JPH0799976A - 修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents
修飾オリゴヌクレオチドInfo
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- JPH0799976A JPH0799976A JP24475393A JP24475393A JPH0799976A JP H0799976 A JPH0799976 A JP H0799976A JP 24475393 A JP24475393 A JP 24475393A JP 24475393 A JP24475393 A JP 24475393A JP H0799976 A JPH0799976 A JP H0799976A
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- JP
- Japan
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- oligonucleotide
- signal peptide
- nuclear localization
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】アンチセンスＤＮＡあるいはＲＮＡを効率よく
細胞内の作用部位に移行可能な核局在シグナル修飾オリ
ゴヌクレオチドを提供する。 【構成】核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレオチド
とを結合させてなる修飾オリゴヌクレオチド。 【効果】標的組織に運搬されたのち効率良く細胞内に取
り込まれ、さらに核内へ移行し、低用量でアンチセンス
治療効果を挙げることができる。
細胞内の作用部位に移行可能な核局在シグナル修飾オリ
ゴヌクレオチドを提供する。 【構成】核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレオチド
とを結合させてなる修飾オリゴヌクレオチド。 【効果】標的組織に運搬されたのち効率良く細胞内に取
り込まれ、さらに核内へ移行し、低用量でアンチセンス
治療効果を挙げることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンチセンスＤＮＡあ
るいはＲＮＡを効率よく細胞内の作用部位に移行可能な
核局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドに関する。
るいはＲＮＡを効率よく細胞内の作用部位に移行可能な
核局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】特定の相補的塩基配列を用いて、遺伝子
の転写・スプライシング・核膜透過または翻訳をDNAレ
ベルあるいはmRNAレベルで阻害するアンチセンス技術が
近年急速に進展してきた。本技術は、従来の医薬品と全
く異なる作用様式で特定の機能蛋白の発現を特異的に抑
制できるため、特に医薬品の開発研究に応用されている
［S.T.Crooke:Bio/Technol.,10,882(1992)］。通常アン
チセンスとしては翻訳開始領域などを含む15〜25mer程
度のオリゴヌクレオチドが用いられるが、これらのオリ
ゴDNAあるいはRNAは細胞内に取り込まれたのち特定の蛋
白をコードするDNAあるいはmRNAと、DNA-DNA，DNA-RN
A，RNA-RNAの形のハイブリッドを形成し、上記に示した
遺伝子の転写・スプライシング・核膜透過または翻訳を
阻害する。またハイブリッド形成によりRNase Hによるm
RNAの特異的な分解を促進することも知られている［川
上純司ら:PHARM TECH JAPAN,8,395(1992)］。アンチセ
ンス技術が生物学的特異性の高い医薬品として潜在的な
可能性を有することは、癌遺伝子産物・増殖因子・各種
ウイルスなどを標的とする数多くのinvitro実験での証
明で明らかであるが、その可能性にもかかわらず一方で
医薬品としての実用化に多くの疑問が持たれていた。そ
の原因として、１）in vivoに投与されたオリゴヌクレ
オチドが生体内で不安定であること、例えば血中や細胞
内のヌクレアーゼにより容易に分解されること、２）組
織移行性・細胞内取り込み・細胞内移行性（核への移行
性）に問題があり、標的部位への到達が困難であるこ
と、３）オリゴヌクレオチドの製造上の問題、すなわち
その純度および製造コストに問題があること、またこれ
らの結果として、４）標的蛋白の発現抑制が必ずしも十
分でないこと、などが挙げられている。
の転写・スプライシング・核膜透過または翻訳をDNAレ
ベルあるいはmRNAレベルで阻害するアンチセンス技術が
近年急速に進展してきた。本技術は、従来の医薬品と全
く異なる作用様式で特定の機能蛋白の発現を特異的に抑
制できるため、特に医薬品の開発研究に応用されている
［S.T.Crooke:Bio/Technol.,10,882(1992)］。通常アン
チセンスとしては翻訳開始領域などを含む15〜25mer程
度のオリゴヌクレオチドが用いられるが、これらのオリ
ゴDNAあるいはRNAは細胞内に取り込まれたのち特定の蛋
白をコードするDNAあるいはmRNAと、DNA-DNA，DNA-RN
A，RNA-RNAの形のハイブリッドを形成し、上記に示した
遺伝子の転写・スプライシング・核膜透過または翻訳を
阻害する。またハイブリッド形成によりRNase Hによるm
RNAの特異的な分解を促進することも知られている［川
上純司ら:PHARM TECH JAPAN,8,395(1992)］。アンチセ
ンス技術が生物学的特異性の高い医薬品として潜在的な
可能性を有することは、癌遺伝子産物・増殖因子・各種
ウイルスなどを標的とする数多くのinvitro実験での証
明で明らかであるが、その可能性にもかかわらず一方で
医薬品としての実用化に多くの疑問が持たれていた。そ
の原因として、１）in vivoに投与されたオリゴヌクレ
オチドが生体内で不安定であること、例えば血中や細胞
内のヌクレアーゼにより容易に分解されること、２）組
織移行性・細胞内取り込み・細胞内移行性（核への移行
性）に問題があり、標的部位への到達が困難であるこ
と、３）オリゴヌクレオチドの製造上の問題、すなわち
その純度および製造コストに問題があること、またこれ
らの結果として、４）標的蛋白の発現抑制が必ずしも十
分でないこと、などが挙げられている。
【０００３】これらの指摘に対して、例えば次のような
試みが成されている。１）オリゴヌクレオチドのDNA骨
格をホスホロチオエート（以下、Ｓ-オリゴと略記する
ことがある）やメチルホスホネート（以下、ＭＰ-オリ
ゴと略記することがある）の形に変え、ヌクレアーゼ抵
抗性を賦与している［東海林洋子ら:PHARM TECH JAPAN,
8,719(1992)］。実際に前者のＳ-オリゴは各種の動物試
験やさらには臨床試験にも応用され、相当に長い血中半
減期（〜20時間）を示し、また肝臓および腎臓を除くか
なりの組織・臓器で安定であることが示されている［S.
Agrawalら:第2回アンチセンスシンポジウム講演要旨集,
p.32(1992)、P.Iversenら:第2回アンチセンスシンポジ
ウム講演要旨集,p.46(1992)、S.Agrawalら:Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,88,7595(1991)］。２）組織内への到達性
は良好で、マウスを用いた動物実験ではかなりの量が肝
臓および腎臓に分布していることが示された［S.Agrawa
lら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,7595 (1991)］。３）
オリゴヌクレオチド、特にＳ-オリゴの合成は一部米国
ベンチャー企業の努力により、純度の高いclinical gra
deの標品が大量に合成可能となり、実際に各種機関で臨
床試験に供されている。従ってそのコストも大幅に減少
しつつあると判断される。しかしながら、アンチセンス
に関するin vivo実験での成功例はきわめて限られてお
り、この原因の多くがオリゴヌクレオチドの不安定性や
細胞膜透過性および細胞内移行性に問題があると考えら
れている［V.G.Budkerら:Antisense Res.Develop.,2,17
7(1992)］。特に細胞内への移入およびその後の細胞内
での局在化のステップがアンチセンス効果発揮のための
律速段階と言われており、この改善がアンチセンス技術
の実用化の大きな鍵となっている［S.Akhtar & R.L.Jul
iano:Pharm.J.,47,89(1991)、V.G.Budkerら:Antisense
Res.Develop.,2,177(1992)］。オリゴヌクレオチドの不
安定性については、実際に前述したＳ-オリゴは通常の
ホスホジエステル結合オリゴヌクレオチド（以下、Ｄ-
オリゴと略記することがある）に比べてヌクレアーゼ耐
性においてきわめて優れているが、それでもなおＳ-オ
リゴの不安定性を示したデータが報告されている［G.Go
odarzi:Biopharm.Drug Disposition,13,221(1992)］。
各種動物実験や臨床試験においてもこの欠点を補うため
持続注入法が採用され［L.Whitesellら:Antisense Res.
Develop.,1,343(1991)、M.Z.Ratajczakら:Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,89,11823(1992)、P.Iversenら:第2回アンチ
センスシンポジウム講演要旨集,p.46(1992)］、その安
定性は臨床応用には不十分と考えられている。
試みが成されている。１）オリゴヌクレオチドのDNA骨
格をホスホロチオエート（以下、Ｓ-オリゴと略記する
ことがある）やメチルホスホネート（以下、ＭＰ-オリ
ゴと略記することがある）の形に変え、ヌクレアーゼ抵
抗性を賦与している［東海林洋子ら:PHARM TECH JAPAN,
8,719(1992)］。実際に前者のＳ-オリゴは各種の動物試
験やさらには臨床試験にも応用され、相当に長い血中半
減期（〜20時間）を示し、また肝臓および腎臓を除くか
なりの組織・臓器で安定であることが示されている［S.
Agrawalら:第2回アンチセンスシンポジウム講演要旨集,
p.32(1992)、P.Iversenら:第2回アンチセンスシンポジ
ウム講演要旨集,p.46(1992)、S.Agrawalら:Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,88,7595(1991)］。２）組織内への到達性
は良好で、マウスを用いた動物実験ではかなりの量が肝
臓および腎臓に分布していることが示された［S.Agrawa
lら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,7595 (1991)］。３）
オリゴヌクレオチド、特にＳ-オリゴの合成は一部米国
ベンチャー企業の努力により、純度の高いclinical gra
deの標品が大量に合成可能となり、実際に各種機関で臨
床試験に供されている。従ってそのコストも大幅に減少
しつつあると判断される。しかしながら、アンチセンス
に関するin vivo実験での成功例はきわめて限られてお
り、この原因の多くがオリゴヌクレオチドの不安定性や
細胞膜透過性および細胞内移行性に問題があると考えら
れている［V.G.Budkerら:Antisense Res.Develop.,2,17
7(1992)］。特に細胞内への移入およびその後の細胞内
での局在化のステップがアンチセンス効果発揮のための
律速段階と言われており、この改善がアンチセンス技術
の実用化の大きな鍵となっている［S.Akhtar & R.L.Jul
iano:Pharm.J.,47,89(1991)、V.G.Budkerら:Antisense
Res.Develop.,2,177(1992)］。オリゴヌクレオチドの不
安定性については、実際に前述したＳ-オリゴは通常の
ホスホジエステル結合オリゴヌクレオチド（以下、Ｄ-
オリゴと略記することがある）に比べてヌクレアーゼ耐
性においてきわめて優れているが、それでもなおＳ-オ
リゴの不安定性を示したデータが報告されている［G.Go
odarzi:Biopharm.Drug Disposition,13,221(1992)］。
各種動物実験や臨床試験においてもこの欠点を補うため
持続注入法が採用され［L.Whitesellら:Antisense Res.
Develop.,1,343(1991)、M.Z.Ratajczakら:Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,89,11823(1992)、P.Iversenら:第2回アンチ
センスシンポジウム講演要旨集,p.46(1992)］、その安
定性は臨床応用には不十分と考えられている。
【０００４】またオリゴヌクレオチドの細胞膜透過性を
改善するためには、１）リポソームに包埋する［M.Mizu
noら:Cancer Res.,50,7826(1990)、S.Akhtar & R.L.Jul
iano:J.Controlled Release,22,47(1992)］、２）オリ
ゴヌクレオチド鎖末端にリン脂質［R.G.Shea:Nucleic A
cids Res.,18,3777(1990)］やコレステロール［B.Oberh
auser & E.Wagner:Nucleic Acids Res.,20,533(1992)］
を導入する、３）標的指向性を有するキャリアに結合さ
せる、例えばアシアロ糖蛋白-ポリ-L-リジン複合体［G.
Y.Wu,C.H.Wu:Biochem.,27,887(1988)、G.Y.Wu,C.H.Wu:
J.Biol.Chem.,267,12436(1992)］やトランスフェリン-
ポリ-L-リジン複合体［M.Zenkeら:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,87,3655(1990)、G.Citro:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
89,7031(1992)］と非共有的に結合させ、それぞれガラ
クトースレセプターを発現する肝細胞やトランスフェリ
ンレセプターを発現する癌細胞に特異的にオリゴヌクレ
オチドを取り込ませる、また、４）カチオン性の脂質、
例えばリポフェクチンをオリゴヌクレオチドと相互作用
させ標的細胞に加えると、細胞内取り込みさらには核内
への移行が増大し、アンチセンス効果を増強させる［M.
Chiangら:J.Biol.Chem.,266,18162(1991)、L.C.Yeoman
ら:Antisense Res. Develop.,2,51(1992)］、などの試
みが成されている。しかし、誘導体化によりオリゴヌク
レオチドの水溶解度が減少したり、またそのようなオリ
ゴヌクレオチド誘導体を用いてもなお細胞内移入できる
量が投与量のほんの一部（〜２％）であったり、さらに
使用されるキャリア（ポリ-L-リジン、アシアロ糖蛋
白、リポフェクチン）は濃度によってはその毒性・抗原
性が臨床応用上大きな問題となることが予測され、アン
チセンスの有する医薬としてきわめて特長の高い有意な
機能を、実際の臨床の場で十分に生かせていないのが現
状である。
改善するためには、１）リポソームに包埋する［M.Mizu
noら:Cancer Res.,50,7826(1990)、S.Akhtar & R.L.Jul
iano:J.Controlled Release,22,47(1992)］、２）オリ
ゴヌクレオチド鎖末端にリン脂質［R.G.Shea:Nucleic A
cids Res.,18,3777(1990)］やコレステロール［B.Oberh
auser & E.Wagner:Nucleic Acids Res.,20,533(1992)］
を導入する、３）標的指向性を有するキャリアに結合さ
せる、例えばアシアロ糖蛋白-ポリ-L-リジン複合体［G.
Y.Wu,C.H.Wu:Biochem.,27,887(1988)、G.Y.Wu,C.H.Wu:
J.Biol.Chem.,267,12436(1992)］やトランスフェリン-
ポリ-L-リジン複合体［M.Zenkeら:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,87,3655(1990)、G.Citro:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
89,7031(1992)］と非共有的に結合させ、それぞれガラ
クトースレセプターを発現する肝細胞やトランスフェリ
ンレセプターを発現する癌細胞に特異的にオリゴヌクレ
オチドを取り込ませる、また、４）カチオン性の脂質、
例えばリポフェクチンをオリゴヌクレオチドと相互作用
させ標的細胞に加えると、細胞内取り込みさらには核内
への移行が増大し、アンチセンス効果を増強させる［M.
Chiangら:J.Biol.Chem.,266,18162(1991)、L.C.Yeoman
ら:Antisense Res. Develop.,2,51(1992)］、などの試
みが成されている。しかし、誘導体化によりオリゴヌク
レオチドの水溶解度が減少したり、またそのようなオリ
ゴヌクレオチド誘導体を用いてもなお細胞内移入できる
量が投与量のほんの一部（〜２％）であったり、さらに
使用されるキャリア（ポリ-L-リジン、アシアロ糖蛋
白、リポフェクチン）は濃度によってはその毒性・抗原
性が臨床応用上大きな問題となることが予測され、アン
チセンスの有する医薬としてきわめて特長の高い有意な
機能を、実際の臨床の場で十分に生かせていないのが現
状である。
【０００５】一方、最近核蛋白の核内運搬機構の解明が
進み、その運搬に関与する核局在シグナルが次々と発表
されてきた［J.G.-Bustosら:Biochim.Biophys.Acta,107
1,83(1991)］。これらのシグナルを結合させることによ
りウシ血清アルブミン（以下、BSAと略記することがあ
る）や免疫グロブリンＧ（以下、IgGと略記することが
ある）のような蛋白のみならず、免疫グロブリンＭのよ
うな分子量の大きな蛋白でさえ核移行させうることが分
かってきた［Y.Yonedaら:Exp.Cell Res.,201,313(199
2)］。かかるシグナルとしては、例えばアフリカツメガ
エル卵母細胞の核蛋白であるヌクレオプラスミンやSV40
のlarge-T抗原が使われるが、それらのフラグメントペ
プチドである Arg-Pro-(Ala)2-Thr-(Lys)2-Ala-Gly-Gln
-Ala-(Lys)4-Leu-Asp や Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val の配
列がこの核移行に重要な役割を果たしていると推測され
た。すなわち、これらのシグナルが核膜孔に存在するヌ
クレオポリンのような糖蛋白に結合し、その孔を拡大し
て蛋白の核内移入を容易にすると考えられている［P.A.
Silver:Cell,64,489(1991)］。しかしながら、これらの
核局在シグナルをアンチセンスオリゴヌクレオチドに結
合させ、その細胞内移入さらには核内移入を容易にして
アンチセンス効果を増強させたという報告はない。
進み、その運搬に関与する核局在シグナルが次々と発表
されてきた［J.G.-Bustosら:Biochim.Biophys.Acta,107
1,83(1991)］。これらのシグナルを結合させることによ
りウシ血清アルブミン（以下、BSAと略記することがあ
る）や免疫グロブリンＧ（以下、IgGと略記することが
ある）のような蛋白のみならず、免疫グロブリンＭのよ
うな分子量の大きな蛋白でさえ核移行させうることが分
かってきた［Y.Yonedaら:Exp.Cell Res.,201,313(199
2)］。かかるシグナルとしては、例えばアフリカツメガ
エル卵母細胞の核蛋白であるヌクレオプラスミンやSV40
のlarge-T抗原が使われるが、それらのフラグメントペ
プチドである Arg-Pro-(Ala)2-Thr-(Lys)2-Ala-Gly-Gln
-Ala-(Lys)4-Leu-Asp や Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val の配
列がこの核移行に重要な役割を果たしていると推測され
た。すなわち、これらのシグナルが核膜孔に存在するヌ
クレオポリンのような糖蛋白に結合し、その孔を拡大し
て蛋白の核内移入を容易にすると考えられている［P.A.
Silver:Cell,64,489(1991)］。しかしながら、これらの
核局在シグナルをアンチセンスオリゴヌクレオチドに結
合させ、その細胞内移入さらには核内移入を容易にして
アンチセンス効果を増強させたという報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アンチセン
スDNAあるいはRNAを効率よく細胞内の作用部位、特に核
内へ移行させ、標的となる遺伝子と反応して、その目的
である遺伝子の転写・スプライシング・核膜透過または
翻訳の阻害を達成するために、より有利に使用できる核
局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
スDNAあるいはRNAを効率よく細胞内の作用部位、特に核
内へ移行させ、標的となる遺伝子と反応して、その目的
である遺伝子の転写・スプライシング・核膜透過または
翻訳の阻害を達成するために、より有利に使用できる核
局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
【課題を提供するための手段】本発明者らは、現状のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはその誘導体が必
ずしも十分な細胞膜透過性あるいは細胞内移行性を有し
ていない現状を鑑み、それを効率よく細胞内の作用部
位、すなわち標的蛋白をコードするDNAあるいはmRNAと
反応させる手段について鋭意研究を重ね、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを核局在シグナルで修飾することに
より、細胞内移入および核内移行を改善してアンチセン
ス効果を増強させうることを見いだし、さらに研究し本
発明を完成するに至った。
ンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはその誘導体が必
ずしも十分な細胞膜透過性あるいは細胞内移行性を有し
ていない現状を鑑み、それを効率よく細胞内の作用部
位、すなわち標的蛋白をコードするDNAあるいはmRNAと
反応させる手段について鋭意研究を重ね、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを核局在シグナルで修飾することに
より、細胞内移入および核内移行を改善してアンチセン
ス効果を増強させうることを見いだし、さらに研究し本
発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、（１）核局在シグナル
ペプチドとオリゴヌクレオチドとを結合させてなる修飾
オリゴヌクレオチド、（２）核局在シグナルペプチドと
オリゴヌクレオチドとをリンカーを介して結合させてな
る上記（１）記載の修飾オリゴヌクレオチド、および
（３）核局在シグナルペプチドの官能基と、オリゴヌク
レオチドの３'−もしくは５'−末端の水酸基あるいは式
（I）
ペプチドとオリゴヌクレオチドとを結合させてなる修飾
オリゴヌクレオチド、（２）核局在シグナルペプチドと
オリゴヌクレオチドとをリンカーを介して結合させてな
る上記（１）記載の修飾オリゴヌクレオチド、および
（３）核局在シグナルペプチドの官能基と、オリゴヌク
レオチドの３'−もしくは５'−末端の水酸基あるいは式
（I）
【化４】 （式中、ＸはＯまたはＳを、ＲはＯＨまたはＣＨ3を示
す）で表される基とをリンカーを介して結合させてなる
上記（２）記載の修飾オリゴヌクレオチドに関するもの
である。
す）で表される基とをリンカーを介して結合させてなる
上記（２）記載の修飾オリゴヌクレオチドに関するもの
である。
【０００９】本発明における核局在シグナルペプチドと
しては、核への局在化に関与するペプチド配列を含むも
のであればいずれのものでもよい。すでに４０種以上の
配列が同定されており［J.G.-Bustosら:Biochim.Biophy
s.Acta,1071,83(1991)］、例えば次のようなものが挙げ
られる。 １）酵母の核蛋白MATα2やヒストン2Bのそれぞれ Lys-I
le-Pro-Ile-Lys［M.N.Hallら:Cell,36,1057(1984)］や
Gly-(Lys)2-Arg-Ser-Lys-Ala［R.B.Morelandら:Mol.Cel
l.Biol.,7,4048(1987)］、 ２）SV40やポリオーマウイルスlarge T-抗原のそれぞれ
Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val［D.Kalderonら:Nature,311,3
3(1984)］や Val-Ser-Arg-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Ala
［W.D.Richardsonら:Cell,44,77(1986)］、 ３）アデノウイルスE1a、pTPおよびDBPのそれぞれ Lys-
Arg-Pro-Arg-Pro［R.H.Lyonsら:Mol.Cell.Biol.,7,2451
(1987)］、Arg-Leu-Pro-Val-(Arg)6-Val-Pro［L-J.Zhao
& R.Padmanabhan:Cell,55,1005(1988)］および (Pro)2
-(Lys)2-Arg［N.Morinら:Mol.Cell.Biol.,9,4372(198
9)］、 ４）アフリカツメガエル・ヌクレオプラスミンの Arg-P
ro-(Ala)2-Thr-(Lys)2-Ala-Gly-Gln-Ala-(Lys)4-Leu-As
p［C.Dingwallら:Cell,30,449(1982)］、 ５）ヒト癌遺伝子c-myb、N-mycおよびp53のそれぞれ Pr
o-(Leu)2-(Lys)2-Ile-Lys-Gln、(Pro)2-Gln-(Lys)2-Ile
-Lys-Ser および Pro-Gln-Pro-(Lys)3-Pro［C.V.Dang &
W.M.F.Lee:J.Biol.Chem.,254,18019(1989)］、 ６）ヒト熱ショック蛋白（Hsp70）の Phe-Lys-Arg-Lys-
His-(Lys)2-Asp-Ile-Ser-Gln-Asn-Lys-Arg-Ala-Val-(Ar
g)2［C.V.Dang & W.M.F.Lee:J.Biol.Chem.,254,18019(1
989)］。
しては、核への局在化に関与するペプチド配列を含むも
のであればいずれのものでもよい。すでに４０種以上の
配列が同定されており［J.G.-Bustosら:Biochim.Biophy
s.Acta,1071,83(1991)］、例えば次のようなものが挙げ
られる。 １）酵母の核蛋白MATα2やヒストン2Bのそれぞれ Lys-I
le-Pro-Ile-Lys［M.N.Hallら:Cell,36,1057(1984)］や
Gly-(Lys)2-Arg-Ser-Lys-Ala［R.B.Morelandら:Mol.Cel
l.Biol.,7,4048(1987)］、 ２）SV40やポリオーマウイルスlarge T-抗原のそれぞれ
Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val［D.Kalderonら:Nature,311,3
3(1984)］や Val-Ser-Arg-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Ala
［W.D.Richardsonら:Cell,44,77(1986)］、 ３）アデノウイルスE1a、pTPおよびDBPのそれぞれ Lys-
Arg-Pro-Arg-Pro［R.H.Lyonsら:Mol.Cell.Biol.,7,2451
(1987)］、Arg-Leu-Pro-Val-(Arg)6-Val-Pro［L-J.Zhao
& R.Padmanabhan:Cell,55,1005(1988)］および (Pro)2
-(Lys)2-Arg［N.Morinら:Mol.Cell.Biol.,9,4372(198
9)］、 ４）アフリカツメガエル・ヌクレオプラスミンの Arg-P
ro-(Ala)2-Thr-(Lys)2-Ala-Gly-Gln-Ala-(Lys)4-Leu-As
p［C.Dingwallら:Cell,30,449(1982)］、 ５）ヒト癌遺伝子c-myb、N-mycおよびp53のそれぞれ Pr
o-(Leu)2-(Lys)2-Ile-Lys-Gln、(Pro)2-Gln-(Lys)2-Ile
-Lys-Ser および Pro-Gln-Pro-(Lys)3-Pro［C.V.Dang &
W.M.F.Lee:J.Biol.Chem.,254,18019(1989)］、 ６）ヒト熱ショック蛋白（Hsp70）の Phe-Lys-Arg-Lys-
His-(Lys)2-Asp-Ile-Ser-Gln-Asn-Lys-Arg-Ala-Val-(Ar
g)2［C.V.Dang & W.M.F.Lee:J.Biol.Chem.,254,18019(1
989)］。
【００１０】該核局在シグナルペプチドとしては、DNA
型発癌ウイルスの一種であるSV40由来の核蛋白large T-
抗原は、細胞質内リボソーム上で合成後きわめて効率良
く核内に運搬されることから、そのlarge T-抗原に含ま
れるペプチド配列 Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val を含むもの
は、強力なシグナルとして好ましく用いられる。さらに
また、最近人工核局在シグナルペプチドの設計も進み、
これらが天然由来の配列と同様に機能することが分かり
つつあり、これらも本発明の核局在シグナルペプチドと
して使用しうる。すなわち、上記のように天然から同定
された核局在シグナルペプチドは、ほぼ塩基性アミノ酸
クラスターとプロリンクラスターとからなるという特徴
を有しており、この情報を基に人工核局在シグナルペプ
チドが合成されている。例えば、(Pro)4-Lys-Ile-(Lys)
4 が挙げられるが、これは天然の配列と同様に機能する
ことが分かっている［田中真人:日本薬学会第113年会予
稿集I-p.130(1993)］。
型発癌ウイルスの一種であるSV40由来の核蛋白large T-
抗原は、細胞質内リボソーム上で合成後きわめて効率良
く核内に運搬されることから、そのlarge T-抗原に含ま
れるペプチド配列 Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val を含むもの
は、強力なシグナルとして好ましく用いられる。さらに
また、最近人工核局在シグナルペプチドの設計も進み、
これらが天然由来の配列と同様に機能することが分かり
つつあり、これらも本発明の核局在シグナルペプチドと
して使用しうる。すなわち、上記のように天然から同定
された核局在シグナルペプチドは、ほぼ塩基性アミノ酸
クラスターとプロリンクラスターとからなるという特徴
を有しており、この情報を基に人工核局在シグナルペプ
チドが合成されている。例えば、(Pro)4-Lys-Ile-(Lys)
4 が挙げられるが、これは天然の配列と同様に機能する
ことが分かっている［田中真人:日本薬学会第113年会予
稿集I-p.130(1993)］。
【００１１】本発明における核局在シグナルペプチドと
しては、その機能を失わない限り、核局在シグナルペプ
チド配列以外のペプチド配列をその前後に含んでいても
よい。例えば、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造
法において、核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレオ
チドとを結合させるにあたって、あらかじめ核局在シグ
ナルペプチドのＣ末端あるいはＮ末端にシステイン残基
を導入しておき、そのスルフヒドリル基を官能基として
利用することができる。本発明におけるオリゴヌクレオ
チドとしては、アンチセンスとして用いうるDNAまたはR
NA、およびその誘導体であればその配列には何ら制限は
なく、特定の遺伝子配列を阻害する目的で細胞内に輸送
すべき核酸あるいはその誘導体を包含し、さらにはリボ
ザイム［大川淳ら:Pharm.Tech.Japan,8,491(1992)、N.S
arver:Science,247,1222(1990)］をも包含する。
しては、その機能を失わない限り、核局在シグナルペプ
チド配列以外のペプチド配列をその前後に含んでいても
よい。例えば、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造
法において、核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレオ
チドとを結合させるにあたって、あらかじめ核局在シグ
ナルペプチドのＣ末端あるいはＮ末端にシステイン残基
を導入しておき、そのスルフヒドリル基を官能基として
利用することができる。本発明におけるオリゴヌクレオ
チドとしては、アンチセンスとして用いうるDNAまたはR
NA、およびその誘導体であればその配列には何ら制限は
なく、特定の遺伝子配列を阻害する目的で細胞内に輸送
すべき核酸あるいはその誘導体を包含し、さらにはリボ
ザイム［大川淳ら:Pharm.Tech.Japan,8,491(1992)、N.S
arver:Science,247,1222(1990)］をも包含する。
【００１２】本発明におけるオリゴヌクレオチドとして
は、式（II）
は、式（II）
【化５】 （式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって水酸基ある
いは式（I）
いは式（I）
【化６】 （式中、ＸはＯまたはＳを、ＲはＯＨまたはＣＨ3を示
す）を、ＸおよびＲは前記と同意義を、Ｂはピリミジン
またはプリン核酸塩基を、ｎは７以上の整数を示す。α
およびβはいずれか一方が水素であり他方は水素，水酸
基またはフッ素である）であるものが挙げられる。該オ
リゴヌクレオチドとしては、Ｓ-オリゴ（Ｘ＝Ｓでかつ
Ｒ＝ＯＨ）やＭＰ-オリゴ（Ｘ＝ＯでかつＲ＝ＣＨ3）が
好ましく、特にＳ-オリゴは水溶性およびヌクレアーゼ
抵抗性に優れ、また標的遺伝子とのハイブリッド形成能
も高いことからより好ましい。Ｒ1およびＲ2としては、
すくなくとも一方が水酸基であるものが好ましい。Ｂで
表されるピリミジン核酸塩基としては、例えば、シトシ
ン，ウラシル，チミン，５−メチルシトシン，オキシメ
チルシトシンなどが挙げられる。さらにこれらの誘導体
であってもよい。Ｂで表されるプリン核酸塩基として
は、例えば、アデニン，グアニンなどが挙げられる。さ
らにこれらの誘導体であってもよい。
す）を、ＸおよびＲは前記と同意義を、Ｂはピリミジン
またはプリン核酸塩基を、ｎは７以上の整数を示す。α
およびβはいずれか一方が水素であり他方は水素，水酸
基またはフッ素である）であるものが挙げられる。該オ
リゴヌクレオチドとしては、Ｓ-オリゴ（Ｘ＝Ｓでかつ
Ｒ＝ＯＨ）やＭＰ-オリゴ（Ｘ＝ＯでかつＲ＝ＣＨ3）が
好ましく、特にＳ-オリゴは水溶性およびヌクレアーゼ
抵抗性に優れ、また標的遺伝子とのハイブリッド形成能
も高いことからより好ましい。Ｒ1およびＲ2としては、
すくなくとも一方が水酸基であるものが好ましい。Ｂで
表されるピリミジン核酸塩基としては、例えば、シトシ
ン，ウラシル，チミン，５−メチルシトシン，オキシメ
チルシトシンなどが挙げられる。さらにこれらの誘導体
であってもよい。Ｂで表されるプリン核酸塩基として
は、例えば、アデニン，グアニンなどが挙げられる。さ
らにこれらの誘導体であってもよい。
【００１３】オリゴヌクレオチドに含まれるリボース部
分の２'位については、デオキシ体の（α,β）＝（Ｈ,
Ｈ）であるもの、およびα、βのいずれか一方がフッ素
あるいは水酸基で置換された（α,β）＝（Ｈ,Ｆ）,
（Ｆ,Ｈ）,（Ｈ,ＯＨ）,（ＯＨ,Ｈ）であるものが挙げ
られるが、なかでも（α,β）＝（Ｈ,ＯＨ）であるもの
が好ましい。本発明の修飾オリゴヌクレオチドに含まれ
るヌクレオチドの数としては７以上であるが、好ましく
は１０〜２５であり、さらに好ましくは１５〜２０であ
る。本発明において、標的となる遺伝子は、各種疾患に
おいてその病因となっている特定の蛋白をコードする、
あるいはその合成に関与する遺伝子配列が挙げられる
が、そのような例として、ウイルス抗原（ヘルペス、イ
ンフルエンザ、エイズ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、パピロー
マなど）、真菌類（菌壁蛋白、リボソーム蛋白など）、
癌遺伝子（c-myc, N-myc, N-rasなど）、増殖因子（bFG
F, IL-1, IL-2,TGF-βなど）、接着蛋白（ICAM-1, LFA-
1, VCAM-1, セレクチンなど）および酵素（ホスホリパ
ーゼA2、蛋白リン酸化酵素、糖転移酵素など）などが挙
げられる。従って、対象疾患としてウイルス性疾患、各
種細菌（真菌）感染症、癌、炎症、アレルギー、循環系
疾患などが挙げられるが、特に従来の医薬品では十分な
治療効果を得ていないウイルス性疾患や癌・免疫性疾患
への適用が考えられる。一例として、免疫応答・癌の転
移・リンパ球の浸潤などに深く関与する接着蛋白ＩＣＡ
Ｍ-１は標的蛋白として好適で、従ってこのＩＣＡＭ-１
に対するアンチセンスは癌あるいはリウマチなどの治療
薬として有望である。
分の２'位については、デオキシ体の（α,β）＝（Ｈ,
Ｈ）であるもの、およびα、βのいずれか一方がフッ素
あるいは水酸基で置換された（α,β）＝（Ｈ,Ｆ）,
（Ｆ,Ｈ）,（Ｈ,ＯＨ）,（ＯＨ,Ｈ）であるものが挙げ
られるが、なかでも（α,β）＝（Ｈ,ＯＨ）であるもの
が好ましい。本発明の修飾オリゴヌクレオチドに含まれ
るヌクレオチドの数としては７以上であるが、好ましく
は１０〜２５であり、さらに好ましくは１５〜２０であ
る。本発明において、標的となる遺伝子は、各種疾患に
おいてその病因となっている特定の蛋白をコードする、
あるいはその合成に関与する遺伝子配列が挙げられる
が、そのような例として、ウイルス抗原（ヘルペス、イ
ンフルエンザ、エイズ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、パピロー
マなど）、真菌類（菌壁蛋白、リボソーム蛋白など）、
癌遺伝子（c-myc, N-myc, N-rasなど）、増殖因子（bFG
F, IL-1, IL-2,TGF-βなど）、接着蛋白（ICAM-1, LFA-
1, VCAM-1, セレクチンなど）および酵素（ホスホリパ
ーゼA2、蛋白リン酸化酵素、糖転移酵素など）などが挙
げられる。従って、対象疾患としてウイルス性疾患、各
種細菌（真菌）感染症、癌、炎症、アレルギー、循環系
疾患などが挙げられるが、特に従来の医薬品では十分な
治療効果を得ていないウイルス性疾患や癌・免疫性疾患
への適用が考えられる。一例として、免疫応答・癌の転
移・リンパ球の浸潤などに深く関与する接着蛋白ＩＣＡ
Ｍ-１は標的蛋白として好適で、従ってこのＩＣＡＭ-１
に対するアンチセンスは癌あるいはリウマチなどの治療
薬として有望である。
【００１４】本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、これ
らの疾病患者に投与されるとオリゴヌクレオチドに結合
した核局在シグナルペプチドが機能し、効率良く標的細
胞に取り込まれ、また細胞内移入後も核内への移行が容
易となって、アンチセンス効果の増強が図れるものであ
る。本発明の修飾オリゴヌクレオチドにおいて、核局在
シグナルペプチドとオリゴヌクレオチドとを結合させる
方法としては、両者をその機能を失わせることなく安定
的に結合させうるものであれば、いかなる方法を用いて
もよい。一例として、核局在シグナルペプチドの官能基
（例えば、アミノ基，カルボキシル基，スルフヒドリル
基）とオリゴヌクレオチドの３'−もしくは５'−末端の
水酸基または式（I）で表される基とをリンカーを介し
て結合させる方法について次に説明する。
らの疾病患者に投与されるとオリゴヌクレオチドに結合
した核局在シグナルペプチドが機能し、効率良く標的細
胞に取り込まれ、また細胞内移入後も核内への移行が容
易となって、アンチセンス効果の増強が図れるものであ
る。本発明の修飾オリゴヌクレオチドにおいて、核局在
シグナルペプチドとオリゴヌクレオチドとを結合させる
方法としては、両者をその機能を失わせることなく安定
的に結合させうるものであれば、いかなる方法を用いて
もよい。一例として、核局在シグナルペプチドの官能基
（例えば、アミノ基，カルボキシル基，スルフヒドリル
基）とオリゴヌクレオチドの３'−もしくは５'−末端の
水酸基または式（I）で表される基とをリンカーを介し
て結合させる方法について次に説明する。
【００１５】（１）まず、オリゴヌクレオチドの３'−
もしくは５'−末端の水酸基または式（I）で表される基
に、あらかじめアミノ基またはスルフヒドリル基を導入
する。例えば、下記式の反応のように
もしくは５'−末端の水酸基または式（I）で表される基
に、あらかじめアミノ基またはスルフヒドリル基を導入
する。例えば、下記式の反応のように
【化７】 〔式中、ＯＮはオリゴヌクレオチドを示す〕、市販の A
MINOLINK-2（アプライドバイオシステムズ社製）あるい
は５'−Amino-Modifiers（グレンリサーチ社製）を用い
てオリゴヌクレオチドの５'末端にアミノ基を導入すれ
ばよい［B.A.Connolly & P.Rider:Nucleic Acids Res.,
13,4485(1985)、B.S.Sproatら:Nucleic Acids Res.,15,
4837(1987)］。また、同様に市販の５'−Thiol-Modifie
rs（グレンリサーチ社製）を用いてオリゴヌクレオチド
の５'末端にスルフヒドリル基を導入することもできる
［B.A.Connolly & P.Rider:Nucleic Acids Res.,13,448
5(1985)、B.S.Sproatら:Nucleic Acids Res.,15,4837(1
987)］。一方、オリゴヌクレオチドの３'末端において
も、アミノ基あるいはスルフヒドリル基を導入すること
もできる。例えば、市販の３'-amine-ON CPG担体（クロ
ンテック社製）を用いて３'末端に (３'−アミノ−２−
ヒドロキシ−プロピル)フォスフェート基〔（3-amino-2
-hydroxyl-propyl)phosphate〕を導入する［B.Oberhaus
er & E.Wagner:Nucleic Acids Res.,20,533(1992)］。
次いで、該３'−アミノオリゴヌクレオチド誘導体に N-
succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate（SPDP；
ファルマシア社製）を反応させた後、 ジチオスレイトー
ルで還元することにより３'末端にスルフヒドリル基を
導入できる。
MINOLINK-2（アプライドバイオシステムズ社製）あるい
は５'−Amino-Modifiers（グレンリサーチ社製）を用い
てオリゴヌクレオチドの５'末端にアミノ基を導入すれ
ばよい［B.A.Connolly & P.Rider:Nucleic Acids Res.,
13,4485(1985)、B.S.Sproatら:Nucleic Acids Res.,15,
4837(1987)］。また、同様に市販の５'−Thiol-Modifie
rs（グレンリサーチ社製）を用いてオリゴヌクレオチド
の５'末端にスルフヒドリル基を導入することもできる
［B.A.Connolly & P.Rider:Nucleic Acids Res.,13,448
5(1985)、B.S.Sproatら:Nucleic Acids Res.,15,4837(1
987)］。一方、オリゴヌクレオチドの３'末端において
も、アミノ基あるいはスルフヒドリル基を導入すること
もできる。例えば、市販の３'-amine-ON CPG担体（クロ
ンテック社製）を用いて３'末端に (３'−アミノ−２−
ヒドロキシ−プロピル)フォスフェート基〔（3-amino-2
-hydroxyl-propyl)phosphate〕を導入する［B.Oberhaus
er & E.Wagner:Nucleic Acids Res.,20,533(1992)］。
次いで、該３'−アミノオリゴヌクレオチド誘導体に N-
succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate（SPDP；
ファルマシア社製）を反応させた後、 ジチオスレイトー
ルで還元することにより３'末端にスルフヒドリル基を
導入できる。
【００１６】（２）次いで、オリゴヌクレオチドに導入
されたアミノ基またはスルフヒドリル基を用いて、核局
在シグナルペプチドとを結合させることによって、本発
明の修飾オリゴヌクレオチドを製造することができる。
オリゴヌクレオチド末端に導入されたアミノ基あるいは
スルフヒドリル基と核局在シグナルペプチドとの結合に
あたっては、 種々の方法が使用できる［A.H.Blair & T.
I.Ghose:J.Immunol.Methods,59,129(1983)、北川常廣:
有機合成化学,42,283(1984)］。例えば、核局在シグナ
ルペプチドがシステイン残基を含む場合、(ｉ) オリゴ
ヌクレオチド末端のアミノ基をSPDPと反応させ、オリゴ
ヌクレオチドにジチオピリジル基を導入し、さらに核移
行シグナルのシステイン残基とのS-S交換反応により目
的の核局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドを合成す
る、(ii) オリゴヌクレオチド末端のアミノ基をマレイ
ミド基含有活性エステル（二官能性結合試薬）、例えば
N-(γ-maleimidobutyryloxy)succinimide（同仁化学
製）やあるいはN-(ε-maleimidocaproyloxy)succinimid
e（EMCS；同仁化学製）と反応させマレイミド基を導入
後、核局在シグナルを添加しチオエーテル結合により目
的の核局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドを合成す
る、などの方法が挙げられる。
されたアミノ基またはスルフヒドリル基を用いて、核局
在シグナルペプチドとを結合させることによって、本発
明の修飾オリゴヌクレオチドを製造することができる。
オリゴヌクレオチド末端に導入されたアミノ基あるいは
スルフヒドリル基と核局在シグナルペプチドとの結合に
あたっては、 種々の方法が使用できる［A.H.Blair & T.
I.Ghose:J.Immunol.Methods,59,129(1983)、北川常廣:
有機合成化学,42,283(1984)］。例えば、核局在シグナ
ルペプチドがシステイン残基を含む場合、(ｉ) オリゴ
ヌクレオチド末端のアミノ基をSPDPと反応させ、オリゴ
ヌクレオチドにジチオピリジル基を導入し、さらに核移
行シグナルのシステイン残基とのS-S交換反応により目
的の核局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドを合成す
る、(ii) オリゴヌクレオチド末端のアミノ基をマレイ
ミド基含有活性エステル（二官能性結合試薬）、例えば
N-(γ-maleimidobutyryloxy)succinimide（同仁化学
製）やあるいはN-(ε-maleimidocaproyloxy)succinimid
e（EMCS；同仁化学製）と反応させマレイミド基を導入
後、核局在シグナルを添加しチオエーテル結合により目
的の核局在シグナル修飾オリゴヌクレオチドを合成す
る、などの方法が挙げられる。
【００１７】またオリゴヌクレオチドがシステイン残基
を含む場合、上記(ｉ)および(ii)の反応を逆にして、核
局在シグナルに含まれるアミノ基、例えば、リジンのε
-アミノ基あるいはＮ末端のα-アミノ基を二官能性結合
試薬で修飾しマレイミド化後、オリゴヌクレオチドを反
応させチオエーテル結合により目的の核局在シグナル修
飾オリゴヌクレオチドを合成することもできる。さらに
は、 あるいは両者がスルフヒドリル基を含む場合は、S-
S結合反応により直接に目的の核局在シグナル修飾オリ
ゴヌクレオチドを合成できる。この他、オリゴヌクレオ
チドと核局在シグナルの両者のアミノ基およびスルフヒ
ドリル基を利用する方法、例えば、 同反応二価性試薬
（アミノ基を利用する例、disuccinimidyl tartarat
e：J.Biol.Chem. 261, 205 (1986), グルタルアルデヒ
ド：Immunochem. 6, 43 (1969)）、スルフヒドリル基
を利用する例、N,N'-1,4-phenylendimaleimide：Bioche
m. 16, 3334 (1977)，disuccinimidyl suberate：J.Bio
l.Chem. 256, 5306 (1981)）を用いて本発明の修飾オリ
ゴヌクレオチドを製造することもできる。あるいはオリ
ゴヌクレオチドのアミノ基と核局在シグナルのカルボキ
シル基とを利用する方法、 例えば、 カルボジイミド法
（Antimicorb.Agents Chemother. 7, 42 (1975)）やN-
ヒドロキシスクシイミド法（北川常広：有機合成協会誌
42, 283 (1984)）を用いて、本発明の修飾オリゴヌク
レオチドを製造することもできる。
を含む場合、上記(ｉ)および(ii)の反応を逆にして、核
局在シグナルに含まれるアミノ基、例えば、リジンのε
-アミノ基あるいはＮ末端のα-アミノ基を二官能性結合
試薬で修飾しマレイミド化後、オリゴヌクレオチドを反
応させチオエーテル結合により目的の核局在シグナル修
飾オリゴヌクレオチドを合成することもできる。さらに
は、 あるいは両者がスルフヒドリル基を含む場合は、S-
S結合反応により直接に目的の核局在シグナル修飾オリ
ゴヌクレオチドを合成できる。この他、オリゴヌクレオ
チドと核局在シグナルの両者のアミノ基およびスルフヒ
ドリル基を利用する方法、例えば、 同反応二価性試薬
（アミノ基を利用する例、disuccinimidyl tartarat
e：J.Biol.Chem. 261, 205 (1986), グルタルアルデヒ
ド：Immunochem. 6, 43 (1969)）、スルフヒドリル基
を利用する例、N,N'-1,4-phenylendimaleimide：Bioche
m. 16, 3334 (1977)，disuccinimidyl suberate：J.Bio
l.Chem. 256, 5306 (1981)）を用いて本発明の修飾オリ
ゴヌクレオチドを製造することもできる。あるいはオリ
ゴヌクレオチドのアミノ基と核局在シグナルのカルボキ
シル基とを利用する方法、 例えば、 カルボジイミド法
（Antimicorb.Agents Chemother. 7, 42 (1975)）やN-
ヒドロキシスクシイミド法（北川常広：有機合成協会誌
42, 283 (1984)）を用いて、本発明の修飾オリゴヌク
レオチドを製造することもできる。
【００１８】上記した方法の中でも、本発明の修飾オリ
ゴヌクレオチドを製造するにあたっては、核局在シグナ
ルペプチドのＣ末端あるいはＮ末端にシステイン残基を
あらかじめ導入した核局在シグナルペプチド誘導体を利
用することが好ましい。例えば、Ｃ末端にシステイン残
基を導入した核局在シグナルペプチド誘導体を、予め二
官能性結合試薬でマレイミド化したオリゴヌクレオチド
と反応させる方法が挙げられ、本発明の修飾オリゴヌク
レオチドを収率良く得る手段として好ましい（下記方法
(Ａ)参照）。
ゴヌクレオチドを製造するにあたっては、核局在シグナ
ルペプチドのＣ末端あるいはＮ末端にシステイン残基を
あらかじめ導入した核局在シグナルペプチド誘導体を利
用することが好ましい。例えば、Ｃ末端にシステイン残
基を導入した核局在シグナルペプチド誘導体を、予め二
官能性結合試薬でマレイミド化したオリゴヌクレオチド
と反応させる方法が挙げられ、本発明の修飾オリゴヌク
レオチドを収率良く得る手段として好ましい（下記方法
(Ａ)参照）。
【化８】 〔式中、ＮＳはシステイン残基をあらかじめ導入した核
局在シグナルペプチド誘導体を、ｎは１〜６の整数を、
Ｒは結合手または２価の６員環状炭化水素残基を、ＯＮ
は前記と同意義を示す〕。方法（Ａ）におけるＲで表さ
れる２価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のも
の、不飽和のもののいずれでもよい。飽和のものとして
は、例えば、１，２−、１，３−、１，４−シクロヘキ
シレンが挙げられ、不飽和のものとしては、例えば、
１，２−、１，３−、１，４−フェニレンなどが挙げら
れる。
局在シグナルペプチド誘導体を、ｎは１〜６の整数を、
Ｒは結合手または２価の６員環状炭化水素残基を、ＯＮ
は前記と同意義を示す〕。方法（Ａ）におけるＲで表さ
れる２価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のも
の、不飽和のもののいずれでもよい。飽和のものとして
は、例えば、１，２−、１，３−、１，４−シクロヘキ
シレンが挙げられ、不飽和のものとしては、例えば、
１，２−、１，３−、１，４−フェニレンなどが挙げら
れる。
【００１９】本発明の修飾オリゴヌクレオチドにおける
リンカーとは、核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレ
オチドとを結合させるための架橋部分を形成するもので
あって、例えば、核局在シグナルペプチドの官能基（例
えば、アミノ基，カルボキシル基，スルフヒドリル基）
とオリゴヌクレオチドの３'−もしくは５'−末端の水酸
基または式（I）で表される基とを結合させるための架
橋部分を形成するものである。上記方法(Ａ)では点線内
で囲まれたものをリンカーと称する。本発明の核局在シ
グナルで修飾されたオリゴヌクレオチドは、通常自体公
知の担体・希釈剤などを用い適宜の医薬品組成物として
経口的または非経口的に哺乳動物（例．サル・イヌ・ブ
タ・ウサギ・マウス・ラット・ヒトなど）に投与でき
る。経口投与のための組成物としては、固体または液体
の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠，フィルムコーティン
グ錠を含む），丸剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤（ソフ
トカプセル剤を含む），シロップ剤，乳剤，懸濁剤など
が挙げられる。かかる組成物は自体公知の方法によって
製造でき、製剤分野において通常用いられる担体もしく
は賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体
もしくは賦形剤としては、乳糖，でんぷん，蔗糖，ステ
アリン酸マグネシウムなどが挙げられる。非経口投与の
ための組成物としては、例えば、注射剤，坐剤などが挙
げられ、注射剤は皮下注射剤，皮内注射剤，筋肉注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤はそれ自体公知の
方法、すなわち本発明の修飾オリゴヌクレオチドを通常
注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に懸濁ま
たは乳化することによって調製される。注射用の水性液
としては生理食塩水，等張液などが挙げられ、必要によ
り適当な懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロー
ス，非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性
液としてはゴマ油，大豆油などが挙げられ、溶解補助剤
としては安息香酸ベンジル，ベンジルアルコールなどを
併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプ
ルに充填される。また、本発明の修飾オリゴヌクレオチ
ドをリポソームに包埋したり、あるいはカチオン性の脂
質と混合し投与することもでき、この場合、より一層の
細胞内移入が期待できる。
リンカーとは、核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレ
オチドとを結合させるための架橋部分を形成するもので
あって、例えば、核局在シグナルペプチドの官能基（例
えば、アミノ基，カルボキシル基，スルフヒドリル基）
とオリゴヌクレオチドの３'−もしくは５'−末端の水酸
基または式（I）で表される基とを結合させるための架
橋部分を形成するものである。上記方法(Ａ)では点線内
で囲まれたものをリンカーと称する。本発明の核局在シ
グナルで修飾されたオリゴヌクレオチドは、通常自体公
知の担体・希釈剤などを用い適宜の医薬品組成物として
経口的または非経口的に哺乳動物（例．サル・イヌ・ブ
タ・ウサギ・マウス・ラット・ヒトなど）に投与でき
る。経口投与のための組成物としては、固体または液体
の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠，フィルムコーティン
グ錠を含む），丸剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤（ソフ
トカプセル剤を含む），シロップ剤，乳剤，懸濁剤など
が挙げられる。かかる組成物は自体公知の方法によって
製造でき、製剤分野において通常用いられる担体もしく
は賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体
もしくは賦形剤としては、乳糖，でんぷん，蔗糖，ステ
アリン酸マグネシウムなどが挙げられる。非経口投与の
ための組成物としては、例えば、注射剤，坐剤などが挙
げられ、注射剤は皮下注射剤，皮内注射剤，筋肉注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤はそれ自体公知の
方法、すなわち本発明の修飾オリゴヌクレオチドを通常
注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に懸濁ま
たは乳化することによって調製される。注射用の水性液
としては生理食塩水，等張液などが挙げられ、必要によ
り適当な懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロー
ス，非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性
液としてはゴマ油，大豆油などが挙げられ、溶解補助剤
としては安息香酸ベンジル，ベンジルアルコールなどを
併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプ
ルに充填される。また、本発明の修飾オリゴヌクレオチ
ドをリポソームに包埋したり、あるいはカチオン性の脂
質と混合し投与することもでき、この場合、より一層の
細胞内移入が期待できる。
【００２０】本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、標的
組織に運搬されたのち効率良く細胞内に取り込まれ、さ
らに核内へ移行し、低用量でアンチセンス治療効果を挙
げることができる。このため、副作用が少なく、より安
全に使用できる。例えば、抗ウイルス・抗菌・抗腫瘍あ
るいは抗炎症のための医薬として用いられ、その場合成
人１日当り１０mg〜２gを静注、筋注または皮下注など
により投与される。また経皮剤としても使用できる。ま
た、本発明の修飾オリゴヌクレオチドはアンチセンスDN
AあるいはRNAを効率よく細胞内に移行させることができ
るので、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを細胞に注入
し、相補的な遺伝子の発現を抑止して、未知の遺伝子の
機能を推定することにも使用できる。
組織に運搬されたのち効率良く細胞内に取り込まれ、さ
らに核内へ移行し、低用量でアンチセンス治療効果を挙
げることができる。このため、副作用が少なく、より安
全に使用できる。例えば、抗ウイルス・抗菌・抗腫瘍あ
るいは抗炎症のための医薬として用いられ、その場合成
人１日当り１０mg〜２gを静注、筋注または皮下注など
により投与される。また経皮剤としても使用できる。ま
た、本発明の修飾オリゴヌクレオチドはアンチセンスDN
AあるいはRNAを効率よく細胞内に移行させることができ
るので、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを細胞に注入
し、相補的な遺伝子の発現を抑止して、未知の遺伝子の
機能を推定することにも使用できる。
【００２１】
【実施例】以下に参考例、実施例および実験例を挙げ
て、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。 参考例１．オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート体
（S-オリゴ）の合成 DNA合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル39
2）においてホスホロチオエート型用プログラムを用い
て、下記式(α)および(β)で表される２種のS-オリゴを
合成した。それぞれICAM-1の転写開始領域に対するアン
チセンス配列およびそれに対するリバース配列を有する
（式中、A, G, C, T はそれぞれアデノシン、グアニ
ン、シトシン、チミンを表す。）。 (α) 5'-TGGGAGCCATAGCGAGGC-3' （配列番号:１） (β) 5'-CGGAGCGATACCGAGGGT-3' （配列番号:２） すなわち、1μmoleスケールの固相カラムとDNA合成用試
薬（いずれもアプライドバイオシステムズ社製）とを用
いてホスホロアミダイト法により合成し、以下常法に従
いカラムより切り出し脱保護した［A.Chollet & E.H.Ka
washima:Nucleic Acids Res.,13,1529(1985)］。得られ
たS-オリゴを逆相高速液体クロマトグラフィーにより精
製した。収量 (α):1.67mg, (β):1.25mg。得られた精
製S-オリゴ体（約1μg）をホルムアミド存在下95℃で2
分間処理し変性後、50％尿素を含むポリアクリルアミド
ゲルに供した。電気泳動終了後、エチジウムブロマイド
染色した。結果を〔図１〕に示した。(α)および(β)、
いずれのS-オリゴ体も１本のバンドを示した。また同様
に、次のＡ,Ｂ２種の溶出溶媒を用いる逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（μBONDASPHERE 5μ C18-300A:ウオ
タース社製）に供した。流速：１．０ｍｌ／分。溶出条
件：０〜5分90％Ａ/10％Ｂ、5〜25分90％Ａ/10％Ｂから
40％Ａ/60％Ｂへの濃度勾配溶出。得られた結果を〔図
２〕に示した。 Ａ： 5％アセトニトリル含有0.1Ｍトリエチル酢酸アン
モニウム緩衝液(pH7.0) Ｂ：40％アセトニトリル含有0.1Mトリエチル酢酸アンモ
ニウム緩衝液（pH7.0） (α)および(β)、それぞれのS-オリゴ体は15.09分およ
び15.50分に主要ピークを示した。
て、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。 参考例１．オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート体
（S-オリゴ）の合成 DNA合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル39
2）においてホスホロチオエート型用プログラムを用い
て、下記式(α)および(β)で表される２種のS-オリゴを
合成した。それぞれICAM-1の転写開始領域に対するアン
チセンス配列およびそれに対するリバース配列を有する
（式中、A, G, C, T はそれぞれアデノシン、グアニ
ン、シトシン、チミンを表す。）。 (α) 5'-TGGGAGCCATAGCGAGGC-3' （配列番号:１） (β) 5'-CGGAGCGATACCGAGGGT-3' （配列番号:２） すなわち、1μmoleスケールの固相カラムとDNA合成用試
薬（いずれもアプライドバイオシステムズ社製）とを用
いてホスホロアミダイト法により合成し、以下常法に従
いカラムより切り出し脱保護した［A.Chollet & E.H.Ka
washima:Nucleic Acids Res.,13,1529(1985)］。得られ
たS-オリゴを逆相高速液体クロマトグラフィーにより精
製した。収量 (α):1.67mg, (β):1.25mg。得られた精
製S-オリゴ体（約1μg）をホルムアミド存在下95℃で2
分間処理し変性後、50％尿素を含むポリアクリルアミド
ゲルに供した。電気泳動終了後、エチジウムブロマイド
染色した。結果を〔図１〕に示した。(α)および(β)、
いずれのS-オリゴ体も１本のバンドを示した。また同様
に、次のＡ,Ｂ２種の溶出溶媒を用いる逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（μBONDASPHERE 5μ C18-300A:ウオ
タース社製）に供した。流速：１．０ｍｌ／分。溶出条
件：０〜5分90％Ａ/10％Ｂ、5〜25分90％Ａ/10％Ｂから
40％Ａ/60％Ｂへの濃度勾配溶出。得られた結果を〔図
２〕に示した。 Ａ： 5％アセトニトリル含有0.1Ｍトリエチル酢酸アン
モニウム緩衝液(pH7.0) Ｂ：40％アセトニトリル含有0.1Mトリエチル酢酸アンモ
ニウム緩衝液（pH7.0） (α)および(β)、それぞれのS-オリゴ体は15.09分およ
び15.50分に主要ピークを示した。
【００２２】実施例１．ICAM-1アンチセンスS-オリゴの
修飾 （１）S-オリゴのアミノ化 参考例１で得られた1μmoleスケールの固相カラムに結
合したS-オリゴ(α)誘導体に市販のAMINOLINK-2（アプ
ライドバイオシステムズ社製）を添加し、公知の方法に
従い5'末端にアミノ基を導入した［B.A.Connolly & P.R
ider:Nucleic Acids Res.,13,4485(1985)］。固相カラ
ムからは28％アンモニア水を用いて切り出し、さらに55
℃で8時間インキュベートして脱保護した。スピードバ
ックコンセントレーターを用いて乾固したのち、蒸留水
に再溶解しPD-10ゲル濾過カラムで低分子物質を除去し
た。収量2.1mg。 （２）アミノ化S-オリゴのマレイミド化 （１）で取得したアミノ化S-オリゴ1.2mgを50mMリン酸
緩衝液（pH7.5）1.2mlに溶解したのち、マレイミド化試
薬EMCS 6mg/60μlジメチルホルムアミド溶液を徐々に添
加した。室温で４時間反応後、PD-10ゲル濾過カラムで
精製した。収量840μg。 （３）核局在シグナルペプチドによる修飾 （２）で取得したマレイミド化S-オリゴ140μg/200μl
50mMリン酸緩衝液（pH6.5）に核局在シグナルペプチド
Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val-Cys 100μg/10μl蒸留水を添
加し室温で5時間反応させた。ゲル濾過カラムにより精
製後、スピードバックコンセントレーターを用いて濃縮
した。収量40μg。
修飾 （１）S-オリゴのアミノ化 参考例１で得られた1μmoleスケールの固相カラムに結
合したS-オリゴ(α)誘導体に市販のAMINOLINK-2（アプ
ライドバイオシステムズ社製）を添加し、公知の方法に
従い5'末端にアミノ基を導入した［B.A.Connolly & P.R
ider:Nucleic Acids Res.,13,4485(1985)］。固相カラ
ムからは28％アンモニア水を用いて切り出し、さらに55
℃で8時間インキュベートして脱保護した。スピードバ
ックコンセントレーターを用いて乾固したのち、蒸留水
に再溶解しPD-10ゲル濾過カラムで低分子物質を除去し
た。収量2.1mg。 （２）アミノ化S-オリゴのマレイミド化 （１）で取得したアミノ化S-オリゴ1.2mgを50mMリン酸
緩衝液（pH7.5）1.2mlに溶解したのち、マレイミド化試
薬EMCS 6mg/60μlジメチルホルムアミド溶液を徐々に添
加した。室温で４時間反応後、PD-10ゲル濾過カラムで
精製した。収量840μg。 （３）核局在シグナルペプチドによる修飾 （２）で取得したマレイミド化S-オリゴ140μg/200μl
50mMリン酸緩衝液（pH6.5）に核局在シグナルペプチド
Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val-Cys 100μg/10μl蒸留水を添
加し室温で5時間反応させた。ゲル濾過カラムにより精
製後、スピードバックコンセントレーターを用いて濃縮
した。収量40μg。
【００２３】実験例１．ICAM-1発現抑制活性(１) 参考例１で作製したアンチセンスS-オリゴ(α)、リバー
スS-オリゴ(β)あるいは実施例１で作製した核局在シグ
ナルペプチド修飾アンチセンスS-オリゴとリポフェクチ
ン（10μg/ml）とを含む無血清培地（ダルベッコMEM培
地(D-MEM)；コスモ社販売）を、ヒト肺癌細胞株A549に
添加した。４時間細胞培養後、IL-1β（40pg/ml）を含
む10％非働化（56℃,30分）ウシ胎児血清添加D-MEM培地
に置換し、さらに４時間培養した。次いでA549細胞を0.
1％グルタルアルデヒドで固定後、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）に IFO 50391として寄託されているマウス抗
ヒトICAM-1モノクローナル抗体SM-1（特願平５−３７２
６２号）を用いる酵素免疫測定法（EIA）により細胞表
面に発現されたICAM-1量を測定した。すなわちA549細胞
に結合したマウス抗体量を西洋わさびペルオキシダーゼ
標識抗マウスIgG抗体（コスモ社販売）を用いて測定
し、ICAM-1発現量を比較した。得られた結果を〔表１〕
に示した。リバースS-オリゴは全く発現抑制能を示さな
いが、アンチセンスS-オリゴは0.33μM濃度で有意な発
現抑制を示した。一方、核局在シグナルペプチド修飾ア
ンチセンスS-オリゴは0.11μM濃度で既に有意な発現抑
制を示し、さらに0.33μM濃度ではほぼ80％の強い発現
抑制活性を示した。
スS-オリゴ(β)あるいは実施例１で作製した核局在シグ
ナルペプチド修飾アンチセンスS-オリゴとリポフェクチ
ン（10μg/ml）とを含む無血清培地（ダルベッコMEM培
地(D-MEM)；コスモ社販売）を、ヒト肺癌細胞株A549に
添加した。４時間細胞培養後、IL-1β（40pg/ml）を含
む10％非働化（56℃,30分）ウシ胎児血清添加D-MEM培地
に置換し、さらに４時間培養した。次いでA549細胞を0.
1％グルタルアルデヒドで固定後、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）に IFO 50391として寄託されているマウス抗
ヒトICAM-1モノクローナル抗体SM-1（特願平５−３７２
６２号）を用いる酵素免疫測定法（EIA）により細胞表
面に発現されたICAM-1量を測定した。すなわちA549細胞
に結合したマウス抗体量を西洋わさびペルオキシダーゼ
標識抗マウスIgG抗体（コスモ社販売）を用いて測定
し、ICAM-1発現量を比較した。得られた結果を〔表１〕
に示した。リバースS-オリゴは全く発現抑制能を示さな
いが、アンチセンスS-オリゴは0.33μM濃度で有意な発
現抑制を示した。一方、核局在シグナルペプチド修飾ア
ンチセンスS-オリゴは0.11μM濃度で既に有意な発現抑
制を示し、さらに0.33μM濃度ではほぼ80％の強い発現
抑制活性を示した。
【００２４】
【表１】 ％ＩＣＡＭ-１発現抑制活性 Ｓ-オリゴ Ｓ-オリゴ濃度 0.04μM 0.11μM 0.33μM リバース ＜ ５ ＜ ５ ＜ ５ アンチセンス ＜ ５ １３ ４３ 核局在シグナルペプチドアンチセンス ９ ２１ ７６
【００２５】実験例２．ICAM-1発現抑制活性(2) 実験例１と同様の手順でICAM-1発現試験を実施した。被
検S-オリゴ（1.0μM）３種はいずれも、3μg/mlあるい
は10μg/mlのリポフェクチンに懸濁し標的細胞A549に添
加した。A549細胞に発現されたICAM-1量は実験例１と同
様の方法によりEIAで測定した。得られた結果は〔表
２〕に示した通りであった。3μg/mlおよび10μg/ml、
いずれのリポフェクチン濃度においても核局在シグナル
ペプチド修飾アンチセンスS-オリゴは未修飾アンチセン
スS-オリゴよりも有意に強いICAM-1発現抑制能を示し
た。
検S-オリゴ（1.0μM）３種はいずれも、3μg/mlあるい
は10μg/mlのリポフェクチンに懸濁し標的細胞A549に添
加した。A549細胞に発現されたICAM-1量は実験例１と同
様の方法によりEIAで測定した。得られた結果は〔表
２〕に示した通りであった。3μg/mlおよび10μg/ml、
いずれのリポフェクチン濃度においても核局在シグナル
ペプチド修飾アンチセンスS-オリゴは未修飾アンチセン
スS-オリゴよりも有意に強いICAM-1発現抑制能を示し
た。
【００２６】
【表２】 ％ＩＣＡＭ-１発現抑制活性 Ｓ-オリゴ リボフェクチン濃度 (1.0μM) 3 μg/ml 10 μg/ml リバース ＜ ５ ＜ ５ アンチセンス １１ ４５ 核局在シグナルペプチドアンチセンス １８ ６５
【００２７】
配列番号（SEQ ID NO)：1 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：18 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRANDEDNESS)：１本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（アンチセン
ス） 配列: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18
ス） 配列: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18
【００２８】配列番号（SEQ ID NO)：2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：18 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRANDEDNESS)：１本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（アンチセン
ス） 配列: CGGAGCGATA CCGAGGGT 18
ス） 配列: CGGAGCGATA CCGAGGGT 18
【図１】は、 実施例１で作製したアンチセンスS-オリゴ
およびリバースS-オリゴの電気泳動の結果を示す。図
中、１はアンチセンスS-オリゴの、２はリバースS-オリ
ゴの結果をそれぞれ示す。
およびリバースS-オリゴの電気泳動の結果を示す。図
中、１はアンチセンスS-オリゴの、２はリバースS-オリ
ゴの結果をそれぞれ示す。
【図２】は、実施例１で作製したアンチセンスS-オリゴ
のクロマトグラフィーの結果を示す。
のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図３】は、実施例１で作製したリバースS-オリゴのク
ロマトグラフィーの結果を示す。
ロマトグラフィーの結果を示す。
Claims (11)
- 【請求項１】核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレオ
チドとを結合させてなる修飾オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】核局在シグナルペプチドとオリゴヌクレオ
チドとをリンカーを介して結合させてなる請求項１記載
の修飾オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】核局在シグナルペプチドの官能基と、オリ
ゴヌクレオチドの３'−もしくは５'−末端の水酸基また
は 【化１】 （式中、ＸはＯまたはＳを、ＲはＯＨまたはＣＨ3を示
す）で表される基とをリンカーを介して結合させてなる
請求項２記載の修飾オリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】官能基がアミノ基，カルボキシル基または
スルフヒドリル基である請求項３記載の修飾オリゴヌク
レオチド。 - 【請求項５】オリゴヌクレオチドの３'−もしくは５'−
末端が水酸基である請求項３記載の修飾オリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項６】核局在シグナルペプチドがＰro-(Ｌys)3-
Ａrg-Ｌys-Ｖalを含むペプチドである請求項１記載の修
飾オリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】核局在シグナルペプチドがそのＣ末端にシ
ステイン残基を含むペプチドである請求項１記載の修飾
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項８】オリゴヌクレオチドが式: 【化２】 （式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって水酸基ある
いは 【化３】 （式中、ＸはＯまたはＳを、ＲはＯＨまたはＣＨ3を示
す）を、ＸおよびＲは前記と同意義を、Ｂはピリミジン
またはプリン核酸塩基を、ｎは７以上の整数を示す。α
およびβはいずれか一方が水素であり他方は水素，水酸
基またはフッ素である）である請求項１記載の修飾オリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項９】Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも一方が水酸
基である請求項８記載の修飾オリゴヌクレオチド。 - 【請求項１０】ＸがＳでかつＲがＯＨである請求項８記
載の修飾オリゴヌクレオチド。 - 【請求項１１】ｎが１５〜２０である請求項８記載の修
飾オリゴヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24475393A JPH0799976A (ja) | 1993-09-30 | 1993-09-30 | 修飾オリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24475393A JPH0799976A (ja) | 1993-09-30 | 1993-09-30 | 修飾オリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0799976A true JPH0799976A (ja) | 1995-04-18 |
Family
ID=17123390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24475393A Pending JPH0799976A (ja) | 1993-09-30 | 1993-09-30 | 修飾オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0799976A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009232862A (ja) * | 1995-12-15 | 2009-10-15 | Enzo Therapeutics Inc | 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物 |
| JP2015529073A (ja) * | 2012-08-20 | 2015-10-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 生物可逆性基を有するポリヌクレオチド |
| US9381208B2 (en) | 2006-08-08 | 2016-07-05 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität | Structure and use of 5′ phosphate oligonucleotides |
| US9399658B2 (en) | 2011-03-28 | 2016-07-26 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags |
| US9738680B2 (en) | 2008-05-21 | 2017-08-22 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof |
| US10059943B2 (en) | 2012-09-27 | 2018-08-28 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | RIG-I ligands and methods for producing them |
| CN115137872A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-10-04 | 北京科技大学 | 兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽dna水凝胶的制备方法 |
-
1993
- 1993-09-30 JP JP24475393A patent/JPH0799976A/ja active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009232862A (ja) * | 1995-12-15 | 2009-10-15 | Enzo Therapeutics Inc | 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物 |
| US10238682B2 (en) | 2006-08-08 | 2019-03-26 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Structure and use of 5′ phosphate oligonucleotides |
| US9381208B2 (en) | 2006-08-08 | 2016-07-05 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität | Structure and use of 5′ phosphate oligonucleotides |
| US10196638B2 (en) | 2008-05-21 | 2019-02-05 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof |
| US9738680B2 (en) | 2008-05-21 | 2017-08-22 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof |
| US10036021B2 (en) | 2008-05-21 | 2018-07-31 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof |
| US9896689B2 (en) | 2011-03-28 | 2018-02-20 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags |
| US9399658B2 (en) | 2011-03-28 | 2016-07-26 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags |
| JP2015529073A (ja) * | 2012-08-20 | 2015-10-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 生物可逆性基を有するポリヌクレオチド |
| US10059943B2 (en) | 2012-09-27 | 2018-08-28 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | RIG-I ligands and methods for producing them |
| US10072262B2 (en) | 2012-09-27 | 2018-09-11 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | RIG-I ligands and methods for producing them |
| US11142763B2 (en) | 2012-09-27 | 2021-10-12 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | RIG-I ligands and methods for producing them |
| CN115137872A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-10-04 | 北京科技大学 | 兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽dna水凝胶的制备方法 |
| CN115137872B (zh) * | 2022-06-13 | 2023-01-24 | 北京科技大学 | 兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽dna水凝胶的制备方法 |
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