JP2719060B2 - アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする固形癌治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】(関連出願の表示) 本願の優先権の主張の基礎となる米国特許出願は、米国
特許出願第０７／６０７,１１３号の一部継続出願であ
り、その内容は本明細書において引用されている。

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、薬化学、より詳細に云
うと、ある種のアンチセンス(antisense)オリゴヌクレ
オチドおよびかかるアンチセンスオリゴヌクレオチドの
使用による癌治療に関する。本発明は、合衆国政府の援
助をもって成されたものである。従って、合衆国政府
は、本発明に関してある種の権利を有する。

【０００３】

【従来の技術】細胞の増殖と分化に関する制御機構は、
腫瘍細胞において途絶される[アドブ・オンコル(Ａdv．
Ｏncol．)第４巻、第１−８頁(１９８８年)に掲載のヴ
ィー・アール・ポッター(Ｖ．Ｒ．Ｐotter)等の論文、
セミン・ヘマトール(Ｓemin．Ｈematol．)第２５巻、第
１−１９頁(１９８８年)に掲載のエイ・ストライフ
(Ａ．Ｓtrife)およびビー・クラークソン(Ｂ．Ｃlarkso
n)の論文、キャンサー・リサーチ(Ｃancer．Ｒes．)第
４７巻、第１９８１−１９８６頁(１９８７年)に掲載の
エル・サックツス(Ｌ．Ｓachs)の論文]。

【０００４】細胞内調節物質であるcＡＭＰは、細胞の
増殖と分化の制御において機能を発揮すると考えられて
きた[アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリ
ー(Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．)第４４巻、第４９１−５２
２頁(１９７５年)に掲載のアイ・パスタン(Ｉ．Ｐasta
n)、ジー・エス・ジョンソン(Ｇ．Ｓ．Ｊohnson)および
ダブリュ・ビー・アンダーソン(Ｗ．Ｂ．Ａnderson)等
の論文、バイオロジカル・レビューズ(Ｂiol．Ｒev．)
第５０巻、第１２９−１６５頁(１９７５年)に掲載のケ
イ・エヌ・プラサド(Ｋ．Ｎ．Ｐrasad)の論文、ジャー
ナル・オブ・サイクリック・ヌクレオチド・リサーチ
(Ｊ．Ｃyclic Ｎucleotide Ｒes．)第６巻、第１６３
−１７７頁(１９８０年)に掲載のワイ・エス・チョ・チ
ュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文、ソマティック・セ
ル・モト・ジェネット(ＳomaticＣell Ｍot Ｇenet)
第１３巻、第４５１−４５７頁(１９８７年)に掲載のテ
ィー・ティー・パック(Ｔ．Ｔ．Ｐuck)の論文]。

【０００５】cＡＭＰの細胞の増殖に対する抑制または
刺激作用は、Ｎ⁶−Ｏ²'−ジブチリルアデノシン３',５'
−サイクリックモノホスフェートのようなcＡＭＰアナ
ログ、または細胞内cＡＭＰを異常なかつ連続して高い
レベルまで高める薬剤を使用した研究において既に報告
されており、入手できるデータは著しく異なって理解さ
れている[アドバンシズ・イン・サイクリック・ヌクレ
オチド・プロテイン・ホスホリレイション・リサーチ
(Ａdv．Ｃyclic Ｎucleotide Ｐrotein Ｐhosphoryl
at．Ｒes．)第６巻、第２４５−３３８頁(１９７５年)
に掲載のエフ・ジェイ・チャポウスキー(Ｆ．Ｊ．Ｃhap
owski)、エル・エイ・ケリー(Ｌ．Ａ．Ｋelly)およびア
ール・ダブリュ・ブッチャー(Ｒ．Ｗ．Ｂutcher)の論
文、フロリダ州、ボカ・ラトン(Ｂoca Ｒaton)のシー
アールシー(ＣＲＣ)発行、シェイ・エイ・ケレン(Ｊ．
Ａ．Ｋellen)およびアール・ヒルフ(Ｒ．Ｈilf)編のイ
ンフルーエンス・オブ・ホルモンズ・オン・チューマ・
ディベロップメント(Ｉnfluence of Ｈormons on
Ｔumor Ｄevelopment)第５５−９３頁(１９７９年)に
掲載のワイ・エス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhun
g)の論文、ニューヨーク州、アカデミック(Ａcademic)
発行、エル・エル・カメロン(Ｌ．Ｌ．Ｃameron)および
ティー・ビー・プール(Ｔ．Ｂ．Ｐool)編のザ・トラン
ス・フォームド・セル(Ｔhe Ｔransformed Ｃell)第
２３５−２６６頁(１９８１年)に掲載のケイ・エヌ・プ
ラサド(Ｋ．Ｎ．Ｐrasad)の論文、アドバンシズ・イン
・サイクリック・ヌクレオチド・リサーチ(Ａdv．Ｃycl
ic Ｎucleotide Ｒes．)第１５巻、第１９３−２９４
頁(１９８３年)に掲載のエイ・アール・ボイントン
(Ａ．Ｌ．Ｂoynton)およびジェイ・エフ・ホイットフィ
ールド(Ｊ．Ｆ．Ｗhitfield)の論文]。

【０００６】最近、部位選択的cＡＭＰアナログが、イ
ンビトロで、精製されたタイプＩのcＡＭＰ−依存性プ
ロテインキナーゼよりもタイプIIに結合性がよいことが
示され[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２５８巻、第１０３２−１
０４０頁(１９８３年)に掲載のエイ・エム・ロビンソン
・スタイナー(Ａ．Ｍ．Ｒobinson−Ｓteiner)およびジ
ェイ・ディー・コービン(Ｊ．Ｄ．Ｃorbin)等の論文、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
(Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．)第１５０巻、第２１９−２２７
頁(１９８５年)に掲載のディー・オグレイド(Ｄ．Ｏgre
id)、アール・エカンガー(Ｒ．Ｅkanger)、アール・エ
イチ・スバ(Ｒ．Ｈ．Ｓuva)、ジェイ・ピー・ミラー
(Ｊ．Ｐ．Ｍiller)、ピー・スターム(Ｐ．Ｓturm)、ジ
ェイ・ディー・コービン(Ｊ．Ｄ．Ｃorbin)およびエス
・オウ・ドスケランド(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)の論文]、
ヒトおよびげっ歯類動物の癌細胞株において重要な増殖
の抑制、分化および逆トランスフォーメーションを引き
起こす[フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイ
オケミカル・ソサエティーズ・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌe
tt．)第２２３巻、第９７−１０３頁(１９８７年)に掲
載のディー・カトサロス(Ｄ．Ｋatsaros)、ジー・トル
トラ(Ｇ．Ｔortora)、ピー・タグリアフェリ(Ｐ．Ｔagl
iaferri)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlair)、エス・アリー
(Ｓ．Ａlly)、エル・ネッカーズ(Ｌ．Ｎeckers)、アー
ル・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．Ｒobins)およびワイ・エ
ス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文、ブラ
ッド(Ｂlood)第７１巻、第２３０−２３３頁(１９８８
年)に掲載のジー・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、ピー・ダ
グリアフェリ(Ｇ．Ｔagliaferri)、ティー・クレア
(Ｔ．Ｃlair)、オー・コラモニッチ(Ｏ．Ｃolamonic
i)、エル・エム・ネッカーズ(Ｌ．Ｍ．Ｎeckers)、アー
ル・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．Ｒobins)およびワイ・エ
ス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂi
ol．Ｃhem．)第２６３巻、第４０９−４１６頁(１９８
８年)に掲載のピー・ダグリアフェリ(Ｇ．Ｔagliaferr
i)、ディー・カトサロス(Ｄ．Ｋatsaros)、ティー・ク
レア(Ｔ．Ｃlair)、アール・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．
Ｒobins)およびワイ・エス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃh
o−Ｃhung)の論文]ことが見出された。

【０００７】タイプＩおよびタイプIIのプロテインキナ
ーゼは、これらの調節サブユニット(regulatory subuni
t)(それぞれ、ＲＩおよびＲII)により区別される[ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂi
ol．Ｃhem．)第２５０巻、第２１８−２２５頁(１９７
５年)に掲載のジェイ・ディー・コービン(Ｊ．Ｄ．Ｃor
bin)、エス・エル・キーリー(Ｓ．Ｌ．Ｋeely)およびシ
ー・アール・パック(Ｃ．Ｒ．Ｐark)の論文、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．
Ｃhem．)第２５０巻、第７７９５−７８０１頁(１９７
５年)に掲載のエフ・ホフマン(Ｆ．Ｈofmann)、ジェイ
・エイ・ビーボ(Ｊ．Ａ．Ｂeavo)およびイー・ジー・ク
レブス(Ｅ．Ｇ．Ｋrebs)の論文]。

【０００８】４つの異なる調節サブユニット[ＲＩα(以
前はＲＩで示されていた) [プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８０巻、第３
６０８−３６１２頁(１９８３年)に掲載のディー・シー
・リー(Ｄ．Ｃ．Ｌee)、ディー・エフ・カーマイケル
(Ｄ．Ｆ．Ｃarmichael)、イー・ジー・クレブス(Ｅ．
Ｇ．Ｋrebs)およびジー・エス・マックナイト(Ｇ．Ｓ．
ＭcＫnight)の論文]、ＲＩβ[プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８５巻、第３
７０３−３７０７頁(１９８８年)に掲載のシー・エイチ
・クレッグ(Ｃ．Ｈ．Ｃlegg)、ジー・ジー・カッド
(Ｇ．Ｇ．Ｃadd)、およびジー・エス・マックナイト
(Ｇ．Ｓ．ＭcＫnight)の論文]、ＲIIα(ＲII₅₄)[プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシーズ・オブザ・ユナイテッド・ステイツ
・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ)第８４巻、第５１９２−５１９６頁(１９８７年)に
掲載のジェイ・ディー・スコット(Ｊ．Ｄ．Ｓcott)、エ
ム・ビー・グラッカム(Ｍ．Ｂ．Ｇlaccum)、エム・ジェ
イ・ゾラー(Ｍ．Ｊ．Ｚoller)、エム・ディー・ウーラ
ー(Ｍ．Ｄ．Ｕhler)、ディー・エム・ホフマン(Ｄ．
Ｍ．Ｈofmann)、ジー・エス・マックナイト(Ｇ．Ｓ．Ｍ
cＫnight)およびイー・ジー・クレブス(Ｅ．Ｇ．Ｋreb
s)の論文]およびＲIIβ(ＲII₅₁) [ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第
２６１巻、第１２３５２−１２３６１頁(１９８６年)に
掲載のティー・ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)、エル・ヘデ
ィン(Ｌ．Ｈedin)、ヴィー・ジェイ・キッド(Ｖ．Ｊ．
Ｋidd)、ダブリュ・ジー・ビーティー(Ｗ．Ｇ．Ｂeatti
e)、エス・エム・ローマン(Ｓ．Ｍ．Ｌohmann)、ユー・
ウォルター(Ｕ．Ｗalter)、ジェイ・デュリカ(Ｊ．Ｄur
ica)、ティー・ズィー・ショルツ(Ｔ．Ｚ．Ｓchulz)、
イー・シュリッツ(Ｅ．Ｓchlitz)、エム・ブラウナー
(Ｍ．Ｂrowner)、シー・ビー・ローレンス(Ｃ．Ｂ．Ｌa
wrence)、ディー・ゴールドマン(Ｄ．Ｇoldman)、エス
・エル・ラツーシュ(Ｓ．Ｌ．Ｒatoosh)およびジェイ・
エス・リチャーズ(Ｊ．Ｓ．Ｒichards)の論文]]が、遺
伝子／mＲＮＡレベルで同定された。

【０００９】２つの異なる触媒サブユニットＣα[プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
イツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ)第８３巻、第１３００−１３０４頁(１９８６年)
に掲載のエム・ディー・ウーラー(Ｍ．Ｄ．Ｕhler)、デ
ィー・エフ・カーマイケル(Ｄ．Ｆ．Ｃarmichael)、デ
ィー・シー・リー(Ｄ．Ｃ．Ｌee)、ジェイ・シー・クリ
ビア(Ｊ．Ｃ．Ｃhrivia)、イー・ジー・クレブス(Ｅ．
Ｇ．Ｋrebs)およびジー・エス・マックナイト(Ｇ．Ｓ．
ＭcＫnight)の論文] とＣβ [ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２６
１巻、第１５３６０−１５３６３頁(１９８６年)に掲載
のエム・ディー・ウーラー(Ｍ．Ｄ．Ｕhler)、ジェイ・
シー・クリビア(Ｊ．Ｃ．Ｃhrivia)およびジー・エス・
マックナイト(Ｇ．Ｓ．ＭcＫnight)の論文、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃ
hem．)第２６１巻、第１６２８８−１６２９１頁(１９
８６年)に掲載のエム・オウ・シャワーズ(Ｍ．Ｏ．Ｓho
wers)およびアール・エイ・モウラー(Ｒ．Ａ．Ｍaurer)
の論文]もまた、同定されたが、タイプＩまたはタイプI
Iのプロテインキナーゼ調節サブユニットのいずれか
と、これらの触媒サブユニットのいずれか一方との優先
的な共発現(coexpression)は見出されなかった[ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂio
l．Ｃhem．)第２６１巻、第１６２８８−１６２９１頁
(１９８６年)に掲載のエム・オウ・シャワーズ(Ｍ．
Ｏ．Ｓhowers)およびアール・エイ・モウラー(Ｒ．Ａ．
Ｍaurer)の論文]。

【００１０】部位選択性cＡＭＰアナログによる増殖の
抑制は、cＡＭＰ依存性プロテインキナーゼタイプＩの
調節サブユニット(ＲＩα)の減少をＲIIβの増加と並行
させることにより、癌細胞中のＲIIβ／ＲＩα比率を大
きくしている[プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８５巻、第６３１９−６３
２２頁(１９８８年)に掲載のエス・アリー(Ｓ．Ａll
y)、ジー・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、ティー・クレア
(Ｔ．Ｃlair)、ディー・グリエコ(Ｔ．Ｇrieco)、ジー
・メルロ(Ｇ．Ｍerlo)、ディー・カトサロス(Ｄ．Ｋats
aros)、ディー・オグレイド(Ｄ．Ｏgreid)、エス・オウ
・ドスケランド(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)、ティージャンセ
ン(Ｔ．Ｊahnsen)およびワイ・エス・チョ・チュン
(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文並びにジャーナル・オブ
・ザ・ナショナル・キャンサー・インスチチュート
(Ｊ．Ｎatl．Ｃancer Ｉnst．)第８１巻、第９８２−
９８７頁(１９８９年)のワイ・エス・チョ・チュン
(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]。

【００１１】このようなＲIIβに対するＲＩαの選択変
調(selection modulation)は、以前に研究されたcＡＭ
ＰアナログであるＮ⁶−Ｏ²'−ジブチリルアデノシン
３',５'−サイクリックモノホスフェートによる処置に
よって模倣されない(mimicked) [プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメ
リカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８５巻、
第６３１９−６３２２頁(１９８８年)に研究のエス・ア
リー(Ｓ．Ａlly)、ジー・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、テ
ィー・クレア(Ｔ．Ｃlair)、ディー・グリエコ(Ｔ．Ｇr
ieco)、ジー・メルロ(Ｇ．Ｍerlo)、ディー・カトサロ
ス(Ｄ．Ｋatsaros)、ディー・オグレイド(Ｄ．Ｏgrei
d)、エス・オウ・ドスケランド(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)、
ティー・ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)およびワイ・エス・
チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]。

【００１２】増殖の抑制はまた、核に対するＲIIβの迅
速な転移およびＲIIβ遺伝子の転写の増大と相互関係を
有する [プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ)第８５巻、第６３１９−６３２２頁
(１９８８年)に掲載のエス・アリー(Ｓ．Ａlly)、ジー
・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlai
r)、ディー・グリエコ(Ｔ．Ｇrieco)、ジー・メルロ
(Ｇ．Ｍerlo)、ディー・カトサロス(Ｄ．Ｋatsaros)、
ディー・オグレイド(Ｄ．Ｏgreid)、エス・オウ・ドス
ケランド(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)、ティー・ジャンセン
(Ｔ．Ｊahnsen)およびワイ・エス・チョ・チュン(Ｙ．
Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]。

【００１３】これらの結果からＲIIβが、cＡＭＰ増殖
調整機能において、重要な役割を果たすという仮説が支
持される [ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャン
サー・インスチチュート(Ｊ．Ｎatl．Ｃancer Ｉns
t．)第８１巻、第９８２−９８７頁(１９８９年)に掲載
のワイ・エス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の
論文]。

【００１４】アンチセンスＲＮＡ配列は、原核生物 [プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
ＵＳＡ)第８１巻、第１９６６−１９７０頁(１９８４
年)に掲載のティー・ミズノ(Ｔ．Ｍizuno)、エム・ワイ
・チョウ(Ｍ−Ｙ Ｃhou)およびエム・イノウエ(Ｍ．Ｉ
noue)の論文] と真核生物[ニュークリーク・アシッズ・
リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)第１４巻、第６７
７１−６７７２頁(１９８６年)に掲載のエス・エム・ヘ
イウッド(Ｓ．Ｍ．Ｈeywood)の論文] と双方において遺
伝子発現の自然発生的な生物学的抑制因子として説明さ
れており、これらの配列は、相補的なmＲＮＡ配列に対
してハイブリダイズさせることにより、翻訳のハイブリ
ダイゼーション阻害を行なうように機能するものと考え
られる [プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ)第７４巻、第４３７０−４３７４頁
(１９７７年)に掲載のビー・エム・パターソン(Ｂ．
Ｍ．Ｐaterson)、ビー・イー・ロバーツ(Ｂ．Ｅ．Ｒobe
rts)およびイー・エル・カフ(Ｅ．Ｌ．Ｋuff)の論文]。

【００１５】アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
は、特定の遺伝子またはＲＮＡメッセージに対して相補
的に形成された短い合成ヌクレオチド配列である。これ
らのオリゴマーがターゲットＤＮＡまたはmＲＮＡ配列
に対して結合することによって、遺伝子の転写または翻
訳が選択的にブロックされ、この遺伝子により生ずる疾
病プロセスを阻止することができる。

【００１６】mＲＮＡの細胞内の位置は、細胞に入った
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに容易にアク
セスすることができると考えられるターゲットを提供す
るので、本技術分野における研究の多くは、ターゲット
としてＲＮＡに向けられている。現在は、アンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチドを採用することにより、イ
ンビトロおよび培養細胞における遺伝子発現の調節を調
べるための有用な手段が提供されている [ジャーナル・
オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスチチュート
(Ｊ．Ｎatl．Ｃancer Ｉnst．)第８１巻、第１５３９
−１５４４頁(１９８９年)に掲載のエム・ロゼンバーグ
(Ｍ．Ｒothernberg)、ジー・ジョンソン(Ｇ．Ｊohnso
n)、シー・ローリン(Ｃ．Ｌaughlin)、アイ・グリーン
(Ｉ．Ｇreen)、ジェイ・クラドック(Ｊ．Ｃraddock)、
エヌ・サーバー(Ｎ．Ｓarver)およびジェイ・エス・コ
ーエン(Ｊ．Ｓ．Ｃohen)の論文]。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＲＩαアン
チセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする固形癌治
療剤を提供することを課題とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＲＩαアンチ
センスオリゴヌクレオチドを有効成分とする固形癌治療
剤に関する。特に、本発明は、配列番号６で表されるＲ
Ｉαの最初の１００Ｎ−末端コドンの領域に対して相補
的な１５−３０マーのオリゴヌクレオチドであるアンチ
センスオリゴヌクレオチドを有効成分とする固形癌治療
剤に関する。

【００１９】本発明はまた、ＲＩα遺伝子またはその転
写産物に対して相補的な配列番号５に示す配列を有する
アンチセンスＤＮＡのフラグメントである１５−３０マ
ーのアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする
固形癌治療剤に関する。さらに本発明は、上記アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つと、薬学的に
許容できるキャリアとを含む固形癌治療用薬剤組成物に
関する。また、さらに本発明は、上記アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドまたは薬剤組成物を、固形癌治療に必要
とする動物(ヒトを除く)に投与することを特徴とする固
形癌治療方法に関する。尚、本明細書において「固形癌」
とは、白血病を除く癌をいうものとする。

【００２０】以下に、本発明を詳細に説明する。アンチ
センス治療は、細胞内にあるターゲットのポリヌクレオ
チドに結合する外来性オリゴヌクレオチドを投与するも
のである。「アンチセンス」なる語は、かかるオリゴヌク
レオチドが細胞内のターゲット、例えば、ＲＩα遺伝子
またはその転写物に対して相補性を有することを意味す
るものである。例えば、１９８９年にシーアールシー・
プレス(ＣＲＣ Ｐress)から発行されたジャック・コー
エン(Ｊack Ｃohen)著の「オリゴデオキシヌクレオチ
ズ、アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・イ
クスプレッション(ＤＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯ
ＴＩＤＥＳ、Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅ
xpression)およびシンセシス(Ｓynthesis)第１巻、第１
−５頁(１９８８年)を参照されたい。

【００２１】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、Ｓ−オリゴヌクレオチド(ホスホロチオエー
ト(phosphorothioate)誘導体、すなわちＳ−オリゴ、上
記ジャック・コーエンの著書参照)のような、著しい癌
細胞増殖抑制作用を発揮する(図７および図９参照)誘導
体を含む。

【００２２】Ｓ−オリゴ(ヌクレオチドホスホロチオエ
ート)は、オリゴヌクレオチド(Ｏ−オリゴ)のリン酸基
の非橋酸素原子がイオウ原子により置換された等電アナ
ログ(isoelectronic analog)である。本発明のＳ−オリ
ゴは、対応するＯ−オリゴを、イオウ転移試薬(sulfer
transfer reagent)である３Ｈ−１、２−ベンゾジチオ
ール−３−オン−１,１−ジオキシドで処理することに
より得ることができる。ジャーナル・オブ・オーガニッ
ク・ケミストリー(Ｊ．Ｏrg．Ｃhem．)第５５巻、第４
６９３−４６９８頁(１９９０年)に掲載のアール・ピー
・イエール(Ｒ．Ｐ．Ｉyer)等の論文およびジャーナル
・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ
(Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．)第１１２巻、第１２５３−１
２５４頁(１９９０年)に掲載のアール・ピー・イエール
(Ｒ．Ｐ．Ｉyer)等の論文を参照されたい。本明細書に
おいては、これらの文献を参照してすべて取り込む。

【００２３】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、ＲＩαゲノムまたは対応するmＲＮＡの最初
の１００Ｎ−末端コドンに対して相補性を有するととも
に、該コドンと安定にハイブリダイズするＲＮＡまたは
ＤＮＡとすることができる。この領域に対して相補性を
有するオリゴヌクレオチドを使用すると、ＲＩαmＲＮ
Ａに対して選択的にハイブリダイズし、プロテインキナ
ーゼの他の調節サブユニットのmＲＮＡに対してはハイ
ブリダイズしない。好ましくは、本発明のＲＩαアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、ＲＩαmＲＮＡにハイブ
リダイズする配列番号５のアンチセンスＤＮＡ分子の１
５−３０マーフラグメントである。あるいは、ＲＩαア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＩαの最初の１０
０Ｎ−末端コドン(配列番号６)における領域に対して相
補的な１５−３０マーのオリゴヌクレオチドである。最
も好ましくは、ＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番
号４に示す配列を有する。

【００２４】本発明にさらに包含されるものとして、有
効量の本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを、薬学的に許容することができるキ
ャリヤと組み合わせてなる薬剤組成物がある。一の実施
例においては、単一のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドが利用される。別の実施例においては、ＲＩαゲ
ノムの隣接部分に対して相補性を有する２つのＲＩαア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが利用される。ＲＩαゲ
ノムまたは対応するmＲＮＡの隣接部分に対して相補性
を有する２つのＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチド
を投与することにより、ＲＩαゲノムの転写またはmＲ
ＮＡの翻訳を一層有効に抑制することができるので、癌
細胞の増殖をより効果的に抑制することができる。

【００２５】好ましくは、ＲＩαアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、細胞によるアンチセンス分子の取り込み
を促進する薬品とともに投与される。例えば、ＲＩαア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソームの形態を
なすことができる親油性陽イオン性化合物と組み合わせ
ることができる。ヌクレオチドを細胞内に導入するのに
リポソームを使用することは、例えば、米国特許第４,
８９７,３５５号および同第４,３９４,４４８号に教示
されているが、これらの米国特許の記載については、そ
の記載を引用しして本明細書に取り込む。さらに、生物
学的物質からなるリポソームをつくる一般的な方法に関
しては、米国特許第４,２３５,８７１号、同第４,２３
１,８７７号、同第４,２２４,１７９号、同第４,７５
３,７８８号、同第４,６７３,５６７号、同第４,２４
７,４１１号および同第４,８１４,２７０号を参照され
たい。

【００２６】あるいは、ＲＩαアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、コレステロール、コール酸およびデオキシ
コール酸をはじめとする数多くのステロールのうちのい
ずれか１つのような親油性キャリヤと組み合わせること
ができる。好ましいステロールは、コレステロールであ
る。

【００２７】さらに、ＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、細胞によって摂取されるペプチドに結合させ
ることができる。有効なペプチドには、例えば、ペプチ
ドホルモン、抗原または抗体およびペプチドトキシンが
ある。腫瘍細胞により選択的に取り込まれるペプチドを
選択することにより、アンチセンス剤の特定の給送を効
果的に行なうことができる。ＲＩαアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、その５'ＯＨ基を介して共有結合させ
ることにより、活性化されたアミノアルキル誘導体を形
成することができる。

【００２８】選択されたペプチドは、次に、アミノおよ
びスルフヒドリル反応性ヘテロ二官能価試薬を用いて活
性化されたＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチドに共
有結合させることができる。後者は、ペプチドに存在す
るシステイン残基に結合する。細胞をペプチドに結合し
たＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝すと、ペ
プチジルアンチセンス剤がエンドサイトシス化され(end
ocytosed)、ＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチドは
ターゲットのＲＩαmＲＮＡに結合して翻訳を抑制す
る。ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３６３号ＰＣＴ出願公報を
参照されたい。

【００２９】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、胃癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肛門癌、結腸直
腸癌、頭部および首部の新生物、神経芽細胞腫、黒色腫
の如き固形癌等広範な癌に有用である。

【００３０】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドはまた、Ｆ９奇形癌腫、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細
胞腫、ＴＭＫ−１胃癌、ＨＬ−６０前骨髄球白血病、白
血病Ｌ−１２１０、白血病Ｐ３８８、Ｐ１５３４白血
病、フレンドウイルス白血病、白血病Ｌ４９４６、メッ
カ(Ｍecca)、リンパ肉腫、ガードナー(Ｇardner)、リン
パ肉腫、リッジウェイ(Ｒidgway)、骨原発性肉腫、肉腫
１８０(腹水)、ワグナー(Ｗagner)骨原発性肉腫、肉腫
Ｔ２４１、ルイス(Ｌewis)肺癌腫、癌腫７５５、ＣＤ８
Ｆ、ＭＣＦ−７乳癌腫、結腸３８、ＬＳ−１７４Ｔ結腸
癌腫、癌腫１０２５、エールリッヒ(Ｅhrlich)癌腫(腹
水および固形質(solid))、クラブス(Ｋrubs)２癌腫(腹
水)、バッシュフォード(Ｂashford)癌腫６３、腺癌腫Ｅ
０７７１、Ｂ１６黒色腫、ハーディン・パッセイ(Ｈard
in−Ｐassey)黒色腫、ギロマ(Ｇiloma)２６、ミヤノ(Ｍ
iyano)腺癌腫、ウォーカー(Ｗalker)癌肉腫２５６、フ
レクスナー・ジョブリング(Ｆlexner−Ｊobling)癌肉
腫、ジェンセン(Ｊensen)肉腫、イグレシアス(Ｉglesia
s)肉腫、イグレシアス卵巣腫瘍、マーフィー・スターン
(Ｍurphy−Ｓturn)リンパ肉腫、ヨシダ(Ｙoshida)肉
腫、ダニング(Ｄunning)白血病、ラウス(Ｒous)家鶏肉
腫およびクラブ(Ｃrabb)ハムスター肉腫といった腫瘍系
に対しても活性を発揮することができる。

【００３１】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドおよび薬剤組成物は、固形癌の治療の目的を達成
する手段を用いて投与することができる。例えば、投与
は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または経皮
ルートにより行なうことができる。投与量は、受体の年
令、健康および体重、治療が行なわれている場合には同
時治療の種類、治療の頻度、並びに所望される効果の種
類により定められる。

【００３２】本発明の範囲に含まれる組成物は、増殖の
抑制を達成しおよび／または対象となる癌細胞の分化を
刺激するのに有効な量のＲＩαアンチセンスオリゴヌク
レオチドを含む全ての組成物を包含する。個々の要求は
変わるが、各成分の有効量の最適範囲は、当業者により
定められる。一般的には、本発明のＲＩαアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、哺乳動物、例えば、ヒトには
０．００５−５mg／kg／日の量、または治療されている
哺乳動物の単位体重について１日当たり、その薬学的に
許容することができる塩の等量を投与することができ
る。

【００３３】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、溶解状態でそのままの形態として投与される
ほかに、ＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学
的に使用することができる製剤に処理することを容易に
する賦形剤と、補助剤等からなる適宜の薬学的に許容す
ることができるキャリヤを含む薬剤の一部として投与す
ることもできる。

【００３４】非経口投与に適した配合物として、水溶性
の形態をなすＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチド、
例えば、水溶性塩の水溶液がある。また、適宜の油状注
射懸濁液として、活性化合物の懸濁液を投与することが
できる。適宜の親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂
肪油、例えば、ごま油または合成脂肪酸エステル、例え
ば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドがある。
水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質を含むこ
とができ、これには、例えば、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキスト
ランがある。懸濁液はまた、必要に応じて、安定化剤を
含むことができる。

【００３５】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、当業者に周知の方法のいずれかに従って調製するこ
とができる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、固相合成によって調製される。オリゴヌクレオ
チドの化学合成の検討については、バイオコンジュゲイ
ト・ケミストリー(Ｂioconjugate Ｃhemistry)第１
巻、第１６５−１６７頁(１９９０年)に掲載のグッドチ
ャイルド(Ｇoodchild)の論文を参照されたい。あるい
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレ
オチドの合成を専門的に行なっている数多くの企業から
得ることができる。

【００３６】

【作用】本発明においては、癌細胞におけるＲＩαの発
現を、ＲＩαのアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制
して、癌細胞の増殖を抑制するとともに細胞分化を刺激
するので、増殖の抑制を受けやすい癌細胞の増殖を抑制
することにより、癌、殊に固形癌を治療することができ
る。

【００３７】本発明を広く説明したきたが、以下、本発
明を実施例に関してさらに詳細に説明する。これらの実
施例は、単に例示のために記載され、別に特定されない
限り本発明を限定するものではない。上記および以下に
おいて引用されている全ての出願、特許および刊行物の
内容全体の記載を引用して、本明細書に取り込む。

【００３８】

【実施例】実施例１ オリゴデオキシヌクレオチド 本発明において使用される２１マーのオリゴデオキシヌ
クレオチドをミッドランド・サーティファイド・リアジ
ェント・カンパニー(Ｍidland ＣertifiedＲeagent
Ｃo．) [テキサス州、ミッドランド(Ｍidland)]におい
て合成したが、これは、次の配列を有する。

【００３９】ヒトＲＩα[バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂi
ochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．)第１４９巻、第９
３９−９４５頁(１９８７年)に掲載のエム・サンドバー
グ(Ｍ．Ｓandberg)、ケイ・タスケン(Ｋ．Ｔasken)、オ
ウ・オウイェン(Ｏ．Ｏyen)、ヴィー・ハンソン(Ｖ．Ｈ
ansson)およびティー・ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)の論
文]アンチセンス: ５'−ＧＧＣ−ＧＧＴ−ＡＣＴ−ＧＣＣ−ＡＧＡ−ＣＴ
Ｃ−ＣＡＴ−３'(配列番号１);

【００４０】ヒトＲIIβ [モレキュラー・エンドクリノ
ロジー(Ｍol．Ｅndocrinol．)第２巻、第１３６４−１
３７３頁(１９８８年)に掲載のエフ・オウ・レヴィ
(Ｆ．Ｏ．Ｒevy)、オウ・オウイェン(Ｏ．Ｏyen)、エム
・サンドバーグ(Ｍ．Ｓandberg)、ケイ・タスケン(Ｋ．
Ｔasken)、ダブリュ・エスキルド(Ｗ．Ｅskild)、ヴィ
ー・ハンソン(Ｖ．Ｈansson)およびティー・ジャンセン
(Ｔ．Ｊahnsen)の論文]アンチセンス: ５'−ＣＧＣ−ＣＧＧ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＧＡＴ−ＧＣ
Ｔ−ＣＡＴ−３'；

【００４１】ヒトＲIIα [フェデレーション・オブ・ヨ
ーロピアン・バイオケミカル・ソサイエティーズ・レタ
ーズ(ＦＥＢＳ Ｌett．)第２４６巻、第５７−６４頁
(１９８９年)に掲載のオウ・オウイェン(Ｏ．Ｏyen)、
エフ・マイクレバスト(Ｆ．Ｍyklebust)、ジェイ・ディ
ー・スコット(Ｊ．Ｄ．Ｓcott)、ヴィー・ハンソン
(Ｖ．Ｈansson)およびティー・ジャンセン(Ｔ．Ｊahnse
n)の論文] アンチセンス: ５'−ＣＧＧ−ＧＡＴ−ＣＴＧ−ＧＡＴ−ＧＴＧ−ＧＣ
Ｔ−ＣＡＴ−３'

【００４２】ランダム配列のオリゴヌクレオチドを、全
ての位置ごとに全ての４つのヌクレオチドの混合物から
調製した。

【００４３】細胞増殖実験 １０％ウシ胎児血清、ペニシリン(５０Ｕ／ml)、ストレ
プトマイシン(５００μg／ml)および１mＭグルタミン
[ニューヨーク州、グランド・アイランド(Ｇrand Ｉsl
and)のギブコ(Ｇibco)]を追加したＲＰＭ１−１６４０
培地における浮遊培養で増殖させた細胞を皿当たり５×
１０⁵個接種した。オリゴデキオシヌクレオチドを、接
種後４８時間ごとに加えた。細胞の計数をクールター
(Ｃoulter)カウンタで行なった。

【００４４】４日間に亙ってオリゴデオキシヌクレオチ
ドに曝されなかった細胞または曝された細胞を、５×１
０⁵個／皿、再接種し(０日目)、オリゴデオキシヌクレ
オチドに予め曝した細胞を０日目および２日目にオリゴ
マーでさらに処理した。[カリフォルニア州、コスタ・
メサ(Ｃosta Ｍesa)のヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ・インスチチュート(Ｎucleic Ａcid Ｒesearch
Ｉnstitute)のアール・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．Ｒobi
ns)博士の好意により提供された] cＡＭＰアナログまた
は１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセ
テート(ＴＰＡ)を、０日目に１回添加した。細胞の計数
を４日目に行なった。

【００４５】８−Ｎ₃−[³²Ｐ] cＡＭＰによるフォトア
フィニティーラベル後のＲＩαおよびＲIIβ cＡＭＰ受
容タンパク質の免疫沈降 細胞抽出物を、０−４℃で調製した。細胞のペレット
(２×１０⁶個の細胞)を、ＰＢＳで２回洗浄した後、蛋
白加水分解抑制剤 [プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８７巻、第７０５−７
０８頁(１９９０年)に掲載のジー・トルトラ(Ｇ．Ｔort
ora)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlair)およびワイ・エス・
チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]を含む
０．５mlの緩衝液テン(Ｔen)(０．１Ｍ ＮaＣl、５mＭ
ＭgＣl₂、１％ノニデット(Ｎonidet)Ｐ−４０、０．
５％デオキシコール酸ナトリウム、２ＫＩＵ／mlのウシ
アプロチニンおよび２０mＭトリス−ＨＣl、pＨ７．４)
に懸濁させ、ボルテックス混合を行ない、２２ゲージの
針に１０回通し、４℃で３０分間放置し、７５０ｘgで
２０分間遠心分離を行ない、得られた上澄みを細胞溶解
液として使用した。

【００４６】８−Ｎ₃−[³²Ｐ] cＡＭＰ(６０．０Ｃi／m
mol)の光活性化取込と、[ノルウェー国、ベルゲン(Ｂer
gen)に所在するベルゲン大学(Ｕniversity of Ｂergen)
のエス・オウ・ドスケランド(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)博士
の好意により提供された]抗ＲＩαまたは抗ＲIIβ抗血
清およびプロテインＡセファロースを用いた免疫沈降、
および可溶化した抗原抗体複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を、上記方法に従って行なった [プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメ
リカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８７巻、
第７０５−７０８頁(１９９０年)に掲載のジー・トルト
ラ(Ｇ．Ｔortora)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlair)および
ワイ・エス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論
文およびジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２６０巻、第３３９３−３
４０１頁(１９８５年)に掲載のアール・エカンガー
(Ｒ．Ｅkanger)、ティー・イー・サンド(Ｔ．Ｅ．Ｓan
d)、ディー・オグレイド(Ｄ．Ｏgreid)、ティー・クリ
ストファーソン(Ｔ．Ｃhristoffersen)およびエス・オ
ウ・ドスケランド(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)の論文]。

【００４７】cＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの検定 細胞ペレット(２×１０⁶個の細胞)を、ダルベッコの(Ｄ
ulbecco's)リン酸塩緩衝生理食塩水で２回洗浄した後、
２０mＭトリス(pＨ７．５)、０．１mＭ ＥＤＴＡナト
リウム、１Ｍジチオトレイトール、０．１mＭペプスタ
チン、０．１mＭアンチパイン、０．１mＭキモスタチ
ン、０．２mＭロイペプチン、０．４mg／mlアプロチニ
ンおよび０．５mg／mlの大豆トリプシン阻害剤を含む液
０．５mlに１００ストロークのダウンス(Ｄounce)ホモ
ジナイザを使用して溶解させた。遠心分離を５分間行な
った後に、上澄みを０．７ml蛋白質／mlに調製し、アッ
セイ[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２６２巻、第１５２０２−１
５２０７頁(１９８７年)に掲載のエム・ディー・ウーラ
ー(Ｍ．Ｄ．Ｕhler)およびジー・エス・マックナイト
(Ｇ．Ｓ．ＭcＫnight)の論文)を直ちに行なった。

【００４８】アッセイ(全容積４０μl)を３０℃で１０
分間行なったところ、２００μＭのＡＴＰ、２．７×１
０⁶ cpmのγ[³²Ｐ]ＡＴＰ、２０ml ＭgＣl₂、１００μ
Ｍのケンプチド(Ｋemptide)[シグマ(Ｓigma)Ｋ−１１２
７)][ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２５２巻、第４８８８−４８
９４頁(１９７７年)に掲載のビー・イー・ケンプ(Ｂ．
Ｅ．Ｋemp)、ディー・ジェイ・グレイブズ(Ｄ．Ｊ．Ｇr
aves)、イー・ベンジャミン(Ｅ．Ｂenjamin)およびイー
・ジー・クレブス(Ｅ．Ｇ．Ｋrebs)の論文]、４０mＭの
トリス(pＨ７．５)、±１００μＭのプロテインキナー
ゼ阻害剤[シグマ(Ｓigma)Ｐ−３２９４][バイオケミカ
ル・ジャーナル(Ｂiochem．Ｊ．)第２３１巻、第６５５
−６６１頁(１９８５年)に掲載のエイチ・シー・チェン
(Ｈ．Ｃ．Ｃheng)、エス・エム・ヴァン・パッテン
(Ｓ．Ｍ．Ｖan Ｐatten)、エイ・ジェイ・スミス(Ａ．
Ｊ．Ｓmith)およびディー・エイ・ウォルシュ(Ｄ．Ａ．
Ｗalsh)の論文]、±８μＭのcＡＭＰおよび７μgの細胞
抽出物を含んでいた。

【００４９】ケンプチドのリン酸化を、ホスホセルロー
スフィルタ[ホワットマン(Ｗhatman)Ｐ８１]に培養混合
物２０μlを点滴し、[メソーズ・イン・エンザイモロジ
ー(Ｍethods Ｅnzymol．)第９９巻、第３−６頁(１９
８３年)に掲載のアール・ロスコスキー(Ｒ．Ｒoskoski)
の論文]に記載のようにしてリン酸で洗浄することによ
り測定した。放射能は、エコノフルア(Ｅconofluor)−
２[エヌイーエヌ・リサーチ・プロダクツ・エヌーイー
エフ−９６９(ＮＥＮ Ｒesearch ＰroductsＮＥＦ−
９６９)を使用して液体シンチレーションにより測定し
た。

【００５０】全ＲＮＡの単離とノザンブロット分析 細胞(リン酸塩緩衝生理的食塩水で２回洗浄した１０
⁸個)を、２５mＭのクエン酸ナトリウム(pＨ７．０)、
０．５％サルコシル(Ｎ−ラウロイルサルコシンＮa＋)
および０．１Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む４．
２Ｍグアニジンイソチオシアネートに溶解し、溶解物を
ホモジナイズし、全細胞ＲＮＡを、チャーグウィン(Ｃh
irgwin)等の記載[バイオケミストリー(Ｂiochemistry)
第１８巻、第５２８４−５２８８頁(１９７７年)に掲載
のジェイ・エム・チャーグウィン(Ｊ．Ｍ．Ｃhirgwi
n)、エイ・イー・プルツィビラ(Ａ．Ｅ．Ｐrznbyla)、
アール・ワイ・マクドナルド(Ｒ．Ｙ．ＭacＤonald)お
よびダブリュ・ジェイ・ラッター(Ｗ．Ｊ．Ｒutter)の
論文]のようにして、ＣsＣlクッション(５．７Ｍ Ｃs
Ｃl、１０mＭ ＥＤＴＡ)を介して沈降させた。

【００５１】２０mＭの３−[Ｎ−モルホリン]プロパン
−スルホン酸(pＨ７．０)、５０％ホルムアミドおよび
６％ホルムアルデヒドを含む全細胞ＲＮＡを６５℃で１
０分間変性させ、変性１．２％アガロース−２．２Ｍホ
ルムアルデヒドゲルで電気泳動した。

【００５２】次に、ゲルを、トーマスの方法[プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ
・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ)第７７巻、第５２０１−５２０５頁(１９８０年)に
掲載のピー・エス・トーマス(Ｐ．Ｓ．Ｔhomas)の論文]
によりバイオトランス(Ｂiotrans)ナイロン膜[アイシー
エヌ・バイオメディカルズ(ＩＣＮ Ｂiomedicals)]に
移し、ヒトcＡＭＰ依存性プロテインキナーゼタイプＩ
調節サブユニット(ＲＩα)[バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ
(Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun)第１４９巻、第
９３９−９４５頁(１９８７年)に掲載のエム・サンドバ
ーグ(Ｍ．Ｓandberg)、ケイ・タスケン(Ｋ．Ｔasken)、
オウ・オウイェン(Ｏ．Ｏyen)、ヴィー・ハンソン(Ｖ．
Ｈansson)およびティー・ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)の
論文] (ノルウェー国、オスロ、リクショスピタレット
(Ｒikshospitalet)に所在するインスチチュート・オブ
・パソロジー(Ｉnstitite of Ｐathology)のティー・
ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)博士の好意により提供され
た] の全コード領域を含む１．５キロベース(kb)の cＤ
ＮＡクローンと、ヒトβアクチン[オンカー(Ｏncor)p７
０００βアクチン]とのニックトランスレーションによ
り³²Ｐ−ラベルされた２つのcＤＮＡプローブにハイブ
リダイズさせた。

【００５３】結果 図１は、ＨＬ−６０白血病細胞の基礎増殖速度に対する
ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響
を示す。図１においては、細胞をＲＩαアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチド(１５μＭ)の非存在下(○)ま
たは存在(●)下において増殖させた。示されている時間
において、細胞の計数は２回行なわれた。データは４回
の実験の平均値±ＳＤを示す。１５μＭ濃度のＲＩαア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、図１に示す
ように、ＨＬ−６０細胞の分化速度に直接影響を及ぼし
た。培養において４−５日までは、ＲＩαアンチセンス
オリゴマーに曝されなかった細胞は指数関数的な増殖速
度を示したが、アンチセンスオリゴマーに曝された細胞
は遅い増殖速度を示すとともに、最終的には分裂を停止
した。

【００５４】細胞の分化に対するこの抑制作用は培養期
間全体に亙って継続していた。増殖の抑制は細胞の殺死
によるものではなく、細胞は前方および側方の散乱を使
用した流動細胞計測法により評価したように、７日間に
亙ってＲＩαアンチセンスオリゴマー(１５μＭ)に暴露
した後は９０％を越えて生存していた。ＲＩαセンス、
ＲIIαもしくはＲIIβアンチセンスまたはランダム配列
のオリゴデオキシヌクレオチドは、このような増殖抑制
作用はもっていなかった。

【００５５】４日間の培養において、ＲＩαアンチセン
スデオキシオリゴヌクレオチドに曝されまたは曝されな
かった細胞は再接種され、cＡＭＰアナログまたはＴＰ
Ａによる処理に対する応答について試験を行った。結果
は、図２に示す通りであった。図２では、上記実験の４
日目に、ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドに曝されまたは曝されなかった細胞は、５×１０⁵個
／皿で再接種(０日目)され、ＲＩαアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドに予め曝した細胞は０日目と２日
目にオリゴマーでさらに処理した。cＡＭＰアナログと
ＴＰＡを０日目に１回加えた。細胞の計数は、クールタ
ーカウンタで４日目に行なった。

【００５６】図２において、８−Ｃlは８−Ｃl−cＡＭ
Ｐ(１０μＭ)を、８−Ｃl＋Ｎ⁶−Ｂは８−Ｃl−cＡＭＰ
(５μＭ)＋Ｎ⁶−ベンジル−cＡＭＰ(５μＭ)を、ＴＰＡ
はＴＰＡ(１０^-8Ｍ)を示す。データは、４回の実験の平
均値±ＳＤを示す。図２に示すように、ＲＩαアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドに曝されなかった細胞
においては、８−Ｃl−cＡＭＰ(１０μＭ)は６０％の増
殖抑制を生じ、８０％の増殖抑制が８−Ｃl−cＡＭＰ
(５μＭ)＋Ｎ⁶−ベンジル−cＡＭＰ(５μＭ)により得ら
れ[ブラッド(Ｂlood)第７１巻、第２３０−２３３頁(１
９８８年)に掲載のジー・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、ピ
ー・タグリアフェリ(Ｐ．Ｔagliaferri)、ティー・クレ
ア(Ｔ．Ｃlair)、オウ・コラモニッチ(Ｏ．Ｃolamonic
i)、エル・エム・ネッカーズ(Ｌ．Ｍ．Ｎeckers)、アー
ル・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．Ｒobins)およびワイ・エ
ス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]、Ｔ
ＰＡ(１０^-8Ｍ)は６０％の増殖抑制を示した(図２)。

【００５７】これに対して、アンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチドに曝した細胞は、図２に示すように、遅
れた増殖を示し(アンチセンスオリゴマーに曝されなか
った細胞の増殖速度の２５％)、cＡＭＰアナログおよび
ＴＰＡはいずれも増殖をさらに遅らせた。

【００５８】ＨＬ−６０細胞は、部位選択性cＡＭＰア
ナログで処理すると単球分化を受ける。ＲＩαアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドに曝されなかった細胞または曝
された細胞のcＡＭＰアナログによる処理の前後の形態
に関して試験を行なった。結果は、図３に示す通りであ
った。図３は、ＨＬ−６０細胞の形態変換に及ぼすＲＩ
αアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響を示
す図である。ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドに曝した細胞または曝さなかった細胞は、図２に
関して説明したようにcＡＭＰアナログまたはＴＰＡで
処理された。４日目(図２参照)に、細胞をダルベッコの
(Ｄulbecco's)リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、細
胞遠心分離によりガラススライド上にペレット化した。
得られた細胞調製物を固定し、ライトの染色(Ｗright's
stain)により染色を行なった。

【００５９】図３に示すように、ＲＩαアンチセンスオ
リゴマーに曝されなかった細胞においては、８−Ｃl−c
ＡＭＰは核対細胞質の比率、非常に撹乱されかつ空砲の
生じた細胞質および核小体の損失を特徴とする単球形態
変化を誘起した。さらに、同じ形態変化が、細胞をＲＩ
αアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝したときに誘起
された。さらにまた、アンチセンスオリゴマーにより誘
起された形態変化は、ＴＰＡに誘起される形態変化と区
別がつかないものであった。

【００６０】ＲＩαアンチセンスオリゴヌクレオチドに
曝されたＨＬ−６０細胞において誘起された増殖抑制と
単球分化が、オリゴマーの細胞内作用によるものである
ことを一層明らかにするため、ＲＩαのmＲＮＡレベル
を測定した。結果は、図４および図５に示す通りであっ
た。図４および図５は、ＲＩαアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドに曝したＨＬ−６０白血病細胞におけ
る低下したＲＩαmＲＮＡ発現を示すノザンブロットの
図である。細胞は、ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシ
ヌクレオチド(１５μＭ)に８時間曝したものと曝さなか
ったものとがあった。全ＲＮＡの単離とノザンブロック
分析を、実施例に記載の方法に従って行なった。

【００６１】図４はＲＮＡのエチジウムブロミド染色を
示し、ＭはリボゾームＲＮＡのマーカーであり、レーン
１、２はＲＩαアンチセンスオリゴマに曝した細胞およ
び曝さなかった細胞である。図５はノザンブロット分析
であり、同じニトロセルロースをＲＩαとアクチンプロ
ーブの双方に順々にハイブリダイズさせた。レーン１、
２はＲＩαアンチセンスオリゴマーに曝さなかった細胞
と曝した細胞である。

【００６２】図５に示すように、３．０mｋｂのＲＩα
のＲＮＡ[バイオケミカル・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケイションズ(Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒe
s．Ｃommun．)第１４９巻、第９３９−９４５頁(１９８
７年)に掲載のエム・サンドバーグ(Ｍ．Ｓandberg)、ケ
イ・タスケン(Ｋ．Ｔasken)、オウ・オウイェン(Ｏ．Ｏ
yen)、ヴィー・ハンソン(Ｖ．Ｈansson)およびティー・
ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)の論文]は、ＲＩαアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドに８時間曝した細胞には実質上
検出されず(図５、レーン２)、ＲＩαmＲＮＡの減少は
エチジウムブロミド染色により示されるように、全ＲＮ
Ａの量がより低いことによるものではなかった(レーン
２を図４のレーン１と比較されたい)。

【００６３】これに対し、ＲＮＡαアンチセンスオリゴ
マーに曝した細胞においては、アクチンmＲＮＡのレベ
ルは高くなっていることが検出された。アクチンmＲＮ
Ａのレベルの増加が細胞骨格構造の変化に関係するかど
うかは、知られていない。

【００６４】次に、これらの細胞におけるcＡＭＰ受容
蛋白質のレベルを、これらの受容蛋白質を８−Ｎ₃−[³²
Ｐ] cＡＭＰでフォトアフィニティーラベルを行なった
後に、抗ＲＩαおよび抗ＲIIβ抗血清を使用した免疫沈
降により測定した[プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８７巻、第７０５−７
０８頁(１９９０年)に掲載のジー・トルトラ(Ｇ．Ｔort
ora)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlair)およびワイ・エス・
チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文およびジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂi
ol．Ｃhem．)第２６０巻、第３３９３−３４０１頁(１
９８５年)に掲載のアール・エカンガー(Ｒ．Ｅkange
r)、ティー・イー・サンド(Ｔ．Ｅ．Ｓand)、ディー・
オグレイド(Ｄ．Ｏgreid)、ティー・クリストファーソ
ン(Ｔ．Ｃhristoffersen)およびエス・オウ・ドスケラ
ント(Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland)の論文]。

【００６５】結果は、図６に示す通りであった。図６
は、ＨＬ−６０白血病細胞におけるＲＩαとＲIIβcＡ
ＭＰ受容蛋白質の基底および誘起レベルに及ぼすＲＩα
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響を示す
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。細胞は、図１、図２に示す
ようにＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
(１５μＭ)に曝され、またはcＡＭＰで処理された。細
胞抽出物の調製、８−Ｎ₃[³²Ｐ] cＡＭＰの光活性化に
よる取り込み、抗ＲＩαまたは抗ＲIIβ抗血清とプロテ
インＡセファロースを使用した免疫沈降、並びに可溶化
した抗原−抗体複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、実施例に
記載の方法に従って行なった。免疫前の血清対照も同時
に行なったが、免疫沈降バンドは検出されなかった。

【００６６】Ｍは既知の分子量を有する¹⁴Ｃ−ラベルさ
れたマーカーの蛋白質であり、ＲＩαは分子量が４８,
０００のＲＩ[シグマ(Ｓigma)]、ＲIIαは分子量が５
６,０００のＲII(シグマ)である。レーンＲＩαとＲII
βは８−Ｎ₃−[³²Ｐ] cＡＭＰだけによるフォトアフィ
ニティラベルしたものであり、レーン１−３は８−Ｎ₃
−[³²Ｐ] cＡＭＰによるフォトアフィニティラベル後に
抗ＲＩαまたはＲIIβ抗血清で免疫沈降させたものであ
る。８−Ｃl、８−ＣlcＡＭＰ(５μＭ)は、Ｎ⁶−ベンジ
ル、Ｎ⁶−ベンジル−cＡＭＰ(５μＭ)である。図６中の
表のデータはオートラジオグラムのデンシトメータ走査
による定量を示す。このデータは、ＲＩαアンチセンス
オリゴマーに曝さずかつcＡＭＰアナログで処理しなか
った対照細胞の、１任意ユニットと等しく設定されたレ
ベルに対して示されている。データは、３回の実験の平
均±ＳＤを示す。ＡとＢは、抗ＲＩαまたはＲIIβ抗血
清での免疫沈降をそれぞれ示す。

【００６７】図６に示すように、対照細胞においては、
８−Ｃl−cＡＭＰプラスＮ⁶−ベンジル−cＡＭＰ処理
が、ＲIIβの３倍増加とともにＲＩαの約７０％減少を
招き、これによりＲIIβ／ＲＩαの比率が１０倍増加し
た[ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・イン
スチチュート(Ｊ．Ｎatl．Ｃancer Ｉnst．)第８１
巻、第９８２−９８７頁(１９８９年)に掲載のワイ・エ
ス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]。こ
れらの細胞をＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドに４日間曝したところ、ＲＩαのレベルとＲIIβ
のレベルの双方に著しい変化が生じ、ＲIIβの５倍増加
に伴ってＲＩαが８０％減少したことにより、ＲIIβ／
ＲＩαの比率が対照細胞における比率と比較して２５倍
増大した。増殖の抑制と分化が、ＲＩαアンチセンスオ
リゴヌクレオチドに対する被曝の３−４日後に認められ
たので、ＲＩαとＲIIβ蛋白質の変化のレベルは分化を
引き起こすのに必要な初期の現象であると考えられる。

【００６８】図６に記載のデータは、ＲＩαをアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドにより抑制すると、Ｒ
IIβレベルを対応的に高めることを示している。Ｃサブ
ユニットの量を変化させることなくＲＩαとＲIIβがこ
のように共役的に発現することは、以前にも示されてい
る[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２５２巻、第１４４１−１４４
７頁(１９７７年)に掲載のエフ・ホフマン(Ｆ．Ｈofma
n)、ピー・ジェイ・ベクテル(Ｐ．Ｊ．Ｂechtel)および
イー・ジー・クレブス(Ｅ．Ｇ．Ｋrebs)の論文並びにジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．
Ｂiol．Ｃhem．)第２６４巻、第２０２５５−２０２６
０頁(１９８９年)に掲載のエイ・ディー・オッテン
(Ａ．Ｄ．Ｏtten)およびジー・エス・マックナイト
(Ｇ．Ｓ．ＭcＫnight)の論文]。

【００６９】ＲIIβの増加は、ＲＩαアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドに対して曝した後にこれらの細
胞に誘起される分化によるものかもしれない。ＲIIβm
ＲＮＡすなわちＲIIβ蛋白質レベルの増加は、Ｋ−５６
２慢性骨髄性白血病細胞におけるcＡＭＰアナログ−誘
起分化[プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ)第８６巻、第２８４９−２８５２頁
(１９８９年)に掲載のジー・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、
ティー・クレア(Ｔ．Ｃlair)、ディー・カトサロス
(Ｄ．Ｋatsaros)、エス・アリー(Ｓ．Ａlly)、オウ・コ
ラモニッチ(Ｏ．Ｃolamonici)、エル・エム・ネッカー
ズ(Ｌ．Ｍ．Ｎeckers)、ピー・タグリアフェリ(Ｐ．Ｔa
gliaferri)、ティー・ジャンセン(Ｔ．Ｊahnsen)、アー
ル・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．Ｒobins)およびワイ・エ
ス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論文]およ
びフレンド(Ｆriend)赤白血病細胞の赤血球分化[ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂio
l．Ｃhem．)第２６０巻、第６２９６−６３０３頁(１９
８５年)のディー・エイ・シュワルツ(Ｄ．Ａ．Ｓchwart
z)およびシー・エス・ラビン(Ｃ．Ｓ．Ｒubin)の論文]
と相関関係を有していた。

【００７０】最近の報告[プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)第８７巻、第７
０５−７０８頁(１９９０年)に掲載のジー・トルトラ
(Ｇ．Ｔortora)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlair)およびワ
イ・エス・チョ・チュン(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)の論
文]において、本発明者は、ＲIIβはＨＬ−６０細胞に
おけるcＡＭＰ誘導分化にとって重要であることを明確
に証明した。ＲIIβアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドに曝されたＨＬ−６０細胞は、cＡＭＰアナログ
による処置に対して抵抗を示し、増殖を継続した。

【００７１】ＨＬ−６０細胞の分化におけるＲIIβの重
要な役割はまた、これらの細胞がＲＩαとＲIIβの双方
のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに同時に曝
されたときにも示された。表１に示すように、ＲＩαア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、未熟骨髄細
胞[(Ｍy９)セルラー・イミュノロジー(Ｃell．Ｉmmuno
l．)第７８巻、第８３頁(１９８３年)に掲載のエム・エ
イ・タレ(Ｍ．Ａ．Ｔalle)、ピー・イー・ラオ(Ｐ．
Ｅ．Ｒao)、イー・ウェストバーグ(Ｅ．Ｗestberg)、エ
ヌ・アレガー(Ｎ．Ａllegar)、エム・マコウスキー
(Ｍ．Ｍakowski)、アール・エス・ミットラー(Ｒ．Ｓ．
Ｍittler)およびジー・ゴールドステイン(Ｇ．Ｇoldste
in)の論文並びにルーコ・リサーチ(Ｌeuk．Ｒes．)第５
巻、第４９１頁(１９８１年)に掲載のアール・エフ・ト
ッド・ザ・サード(Ｒ．Ｆ．Ｔodd．ＩＩＩ)、ジェイ・
ディー・グリフィン(Ｊ．Ｄ．Ｇriffin)、ジェイ・リッ
ツ(Ｊ．Ｒitz)、エル・エム・ナドラー(Ｌ．Ｍ．Ｎadle
r)、ティー・アブラムズ(Ｔ．Ａbrams)およびエス・エ
フ・シュロスマン(Ｓ．Ｆ．Ｓchlossman)の論文]に関す
るマーカーの減少とともに、単球表面抗原[(Ｌeu１５):
ジャーナル・オブ・イミュノロジー(Ｊ．Ｉmmuno．)第
１３１巻、第２７５７−２７６１頁(１９８３年)に掲載
のエイ・ランデイ(Ａ．Ｌanday)、エル・ガートランド
(Ｌ．Ｇartland)およびエル・ティー・クレメント(Ｌ．
Ｔ．Ｃlement)の論文]と[Ｌeu Ｍ３:ジャーナル・オブ
・イミュノロジー(Ｊ．Ｉmmuno．)第１３０巻、第１４
５−１５２頁(１９８３年)に掲載のエイ・ディミトリュ
ー・ボナ(Ａ．Ｄimitriu−Ｂona)、ジー・アール・バー
メスター(Ｇ．Ｒ．Ｂurmester)、エス・ジェイ・ウォー
ターズ(Ｓ．Ｊ．Ｗaters)およびアール・ジェイ・ウィ
ンチェスター(Ｒ．Ｊ．Ｗinchester)の論文] の発現の
著しい増大を引き起こした。

【００７２】表面マーカーの発現におけるこれらの変化
は、細胞がＲＩαとＲIIβの双方のアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドに同時に曝されたときになくなっ
た(表１)。ＲIIαのcＡＭＰ受容体は、ＨＬ−６０細胞
においては検出されず[キャンサー・インベスティゲイ
ション(Ｃancer Ｉnvest．)第７(２)巻、第１６１−１
７７頁(１９８９年)に掲載のワイ・エス・チョ・チュン
(Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung)、ティー・クレア(Ｔ．Ｃlai
r)、ピー・タグリアフェリ(Ｐ．Ｔagliaferri)、エス・
アリー(Ｓ．Ａlly)、ディー・カトサロス(Ｄ．Ｋatsaro
s)、ジー・トルトラ(Ｇ．Ｔortora)、エル・ネッカーズ
(Ｌ．Ｎeckers)、ティー・エル・アベリー(Ｔ．Ｌ．Ａv
ery)、ジー・ダブリュ・クラブツリー(Ｇ．Ｗ．Ｃrabtr
ee)およびアール・ケイ・ロビンズ(Ｒ．Ｋ．Ｒobins)の
論文]、ＲIIαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドは、ＲＩαアンチセンスオリゴマーの効果に対する影
響は示さなかった(表１)。

【００７３】ＲＩαとＲIIβの双方のアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドに曝された細胞は、cＡＭＰア
ナログによる処理の如何に拘わらず、増殖抑制も、分化
も受けなかった。これらの結果は、cＡＭＰ依存増殖調
節経路を遮断していることを示しているものと考えられ
る。細胞は、これらの条件下では、もはやcＡＭＰ依存
性ではなく、別の経路を介して生存し、分化するものと
考えられる。

【００７４】かくして、ＲＩαとＲIIβの双方の遺伝子
発現を抑制すると、突然変異細胞ラインと同様に、異常
な細胞増殖調節を受け[セル(Ｃell)第２２巻、第３２９
−３３０頁(１９８０年)に掲載のエム・エム・ゴッテス
マン(Ｍ．Ｍ．Ｇottesman)の論文]、cＡＭＰ依存性プロ
テインキナーゼの不十分なあるいは不完全な調節サブユ
ニットを含むとともに、cＡＭＰ賦活に対してはもはや
感受性を示さなかった。

【００７５】本発明者が得た結果によれば、cＡＭＰ
は、ＲＩαまたはＲIIβ受容蛋白質の有効性により、細
胞分化に関して正または負のデュアル制御の信号を変換
することが示されている。ＲIIβ発現の高まりとともに
ＲＩαの抑制を引き起こすＲＩαアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドにより、細胞毒性の兆候をもたない
ＨＬ−６０の末端分化が生じた。

【００７６】細胞は、ＲIIβアンチセンスまたはＲＩα
とＲIIβの双方のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ
チドに曝されているので、ＲＩαアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドに曝された細胞の遊離のＣサブユニ
ットの増加は分化によるものとは考えられず、遊離のＣ
サブユニットを生ずる条件の下で、増殖を続け、cＡＭ
Ｐ賦活に抵抗を示すようになった。

【００７７】かかる事実を直接明らかにするため、飽和
濃度cＡＭＰの存在下および非存在下で、かつ熱安定性
プロテインキナーゼ阻害剤[バイオケミカル・ジャーナ
ル(Ｂiochem．Ｊ．)第２３１巻、第６５５−６６１頁
(１９８５年)に掲載のエイチ・シー・チェン(Ｈ．Ｃ．
Ｃheng)、エス・エム・ヴァン・パッテン(Ｓ．Ｍ．Ｖan
Ｐatten)、エイ・ジェイ・スミス(Ａ．Ｊ．Ｓmith)およ
びディー・エイ・ウォルシュ(Ｄ．Ａ．Ｗalsh)の論文]
の存在下および非存在下で、基質としてケンプチド(ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．
Ｂiol．Ｃhem．)第２５２巻、第４８８８−４８９４頁
(１９７７年)に掲載のビー・イー・ケンプ(Ｂ．Ｅ．Ｋe
mp)、ディー・ジェイ・グレイブズ(Ｄ．Ｊ．Ｇraves)、
イー・ベンジャミン(Ｅ．Ｂenjamin)およびイー・ジー
・クレブス(Ｅ．Ｇ．Ｋerbs)の論文]を使用し、アンチ
センスオリゴデオキシヌクレオチドに曝しまたは曝さな
い細胞のホスホトランスフェラーゼを測定した。

【００７８】このアッセイ法によれば、解離したＣと全
Ｃ活性の相対的レベルを正確に測定することができる。
未処理のＨＬ−６０細胞からの細胞抽出物は、解離した
Ｃは著しく低レベルであり、cＡＭＰにより３６倍刺激
を受けた（表２）。このcＡＭＰ刺激活性は、熱安定性
プロテインキナーゼ阻害剤によりほぼ完全に抑制され
（表２）、測定された全Ｃ活性から、cＡＭＰ依存性プ
ロテインキナーゼであることがわかった。これらの結果
は、遊離の触媒サブユニットがＨＬ−６０細胞において
観察される分化を引き起こさないことを直接証明してい
る。

【００７９】ＲＩαのcＡＭＰ受容蛋白質の過度の発現
が、試験されたヒトの乳および結腸原発性癌腫の大部分
において見出されており［プロシーディングズ・オブ・
ザ・アメリカン・アソシエイション・オブ・キャンサー
・リサーチ（Ｐroc．Ａm．Ａssoc．Ｃancer Ｒes.）第
３１巻、第１７２頁（１９９０年）に掲載のエイ・ダブ
リュ・ブラッドバリー（Ａ．Ｗ．Ｂradbury）、ダブリ
ュ・アール・ミラー（Ｗ．Ｒ．Ｍiller）、ティー・ク
レア（Ｔ．Ｃlair）およびワイ・エス・チョ・チュン
（Ｙ．Ｓ．Ｃho−Ｃhung）の論文］、cＡＭＰ受容体が
更に腫瘍の増殖においてインビトロで重要な役割を果た
していることを示している。

【００８０】しかしながら、細胞増殖におけるＲＩαの
正確な役割は、現時点では知られていない。ＲＩαは、
Ｃサブユニットを滴定（タイトレート）することにより
ＲIIβの生成を抑制することができ、あるいは、これは
細胞増殖を引き起こすマイトジェン信号の変換器とする
ことができる。これらの結果は、ＲＩαアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドが細胞の増殖と分化における
cＡＭＰ受容蛋白質の役割に関する研究に対して有用な
遺伝手段を提供するとともに、悪性度の制御における新
しい解決方法に寄与することを示している。

【００８１】

【表１】

【００８２】表面抗原分析は、単球または骨髄細胞と反
応するモノクローナル抗体を使用したフローサイトメト
リー（流動細胞計測法）により実施した。使用したモノ
クローナル抗体は、Ｌeu１５、ＬeuＭ３およびＭy９で
あった。各サンプルに関して２×１０⁴個の細胞を分析
し、細胞ゲーティング（cell gating）は、前方および
側方散乱を使用して行った。数字は、％陽性を示すとと
もに、３つの実験の平均値を示す。

【００８３】

【表２】

【００８４】細胞は、図１に示すように、１５μＭ濃度
のＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、Ｒ
IIβアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびＲ
ＩαとＲIIβアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
のそれぞれに４日間曝された。データは、３回の同じ実
験の二重測定の平均±ＳＤを示す。

【００８５】＊分／mg蛋白質当たりケプチドに移動した
リン酸塩のピコモル。

【００８６】実施例２ 次に、配列番号１を有するＲＩαアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドを、実験的な腫瘍を有するマウスに
投与した。ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ
チド（２５０mg／kg）とコレステロール（７５０mg／k
g）のペレットを、リン酸塩緩衝生理的食塩水に懸濁さ
せたＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌細胞（２×１０⁶個）を
左脇腹に注入した無胸腺症マウスの左脇腹に皮下（s．
c.）に埋め込んだ。腫瘍の測定とマウスの重量を処理の
最初の日（開始日）と処理の最後（開始日＋５）に記録
した。平均腫瘍重量変化（Δ）は、長さと幅のミリメー
トル測定に基づくものである。数日後、腫瘍の増殖は、
対照細胞と比較して抑制された（表３）。対照動物およ
び処理動物には体重変化は認められなかった。

【００８７】

【表３】

【００８８】別のインビトロの実験においては、配列番
号１を有するＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドを、神経芽細胞腫、結腸癌、乳癌および胃癌細胞
を別々に含む皿に加えた。結果は、図７に示す通りであ
った。図７は、配列番号１（Ｏ−オリゴおよびＳ−オリ
ゴ誘導体）を有するＲＩαアンチセンスオリゴデオキシ
ヌクレオチドによるヒト癌細胞ラインの増殖抑制を対照
と比較して示すグラフ図である。細胞ラインは、ＳＫ−
Ｎ−ＳＨが神経芽細胞腫、ＬＳ−１７４Ｔが結腸癌、Ｍ
ＣＦ−７が乳癌、ＴＭＫ−１が胃癌である。Ｅ₂はエス
トラジオール−１７βを示す。

【００８９】図７に示すように、配列番号１を有するＲ
Ｉαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、対照
細胞と比較すると、全ての癌細胞の増殖を抑制した。更
に、配列番号１を有するＲＩαアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドは、図８に示すように、ヒトの神経芽
細胞の分化を引き起こした。

【００９０】実施例３ 次に、無胸腺症のマウスにおけるＬＳ−１７４Ｔヒト結
腸癌の増殖に対するＯ−オリゴおよびＳ−オリゴＲＩα
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの作用の比較
を行った。

【００９１】＜材料と方法＞ 本発明者は、第１のコドンから出発するヒトＲＩα、ヒ
トＲIIβmＲＮＡ転写物に相補的な２１マーのアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチド並びにこれらのホスホ
ロチオエートアナログ、および同じサイズのミスマッチ
配列オリゴマーを合成した［ミリジェン・バイオサーチ
８７００ＤＮＡ合成器（Ｍilligen Ｂiosearch ８７
００ ＤＮＡ synthesizer）（マサチューセッツ州、
ベッドフォード（Ｂedford，ＭＡ))]。各オリゴマーの
配列は以下の通りである。

【００９２】ＲＩαアンチセンス：５'−ＧＧＣ−ＧＧ
Ｔ−ＡＣＴ−ＧＣＣ−ＡＧＡ−ＣＴＣ−ＣＡＴ−３' ＲIIβアンチセンス：５'−ＣＧＣ−ＣＧＧ−ＧＡＴ−
ＣＴＣ−ＧＡＴ−ＧＣＴ−ＣＡＴ−３' ランダムオリゴ：５'−ＣＧＡ−ＴＣＧ−ＡＴＣ−ＧＡ
Ｔ−ＣＧＡ−ＴＣＧ−ＴＡＣ−３'

【００９３】ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌細胞（２×１０
⁶）を無胸腺症マウスに皮下（s．c.）注射し、コレステ
ロールペレットまたは５０％胡麻油エマルジョンの形態
をなすアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを、腫
瘍の平均サイズが通常２５−５０mgとなる１週間後に皮
下投与した。腫瘍の体積は、長さと幅とを測定し、（４
／３）πr³なる式により算出した。該式において、r＝
(長さ＋幅)／４である。

【００９４】＜結果と検討＞ 結果は図９および図１０に示す通りであった。図９およ
び図１０は、ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドおよびそのホスホロチオエートアナログが、無胸
腺症マウスにおけるＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌のインビ
ボにおける増殖を抑制することを示すものである。即
ち、図９は、腫瘍の増殖のオリゴデオキシヌクレオチド
濃度依存抑制を示す。Ｏ−オリゴは、ＲＩαアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドであり、Ｓ−オリゴは、
ＲＩαアンチセンスオリゴマのホスホロチオエートアナ
ログである。指示された投与量のＯ−オリゴまたはＳ−
オリゴを含むコレステロールペレット（全重量２０mg）
を、１回、ゼロ時で皮下に埋め込み、腫瘍のサイズを測
定した。腫瘍の体積（実施例３に記載の材料と方法を参
照）は、７つの腫瘍の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。

【００９５】図１０は、腫瘍の増殖に対するアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートの影
響を示す。コレステロールペレットで３mg投与量でＳ−
オリゴ（全量で２０mg）を、２×／週、皮下に投与し
た。腫瘍の体積（実施例３の材料と方法を参照）は、７
つの腫瘍の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。

【００９６】図７および図１０は、（ゼロ時で）コレス
テロールペレットで１回皮下投与された２および５mg投
与量のＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
（Ｏ−オリゴ）の投与量および時間依存効果を示し、対
照（未処理）の腫瘍と比較すると、７日で約２０％およ
び４６％の増殖抑制を示している。驚いたことに、ＲＩ
αアンチセンスホスホロチオエートアナログ（Ｓ−オリ
ゴ）を２mg投与（コレステロールペレット、皮下）した
ところ、７日目に６０％の増殖抑制が得られ、Ｏ−オリ
ゴアンチセンスに比べて効果が３倍大きかった（図
９）。ＲＩαアンチセンスＳ−オリゴマは、動物を長期
間処理したときに一層大きな増殖抑制効果を発揮した。

【００９７】また、図１０に示すように、３mgの投与量
のＲＩαアンチセンスＳ−オリゴマーをコレステロール
ペレットで、週２回、３週間皮下埋め込みを行ったとこ
ろ、８０％の増殖抑制を果たし、腫瘍の増殖は、２週間
の処理後にほとんど停止した。ＲＩαアンチセンスＯ−
オリゴマーまたはＳ−オリゴマーを、５０％胡麻油エマ
ルジョンとして皮下投与したところ、同様の結果が得ら
れた。ＲＩαアンチセンスＳ−オリゴマーは、動物にお
いて明らかな毒性を生ずることは全くなく、体重の減少
その他の毒性による兆候は、３週間に亘る処理において
は見られなかった。

【００９８】ＲＩαアンチセンスＳ−オリゴマーにより
得られる増殖抑制効果は、オリゴマーの特有の効果であ
り、ＲＩαアンチセンスオリゴマーと同じサイズのＲII
βアンチセンスまたはランダム（ミスマッチ配列）Ｓ−
オリゴマーは、腫瘍増殖に対して効果を発揮しなかった
（図１０）。

【００９９】ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドで処理した無胸腺症マウスの結腸癌において観察
された増殖抑制が、オリゴマーの細胞内効果によるもの
であることを一層明らかにするため、これらの腫瘍にお
けるＲＩαおよびＲIIβcＡＭＰ受容蛋白質のレベルを
測定した。ＲＩαレベルは、（ノルウェー国、オスロに
所在するオスロ大学（Ｕniversity of Ｏslo）のリー
（Ｌea）博士およびジャンセン（Ｊahnsen）博士の好意
により提供された）ヒトＲＩαに対するモノクローナル
抗体を使用して免疫染色［プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイセンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）第８５巻、第
６３１９−６３２２頁（１９８８年）に掲載のエス・ア
ライ（Ｓ．Ａlly）の論文］を行うことにより測定し、
一方、ＲIIβは［³²Ｐ］８−Ｎ₃−cＡＭＰでＲIIβのフ
ォトアフィニティラベルを行った後に、［ノルウェー
国、ベルゲン（Ｂergen）に所在するベルゲン大学（Ｕn
iversity of Ｂergen）のエス・オウ・ドスケランド
（Ｓ．Ｏ．Ｄoskeland）博士の好意により提供された］
抗ＲIIβ抗血清による免疫沈降［プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイセンシ
ーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメ
リカ（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）第８７
巻、第７０５−７０８頁（１９９０年）に掲載のジー・
トルトラ（Ｇ．Ｔortora）等の論文］により測定した。

【０１００】表４に示すように、ＲＩαアンチセンスＳ
−オリゴマー処理により、未処理の対照腫瘍と比較し
て、腫瘍のＲＩαレベルは著しく減少した（８０％減
少）。ＲＩαアンチセンスＳ−オリゴマーによるＲＩα
発現に対するこのような抑圧により、ＲIIβレベルは２
倍増大した（表４）。プロテインキナーゼの触媒サブユ
ニットの量の変化を引き起こすことのないＲＩαとＲII
βのこのような調節された発現は、ＲＩαアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチドに曝したときに増殖の抑制
と分化を示すＨＬ−６０白血病細胞において示された。

【０１０１】一方、ＲIIβレベルの８０％の抑制ととも
にＲＩαレベルの５０％の増大が、腫瘍の増殖に影響を
及ぼさないＲIIβアンチセンスＳ−オリゴマによる処理
後に観察された（図９および図１０）。腫瘍の増殖に影
響を及ぼさなかった（図９および図１０）ランダムな
（ミスマッチ配列）Ｓ−オリゴマーはまた、ＲＩαレベ
ルに対しても影響を及ぼさなかった（表４）。かくし
て、ＲＩα発現の低減は、ＲＩαアンチセンスオリゴマ
ーで処理すると腫瘍増殖の低減または停止を引き起こす
ものと考えられる。

【０１０２】かかる結果により、cＡＭＰは、ＲＩαま
たはＲIIβ受容蛋白質の有効性により、細胞増殖に対す
る積極的または消極的な二重制御の信号を変換すること
がわかった。ＲＩαの発現を抑制し、ＲIIβ発現を高め
るＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによ
り、動物に毒性の兆候をもたらさずに、無胸腺症マウス
における充実性結腸癌のインビボにおける増殖が抑制さ
れた。ＲＩαアンチセンスオリゴマのホスホロチオエー
トアナログ（Ｓ−オリゴ）は、改質されていないオリゴ
デオキシヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）のアンチセンスよ
りも大きい効力を示した。

【０１０３】Ｓ−オリゴは、Ｏ−オリゴと比較して、容
易に細胞に入り易く、エンドヌクレアーゼに対して耐性
があり、かつ、標的mＲＡまたはＤＮＡ［フロリダ州、
ボカラトン（Ｂoca Ｒaton）のシーアールシー・プレ
ス・インコーポレイテッド（ＣＲＣ Ｐress，Ｉnc.）
発行、シー・エイ・スタイン（Ｃ．Ａ．Ｓtein）著、ジ
ェイ・エス・コーエン（Ｊ．Ｓ．Ｃohen）編集のオリゴ
デオキシヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス抑制
剤（Ｏligodeoxynucleotides：Ａntisense Ｉnhibitor
s of Ｇene Ｅxpression）第９７−１１７頁（１９
８９年)］との雑種形成において大きい効力を示すこと
がわかった。

【０１０４】これらの結果は、アンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドがインビボにおいて悪性腫瘍の抑制に
おいて著しい効果を示すことを、ここに初めて示す。ア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる、特にそ
のホスホロチオエートアナログによるcＡＭＰ依存プロ
テインキナーゼのタイプＩ調節サブユニット（ＲＩα）
を枯渇させることにより、毒性の兆候を示すことなく、
インビボでの腫瘍増殖を首尾よく停止させることがで
き、このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは臨
床応用に大きな効力を発揮するものと考えられる。

【０１０５】

【表４】

【０１０６】表４において、Ｓ−オリゴによる処理は、
図１０におけるものと同じである。実験（３週間）の最
後に、腫瘍抽出物を前記［キャンサー・リサーチ（Ｃan
cerＲes.）第４９巻、第５６５０−５６５５頁（１９８
０年）に掲載のエス・アリー（Ｓ．Ａlly）等の論文］
のようにして得て、ＲＩαおよびＲIIβの免疫染色およ
び免疫沈降を、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイセンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐroc．Ｎa
tl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）第８５巻、第６３１９−６
３２２頁（１９８８年）に掲載のエス・アリー（Ｓ．Ａ
lly）の論文およびプロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイセンシーズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）第８７巻、第７０５
−７０８頁（１９９０年）に掲載のジー・トルトラ
（Ｇ．Ｔortora）等の論文に記載のようにして行った。
データは、オートラジオグラフィのデンシトメトリ走査
による定量からのものである。データは、任意の単位と
しての１に等しく設定された対照腫瘍（未処理）のレベ
ルに対するものとして示されている。データは、７つの
腫瘍の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。

【０１０７】以下の配列表において、配列番号１は、Ｒ
Ｉαの最初の７Ｎ−末端コドン（第１−７コドン）に対
応するアンチセンス配列を示す。配列番号２は、ＲＩα
の第８−１３コドンに対応するアンチセンス配列を示
す。配列番号３は、ＲＩαの第１４−２０コドンに対応
するアンチセンス配列を示す。配列番号４は、ＲＩαの
第９４−１００コドンに対応するアンチセンス配列を示
す。配列番号５は、ＲＩαの第１−１００コドンに対応
するアンチセンス配列を示す。配列番号６は、ＲＩαの
第１−１００コドンに対応するセンス配列を示す。

【０１０８】

【発明の効果】本発明のＲＩαアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、癌細胞におけるＲＩαの発現を抑制するこ
とにより、細胞の増殖を抑制するとともに、細胞分化を
刺激することができる。更に、本発明の薬剤組成物は、
増殖の抑圧を受けやすい癌細胞の増殖を抑圧することに
より、癌の治療、殊に固形癌の治療に使用することがで
きる。

【０１０９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＹＥＳ 配列 GGCGGTACTG CCAGACTCCA T 21

【０１１０】 配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＹＥＳ 配列 GCGTGCCTCC TCACTGGC 18

【０１１１】 配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＹＥＳ 配列 GAGCTCACAT TCTCGAAGGC T 21

【０１１２】 配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＹＥＳ 配列 GATAGCACCT CGTCGCCTCC T 21

【０１１３】 配列番号：５ 配列の長さ：３００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＹＥＳ 配列 GATAGCACCT CGTCGCCTCC TACCTTTAAC CACTGGGTTG GGTGGAGGAG GAGAAATCTC 60 ATCCTCCCTT GAGTCTGTAC GAGTGCCTGC TTTCTGCAGA TTGTGAATCT GTTTTGCCTC 120 CTCCTTCTCC AACCTCTCAA AGTATTCCCT GAGGAATGCC ATGGGACTCT CAGGTCGAGC 180 AGTGCACAAC TGCACAATAG AATCTTTGAG CAGTGCTTGA ATGTTATGCT TCTGGACGTA 240 GAGCTCACAT TCTCGAAGGC TGCGTGCCTC CTCACTGGCG GCGGTACTGC CAGACTCCAT 300

【０１１４】 配列番号：６ 配列の長さ：３００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＮＯ 配列 ATGGAGTCTG GCAGTACCGC CGCCAGTGAG GAGGCACGCA GCCTTCGAGA ATGTGAGCTC 60 TACGTCCAGA AGCATAACAT TCAAGCACTG CTCAAAGATT CTATTGTGCA GTTGTGCACT 120 GCTCGACCTG AGAGACCCAT GGCATTCCTC AGGGAATACT TTGAGAGGTT GGAGAAGGAG 180 GAGGCAAAAC AGATTCAGAA TCTGCAGAAA GCAGGCACTC GTACAGACTC AAGGGAGGAT 240 GAGATTTCTC CTCCTCCACC CAACCCAGTG GTTAAAGGTA GGAGGCGACG AGGTGCTATC 300

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＬ−６０白血病細胞の基礎増殖速度に対する
ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響
を示すグラフ図である。

【図２】ＨＬ−６０白血病細胞をｃＡＭＰアナログまた
はＴＰＡで処理したときのこれらの細胞の増殖を示すグ
ラフ図である。

【図３】ＨＬ−６０細胞の形態変化に及ぼすＲＩαアン
チセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響を示す図で
ある。×１８０。

【図４】ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドに曝したＨＬ−６０白血病細胞における低下したＲＩ
αｍＲＮＡの発現を示すノザンブロットである。

【図５】ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドに曝したＨＬ−６０白血病細胞における低下したＲＩ
αｍＲＮＡの発現を示すノザンブロットである。

【図６】ＨＬ−６０白血病細胞におけるＲＩαとＲＩＩ
βｃＡＭＰ受容蛋白質の基礎および誘起レベルに及ぼす
ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響
を示すＳＤＳＡ−ＰＡＧＥ図である。

【図７】配列番号１（Ｏ−オリゴおよびＳ−オリゴ誘導
体）を有するＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドによるヒト癌細胞ラインの増殖抑制を対照と比較
して示すグラフ図である。

【図８】この図は、配列番号１を有するＲＩαアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドに曝されたＳＫ−Ｎ−
ＳＨヒト神経芽細胞腫細胞の形態変化を示す図である。

【図９】ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドの投与量および時間依存効果を示すグラフ図である。

【図１０】ＲＩαアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ
チドの投与量および時間依存効果を示すグラフ図であ
る。

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号６で表されるｃＡＭＰ依存性プ
   ロテインキナーゼタイプＩの調節サブユニット（ＲＩ
   α）の最初の１００ Ｎ−末端コドンの領域に対して相
   補的な１５−３０マーのオリゴヌクレオチドであるアン
   チセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする固形癌治
   療剤。
2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮ
   Ａである請求項１に記載の固形癌治療剤。
3. 【請求項３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列
   番号１に示す配列を有する２１マーである請求項１に記
   載の固形癌治療剤。
4. 【請求項４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列
   番号２に示す配列を有する１８マーである請求項１に記
   載の固形癌治療剤。
5. 【請求項５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列
   番号３に示す配列を有する２１マーである請求項１に記
   載の固形癌治療剤。
6. 【請求項６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列
   番号４に示す配列を有する２１マーである請求項１に記
   載の固形癌治療剤。
7. 【請求項７】 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ タ
   イプＩの調節サブユニット（ＲＩα）遺伝子またはその
   転写産物に対して相補的な配列番号５に示す配列を有す
   るアンチセンスＤＮＡの１５−３０マーのフラグメント
   を有効成分とする固形癌治療剤。
8. 【請求項８】 請求項１−７のいずれか一項に記載のア
   ンチセンスオリゴヌクレオチドがＯ−オリゴヌクレオチ
   ドである固形癌治療剤。
9. 【請求項９】 請求項１−７のいずれか一項に記載のア
   ンチセンスオリゴヌクレオチドがＳ−オリゴヌクレオチ
   ドである固形癌治療剤。
10. 【請求項１０】 活性成分として、配列番号６で表され
    るｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ タイプＩの調節
    サブユニット（ＲＩα）の最初の１００ Ｎ−末端コド
    ンの領域に対して相補的な１５−３０マーのオリゴヌク
    レオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬
    学的に許容できるキャリヤとを含有する固形癌治療用薬
    剤組成物。
11. 【請求項１１】 薬学的に許容できるキャリヤがステロ
    ールである請求項１０に記載の固形癌治療用薬剤組成
    物。
12. 【請求項１２】 薬学的に許容することができるキャリ
    ヤがリポソームである請求項１０に記載の薬剤組成物。
13. 【請求項１３】 配列番号６で表されるｃＡＭＰ依存性
    プロテインキナーゼタイプＩの調節サブユニット（ＲＩ
    α）の最初の１００ Ｎ−末端コドンの領域に対して相
    補的な１５−３０マーのオリゴヌクレオチドであるアン
    チセンスオリゴヌクレオチド、または請求項１０−１２
    のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、固形癌治療を必
    要とする動物（ヒトを除く）に投与することを特徴とす
    る固形癌の治療方法。