B13遺伝子は、およそ19kbの長さであり、ゲノム内の4q22.1に位置する7つのエクソンおよび6つのイントロンを含む。例示的なヒトHSD17B13タンパク質配列には、UniProt受託番号Q7Z5P4(配列番号240および241;それぞれQ7Z5P4-1およびQ7Z5P4-2)およびNCBI Reference Sequence番号NP_835236およびNP_001129702(それぞれ配列番号242および243)が割り当てられる。例示的なヒトHSD17B13 mRNAには、NCBI Reference Sequence番号NM_178135およびNM_001136230(それぞれ配列番号244および245)が割り当てられる。
HSD17B13バリアントおよびバリアントHSD17B13転写産物に関連する単離された核酸が本明細書に開示される。本明細書に開示される核酸のいずれかとストリンジェントなまたは中等度の条件でハイブリダイズする単離された核酸も開示される。そのような核酸は、例えば、HSD17B13バリアントタンパク質を発現させるのに、または、それぞれが本明細書の他の箇所に詳しく記載されているプライマー、プローブ、外因性ドナー配列、ガイドRNA、アンチセンスRNA、shRNA、およびsiRNAとして有用であり得る。
HSD17B13遺伝子の少なくとも15個連続したヌクレオチドを含み、HSD17B13 rs72613567バリアントと最適にアラインメントした場合、HSD17B13 rs72613567バリアント(配列番号2)の12666位に対応する位置にチミンを有する(または12666位および12667位に対応する位置にチミンを有する)単離された核酸が本明細書に開示される。すなわち、HSD17B13遺伝子の少なくとも15個連続したヌクレオチドを含み、野生型HSD17B13遺伝子と最適にアラインメントした場合、野生型HSD17B13遺伝子(配列番号1)の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む単離された核酸が本明細書に開示される。そのような単離された核酸は、例えば、HSD17B13バリアント転写産物およびタンパク質を発現させるのに、または外因性ドナー配列として有用であり得る。そのような単離された核酸は、例えば、ガイドRNA、プライマー、およびプローブとしても有用であり得る。
HSD17B13 rs72613567バリアントと最適にアラインメントした場合、HSD17B13 rs72613567バリアント(配列番号2)の12666位または12666位および12667位に対応する位置を含むかまたはそれから1000、500、400、300、200、100、50、45、40、35、30、25、20、15、10、または5ヌクレオチドの範囲内であるセグメントでHSD17B13遺伝子(例えば、HSD17B13ミニ遺伝子)とハイブリダイズする少なくとも15個連続したヌクレオチドを含む単離された核酸も本明細書に開示される。そのような単離された核酸は、例えば、ガイドRNA、プライマー、プローブ、または外因性ドナー配列として有用であり得る。
転写産物A~Hのいずれか1つと最適にアラインメントした場合、転写産物A~H(それぞれ配列番号4~11)、特に転写産物C~Hのいずれか1つに対応するmRNA転写産物またはcDNAの全部または一部に対応する核酸も提供される。集団内の遺伝子配列およびそのような遺伝子から転写されるmRNA配列は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。各転写産物について本明細書において提示される配列は、単に例示的な配列である。他の配列も可能である。具体的な非限定的な例を以下に提示する。そのような単離された核酸は、例えば、HSD17B13バリアント転写産物およびタンパク質を発現させるのに有用であり得る。
転写産物A~Hのいずれか1つと最適にアラインメントした場合、転写産物A~H(それぞれ配列番号4~11)、特に転写産物C~Hのいずれか1つに対応するmRNA転写産物またはcDNAのセグメントとハイブリダイズする核酸も提供される。具体的な非限定的な例を以下に提示する。そのような単離された核酸は、例えば、プライマー、プローブ、アンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAとして有用であり得る。
本明細書に開示される核酸のいずれかおよび異種核酸を含むベクターも提供される。ベクターは、核酸を運搬することが可能なウイルスまたは非ウイルスベクターであってよい。一部の場合では、ベクターは、プラスミド(例えば、追加的なDNAセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖DNA)であってよい。一部の場合では、ベクターは、ウイルスベクターであってよく、追加的なDNAセグメントをウイルスゲノム内にライゲーションすることができる。一部の場合では、ベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる(例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他の場合では、ベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」と称され得る。そのようなベクターはまた、本明細書の他の箇所で開示される標的化ベクター(すなわち、外因性ドナー配列)の場合もある。
単離されたHSD17B13タンパク質およびその断片、特に、HSD17B13 rs72613567バリアントによって生じるHSD17B13タンパク質およびその断片が本明細書に開示される。
単離されたHSD17B13タンパク質およびその断片、特に、HSD17B13 rs72613567バリアントによって生じるHSD17B13タンパク質およびその断片、または特に、HSD17B13アイソフォームC、D、E、F、F’、G、およびHが本明細書に開示される。そのようなタンパク質としては、例えば、HSD17B13アイソフォームC、D、E、F、F’、G、もしくHまたはその断片の少なくとも5個、6個、8個、10個、12個、14個、15個、16個、18個、20個、22個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、または300個連続したアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを挙げることができる。集団内の遺伝子配列およびそのような遺伝子によってコードされるタンパク質は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。各HSD17B13アイソフォームについて本明細書において提示される配列は、単に例示的な配列である。他の配列も可能である。例えば、単離されたポリペプチドは、それぞれアイソフォームC、D、E、F、F’、G、またはHと最適にアラインメントした場合、HSD17B13アイソフォームC、D、E、F、F’、G、またはHと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列(例えば、連続したアミノ酸の配列)を含む。必要に応じて、単離されたポリペプチドは、HSD17B13アイソフォームC、D、E、F、F’、G、またはHと同一である配列を含む。
本明細書に開示されるHSD17B13タンパク質またはその断片のいずれかを作製する方法も開示される。そのようなHSD17B13タンパク質またはその断片は、任意の適切な方法で作製することができる。例えば、HSD17B13タンパク質またはその断片を、そのようなHSD17B13タンパク質またはその断片をコードする核酸(例えば、組換え発現ベクター)を含む宿主細胞から作製することができる。そのような方法は、HSD17B13タンパク質またはその断片をコードする核酸(例えば、組換え発現ベクター)を含む宿主細胞を培養し、それにより、HSD17B13タンパク質またはその断片を作製するステップを含み得る。核酸を宿主細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができ、核酸が発現する条件下で培養を行うことができる。そのような方法は、発現したHSD17B13タンパク質またはその断片を回収するステップをさらに含み得る。回収するステップは、HSD17B13タンパク質またはその断片を精製することをさらに含み得る。
本明細書に開示される核酸およびタンパク質のいずれかを含む細胞(例えば、組換え宿主細胞)も本明細書において提示される。細胞は、in vitro、ex vivo、またはin vivoにあってよい。核酸をプロモーターおよび他の制御配列に連結し、したがって、それらを発現させて、コードされるタンパク質を作製することができる。任意の細胞型が提供される。
ヌクレアーゼ作用剤、外因性ドナー配列、転写活性化因子、転写リプレッサー、アンチセンスRNA、siRNA、およびshRNAなどのアンチセンス分子、HSD17B13タンパク質またはその断片、およびHSD17B13タンパク質をコードする組換えHSD17B13遺伝子または核酸を発現するための発現ベクターの任意の組合せを使用することによって細胞を改変するための種々の方法が提供される。当該方法は、in vitro、ex vivo、またはin vivoにおいて行うことができる。ヌクレアーゼ作用剤、外因性ドナー配列、転写活性化因子、転写リプレッサー、アンチセンスRNA、siRNA、およびshRNAなどのアンチセンス分子、HSD17B13タンパク質またはその断片、ならびに発現ベクターを細胞に任意の形態で本明細書の他の箇所に記載の任意の手段によって導入することができ、また、全部または一部を任意の組合せで同時にまたは逐次的に導入することができる。一部の方法は、細胞内の内因性HSD17B13遺伝子を変更するステップのみを伴う。一部の方法は、転写活性化因子またはリプレッサーを使用することによってか、またはアンチセンスRNA、siRNA、およびshRNAなどのアンチセンス分子を使用することによって内因性HSD17B13遺伝子の発現を変更するステップのみを伴う。一部の方法は、HSD17B13タンパク質をコードする組換えHSD17B13遺伝子もしくは核酸またはその断片を細胞に導入するステップのみを伴う。一部の方法は、細胞にHSD17B13タンパク質またはその断片を導入するステップのみを伴う(例えば、本明細書に開示されるHSD17B13タンパク質もしくはその断片のいずれか1つもしくはそれらの任意の組合せ、または本明細書に開示されるHSD17B13アイソフォームA~Hもしくはその断片のいずれか1つもしくはそれらの任意の組合せ)。例えば、そのような方法は、HSD17B13アイソフォームC、D、F、G、およびH(もしくはその断片)の1つもしくは複数を細胞に導入するステップ、またはHSD17B13アイソフォームD(もしくはその断片)を細胞に導入するステップを伴い得る。あるいは、そのような方法は、HSD17B13アイソフォームA、B、およびEもしくはアイソフォームA、B、E、およびF’(もしくはその断片)の1つもしくは複数を細胞に導入するステップ、またはHSD17B13アイソフォームA(もしくはその断片)を細胞に導入するステップを伴い得る。他の方法は、細胞内の内因性HSD17B13遺伝子を変更するステップと、HSD17B13タンパク質もしくはその断片またはHSD17B13タンパク質をコードする組換えHSD17B13遺伝子もしくは核酸またはその断片を細胞に導入するステップの両方を伴い得る。さらに他の方法は、細胞内の内因性HSD17B13遺伝子の発現を変更するステップと、HSD17B13タンパク質もしくはその断片またはHSD17B13タンパク質をコードする組換えHSD17B13遺伝子もしくは核酸またはその断片を細胞に導入するステップの両方を伴い得る。
ヌクレアーゼ作用剤および/または外因性ドナー配列を使用することによって細胞(例えば、多能性細胞または肝細胞などの分化細胞)内のゲノム内のHSD17B13遺伝子を改変するための種々の方法が提供される。当該方法は、in vitro、ex vivo、またはin vivoにおいて行うことができる。ヌクレアーゼ作用剤を、単独で使用することもでき、外因性ドナー配列と組み合わせて使用することもできる。あるいは、外因性ドナー配列を単独で使用することもでき、ヌクレアーゼ作用剤と組み合わせて使用することもできる。
本明細書に記載の方法を使用して標的化遺伝子改変の種々の型を導入することができる。そのような標的化改変としては、例えば、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、点突然変異、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、7個、8個、9個、10個またはそれよりも多くのヌクレオチドを変化させて(例えば、欠失させるか、挿入するか、または置換する)、標的化ゲノム改変を形成することができる。欠失、挿入、または置換は、本明細書の他の箇所で開示される通り、任意のサイズのものであってよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら(2013年)Cell、153巻:910~918頁;Mandalosら(2012年)PLOS ONE 7巻:e45768:1~9頁;およびWangら(2013年)Nat Biotechnol.、31巻:530~532頁を参照されたい。
本明細書に開示される方法は、改変されたHSD17B13遺伝子を有する細胞を同定するステップをさらに含み得る。種々の方法を使用して、欠失または挿入などの標的化遺伝子改変を有する細胞を同定することができる。そのような方法は、HSD17B13遺伝子に標的化遺伝子改変を有する1つの細胞を同定するステップを含み得る。スクリーニングを行って、改変されたゲノム遺伝子座を有するそのような細胞を同定することができる。
B.HSD17B13核酸の発現を変更する方法
本明細書に開示される核酸およびタンパク質は、任意の手段によって細胞に導入することができる。「導入すること」は、核酸またはタンパク質を、当該配列が細胞の内部に進入するように細胞にもたらすことを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、構成成分の1つまたは複数(例えば、構成成分のうちの2つ、または構成成分の全て)を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞に導入することができる。例えば、外因性ドナー配列をヌクレアーゼ作用剤の導入前に導入することもでき、ヌクレアーゼ作用剤の導入後に導入することもできる(例えば、外因性ドナー配列をヌクレアーゼ作用剤の導入の約1、2、3、4、8、12、24、36、48、もしくは72時間前、または約1、2、3、4、8、12、24、36、48、もしくは72時間後に投与することができる)。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2015/0240263およびUS2015/0110762を参照されたい。細胞のゲノムをヌクレアーゼ作用剤または外因性ドナー配列と接触させることは、1つもしくは複数のヌクレアーゼ作用剤もしくはヌクレアーゼ作用剤をコードする核酸(例えば、1つもしくは複数のCasタンパク質もしくは1つもしくは複数のCasタンパク質をコードする核酸、および1つもしくは複数のガイドRNAもしくは1つもしくは複数のガイドRNAをコードする核酸(すなわち、1つもしくは複数のCRISPR RNAおよび1つもしくは複数のtracrRNA))ならびに/または1つもしくは複数の外因性ドナー配列を細胞に導入することを含み得る。細胞のゲノムを接触させること(すなわち、細胞を接触させること)は、上記の構成成分のうちの1つのみ、構成成分のうちの1つもしくは複数、または全ての構成成分を細胞に導入することを含み得る。
所望の標的配列内にニックもしくは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤または所望の標的配列に結合する任意のDNA結合タンパク質を本明細書に開示される方法および組成物に使用することができる。ヌクレアーゼ作用剤が所望の標的配列内にニックまたは二本鎖切断を誘導する限りは、天然に存在するまたはネイティブなヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。同様に、DNA結合タンパク質が所望の標的配列に結合する限りは、天然に存在するまたはネイティブなDNA結合タンパク質を使用することができる。あるいは、改変されたまたは工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質を使用することができる。「工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質」は、ネイティブな形態から、所望の標的配列を特異的に認識するように工学的に操作された(改変または誘導された)ヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質を含む。したがって、工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質は、ネイティブな、天然に存在するヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質に由来してもよく、人工的に創出または合成することもできる。工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質は標的配列を認識することができ、例えば、標的配列は、ネイティブな(工学的に操作されていないまたは改変されていない)ヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質によって認識されていた配列ではない。ヌクレアーゼ作用剤またはDNA結合タンパク質の改変は、タンパク質切断作用剤の1アミノ酸または核酸切断作用剤の1ヌクレオチドの小ささであり得る。標的配列または他のDNAにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、標的配列または他のDNAを「カットすること」または「切断すること」と称され得る。
本明細書に開示される方法では、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)系またはそのような系の構成成分を利用して細胞内のゲノムを改変することができる。CRISPR-Cas系は、転写産物およびCas遺伝子の発現に関与する、またはCas遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。CRISPR-Cas系は、I型、II型、またはIII型系であり得る。あるいは、CRISPR/Cas系は、例えば、V型系(例えば、V-A亜型またはV-B亜型)であり得る。本明細書に開示される方法および組成物では、核酸の部位特異的切断のためにCRISPR複合体(Casタンパク質と複合体を形成したガイドRNA(gRNA)を含む)を利用することによってCRISPR-Cas系を使用することができる。
Casタンパク質は、一般に、ガイドRNA(gRNA、下でより詳細に記載されている)と相互作用し得る少なくとも1つのRNA認識または結合ドメインを含む。Casタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン(例えば、DNaseまたはRNaseドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Cas9タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Cpf1タンパク質(例えば、FnCpf1)は5ヌクレオチド5’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のPAM配列から18番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の23番目の塩基の後ろで起こる。Casタンパク質は、HSD17B13遺伝子に二本鎖切断(例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断)を創出させるのに十分な切断活性を有してもよく、HSD17B13遺伝子において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
「ガイドRNA」または「gRNA」は、Casタンパク質(例えば、Cas9タンパク質)に結合し、Casタンパク質を標的DNA(例えば、HSD17B13遺伝子)内の特定の場所にターゲティングするRNA分子である。特に、Cas酵素を、HSD17B13遺伝子座またはHSD17B13遺伝子に結合するか、またはそれを切断するように方向付けるのに有効なガイドRNAが本明細書に開示される。1つの例示的なガイドRNAは、Cas酵素を、HSD17B13遺伝子に結合するか、またはそれを切断するように方向付けるのに有効なガイドRNAであって、HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、HSD17B13遺伝子内のガイドRNA認識配列とハイブリダイズする(すなわち、ガイドRNA標的配列を標的とする)DNA標的化セグメントを含む、ガイドRNAである。ガイドRNA標的配列を標的とするとは、非相補鎖上のガイドRNA標的配列の逆相補物である相補鎖配列とハイブリダイズすることを意味する。例えば、ガイドRNA標的配列は、HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2の12666位に対応する位置から約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、または1,000ヌクレオチドの範囲内の場合がある。他の例示的なガイドRNAは、HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のエクソン6および/またはイントロン6に対応する領域内である、HSD17B13遺伝子内のガイドRNA標的配列を標的とするDNA標的化セグメントを含む。他の例示的なガイドRNAは、HSD17B13遺伝子を配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のエクソン6および/またはイントロン6および/またはエクソン7に対応する領域内である、HSD17B13遺伝子内のガイドRNA標的配列を標的とするDNA標的化セグメントを含む。他の例示的なガイドRNAは、HSD17B13遺伝子の開始コドンを含むかもしくはそれに近接しているまたはHSD17B13遺伝子の終止コドンを含むかもしくはそれに近接している、HSD17B13遺伝子内のガイドRNA認識配列とハイブリダイズする(すなわち、ガイドRNA標的配列を標的とする)DNA標的化セグメントを含む。例えば、ガイドRNA標的配列は、開始コドンから約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、もしくは1,000ヌクレオチドの範囲内、または終止コドンから約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、もしくは1,000ヌクレオチドの範囲内の場合がある。例えば、ガイドRNA標的配列は、HSD17B13遺伝子を配列番号1または2と最適にアラインメントした場合、配列番号1または2のエクソン1に対応する領域の範囲内の場合がある。同様に、ガイドRNA標的配列は、HSD17B13遺伝子を配列番号1または2と最適にアラインメントした場合、配列番号1または2のエクソン7に対応する領域の範囲内の場合がある。HSD17B13遺伝子は、任意の生物体に由来するHSD17B13遺伝子であってよい。例えば、HSD17B13遺伝子は、ヒトHSD17B13遺伝子または非ヒト哺乳動物、齧歯類、マウス、またはラットなどの別の生物体に由来するオルソログであってよい。
「ガイドRNA認識配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在すればgRNAのDNA標的化セグメントが結合する標的DNA(例えば、HSD17B13遺伝子)に存在する核酸配列を包含する。ガイドRNA認識配列という用語は、本明細書で使用される場合、標的二本鎖DNAの両方の鎖(すなわち、ガイドRNAがハイブリダイズする相補鎖上の配列、およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する非相補鎖上の対応する配列)を包含する。「ガイドRNA標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、PAMに隣接する非相補鎖上(すなわち、PAMの上流または5’側)の配列を指す。すなわち、ガイドRNA標的配列は、ガイドRNAがハイブリダイズする相補鎖上の配列に対応する非相補鎖上の配列を指す。ガイドRNA標的配列は、ガイドRNAのDNA標的化セグメントと等しいが、ウラシルの代わりにチミンである。一例として、Cas9酵素に対するガイドRNA標的配列は、5’-NGG-3’PAMに隣接する非相補鎖上の配列を指すことになる。ガイドRNA認識配列は、ガイドRNAが相補性を有するように設計された配列を含み、ガイドRNA認識配列の相補鎖とガイドRNAのDNA標的化配列のハイブリダイゼーションにより、CRISPR複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドRNA認識配列またはガイドRNA標的配列は、下でより詳細に記載されているCasタンパク質の切断部位も含む。ガイドRNA認識配列またはガイドRNA標的配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書に開示される方法および組成物では、HSD17B13遺伝子の切断を伴わずに、またはヌクレアーゼ作用剤を用いたHSD17B13遺伝子の切断後に、HSD17B13遺伝子を改変するために外因性ドナー配列(例えば、標的化ベクターまたは修復鋳型)を利用することができる。外因性ドナー配列は、標的配列との部位特異的組換えを可能にするために必要なエレメントを含む任意の核酸またはベクターを指す。外因性ドナー配列をヌクレアーゼ作用剤と組み合わせて使用することにより、相同組換え修復を促進することによってHSD17B13遺伝子内でのより厳密な改変をもたらすことができる。
一部の外因性ドナー配列は、標的ゲノム遺伝子座における(例えば、HSD17B13遺伝子における)ヌクレアーゼ媒介性またはCasタンパク質媒介性切断によって創出される1つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を5’末端および/または3’末端に有する。これらの突出部は、5’および3’相同アームとも称され得る。例えば、一部の外因性ドナー配列は、標的ゲノム遺伝子座の5’および/または3’標的配列におけるCasタンパク質媒介性切断によって創出される1つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を5’末端および/または3’末端に有する。一部のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を5’末端のみに有するかまたは3’末端のみに有する。例えば、一部のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を、標的ゲノム遺伝子座の5’標的配列において創出される突出部に相補的な5’末端のみに有するかまたは標的ゲノム遺伝子座の3’標的配列において創出される突出部に相補的な3’末端のみに有する。他のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を5’および3’末端の両方に有する。例えば、他のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を5’および3’末端の両方に有し、これらは、例えば、それぞれ標的ゲノム遺伝子座におけるCas媒介性切断によって生じる第1および第2の突出部に相補的である。例えば、外因性ドナー配列が二本鎖である場合、一本鎖の相補的な領域を、ドナー配列の上鎖の5’末端およびドナー配列の下鎖の5’末端から伸長させ、それにより、各末端に5’突出部を創出することができる。あるいは、一本鎖の相補的な領域をドナー配列の上鎖の3’末端および鋳型の下鎖の3’末端から伸長させ、それにより、3’突出部を創出することができる。
一部の外因性ドナー配列(すなわち、標的化ベクター)は、相同アームを含む。外因性ドナー配列が核酸挿入物も含む場合、相同アームにより核酸挿入物が挟まれていてよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを5’および3’(すなわち、上流および下流の)相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー配列内の核酸挿入物に対する相同アームの相対的な位置に関する。5’および3’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「5’標的配列」および「3’標的配列」と称されるHSD17B13遺伝子内の領域に対応する。
内因性HSD17B13遺伝子の発現を改変または変更するための本明細書に開示される方法を使用した、慢性肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。内因性HSD17B13遺伝子の発現を改変または変更するための本明細書に開示される方法を使用した、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患などの肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。HSD17B13 mRNA転写産物の発現を低減するための方法を使用するか、または、対象にHSD17B13タンパク質をコードする組換え核酸を提供するか、HSD17B13タンパク質をコードするmRNAを提供するかもしくはHSD17B13タンパク質を提供するための方法を使用した、慢性肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。HSD17B13 mRNA転写産物の発現を低減するための方法を使用するか、または、対象にHSD17B13タンパク質をコードする組換え核酸を提供するか、HSD17B13タンパク質をコードするmRNAを提供するかもしくはHSD17B13タンパク質を提供するための方法を使用した、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患などの肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。方法は、1つまたは複数の核酸またはタンパク質を対象に、対象の肝臓に、または対象の細胞(例えば、肝細胞)に(例えば、in vivoまたはex vivoにおいて)導入するステップを含み得る。
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端から始まり、フォワード方向に(すなわち、各線の左から右に)3’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に(すなわち、各線の左から右に)カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
17ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ13バリアントは慢性肝疾患に対して保護する
慢性肝疾患および肝硬変は、米国における疾病率死亡率の主因である(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kochanekら(2016年)Natl Vital Stat Rep 65巻:1~122頁)。肝硬変の最も一般的な病因は、アルコール性肝疾患、慢性C型肝炎、および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)であると共に、肝移植を待っている患者の約80%を占める(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wongら(2015年)Gastroenterology 148巻:547~555頁)。注目すべきことに、米国におけるNAFLDの推定有病率は、19~46パーセントであり(それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Browningら(2004年)Hepatology 40巻:1387~1395頁;Lazoら(2013年)Am J Epidemiol 178巻:38~45頁;およびWilliamsら(2011年)Gastroenterology 140巻:124~131頁)、おそらく肥満症の率の増大と関連して、時間と共に上昇している(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Younossiら(2011年)Clin Gastroenterol Hepatol 9巻:524~530e1頁;quiz e60(2011年))。今まで、NAFLDの進行および転帰における個体間変動に関しては依然として非常に不安定である;基礎となる遺伝的因子の知識は、リスク階層化を改善し、新規治療戦略のための基礎を提供することができる。ここで、本発明者らは、HSD17B13(ヒドロキシステロイド-17-ベータデヒドロゲナーゼ13をコードする)におけるスプライスバリアントの保因者は、アルコール性および非アルコール性肝疾患のリスクが低く、NAFLD進行のリスクが低いことを示す。DiscovEHR研究における46,544人の欧州祖先参加者に由来する電子カルテにリンクされた全エクソーム配列データの関連研究は、アラニントランスアミナーゼおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼレベルの低下と関連するHSD17B13(rs72613567)中のスプライスバリアントの同定をもたらした;これらの知見を、12,528人の個体を含む3つの別々のコホートにおいて再現した。ディスカバリーコホートにおいて、HSD17B13バリアントは、アルコール性および非アルコール性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌のリスクの低下と関連していた。肥満外科手術コホートにおいては、バリアントは、脂肪症を有する個体における組織病理学的脂肪性肝炎のリスクの低下と関連していた。肥満外科手術コホートに由来するヒト肝臓試料のRNA配列決定により、スプライスバリアントのホモ接合体保因者が、トランケートされたHSD17B13アイソフォームをコードする新規転写産物を主に発現することが示された。これらの知見は、肝疾患進行の促進におけるHSD17B13の役割、ならびに脂肪性肝炎および肝硬変のための治療標的としてのその可能性に新しい光明を投じるものである。
研究の参加者。ヒト遺伝学研究を、Regeneron Genetics Centerと、Geisinger Health System(GHS)とのDiscovEHR共同研究の一部として行った。研究は、GHS Institutional Review Boardによって認可された。2つのDiscovEHR研究集団(ディスカバリーコホートおよび肥満外科手術コホート)は、MYCODE(登録商標)Community Health Initiative of GHSに由来する18歳以上の年齢の最初の50,726人の同意した参加者が起源であった(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deweyら(2016年)Science 354巻(6319頁)doi:10.1126/science.aaf6814)。GHSディスカバリーコホートは、肥満外科手術コホートに募集された全ての人を除く、2007年~2016年に外来初期診療および専門クリニックから募集した46,544人の欧州系の個体からなっていた。GHS肥満外科手術コホートは、肥満外科手術を勧められた2,644人の欧州系の個体からなっていた。
HSD17B13 mRNAおよびHSD17B13タンパク質発現に対するrs72613567:TAの効果
遺伝子の公知および新規の転写産物の発現に対するHSD17B13 rs72613567:TA対立遺伝子の効果を検査した。RNA配列決定を使用して、HSD17B13 rs72613567スプライスバリアントの22のT/Tホモ接合体、30のT/TAヘテロ接合体、および17のTA/TAホモ接合体保因者に由来する組織学的に正常な肝臓試料中でのHSD17B13 mRNA発現を評価した。2つの公知のHSD17B13転写産物AおよびBに加えて、2つの新規転写産物が同定された:エクソン6を欠く転写産物C、およびタンパク質の早期トランケーションをもたらすと予測される、エクソン6の3’末端にグアニンヌクレオチドの挿入を含有する転写産物D。これらの転写産物を、RT-PCRおよびSanger配列決定によって検証した(データは示さない)。また、転写産物Dを、ロングリードcDNA配列決定を使用して検証した。これらの転写産物の発現レベルは、HSD17B13 rs72613567遺伝子型によって変化した;それぞれのTA対立遺伝子について、転写産物Aのレベルは減少したが、転写産物Dのレベルは対立遺伝子用量依存的様式で増加した(図3A、3Dおよび10Bを参照されたい)。完全長300アミノ酸タンパク質をコードする転写産物Aは、T/Tホモ接合体における優勢な転写産物であったが、早期にトランケートされたタンパク質をコードする転写産物Dは、TA/TAホモ接合体における優勢な転写産物であった。ヒト肝臓生検組織において、トランケートされたアイソフォームDタンパク質は、ヘテロ接合体およびTA/TAホモ接合体に最小限に存在し、アイソフォームAタンパク質の存在量は、対立遺伝子用量依存的様式で減少した(図10Bおよび10Cを参照されたい)。これらのデータは、ヒト肝臓における発現が実質的に減少したトランケートされた形態のタンパク質の合成をもたらす、HSD17B13 rs72613567選択的mRNAスプライシングと一致している。
17ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ13バリアントは慢性肝疾患に対して保護する
慢性肝疾患に寄与する遺伝的因子を同定するために、本発明者らは、DiscovEHRヒト遺伝学研究における46,544人の参加者に由来するエクソーム配列データおよび電子カルテを利用した。本発明者らは、慢性肝疾患と関連し得る候補を指名するために、肝損傷の確立されたバイオマーカー(血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST))と関連する遺伝子バリアントを同定した。続いて、3つのさらなるコホート(12,527人の個体)において再現する候補バリアントを、DiscovEHRおよび2つの独立したコホート(合計37,892人の個体)における慢性肝疾患の臨床診断との関連について評価した。本発明者らはまた、独立した肥満外科手術コホート(n=2,391のヒト肝臓試料)における肝疾患の組織病理学的重症度との関連を検査した。
ヒト遺伝学研究を、Regeneron Genetics CenterとGeisinger Health System(GHS)とのDiscovEHR共同研究の一部として行った。2つのDiscovEHR研究集団(ディスカバリーコホートと肥満外科手術コホート)は、MyCode(登録商標)Community Health Initiative of GHSに由来する18歳以上の年齢の最初の50,726人の同意した参加者が起源であった。GHSディスカバリーコホートは、肥満外科手術コホートに募集された全ての人を除く、2007年~2016年に外来初期診療および専門クリニックから募集した46,544人の欧州系の個体からなっていた。GHS肥満外科手術コホートは、肥満外科手術を勧められた2,644人の欧州系の個体からなっていた。
ALTおよびASTの臨床検査測定値を、GHSディスカバリーコホートおよび肥満外科手術コホートに由来する参加者のEHRから抽出した。ALTおよびASTの中央値を、2つまたはそれより多い測定値を有する全ての参加者について算出し、log10変換して、関連分析の前に分布を正規化した。
GHS肥満外科手術コホートは、欧州子孫の2,644人の個体からなっていた。肝臓のくさび状生検を、これらの個体の2,391人から肥満外科手術中に取得した。生検を、肝圧排または胃に対する外科手術の前に肝鎌状間膜の左に10cm、一貫して得た。生検を切片に分割し、一次切片を肝臓組織学的分析のために臨床病理学者に送達し(日常的な組織学的分析のために10%中性緩衝化ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、線維症の評価のためにマッソンのトリクロムで染色した)、残りの切片を研究生体バンク内に保存した(RNAlaterおよび/または液体窒素中で凍結した)。肝臓の組織学的分析を、経験のある病理学者によって行い、続いて、以下のように、NASH Clinical Research Networkスコアリングシステム(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kleinerら、Hepatology、2005年、41巻、1313~21頁)を使用して第2の経験のある病理学者によって再検討した:脂肪症等級0(5%未満の実質性病変)、1(5~33%未満)、2(34~66%未満)、および3(67%を超える);小葉炎症等級0(病巣なし)、等級1(軽度、200×視野あたり2個未満の病巣)、等級2(中等度、200×視野あたり2~4個の病巣)、等級3(重度、200×視野あたり4個を超える病巣);線維症ステージ0(なし)、ステージ1(類洞周囲または門脈周囲の線維症)、ステージ2(類洞周囲および門脈周囲の線維症)、ステージ3(架橋線維症)、およびステージ4(肝硬変)。これらの組織学的診断を使用して、以下の表現型:1)正常:脂肪症、NASHまたは線維症の証拠なし;2)単純脂肪肝:NASHまたは線維症の証拠がない脂肪症(等級に関係なく);3)NASH:小葉炎症もしくは肝細胞肥大の任意の存在(等級に関係なく)、または線維症の任意の存在(ステージに関係なく);4)線維症:線維症の任意の存在(ステージに関係なく)を定義した。
DiscovEHR研究、Dallas Heart Study、およびPenn Medicine Biobankにおける参加者のためのDNA試料調製および全エクソーム配列決定を、Regeneron Geneticsで実施した(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deweyら、Science In Press、2016年)。HSD17B13 rs72613567を、Dallas Liver StudyおよびDallas Pediatric Liver StudyにおいてTaqmanアッセイによってジェノタイピングした(および各遺伝子型の5人の個体においてSanger配列決定によって検証した)。
本発明者らは、線形混合モデルを使用して、トランスアミナーゼレベルとの関連について、1%未満の欠測データ率、1.0×10-6より大きいハーディー-ワインベルク平衡P値、および0.1%を超えるマイナー対立遺伝子頻度を示す502,219の二対立遺伝子バリアントを試験した。GHSディスカバリーコホートにおけるトランスアミナーゼとのエクソームワイドな有意な関連を有するバリアントについて(p<1×10-7)、本発明者らは、上記の欧州祖先再現研究において、関連分析およびメタ分析を実施した。本発明者らは、再現された関連を定義するために試験したバリアント数によって決定されたボンフェローニの有意性閾値を使用した。ディスカバリー研究および再現研究のメタ分析も実施した。本文中で報告される全てのP値は、対立遺伝子モデルに対応する。
本発明者らは、上記のように、GHSディスカバリーコホートから定義された慢性肝疾患表現型との関連について、肝臓酵素ExWASに由来する13の有意かつ再現された単一ヌクレオチドバリアントを分析した。本発明者らは、試験した13個のバリアントおよび2つの広い慢性肝疾患カテゴリー(アルコール性および非アルコール性)を説明するために、P<0.05/26(P<1.92×10-3)のボンフェローニの有意性閾値を使用した。HSD17B13 rs72613567バリアントを、上記のように、GHS肥満外科手術コホートに由来する組織病理学的に定義された肝臓表現型との関連についてさらに試験した。オッズ比を、年齢、年齢2、性別、BMI、および祖先の最初の4つの主成分について調整した後、ロジスティック回帰のFirthの罰則付き尤度法を使用して見積もった。遺伝子型オッズ比を、同じ共変量を使用してHSD17B13 rs72613567について見積もった。
本発明者らは、HSD17B13 rs72613567と、405の量的EHR由来身体計測値、バイタルサイン、検査値、心電図、心エコー図、および骨密度測定値、ならびにまた、3,168のEHR由来臨床診断との関連のフェノムワイド研究を実施した。連続外来患者測定値を有する個体に関する検査中央値を、個体内中央値に由来する3を超える標準偏差であったおそらく偽の値の除去後に算出した;最大値と最小値も算出した。次いで、本発明者らは、年齢、年齢2、性別、および祖先の最初の10の主成分について調整した後、全ての検査形質について残存形質を算出し、関連分析の前に適切な変換を適用した。ICD-9に基づく診断コードを、Dennyら(それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dennyら、Nature Biotechnology、2013年、31巻、1102~10頁およびDennyら、Bioinformatics、2010年、26巻、1205~10頁)によって提唱された改変型のグループ分けを使用して、階層的臨床疾患群および対応する対照に折り畳んだ。ICD-9に基づく診断には、以下の1つまたは複数:診断コードの問題リスト登録または別のカレンダー日に2つの別々の臨床エンカウンターについて入れられたエンカウンター診断コードが必要であった。
遺伝子関連分析を、GCTAソフトウェア、バージョン1.25.07およびPLINK、バージョン1.9.0を使用して実施した。分位点-分位点およびマンハッタンプロットを、Rソフトウェア、バージョン3.2.1(R Project for Statistical Computing)を使用して生成した。領域関連プロットを、LocusZoomを使用して生成した(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pruimら、Bioinformatics、2010年、26巻、2336~7頁)。
Agilent RNA Nano Bioanalyzerチップ上で総RNAを泳動することによって、RNAの品質および濃度を評価した;全試料は、8より大きいRNAインテグリティーナンバー(RIN)を有していた。ポリアデニル化されたRNA転写産物を、オリゴ(dT)25ビーズ(Thermo Fisher Scientific)を用いる2ラウンドの富化を使用して単離した。RNAcleanXPビーズ(Beckman Coulter)を用いて試料を精製および濃縮し、約140塩基対まで熱断片化した。ランダムヘキサマーを使用するSuperScriptIII逆転写酵素(Thermo Fisher Scientific)を用いて第1鎖合成を完了した;第2鎖合成中にdTTPをdUTPと置き換えた。ウラシルDNA-グリコシラーゼステップを追加したエクソームに関して上記された本発明者らの標準的なDNAライブラリー調製法に従って、試料をプロセッシングして、鎖特異的配列決定ライブラリーを生成した。
2つのミスマッチを許容するArrayStudio(登録商標)ソフトウェア(OmicSoft(登録商標)、Cary、NC)を使用して、リードをHuman.B38にマッピングした。2つの手法を使用して、新規HSD17B13転写産物を同定した。新規エクソン結合部を、ArrayStudioを使用してGencode v24に基づいて発見した。De novo転写産物アセンブリを、デフォルト設定でTrinity(v2.2.0)を使用して実行した。カスタム遺伝子モデルを構築して、HSD17B13の新規転写産物を組み込み、転写産物の量を、カスタム遺伝子モデルとのリードアライメントによって見積もった。全ての同定されたHSD17B13アイソフォームのタンパク質配列アラインメントを、図7Aおよび7Bに示す。ヒト肝臓試料に由来する総RNA上でのRT-PCRを、SuperScript(商標)One-Step RT-PCR Systemを、Platinum(商標)Taq DNAポリメラーゼ(ThermoFisher)と共に使用して実施した。それぞれ50μLのRT-PCR反応物は、1×反応ミックス、500nMのそれぞれのフォワードおよびリバースプライマー(PST516:ATGAACATCATCCTAGAAATCCTTC(配列番号251)およびPST517:ATCATGCATACATCTCTGGCTGGAG(配列番号252))、1μLのRT/Platinum Taq、および75ngのRNAを含有していた。サイクリング条件は、45℃で30分の1サイクル;94℃で2分の1サイクル;94℃で20秒、53℃で30秒、および72℃で90秒の40サイクル;72℃で5分の1サイクル;次いで、10℃で保持であった。生成物を、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、プライマーDE002(ATCAGAACTTCAGGCCTTGG(配列番号253))を使用する直接Sanger配列決定のために提出した。BおよびC転写産物を同定するために、RT-PCR生成物を、SYBR GoldSYBR(登録商標)Gold Nucleic Acid Gel Stain(ThermoFisher)で染色された2%アガロースゲル上で泳動し、予想分子量のバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した後、TOPO(登録商標)TA Cloning Kit(ThermoFisher)を用いるクローニングにかけた。TOPOクローンの配列決定を、M13FおよびM13R配列決定プライマーを使用して実施した。配列分析を、Sequencer DNA分析ソフトウェア(Gene Codes Corporation)を使用して実施した。完全長HSD17B13転写産物を、最初のエクソン(GCAAAGCCATGAACATCATCC(配列番号254))および最後のエクソン(TCTTGATGTAGTGGGAGTCGGATT(配列番号255))中の遺伝子特異的プライマーを使用する、Platinum Taq High Fidelityを含むSuperScript III One-step RT-PCR System(ThermoFisher Scientific)を用いて50ngの総RNAから直接増幅させて、約2.2kbのアンプリコン(最大予測サイズの転写産物)を生成した。アンプリコンを、Agilent Bioanalyzer上で検証した。PacBio互換性バーコードアダプターを、アンプリコンにライゲートし、PacBio PBビーズ(Pacific Biosciences)を用いて清浄化した。ライブラリーを等量でプールし、PacBio RSIIプラットフォーム上で180分間、1個のSMRTセル上で配列決定した。データを、PacBioソフトウェアsmrtanalysis v2.3 tool labelzmwを使用して脱多重化した後、ConsensusToolsAmpliconAnalysisを用いて分析した。得られるアンプリコンを、HSD17B13 RefSeq遺伝子と比較して、アイソフォームおよび遺伝子型状態を決定した。
HepG2細胞を、10%ウシ胎仔血清を添加したEagleの最少必須培地中で培養した。HSD17B13転写産物AおよびDを、Myc-DDK骨格レンチウイルス構築物中にサブクローニングし、レンチウイルスを生成した。HepG2細胞に、HSD17B13転写産物を担持するレンチウイルスを感染させた。それぞれのHSD17B13転写産物を発現する安定な細胞株を、完全培養培地中で2週間、1~3mg/mlのゲネチシンG-418硫酸塩を用いて選択した。固定後、HSD17B13アイソフォームを、マウス抗Myc抗体を用いて検出した。脂肪滴を、BODIPY FL色素(Sigma)で標識した。免疫蛍光のための二次抗体は、Alexa Fluor 488ロバ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 594ロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch)であった。
ヒト肝臓および細胞ペレット試料を、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤の混合物(ThermoFisher)の存在下で、氷冷1×RIPA溶解緩衝液(EMD Millipore)中でホモジェナイズした。上清を収集し、BCAタンパク質アッセイ(ThermoFisher)を使用してタンパク質濃度のために使用した。ヒト組織および細胞溶解物を、SDS/PAGEゲル(Bio-Rad)上にロードし、分離し、PVDF膜(Bio-Rad)に移した。膜を、0.1%Tween20(Bio-Rad)を添加した1×TBS中の5%(wt/vol)ミルクで1時間ブロックした。膜を、HSD17B13(1:200、Thermo-Fisher)およびB-アクチン(1:500、Cell Signaling Technology)に対して4℃で一晩、抗体と共にインキュベートした。結合した抗体を、HRPコンジュゲート化抗ウサギ抗体(1:10,000、Jackson ImmunoResearch)を使用して検出し、化学発光試薬(ThermoFisher)を使用して増強した。バンド強度を、Image Jソフトウェアを使用して定量した。
RNAを、TRIzol(登録商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して細胞から抽出した。第1鎖cDNAを、SuperscriptIII RT(Invitrogen)を使用して合成し、イントロン-スパニングプライマーに基づく半定量的PCRのために使用した。QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systemを使用して、転写産物の発現レベルを測定した。HSD17B13とTBPのプライマーは、IDT(Integrated DNA Technologies)から注文されたものであった。相対的遺伝子発現を、ΔΔCt法を用いて分析し、ハウスキーピング遺伝子TBPに対して正規化された発現の倍数変化(ΔCt)を提供した。
脂肪滴を、以前に報告されたように(それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brasaemle DL、Wolins NE.、Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation、Current protocols in cell biology 2006年;第3章:ユニット3 15およびDingら、Nature Protocols、2013年、8巻、43~51頁)、HSD17B13転写産物A(IsoA)または転写産物D(IsoD)を安定に発現するHepG2細胞から調製した。簡単に述べると、HSD17B13 IsoA、IsoDを安定に発現するHepG2細胞、または親細胞株を、1mMのオレイン酸と共に一晩インキュベートした。脂質負荷の後、細胞を掻き取り、1×Halt(商標)プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤(Thermo)を添加した低張性溶解緩衝液(20mM Tris、pH7.5、1mM EDTA)中に再懸濁し、50バールで8分間、キャビテーションによって溶解した。溶解物を1000g/4℃で10分間遠心分離し、核除去後上清(PNS)を、2mLの最終容量および20%の濃度まで超遠心分離管中でスクロースと混合した。次いで、1.5mLの5%スクロースおよび別の1.5mLの低張性溶解緩衝液を、溶解物の上に載せた。管を、182,000g/4℃で40分間遠心分離し、脂肪滴(LD)層を新しい管に移した。管中の残存容量を吸引し、ペレット(総膜、TM)を0.5mLの低張性溶解緩衝液中に再懸濁した。PNS、LD、およびTM画分を、1×ラジオイムノ沈降(RIPA)緩衝液(EMD)+NuPAGE(商標)LDS試料緩衝液(Thermo)およびβ-メルカプトエタノールと混合し、37℃で3時間、超音波処理した。TM溶解物を、2.5倍希釈して、PNSに対して正規化した。溶解物を、4~20%のSDS-PAGEゲル(Biorad)上で泳動し、Trans-Blot(Biorad)を使用して、低蛍光PVDF膜上に移し、Odyssey TBS Blocking緩衝液中で1時間ブロックした。膜を、以下の抗体:α-HSD17B13(Abgent、カタログ番号AP5729a 1:500);LDマーカー:α-ADRP(Proteintech、152-94-1-AP、1:2500);LDマーカー:α-TIP47(Proteintech、10694 1:2000);リソソームマーカー:α-LAMP1(Novus、NBP2-25183、1:1000);細胞質マーカー:α-GAPDH(Proteintech、60004-1-Ig、1:2000);小胞体マーカー:α-カルレティキュリン(Abcam、ab92516、1:1000);ミトコンドリアマーカー:α-COX IV(Abcam、ab33985、1:500);細胞骨格マーカー:α-アクチン(Sigma、A5441、1:4000)と共に一晩インキュベートした。次の日、膜を、Tris緩衝化食塩水+0.1%Tweenで4回洗浄した後、それぞれ、1:5,000および1:10,000の希釈率のIRDye(登録商標)α-ウサギ(800CW)およびα-マウス(680RD)二次抗体(Li-Cor)を含有するブロッキング緩衝液と共に、室温で1時間インキュベートした。ゲルをTBSTで再度洗浄し、Odysseyを使用して画像化した。
安定細胞に由来するトリグリセリド(TG)含量を、TG定量化キット(Abcam)を使用して決定した。このアッセイでは、TGは、遊離脂肪酸およびグリセロールに変換される。次いで、グリセロールは酸化されて、定量される生成物を生成する(λ=570nmでの分光測光)。
反応を、500μMのNAD+、5μMの生物活性脂質または50μMのステロイド(全て5%DMSO中での最終濃度)、および100ngの組換えヒトHSD17B13を含有する40μLの最終容量のアッセイ緩衝液(0.2M Tris-HCl、pH7.5)中で実施した。反応物を、23℃で3時間インキュベートした後、等量のNADH-Glo Detection Reagent(Promega)を添加した。23℃で1時間インキュベートした後、相対的光単位(RLU)を、Envision Plate Reader(Perkin Elmer)上で測定した。生のRLU値を、以下の式:対照のパーセント(POC)=100×(試料(RLU)-陰性CTRL平均)/(陽性CTRL平均-陰性CTRL平均)を使用して、陰性対照(5%DMSO)の減算後の対照(50μMエストラジオール)のパーセントとして正規化した。
組換えヒトHSD17B13タンパク質を、HSD17B13転写産物Aまたは転写産物Dを担持するプラスミドDNAで形質転換されたE.coli(Genscript)から精製した。HSD17B13バリアントは、C末端に10×Hisタグを含有し、Ni2+親和性精製を使用して可溶性画分から精製した。酵素活性を、NAD(P)H-Glo Detection System(Promega)を使用して、NADH産生の測定によって決定した。反応を、最終容量100μL中の0.2M Tris-HCl、pH7.5、0.5mM NAD+、75μMの基質(Sigma)および500ngの精製された酵素中、25℃で3時間実施した。インキュベーション後、20μLの反応物を、20μLのルシフェラーゼ試薬(Promega)と混合し、室温で1時間インキュベートし、Envision Plate Reader(Perkin Elmer)上で読み取った。
本発明者らは、DiscovEHR研究に由来する欧州子孫の46,544人の個体(「GHSディスカバリーコホート」;表6における基本人口統計)における血清ALTまたはASTレベルとの関連について、502,219の二対立遺伝子単一遺伝子バリアントを試験した。19個の遺伝子中の合計35個のバリアントが、P<1.0×10-7でALTまたはASTと関連することが見出された(図1Aおよび1B、ならびに表7)。本発明者らは、欧州祖先の個体の3つのコホート:1)DiscovEHRに由来する肥満外科手術患者(n=2,644)(「GHS肥満外科手術コホート」);2)Dallas Heart Studyに由来する1,357人の個体;および3)Penn Medicine Biobankに由来する8,526人の個体において再現研究を実施した。再現コホートのメタ分析において、9個の遺伝子中の13個のバリアントが、ALTまたはASTの血清レベルと有意に関連していた(試験した35のバリアントについて、P<1.43×10-3のボンフェローニの有意性閾値、表8)。これらのものは、PNPLA37、TM6SF211、SERPINA122、SAMM5023、およびERLIN124などの、トランスアミナーゼレベルの上昇と関連すると以前に報告されたバリアントを含んでいた。SERPINA1は、アルファ-1-抗トリプシンをコードし、その機能的欠損は、肝疾患を引き起こす;SAMM50との関連は、PNPLA3中の変化との連鎖不均衡によって媒介され、ERLIN1は肝臓の脂肪沈着に関与している。本発明者らはまた、肝疾患と関連すると以前には報告されなかったバリアントも同定した。これらのものは、それぞれ、ALTおよびASTをコードする遺伝子であるGPTおよびGOT1、ならびに溶質運搬ファミリー39メンバー12をコードするSLC39A12中にいくつかのバリアントを含んでいた。
次に、本発明者らは、ディスカバリーコホートおよび再現コホートにおいて見出された9個の遺伝子中の13個のトランスアミナーゼ関連バリアントと、アルコール性および非アルコール性(非ウイルス性)肝疾患を含む慢性肝疾患、ならびに最も進行した形態の慢性肝疾患:アルコール性肝硬変、非アルコール性肝硬変、および肝細胞癌(HCC)との関係を分析した。試験した13個のバリアントに関するP<1.92×10-3のボンフェローニの有意性閾値を使用して、本発明者らは、5個の遺伝子(HSD17B13、SERPINA1、TM6SF2、PNPLA3、およびSAMM50)における6個のバリアントと、慢性肝疾患表現型との間の有意な関連を見出した(表9)。SERPINA1、TM6SF2、PNPLA3、およびSAMM50の関連は、以前に報告された関連を確認するものである。ディスカバリーコホートにおいて、HSD17B13 rs72613567:TAは、対立遺伝子用量依存的様式で、アルコール性と非アルコール性肝疾患の両方のEHR由来カテゴリーのより低いオッズと関連していた(図2A):アルコール性肝疾患の全カテゴリー、ヘテロ接合体オッズ比(ORhet)(95%信頼区間)0.58(0.42~0.80)、ホモ接合体OR(ORhom)0.47(0.23~0.97)、対立遺伝子OR(ORallelic)0.62(0.48~0.81)、P=1.8×10-4;非アルコール性肝疾患の全カテゴリー、ORhet0.83(0.75~0.92)、ORhom0.70(0.57~0.87)、ORallelic0.84(0.78~0.91)、P=1.3×10-5。HSD17B13 rs72613567:TAはまた、アルコール性および非アルコール性肝硬変のより低いオッズとも関連し、ヘテロ接合体およびホモ接合体について、それぞれ、アルコール性肝硬変の42%および73%低いオッズ(ORhet 0.58(0.39~0.86)、ORhom 0.27(0.09~0.85)、ORallelic 0.56(0.41~0.78)、P=3.4×10-4)であり、ヘテロ接合体およびホモ接合体について、それぞれ、非アルコール性肝硬変の26%および49%低いオッズ(ORhet 0.74(0.60~0.93)、ORhom 0.51(0.31~0.85)、ORallelic 0.74(0.62~0.88)、P=4.5×10-4)であった。HSD17B13 rs72613567:TAはまた、HCCのより低いオッズと名目上関連していた。
NAFLDは、有意な炎症の証拠がない肝臓脂肪蓄積(単純脂肪肝)から、より臨床的に影響のあるNASHまでの疾患スペクトラムを記載する。HSD17B13 rs72613567:TAと、EHR由来肝疾患診断コードとの関連を確認するために、および脂肪症からNASHへの組織病理学的進行とのその関連をさらに理解するために、本発明者らは、GHS肥満外科手術コホートにおける関連の試験を実施した。肥満外科手術の時点で肝臓生検によって評価された全エクソーム配列決定された2,391人の個体のこのコホートにおいて、合計555人(23%)の個体が脂肪症、脂肪性肝炎、または線維症の証拠がなく(「正常」)、830人(35%)が単純脂肪肝を有し、1006人(42%)がNASHを有していた。遺伝子型によって正常な肝臓、単純脂肪肝、およびNASHの有病率を比較する場合、それぞれのTA対立遺伝子に関して、正常な肝臓の有病率は遺伝子型によって異ならないと考えられる(T/T、T/TA、およびTA/TA保因者について、それぞれ、23%、24%、および23%、割合における傾向に関するカイ二乗検定によるP=0.5)が、NASHの有病率は減少し(T/T、T/TA、およびTA/TA保因者について、それぞれ、45%、40%、および31%、P=1.6×10-4)、単純脂肪肝の有病率は増加する(T/T、T/TA、およびTA/TA保因者について、それぞれ、33%、35%、および47%、P=1.1×10-3)ことが観察された(図9)。脂肪症を有する個体のうち、TA対立遺伝子は、対立遺伝子用量依存的様式で、単純脂肪肝と比較して、NASHと線維症の両方の統計的に有意に低いオッズと関連していた(NASHについては、ORallelic 0.77(0.66~0.90)、P=6.5×10-4;線維症については、ORallelic 0.74(0.62~0.88)、P=4.15×10-4;図2B)。要するに、これらのデータは、単純脂肪肝から、より進行した段階のNASHおよび線維症へのNAFLDの進行を媒介する際のHSD17B13の役割を示唆する。
HSD17B13スプライスバリアントの臨床結果をより包括的に検査するために、本発明者らは、HSD17B13 rs72613567:TAと、405の量的EHR由来身体計測値、バイタルサイン、検査値、心電図、心エコー図、および骨密度測定値、ならびにまた、3,168のEHR由来臨床診断との関連のフェノムワイド研究を実施した。それぞれ、量的臨床測定値および臨床診断との関連に関する1.23×10-4および1.58×10-5のボンフェローニの有意性閾値を使用して、本発明者らは、肝臓トランスアミナーゼとの関連に加えて、HSD17B13 rs72613567:TA対立遺伝子と、より高い血小板数との統計的に有意な関連を同定した(表11)。慢性肝疾患以外の臨床診断との統計的に有意な関連はなかった(OR(95%CI)=0.88(0.84~0.93);P=9.14×10-6;AAF=0.263;N合計症例数=4031、T/T=2331、T/TA=1449、TA/TA=251;N合計対照数=35701、T/T=19238、T/TA=13984、TA/TA=2479)。
本発明者らは次に、遺伝子の公知および新規の転写産物の発現に対するHSD17B13 rs72613567:TA対立遺伝子の効果を検査した。本発明者らは、HSD17B13 rs72613567スプライスバリアントの22のT/Tホモ接合体、30のT/TAヘテロ接合体、および17のTA/TAホモ接合体保因者に由来する組織学的に正常な肝臓試料におけるHSD17B13 mRNA発現を評価するために、RNA配列決定を使用した。2つの公知のHSD17B13転写産物AおよびBに加えて、2つの新規転写産物が同定された:エクソン6を欠く転写産物C、およびタンパク質の早期トランケーションをもたらすと予測される、エクソン6の3’末端にグアニンヌクレオチドの挿入を含有する転写産物D。4つのさらなる転写産物(E~H)は、非常に低レベルで発現された(図3A~3Dおよび6A~6D)。転写産物を、RT-PCRおよびSanger配列決定によって検証した。また、転写産物Dを、ロングリードcDNA配列決定を使用して検証した。全ての同定されたHSD17B13アイソフォーム(A~H)のタンパク質配列アラインメントを、図7Aおよび7Bに示す。これらの転写産物の発現レベルは、HSD17B13 rs72613567遺伝子型に応じて変化した:それぞれのTA対立遺伝子について、対立遺伝子用量依存的様式で、転写産物AおよびBのレベルは減少したが、転写産物CおよびDのレベルは増加した(図3A~3D)。完全長300アミノ酸タンパク質をコードする転写産物Aは、T/Tホモ接合体における優勢な転写産物であったが、早期にトランケートされるタンパク質をコードする転写産物Dは、TA/TAホモ接合体における優勢な転写産物であった。ヒト肝臓生検組織中で、トランケートされたアイソフォームDタンパク質は、ヘテロ接合体およびTA/TAホモ接合体中に最小限に存在し、アイソフォームAタンパク質の存在量は、対立遺伝子用量依存的様式で減少した(図10Bおよび10C)。HEK293細胞中でのアイソフォームAおよびDの異種発現は、mRNA発現と比較してアイソフォームDの存在量の減少を示したが、これは、アイソフォームAと比較した場合、アイソフォームDの不安定性を示唆している(図11A~11C)。これらのデータは、ヒト肝臓における発現の実質的な減少と共に、トランケート型のタンパク質の合成をもたらす、HSD17B13 rs72613567の選択的mRNAスプライシングと一致している。
HSD17B13は、主に肝臓中で発現され(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liuら、Acta Biochim. Pol.、2007年、54巻、213~218頁)、そこでそれは脂肪性肝疾患の発症における役割と一致して、脂肪滴に局在化する(あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2014年、111巻、11437~11442頁、doi:10.1073/pnas.1410741111)。本発明者らは、HSD17B13転写産物AまたはDを発現するレンチウイルスを安定に形質導入した不死化ヒト肝臓細胞株におけるHSD17B13の発現およびその局在化を評価した。HSD17B13アイソフォームAは、BODIPYで標識された脂肪滴を取り囲む膜上で主に検出された(データは示さない)。同様の細胞内局在化が、脂肪滴表面でHSD17B13アイソフォームDについても観察された(データは示さない、および図12)。細胞内トリグリセリド含量の差異は、GFP対照またはHSD17B13アイソフォームAまたはDを過剰発現する細胞株のオレイン酸処理について観察されなかった(図13A~13D)。
rs72613567:TAに起因するHSD17B13タンパク質の早期トランケーションの機能的結果を理解するために、本発明者らは、組換えタンパク質およびコファクターとしてのニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドを使用して、in vitroでアイソフォームAおよびDの酵素活性を評価した。本発明者らは、265のユニークな推定基質を試験し、ステロイド基質およびHS17B13の酵素基質としての生物活性脂質(例えば、ロイコトリエンB4)を同定した。本発明者らは、ヒドロキシルのケトン基への酸化をもたらす、エストラジオールの酵素的変換に対するHSD17B13の酵素活性のその後の特徴付けに焦点を当てた(図14中のVmaxおよびKm値)。HSD17B13アイソフォームDは、HSD17B13アイソフォームAと比較した場合、in vitro(図10D)および細胞に基づく酵素変換アッセイ(図10E)でエストラジオールに向かう大きく低下した活性を示した。
ex vivoおよびin vivoでのCRISPR/Cas9を使用したマウスHsd17b13遺伝子座の改変
CRISPR/Cas9系を使用してHsd17b13を標的化するための概念実証として、マウスHsd17b13遺伝子座のエクソン1領域またはエクソン6/7領域のいずれかを標的とするマウスHsd17b13ガイドRNAを試験した。ガイドRNA標的配列を、表12に提供する。配列番号259~268に対応するガイドRNA DNA標的化セグメントは、それぞれ、配列番号1643~1652に記載され、チミンの代わりにウラシルを含むことを除いて、配列番号259~268と同一である。マウスHsd17b13(ヒドロキシステロイド(17-ベータ)デヒドロゲナーゼ13)のNCBI遺伝子IDは、243168(配列番号269)である。マウスゲノム遺伝子座は、第5染色体、NC_000071.6(103955442..103977388、補体)上にある。
Claims (53)
- 細胞内のHSD17B13遺伝子の発現を改変または変更するための組合せ物であって、
(a)Cas9タンパク質または前記Cas9タンパク質をコードする核酸;および
(b)第1のガイドRNAまたは前記第1のガイドRNAをコードするDNAであって、前記第1のガイドRNAが、第1のCRISPR RNA(crRNA)部分および第1のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分を含み、前記第1のガイドRNAが、前記Cas9タンパク質と複合体を形成し、前記HSD17B13遺伝子内の第1のガイドRNA標的配列を標的とし、前記第1のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接する、第1のガイドRNAまたは前記第1のガイドRNAをコードするDNA
を含み、前記Cas9タンパク質が、前記第1のガイドRNA標的配列を切断し、前記HSD17B13遺伝子において標的化遺伝子改変を生成するか、または前記Cas9タンパク質が、前記第1のガイドRNA標的配列に結合し、前記HSD17B13遺伝子の発現を変更し;
前記組合せ物が、前記細胞に導入され、前記組合せ物が、前記HSD17B13遺伝子の機能喪失をもたらす、
組合せ物。 - 前記Cas9タンパク質がヌクレアーゼ活性Cas9タンパク質であり、前記HSD17B13遺伝子が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを有さない、請求項1に記載の組合せ物。
- (a)前記第1のガイドRNA標的配列が、配列番号20~81および259~263のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第1のガイドRNAが、配列番号1423~1484および1643~1647のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第1のガイドRNAが、配列番号500~561、730~791、960~1021、1190~1251、720~724、950~954、1180~1184、および1410~1414のいずれか1つを含む、
請求項1または2に記載の組合せ物。 - 前記第1のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1または2と最適にアラインメントした場合、配列番号1または2のエクソン1に対応する領域内にある、請求項1から3までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記第1のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の前記開始コドンの10、20、30、40、50、100、200、300、400、500または1,000ヌクレオチド内にあるか、または前記HSD17B13遺伝子の前記開始コドンを含む、請求項1から4までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 第2のガイドRNAまたは前記第2のガイドRNAをコードするDNAをさらに含み、
前記第2のガイドRNAが、第2のCRISPR RNA(crRNA)部分および第2のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分を含み、
前記第2のガイドRNAが、前記Cas9タンパク質と複合体を形成し、前記HSD17B13遺伝子内の第2のガイドRNA標的配列を標的とし、かつ
前記第2のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接する、
請求項1から5までのいずれか一項に記載の組合せ物。 - 前記第2のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の前記開始コドンの10、20、30、40、50、100、200、300、400、500または1,000ヌクレオチド内にあるか、または前記HSD17B13遺伝子の前記開始コドンを含む、請求項6に記載の組合せ物。
- 前記HSD17B13遺伝子の前記開始コドンの破壊をもたらす、請求項1から7までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 第2のガイドRNAまたは前記第2のガイドRNAをコードするDNAをさらに含み、
前記第2のガイドRNAが、第2のCRISPR RNA(crRNA)部分および第2のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分を含み、
前記第2のガイドRNAが、前記Cas9タンパク質と複合体を形成し、前記HSD17B13遺伝子内の第2のガイドRNA標的配列を標的とし、
前記第2のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接する、かつ
前記細胞が、前記第1のガイドRNA標的配列と前記第2のガイドRNA標的配列との間にHSD17B13コード領域の欠失を含むように改変される、
請求項1から5までのいずれか一項に記載の組合せ物。 - (a)前記第2のガイドRNA標的配列が、配列番号88~225のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第2のガイドRNAが、配列番号1485~1628のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第2のガイドRNAが、配列番号562~705、792~935、1022~1165および1252~1395のいずれか1つを含む、
請求項9に記載の組合せ物。 - 前記第2のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1または2と最適にアラインメントした場合、配列番号1または2のエクソン7に対応する領域内にある、請求項9または10に記載の組合せ物。
- 前記第2のガイドRNA標的配列が、前記HSD17B13遺伝子の前記終止コドンの10、20、30、40、50、100、200、300、400、500または1,000ヌクレオチド内にあるか、または前記HSD17B13遺伝子の前記終止コドンを含む、請求項9から11までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記HSD17B13遺伝子の前記コード配列が欠失される、請求項9から12までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記標的化遺伝子改変が、非相同末端結合による切断された第1のガイドRNA標的配列の修復によって生成される、請求項1から13までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記組合せ物が、発現ベクターと組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記発現ベクターが、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えHSD17B13遺伝子を含む、請求項1から14までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記組換えHSD17B13遺伝子がヒト遺伝子である、請求項15に記載の組合せ物。
- 前記組換えHSD17B13遺伝子が、前記遺伝子の1つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型HSD17B13遺伝子に対して欠失しているHSD17B13ミニ遺伝子であり、前記欠失したセグメントが、1つまたは複数のイントロン配列を含み、前記HSD17B13ミニ遺伝子が、配列番号2と最適にアラインメントした場合、配列番号2のイントロン6に対応するイントロンを含む、請求項15または16に記載の組合せ物。
- 前記組合せ物が、発現ベクターと組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記発現ベクターが、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるHSD17B13タンパク質をコードする核酸を含み、前記HSD17B13タンパク質が、配列番号12(HSD17B13アイソフォームA)と同一でない、請求項1から14までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記HSD17B13タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号7と最適にアラインメントした場合、配列番号7(HSD17B13転写産物D)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項18に記載の組合せ物。
- 前記組合せ物が、HSD17B13タンパク質またはその断片と組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記HSD17B13タンパク質またはその断片が、配列番号15(HSD17B13アイソフォームD)と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であり、前記HSD17B13タンパク質が、配列番号12(HSD17B13アイソフォームA)と同一でない、請求項1から14までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記組合せ物が、外因性ドナー配列と組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記外因性ドナー配列を、前記HSD17B13遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座と組換えて、標的化遺伝子改変を生じさせる、請求項1から14までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列による前記HSD17B13遺伝子の修復が、非相同末端結合媒介性挿入を介して生じる、請求項21に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列による前記HSD17B13遺伝子の修復が、相同組換え修復を介して生じる、請求項21に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列が、配列番号2の12666位に対応する位置の5’側の標的配列とハイブリダイズする5’相同アーム、および配列番号2の12666位に対応する位置の3’側の標的配列とハイブリダイズする3’相同アームを含み、前記外因性ドナー配列が、前記HSD17B13遺伝子と組換えられる、請求項23に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列が、5’相同アームと3’相同アームに挟まれた核酸挿入物をさらに含む、請求項24に記載の組合せ物。
- 前記核酸挿入物がチミンを含み、前記外因性ドナー配列がHSD17B13遺伝子と組換えられると、前記HSD17B13遺伝子を配列番号1と最適にアラインメントした場合、配列番号1の12665位に対応するヌクレオチドと12666位に対応するヌクレオチドとの間に前記チミンが挿入される、請求項25に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列が、50ヌクレオチド~1kbの長さである、請求項21から26までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列が、80ヌクレオチド~200ヌクレオチドの長さである、請求項27に記載の組合せ物。
- 前記外因性ドナー配列が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項21から28までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記第1のガイドRNAが、前記第1のcrRNA部分が前記第1のtracrRNA部分に連結している単一分子ガイドRNAである、請求項1から29までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記第1のガイドRNAが、配列番号1420、256、257または258に記載の配列を含む、請求項30に記載の組合せ物。
- 前記第1のcrRNA部分および前記第1のtracrRNA部分が、別々のRNA分子である、請求項1から29までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記第1のcrRNA部分が、配列番号1421に記載の配列を含み、かつ/または前記第1のtracrRNA部分が、配列番号1422に記載の配列を含む、請求項32に記載の組合せ物。
- 前記第1のガイドRNAが、改変または制御された安定性をもたらす改変を含む、請求項1から33までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記Cas9タンパク質をコードする前記核酸を含み、前記Cas9タンパク質をコードする前記核酸がDNAを含む、請求項1から34までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記Cas9タンパク質をコードする前記核酸を含み、前記Cas9タンパク質をコードする前記核酸がRNAを含む、請求項1から34までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- RNAの形態で前記第1のガイドRNAを含む、請求項1から36までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記第1のガイドRNAをコードするDNAを含む、請求項1から36までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 脂質ナノ粒子中にある、請求項1から38までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- アデノ随伴ウイルスベクター中にある、請求項1から39までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記細胞が、マウス細胞、ラット細胞またはヒト細胞である、請求項1から40までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記細胞が、ヒト肝臓細胞、マウス肝臓細胞、ラット肝臓細胞、マウス多能性細胞またはラット多能性細胞である、請求項41に記載の組合せ物。
- 前記細胞がヒト肝臓細胞である、請求項42に記載の組合せ物。
- 前記細胞がヒト細胞であり、
(a)前記第1のガイドRNA標的配列が、配列番号20~81のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第1のガイドRNAが、配列番号1423~1484のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第1のガイドRNAが、配列番号500~561、730~791、960~1021および1190~1251のいずれか1つを含む、
請求項1から43までのいずれか一項に記載の組合せ物。 - (a)前記第1のガイドRNA標的配列が、配列番号20~41のいずれか1つ、配列番号21~23、33および35のいずれか1つ、または配列番号33および35のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第1のガイドRNAが、配列番号1447~1468のいずれか1つ、配列番号1448~1450、1460および1462のいずれか1つ、または配列番号1460および1462のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第1のガイドRNAが、配列番号524~545、754~775、984~1005および1214~1235のいずれか1つ、配列番号295~297、525~527、755~757、985~987、1215~1217、307、309、537、539、767、769、997、999、1227および1229のいずれか1つ、または配列番号307、309、537、539、767、769、997、999、1227および1229のいずれか1つを含む、
請求項44に記載の組合せ物。 - 前記細胞がマウス細胞であり、
(a)前記第1のガイドRNA標的配列が、配列番号259~263のいずれか1つを含み、かつ/または
(b)前記第1のガイドRNAが、配列番号1643~1647のいずれか1つを含むDNA標的化セグメントを含み、かつ/または
(c)前記第1のガイドRNAが、配列番号720~724、950~954、1180~1184および1410~1414のいずれか1つを含む、
請求項1から42までのいずれか一項に記載の組合せ物。 - 前記細胞がex vivoまたはin vivoである、請求項1から46までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記細胞がin vivoである、請求項47に記載の組合せ物。
- 前記細胞が肝臓細胞であり、前記組合せ物がin vivoで肝臓に導入される、請求項48に記載の組合せ物。
- 前記細胞が、慢性肝疾患を有するか、またはそのリスクがある対象における肝臓細胞であり、前記組合せ物が、細胞内のHSD17B13遺伝子の発現を改変または変更することにより前記対象を治療するためのものである、請求項1から49までのいずれか一項に記載の組合せ物。
- 前記慢性肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、または肝細胞癌である、請求項50に記載の組合せ物。
- 前記対象が、脂肪性肝炎、線維症、肝硬変および/または肝細胞癌を有するか、またはそのリスクがある、請求項50または51に記載の組合せ物。
- 前記対象がヒト対象である、請求項50から52までのいずれか一項に記載の組合せ物。
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