JP2012527883A - ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１のムテイン - Google Patents

Abstract

本発明は、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）のムテイン、そのようなムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、対象者におけるＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を測定する方法、ＰＹＣＲ１の発現を変化させることができる化合物を同定する方法、およびＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患している対象者を治療する方法に関する。本発明はさらに、遺伝子組換え動物、および動物においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法に関する。

Description

本願は、２００９年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／１８０，９３７号の優先権の利益を主張するものであり、前記出願の内容は、あらゆる目的において全体が参照により本願に組み込まれる。

本発明はピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）のムテイン（変異タンパク質）に関する。本発明はさらに、対象者においてＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を測定する方法、ＰＹＣＲ１の発現を変化させることができる化合物を同定する方法、およびＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患している対象者を治療する方法にも関する。本発明はさらに、遺伝子組換え動物および動物のＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法に関する。

皮膚の多皺および骨量減少は、加齢に伴う典型的な特徴である。いくつかの単一遺伝子疾患（monogenetic disease）では、上記の変化が若年で生じ、その結果として罹患者の早老症様顔貌をもたらす。臨床像として、皮膚の多皺または皮膚弛緩症は、常染色体優性皮膚弛緩症（ＡＤＣＬ；ＭＩＭ１２３７００）、常染色体劣性皮膚弛緩症Ｉ型（ＡＲＣＬ１；ＭＩＭ２１９１００）、常染色体劣性皮膚弛緩症ＩＩ型（ＡＲＣＬ２；ＭＩＭ２１９２００、リンクリー・スキン（wrinkly skin）症候群（ＷＳＳ；ＭＩＭ２７８２５０）とも呼ばれる）、デ・バーシー（de Barsy）症候群（ＤＢＳ；ＭＩＭ２１９１５０）、および老人様皮膚萎縮骨形成異常症（ＧＯ，ＭＩＭ２３１０７０）を含むいくつかの重複症候群（overlapping syndromal disorder）の共通要素として用いられる。臨床的に広範囲に重複することから、これらの病気において診断は困難であることが多い。

第１の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１のムテインであって、スイスプロット（Swiss−Prot）の登録番号Ｐ３２３２２に示されるようなＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４〜２２０位および２２２〜２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つが突然変異していることを特徴とする、ムテインを提供する。

第２の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１のムテインを提供する。該ムテインは、スイスプロットの登録番号Ｐ３２３２２に示されるようなＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４〜２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つの突然変異を含み、該突然変異は野生型タンパク質と比較して機能低下または機能喪失したムテインをもたらす。

第３の態様では、本発明は核酸分子を提供する。該核酸分子は、上述のようなムテインをコードするヌクレオチド配列を含む。
第４の態様では、本発明は、対象者においてピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を測定する方法を提供する。該方法は、上述のようなムテインをコードするヌクレオチド配列の存在について、対象者から得られた核酸試料を分析するステップを含み、該ヌクレオチド配列の存在が、対象者の加齢関連疾患に罹患しやすい素因または罹患するリスクを有する素因を示すことを特徴とする。

第５の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を診断または測定するための、上述のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用を提供する。

第６の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、対象とする化合物を、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と接触させるステップと、該ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を計測するステップとを含む。

第７の態様では、本発明は、細胞内においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法を提供する。該方法は、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入するステップを含む。

第８の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しているかまたはＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患を発症するリスクを有している対象者を治療する方法を提供する。該方法は、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を対象者に導入するステップを含む。

第９の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しているかまたはＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患を発症するリスクを有している対象者を治療する方法を提供する。該方法は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を対象者に投与するステップを含む。

第１０の態様では、本発明は遺伝子組換え動物を提供する。該遺伝子組換え動物は、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）をコードする核酸であって、不活性であることを特徴とする核酸を含む。

第１１の態様では、本発明は、動物においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法を提供する。該方法は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を動物に投与するステップを含む。

第１２の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、対象とする化合物を上述のような遺伝子組換え動物に投与するステップと；該化合物が該ＰＹＣＲ遺伝子の発現を変化させることができるかどうかを測定するステップとを含む。

第１３の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、生きている動物の皮膚の少なくとも１つの層を含む単離された皮膚片であって、試験動物に付着させた皮膚片を提供するステップと；対象とする化合物を、生きている動物の皮膚と接触するように適用するステップとを含む。

デ・バーシーのＰＹＣＲ１関連常染色体劣性早老症候群の患者の表現型の特徴を示す図。 ＰＹＣＲ１突然変異の影響を示す図。 ＰＹＣＲ１の喪失は酸化ストレスに対する感受性増大をもたらすことを示す図。 Ｐｙｃｒ１ツメガエルモルファントの表現型を示す図。 Ｐｙｃｒ１モルファントにおける皮膚の発育不全には自発的アポトーシスを伴い、貧血とは無関係であることを示す図。 突然変異したＰＹＣＲ１残基の局在化を示す図。 ａ）定量的ＰＣＲによって測定されたＰＹＣＲ１突然変異患者由来および対照の線維芽細胞における遺伝子発現の変化。ｂ）定量的ＰＣＲによって測定された、４日齢マウスからの組織におけるプロリン代謝関連遺伝子の発現であり、心臓における発現レベルに対して標準化したもの。 ａ）対照（Ｃｔｒ）と比較した、ＰＹＣＲ１突然変異患者（Ｐａｔ）におけるプロリンおよびオルニチンのレベル。ｂ）対照由来およびＰＹＣＲ１突然変異患者由来の線維芽細胞におけるプロリンレベル。ｃ）様々なプロリン濃度を有する培地で成長させた、ＰＹＣＲ１突然変異患者（Ｐａｔ）および対照（Ｃｔｒ）由来の線維芽細胞の増殖率。 Ｐｙｃｒ１モルファント表現型の部分的レスキューは、ヒトの野生型Ｐｙｃｒ１ ｍＲＮＡの過剰発現によって為されるが、突然変異型Ｐｙｃｒ１ Ｋ２１５‐Ｄ３１９ｄｅｌ ｍＲＮＡでは為されないことを示す図。 Ｐｙｃｒ１モルファントの血液欠損症は並体結合によって緩和されることを示す図。 ゼブラフィッシュにおけるＰｙｃｒ１およびＰｙｃｒ２のノックダウンは、奇形、表皮の萎縮およびアポトーシス増加をもたらすことを示す図。 ＰＹＣＲ１遺伝子のアミノ酸配列（スイスプロット登録番号Ｐ３２３２２）。

発明の詳細な説明
皮膚の多皺、骨粗鬆症および早老症様顔貌を特徴とする一連の疾患に関連するＰＹＣＲ１の突然変異が、本明細書において記載される。これに関連して、本発明者らは、ＰＹＣＲ１遺伝子において疾患を引き起こす突然変異を発見した。ＰＹＣＲ１遺伝子のそのような突然変異は、スイスプロットの受入番号Ｐ３２３２２に示されるようなＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４〜２２０位および２２２〜２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つが突然変異している、ＰＹＣＲ１のムテインである（図６を参照）。いくつかの実施形態では、該ムテインは、スイスプロットの受入番号Ｐ３２３２２に示されるようなＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４〜２６６位の配列のアミノ酸残基のうち少なくとも１つの突然変異であって、野生型タンパク質と比較して機能低下または機能喪失したムテインをもたらす突然変異を含む場合もある。

本発明により記載されるムテインは、任意の標準的な方法によって、例えば、対象とする染色体座またはその候補領域を同定するために多くの血族関係者から得たプールＤＮＡ試料を用いるホモ接合性マッピングによって、同定または測定可能である。染色体座の候補領域が同定されれば、該領域について、従来の塩基配列決定法およびゲノム遺伝子座捕獲法とその後のハイスループット塩基配列決定法を使用して、疾患を引き起こす突然変異をスクリーニングすることができる。

いくつかの実施形態では、本発明により記載されるムテインは、一塩基多型（ＳＮＰ）に由来していてもよい。用語「ＳＮＰ」は、個体の集団の中で多様である、ヒトゲノム中の特定の部位における一塩基多型を指す。この一塩基多型は、例えば、所与の部位において２つのヌクレオチドの可能性がある通常の対立遺伝子を含んだ、ＤＮＡ塩基配列中の単一塩基の変化であってよい。本明細書中で使用されるように、ＳＮＰはその名前によって、または特定の配列の中の位置によって特定されうる。当業者に周知の様々な方法が、ＳＮＰを生成させるために使用可能である。本発明によるＳＮＰは、例えば、特に使用されるライブラリが様々な個体からの組織を使用して構築される場合、発現配列タグ（ＥＳＴ）作製プロジェクトからの配列データの比較で得ることができる（Picoult−Newberg L．，et al，Mining SNPs from EST databases，Genome Res．9（1999）167−174）。本発明によるＳＮＰは、Altshuler D．et al．，An SNP map of human genome generated by reduced representation shotgun sequencing，Nature 407（2000）513−516に記載されているような簡約表示ショットガン（ＲＲＳ）法を使用して得ることもできる。

さらに、所望の目的が達成される限り、例えばそれぞれの野生型タンパク質と比較して機能低下または機能喪失した本発明のムテインを達成するために、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列に突然変異を導入することも可能である。これらの突然変異には、例えばＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の置換、欠失および挿入が挙げられる。可能な変更の例には、その変更がアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸で置換することである、保存的に改変される変異が挙げられる。機能的に類似したアミノ酸を提供する表は、当分野で良く知られている。保存的置換の例は、以下のものすなわち、１）アラニン、セリン、トレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン：の間での置換である。他の実施形態では、ＰＹＣＲ１のアミノ酸配列は非保存的な変更によって改変されてもよい。

ある実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４位、１１９位、１７９位、１８９位、２０６位、２５１位、２５７位および２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つが突然変異している。これに関連して、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４位のアミノ酸残基の突然変異は、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の５０位をコードするコドンに翻訳停止コドンを生じさせるフレームシフト突然変異によって変異していてもよい。

他の実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の１１９位のアミノ酸残基が、グリシンまたはヒスチジンに置き換わっていてもよい。
いくつかの実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の１７９位のアミノ酸残基が親水性アミノ酸に置き換わっていてもよい。親水性アミノ酸は、例えばヒドロキシルを含んでいるアミノ酸であってよい。そのようなヒドロキシルを含んでいるアミノ酸の例には、セリンまたはトレオニンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の１８９位のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に置き換わっていてもよい。疎水性アミノ酸は、例えば脂肪族アミノ酸であってよい。そのような脂肪族アミノ酸の例には、イソロイシン、ロイシンおよびバリンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の２０６位のアミノ酸残基が芳香族アミノ酸または正に荷電したアミノ酸に置き換わっていてもよい。芳香族アミノ酸の例には、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。正に荷電したアミノ酸の例には、アルギニンまたはリジンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の２５１位のアミノ酸残基がヒスチジンに置き換わっていてもよい。他の実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の２５７位のアミノ酸残基が親水性アミノ酸に置き換わっていてもよい。この親水性アミノ酸は、例えばヒドロキシルを含んでいるアミノ酸であってよい。そのようなヒドロキシルを含んでいるアミノ酸の例は、セリンまたはトレオニンとなりうる。

いくつかの実施形態では、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の２６６位のアミノ酸残基がグルタミンまたはアスパラギンに置き換わっていてもよい。
本発明によるムテインの配列は、改善された安定性、生産、精製または適用可能性を目的として改変されてもよい。例えば、必要であれば、機能的な三次元構造へフォールディングするのに不可欠ではないペプチド断片が、上記目的のために削除されてもよい。ジスルフィド結合がシステイン残基の置換によって削除されてもよいし、新しいジスルフィド結合が別の部位に導入されてもよい。任意選択で、例えば、他の成分との化学結合によって対応するタンパク質コンジュゲートを調製するために、システイン残基が新たに導入されてもよい。例えば金属イオンのようなさらなるリガンドの結合部位がムテインに組み込まれてもよい。

本明細書中で使用されるように、用語「アミノ酸残基」は、Ｄ型もしくはＬ型いずれかのアミノ酸、またはアミド結合によってポリペプチドに組み入れることができるアミノ酸ミメティックを指す。従って、８９位の正に荷電したアミノ酸残基は、例えば、アルギニンもしくはリジンのような、生理学的条件下で正に荷電している天然に存在するアミノ酸残基、または、安定な正電荷を有する（第四）アンモニウム塩を出じるためにαアミノ基がアルキル化されているリジン残基のような、非天然のミメティックのいずれかであってよい。

本明細書中で使用されるような動物またはアミノ酸配列に関する用語「野生型」とは、天然または人工の環境で遺伝的組換えがなされたものとは対照的に、天然の生物集団または生物系統において優性である、表現型、遺伝子型または遺伝子を意味する。

本発明の例示の実施形態では、２２組の家族からの３５人の罹患者の臨床像が研究されて表１に概括された。これらの特徴には、先天的な皮膚の多皺（手背および足背において最も顕著）、全身性の結合組織脆弱、手指拘縮、ヘルニア、骨粗鬆症、ならびに、弛緩した皮膚と上顎前突症をもたらすことの多い顎の発育不全とに起因する早老症様顔貌を備えた三角顔が挙げられる（図１ａ〜ｄ）。皮膚の超微細構造研究から、常染色体劣性皮膚弛緩症（ＡＲＣＬ）において描写された変化に類似の弾性線維の希薄化および断片化が明らかとなった（図１ｅ〜ｈ）。グリコシル化異常は標準的診断法では検出されなかった。様々な程度の精神遅滞が１例を除く全ての症例で観察された。患者の相当数において脳梁欠損症が明白であった。ほとんどの罹患者は老人様皮膚萎縮骨形成異常症（ＧＯ）またはリンクリー・スキン症候群（ＷＳＳ）として分類されたが、より重症の罹患者はさらに幼年期白内障またはジストニー運動を示し、したがってデ・バーシー症候群（ＤＢＳ）と診断された（Al−Gazali，L．I．，et al．，Gerodermia osteodysplastica and wrinkly skin syndrome：are they the same？Am J Med Genet 101，213−20（2001）；Hamamy，H．，et al．，Wrinkly skin syndrome． Clin Exp Dermatol 30，590−2（2005）；Nanda，A．et al．Gerodermia osteodysplastica／wrinkly skin syndrome：report of three patients and brief review of the literature．Pediatr Dermatol 25，66−71（2008）；およびKunze，J．et al．De Barsy syndrome−−an autosomal recessive，progeroid syndrome．Eur J Pediatr 144，348−54（1985））。

５組の血縁家族におけるホモ接合性マッピングから、染色体１７ｑ２５上のｒｓ８０６５４３１マーカーとｒｓ１０４６８９６マーカーとの間の２．８Ｍｂの最小候補領域が明らかとなった（図１ｉ）。配列決定によって除外されたＰ４ＨＢを除いて、この領域内の５９個の遺伝子はいずれも明白な候補ではなかった。したがって、従来の塩基配列決定法およびゲノム遺伝子座捕獲法を組み合わせ、ハイスループット塩基配列決定法を後続させた（図１ｊ）。後者から５５２個のゲノムミスマッチが同定され、そのうち８個は、非同義的（non−synonomous）突然変異を引き起こす新規なＳＮＰであった（表１）。本発明者らはこのように、ＰＹＣＲ１のムテイン、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１酵素（ＰＹＣＲ１）をコードする遺伝子を同定した。

本発明の別の態様では、本発明によるムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。本明細書中で使用されるように、用語「核酸」は、例えば直線状の一本鎖、二本鎖、またはこれらの組み合わせのような任意の可能な構造の任意の核酸分子を指す。そのような核酸の例には、限定するものではないが、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用するかもしくは核酸化学を使用して生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの共重合体、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（タンパク質核酸）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノム起源でも合成起源でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。それぞれの核酸は更に、非天然のヌクレオチドアナログを含有していてもよく、かつ／またはアフィニティータグまたは標識に連結されていてもよい。

用語「ヌクレオチド」には、天然の（天然に存在する）ヌクレオチドであって、アデニン、チミジン、シトシン、グアニンおよびウラシルからなる群から選択された窒素含有塩基と、リボース、アラビノース、キシロースおよびピラノースならびにデオキシリボースからなる群から選択された糖と（塩基と糖との組み合わせは一般に「ヌクレオシド」と呼ばれる）、１〜３個のリン酸基とを含み、かつヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成することができる、ヌクレオチドが含まれる。「ヌクレオチド」はさらにヌクレオチドアナログも指す。そのようなアナログは、糖アナログ、塩基アナログおよびヌクレオシド間結合アナログのうち少なくともいずれかを有することができる。加えて、非標準的な塩基対合を示すアナログも含まれる（例えば米国特許第５，４３２，２７２号明細書を参照のこと）。そのようなヌクレオチドアナログには、天然の塩基が化学修飾されたもの（「塩基アナログ」）、天然の糖が化学修飾されたもの（「糖アナログ」）、および／または、天然のホスホジエステル結合もしくは他のヌクレオシド間結合が化学修飾されたもの（「ヌクレオシド間結合アナログ」）であるヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数の芳香環が少なくとも１つの窒素原子を含有している。ある実施形態では、ヌクレオチド塩基は、適切な相補性を有するヌクレオチド塩基とともにワトソン・クリック型およびフーグスティーン（Hoogsteen）型のうち少なくともいずれかの水素結合を形成することができる。例示のヌクレオチド塩基およびそのアナログには、限定するものではないが、天然に存在するヌクレオチド塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、およびチミン、ならびに天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ、例えば７‐デアザアデニン、７‐デアザグアニン、７‐デアザ‐８‐アザグアニン、７‐デアザ‐８‐アザアデニン、Ｎ６δ２‐イソペンテニルアデニン、Ｎ２‐ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７‐メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２‐アミノプリン、２‐アミノ‐６‐クロロプリン、２，６‐ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５‐プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７‐デアザグアニン、２チオピリミジン、６‐チオグアニン、４‐チオチミン、４‐チオウラシル、Ｏ^６‐メチルグアニン、Ｎ^６‐メチルアデニン、Ｏ^４‐メチルチミン、５，６‐ジヒドロチミン、５，６‐ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４‐Ｄ］ピリミジン（例えば米国特許第６，１４３，８７７号明細書および同第６，１２７，１２１号明細書を参照）、エテノアデニン、ニトロインドールおよび４‐メチルインドールのようなインドール、ならびにニトロピロールのようなピロールが挙げられる。

用語「相補的な（相補性の）」は、２つの異なるＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖におけるヌクレオチド／塩基の関係であって、塩基が対をなす（グアニンとシチジン、アデニンとチミン（ＤＮＡ）またはウラシル（ＲＮＡ））関係を意味するように意図される。

ある実施形態では、本発明によって使用される核酸分子は、本発明のムテインをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。他の実施形態では、本発明によって使用される核酸は、ヌクレオチド配列ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体を含むことができる。本明細書中で使用されるＰＹＣＲ１の「機能性突然変異体」という用語は、本発明のムテイン以外の、機能がほとんど完全に保持されている変異体タンパク質を指す。例えば、前記の機能に関連しない１つ以上のアミノ酸が置換されていてもよい。本明細書中で使用されるように、用語「機能性フラグメント」は、その所望の機能を提供するのに十分な長さを有する、ＰＹＣＲ１のフラグメントを指す。

これに関連して、本明細書中で使用されるＤＮＡなどの核酸分子は、該分子が転写情報および翻訳情報を包含している調節ヌクレオチド配列を含有し、かつそのような配列が本発明のムテインをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されていれば、例えば「核酸分子もしくはヌクレオチドコード配列を発現させることができる」か、または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」ことができるとみなすことができる。作動可能な連結とは、調節ＤＮＡ配列と発現させるべきＤＮＡ配列とが、遺伝子配列発現を可能にするような状態で繋がれる結合である。遺伝子配列発現に必要な調節領域の正確な性質は、生物によって様々であるかもしれないが、概して、原核生物では、プロモータ単独またはＲＮＡ転写の開始を指図するプロモータとＲＮＡへ転写された時に合成の開始を合図することになるＤＮＡ配列との両方を含有しているプロモータ領域を備えることになる。そのような領域は通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列のような、発現されるヌクレオチド配列の５’側および３’側にあって転写および翻訳の開始に関与する、非コード領域を含むことになろう。

本発明の核酸分子または本発明によって使用される核酸分子は、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドを挿入するか、またはヌクレオチド配列から少なくとも１つのヌクレオチドを欠失させることにより、変更されてもよい。他の実施形態では、核酸分子のヌクレオチド配列のスプライス部位のうち少なくとも１つが突然変異していてもよい。用語「スプライス部位」とは、真核細胞のスプライシング機構によって、切断および／または対応するスプライス部位への結合に適切であると認識される特異的な核酸配列を指す。スプライス部位は、前駆体ｍＲＮＡ転写物に存在するイントロンの切除を可能にする。典型的には、イントロンの５’部分はドナースプライス部位と呼ばれ、３’側の対応するスプライス部位はアクセプタースプライス部位と呼ばれる。スプライス部位という用語には、例えば、天然に存在するスプライス部位、人工的に作製されたスプライス部位が含まれる。人工的に作製されたスプライス部位は、例えば突然変異が導入された部位であってよい。スプライス部位の突然変異は、異なる転写物集団から翻訳されるポリペプチド間の比率の制御を可能にする。スプライス部位は当分野において良く知られており、いずれも本発明において利用可能である。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、ベクター、例えば発現ベクターに包含されていてもよい。そのようなベクターは、上述のような核酸を一体化する能力を有し、かつ、本発明のムテインまたはＰＹＣＲ１もしくはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードする核酸に５’方向および３’方向のうち少なくともいずれか一方に隣接する、制限酵素切断部位をコードする配列を含むことができる。ベクターは、発現のために使用される宿主との適合性を有する生物種に由来する複製部位および制御配列も包含することができる。この場合は、用語「ベクター」は、細胞内へ導入、例えばトランスフェクションされ、かつ細胞ゲノム内で、または細胞ゲノムとは独立に複製されることが可能な、一本鎖または二本鎖の環状核酸分子に関する。環状の二本鎖核酸分子は、制限酵素を用いて処理すると、切断され、従って直線化が可能である。核酸ベクター、制限酵素、および制限酵素によって切断されるヌクレオチド配列の情報の組合せは、当業者には容易に利用可能である。

本発明のムテインまたはＰＹＣＲ１もしくはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードする核酸分子は、制限酵素でベクターを切断して２つの断片をともにライゲーションすることにより、ベクターに挿入可能である。当業者に周知の遺伝子クローニングに適した任意のベクターを、本発明において使用可能である。これらのベクターの例には、限定するものではないが、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７およびｐＢＲ３２８が挙げられる。本発明のムテインまたはＰＹＣＲ１もしくはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードする核酸、および／またはそれぞれのベクターは、該核酸を発現することができる宿主細胞の中に含められてもよい。本明細書中に開示された宿主細胞も、上記に定義されるような核酸を包含することができる。本明細書中で使用されるような宿主細胞には、組換えタンパク質、特に上述のようなムテインまたはＰＹＣＲもしくはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体を生産するための発現系として使用することができる任意の宿主細胞が挙げられる。典型的な宿主細胞は、原核生物の宿主細胞、例えば、限定するものではないが大腸菌（E．coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）；ならびに真核生物の宿主細胞、例えば、哺乳類、鳥類、真菌類および昆虫の細胞である。宿主細胞へベクターを導入する様々な方法、例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびバイオリスティック法（biolistics）が当業者に知られている。

本発明は、ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因の診断または測定において使用するための、本発明のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。加齢関連疾患は、限定するものではないが、皮膚弛緩症（リンクリー・スキン症候群）、デ・バーシー症候群および老人様皮膚萎縮骨形成異常症であってよい。

さらなる態様では、本発明は、対象者においてピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を測定する方法を提供する。該方法は、本発明のムテインをコードするヌクレオチド配列の存在について、対象者から得られた核酸試料を分析するステップを含み、該ヌクレオチド配列の存在が、対象者の加齢関連疾患に罹患しやすいかまたは罹患するリスクを有する素因を示すことを特徴とする。

本発明はさらに、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、対象とする化合物を、ＰＹＣＲ１またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と接触させるステップを含む。該方法は、ＰＹＣＲ１またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を計測するステップをさらに含む。続いて、計測の結果を、対象とする化合物が添加されない対照の計測の結果と比較してもよい。

本発明はさらに遺伝子組換え動物も提供する。該遺伝子組換え動物は、ＰＹＣＲ１遺伝子をコードする不活性な核酸を含む。いくつかの実施形態では、該核酸はＰＹＣＲ１遺伝子の機能喪失をもたらす。ＰＹＣＲ１遺伝子をコードする核酸は、当分野において良く知られた遺伝学的方法によって不活性化することができる。該核酸は、例えば、遺伝子ノックアウトまたはノックダウン法、モルフォリノアンチセンスオリゴマー、またはＰＹＣＲ１遺伝子の機能喪失をもたらすことができるその他の既知の方法を使用することにより、不活性化されうる。用語「動物」には、ヒトを含むすべての脊椎動物が含まれうる。該用語はさらに、胚形成期および胎児期を含むすべての発生段階の個々の動物を含むことができる。本発明による遺伝子組換え動物を得るために、動物の遺伝物質が組換えＤＮＡ技術のような遺伝子工学技術を使用して改変されてもよい。組換えＤＮＡは、例えば、特定の目的のため様々な形質をコードするかまたは変更するために、プラスミドのような既存の生物ゲノムに関連ＤＮＡを加えることにより生産される。そのような動物の例には、限定するものではないが、ツメガエル（xenopus）、魚類、両生類、爬虫類および鳥類が挙げられる。本発明に使用される遺伝子組換え動物はさらに、哺乳類であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類には、ヒト、げっ歯類、イヌ属（Canis）、有蹄類（Ungulate）、ネコ科（Felidae）、ウサギ科（Leporidae）、およびマカク属（Macaque）が挙げられる。げっ歯類の例には、限定するものではないが、マウス、ラット、リス、シマリス、ジリス、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、アレチネズミ、モルモット、チンチラ、プレーリードッグ、およびマーモットが挙げられる。イヌ属の例には、限定するものではないが、イヌ、オオカミ、コヨーテおよびジャッカルが挙げられる。有蹄類の例には、限定するものではないが、ウマ、ロバ、シマウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、キリンおよびムースが挙げられる。ネコ科の例には、限定するものではないが、ネコ、カラカル、ピューマ、チータ、およびヒョウが挙げられる。ウサギ科の例には、限定するものではないが、アナウサギ（rabbit）、ノウサギ（hare）およびジャックウサギが挙げられる。マカク属の一例としてアカゲザルが挙げられる。

別の態様では、本発明は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、対象とする化合物を、本明細書中に記載されるような動物または遺伝子組換え動物に投与するステップを含む。該方法はさらに、化合物がＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができるかどうかを測定するステップを含む。

本発明によって使用される対象となる化合物は、該化合物がＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる限り任意の形態に製剤化されていてよい。化合物は、例えば、医薬組成物または化粧品組成物の形態に製剤化されていてもよい。化粧品組成物の例には、ジェル剤、軟膏、クリーム、ローション剤、セラム、パスタ剤、石鹸、エアゾール剤、可溶性錠剤、散剤、スティック剤、水ベースまたは油ベースの懸濁剤および乳剤が挙げられる。

この場合、ＰＹＣＲ１の発現は遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいずれかで変化させることができる。遺伝子発現レベルまたはタンパク質量のレベルは、それぞれのタンパク質の遺伝子発現／活性／量が、対照のレベルと比較して、例えば約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、またはそれ以上増加または減少したとき、「変化」または「改変」されたとみなされる。別例として、発現レベルまたは活性レベルまたはタンパク質レベル／量は、遺伝子発現／または活性／タンパク質レベルが、対照のレベルと比較して、例えば少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍もしくはそれ以上増加または減少したとき、「増加」または「減少」したとみなされる。このように、いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用される対象の化合物は、例えばＰＹＣＲ１遺伝子の発現を増大または減少させることができる。

したがって、細胞においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法を提供することは本発明のさらなる態様である。該方法は、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入するステップを含む。任意の細胞が本発明の方法で使用されうる。いくつかの実施形態では、細胞は宿主生物から得てもよいし宿主生物から派生したものであってもよく、宿主生物は任意の生物であってよい。細胞はそれぞれの宿主生物から、生検試料または血液試料のような試料の形態で、直接採取、例えば単離されてもよい。また、細胞は宿主生物からの採取、例えば単離が完了しており、続いて培養、増殖、形質転換または選択された処理が行われていてもよい。いくつかの実施形態では、本発明によって使用される細胞は、宿主生物に包含されていてもよい。例えば、細胞が宿主生物の血液中または組織中、例えば臓器の中に存在していてもよい。細胞の起源であるかもしくは採取（例えば単離、精製または濃縮）元である宿主生物、または細胞が包含されている宿主生物は、任意の生物、例えば微生物、動物、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、げっ歯動物類を含む哺乳類、無脊椎動物の生物種、例えばカエル、ヒキガエル、サンショウウオもしくはイモリを含む平滑両生亜綱（subclass Lissamphibia）の生物種、または植物であってよい。哺乳動物の例には、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、リス、ハタネズミ、カモノハシ、ニワトリ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ムフロン、モルモット、ハムスター、チンパンジー、アカゲザル、マカク、またはヒトが挙げられる。

本発明はさらに、上述の動物を含む動物においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法も提供する。該方法は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を動物に投与するステップを含む。該化合物は、いくつかの実施形態では、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる核酸分子を含むことができる。そのような核酸分子の例は上述されており、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびこれらの組み合わせが挙げられる。

ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しているかまたはＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患を発症するリスクを有する対象者を治療する方法を提供することは、本発明の別の態様である。いくつかの実施形態では、該方法は、ＰＹＣＲ１またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を対象者に導入するステップを含む。他の実施形態では、該方法はさらに、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を投与するステップを含むこともできる。個々の使用は、例えば、この目的のための薬剤または医薬組成物の製造であってもよい。従って、本発明の方法は、上記に定義された核酸または化合物の使用、例えば薬剤の製造における使用を含む。ＰＹＣＲ１の発現を変化させることができる化合物は、本明細書中に記載された本発明の方法を使用して同定可能である。これに関して、本発明の方法または本発明によって使用される方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施されてもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されてもよい。

用語「投与する」は、対象とする化合物、本発明の核酸またはこれらそれぞれの医薬組成物を、生物の１個以上の細胞または組織の中へ組み入れる方法に関する。それぞれの化合物、核酸またはこれらの医薬組成物の典型的な投与経路には、経口送達、経皮送達、および非経口送達が含まれる。適切な投与経路には、例えばデポ剤、経口、直腸、経粘膜、静脈内、髄内への注射、および髄腔内注入、脳室内直接注入、腹腔内注入、鼻腔内注入または眼内注入が挙げられる。

例示の実施形態では、８個のミスセンス突然変異、１個のフレームシフト突然変異、５個のスプライス部位突然変異、およびエキソン５のエキソン‐イントロン境界を含む１個の２２ｂｐ欠失が同定された（表１、図６）。罹患者は共通の民族的背景を有していなかったが、上記突然変異のうちの５つは頻発性であった。ＰＹＣＲ１タンパク質の発現を調査するために、発端者および兄弟姉妹である非罹患者から皮膚線維芽細胞が単離された（図２）。ホモ接合のスプライス部位突然変異を有する患者（ＳＪ）ならびにミスセンスおよびフレームシフト突然変異を有する複合型のヘテロ接合の患者（ＤＩ）から得た線維芽細胞において、ＰＹＣＲ１タンパク質レベルの大きな低下が検出された（図２ａ）。ミスセンス突然変異ｐ．Ｇｌｙ２０６Ｔｒｐおよびｐ．Ａｒｇ２５１Ｈｉｓは、対照の細胞と比較してタンパク質レベルの低下をもたらした（図２ａ）。細胞質型であると記載されることの多いＰＹＣＲ１タンパク質は、プロリン代謝経路にも属するミトコンドリア基質タンパク質Δ^１‐ピロリン‐５‐カルボン酸合成酵素（Ｐ５ＣＳ）とともに局在していた（図２ｂ〜ｆ）。したがって、ＰＹＣＲ１はミトコンドリアタンパク質であること、および本明細書中に記載された突然変異は機能喪失をもたらすことを結論付けることができる。

別の例示の実施形態では、マウスの組織におけるＰｙｃｒ１発現解析から、最も重篤な影響を受ける２つの組織である硬骨および皮膚において、最も高いｍＲＮＡレベルが示された（図７ｂ）。ＰＹＣＲ１にはヒトでは２つのパラログが、すなわち極めて類似しているＰＹＣＲ２およびより関連性の遠いＰＹＣＲＬが、存在する。ＰＹＣＲ１突然変異を有する個体由来の線維芽細胞における著しい発現変化は、ＰＹＣＲ２またはＰ５ＣＳについては観察されなかった（図７ａ）。ＰＹＣＲ１はプロリンの新規（de novo）合成における必須かつ最後のステップを触媒するので、罹患者が低プロリン血症を示すかどうかという問題について調査がなされた。罹患者の血清プロリンレベルはわずかに低下したが、正常範囲内であった（図８ａ）。同様に、培養した皮膚線維芽細胞は、プロリンレベルの低下（図８ｂ）やプロリンを含まない培地中での増殖速度の低下（図８ｃ）を立証する証拠を示さず、プロリン栄養要求性には相反していた。

さらなる例示の実施形態では、ＰＹＣＲ１のミトコンドリア局在に基づいて、ミトコンドリアネットワークがより詳細に調査された。超微細構造解析から、ミトコンドリアおよびそのクリステの形態異常が明らかとなった（図３ａ、ｂ）。これらの変化は酸化ストレスで悪化した（図３ｃ〜ｅ）。細胞培養培地へのＨ_２Ｏ_２の添加は、罹患者由来の細胞における線維状のミトコンドリアネットワークの崩壊を引き起こしたが、対照細胞のミトコンドリアでは変化はほとんど観察されなかった（図３ｆ）。正常な培養条件の下では、患者および対照者の線維芽細胞は、アポトーシスのレベルにおいて差を示さなかった。しかしながら、Ｈ_２Ｏ_２への短時間曝露の後では、患者の線維芽細胞における細胞死の、対照と比較して５倍の増加が検出された（図３ｆ）。これは、ＰＹＣＲ１が酸化ストレスに対する細胞の応答に関与することを示唆している。

別の例示の実施形態では、ＰＹＣＲ１に突然変異を有する患者は出生時点で影響が出ていることから、胚発生中のＰＹＣＲ１の機能について調査がなされた。進化を通じて保存されており、ＰＹＣＲ１オルソログは細菌、植物、昆虫および脊椎動物の各生物に見出される（図４ａ）。ツメガエルの胚において該疾患をモデル化するために、本発明によるＰｙｃｒ１に対するモルフォリノ（ＭＯ）が設計された（図４ｂ）。Ｐｙｃｒ１を枯渇させた胚は、初期のオタマジャクシ期までは明白な発生不全を示さなかった。ステージ３０までに、Ｐｙｃｒ１モルファント胚は目および尾芽を発生させることができなかった（図４ｃ、ｄ）。この表現型は、腹側または背側の割球のみに注入するとそれぞれ眼球および尾部の発生が妨げられたことから、細胞自律的であることが示された（図４ｅ〜ｉ）。皮膚の変質が明白となり、後に遊泳型オタマジャクシ期で外胚葉の浮腫へと進行した（図４ｊ、ｉ）。皮膚の組織切片から、肥大した細胞および核を伴う上皮の崩壊が明らかとなった（図４ｋ、ｍ）。ヒトＰＹＣＲ１のｍＲＮＡを微量注入（マイクロインジェクション）するとＰｙｃｒ１モルファントで観察された表現型が部分的にレスキューされたが、Ｋ２１５‐Ｄ３１９Ｄｄｅｌ突然変異を模倣したヒトＰＹＣＲ１のｍＲＮＡでは効果はなかった（図９）。同様に、ゼブラフィッシュにおけるＰｙｃｒ１およびＰｙｃｒ２のモルフォリノを介したノックダウンは同様の皮膚の表現型をもたらし（図１１ａ、ｂ）、これはヒトの野生型ＰＹＣＲ１ ｍＲＮＡの注入によりレスキューされた（図１１ｄ、ｅ）。Ｐｙｃｒ１モルファントは視認可能な循環血中赤血球を有していなかった（図１０ａ、ｂ）。この貧血を遡ると、ステージ２５における、初期造血のマーカーであるＳｃｌ発現の喪失に行き着いた（図５ｅ、ｆ）。

ステージ２５〜３０までに、皮膚の形成不全には、アポトーシス細胞の数の顕著な増加が伴っていた（図５ａ〜ｄ、ｇ）。Ｐｙｃｒ１モルファントで観察された皮膚の欠損は貧血によって引き起こされた可能性があったので、野生型の胚とＰｙｃｒ１ ＭＯを注入した胚との間で並体結合が行なわれた（図１０ｃ）。血液循環を共有して外胚葉の浮腫の範囲は減少したが、皮膚の形成不全、アポトーシスおよび発育不全は並体結合後のＰｙｃｒ１モルファントにおいてレスキューされなかった（図５ｇ〜ｉ）。Ｐｙｃｒ１は、ツメガエルにおける血液新生および皮膚発生の際に独立した役割を果たすということが結論付けられる。カエルで観察された貧血は、Ｐｙｃｒ２遺伝子を欠くこの生物種においてＰｙｃｒ１によって果たされる二元的役割を反映している可能性がある。ヒトでは、赤血球におけるＰＹＣＲ２の役割は十分立証されている^{２４〜２５}。まとめると、上記の結果から、ＰＹＣＲ１における機能喪失型突然変異はミトコンドリアの機能に支障をきたし、このことが胚発生中のアポトーシスおよび成年期における全面的な繁殖不能をもたらすものと示唆される。

ＰＹＣＲ１は、１‐ピロリン‐５‐カルボキシラート（Ｐ５Ｃ）のＬ‐プロリンへの変換を触媒するＮＡＤ（Ｐ）結合型ロスマンフォールドドメイン・スーパーファミリーに属する。いくつかの遺伝性疾患はプロリン代謝経路に結び付けて考えられてきた^１０。最も顕著には、Ｐ５ＣＳの突然変異は、精神遅滞、関節の過度可動性、および皮膚の弛緩という症状を引き起こす（ＯＭＩＭ ６１２６５２）^{１１〜１３}。本明細書中に記載された患者のように、Ｐ５ＣＳの欠損が一貫して血清中プロリンレベルの低下を特徴とするわけではない^{１１、１２}。更に、これらの患者由来の線維芽細胞は、Ｐ５ＣＳの欠損に関して記載された増殖欠損を示さなかった^１３。ＰＹＣＲ１に関係した疾患の表現型は他の種類の皮膚弛緩症と重複し、このことは、このコホートの罹患者がＷＳＳ、ＧＯ、またはＤＢＳの診断の下で先述されているという事実がよく反映している^{５、６、８、９、１４、１５}。ＧＯは知能障害をもたらさないが、ＡＲＣＬ２は軽度または中程度の精神遅滞および脳異常を含むことが多い^１６。エンドソームおよびゴルジ装置に局在するＶ‐ＡＴＰアーゼ複合体のサブユニットａ２をコードするＡＴＰ６Ｖ０Ａ２の突然変異は、ＡＲＣＬ２において同定されている^４。別の小胞ゴルジタンパク質であるＧＯＲＡＢの突然変異はＧＯにおいて同定されている。表現型の類似性は、これらの疾患における、共通しているが未だ究明されていない病理学的機構を示唆している。興味深いことに、アポトーシスの増加は、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２欠損を有するＡＲＣＬ２患者からの線維芽細胞においても見られる^１７。

好気的代謝における、潜在的に有害な活性酸素種（ＲＯＳ）の生成は、老化研究の中心となってきた^１８。ＲＯＳは当初は酸化的リン酸化反応の毒性副産物と見なされたが、最近になって、酸化還元反応依存的なシグナル伝達の過程に関するその重要性が明らかになった^{１８、１９}。実際、プロリンはＲＯＳレベルの調節に関与してきた^{２０、２１}。更に、ＰＹＣＲ１および２は、細胞質中およびミトコンドリア中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）^＋比の調節に関与してきた^２２。ミトコンドリアの断片化は神経変性障害において細胞機能を低下させると記載されている^２３。更に、ミトコンドリアの融合における変化は老齢化を引き起こす可能性がある^２４。ミトコンドリアの機能および完全性に関するＰＹＣＲ１の正確な役割は未だ不明であるが、サッカロミセス（Saccharomyces）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）およびショウジョウバエ（Drosophila）のような他の生物種におけるＰＹＣＲ１のオルソログがストレス抵抗性に関連付けられているという事実は、ヒトのＰＹＣＲ１も、ミトコンドリア内へ急速に動員可能なプロリンおよび還元性等価物のリザーバを維持することにより、ストレスに対する適応保護を提供しうることを示唆している^２５。

概括すると、ＰＹＣＲ１機能の喪失をもたらすＰＹＣＲ１の突然変異は、老人様皮膚萎縮骨形成異常症、ＡＲＣＬ２型およびＡＲＣＬ３型と重複する表現型を誘発する常染色体劣性皮膚弛緩症の主な原因である。病態生理学的基礎は、アポトーシス増加による発生不全をもたらす、ミトコンドリア機能の障害である。本発明者らによって明らかにされた老化の過程におけるミトコンドリア機能の重要性は、通常の加齢関連疾患についての新たな治療戦略を開発する助けとなりうる^２７。そのような治療戦略には、加齢関連疾患を治療するかまたは皮膚の多皺のような加齢の影響を予防するための、新しい薬学的用途または化粧用途が含まれうる。例示の実施例として、新しい化粧品化合物または医薬組成物のスクリーニングのために実験動物を使用するスクリーニングアッセイが作り出されてもよい。実験動物の一例には、ＰＹＣＲ１遺伝子の突然変異を担持する生きているヒトの皮膚移植片が移植された、ヌードマウスが挙げられる。

１つの態様では、本発明はさらに、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、例えば米国特許第４，６７７，９６８号明細書に記載されるように、生きている動物の皮膚の少なくとも１つの層を含む単離された皮膚片であって、試験動物に付着させた皮膚片を提供するステップを含む。該方法は、対象とする化合物を、生きている動物の皮膚に適用するステップをさらに含む。

これに関して、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物をスクリーニングするために、対象とする化合物が、ヌードマウス上に移植された生きているヒトの皮膚の上に直接適用されてもよい。この方法によって使用される化合物は、上述のような医薬組成物または化粧品組成物を含む任意の形態であってよい。

いくつかの実施形態では、皮膚片は、本発明のムテインを発現する細胞を含むことができる。該細胞は例えば線維芽細胞を含むことができる。皮膚片は、一方の表面上に生きているヒト皮膚の層を、かつ他方の表面上に生きている動物の皮膚を備えることができる。該皮膚片は、試験動物に付着可能な単離された血管系によって供給を受けてもよい。生きている動物の皮膚は試験動物と同じ生物種のものであってもよいし、異なる生物種のものであってもよい。動物は、ヒトまたはげっ歯類、例えば無胸腺のげっ歯類などであってよい。

概括すると、上記のスクリーニングアッセイは、生きているヒトの皮膚と接触している化粧品組成物または医薬組成物の効果を同定および分析する方法を提供することができる。対象とする化合物は、皮膚上で直接表面に適用することによって試験することができる。生きているヒトの皮膚の、様々な化合物に応答する挙動および効果を研究することが可能である。

実施例
以下の非限定的な実施例も上述の手法の例証であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

［遺伝子型決定および連鎖解析］ ＤＮＡ試料を２２組の家族から得たが、その前に参加者から告知に基づく同意を得るとともに地域の倫理委員会（シャリテ倫理委員会（Ethikkommission der Charite））による承認を得た。本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標） ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトマッピング２５０Ｋアレイ（米国カリフォルニア州サンタクララ所在のアフィメトリクス（Affymetrix））を使用して、８組の家族における全ゲノム連鎖解析を行なった。遺伝子型はＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＤＮＡ解析ソフトウェア（ＧＤＡＳ ｖ２．０、アフィメトリクス）によって判定された。本発明者らはＸ染色体上のヘテロ接合のＳＮＰを数えることにより試料の性別を確認した。関連誤差はGraphical Relationship Representationプログラムの助けを借りて評価した。メンデル性遺伝のエラーを検出するためにPedCheckプログラムを適用し、そのようなエラーを備えたＳＮＰについてのデータはデータセットから取り除いた。非メンデル性遺伝のエラーはＭＥＲＬＩＮ（登録商標）プログラムの使用により同定し、関連試料について見込みのない遺伝子型は削除した^２８。染色体のすべての遺伝子型を同時に使用するノンパラメトリック連鎖解析を、ＭＥＲＬＩＮ（登録商標）を用いて実行した。パラメトリック連鎖解析は、１１０個または２００個のＳＮＰのセットを用いてスライディングウィンドウ方式の段階的な使用により修正版GENEHUNTER２．１プログラムによって行なわれた。ハプロタイプを、GENEHUNTER２．１を用いて再構築し、HaploPainterを用いてグラフ表示した^２９。

［突然変異解析］ 位置上の候補遺伝子はGenBankデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍａｐｖｉｅｗ／）およびＥｎｓｅｍｂｌデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から得た。遺伝子は、各エキソンに隣接するプライマーを用いたＤＮＡの直接配列決定によって解析した。プライマー配列は各遺伝子の参照配列に基づくものとした。ＰＹＣＲ１変異スクリーニングのためのプライマー配列は、添付の表１に示されている。配列解析は、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクルシーケンシングキット（米国カリフォルニア州フォスターシティー所在のアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を用いて行い、生成物を３７３０ＤＮＡアナライザー（米国カリフォルニア州フォスターシティー所在のアプライド・バイオシステムズ）で解析した。

［ゲノム遺伝子座捕獲法］ 簡潔に述べると、遺伝子座１７ｑ２５において高度に反復した領域を除く７２，０４８，３５７と７８，７７４，７４２との間に存在する遺伝子のすべてのエキソンの配列を標的として、カスタムアレイ（アジレント（Agilent）２４４Ｋ）を設計した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリ生成プロトコール・バージョン２．３に従ってＤＮＡライブラリを調製し、該ライブラリをアジレント ＣＧＨ ２４４Ｋアレイのプロトコールに従って該カスタムアレイにハイブリダイズし、次いで洗浄、溶出、および増幅を行った。各試料をＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）フローセルの１つのチャネルに供し、製造業者の標準プロトコールを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ゲノムアナライザー（ＧＡ）により配列を決定した。画像データを添付のGA Pipelineバージョン１．０によって処理し、すべての配列を、Blat−like Fast Accurate Search Tool（BFAST，ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅｃｕｒｅ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ＢＦＡＳＴ，Ｎ．ホーマー（N．Homer）ら、準備中）によってヒトの参照ゲノム（UCSC build １８， ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）に対してアラインした。ミスマッチについては、突然変異が常に見られ（ホモ接合）、かつ既知のｄｂＳＮＰ１２９エントリーのミスマッチと重複しなかった場合、２回以上見られたものについてフィルタをかけた。試料を追跡するためのＬＩＭＳツール（SeqWare LIMS）および配列解析のためのパイプライン（SeqWare Pipeline）を提供するオープンソースのSeqWareプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｑｗａｒｅ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を、この研究全体にわたって使用した。

［細胞培養］ ヒトの皮膚線維芽細胞は、ＤＭＥＭ（ロンザ（Lonza））に１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ロンザ）、１％のウルトラグルタミン（Ultraglutamine）（ロンザ）、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ロンザ）を補足したものの中で、５％ＣＯ_２および３７℃で培養した。

［定量的ＰＣＲ］ ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン（Invitrogen））法を使用してＰ４マウスの臓器から単離した。１μｇのＲＮＡを、Revert Aidキット（フェルメンタス（Fermentas））およびランダムヘキサマーを使用して逆転写した。定量的ＰＣＲを、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（アプライド・バイオシステムズ）を用いて実施した。プライマーは添付の表１に示されている。

［ウエスタンブロット解析］ 初代皮膚線維芽細胞の全細胞溶解物のミトコンドリア画分および細胞質画分を、哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キット（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））を用いて得て、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって展開した。ウエスタンブロット解析については、ＰＶＤＦメンブレンを、下記抗体すなわち：抗アクチンＡ５０６０（シグマ（Sigma））１：１０００、ウサギ抗ＰＹＣＲ１（プロテインテック（Proteintech））１：５００を用いて探査した。

［免疫蛍光分析］ 免疫蛍光法については、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した。細胞を、１×ＰＢＳ中の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドの中で１０分間固定し、１×ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中の０．４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリトンＸ‐１００を用いて４℃で１０分間透過処理した。ＰＹＣＲ１に対する特異抗体（ウサギ抗ＰＹＣＲ１（プロテインテック）１：５００およびＰ５ＣＳに対する特異抗体（マウス抗Ｐ５ＣＳ（アブノバ（Abnova））１：３００を３％ＢＳＡ中で４℃にて一晩インキュベートした。視覚化については、抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（インビトロジェン、モレキュラープローブス（Molecular Probes））および抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン、モレキュラープローブス）のコンジュゲートを適用した。ＤＮＡをＤＡＰＩによって染色し、細胞をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（サイエンティフィックサービシズ（Scientific Services））にマウントした。画像を、６３×プランアポクロマート油浸対物レンズを用いてＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ（ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在のカール・ツァイス（Carl Zeiss））を使用して収集した。

［ミトコンドリアの形態学］ ミトコンドリアネットワークの形態を、過酸化水素（ネオラボ（neoLab））を用いた処理の後に調査した。細胞を５０％コンフルエントまで培養した。いずれの物質を用いた処理も正常な培地の中で実施した。細胞に１００ｎＭのMito Tracker Red CM−H2XRos（インビトロジェン）を装荷した。細胞を５００μＭのＨ_２Ｏ_２とともに５分間インキュベートした。細胞を、１×ＰＢＳ中の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドの中で４℃にて１０分間固定した。ＤＮＡをＤＡＰＩによって染色し、細胞をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（サイエンティフィックサービシズ）にマウントした。ＢＸ６０オリンパス顕微鏡を使用してすべての試料の写真を無作為に収集し、ミトコンドリアの形態を測定した。

［アポトーシスアッセイ］ 過酸化水素（ネオラボ）処理後のアポトーシス測定については、細胞を、ＦＣＳを含めずに２００μＭ Ｈ_２Ｏ_２とともに１時間インキュベートした。ストレス期間（stress periode）の後、培地を正常培地＋０．４％ＦＣＳに交換し、細胞を正常条件でさらに２４時間インキュベートした。同じ実験を、５ｍＭ Ｌ‐プロリン（シグマ・アルドリッチ（Sigma−Adrich））が補足された培地で実施した。細胞を、１×ＰＢＳ中の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドの中で１０分間固定し、１×ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中の０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリトンＸ‐１００を用いて氷上で２分間透過処理した。アポトーシス測定については、ＴＵＮＥＬアッセイ（ロッシュ（Roche））を製造業者の説明書に従って実施した。細胞を、１×ＰＢＳ中の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドの中で４℃にて１０分間固定した。ＤＮＡをＤＡＰＩによって染色し、細胞をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（サイエンティフィックサービシズ）にマウントした。写真を無作為に収集した。実験はそれぞれ３回実施した。１つのアッセイごとに２０００個を超える細胞を分析した。

［増殖アッセイ］ 増殖速度を評価するために、２．５×１０^４個の細胞をカバーガラス上に播種した。該細胞を、１０μＭのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（ロッシュ）を含有する培地中で８時間インキュベートした。細胞を、２４、４８、および７２時間後に１×ＰＢＳ中の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドの中で１０分間固定し、次いで３Ｎ ＨＣｌ中で室温にて１０分間インキュベートした。これを、１×ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中の０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリトン‐Ｘ１００を用いて４℃で３０分間透過処理した。ＢｒｄＵに対する特異抗体（Ｇ３Ｇ４）１：５００を、室温で１時間インキュベートした。視覚化については、抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン、モレキュラープローブス）のコンジュゲートを適用した。ＤＮＡをＤＡＰＩによって染色し、細胞をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（サイエンティフィックサービシズ）にマウントした。この実験を、１０％の透析されたＦＣＳを含む培地、および５ｍＭ Ｌ‐プロリン（シグマ・アルドリッチ）が補足された培地においても実施した。

［モルフォリノオリゴおよびＲＮＡの注入］ ツメガエルＰｙｃｒ１用の２５ｂｐモルフォリノ（ＭＯ）アンチセンスオリゴマーをジーンツールス（Gene Tools）から入手したが、これは次の配列：５’‐ＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧ‐３’で構成されるものであった。該ＭＯを、製造業者の説明書に従って滅菌水中に再懸濁して濃度１ｍＭとした。胚に、４ｎｌ（注入１回あたり３３ｎｇのＭＯ）を、２〜４細胞期において半径方向に４回注入した。４細胞期の各割球中に２００ｐｇとしたレスキュー実験に、ヒトＰＹＣＲ１ ｃＤＮＡの合成キャップ化ｍＲＮＡを使用した。ゼブラフィッシュの実験については、ゼブラフィッシュＰｙｃｒ１およびゼブラフィッシュＰｙｃｒ２に対するＭＯをジーンツールスから入手した、すなわちＤｒＰｙｃｒ１‐ＭＯ ５’‐ＣＡＧＣＴＣＣＧＡＴＡＡＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴ‐３’およびＤｒＰｙｃｒ２‐ＭＯ ５’‐ＣＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴ‐３’である。胚に、１細胞期において４ｎｌ（注入１回あたり３３ｎｇのＭＯ）または同時注入の場合は各ＭＯにつき２ｎｌを注入した。レスキュー実験は、ＳＰ６‐キット（アンビオン（Ambion））を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された２０ｐｇまたは２００ｐｇのヒトＰＹＣＲ１キャップ化ｍＲＮＡの同時注入によって実施した。

［発生学的方法］ 受精、注入、ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＴＵＮＥＬのプロトコールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｖｅｒｓａｄｅ．ｃｏｍ−ａ．ｇｏｏｇｌｅｐａｇｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに見られる^３０。生きている胚における細胞死の分析は、０．１×バース液（Barth）中のアクリジンオレンジ（２μｇ／ｍｌ）とともに３０分間、暗所でオタマジャクシをインキュベートすることにより実施した。０．１×バース液中で多数回洗浄した後、胚の画像をライカ（Leica）ＤＦＣ ３００ ＦＸカメラで蛍光（４８０ｎｍ）下にて撮影した。並体結合をステージ２２で実施したが、コリオン除去した胚の上に、わずかな切込みを実施した後で腹部外胚葉を接合した。並体結合した胚を治癒するまで１×バース液中で培養してから、スタインバーグ（Steinberg）１×溶液中に移した。ライカのＩＣＤカメラを装備した実体顕微鏡Ｍ２０５ ＦＡを使用して、一連の焦点面における胚の画像を撮影した。その後、画像をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳ３を用いて１つの写真像にマージした。

［皮膚移植のための試験動物の作成］ 試験動物上の単離皮膚片を得るために、ヌードマウスの被験領域の３方に沿って切込みを作製した。この切込みの前に、ヌードマウスを腹腔内ケタミン投与によって麻酔した。ヒトの皮膚を、ヌードマウス上に移植するために表１に言及された家族の患者から得た。ヒトの皮膚移植片は、ヌードマウス上に作成された皮膚片とほぼ同じ大きさかつ形態であった。ヒトの皮膚移植片は、直ちに使用するか、または１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ‐１６４０中に４℃でおよそ７２時間以内もしくは移植に使用されるまで、保存した。ヌードマウス上にヒトの皮膚移植片を移植するために、ヒトの皮膚移植片を、ヌードマウスの単離皮膚片領域の皮下側表面に外科的に付着した。皮膚片およびヒトの皮膚移植片をそのまま縫合し、これらの皮膚層の間に血管系が挟まれた狭装物を作成して、皮膚片から出るほぼ全ての血液が、この単離血管系を通って流れるようにした。ヒトの皮膚およびヌードマウスの影響皮膚領域が共に増殖して一体的な皮膚片を形成するようになったら、次にこの血管が新生された皮膚片を、皮下トンネルを通してマウスの背面に移動し、そこで試験のためにその場に縫合した。ヒトの皮膚移植片の拒絶を防ぐために、マウスに、２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でシクロスポリンの皮下注射を行った。

［登録コード］ Ｇｅｎｂａｎｋの参照配列（Refseq）ＤＮＡ：ヒト（Homo sapiens）ＰＹＣＲ１アイソフォームＡ ＮＭ＿００６９０７．２、ヒトＰＹＣＲ１アイソフォームＢ ＮＭ＿１５３８２４．１、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ＰＹＣＲ１ ＮＭ＿００１０９１６１９、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）ＰＹＣＲ１ ＢＣ０９５３５４；ゼブラフィッシュＰＹＣＲ２ ＢＣ０６０９０５。

本発明について説明する例証の実施例
図１ デ・バーシーのＰＹＣＲ１関連常染色体劣性早老症候群の患者の表現型の特徴。（ａ）典型的な三角顔を備えた家族ＤＩの９か月齢の女児患者。（ｂ）家族ＤＴの６歳の男児患者における同様の顔貌。（ｃ）最初にリンクリー・スキン症候群と診断された家族ＴＰの７歳の女児患者。上顎前突症を含む典型的な顔面形態に注目されたい。（ｄ）家族ＨＢの罹患者における、手背の皮膚の多皺および典型的な内転母指。（ｅ〜ｈ）家族ＤＩの罹患者からの皮膚生検の所見。（ｅ、ｆ）ワイゲルト染色により、真皮網状層における、対照と比較してまばらで薄くかつ寸断された弾性線維が明らかとなっている。スケールバーは１００μｍ。（ｇ、ｈ）超微細構造解析から、家族ＤＩの罹患者における、対照と比較して線維成分および無定形成分の両方の低減を伴い著しく縮小した弾性線維（矢印）の大きさが確認される。スケールバーは５００ｎｍ。（ｉ）ホモ接合性マッピングから、染色体１７ｑ２５上のマーカーｒｓ８０６５４３１とｒｓ１０４６８９６との間の２．８Ｍｂの最小候補領域が得られた。最も情報量の多い４つの家系図だけが示されている。（Ｊ）７２．０５〜７８．７７Ｍｂにわたる最大候補領域のゲノム捕獲とその後の次世代シーケンシング。シトシンからチミジンへの配列変化は、家族ＧＯの患者で７回配列決定された。この塩基変化は、ＰＹＣＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質に単一のｐ．Ａｒｇ１１９Ｈｉｓ突然変異をもたらした。

図２ ＰＹＣＲ１突然変異の影響。（ａ）対照者および患者からの初代皮膚線維芽細胞におけるＰＹＣＲ１タンパク質発現のウエスタンブロット解析。アクチン（ＡＣＴＩＮ）はローディング対照としての役割を果たした。罹患者ＤＩおよびＳＪにおけるＰＹＣＲ１発現の欠如に注目されたい。一方ＥＵおよびＴＰは著しい減少を示している。（ｂ〜ｆ）皮膚線維芽細胞におけるＰＹＣＲ１およびＰ５ＣＳの免疫蛍光検出。（ｂ）対照の線維芽細胞では、ＰＹＣＲ１およびミトコンドリア基質タンパク質Ｐ５ＣＳは共局在化している。患者ＤＩ（ｅ）およびＳＪ（ｄ）の線維芽細胞では、ＰＹＣＲ１シグナルの免疫染色は検出不能である。対照的に、ＴＰ（ｃ）およびＥＵ（ｄ）の線維芽細胞では、ミトコンドリアにおけるＰＹＣＲ１染色は対照に比べて強度が低下している。ＤＩ、ＳＪおよびＴＰにおける異常なミトコンドリアネットワークに注目されたい。スケールバーは２０μｍである。

図３ ＰＹＣＲ１の喪失は酸化ストレスに対する感受性増大をもたらす。（ａ、ｂ）ミトコンドリアの形態の超微細構造解析。対照の線維芽細胞のミトコンドリア（ａ）は規則的に配列されたクリステを有する。一方、（ｂ）罹患者ＤＩの線維芽細胞は著しく変化したクリステおよび縮小した直径を示す。スケールバー：１μｍ。（ｃ、ｄ）酸化ストレス時のミトコンドリアの形態の変化。細胞培養培地に５００μＭのＨ_２Ｏ_２を追加して１０分間で、家族ＳＪの罹患者からの線維芽細胞におけるミトコンドリアネットワークの崩壊がもたらされ（ｄ）、対照細胞では管状のミトコンドリアネットワークは大部分が無傷のままである（ｃ）。スケールバー：２０μｍ。（ｅ）酸化ストレス時のミトコンドリアの形態変化の定量化。酸化ストレスが無いとき（灰色のバー）、ほとんどの対照者（ｎ＝２）および患者（ｎ＝４）の細胞は管状のミトコンドリアを示す。断片化した形態または中間的な形態（interm．）を有する細胞は、ごく僅かしかなかった。対照的に、酸化ストレス下では（黒色のバー）、断片化したミトコンドリアを有する細胞の数は、対照よりも患者の細胞において非常に大きく増加した。２つの独立した実験からのデータが平均されている。（ｆ）酸化ストレスの２４時間後の、ＴＵＮＥＬによるアポトーシス細胞死の定量化。対照者（ｎ＝２）および罹患者（ｎ＝４）からの線維芽細胞は、正常な培養条件下ではアポトーシス率の差を示さなかった（対照）。２００μＭ Ｈ_２Ｏ_２とともに１０分間インキュベートした２４時間後では、罹患者からの細胞においてアポトーシスの５倍増加（ｐ＝０．０２６）が観察された。数値は対照実験（ｎ＝１）の対照細胞に対して標準化されている。

図４ Ｐｙｃｒ１ツメガエルモルファントの表現型。（ａ）Ｐｙｃｒ１は、細菌から植物、昆虫、脊椎動物まで進化的に保存されている。（ｂ）ツメガエルＰｙｃｒ１の翻訳を阻止するモルフォリノオリゴの設計。（ｃ）ステージ３０の対照胚。（ｄ）４細胞期で各割球に注入されたＰｙｃｒ１モルファントは、尾部の発育に失敗し、かつ眼球が発育不全であった。（ｅ）背側へのＭＯ注入は眼球を害したが尾部の発生は害さなかった。（ｆ）腹側へのＭＯ注入は尾部を害したが眼球の発生は害さず、Ｐｙｃｒ１が細胞自律的に必要とされることが示唆された。白色の矢印記号は皮膚の皺を指し、この皺はステージ４０までに外胚葉の浮腫へと進行する。（ｇ）前脳／中脳マーカーＯｔｘ２および体節マーカーＭｙｏＤで染色されたステージ２３の対照のオタマジャクシ。（ｈ）Ｐｙｃｒ１が背側で枯渇すると、Ｏｔｘ２によって標識された背‐前側構造物に影響を及ぼすが、ＭｙｏＤによって標識された腹‐後側構造物には影響しない。（ｉ）Ｐｙｃｒ１が腹側で枯渇すると、ＭｙｏＤによって標識された腹‐後側構造物に影響を及ぼすが、Ｏｔｘ２によって標識された背‐前側構造物には影響しない。（ｊ）遊泳型オタマジャクシ期の対照胚。（ｌ）Ｐｙｃｒ１ ＭＯが注入された胚は重篤な成長遅延を被り、全身に大規模な外胚葉の浮腫を示した。（ｋ）ステージ４５の対照胚の組織学的皮膚切片は、外側の胞皮および内側の感覚層で構成される二層状の表皮を示した。（ｍ）肥大した細胞、核および細胞の突出を備えた表皮の無秩序な構造。

図５ Ｐｙｃｒ１モルファントにおける皮膚の発育不全には自発的アポトーシスを伴い、貧血とは無関係である。（ａ）ステージ３０の対照胚。（ａ’）（ａ）に示された胚のアクリジンオレンジによるバックグラウンド染色。（ｂ）腹側のみへのＭＯ注入から得られたＰｙｃｒ１モルファント。（ｂ’）（ｂ）に示された胚における死細胞（濃緑色）のアクリジンオレンジ標識。注入が行われた腹側の割球に由来する胚の腹‐後側半分のみがアポトーシスを起こしていることに注目されたい。（ｃ）ステージ３３のオタマジャクシをＴＵＮＥＬ染色すると、アポトーシス細胞をほとんど示さなかった（挿入図：ステージ２５の対照）。（ｄ）Ｐｙｃｒ１モルファントは、対照（挿入図：ステージ２５）に比べてステージ３３において著しく多い死細胞数を有している。（ｅ）ステージ２５におけるＳｃｌ発現は、対照胚の外胚葉腹側における初期造血の部位を示している。（ｆ）Ｓｃｌ発現は、貧血を被っているＰｙｃｒ１モルファントでは停止した（補足図５）。（ｇ）Ｐｙｃｒ１が枯渇したオタマジャクシ（上）と対照（下）との間でステージ２２において実施した並体結合は、血液循環の共有（補足図５）にもかかわらず、アポトーシス（挿入図：ステージ３３）、発育不全および皮膚欠損をレスキューできなかった。（ｈ）組織学的染色から、Ｐｙｃｒ１並体結合モルファント胚の表皮が対照に比べて無秩序なままであることが示された。（ｉ）正常な皮膚の構造を示している、ステージ４５の並体結合した対照オタマジャクシの表皮を横断する組織切片。

図９ Ｐｙｃｒ１モルファント表現型の部分的レスキューは、ヒトの野生型Ｐｙｃｒ１ ｍＲＮＡの過剰発現によって為されるが、突然変異型Ｐｙｃｒ１ Ｋ２１５‐Ｄ３１９ｄｅｌ ｍＲＮＡでは為されない。（ａ）ステージ４２の対照オタマジャクシ。（ｂ）Ｐｙｃｒ１が枯渇したオタマジャクシ。（ｃ）野生型ヒトＰｙｃｒ１の合成ｍＲＮＡ８００ｐｇを注入されたオタマジャクシ。（ｄ）野生型ヒトＰｙｃｒ１の合成ｍＲＮＡを８００ｐｇ注入された、Ｐｙｃｒ１が枯渇したオタマジャクシ。ｂと比べて発育不全がレスキューされたことに注目されたい。（ｅ）突然変異型Ｋ２１５‐Ｄ３１９ｄｅｌヒトＰＹＣＲ１の合成ｍＲＮＡを８００ｐｇ注入しても効果がない。（ｆ）Ｐｙｃｒ１が枯渇したオタマジャクシの発育不全は、突然変異型Ｋ２１５‐Ｄ３１９ｄｅｌヒトＰＹＣＲ１の合成ｍＲＮＡを８００ｐｇ注入してもレスキューされない。

図１０ Ｐｙｃｒ１モルファントの血液欠損症は並体結合によって緩和される。（ａ）ステージ３０の対照オタマジャクシにおける循環する赤血球および鼓動する心臓の動画。（ｂ）循環する赤血球が存在しないにもかかわらず鼓動している、ステージ３０のＰｙｃｒ１モルファント・オタマジャクシの心臓の動画。（ｃ）ステージ４５の並体結合した胚における、Ｐｙｃｒ１モルファント（上側）と対照オタマジャクシ（下側）との間で共有される血液循環の動画。

図１１ ゼブラフィッシュにおけるＰｙｃｒ１およびＰｙｃｒ２のノックダウンは、奇形、表皮の萎縮およびアポトーシス増加をもたらす。（ａ〜ｈ）ステージ２４ｈにおける、対照、Ｐｙｃｒ１モルファント、Ｐｙｃｒ２モルファント、Ｐｙｃｒ１＋２モルファント、および２０ｐｇのヒトＰＹＣＲ１ ｍＲＮＡを注入されたＰｙｃｒ１＋２モルファントのゼブラフィッシュ。（ｆ〜ｈ）ステージ４８時間における、対照、Ｐｙｃｒ１＋２モルファント、および２０ｐｇのヒトＰＹＣＲ１ ｍＲＮＡを注入されたＰｙｃｒ１＋２モルファントのゼブラフィッシュ。モルファントの魚の体長の縮小、異常に湾曲した尾部、および卵黄嚢のまわりの表皮の弛緩に注目されたい。Ｐｙｃｒ１およびＰｙｃｒ２が両方ともノックダウンされると、表現型の重篤度は増大する。２０ｐｇのヒトＰＹＣＲ１ ｍＲＮＡを用いたモルファント表現型のレスキュー後も、軽微な変化しかみられない。（ｉ、ｊ）Ｐｙｃｒ１＋２モルファントにおける皮膚の萎縮。４８時間齢の対照の魚（ｉ）では、二重層状の表皮が卵黄嚢を取り囲んでいる。Ｐｙｃｒ１＋２モルファントでは、この表皮は萎縮している。ゴールドナー（Goldner）の三重染色。（ｋ〜ｍ）ステージ２４ｈにおけるアポトーシス細胞のアクリジンオレンジ染色。モルファント中のアポトーシス細胞数の著しい増加およびヒトＰＹＣＲ１ ｍＲＮＡの同時注入による表現型のほぼ完全な復帰に注目されたい。（ｎ〜ｐ）尾部のアポトーシス細胞のアクリジン染色、より高倍率。

図１２は、ＰＹＣＲ１遺伝子のアミノ酸配列を示す（スイスプロット登録番号Ｐ３２３２２）。
本明細書中における先に出版された文書の列挙または議論は、該文書が最先端技術の一部であるかまたは共通の一般知識であるとの認識と必ずしも受け止めるべきでない。列挙された文書はすべて、参照によりその全体がここで本願に組み込まれる。

本発明について、本明細書中に広範囲かつ総括的に記載してきた。総括的な開示の範囲内にあるより狭い生物種および亜属の各グループも、本発明の一部を形成する。このことは、その属から何らかの主題を削除する条件付きまたは消極的限定を伴った本発明の総括的な記載を含み、削除される材料が本明細書中に特に詳述されるどうかにはかかわらない。

他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲内にある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループの表現で記載されている場合、当業者には、本発明が該マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの表現でも記載されていることが認識されるであろう。

以下の参照文献が本明細書中で引用されている。

Claims (68)

1. ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）のムテインであって、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）の登録番号Ｐ３２３２２に示されるＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４〜２２０位および２２２〜２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つが突然変異していることを特徴とする、ムテイン。
2. ＰＹＣＲ１のムテインであって、スイスプロットの登録番号Ｐ３２３２２に示されるＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の４〜２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は野生型タンパク質と比較して機能低下または機能喪失したムテインをもたらすことを特徴とする、ムテイン。
3. ４位、１１９位、１７９位、１８９位、２０６位、２５１位、２５７位および２６６位のアミノ酸残基のうち少なくとも１つが突然変異している、請求項１または２に記載のムテイン。
4. ４位のアミノ酸残基の突然変異は、ＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列の５０位をコードするコドンに生じる翻訳停止コドンをもたらすフレームシフト突然変異である、請求項３に記載のムテイン。
5. １１９位のアミノ酸残基がグリシンまたはヒスチジンに置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
6. １７９位のアミノ酸残基が親水性アミノ酸に置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
7. 親水性アミノ酸はヒドロキシルを含んでいるアミノ酸である、請求項６に記載のムテイン。
8. ヒドロキシルを含んでいるアミノ酸はセリンまたはトレオニンである、請求項７に記載のムテイン。
9. １８９位のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
10. 疎水性アミノ酸は脂肪族アミノ酸である、請求項９に記載のムテイン。
11. 脂肪族アミノ酸は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される、請求項１０に記載のムテイン。
12. ２０６位のアミノ酸残基が芳香族アミノ酸に置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
13. 芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１２に記載のムテイン。
14. ２０６位のアミノ酸残基が正に荷電したアミノ酸に置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
15. 正に荷電したアミノ酸はアルギニンまたはリジンである、請求項１４に記載のムテイン。
16. ２５１位のアミノ酸残基がヒスチジンに置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
17. ２５７位のアミノ酸残基が親水性アミノ酸に置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
18. 親水性アミノ酸はヒドロキシルを含んでいるアミノ酸である、請求項１７に記載のムテイン。
19. ヒドロキシルを含んでいるアミノ酸はセリンまたはトレオニンである、請求項１８に記載のムテイン。
20. ２６６位のアミノ酸残基がグルタミンまたはアスパラギンに置き換わっている、請求項３に記載のムテイン。
21. スイスプロットの登録番号Ｐ３２３２２に示されるＰＹＣＲ１の野生型アミノ酸配列のアミノ酸残基のうち少なくとも１つの突然変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）であるか、または置換、欠失、挿入およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のムテイン。
22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
23. 少なくとも１つのヌクレオチドが挿入されているか、またはヌクレオチド配列から少なくとも１つのヌクレオチドが欠失している、請求項２２に記載の核酸分子。
24. ヌクレオチド配列のスプライス部位のうち少なくとも１つが突然変異している、請求項２２または２３に記載の核酸分子。
25. 対象者においてピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を測定する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列の存在について、対象者から得られた核酸試料を分析するステップを含み、前記ヌクレオチド配列の存在が、対象者の加齢関連疾患に罹患しやすい素因または罹患するリスクを有する素因を示すことを特徴とする方法。
26. 加齢関連疾患は、皮膚弛緩症（リンクリー・スキン（ｗｒｉｎｋｌｙ ｓｋｉｎ）症候群）、デ・バーシー（ｄｅ Ｂａｒｓｙ）症候群および老人様皮膚萎縮骨形成異常症からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しやすい素因を診断または測定するための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用。
28. 加齢関連疾患は、皮膚弛緩症（リンクリー・スキン症候群）、デ・バーシー症候群および老人様皮膚萎縮骨形成異常症からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
29. ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法であって、
    ａ．対象とする化合物を、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と接触させるステップと、
    ｂ．ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を計測するステップと
    を含む方法。
30. ステップ（ｂ）から得た計測の結果を、対象とする化合物が添加されない対照の計測の結果と比較するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 化合物はＰＹＣＲ１遺伝子の発現を増大させる、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 細胞内においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法であって、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を、細胞に導入するステップを含む方法。
33. ＰＹＣＲ１遺伝子の発現が増大することを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
34. 細胞は哺乳類に包含されている、請求項３２または３３に記載の方法。
35. 哺乳類はヒトまたはげっ歯類である、請求項３４に記載の方法。
36. 核酸分子は、前記核酸分子の発現を可能にするように、調節配列に作動可能に連結される、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 調節配列はプロモータ配列を含む、請求項３６に記載の方法。
38. 核酸分子はベクターに包含されている、請求項３６または３７に記載の方法。
39. ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しているかまたはＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患を発症するリスクを有している対象者を治療する方法であって、ピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）またはその機能性フラグメントもしくは機能性突然変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を対象者に導入するステップを含む方法。
40. ＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患に罹患しているかまたはＰＹＣＲ１に関係する加齢関連疾患を発症するリスクを有している対象者を治療する方法であって、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を対象者に投与するステップを含む方法。
41. 化合物は請求項２９に記載の方法によって同定されたものである、請求項４０に記載の方法。
42. 遺伝子組換え動物であって、前記遺伝子組換え動物はピロリン‐５‐カルボン酸レダクターゼ１（ＰＹＣＲ１）をコードする核酸を含むことと、前記核酸は不活性であることとを特徴とする、遺伝子組換え動物。
43. 不活性な核酸はＰＹＣＲ１の機能喪失をもたらす、請求項４２に記載の遺伝子組換え動物。
44. 前記動物はツメガエル（ｘｅｎｏｐｕｓ）または魚類である、請求項４２または４３に記載の遺伝子組換え動物。
45. 前記動物は哺乳類である、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え動物。
46. 哺乳類はヒトまたはげっ歯類である、請求項４５に記載の遺伝子組換え動物。
47. 動物においてＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させる方法であって、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を動物に投与するステップを含む方法。
48. 化合物は、ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる核酸分子を含む請求項４７に記載の方法。
49. 核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
50. ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法であって、
    ａ．対象とする化合物を、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の動物に投与するステップと；
    ｂ．前記化合物がＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができるかどうかを測定するステップと
    を含む方法。
51. 化合物はＰＹＣＲ１遺伝子の発現を増大させる、請求項５０に記載の方法。
52. 化合物は化粧品組成物の形態に製剤化されている、請求項５０または５１に記載の方法。
53. ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を変化させることができる化合物を同定する方法であって、
    ａ．生きている動物の皮膚の少なくとも１つの層を含む単離された皮膚片であって、試験動物に付着させた皮膚片を提供するステップと；
    ｂ．対象とする化合物を、生きている動物の皮膚に適用するステップと
    を含む方法。
54. 皮膚片は、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のムテインを発現する細胞を含む、請求項５３に記載の方法。
55. 細胞は線維芽細胞である、請求項５４に記載の方法。
56. 皮膚片は、生きている動物の皮膚の層をさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 皮膚片は、一方の表面上に生きているヒト皮膚を、かつ他方の表面上に生きている動物の皮膚を含む、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 皮膚片は単離された血管系によって供給を受けている、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 単離された血管系は試験動物に付着される、請求項５８に記載の方法。
60. 単離された血管系から少なくとも１つの血液の試料を採取するステップをさらに含み、採取された血液の内容物が分析されることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
61. ＰＹＣＲ１遺伝子の発現を計測するために、皮膚片からＤＮＡの試料を採取するステップをさらに含む、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の方法。
62. 生きている動物の皮膚は、試験動物と同じ生物種のものであるか、または異なる生物種のものである、請求項５３〜６１のいずれか１項に記載の方法。
63. 試験動物は哺乳類である、請求項６２に記載の方法。
64. 哺乳類はヒトまたはげっ歯類である、請求項６３に記載の方法。
65. げっ歯類は、マウス、ラット、リス、シマリス、ジリス、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、アレチネズミ、モルモット、チンチラ、プレーリードッグ、およびマーモットからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
66. げっ歯類は無胸腺である、請求項６５に記載の方法。
67. 対象とする化合物は化粧品組成物の形態に製剤化されている、請求項５３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
68. 化粧品組成物は、ジェル剤、軟膏、クリーム、ローション剤、セラム、パスタ剤、石鹸、エアゾール剤、可溶性錠剤、散剤、スティック剤、水ベースまたは油ベースの懸濁剤および乳剤からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。

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