JPH09506770A - ｃ−ｅｒｂＢの発現が関与する疾患を予防及び治療するためのアンチセンス核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、p185^erbB-2レセプター（c-erbB-2、HER2または neuとも呼ばれる）をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)または DNAのある領域にハイブリダイズするアンチセンス核酸又はその有効な誘導体、c-erbB-2レセプターをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)または DNAの領域にハイブリダイズするアンチセンス核酸又はその有効な誘導体を含む医薬用組成物、並びに新生物及び／又は免疫疾患及び／又は異常脈管形成の関与する疾患を治療するための医薬用組成物を製造するための当該アンチセンス核酸及びその誘導体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 c-erbBの発現が関与する疾患を予防及び治療するためのアンチセンス核酸 本発明は、p185^erbB-2レセプター（c-erbB-2、HER2または neuとも呼ばれる） をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)または DNAのある領域にハイブリダイズ するアンチセンス核酸又はその有効な誘導体、c-erbB-2レセプターをコードする メッセンジャーRNA(mRNA)または DNAのある領域にハイブリダイズするアンチセ ンス核酸又はその有効な誘導体を含む医薬用組成物、並びに新生物及び／又は免 疫疾患及び／又は異常脈管形成の関与する疾患を治療するための医薬用組成物を 製造するための当該アンチセンス核酸及びその誘導体の使用に関する。 erbB-2は、乳癌、肺癌、食道癌及び胃癌、胆管癌、膀胱癌並びに卵巣癌を含む 多様な新生物中の腫瘍細胞により増幅及び／又は過剰発現される細胞内チロシン キナーゼ活性を持つ成長因子レセプターと推定されるものである。 乳癌患者では、腫瘍組織における c-erbB-2 遺伝子の増幅及び過剰発現が臨床 的な予後の悪さと相関関係を持つことが示されている。非スモールセル肺癌にお ける p185 ^erbB-2の過剰発現は幾つかの化学療法剤に対して耐性を与えることが 示されている。 WO 93/09788 は erb B2/neu 遺伝子部位を含む細胞の増殖を阻害する方法を開 示している。この方法は erb B2/neu 遺伝子のプロモーター領域と同一線形三重 構造（a colinear triplex）を形成することができるオリゴヌクレオチドを治療 用量投与することを含む。 WO 92/19732 は、センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち閉鎖 （closed）オリゴヌクレオチドを開示している。これらの化合物は薬理的にセン ス又はアンチセンス分子として使用することができる。オリゴヌクレオチドのセ ンス又はアンチセンス薬剤としての治療的使用が広く述べられている。 WO 92/13063 は細胞内又は多細胞生物内で成長因子及び成長因子レセプターの 発現をもたらす方法、並びに成長因子及び成長因子レセプターを転写させる作用 体としての化合物を試験する方法を開示している。 遺伝子調節：アンチセンス RNA及び DNAの生物学(Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA)中の文献「ウィルス及び細胞の遺伝子発現を調節す る化学修飾オリゴデオキシヌクレオチドアナログ」はアンチセンス技術における 化学修飾オリゴヌクレオチドの使用を広く開示している。 本発明の目的は新生物及び／又は免疫疾患及び／又は異常脈管形成の関与する 疾患を治療するための化合物を提供することにある。 上記の課題を解決する本発明の c-erbB-2 アンチセンス−オリゴヌクレオチド は DNA- 又は RNA- 型構造を持ち配列表中 Seq．ID No．1-105で開示される配列 を持つ。対照オリゴヌクレオチドは DNA- 又は RNA- 型構造を持ち配列表中 Seq ．ID No．106で開示される配列を持つ。 本発明のアンチセンス核酸は、乳癌細胞を含む多様な腫瘍細胞における p185^{e rbB-2} 蛋白の発現、チロシンキナーゼ活性及び細胞成長を強く阻害することがで きた。形質転換していない正常な線維芽細胞は抗-c-erbB-2 アンチセンス化合物 による成長阻害を受けなかった。このことは、 p185 ^erbB-2が上記の腫瘍細胞の 成長において病原的役割を演じることを示唆している。 さらに驚くべきことに、多様な新生物に対する免疫反応が本発明のアンチセン ス核酸を使用することにより顕著に増大した。腫瘍細胞と末梢血単球を合わせて 培養する共培養アッセイにおいて、免疫細胞の成長及び活性が刺激された。 驚くべきことに、本発明のアンチセンス核酸は脈管形成の強い阻害剤としても 作用した。このことは、分泌されたトランケイテッド型の c-erbB-2 蛋白又は完 全なレセプター蛋白のいずれかが異常新生脈管形成における原因として働くらし いことを示唆している。 本発明によれば、p185^erbB-2をコードする mRNA または DNAのある領域にハイ ブリダイズするアンチセンス核酸又はその有効な誘導体は上記の疾患を有効に治 療することができる。このアンチセンス核酸は p185 ^erbB-2 mRNA の領域にハイ ブリダイズすることができる。このアンチセンス核酸のフラグメント及びこれら の配列を含むアンチセンス核酸は p185 ^erbB-2の産生が減少又は阻害されさえす れば本発明の作用を持つことが、当業者には理解される。 本発明によれば、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、固相に共有結合した 最初のヌクレオチドに各ヌクレオチドが結合してヌクレオチド鎖が 3'-5'方向に 成長することによる亜リン酸トリエステル化学を用いた固相合成によって得るこ とができ、この合成は以下の工程を含む： − 先のヌクレオチドの 5'DMT保護基の開裂、 − 鎖を増殖させるための各ヌクレオチドの付加、 − 亜リン酸基の修飾、次いで未反応 5'-水酸基の封鎖、及び − 固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂、 − それに続く合成生成物の処理。 オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を図１に示し、同時に、アン チセンス オリゴ−リボヌクレオチド類のそれぞれの構造を図２に示す。オリゴ ヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド長鎖からの細部として理解されるべきものであ る。 図１において、B は N9(A,G)又は N1(D,T)を介してデオキシリボースに結合し ているアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)及びチミン(T)等の有機塩基を意 味する。これらの塩基配列は対象遺伝子配列（mRNA- 配列）の逆相補物である。 使用される修飾によって以下に示すものが得られる： １．全ての R¹ が 1.1 R¹ = O 1.2 R¹ = S 1.3 R¹ = F 1.4 R¹ = CH₃ 1.5 R¹ = OEt で置換されたオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 ２．一つのオリゴヌクレオチド； （式中、 B = 遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチド dA 、dC、dG又は dT p = ヌクレオチド内リン酸 n = ６〜20塩基の長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲） の中のヌクレオチド内リン酸において、 R¹ が 2.1 R^1a = S； R^1b = O 2.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 2.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ 2.4 R^1a = CH₃； R^1b = S に変わっているオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 ３．一つのオリゴヌクレオチド； （式中、 B = 遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチド dA 、dC、dG又は dT p = ヌクレオチド内リン酸 n = ４〜12ジヌクレオチドの長さのオリゴデオキシ−リボジヌクレオチドの範 囲） の中のヌクレオチド内リン酸において、 R¹ が 3.1 R^1a = S； R^1b = O 3.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 3.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ に変わっているオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 ４．共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 4.1 コレステロール 4.2 ポリ(L)リジン 4.3 トランスフェリン と R² において結合している化合物 1.1〜1.5; 2.1〜2.4; 3.1〜3.3 のいずれか 、 ５．共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 5.1 コレステロール 5.2 ポリ(L)リジン 5.3 トランスフェリン と R³ において結合している化合物 1.1〜1.5; 2.1〜2.4; 3.1〜3.3 のいずれか 。 RNA-オリゴヌクレオチド類の場合は（図２）、塩基(アデニン(A)、グアニン(G )、シトシン(C)、ウラシル(U))は N9(A,G)又は N1(C,U)を介してリボースに結合 している。これらの塩基配列は対象遺伝子配列(mRNA-配列)の逆相補物である。 オリゴヌクレオチド配列中に使用する修飾により、以下に示すものが得られる： ６．全ての R¹ が 6.1 R¹ = O 6.2 R¹ = S 6.3 R¹ = F 6.4 R¹ = CH₃ 6.5 R¹ = OEt で置換されたオリゴ−リボヌクレオチド類、 ７．一つのオリゴヌクレオチド； （式中、 B = 遺伝子配列に依存するリボヌクレオチド A、C、G 又は T p = ヌクレオチド内リン酸 n = ４〜20塩基の長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲） の中のヌクレオチド内リン酸において、 R¹ が 7.1 R^1a = S； R^1b = O 7.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 7.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ 7.4 R^1a = CH₃； R^1b = S に変わっているオリゴ−リボヌクレオチド類、 ８．一つのオリゴヌクレオチド； （式中、 B = 遺伝子配列に依存するリボヌクレオチド A、C、G又は T p = ヌクレオチド内リン酸 n = ４〜12ジヌクレオチドの長さのオリゴ−リボジヌクレオチドの範囲） の中のヌクレオチド内リン酸において、 R¹ が 8.1 R^1a = S； R^1b = O 8.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 8.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ に変わっているオリゴ−リボヌクレオチド類、 ９．共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 9.1 コレステロール 9.2 ポリ(L)リジン 9.3 トランスフェリン と R² において結合している化合物 6.1〜6.5; 7.1〜7.4; 8.1〜8.3 のいずれか 、 10．共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 10.1 コレステロール 10.2 ポリ(L)リジン 10.3 トランスフェリン と R³ において結合している化合物 6.1〜6.5; 7.1〜7.4; 8.1〜8.3 のいずれか 、 11．全ての R⁴ が 11.1 R⁴ = O 11.2 R⁴ = F 11.3 R⁴ = CH₃ で置換された化合物 6.1〜6.5; 7.1〜7.4; 8.1〜8.3;9.1〜9.3; 10.1〜10.3のい ずれか。 本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様では、それらは DNA- 又は RNA- 型構造を持つホスホロチオエート誘導体である。 上記の単独の一配列が本発明のアンチセンス核酸又はオリゴヌクレオチド構造 として機能することも可能である。しかしながら、一本のヌクレオチド鎖が、直 接共有結合しているか又は他のヌクレオチドを中にはさんで共有結合している２ 個以上の上記配列を含むことも可能である。好ましくは、単独のオリゴヌクレオ チド類が挙げられる。 これらのオリゴ−ヌクレオチド類の好ましい態様では、それらはホスホロチオ エート誘導体である。 アンチセンス−オリゴヌクレオチド類を修飾すると、それらを使用した際に内 因性の因子によって破壊される速度が、自然に存在するヌクレオチド配列に確認 されている速度よりも遅いために、有利である。しかしながら、開示されている 配列を持つ自然に存在するヌクレオチドもまた本発明に使用しうることが当業者 には理解される。特に好ましい態様において、上記修飾はホスホロチオエート修 飾である。 本発明のオリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成を、以下により詳しく具体例を 挙げて述べる。 オリゴデオキシ−ヌクレオチド類は亜リン酸トリエステル化学を用いて、保護 されたヌクレオチドの段階的 5'-付加により合成した。ヌクレオチドA は 5'-ジ メトキシ−トリチル−デオキシアデノシン（N-ベンゾイル）-N,N'-ジイソプロピ ル -2-シアノエチル ホスホルアミダイト(0.1 M)として導入し；C は 5'-ジメ トキシトリチル−デオキシシチジン（N⁴-ベンゾイル）-N,N'-ジイソプロピル -2 -シアノエチル ホスホルアミダイトとして導入し；G は 5'-ジメトキシトリチ ル−デオキシグアノシン（N⁸- イソブチリル）-N,N'-ジイソプロピル -2-シアノ エチル ホスホルアミダイトとして導入し、Tは 5'-ジメトキシトリチル−デオ キシチミジン-N,N'-ジイソプロピル-2-シアノエチル ホスホルアミダイトとし て導入した。ヌクレオチド類は好ましくはアセトニトリル中に 0.1 M濃度に溶解 して使用した。 合成は、殆どの 3' ヌクレオチドが長鎖アルキルアミンリンカーを介して共有 結合する（平均担持 30 μmol/g 固体支持体）、直径が約 150μm に調節された 細孔ガラス粒子（細孔直径 500Å）上で行った。 固体支持体は円筒状の合成カラムに充填し、試薬類は十分流出できるが固体合 成支持体は保持するフィルターで両末端をキャップした。試薬類は、不活性ガス による加圧を利用して合成カラムに供給し、回収した。ヌクレオチド類は3'→5' 方向に伸長するオリゴヌクレオチド鎖に付加した。各ヌクレオチドは以下の合成 サイクルを一巡して結合させた： 先のヌクレオチドの 5'DMT（ジメトキシトリチル）保護基をジクロロメタン中 で 3-クロロ酢酸を用いて開裂し、次いで無水アセトニトリルでカラムを洗浄し た。そして同時に、配列に応じて、保護された誘導体の形態にある塩基の一つを アセトニトリル中でテトラゾールと共に添加した。反応後、反応混合液を回収し て、亜リン酸を二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中の硫黄（S₈）の混合 物で酸化した。酸化反応の後、混合液を回収し、カラムをアセトニトリルで洗浄 した。1-メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフランを同 時に添加して未反応の 5'-水酸基を封鎖した。その後、合成カラムをアセトニト リルで洗浄し、次のサイクルを開始した。 合成生成物の処理及び精製は以下のように行われた。 最後のヌクレオチドを付加した後に、デオキシヌクレオチドをアンモニア溶液 中でインキュベートすることにより固体支持体から開裂した。環外塩基保護基は アンモニア中でさらにインキュベートすることにより除去した。その後アンモニ アを減圧留去した。依然として 5'DMT保護基を有する全長合成生成物を、シリカ C₁₈固定相上で逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて短い破損不純物から分 離した。生成物のピーク溶離液を回収し、減圧乾燥し、 5'DMT保護基を酢酸中で インキュベートすることにより開裂し、その後酢酸を減圧留去した。合成生成物 を脱イオン水中に溶解し、ジエチルエーテルで３回抽出した。その後、生成物を 減圧乾燥した。再度 HPLC-AXクロマトグラフィーを行い、生成物のピーク溶離液 を過剰のトリスバッファーに対して透析し、同様に二度目の透析を脱イオン水に 対して行った。最終生成物は凍結乾燥し、乾燥貯蔵した。 本発明のアンチセンス核酸は、医薬用組成物又は薬剤として使用することがで きる。この薬剤は、 c-erbB-2 由来のレセプター蛋白又はトランケイテッドp185 ^erbB-2の発現が病原性に関連を持つ新生物及び／又は免疫疾患及び／又は異常 脈管形成の関与する疾患を治療するために使用することができる。この薬剤は、 p185 ^erbB-2を発現する細胞類において新生物細胞の成長を抑制し、免疫反 応に対する腫瘍細胞の耐性を失わせ、異常脈管形成を阻害し、さらに免疫系を刺 激することを目的として使用することができる。 本発明のアンチセンス核酸は、本発明の医薬用組成物又は薬剤の中間産物であ る。この医薬用組成物は有効化合物（類）の他に、薬剤製造用に当技術分野にお いて公知の適当な担体試薬、溶媒及び他の成分を含んでもよい。好ましくは、こ れらの試薬は本発明の医薬用組成物の投与を容易にするものである。典型的には 、この医薬用組成物は静脈内注入又は静脈内ボーラス注射として投与される。投 与される活性成分の量は典型的には、１日当たり体重１kgについて 0.2 - 50 mg の範囲、とりわけ１ - 12 mgの範囲のオリゴヌクレオチドである。 この医薬用組成物において活性化合物として使用することができる化合物はた いてい、各遺伝子が発現されているかどうかを評価するための診断手段として用 いることができる。典型的には、放射性ラベルヌクレオチドを当技術分野におい て周知のノーザン・ブロッティング法により又は生体内でそのまま検査されるサ ンプルにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの度合いが各遺伝子の 発現度についての測定値となる。 新生物細胞の成長に対する c-erbB-2 特異性アンチセンス−オリゴヌクレオチ ドの作用を調べた。 c-erbB-2 mRNAに相補的なアンチセンス オリゴデオキシヌ クレオチドは、ホスホロチオエートで修飾された核酸も同様に、 p185 ^erbB-2蛋 白の発現を特異的に阻害することができ、乳癌細胞、卵巣癌細胞及び膀胱癌細胞 における細胞増殖を相当程度抑制できることが明らかにされた。また、このアン チセンス核酸で処理された腫瘍細胞では蛋白合成及び S6 キナーゼ活性が強く抑 制されることも示すことができた。 さらに、多様な新生物に対する免疫反応が上記のアンチセンス核酸を使用する ことにより顕著に増大した。腫瘍細胞と末梢血単球を合わせて培養する共培養ア ッセイにおいて、リンパ球の成長及び活性が刺激された。 さらに、上記のアンチセンス核酸は脈管形成に対する阻害剤としても作用する 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (72)発明者 シュリンゲンジーペン カール−ヘルマン ドイツ連邦共和国、ボーフェンデン Ｄ− 37120、ボーフェンデア シュトラーセ ５ (72)発明者 シュリンゲンジーペン レイマール ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ− 37073、アム ゴルドグラーベン 13 (72)発明者 シュリンゲンジーペン ゲオルグ−エフ ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ− 37073、アム ゴルドグラーベン 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．c-erbB-2をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)及び／又は DNAのある領域 にハイブリダイズし、配列表中 Seq．ID No．1-105で規定された配列を含み、DN A- 又は RNA- 型構造を持ち、新生物、免疫疾患及び／又は異常脈管形成の関与 する疾患を治療又は予防することができるアンチセンス核酸又はその有効な誘導 体。 ２．当該オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート誘導体のような修飾されたオ リゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンス オリゴヌクレオチド 。 ３．固相に共有結合した最初のヌクレオチドに各ヌクレオチドが結合してヌクレ オチド鎖が 3'-5'方向に成長することによる亜リン酸トリエステル化学を用いた 固相合成によって得ることができ、この合成が以下の工程 − 先のヌクレオチドの 5'DMT保護基の開裂、 − 鎖を増殖させるための各ヌクレオチドの付加、 − 亜リン酸基の修飾、次いで未反応 5'-水酸基の封鎖、及び − 固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂、 − それに続く合成生成物の処理 を含む、請求項１及び／又は２のいずれかに記載のアンチセンス核酸又はアン チセンス−オリゴヌクレオチド類。 ４．新生物及び／又は免疫疾患及び／又は異常脈管形成の関与する疾患を予防及 び治療するための、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を有効量含む医薬用 組成物。 ５．新生物及び／又は免疫疾患及び／又は異常脈管形成の関与する疾患を予防及 び治療するための医薬用組成物を製造するための、請求項１〜３のいずれかに記 載の化合物の使用。 ６．請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の診断薬としての使用。 ７．請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又は請求項４に記載の医薬用組成物 を c-erbB-2 の発現が関係する疾患の患者に有効量投与することにより、新生 物及び／又は免疫疾患及び異常脈管形成の関与する疾患を治療又は予防する方法 。