ES2330301T3 - Dosificaciones para tratamiento con anticuerpos anti-erbb2. - Google Patents

Abstract

Utilización del anticuerpo anti-ErbB2huMab 4D5-8 en la fabricación de un medicamento para su uso en un procedimiento para el tratamiento de un paciente humano diagnosticado con un cáncer de mama, caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de administrar al paciente una dosis inicial de 8 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2; y administrar al paciente una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo en una cantidad que es de 6 mg/kg, en el que las dosis están separadas en el tiempo entre sí en tres semanas.

Description

Dosificaciones para tratamiento con anticuerpos anti-ErbB2.

Campo de la invención

La presente descripción se refiere al tratamiento de los desórdenes caracterizados por la sobreexpresión de ErbB2 o desórdenes que expresan receptores de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), comprendiendo administrar a un humano o animal que presenta los desórdenes una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que enlaza ErbB2. Más específicamente, la descripción se refiere al tratamiento de pacientes humanos susceptibles o diagnosticados con cáncer que sobreexpresa ErbB2 o que expresa EGFR, donde el tratamiento es con un anticuerpo anti-ErbB2 administrado mediante la carga frontal de la dosis de anticuerpo durante el tratamiento mediante administración intravenosa y/o subcutánea. La descripción opcionalmente incluye el tratamiento del cáncer en un paciente humano con una combinación de un anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico, tal como, pero no limitado a, un taxoide. El taxoide puede ser, pero no está limitado a paclitaxel o docetaxel. La descripción incluye además un tratamiento del cáncer en un paciente humano con una combinación del anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico, tal como, pero no limitado a, un derivado de antraciclina. Opcionalmente, un tratamiento con una combinación de anti-ErbB2 y un derivado de antraciclina incluye un tratamiento con una cantidad efectiva de un cardioprotector. La presente invención se refiere además a la dosificación infrecuente de anticuerpos anti-ErbB2.

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Antecedentes de la invención

Se ha identificado que proto-oncogenes que codifican factores de crecimiento y receptores de factor de crecimiento juegan importantes papeles en la patogénesis de varias malignidades humanas, incluyendo el cáncer de mama. Se ha encontrado que el gen ErbB2 humano (erbB2, también conocido como her2, o c-erbB-2), que codifica un receptor 185-kd glicoproteína transmembrana (p185^{HER2}) relacionado con el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), está sobreexpresado en aproximadamente un 25% a un 30% del cáncer de mama humano (Slamon et al., Science 235:177-182 [1987]; Slamon et al., Science 244:707-712 [1989]).

Varias líneas de evidencia sostienen un papel directo para el ErbB2 en la patogénesis y agresividad clínica de los tumores que sobreexpresan el ErbB2. Se ha mostrado que la introducción de ErbB2 dentro de células no-neoplásticas causa su transformación maligna (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7159-7163 [1987]; DiFiore et al., Science 237:78-182 [1987]). Se encontró que ratones transgénicos que expresan HER2 desarrollaron tumores mamarios (Guy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10578-10582 [1992]).

Se han descrito anticuerpos dirigidos contra los productos de proteína humana erbB2 y proteínas codificadas mediante el equivalente de ratón del gen erbB2 (neu). Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985) se refiere a un anticuerpo monoclonal IgG2a que es dirigido contra el producto génico neu del ratón. Este anticuerpo llamado 7.16.4 causa la sub-modulación de la expresión de superficie celular p185 en células B104-1-1 (células NIH-3T3 transfectadas con el proto-oncogén neu) e inhibe la formación de colonias de estas células. En Drebin et al. PNAS (USA) 83:9129-9133 (1986), se mostró que el anticuerpo 7.16.4 inhibe el crecimiento tumorigénico de células NIH-3T3 neu-transformadas así como de células de neuroblastoma de ratón (a partir de las cuales el neu oncogén fue inicialmente aislado) implantadas en ratones desnudos. Drebin et al. en Oncogéne 2:387-394 (1988) discute la producción de un panel de anticuerpos contra el producto génico neu del ratón. Se encontró que todos los anticuerpos ejercían un efecto citostático sobre el crecimiento de las células neu-transformadas suspendidas en agar blando. Anticuerpos de los isotipos IgM, IgG2a y IgG2b fueron capaces de mediar significativamente en la lisis in vitro de células neu-transformadas en presencia de complemento, donde ninguno de los anticuerpos fue capaz de mediar altos niveles de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de las células neu-transformadas. Drebin et al. Oncogéne 2:273-277 (1988) indica que mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas sobre la molécula p185 resultan en efectos anti-tumorales sinérgicos en células neu-transformadas NIH-3T3 implantadas en ratones desnudos. Los efectos biológicos de anticuerpos anti-neu son revisados en Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991). Ver también el documento WO94/22478 publicado el 13 de Octubre de 1994.

Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989) describe la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 que fueron caracterizados utilizando la línea celular de tumor de mama humano SKBR3. Se determinó la proliferación celular relativa de las células SKBR3 siguiendo a la exposición a los anticuerpos mediante coloración violeta cristalina de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este ensayo, se obtuvo una máxima inhibición con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibió la proliferación celular en un 56%. Otros anticuerpos en el panel, incluyendo 7C2 y 7F3, redujeron la proliferación celular en una extensión menor en este ensayo. Hudziak et al. concluyen que el efecto del anticuerpo 4D5 sobre células SKBR3 fue más citostático que citotóxico, ya que las células SKBR3 reasumieron el crecimiento a una tasa casi normal después de la extracción del anticuerpo del medio. El anticuerpo 4D5 se encontró además que sensibiliza las líneas de células de tumor de mama que sobreexpresan p185^{erbB2} a los efectos citotóxicos de TNF-\alpha. Ver también el documento WO89/06692 publicado el 27 de Julio de 1989. Los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en Hudziak et al. están además caracterizados en Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogéne 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); y D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994).

Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991) describe dos anticuerpos que fueron seleccionados por su reactividad en la línea celular del adenocarcinoma de pulmón (Calu-3) que sobreexpresa el ErbB2. Uno de los anticuerpos, llamado MGR3, se encontró que internalizaba, inducía fosforilación de ErbB2, e inhibía el crecimiento de la células del tumor in vitro.

McKenzie et al. Oncogéne 4:543-548 (1989) generaron un panel de anticuerpos anti-ErbB2 con variación de especificidades de epítopes, incluyendo el anticuerpo designado TA1. Este anticuerpo TA1 se encontró que induce la endocitosis acelerada de ErbB2 (ver Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 [1991]). Bacus et al. Molecular Carcinogénesis 3:350-362 (1990) informó que el anticuerpo TA1 inducía la maduración de las líneas celulares de cáncer de mama AU-565 (que sobreexpresa el gen erbB2) y MCF-7 (que no lo hace). Se encontró que la inhibición de crecimiento y la adquisición de un fenotipo maduro en estas células están asociadas con niveles reducidos de receptor ErbB2 en la superficie celular y niveles transitorios incrementados en el citoplasma.

Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991) generaron un panel de anticuerpos anti-ErbB2, inyectándoles i.p. en ratones desnudos y evaluaron su efecto sobre el crecimiento del tumor de fibroblastos de murina transformados mediante la sobreexpresión del gen erbB2. Se detectaron varios niveles de inhibición del tumor para cuatro de los anticuerpos, pero uno de los anticuerpos (N28) estimulaba consistentemente el crecimiento del tumor. El anticuerpo monoclonal N28 indujo una fosforilación significativa en el receptor ErbB2, mientras que los otros cuatro anticuerpos generalmente mostraron baja o ninguna actividad de inducción de la fosforilación. También fue determinado el efecto de los anticuerpos anti-ErbB2 sobre la proliferación de células SKBR3. En este ensayo de proliferación celular SKBR3, dos de los anticuerpos (N12 y N29) causaron una reducción en la proliferación celular en relación con el control. Se determinó la habilidad de los distintos anticuerpos para inducir la lisis celular in vitro a través de citotoxicidad complemento-dependiente (CDC) y citotoxicidad celular-dependiente mediada por anticuerpo (ADCC), con los autores de este documento concluyendo que la función inhibidora de los anticuerpos no fue atribuída significativamente a CDC o ADCC.

Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992) caracterizó además los anticuerpos descritos en Bacus et al. (1990) y Stancovski et al. de los párrafos precedentes. Extendiendo los estudios i.p. de Stancovski et al., se determinó el efecto de los anticuerpos después de inyección i.v. en ratones desnudos que albergan fibroblastos de ratón que sobreexpresan ErbB2 humano. Como se observó en su trabajo anterior, N28 aceleró el crecimiento del tumor, mientras que N12 y N29 significativamente inhibían el crecimiento de las células que expresan ErbB2. La inhibición parcial del tumor también se observó con el anticuerpo N24. Bacus et al. también probaron la habilidad de los anticuerpos para promover un fenotipo maduro en las líneas celulares del cáncer de mama humano AU-565 y MDA-MB453 (que sobreexpresa ErbB2) así como MCF-7 (que contiene bajos niveles del receptor). Bacus et al. vió una correlación entre la inhibición del tumor in vivo y la diferenciación celular; el anticuerpo estimulador del tumor N28 no tenía efecto sobre la diferenciación, y la acción inhibitoria del tumor de los anticuerpos N12, N29 y N24 correlacionada con la extensión de la diferenciación que ellos inducen.

Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993) evaluó un panel de anticuerpos anti-ErbB2 para sus especificidades de enlace de epítope, así como su habilidad para inhibir el crecimiento independiente de la fijación y dependiente de la fijación de células SKBR3 (mediante anticuerpos individuales y en combinaciones), modular la superficie celular ErbB2, e inhibir el crecimiento estimulado por el ligando independiente de la fijación. Ver también el documento WO94/00136 publicado el 6 de Enero de 1994 y Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992) concerniente a las combinaciones anticuerpo anti-ErbB2. Otros anticuerpos anti-ErbB2 son discutidos en Hancock et al. Cancer Res.51:4575-4580(1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); y Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992).

Un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado anti-ErbB2 (una versión humanizada del anticuerpo murina anti-ErbB24D5, referida como rhuMAb HER2, HERCEPTIN®, o anticuerpo HERCEPTIN® anti-ErbB2) ha sido clínicamente activo en pacientes con cánceres de mama metastáticos que sobreexpresan ErbB2 que habían recibido terapia anticáncer extensiva anterior (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744). La dosis de carga inicial recomendada para HERCEPTIN® es de 4 mg/kg administrada como una infusión de 90 minutos. La dosis de mantenimiento semanal recomendada es 2 mg/kg y puede ser administrada como una infusión de 30 minutos si la dosis de carga inicial es bien tolerada.

La sobreexpresión de ErbB2 comúnmente es considerada como un predictor de pronóstico pobre, especialmente en pacientes con enfermedad primaria que implica nodos linfáticos axilares (Slamon et al., [1987] y [1989], supra; Ravdin y Chamness, Gene 159:19-27 [1995]; y Hynes y Stern, Biochim Biophys Acta 1198:165-184 [1994]), y se ha vinculado a sensibilidad y/o resistencia a terapia hormonal y regímenes quimioterapéuticos, incluyendo CMF (ciclofosfamida, metotrexato, y fluoruracil) y antraciclinas (Baselga et al., Oncology 11(3 Suppl 1):43-48 [1997]). Sin embargo, a pesar de la asociación de la sobreexpresión ErbB2 con pronóstico pobre, las posibilidades de pacientes HER2-positivos que responden clínicamente al tratamiento con taxanos fueron mayores de tres veces a las de pacientes HER2-negativos (Ibid). rhuMab HER2 mostró mejorar la actividad de paclitaxel (TAXOL®) y doxorubicina contra injertos heterólogos de cáncer de mama en ratones desnudos inyectados con células de adenocarcinoma de mama humano BT-474, que expresa altos niveles de HER2 (Baselga et al., Breast Cancer, Proceedings of ASCO, Vol. 13, Abstract 53 [1994]).

Descripción de la invención

La presente descripción se refiere al descubrimiento que un intento temprano de un objetivo efectivo a través de una concentración de suero proporcionando una dosis inicial o más dosis de anticuerpos anti-ErbB2 seguidas por dosis posteriores de cantidades iguales o menores de anticuerpos (carga frontal mayor) es más eficaz que los tratamientos convencionales. La diana efectiva a través de la concentración de suero se alcanza en 4 semanas o menos, preferentemente 3 semanas o menos, más preferentemente 2 semanas o menos, y aún más preferentemente en 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos. La concentración de suero diana se mantiene luego mediante la administración de dosis de mantenimiento de cantidades iguales o menores para el resto del régimen de tratamiento o hasta que se logra la supresión de los síntomas de la enfermedad.

La descripción se refiere además a un procedimiento para el tratamiento de un paciente humano susceptible o diagnosticado con un desorden caracterizado por la sobreexpresión de receptor ErbB2 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-ErbB2 subcutáneamente. Preferentemente, la dosis inicial (o las dosis) así como la o las posteriores dosis de mantenimiento son administradas subcutáneamente. Opcionalmente, si la tolerancia del paciente al anticuerpo anti-ErbB2 es desconocida, la dosis inicial se administra mediante infusión intravenosa, seguida por administración subcutánea de las dosis de mantenimiento si la tolerancia del paciente para el anticuerpo es aceptable.

Según la descripción, el procedimiento del tratamiento implica la administración de una dosis inicial de anticuerpo anti-ErbB2 de más de aproximadamente 4 mg/kg, preferentemente más de aproximadamente 5 mg/kg. La dosis inicial máxima o una dosis posterior no excede de 50 mg/kg, preferentemente no excede de 40 mg/kg, y más preferentemente no excede de 30 mg/kg. La administración es mediante administración intravenosa o subcutánea, preferentemente infusión intravenosa o inyección de bolo, o más preferentemente inyección de bolo subcutánea. La dosis inicial pueden ser una o mas administraciones de medicamento suficientes para alcanzar el objetivo a través de la concentración de suero en 4 semanas o menos, preferentemente 3 semanas o menos, más preferentemente 2 semanas o menos, y aún más preferentemente 1 semana o menos, incluyendo un día o menos.

Según la descripción, la dosis inicial o las dosis son seguidas por dosis posteriores de cantidades iguales o menores de anticuerpo a intervalos suficientemente próximos para mantener la concentración mínima de anticuerpo en suero en o por encima de un nivel objetivo eficaz. Preferentemente, una dosis inicial o dosis posteriores no exceden de 50 mg/kg, y cada dosis posterior es al menos de 0,01 mg/kg. Preferentemente, la cantidad de medicamento administrada es suficiente para mantener la concentración mínima objetivo en suero de forma tal que el intervalo entre ciclos de administración es de al menos una semana. Preferentemente la concentración mínima en suero no excede de 2500 \mug/ml y no cae por debajo de 0,01 \mug/ml durante el tratamiento. El procedimiento de tratamiento de carga frontal del medicamento de la descripción tiene la ventaja de su eficacia incrementada al alcanzar una concentración de fármaco en suero objetivo temprano en el tratamiento. La entrega subcutánea de dosis de mantenimiento según la descripción tiene la ventaja de ser conveniente para el paciente y profesionales del cuidado de la salud, reduciendo el tiempo y costes de fármacos de tratamiento. Preferentemente, la dosis inicial (o la última dosis dentro de una serie de dosis iniciales) está separada en el tiempo de la primera dosis posterior en 4 semanas o menos, preferentemente 3 semanas o menos, más preferentemente 3 semanas o menos, aún más preferentemente 1 semana o menos.

En una realización, la dosis inicial de anti-ErbB2 es 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg suministrada mediante administración intravenosa o subcutánea, tal como infusión intravenosa o inyección de bolo subcutánea. La posterior dosis de mantenimiento son 2 mg/kg suministrados una vez por semana mediante infusión intravenosa, inyección de bolo subcutánea, infusión subcutánea, o inyección de bolo subcutánea. La elección del procedimiento de suministro para la dosis inicial y de mantenimiento se realiza según la capacidad del animal o paciente humano para tolerar la introducción del anticuerpo en el cuerpo. Si el anticuerpo es bien tolerado, el tiempo de infusión puede ser reducido. La elección del procedimiento de suministro como se describe para esta realización se aplica a todos los regímenes de suministro de fármacos contemplados según la invención.

En otra realización, la descripción incluye una dosis inicial de 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por posteriores dosis de mantenimiento de 6 mg/kg una vez durante 3 semanas.

En otra realización, la descripción incluye una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por 6 mg/kg una vez durante 3 semanas.

Aún en otra realización, la descripción incluye una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por la posterior dosis de mantenimiento de 8 mg/kg una vez por semana u 8 mg/kg una vez cada 2 a 3 semanas.

En otra realización, la descripción incluye una dosis inicial de al menos 1 mg/kg, preferentemente 4 mg/kg, de anticuerpo anti-ErbB2on cada 1, 2 y 3 días, seguida por posteriores dosis de mantenimiento de 6 mg/kg una vez durante 3 semanas.

En otra realización, la descripción incluye una dosis inicial de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por posteriores dosis de mantenimiento de 2 mg/kg dos veces por semana, donde las dosis de mantenimiento están separadas por 3 días.

Aún en otra realización, la descripción incluye un ciclo de dosificación en el que el suministro del anticuerpo anti-ErbB2 es 2-3 veces por semana durante 3 semanas. En una realización, cada dosis es aproximadamente 25 mg/kg o menos para un paciente humano, preferentemente aproximadamente 10 mg/kg o menos. Este ciclo de 3 semanas es preferentemente repetido según sea necesario para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad.

En otra realización, la descripción incluye un ciclo de dosificación en el cual el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 es diariamente durante 5 días. Según la descripción, el ciclo es preferentemente repetido según sea necesario para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad.

El desorden preferentemente es un tumor benigno o maligno caracterizado por la sobreexpresión del receptor ErbB2, por ejemplo un cáncer, tal como, cáncer de mama, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. El procedimiento de la invención puede comprender además la administración de un agente quimioterapéutico distinto de una antraciclina, por ejemplo doxorubicina o epirubicina. El agente quimioterapéutico preferentemente es un taxoide, tal como TAXOL® (paclitaxel) o un derivado de TAXOL®.

Los anticuerpos anti-ErbB2 preferidos enlazan el dominio extracelular del receptor ErbB2, y preferentemente enlaza el epítope 4D5 o 3H4 dentro de la secuencia de dominio extracelular ErbB2. Más preferentemente, el anticuerpo es el anticuerpo 4D5, aún más preferentemente en una forma humanizada. Otros anticuerpos preferidos que enlazan ErbB2 incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos 7C2, 7F3, y 2C4, preferentemente en una forma humanizada.

El procedimiento de la presente descripción es particularmente adecuado para el tratamiento de cáncer de mama u ovárico, caracterizado por la sobreexpresión del receptor ErbB2.

La presente solicitud también proporciona un procedimiento de terapia que implica la dosificación infrecuente de un anticuerpo anti-ErbB2. En particular, la descripción proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer (por ejemplo cáncer caracterizado por sobreexpresión del receptor ErbB2) en un paciente humano que comprende administrar al paciente una primera dosis de un anticuerpo anti-ErbB2 seguida por al menos una dosis posterior del anticuerpo, donde la primera dosis y las dosis posteriores están separadas entre sí en el tiempo por al menos aproximadamente dos semanas (por ejemplo desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente dos meses), y opcionalmente al menos aproximadamente tres semanas (por ejemplo desde aproximadamente tres semanas hasta aproximadamente seis semanas). Por ejemplo, el anticuerpo puede ser administrado aproximadamente cada tres semanas, aproximadamente dos hasta aproximadamente 20 veces, por ejemplo aproximadamente seis veces. La primera dosis y las dosis posteriores pueden ser cada una de desde aproximadamente 2 mg/kg hasta aproximadamente 16 mg/kg; por ejemplo desde aproximadamente 4 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg; y opcionalmente desde aproximadamente 6 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Generalmente, dos o más dosis posteriores (por ejemplo desde aproximadamente dos hasta aproximadamente diez dosis posteriores) del anticuerpo son administradas al paciente, y aquellas dosis posteriores están preferentemente separadas unas de otras en el tiempo por al menos aproximadamente dos semanas (por ejemplo desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente dos meses), y opcionalmente al menos aproximadamente tres semanas (por ejemplo desde aproximadamente tres semanas hasta aproximadamente seis semanas). Las dos o más dosis posteriores pueden ser cada una desde aproximadamente 2 mg/kg hasta aproximadamente 16 mg/kg; o desde aproximadamente 4 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg; o desde aproximadamente 6 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. La descripción adicionalmente proporciona un artículo de fabricación, que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2, y una inserción del envoltorio que contiene instrucciones para administrar el anticuerpo según dichos procedimientos.

Los protocolos de dosificación actualmente descritos pueden ser aplicados a otros anticuerpos anti-ErbB tal como anticuerpos anti-receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), anti-ErbB3 y anti-ErbB4. Por lo tanto, la descripción proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un paciente humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-ErbB al paciente humano, comprendiendo el procedimiento administrar al paciente una dosis inicial de al menos aproximadamente 5 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB; y administrar al paciente una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo en una cantidad que es aproximadamente la misma o menos que la dosis inicial. Alternativamente, o adicionalmente, la descripción pertenece a un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un paciente humano que comprende administrar al paciente una primera dosis de un anticuerpo anti-ErbB seguido por al menos una dosis posterior del anticuerpo, donde la primera dosis y dosis posteriores están separadas unas de otras en el tiempo por al menos aproximadamente dos semanas. La descripción adicionalmente proporciona un artículo de fabricación, que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB, y una inserción en el envase conteniendo instrucciones para administrar el anticuerpo según tales procedimientos.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un artículo de fabricación, que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2, opcionalmente una etiqueta sobre o asociada con el contenedor que indica que la composición puede ser utilizada para tratar una condición caracterizada por la sobreexpresión del receptor ErbB2, y una inserción de envase conteniendo instrucciones para evitar el uso de quimioterapéuticos de tipo antraciclina en combinación con la composición. Según la descripción, la inserción del envase incluye además instrucciones para administrar el anticuerpo anti-ErbB2 a una dosis inicial de 5 mg/kg seguida por las mismas o menores dosis posteriores. En otra realización de la invención, la inserción del envase incluye además instrucciones para administrar el anticuerpo anti-ErbB2 subcutáneamente y durante al menos una de las dosis, preferentemente para todas las dosis posteriores siguiendo a la dosis inicial, aún más preferentemente para todas las dosis.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un procedimiento de tratamiento de ErbB2 que expresa cáncer en un paciente humano que comprende administrar al paciente cantidades efectivas de un anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico. En una realización de la descripción, el agente quimioterapéutico es un taxoide que incluye, pero no limitado a, paclitaxel y docetaxel. En otra realización, el agente quimioterapéutico es un derivado de antracilina que incluye, pero no limitado a, doxorubicina o epirubicina. Aún en otra realización, el tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB2 y un derivado antraciclina incluye además la administración de un cardioprotector al paciente. En aún otra realización, no se administra un derivado de antraciclina al paciente con el anticuerpo anti-ErbB2. También pueden administrarse uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales al paciente. El cáncer está preferentemente caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2.

La descripción proporciona además un artículo de fabricación que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2 y una inserción de envase que instruye al usuario de la composición a administrar la composición del anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico a un paciente. En otra realización, el agente quimioterapéutico es otro distinto de la antraciclina, y es preferentemente un taxoide, tal como TAXOL®. Aún en otra realización, el agente quimioterapéutico es una antraciclina, que incluye pero no limitado a, doxorubicina o epirubicina. Aún en otra realización, el agente quimioterapéutico es una antraciclina y la inserción del envase instruye además al usuario para administrar un cardioprotector.

Los procedimientos y la composición de la descripción comprenden un anticuerpo anti-ErbB2 e incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 humanizado. Por lo tanto, la descripción pertenece además a una composición que comprende un anticuerpo que enlaza ErbB2 y el uso del anticuerpo para tratar cáncer que expresa ErbB2, por ejemplo, cáncer que sobreexpresa ErbB2, en un humano. La descripción también pertenece al uso del anticuerpo para tratar cáncer que expresa EGFR. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, 4D5 humanizado (y preferentemente huMAb4D5-8 (HERCEPTIN® anticuerpo anti-ErbB2); o anticuerpo monoclonal 2C4, por ejemplo, 2C4 humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo intacto IgG,) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, F(ab)_{2}, diacuerpo, y similares). Las regiones de cadena liviana variable y cadena pesada variable del anticuerpo anti-ErbB22C4 humanizado se muestran en las Figuras 5A y 5B. La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el mapeo del epítope del dominio extracelular de ErbB2 como se determinó mediante análisis mutante de truncamiento y mutagénesis dirigida al sitio (Nakamura et al. J. of Virology 67(10):6179-6191 [Oct 1993]; Renz et al. J. Cell Biol. 125(6):1395-1406 [Jun 1994]). Los MAbs 4D5 y 3H4 anti-proliferativo enlazan adyacentes al dominio transmembrana. Los distintos truncamientos ErbB2-ECD o mutaciones puntuales se prepararon a partir de cADN utilizando tecnología de reacción de cadena de polimerasa. Los mutantes ErbB2 se expresaron como proteínas de fusión gD en un plásmido de expresión mamífera. Este plásmido de expresión utiliza el promotor/mejorador citomegalovirus con terminación SV40 y señales de poliadenilación ubicadas después del cADN insertado. Se transfectó ADN plásmido en células 293S. Un día después de la transfección, las células fueron etiquetadas metabólicamente durante la noche en metionina y libre de cisteína, bajo glucosa DMEM conteniendo 1% de suero bovino fetal dializado y 25 \muCi cada uno de ^{35}S metionina y ^{35}S cisteína. Se recogieron los sobrenadantes tanto de ErbB2 MAbs o se añadieron anticuerpos de control al sobrenadante y se incubó 2-4 horas a 4ºC. Se precipitaron los complejos, se aplicaron a un gel de gradiente 10-20% Tricine SDS y se realizó electroforesis a 100 V. El gel fue electrotransferido sobre una membrana y se analizaron mediante autoradiografía. SEQ ID NOs: 8 y 9 representan los epítopes 3H4 y 4D5, respectivamente.

La Figura 2 representa con subrayado la secuencia de aminoácido del Dominio 1 de ErbB2 (SEQ ID NO: 1). Los aminoácidos en negrita indican la ubicación del epítope reconocido mediante MAbs 7C2 y 7F3 como se determinó mediante mapeo de supresión, es decir el "epítope 7C2/7F3" (SEQ ID NO: 2).

La Figura 3 es un gráfico del anticuerpo anti-ErbB2 (HERCEPITN®) concentración mínima en suero (\mug/ml, media \pm SE, círculos oscuros) por semana desde la semana 2 hasta la semana 36 para los pacientes que sobreexpresan ErbB2 tratados con HERCEPTIN® anticuerpo anti-ErbB2 una 4 mg/kg dosis inicial, seguida por 2 mg/kg semanalmente. El número de pacientes en cada punto de tiempo está representado por "n" (cuadrados blancos).

La Figura 4A es un diagrama lineal de los cambios de volumen del tumor en el tiempo en ratones tratados con HERCEPTIN® anticuerpo anti-ErbB2. La Figura 4B es un diagrama semi-logarítmico de los mismos datos que en la Figura 4A de forma tal que la variación en el volumen del tumor para los animales tratados se observa más fácilmente.

Las Figuras 5A y 5B representa alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios liviano variable (V_{L}) (la Figura 5A) y pesado variable (V_{H}) (la Figura 5B) de anticuerpo monoclonal murina 2C4 (SEQ ID Nos. 10 y 11, respectivamente); dominios V_{L} y V_{H} de Fab humanizado versión 574 (SEQ ID Nos. 12 y 13, respectivamente), y marcos de trabajo consensuado humano V_{L} y V_{H} (hum \kappal, subgrupo kappa liviano I; humIII, subgrupo pesado III) (SEQ ID Nos. 14 y 15, respectivamente). Los asteriscos identifican diferencias entre Fab humanizado versión 574 y anticuerpo monoclonal murina 2C4 o entre Fab humanizado versión 574 y el marco de trabajo humano. Las Regiones que Determinan Complementariedad (CDRs) están entre paréntesis. Fab humanizado versión 574, con los cambios ArgH7lVal, AspH73Arg y IleH69Leu, aparece habiendo restaurado el enlace con el del fragmento 2C4 Fab quimérico original. FR adicional y/o residuos CDR, tales como L2, L54, L55, L56, H35 y/o H48, pueden ser modificados (por ejemplo sustituidos como sigue - IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; y ValH48Ile) para refinar adicionalmente o mejorar el enlazado del anticuerpo humanizado. Alternativamente, o adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede ser madurado por afinidad para mejorar adicionalmente o refinar su afinidad y/u otras actividades biológicas.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Un "receptor ErbB" es un receptor de proteína tirosina quinasa que pertenece a la familia del receptor ErbB receptor e incluye receptores EGFR, HER2, ErbB3 y ErbB4 así como TEGFR (Patente US No. 5.708.156) y otros miembros de esta familia a ser identificados en el futuro. El receptor ErbB generalmente comprenderá un dominio extracelular, que puede enlazar un ligando ErbB; un dominio transmembrana lipofílico; un dominio de quinasa tirosina intracelular conservado; y un dominio que señaliza un carboxil-terminal que alberga diversos residuos tirosina que pueden ser fosforilados. El receptor ErbB puede ser una secuencia nativa del receptor ErbB o una variante de secuencia de aminoácido del mismo. Preferentemente el receptor ErbB es secuencia nativa de ErbB receptor humano.

Los términos "ErbB1", "receptor epidérmico de factor de crecimiento" y "EGFR" se utilizan aquí de forma intercambiable y se refieren a la secuencia nativa EGFR como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluyendo variantes del mismo (por ejemplo un EGFR mutante de supresión como en Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbB1 se refiere al gen que codifica el producto proteína EGFR. Ejemplos de anticuerpos que enlazan EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (ver, Patente US No. 4.943.533, Mendelsohn et al.) y variantes del mismo, tal como 225 quimerizado (C225) y 225 humano reformado (H225) (ver, el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.).

"ErbB3" y "HER3" se refieren al receptor polipéptido como se describió, por ejemplo, en las patentes US 5.183.884 y 5.480.968 así como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989), incluyendo variantes del mismo. Ejemplos de anticuerpos que enlazan HER3 se describen en la Patente US 5.968.511 (Akita y Sliwkowski), por ejemplo el anticuerpo 8B8 (ATCC HB 12070) o una variante humanizada del mismo.

Aquí los términos "ErbB4" y "HER4" se refieren al receptor polipéptido como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente EP 0 599 274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), incluyendo variantes del mismo tal como las isoformas HER4 descritas en el documento WO 99/19488.

Los términos "HER2", "ErbB2" "c-Erb-B2" se utilizan de forma intercambiable. A menos que se indique otra cosa, los términos "ErbB2" "c-Erb-B2" y "HER2" cuando se utilizan aquí se refieren a la proteína humana, y "erbB2", "c-erb-B2", y "her2" se refieren al gen humano. El gen ErbB2 humano y la proteína ErbB2 son, por ejemplo, descritos en Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Genebank accession number X03363). ErbB2 comprende cuatro dominios (Dominios 1-4).

El "epítope 4D5" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se enlaza el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463). Este epítope está próximo a la región transmembrana de ErbB2. Para filtrar los anticuerpos que se enlaza al epítope 4D5, puede realizarse un ensayo de rutina de aclareo transversal tal como el descrito en Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, el mapeo del epítope puede realizarse (ver la Figura 1) para determinar si el anticuerpo se enlaza al epítope 4D5 de ErbB2 (por ejemplo cualquiera o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 529, por ejemplo aproximadamente el residuo 561 hasta aproximadamente el residuo 625, inclusive).

El "epítope 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se enlaza el anticuerpo 3H4. Este epítope se muestra en la Figura 1, e incluye residuos desde aproximadamente 541 hasta aproximadamente 599, inclusive, en la secuencia de aminoácido del dominio extracelular ErbB2.

El "epítope 7C2/7F3" es la región en el N-terminal del dominio extracelular de ErbB2 al cual se enlazan los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositado con el ATCC, ver a continuación). Para filtrar los anticuerpos que se enlazan al epítope 7C2/7F3, puede realizarse un ensayo de rutina de bloqueo transversal tal como el descrito en Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, el mapeo del epítope puede realizarse para establecer si el anticuerpo se enlaza con el epítope 7C2/7F3 sobre ErbB2 (por ejemplo cualquiera o más de los residuos en la región desde aproximadamente el residuo 22 hasta aproximadamente el residuo 53 de ErbB2; SEQ ID NO: 2).

El término "induce muerte celular" o "capaz de inducir muerte celular" se refiere a la habilidad del anticuerpo para hacer que una célula viable se vuelva no viable. Aquí la "célula" es una que expresa el receptor ErbB2, especialmente cuando la célula sobreexpresa el receptor ErbB2. Una célula que "sobreexpresa" ErbB2 tiene niveles significativamente más altos que el ErbB2 normal comparada con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Preferentemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo una célula de mama, ovárica, del estómago, endometrial, de glándula salival, de pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreática o de la vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vitro puede ser determinada en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad celular dependiente anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por lo tanto, en ensayo para la muerte celular puede ser realizado utilizando suero inactivado por calor (por ejemplo en ausencia del complemento) y en la ausencia de las células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de la integridad de membrana como se evalúa mediante absorción de ioduro de propidio (PI), azul de tripano (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 [1995]) o 7AAD puede determinarse respecto a las células no tratadas. Los anticuerpos que inducen la muerte celular preferidos son aquellos que inducen la absorción PI en el "ensayo de absorción de PI en células BT474".

La frase "induce apoptosis" o "capaces de inducir apoptosis" se refiere a la habilidad del anticuerpo para inducir la muerte celular programada como se determinó mediante enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación celular, y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apoptoticos). La célula es una que sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferentemente la "célula" es una célula tumoral, por ejemplo una célula de mama, ovárica, del estómago, endometrial, de glándula salival, de pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreática o de la vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o célula SKOV3. Están distintos procedimientos para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse mediante enlace anexina; la fragmentación de ADN puede ser evaluada a través de escalonamiento de ADN como se describe aquí en el ejemplo; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN puede ser evaluada mediante cualquier incremento en células hipodiploides. Preferentemente, el anticuerpo que induce la apoptosis es uno que resulta en aproximadamente 2 a 50 veces, preferentemente aproximadamente 5 a 50 veces, y aún más preferentemente aproximadamente 10 a 50 veces, inducción de enlace anexina respecto a células no tratadas "ensayo de enlace utilizando células BT474" (ver a continuación).

Algunas veces el anticuerpo pro-apoptótico será uno que bloquea el enlace/activación HRG del complejo ErbB2/
ErbB3 (por ejemplo anticuerpo 7F3). En unas situaciones, el anticuerpo es uno que no bloquea significativamente la activación del complejo del receptor ErbB2/ErbB3 mediante HRG (por ejemplo 7C2). Además, el anticuerpo puede ser uno como 7C2 que, mientras induce apoptosis, no induce una gran reducción en el porcentaje de células en fase S (por ejemplo uno que sólo induce aproximadamente 0-10% de reducción en el porcentaje de estas células respecto al control).

El anticuerpo de interés puede ser uno como 7C2 que se enlaza específicamente al ErbB2 humano y no reacciona de forma cruzada significativamente en otras proteínas tal como aquellos codificados mediante los genes erbB1, erbB3 y/o erbB4. Algunas veces, el anticuerpo puede no reaccionar significativamente de forma cruzada con la proteína de ratón neu, por ejemplo, como se describió en Schecter et al. Nature 312:513 (1984) y Drebin et al., Nature 312:545-548 (1984). En dichas realizaciones, la extensión del enlace del anticuerpo a estas proteínas (por ejemplo, superficie celular enlazando a un receptor endógeno) será menos de aproximadamente el 10% como se determinó mediante análisis de clasificación de células de fluorescencia activada (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA).

"Heregulina" (HRG) cuando se utiliza aquí se refiere a un polipéptido que activa los complejos ErbB2-ErbB3 y proteína ErbB2-ErbB4 (por ejemplo induce la fosforilación de residuos tirosina en el complejo al unirse al mismo). Varios polipéptidos heregulina abarcados por este término se describen en Holmes et al., Science, 256:1205-1210(1992); el documento WO 92/20798; Wen et al., Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919(1994); y Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993), por ejemplo. El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido naturalmente producido HRG, tal como un fragmento de dominio a modo de EGF del mismo (por ejemplo HRG\beta1_{177-244}).

El "complejo de proteína ErbB2-ErbB3" y "complejo de proteína ErbB2-ErbB4" son oligómeros no covalentemente asociados del receptor ErbB2 y el receptor ErbB3 o receptor ErbB4, respectivamente. Los complejos se forman cuando una célula que expresa ambos de estos receptores se expone a HRG y puede ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizada mediante SDS-PAGE como se describió en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994).

"Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas a modo de anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producidos a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles incrementados por los mielomas.

"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativas" usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y liviana también tiene puentes disulfuro intracadenas regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena liviana está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena liviana está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios de cadena liviana y pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Ésta está concentrada en tres segmentos llamados regiones que determinan la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena livina y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas la región marco (FR). Los dominios variables de cadenas nativas pesadas y livianas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran parte una configuración de hoja \beta, conectado mediante tres CDRs, que forma bucles que conectan, y en algunos casos formando parte de, la estructura de hoja \beta. Los CDRs en cada cadena se sostienen juntos en gran proximidad mediante los FRs y, con los CDRs de otra cadena, contribuye a la formación del sitio de unión de antígeno y anticuerpos (ver Kabat et al., NIH Publ. No.91-3242, Vol. I, pages 647-669 [1991]). Los dominios constantes no están implicados directamente en enlazar un anticuerpo a un antígeno, pero exhibe distintas funciones de efector, tal como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión de antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión de antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de enlace cruzado con el antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de enlace antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena liviana en asociación firme, no covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, los seis CDRs confieren especificidad de enlace al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y enlazar un antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de enlace entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1) de cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab mediante la adición de unos pocos residuos en el carboxil terminal del dominio de cadena pesada CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es aquí la designación para Fab' en el cual el residuo(s) cisteína de los dominios constantes soporta un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Las "cadenas livianas" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basado en las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes.

Dependiendo en la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse inmunoglobulinas a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas pueden ser además divididas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamadas \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases son bien conocidas.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos bispecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo en tanto éstos exhiban la actividad biológica deseada.

"Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente el enlace antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturalmente producidas que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Por otra parte, en contraste con preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluye diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que son sintetizados mediante el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse requiriendo la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar pueden realizarse mediante el primer procedimiento de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o puede hacerse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente U.S. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Aquí, los anticuerpos monoclonales específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados a partir de especies particulares o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a secuencias correspondiente en anticuerpos derivados a partir de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto que éstos exhiban la actividad biológica deseada (Patente U.S. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos que enlazan antígenos) que contienen la secuencia mínima derivada a partir de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en el cual residuos a partir de una región determinante complementaria (CDR) del recipiente son reemplazadas por residuos a partir de CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos ejemplos, residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por correspondientes residuos no humanos. Por otra parte, anticuerpos humanizados puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo recipiente ni en el CDR importado o secuencias marco. Estas modificaciones se realizan para refinar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos un, y típicamente dos, dominios variable, en el cual todos o sustancialmente todos los CDRs corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM} donde la región de enlace del antígeno-binding del anticuerpo es derivada a partir de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.

"Cadena única Fv" o fragmentos de anticuerpo "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv además comprende un polipéptido de enlace entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el sFv forme la estructura deseada para el enlace del antígeno. Para una revisión de sFv ver Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena liviana (V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H} - V_{L}). Utilizando un enlace que es demasiado corto para permitir en emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos son descritos de forma más completa en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más del 95% en peso del anticuerpo como determina el procedimiento Lowry, y aún más preferentemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o secuencia de aminoácido interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta una homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul Coomassie o, preferentemente, tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante al menos una etapa de purificación.

Como se emplea aquí, el término "epítope de enlace receptor salvaje" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}) que es responsable de incrementar el período de suero in vivo de molécula la IgG.

"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen a aquellos ya con el desorden así como aquellos en los que el desorden debe prevenirse.

"Mamífero" para el propósito del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, de deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.

Un "desorden" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo anti-ErbB2. Esto incluye desórdenes o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. Ejemplos no limitativos de desórdenes a tratar incluyen aquí tumores benignos y malignos; leucemias y malignidades linfoides; desórdenes neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y de blastocele; y desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se utiliza para referirse a una cantidad que tiene efecto antiproliferativo. Preferentemente, la cantidad terapéuticamente efectiva tiene actividad apoptótica, o es capaz de inducir la muerte celular, y preferentemente muerte de células tumorales benignas o malignas, en particular células de cáncer. La eficacia puede ser medida en formas convencionales, dependiendo de la condición a ser tratada. Para terapia del cáncer, la eficacia puede, por ejemplo, medirse determinando el tiempo de progresión de la enfermedad (TTP), o determinando las tasas de respuesta (RR) (ver Ejemplo 1, a continuación). La cantidad terapéuticamente efectiva también se refiere a una concentración de suero objetiva, tal como una concentración mínima en suero, esto se ha mostrado que es efectivo para suprimir los síntomas de la enfermedad cuando se mantiene durante un período de tiempo.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está típicamente caracterizada por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "agente citotóxico" como se emplea aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células. El término se propone para incluir isótopos radioactivos (por ejemplo I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de plantas o animales, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN^{TM}); alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, mecloretamina óxido hidrocloruro, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracil; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliceamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; purina analogs tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; replenedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofillinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanium; ácido tenuazonico; triaziquona; 2, 2',2''-triclorovietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También incluídos en esta definición están agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como anti-estrógenos incluyendo por ejemplo tamoxifen, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazolas, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de que cáncer sobreexpresa ErbB2 tanto in vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento es uno que significativamente reduce el porcentaje de células que sobreexpresan ErbB2 en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar u otro de la fase S), tales como agentes que inducen detención de G1 y detención de fase M. Los bloqueadores clásicos de fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), TAXOL®, e inhibidores topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen el G1 también se derraman sobre la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil, y ara-C. Puede encontrarse información adiciona en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, y antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especial-
mente p. 13. El anticuerpo 4D5 (y equivalentes funcionales del mismo) también pueden emplearse para este propósito.

"Doxorubicina" es un antibiótico atraciclina. El nombre químico completo de doxorubicina is (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-
naftacenediona.

El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y hormonas polipéptido tradicionales. Incluidas entre las citoquinas está la hormona de crecimiento tal como la hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionil, y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteínas tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante tiroidea (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factor-\alpha y -\beta de necrosis de tumor; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crecimiento nerviosos tales como NGF-\beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformadores (TGFs) tales como TGF-\alpha y TGF-\beta; factor de crecimiento similar a la insulina -I y -II; eritropoietina (EPO); factores osteoinductivos; interferonas tales como interferon-\alpha, -\beta, y -\gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs) tales como macrófagos-CSF (M-CSF); granulocito-macrófage-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (ILs) tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-\alpha o TNF-\beta; y otros factores polipéptidos incluyendo LIF y equipo ligando (KL). Como se emplea aquí, el término citoquina incluye proteínas a partir de fuentes naturales o a partir de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

El término "promedicamento" como se utiliza en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células del tumor comparada con el medicamento base y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma base más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los promedicamentos incluyen, pero no están limitados a, promedicamentos que contienen fosfato, promedicamentos que contienen tiofosfato, promedicamentos que contienen sulfato, promedicamentos que contienen péptido, promedicamentos de D-aminoácido-modificado, promedicamentos glicosilados, promedicamentos que contienen \beta-lactamo, opcionalmente promedicamentos que contienen fenoxiacetamida sustituida u opcionalmente promedicamentos que contienen fenilacetamida sustituida, promedicamentos 5-fluorocitosina y otras 5-fluorouridina que pueden ser convertidos en el medicamento libre del citotóxico más activo. Ejemplos de medicamentos citotóxicos que pueden ser derivados en un promedicamento incluyen, pero no están limitados a, aquellos agentes quimioterapéuticos antes descritos.

Mediante "fase sólida" se indica una matriz no acuosa a la cual los anticuerpos utilizados según la presente descripción pueden adherirse. Ejemplos de fases sólidas abarcados aquí incluyen aquellos formados parcialmente o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otros es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como aquellas descritas en la Patente U.S. 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que es útil para el suministro de un medicamento (tal como el anticuerpo anti-ErbB2s aquí descrito y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes de la liposoma son comúnmente dispuestos en una formación bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.

El término "inserción de envase" se utiliza para referirse a instrucciones acostumbradamente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de dichos productos terapéuticos.

El término "concentración del suero", "concentración del medicamento en suero", o "concentración en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®" se refiere a la concentración de un medicamento, tal como anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®, en el suero sanguíneo de un animal o paciente humano que se está tratando con el medicamento. Concentración en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, por ejemplo, preferentemente es determinada mediante inmunoensayo. Preferentemente, el inmunoensayo es un ELISA según el procedimiento aquí descrito.

El término "concentración pico de suero" se refiere a la concentración máxima de medicamento en el suero poco después del suministro del medicamento en el animal o paciente humano, después que el medicamento se ha distribuido a través de todo el sistema sanguíneo, pero antes que se haya producido una distribución significativa en el tejido, metabolismo o excreción de medicamento por parte del cuerpo.

El término "concentración mínima en suero" se refiere a la concentración de medicamento en suero en un momento después del suministro de una dosis previa e inmediatamente antes del suministro de la próximas dosis posteriores de medicamento en una serie de dosis. Generalmente, la concentración mínima en suero es una concentración de medicamento mínima de eficacia sostenida en la serie de administraciones de medicamento. También, la concentración mínima en suero frecuentemente es apuntada como una concentración mínima en suero para tener eficacia porque representa la concentración en suero a la cual otra dosis de medicamento debe administrarse como parte del régimen del tratamiento. Si el suministro del medicamento es mediante administración intravenosa, la concentración mínima en suero es aún más preferentemente lograda dentro de 1 día de una carga inicial delantera de suministro de medicamento. Si el suministro del medicamento es mediante administración subcutánea, el pico de concentración en suero es preferentemente logrado en 3 días o menos. Según la descripción, la concentración mínima en suero es preferentemente lograda en 4 semanas o menos, preferentemente 3 semanas o menos, más preferentemente 2 semanas o menos, aún más preferentemente en 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos utilizando cualquiera de los procedimientos de suministro de medicamento aquí descritos.

El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un medicamento dentro de la vena de un animal o paciente humano durante un período de tiempo mayor de aproximadamente 5 minutos, preferentemente entre aproximadamente 30 a 90 minutos, aunque, una infusión intravenosa es alternativamente administrada durante 10 horas o menos.

El término "bolo intravenoso" o "empuje intravenoso" se refiere a una administración de medicamento dentro de una vena de un animal o humano de forma tal que el cuerpo recibe el medicamento en aproximadamente 15 minutos o menos, preferentemente en 5 minutos o menos.

El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un medicamento bajo la piel de un animal o paciente humano, preferiblemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante un suministro relativamente lento, sostenido a partir de un receptáculo de medicamento. El bolsillo puede crearse pellizcando o levantando y separando la piel del tejido subyacente.

El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un medicamento bajo la piel de un animal o paciente humano, preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante un suministro relativamente bajo, sostenido a partir de un receptáculo de medicamento durante un período de tiempo incluyendo, pero no limitado a, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión puede realizarse mediante implantación subcutánea de una bomba de suministro de medicamento implantada bajo la piel del animal o paciente humano, donde la bomba suministra una cantidad predeterminada de medicamento durante un período de tiempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos, o un período de tiempo que abarca la longitud del régimen del tratamiento.

El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del medicamento por debajo de la piel de un animal o paciente humano, donde el bolo de suministro de medicamento es preferentemente menos de aproximadamente 15 minutos, más preferentemente menos de 5 minutos, y aún más preferentemente menos de 60 segundos. La administración es preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, donde el bolsillo se crea, por ejemplo, pellizcando y separando la piel del tejido subyacente.

El término "carga frontal" cuando se refiere a la administración del medicamento se usa para describir una dosis inicialmente alta seguida por la misma o dosis menores a intervalos. La o las dosis iniciales mayores significan incrementar más rápidamente la concentración de medicamento en el suero del animal o paciente humano hasta una concentración en suero objetiva eficaz. La carga frontal se logra mediante una dosis inicial o dosis suministrada durante las tres semanas o menos que produce que la concentración en suero del animal o paciente para alcanzar una concentración mínima objetivo en suero. Preferentemente, la dosis inicial de carga frontal o serie de dosis es administrada en dos semanas o menos, más preferentemente en 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos. Aún más preferentemente, donde la dosis inicial es una dosis única y no es seguida por dosis posteriores de mantenimiento durante al menos 1 semana, la dosis inicial se administra en 1 día o menos. Donde la dosis inicial es una serie de dosis, cada dosis está separada por al menos 3 horas, pero no más de 3 semanas o menos, preferentemente 2 semanas o menos, más preferentemente 1 semana o menos, aún más preferentemente 1 día o menos. Para evitar una reacción inmune adversa a un medicamento anticuerpo tal como un anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, HERCEPTIN® anticuerpo anti-ErbB2) en un animal o paciente que no ha sido tratado previamente con el anticuerpo, puede ser preferible suministrar una dosis inicial del anticuerpo mediante infusión intravenosa. La presente descripción incluye el suministro de una carga frontal inicial de medicamento y dosis de mantenimiento mediante infusión o administración de bolos, intravenosa o subcutáneamente.

Información publicada relativa a los anticuerpos anti-ErbB2 se incluye en las siguientes patentes publicadas y solicitudes publicadas: PCT/US89/00051 (WO89/06692) publicada el 5 de Enero de 1989; PCT/US90/02697
(WO90/14357) publicada el 18 de Mayo de 1990; EU 0474727 publicada el 23 de Julio de 1997; DE 69031120.6, publicada el 23 de Julio de 1997; PCT/US97/18385 (WO98/17797), publicada el 9 de Octubre de 1997; SA 97/9185, publicada el 14 de Octubre de 1997; US 5677171, publicada el 14 de Octubre de 1997; US 5720937, publicada el 24 de Febrero de 1998; US 5720954, publicada el 24 de Febrero de 1998; US 5725856, publicada el 10 de Marzo de 1998; US 5770195, publicada el 23 de Junio de 1998; US 5772997, publicada el 30 de Junio de 1998; PCT/US98/2626 (WO98/5514) publicada el 10 de Diciembre de 1998; y PCT/US99/06673 (WO99/48527) publicada el 26 de Marzo de 1999.

II. Producción de anticuerpo anti-ErbB2s

A continuación se proporciona una descripción en cuanto a técnicas ejemplares para la producción de anticuerpos utilizados según la presente descripción. El antígeno ErbB2 a utilizar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una porción del mismo, conteniendo el epítope deseado. Alternativamente, pueden utilizarse células que expresan ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo NIH-3T3 células transformadas para sobreexpresar ErbB2; o una línea celular de carcinoma tal como células SKBR3, ver Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 [1991]) para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos será evidente para aquellos entendidos en la técnica.

(i) Anticuerpos Policlonales

Los anticuerpos policlonales son preferentemente elevados en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmmunogénica en la especie a ser inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizador, por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son diferentes grupos alquilo.

Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados mediante combinación, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratas, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund's e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. 7 a 14 días más tarde los animales son sangrados y se realiza en ensayo del suero para el título del anticuerpo. Los animales son reforzados hasta la meseta del título. Preferentemente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de enlace cruzado diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo de células recombinante como fusiones de proteína. También, agentes de agregación tales como alumbre son adecuadamente utilizados para mejorar la respuesta inmune.

(ii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturalmente producidas que pueden estar presentes en menores cantidades. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse utilizando el procedimiento hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse mediante procedimientos de ADN recombinante (Patente U.S. 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describió con anterioridad para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente se enlazarán a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse los linfocitos in vitro. Los linfocitos se fusionan entonces con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietileno glicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 [Academic Press, 1986]).

Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las no fusionadas, células de mieloma parental. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirán hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), dichas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan el alto nivel de producción estable de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares mieloma preferidas son líneas de mieloma murina, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles a partir del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles a partir del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 [Marcel Dekker, Inc., New York, 1987]).

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma es determinado mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de enlace in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de enzima unida inmunoabsorbente (ELISA).

La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después que las células de hibridoma son identificadas que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante la limitación de los procedimientos de dilución y crecimiento mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 [Academic Press, 1986]). Medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados mediante los subclones son adecuadamente separados a partir del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía por afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de anticuerpos murina). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado dentro de vectores de expresión, que son entonces transfectados en células huésped tal como células E. coli, células de simio COS, células de ovario de hámster Chino (CHO), o células mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. Artículos de estudio sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

En una realización adicional, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de bibliotecas de fagos anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describe en aislamiento de anticuerpos murina y humano, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de alta afinidad (rango nM) de anticuerpos humanos mediante mezclado de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 [1992]), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 [1993]). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de anticuerpos monoclonales de hibridoma para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación para dominios constantes para cadena pesada y liviana humanos en lugar de las secuencias de murina homólogas (Patente U.S. 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 [1984]), o mediante la unión covalente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina de todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina.

Típicamente dichos polipéptidos no inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.

(iii) Anticuerpos Humanizados y Humanos

Procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos dentro de él a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia son referidos como residuos "importados", que típicamente son tomados a partir de un dominio variable "importado". La humanización esencialmente puede ser realizada siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 [1988]), sustituyendo secuencias CDRs o CDR de roedor para las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente U.S. 4.816.567) donde sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la correspondiente secuencia a partir de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, tanto liviano como pesado, para utilizar en realizar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento llamado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor defendida contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que es la más cercana al a del roedor se acepta entonces como la región de marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Otro procedimiento usa una región particular de marco derivada a partir de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas livianas o pesadas. El mismo marco puede ser usado para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 [1993]).

Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un procedimiento preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y distintos productos conceptuales humanizados usando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizada. Modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos entendidos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras tridimensionales conformacionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas muestras permite el análisis del rol probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, por ejemplo, el análisis de residuos que influencia la habilidad del candidato inmunoglobulina para enlazar a su antígeno. De esta forma, los FR residuos pueden ser seleccionados y combinados a partir del recipiente y importar secuencias de forma que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para el antígeno(s) diana. En general, los CDR residuos están directa y muy sustancialmente implicados en influenciar el enlace del antígeno.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, mediante inmunización, de producir un completo repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal resulta en la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del gen de inmunoglobulina germinal humano dispuesto en dicho ratón mutante germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos ante la amenaza del antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993). También pueden derivarse anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de muestras de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1911); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 [1991]).

(iv) Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado distintas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 [1985]). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora producirse directamente mediante células huéspedes recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fagos de anticuerpos antes descritas. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH pueden ser directamente recuperados a partir de E. coli y químicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 [1992]). Según otra aproximación, fragmentos de F(ab')_{2} pueden ser aislados directamente a partir del cultivo de célula huésped recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el médico entendido. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv). Ver WO 93/16185.

(v) Anticuerpos Biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlazarse a dos epítopes diferentes de la proteína ErbB2. Por ejemplo, un brazo puede enlazar un epítope en el Dominio 1 de ErbB2 tal como el epítope 7C2/7F3, el otro puede enlazar un epítope ErbB2 diferente, por ejemplo el epítope 4D5. Otros tales anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace ErbB2 con sitio(s) de enlace para EGFR, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, un brazo anti-ErbB2 puede ser combinado con un brazo que enlaza a una molécula que acciona sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa ErbB2. Anticuerpos biespecífico también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos para células que expresan ErbB2. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace ErbB2 y un brazo que enlaza el agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferona-\alpha, vinca alcaloide, cadena de ricino A, metotrexato o hapteno isotopo radioactivo). Anticuerpos biespecífico pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecífico F(ab')_{2}). Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 [1983]). Debido al surtido al azar de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que es usualmente realizada mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Según una aproximación diferente, anticuerpos de dominio variables con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio necesario para el enlace de cadena liviana, presente en al menos una de las fusiones. ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena liviana de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y son cotransfectados dentro de un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando relaciones no iguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o para las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales resultan en altos rendimientos o cuando las relaciones no son de particular significado.

En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena liviana inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta aproximación se describe en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Según otra aproximación descrita en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser dirigida para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan para el cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácido de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más largas (por ejemplo tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena(s) lateral larga sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales largas de aminoácido con otras más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos enlazados cruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para apuntar células del sistema inmune a células no deseadas (Patente US No. 4.676.980), y para el tratamiento de infección por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse usando cualquier procedimiento de enlace cruzado conveniente. Los agentes de enlace cruzado son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente US 4.676.980, junto con un número de técnicas de enlace cruzado.

Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento donde anticuerpos intactos son rotos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos son reducidos en la presencia de agente ditiol que acompleja arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados son convertidos entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB es entonces reconvertido al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de los otros derivados Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Progresos recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden ser químicamente acoplados para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' fue secretado separadamente a partir de E. coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de enlazarse a células que sobreexpresan el Receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humano.

También se han descrito varias técnicas para realizar y aislar fragmentos biespecíficos de anticuerpo directamente a partir de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados con las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros del anticuerpo fueron reducidos en la región de bisagra para formar monómeros y luego re-oxidizados para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos biespecíficos de anticuerpo. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena liviana (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios complementarios V_{L} y V_{H} de otro fragmento, formando así dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos biespecíficos de anticuerpo mediante el uso de dímeros de cadena única Fv (sFv) también ha sido informada. See Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vi) Investigación para anticuerpos con las propiedades deseadas

Se han descrito técnicas para generar anticuerpos con anterioridad. Aquellos anticuerpos que tienen las características aquí descrita son seleccionados.

Para seleccionar los anticuerpos que inducen la muerte celular, la pérdida de la integridad de la membrana como se indica mediante, por ejemplo, PI, absorción de azul de tripano o 7AAD se determina respecto al control. El ensayo preferido es el "ensayo de absorción PI utilizando células BT474". Según este ensayo, células BT474 (que pueden ser obtenidas a partir de American Type Culture Collection [Rockville, MD]) son cultivadas en Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM):Ham's F-12 (50:50) suplementado con 10% FBS (Hyclone) térmicamente inactivado y 2 mM L-glutamina. (Así, el ensayo se realiza en ausencia de células de complemento y efector inmune). Las células BT474 son sembradas a una densidad de 3 x 10^{6} por plato en platos 100 x 20 mm y se dejan fijar durante la noche. Entonces se retira el medio y se reemplaza con medio fresco solo o medio conteniendo 10 \mug/ml del MAb apropiado. Las células son incubadas durante un período de tiempo de 3 días. Siguiendo a cada tratamiento, se lavan monocapas con PBS y se separan mediante tripsinización. Las células son entonces centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC, el gránulo es resuspendido en 3 ml de tampón de enlace enfriado en hielo Ca^{2+} (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl_{2}) y se realizan alícuotas en tubos de 35 mm con tapón de filtro 12 x 75 (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para extraer los grupos de células. Los tubos recibieron entonces PI (10 \mug/ml). Se pueden analizar muestras utilizando un citómetro de flujo FACSCAN^{TM} y software FACSCONVERT^{TM} CellQuest (Becton Dickinson). Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular como se determinó mediante absorción de PI son seleccionados.

Para seleccionar los anticuerpos que inducen apoptosis, está disponible un "ensayo de enlace utilizando células BT474". Las células BT474 son cultivadas y sembradas en platos como se discutió en el párrafo precedente. El medio se extrae a continuación y es reemplazado con medio fresco solamente o medio que contiene 10 \mug/ml de MAb. Siguiendo un período de incubación de tres días, se lavan monocapas con PBS y separadas mediante tripsinización. Entonces las células son centrifugadas, resuspendidas en tampón de enlace Ca^{2+} y se hacen alícuotas en tubos como se discutió anteriormente para el ensayo de muerte celular. Los tubos recibieron entonces anexina marcada (por ejemplo anexina V-FTIC) (1 \mug/ml). Se pueden analizar muestras utilizando un citómetro de flujo FACSCAN^{TM} y software FACSCONVERT^{TM} CellQuest (Becton Dickinson). Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de enlace de anexina respecto al control son seleccionados como anticuerpos inductores de apoptosis.

Además del ensayo de enlace de anexina, está disponible un "ensayo de coloración de ADN utilizando células BT474". Para realizar este ensayo, células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés como se describió en los dos párrafos precedentes son incubadas con 9 \mug/ml HOECHST 33342^{TM} durante 2 hr a 37ºC, luego analizadas en un citómetro de flujo EPICS ELITE^{TM} (Coulter Corporation) usando software MODFIT LT^{TM} (Verity Software House). Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que es 2 veces o mayor (y preferentemente 3 veces o mayor) que células no tratadas (hasta 100% de células apoptóticas) pueden ser seleccionadas como anticuerpos pro-apoptóticos utilizando este ensayo.

Para revisar los anticuerpos que se unen a un epítope sobre ErbB2 enlazado por un anticuerpo de interés, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, puede realizarse el mapeo del epítope mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Para identificar un anticuerpo anti-ErbB2s que inhibe el crecimiento de células SKBR3 en un cultivo celular mediante 50-100%, puede realizarse el ensayo SKBR3 descrito en el documento WO 89/06692. Según este ensayo, las células SKBR3 son cultivadas en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal, glutamina y penicilinestreptomicina. Las células SKBR3 son puestas en placas de 20.000 células en un plato de cultivo celular de 35 mm (2 mls/35 mm plato). 2.5 \mug/ml del anticuerpo anti-ErbB2is añadidos por plato. Después de seis días, el número de células, comparadas con las células no tratadas son contadas utilizando un contador celular electrónico COULTER^{TM}. Aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SKBR3 en un 50-100% son seleccionadas para la combinación con los anticuerpos apoptóticos como se deseaba.

(vii) Dirección de función del efector

Puede ser deseable modificar el anticuerpo respecto a la función del efector, para mejorar la efectividad del anticuerpo en tratar el cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, residuo(s) de cisteína pueden ser introducidos en la Región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o matanza celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) incrementadas. Ver Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también pueden prepararse utilizando enlazadores cruzados heterobifuncionales como se describió en Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede dirigirse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y puede así tener capacidades mejoradas de lisis de complemento y ADCC. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

(viii) Immunoconjugados

La descripción también pertenece a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo aquí descrito conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, o fragmentos de la misma), o un isotopo radioactivo (por ejemplo, un radioconjugado).

Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito con anterioridad. Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de la misma que pueden ser utilizados incluyen cadena A diftheria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de diftheria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricino, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionucléidos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-ErbB2 radioconjugados. Los ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico son realizados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutareldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tales como toliene 2,6-diisocianato), y compuestos flúor bis-activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por ejemplo, una inmunotoxina ricino puede ser preparada como se describió en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminepentaacético carbon-14-marcado (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplificador para la conjugación de radionucleótido para el anticuerpo. Ver el documento WO 94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre-dirigir el tumor donde el anticuerpo -receptor conjugado se administra al paciente, seguido por la extracción del conjugado no enlazado de la circulación usando un agente de vaciado y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).

(ix) Inmunoliposomas

Estos anticuerpos anti-ErbB2 aquí descritos también pueden ser formulados como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y las patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Liposomas con tiempo de circulación mejorado son descritos en la Patente U.S. 5.013.556.

Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el procedimiento de evaporación de fase reversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina PEG-derivatizada (PEG-PE). Los liposomas son extrudidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a las liposomas como se describió en Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico es opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19)1484 (1989).

(x) Terapia de Promedicamento Mediada por Enzima Dependiente de Anticuerpo (ADEPT)

El anticuerpo también puede utilizarse en ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima activadora del promedicamento que convierte un promedicamento (por ejemplo un agente peptidil quimioterapéutico, ver el documento WO 81/01145) en un medicamento anti-cáncer activo. Ver, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la Patente U.S. 4.975.278.

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El componente de la enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un promedicamento en una forma tal para convertirlo en su forma más activa, citotóxica.

Enzimas que son útiles en el procedimiento incluyen, pero no están limitados a, fosfatasa alcalina útil para convertir los promedicamentos fosfato que contienen en medicamentos libres; arilsulfatasa útil para convertir los promedicamentos sulfato que contienen en medicamentos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el medicamento anti-cáncer, 5-fluorouracil; proteasas, tal como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir los promedicamentos péptido que contienen en medicamentos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útil para convertir promedicamentos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que separan carbohidrate tales como \beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir promedicamentos glicosilados en medicamentos libres; \beta-lactamasa útil para convertir medicamentos derivados con \beta-lactamos en medicamentos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir medicamentos derivados en sus amino nitrógenos con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en medicamentos libres. Alternativamente, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden usarse para convertir los promedicamentos en medicamentos libres activos (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 [1987]). Pueden prepararse conjugados anticuerpo-abzima como se describe aquí para el suministro de la abzima a una población celular tumoral.

Las enzimas pueden estar covalentemente enlazadas al anticuerpo anti-ErbB2 mediante técnicas bien conocidas en la técnica tal como el uso de reactivos reticulados heterobifuncionales antes comentados. Alternativamente, proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antígeno de un anticuerpo enlazado al menos a una porción funcionalmente activa de una enzima puede ser construida utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 [1984]).

(xi) Fusiones de epítope de enlace de anticuerpo-receptor salvaje

En ciertas realizaciones, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo, más que un anticuerpo intacto, para incrementar la penetración en el tumor, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para incrementar su vida media en suero. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante incorporación de un epítope de enlace receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo mediante mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítope en un a etiqueta péptido que entonces se fusiona con el fragmento de anticuerpo en cada extremo o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o péptido).

Un procedimiento sistemático para preparar dicha variante de anticuerpo que tiene una vida media in vivo incrementada que comprende diversas etapas. La primera implica identificar la secuencia y conformación de uno epítope de enlace receptor salvaje de una Región Fc de una molécula IgG. Una vez que este epítope es identificado, la secuencia del anticuerpo de interés se modifica para incluir la secuencia y conformación del epítope de enlace identificado. Después la secuencia es mutada, la variante de anticuerpo se comprueba para ver si tiene una vida media in vivo más largo que aquel del anticuerpo original. Si la variante de anticuerpo no tiene una media in vivo más larga con la comprobación, su secuencia es adicionalmente alterada para incluir la secuencia y conformación del epítope de enlace identificado. El anticuerpo alterado se comprueba para vida media in vivo más larga, y este proceso continúa hasta que se obtiene una molécula que exhibe una vida media in vivo más larga.

El epítope de enlace receptor salvaje siendo así incorporado en el anticuerpo de interés es cualquier epítope adecuado como se definió anteriormente y su naturaleza dependerá, por ejemplo, del tipo de anticuerpo que se modifica. La transferencia se realiza de forma tal que el anticuerpo de interés todavía posee las actividades biológicas aquí descritas.

El epítope preferentemente constituye una región donde cualquiera o más residuos aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc son transferidos a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Aún más preferentemente, son transferidos tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio Fc. Aún más preferidos, el epítope se toma del dominio CH2 de la Región Fc (por ejemplo, de un IgG) y transferidos a la región CH1, CH3, o V_{H}, o más de una región como tal, del anticuerpo. Alternativamente, el epítope se toma del dominio CH2 de la Región Fc y se transfiere a la región C_{L} o región V_{L}, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

En una realización más preferida, el epítope de enlace receptor salvaje comprende la secuencia (5' a 3'): PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:3), y opcionalmente además comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo consistente en HQSLGTQ (SEQ ID NO:4), HQNLSDGK (SEQ ID NO:5), HQNISDGK (SEQ ID NO:6), o VISSHLGQ (SEQ ID NO:7), particularmente donde el fragmento de anticuerpo es un Fab o F(ab')_{2}. En otra realización más preferida, el epítope de enlace receptor salvaje es un polipéptido conteniendo la(s) secuencia(s) (5' a 3'): HQNLSDGK (SEQ ID NO:5), HQNISDGK (SEQ ID NO:6), o VISSHLGQ (SEQ ID NO:7) y la secuencia: PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:3).

(xii) Purificación del anticuerpo anti-ErbB2

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los restos de partículas, tanto células huésped o fragmentos lisados, es extraído, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, pasta celular es decongelada en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden ser extraídos mediante centrifugación. Donde el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes a partir de dichos sistemas de expresión son preferentemente primero concentrados utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de las etapas precedentes para inhibir proteolisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de células puede ser purificada utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio inmunoglobulina Fc que es presente en el anticuerpo. La proteína A pueden utilizarse para purificar anticuerpos que son basados en cadena pesadas humana \gamma1, \gamma2, o \gamma4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 [1983]). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 [1986]). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une es más frecuentemente agarosa, pero otras matrices están disponibles. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenedivinil)benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tal como fraccionamiento sobre una columna de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografía sobre sílica, cromatografía sobre heparina, cromatografía SEPHAROSE^{TM} sobre una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatofocalización, SDS-PAGE, y precipitación en sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

Siguiendo cualquier etapa(s) preliminar de purificación, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH usando una elución tampón a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferentemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo desde aproximadamente 0-0,25M sal).

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III. Determinación de concentración de anticuerpo anti-ErbB2 en suero

El siguiente ensayo no limitativo es útil para determinar la presencia y cuantificar la cantidad de rhuMAb HER2 específico (anticuerpo monoclonal humanizado anti-p185^{HER2}, incluyendo anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®) en un fluido corporal de un mamífero incluyendo, pero no limitado a, suero, fluido amniótico, leche, suero del cordón umbilical, líquidos oculares acuoso y vítreo, y gel ocular vítreo.

Ensayo de Actividad de Enlace en Placa para Anticuerpo monoclonal rhuMAb HER2 (Humanizado Anti-p185^{HER2})

El procedimiento de ensayo de rhuMAb HER2 aquí descrito se indica como un ejemplo de dicho procedimiento y no se indica como limitativo. Una preparación estandarizada de rhuMAb HER2 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA), controles, y muestras de suero fueron diluidos con Diluyente de Ensayo (PBS/0,5% BSA/0,05% Polysorbate 20/0,01% Thimerosal). Las diluciones de rhuMAb HER2 estandarizadas fueron preparadas para abarcar un rango de concentraciones útil para una curva estándar. Las muestras fueron diluidas para entrar dentro de la curva estándar.

Una alícuota de Revestimiento Antígeno en tampón de revestimiento (p 185^{HER2} recombinante (Genentech, Inc.) en 0,05 M carbonato de sodio tampón) se añadió a cada pozo de una placa de microtítulo y se incubó a 2-8ºC durante 12-72 horas. La solución de revestimiento fue extraída y cada pozo se lavó seis veces con agua, luego se escurrió para retirar el exceso de agua.

Una alícuota de Diluyente de Ensayo se añadió a cada pozo y se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente con agitación. Los pozos se lavaron como en la etapa anterior.

Alícuotas de soluciones diluida estándar, control y muestra fueron añadidas a los pozos e incubada a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación para permitir el enlace del anticuerpo al revestimiento antígeno. Los pozos son lavados nuevamente con agua como en las etapas previas.

Peroxidasa-conjugada de rábano picante (HRP-conjugado, Fc de cabra anti-humano IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante; Organon Teknika catalog #55253 o equivalente) se diluyó con diluyente de ensayo para producir un rango de densidad óptica apropiado entre los estándares más alto y más bajo. Una alícuota de la solución HRP-conjugado se añadió a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Los pozos fueron lavados con agua como en las etapas anteriores.

Una alícuota de Solución Sustrato (tableta o-fenilenediamina (OPD) 5 mg (Sigma P6912 o equivalente) en 12,5 ml 4 mM H_{2}O_{2} en PBS) se añadió a cada pozo y se incubó durante un período de tiempo suficiente (aproximadamente 8-10 minutos) en la oscuridad a temperatura ambiente para permitir desarrollo de color. La reacción se detuvo con una alícuota de 4,5 N de ácido sulfúrico. Se leyó la densidad óptica a 490-492 nm para la absorbancia de detección y 405 nm para absorbancia de referencia. Se trazan los datos de la curva estándar y los resultados para los controles y muestras son determinados a partir de la curva estándar.

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IV. Formulaciones Farmacéuticas

Formulaciones terapéuticas de los anticuerpos son preparadas para almacenamiento mediante la mezcla con un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como octadecildimetilbenzil amonio cloruro; hexametonio cloruro; benzalconio cloruro, benzetonio cloruro; fenol, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos metal (por ejemplo proteínas Zn-complejo); y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietileno glicol (PEG). Formulaciones liofilizadas preferidas anticuerpo anti-ErbB2 son descritas en el documento WO 97/04801.

La formulación aquí presentada también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente unas con otras. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar anticuerpos adicionales que se enlacen con EGFR, ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo que enlaza un epítope diferente en ErbB2), ErbB3, ErbB4, o factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) en la formulación. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos pueden también ser encerrados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de suministro coloidal del medicamento (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a utilizar para administración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente conseguido mediante filtración a través de membranas estériles de filtración.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, dichas matrices son en la forma de artículos con forma, por ejemplo películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (U.S. Pat. No. 3.773. 919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato, etilene-vinil acetato no degradable, copolímeros degradables ácido láctico-ácido glicólico tal como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico- ácido glicólico y leuprolida acetato), y poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilene-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se puede desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante la modificación de los residuos sulfhidril, liofilización a partir de soluciones ácidas, control del contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

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V. Tratamiento con los Anticuerpos anti-ErbB2

Se contempla que los anticuerpos anti-ErbB2 puedan utilizarse para tratar varias condiciones caracterizadas por sobreexpresión y/o activación del receptor ErbB2. Condiciones o desórdenes ejemplares incluyen tumores benignos o malignos (por ejemplo renal, de hígado, riñón, vejiga, mama, gástrico, ovárico, colorectal, prostata, pancreático, pulmón, vulval, tiroide, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y malignidades linfoides; otros desórdenes tal como neuronal, glial, astrocital, hipotalámico y otros desórdenes glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

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Los anticuerpos son administrados a un paciente humano, según procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. Es preferida la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.

El tratamiento implica la administración de un anticuerpo anti-ErbB2 a un animal o paciente humano, seguida a intervalos por dosis posteriores de dosis iguales o más pequeñas de forma que se logra una concentración objetivo en suero y se mantiene durante el tratamiento. Preferentemente, las dosis de mantenimiento son suministradas mediante suministro de bolo, preferentemente mediante administración subcutánea de bolo, haciendo el tratamiento conveniente y de coste efectivo para el paciente y los profesionales del cuidado de la salud.

Si se desea la administración de un agente quimioterapéutico (distinto de una antraciclina), la administración combinada incluye la coadministración, usando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, donde preferentemente hay un período de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. La preparación y calendarios de dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos puede utilizarse según las instrucciones del fabricante o como se determine empíricamente por el médico entendido. La preparación y calendarios de dosificación para dicha quimioterapia son también descritos en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder, o seguir a la administración del anticuerpo o puede darse simultáneamente con el mismo. El anticuerpo puede combinarse con un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen o una anti-progesterona tal como onapristona (ver, el documento EP 616 812) en dosis conocidas para dichas moléculas.

Puede ser deseable administrar también anticuerpos contra otros antígenos asociados al tumor, tales como anticuerpos que se enlazan al EGFR, ErbB3, ErbB4, o factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, dos o más anticuerpos anti-ErbB2 pueden ser coadministrados al paciente. Algunas veces, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. El anticuerpo ErbB2 puede ser co-administrado con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser administrado primero, seguido por el anticuerpo ErbB2. Sin embargo, la administración simultánea, o administración del anticuerpo ErbB2 primero también se contempla. Las dosis adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas presentemente utilizadas y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo anti-ErbB2.

Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a la extracción quirúrgica de células de cáncer y/o terapia de radiación.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo anti-ErbB2 dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió con anterioridad, la severidad y el curso de la enfermedad, so el anticuerpo es administrado con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico asistente. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente en un momento o durante una serie de tratamientos. Donde el tratamiento implica una serie de tratamientos, la dosis inicial o dosis iniciales son seguidas a intervalos diarios o semanales por dosis de mantenimiento. Cada dosis de mantenimiento proporciona la misma o una cantidad más pequeña de anticuerpo comparada con la cantidad de anticuerpo administrada en la o las dosis iniciales.

Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis inicial candidata para la administración al paciente, si, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más prolongadas, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia es fácilmente monitorizado mediante técnicas y ensayos convencionales.

Según la descripción, los regímenes de dosificación pueden incluir una dosis inicial de anti-ErbB2 de 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg suministrados mediante infusión intravenosa o subcutánea, seguida por la posterior dosis semanal de mantenimiento d 2 mg/kg mediante infusión intravenosa, inyección de bolo subcutánea, infusión subcutánea, o inyección de bolo subcutánea. Donde el anticuerpo es bien tolerado por el paciente, el tiempo de infusión puede ser reducido.

Alternativamente, la descripción incluye una dosis inicial de 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por dosis posteriores de mantenimiento de 6 mg/kg una vez durante 3 semanas.

Otro régimen de dosificación implica una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por 6 mg/kg una vez durante 3 semanas.

Aún otro régimen de dosificación implica una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por dosis posteriores de mantenimiento de 8 mg/kg una vez por semana o 8 mg/kg una vez cada 2 a 3 semanas.

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Como un régimen alternativo, una dosis inicial de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 puede ser administrada en cada uno de los días 1, 2 y 3, seguida por una dosis posterior de mantenimiento de 6 mg/kg una vez por 3 semanas.

Un régimen adicional implica una dosis inicial de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por dosis posteriores de mantenimiento de 2 mg/kg dos veces por semana, donde las dosis de mantenimiento están separadas por 3 días.

Alternativamente, la descripción puede incluir un ciclo de dosificación en el cual el suministro del anticuerpo anti-ErbB2 es de 2-3 veces por semana durante 3 semanas. El ciclo de 3 semanas es preferentemente repetido como sea necesario para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad.

La descripción incluye además un régimen de dosificación cíclico en el cual el suministro del anticuerpo anti-ErbB2 es diario durante 5 días. Según la descripción, el ciclo es preferentemente repetido como sea necesario para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad. Información adicional sobre dosificaciones adecuadas se proporciona en los Ejemplos a continuación.

VI. Artículos de Fabricación

En otra realización, se proporciona un artículo de fabricación conteniendo materiales útiles para el tratamiento de los desórdenes descritos con anterioridad. El artículo de fabricación comprende un contenedor, una etiqueta y una inserción de envase. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor soporta una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante la aguja de una inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-ErbB2. La etiqueta sobre, o asociada con, el contenedor indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como salino tamponado con fosfato, solución de Ringer y solución dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas. Además, el artículo de fabricación puede comprender una inserción de envase con instrucciones para el uso, incluyendo, por ejemplo, una advertencia de que la composición no debe utilizarse en combinación con un agente quimioterapéutico de tipo antaciclina, por ejemplo doxorubicina o epirubicina.

Depósito de Materiales

Las siguientes líneas celulares hibridoma se han depositado en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

1

Detalles adicionales de la descripción se ilustran en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación y Eficacia del Anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® Materiales y Procedimientos

Anticuerpo anti-ErbB2 monoclonal. El anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 IgG_{1}\kappa murina 4D5, específico para el dominio extracelular de ErbB2, se produjo como se describió en Fendly et al., Cancer Research 5o:1550-1558 (1990) y WO89/06692. Brevemente, células NIH 3T3/HER2-3_{400} (que expresan aproximadamente 1 x 10^{5} ErbB2 moléculas/célula) producidas como se describió en Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:7159 (1987) fueron recogidas con salino tamponado con fosfato (PBS) conteniendo 25 mM EDTA y utilizado para inmunizar ratones BALB/c. Se dio a los ratones inyecciones i.p. de 10^{7} células en 0,5 ml PBS en las semanas, 0, 2, 5 y 7. A los ratones con antisuero que inmunoprecipitaba ErbB2 marcado ^{32}P fueron dadas inyecciones i.p. de un extracto de membrana ErbB2 aglutinina-Sefarosa de germen de trigo (WGA) purificado en las semanas 9 y 13. Esto fue seguido por una inyección i.v. de 0,1 ml de preparación ErbB2 y los esplenocitos fueron fusionados con línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes hibridoma fueron revisados para enlace ErbB2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación. MOPC-21 (IgG 1), (Cappell, Durham, NC), se utilizó como un isotipo de control correspondiente.

El tratamiento se realizó con una versión humanizada del anticuerpo murina 4D5 (anticuerpo anti-
ErbB2HERCEPTIN®). El anticuerpo humanizado fue dirigido mediante la inserción de las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo murina 4D5 dentro del marco de una inmunoglobulina humana de consenso IgG_{1} (IgG_{1}) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289). El anticuerpo monoclonal humanizado anti-ErbB2 resultante tenía una alta afinidad para p185^{HER2} (constante Dillohiation [K_{d}]=0,1 nmol/L), marcadamente inhibía, in vitro y en injertos heterólogos humanos, el crecimiento de las células del cáncer de mama que contienen altos niveles de p185^{HER2}, induce la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), y se ha encontrado clínicamente activo, como un único agente, en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan ErbB2 que habían recibido terapia anterior extensiva. El anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® es producido por una línea celular genéticamente dirigida de Ovario de Hámster Chino (CHO), cultivado en gran escala, que segrega el anticuerpo dentro del medio de cultivo. El anticuerpo es purificado del medio de cultivo del CHO utilizando procedimientos estándar cromatográficos y de filtración. Cada lote de anticuerpo utilizado en este estudio fue ensayado para verificar identidad, pureza, y potencia, así como para cumplir los requerimientos de esterilidad y seguridad de Food and Drug Administration.

Criterios de Elegibilidad. Los pacientes tenían que completar la totalidad de los siguientes criterios para ser elegibles para la admisión en el estudio:

\bullet Cáncer de mama metastásico

\bullet Sobreexpresión del oncogén ErbB2 (HER2) (2+ a 3+ como se determinó mediante inmunohistoquímica o hibridización de fluorescencia in situ (FISH). [La expresión de ErbB2 del tumor puede ser determinada mediante análisis inmunohistoquímico, como fue previamente descrito (Slamon et al., [1987] y [1989], supra), de un juego de finas secciones preparadas a partir de los bloques de tumor archivados en parafina del paciente. El anticuerpo de detección primaria utilizado es murina 4D5 MAb, que tiene el mismo CDRs que el anticuerpo humanizado utilizado para el tratamiento. Los tumores son considerados que sobreexpresan ErbB2 si al menos 25% de las células del tumor exhiben tintados de membrana característicos para p185^{HER2}].

\bullet Enfermedad que se puede medir bidimensionalmente (incluyendo lesiones de hueso lítico) a través de medios radiográficos, examen físico, o fotografías.

La enfermedad que se puede medir fue definida como cualquier masa que se puede medir de forma reproducible en dos diámetros perpendiculares mediante examen físico, rayos X (películas planas), tomografía computarizada (CT), imágenes de resonancia magnética (MRI), ultrasonido, o fotografías.

Las metástasis osteoblásticas, efusiones pleurales, o ascitis no se consideraron que se puedan medir. Las lesiones que se pueden medir deben ser de al menos de 1 cm en su mayor dimensión. La enumeración de sitios evaluables de enfermedad metastásica y número de lesiones en un sitio evaluable (por ejemplo pulmón) tiene que ser registrado en el Formulario de Informe del Caso (CRF) apropiado. Si estuvieran presentes un gran número de lesiones pulmonares o hepáticas, se siguieron las seis lesiones más grandes por sitio.

\bullet La habilidad de entender y disposición para firmar un formulario de consentimiento informado.

\bullet Mujeres \geq 18 años.

\bullet Candidatas adecuadas para recibir quimioterapia citotóxica concomitante como se evidencia mediante determinaciones de cribado de laboratorio de las funciones hematológicas, renales, hepáticas, y metabólicas.

Criterio de Exclusión. Pacientes con cualquiera de los siguientes fueron excluidos de la entrada en el estudio:

\bullet Quimioterapia citotóxica previa para cáncer de mama metastásico.

\bullet Pacientes que podían haber recibido terapia hormonal previa (por ejemplo tamoxifeno) para enfermedad metastásica o terapia citotóxica en el ajuste de adyuvante.

\bullet Malignidad concomitante que no ha sido tratada curativamente.

\bullet Un estado de funcionamiento de <60% en la escala Karnofsky.

\bullet Mujeres embarazadas o lactantes; mujeres de maternidad potencial, a menos que utilicen contracepción efectiva según determine el investigador.

\bullet Cáncer de mama bilateral (tanto ambos tumores primarios deben tener 2+ a 3+ HER2 sobreexpresión, o el sitio metastásico debe tener 2+ a 3+ HER2 sobreexpresión).

\bullet Uso de agentes de investigación o sin licencia dentro de los 30 días anteriores a la entrada en el estudio.

\bullet Metástasis clínicamente inestable o no tratada en el cerebro (por ejemplo que requiera terapia de radiación).

Basándose en los criterios anteriores, 469 pacientes fueron elegidas, y enroladas en el estudio. La mitad de las pacientes (estratificadas mediante quimioterapia) fueron seleccionadas al azar para recibir adicionalmente el anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® (ver a continuación).

Administración y Dosificación Anticuerpo anti-ErbB2

En el día 0, una 4 mg/kg dosis de anticuerpo humanizado anti-ErbB2 (HERCEPTIN®, H) fue administrada intravenosamente, durante un período de 90 minutos. Comenzando el día 7, las pacientes recibieron semanalmente la administración de 2 mg/kg anticuerpo (i.v.) durante un período de 90 minutos.

Quimioterapia

Las pacientes recibieron uno de dos regímenes de quimioterapia por un mínimo de seis ciclos, siempre que su enfermedad no estuviera progresando: a) ciclofosfamida y doxorubicina o epirubicina (AC), si las pacientes no habían recibido terapia de anticiclina en el ajuste del adyuvante, o b) paclitaxel (T, TAXOL®), si las pacientes han recibido alguna terapia de anticiclina en el ajuste del adyuvante. La dosis inicial del anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN® precedía el primer ciclo de cada régimen de quimioterapia por 24 horas. Dosis posteriores del anticuerpo fueron dadas inmediatamente antes de la administración de quimioterapia, si la dosis inicial del anticuerpo fue bien tolerada. Si la primera dosis del anticuerpo no fue bien tolerada, infusiones posteriores continuaron precediendo la administración de quimioterapia por 24 horas. Se permitió a las pacientes continuar recibiendo quimioterapia más allá de seis ciclos si, en la opinión del médico del tratamiento, continuaban recibiendo beneficio del tratamiento.

La ciclofosfamida (600 mg/m^{2}) se dio tanto mediante refuerzo iv durante un período mínimo de 3 minutos o mediante infusión durante un período máximo de 2 horas.

Doxorubicina (60 mg/m^{2}) o epirubicina (75 mg/m^{2}) fueron dadas tanto mediante iv de refuerzo lento durante un período mínimo de 3-5 minutos o mediante infusión durante un período máximo de 2 horas, según el protocolo institucional.

Paciltaxel (TAXOL®) fue dado en una dosis de 175 mg/m^{2} durante 3 horas mediante administración intravenosa. Todas las pacientes que recibían paclitaxel fueron premedicadas con dexametasona (o su equivalente) 20 mg x 2, administrado oralmente y 12 y 6 horas antes del paclitaxel; difenhidramina (o su equivalente) 50 mg, iv, administrado 30 minutos previo al paclitaxel, y dimetidine (u otro molde H_{2}) 300 mg, iv, administrado 30 minutos antes del paclitaxel.

Criterio de Respuesta

Enfermedad Progresiva. Evidencia objetiva de un incremento de 25% o más en cualquier lesión que se puede medir. Enfermedad progresiva también incluye aquellos ejemplos cuando han aparecido nuevas lesiones. Para lesiones de hueso, la progresión se define como un 25% de incremento en medición objetiva mediante película plana, CT, MRI; lesiones sintomáticas nuevas no debidas a fractura; o requerimiento de radioterapia paliativa.

Respuesta Completa. Desaparición de todos los tumores radiográfica y/o visualmente aparentes por un mínimo de 4 semanas. Respuestas completas de piel y pared del pecho deben ser confirmadas mediante biopsia.

Respuesta Parcial. Una reducción de al menos 50% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones que se pueden medir por un período mínimo de 4 semanas. Pueden no haber aparecido nuevas lesiones, ni cualquiera de las lesiones puede haber progresado en tamaño.

Respuesta Menor. Una reducción de 25% a 49% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones que se pueden medir. Puede no haber aparecido nuevas lesiones, ni cualquiera de las lesiones puede haber progresado en tamaño.

Enfermedad Estable. Sin cambios de más de 25% en el tamaño de lesiones que se pueden medir. Puede no haber aparecido lesiones.

\newpage

El tiempo para la progresión de la enfermedad (TTP) fue calculado desde el comienzo de la terapia a la progresión. Los límites de confianza para las tasas de respuesta fueron calculadas usando el procedimiento exacto para una proporción única. (Fleiss, JL, Statistical Methods for Rates and Proportions (ed.2), New York, NY, Wiley, 1981, pp 13-17).

Resultados

Con un seguimiento medio de 10,5 meses, las determinaciones de tiempo de progresión de la enfermedad (TTP en meses) y las tasas de respuesta (RR) mostraron un aumento significativo del efecto quimioterapéutico del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, sin incremento en eventos adversos severos globales (AE):

TABLA 1

3

Un síndrome de disfunción del miocardio similar al observado con antraciclinas se informó más comúnmente con un tratamiento combinado de AC+H (18% Grado 3/4) que con AC solo (3%), T (0%), o T+H (2%).

Estos datos indican que la combinación de tratamiento anticuerpo anti-ErbB2 con quimioterapia incrementa marcadamente el beneficio clínico, como se determinó mediante tasas de respuesta y la evaluación de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, debido a los efectos secundarios cardíacos incrementados de doxorubicina o epirubicina, el uso combinado de antraciclinas con terapia anticuerpo anti-ErbB2 está contraindicado. Los resultados, tomando en cuenta riesgo y beneficio, favorecen al tratamiento con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® y paclitaxel (TAXOL®) donde se desea un régimen de tratamiento combinado.

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Ejemplo 2 Propiedades Farmacoquinéticas y Farmacodinámicas de Anticuerpo anti-ErbB2 (HERCEPTIN®)

Anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® fue administrado mediante infusión intravenosa a pacientes humanas seleccionadas según los criterios proporcionados en el Ejemplo 1. Una dosis inicial de 4 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® fue suministrado mediante infusión intravenosa, seguida por posteriores infusiones i.v. de 2 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® semanalmente durante varias semanas. Doscientas trece pacientes comenzaron este régimen de tratamiento y se obtuvo la concentración de medicamento en suero más allá de las 8 semanas para menos de 90 pacientes al producirse una discontinuidad selectiva de pacientes con enfermedad progresando rápidamente. De las 213 pacientes que comenzaron el tratamiento, los datos de concentración mínima de suero estuvieron disponibles para 80 pacientes a la Semana 12, para 77 pacientes a la Semana 16, para 44 pacientes a la Semana 20, para 51 pacientes a la Semana 24, para 25 pacientes a la Semana 28, para 23 pacientes a la Semana 32, y para 37 pacientes a la Semana 36.

Concentraciones mínimas en suero de Anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® para las Semanas 0-36

Las concentraciones mínimas en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® (\mug/ml, media \pm SE) desde Semana 2 hasta Semana 36 son trazados en la Figura 3 (círculos oscuros). El número de pacientes fue bastante constante porque los datos de pacientes discontinuadas del programa debido a la enfermedad progresando rápidamente fueron excluidas de este análisis. Las concentraciones mínimas en suero tienden a incrementarse a través de la Semana 12 y tienden a una meseta después de ese momento.

Concentraciones de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® mínima y pico en suero para las Semanas 1-8

Algunos datos de concentración en suero del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® estuvieron disponibles para 212 de las pacientes 213 originales. Los datos de la concentración mínima y pico en suero que reflejan la primera infusión anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® estuvieron disponibles para 195 de las 212 pacientes. Para la séptima infusión, los datos de concentración mínima en suero estuvieron disponibles para 137/212 pacientes y datos de concentración pico en suero estuvieron disponibles para 114/212 pacientes. La Tabla 2 presenta un resumen de las estadísticas de concentraciones mínima y pico en suero de las primeras 8 semanas de tratamiento. Las muestras pico fueron extraídas poco después del final de la administración de anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®; las muestras mínimas fueron extraídas antes de las dosis posteriores (por ejemplo, 1 semana más tarde). Las concentraciones en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® fueron determinadas como se indica aquí.

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TABLA 2

4

Los datos en la Tabla 2 sugieren que había un incremento en la concentración mínima en suero en el tiempo. De las muchas pacientes estudiadas, hubo 18 pacientes para quienes las concentraciones mínimas no excedieron 20 \mug/ml desde la Semana 2 hasta la Semana 8. Una concentración mínima en suero anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN® de 20 \mug/ml fue nominalmente apuntada por estos estudios basados en estudios farmacológicos previos en animales y análisis exploratorios en ensayos clínicos.

El estado de respuesta de la paciente se evaluó respecto a la concentración en suero de anticuerpo anti-
ErbB2HERCEPTIN®. Con este propósito, fue calculada la concentración media en suero (un promedio de mínimos y picos) para distintos momentos y estados de respuesta de la paciente (donde el estado de respuesta de la paciente se determinó mediante un Comité de Evaluación de Respuesta independiente). El incremento en la concentración en suero entre las Semanas 2 y 8 apareció siendo mayor en respondedores que en no respondedores, sugiriendo que hay una relación entre estado de respuesta y concentración en suero anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®. Un análisis estadístico (análisis de variancia) de los valores de la concentración mínima en suero a la Semana 2 y un promedio de las Semanas 7 y 8 en relación al estado de respuesta indicó una relación altamente significativa entre estado de respuesta y promedio a través de las Semanas 7 y 8 (p < 0,001). Los resultados indicaron que había una diferencia significativa entre la concentración mínima en suero (promedio a través de las Semanas 7 y 8) en los respondedores y no respondedores: las concentraciones mínimas fueron 60 \pm 20 \mug/ml en los respondedores versus 44 \pm 25 \mug/ml en los no respondedores (media \pm SD). El nivel de sobreexpresión HER2 y tipo de sitios metastásicos fueron asociados con diferencias significativas en las concentraciones mínimas en suero. A la Semana 2, pacientes con sobreexpresión 2+ HER2 tuvieron concentraciones mínimas en suero significativamente más altas (n = 40, media = 28,8 \mug/ml, SD = 10,4) comparadas con pacientes con 3+ HER2 sobreexpresión (n = 155, media = 24,1 \mug/ml, SD = 13,1). Esta diferencia en el promedio de las concentraciones mínimas de suero para las Semanas 7 y 8 ya no fue estadísticamente significativa. Además, a la Semana 2, pacientes con enfermedad superficial tuvieron concentraciones mínimas en suero significativamente más altas (n = 12, media 34,1 \mug/ml, SD = 12,0) comparadas con pacientes con enfermedad visceral (n = 183, media = 24,4 \mug/ml, SD = 12,6). Esta diferencia en el promedio de las concentraciones mínimas en suero para las Semanas 7 y 8 fue significativa. Estos datos indican que el aumento en las concentraciones mínimas en suero entre las Semanas 2 y 7/8 se producen para pacientes humanos con distintos perfiles de enfermedad.

En un estudio posterior, similarmente diseñado, pacientes de cáncer de mama humano fueron tratadas con una dosis de carga de 8 mg/kg seguida por dosis de mantenimiento de 4 mg/kg semanalmente. Los resultados de este estudio humano preliminar indicó que una carga 8 mg/kg: régimen de mantenimiento de 4 mg/kg semanalmente fue eficaz para reducir el volumen del tumor en las pacientes.

Los datos descritos en este Ejemplo indican que la carga frontal de anticuerpo, de forma tal que se alcanza una concentración objetivo en suero más rápidamente, puede estar asociada con resultados mejorados.

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Ejemplo 3 I.V. Suministro de Bolo e Infusión subcutánea para Anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® Disminuye Efectivamente el Volumen del Tumor en el Ratón

Se examinó la eficacia de infusión o suministro de bolo de anticuerpo humanizado anti-ErbB2(HERCEPTIN,® ver Ejemplo 1 para la preparación), ya sea mediante inyección intravenosa o subcutánea inyección. El propósito del estudio fue preguntar si el suministro subcutáneo era factible y si el suministro conveniente de bolo subcutáneo era útil para tratar cáncer de mama metastásico en animales inoculados con una línea celular que sobreexpresara el gen HER2. Los resultados, detallados a continuación, muestran que infusión i.v. y s.c. y suministro de bolo son metodologías factibles de tratamiento.

Un estudio en un modelo de injerto heterólogo de ratón desnudo, que incorpora una línea celular de cáncer de mama humano que naturalmente sobreexpresa el gen HER2 (BT-474M1, derivado a partir de células BT-474, ATCC Accession number HTB-20), comparando el volumen del tumor como una función de bolo i.v. versus infusión s.c. se realizó como sigue. En el primer estudio se obtuvieron ratones hembra atímicos desnudos nu/nu de 7-9 semanas de edad de Taconic Inc (Germantown, NY). Para iniciar el desarrollo del tumor, cada ratón fue inoculado subcutáneamente con 3 x 10^{6} BT474M1 células suspendidas en Matrigel^{TM}. Cuando los nódulos del tumor alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm^{3}, los animales fueron seleccionados al azar para 4 grupos de tratamiento. Los grupos fueron tratados según la Tabla 3.

TABLA 3

5

Los animales fueron expuestos a estrógeno mediante un gránulo de liberación subcutánea sostenida de estrógeno 9 días antes del inicio de la dosificación para promover el crecimiento de las células de tumor injertadas. Los animales fueron inoculados con las células BT474M 1 8 días antes del inicio del tratamiento y se dejó crecer los tumores. Los animales fueron tratados entonces con anticuerpo E25 no relevante (no específico para receptor HER2, pero un elemento de la clase monoclonal IgG) o prueba anticuerpo HERCEPTIN® anti-ErbB2 anticuerpo como se indicó en la Tabla 3. Los niveles de dosificación fueron seleccionados para lograr concentraciones objetivo en suero de HERCEPTIN®, tanto 1 \mug/ml o 20 \mug/ml, mediante bomba subcutánea de infusión o mediante suministro de bolo i.v. Los grupos de estudio fueron tratados hasta el día 35. La concentración en suero de anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN® se midió semanalmente (justo antes de la dosificación del Grupo 4) usando 3 ratones/grupo/punto de tiempo. La concentración del anticuerpo anti-ErbB2 se determinó según el procedimiento aquí descrito implicando técnicas estándar. Se midieron los volúmenes del tumor dos días antes de comenzar la dosificación y dos veces por semana desde el día 6 al día 35 en el estudio para el cual los datos se tabulan a continuación. Los tumores fueron medidos en tres dimensiones y los volúmenes se expresaron en mm^{3}. Se determinó la eficacia mediante una comparación estadística (ANOVA) para volúmenes de tumor de animales de prueba respecto a animales de control no tratados.

Como se muestra en la Tabla 4, a continuación, el tratamiento de los ratones BT474M1 que portaban un tumor con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® mediante los procedimientos de dosificación indicados inhibió significativamente el crecimiento de los tumores. Todos los grupos tratados con HERCEPTIN® mostraron una inhibición similar del crecimiento del tumor respecto al grupo de control. No se observó respuesta a la dosis.

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TABLA 4

6

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Los resultados tabulados arriba indican que el mantenimiento de una concentración en suero de aproximadamente 2 \mug/ml fue tan efectiva como una concentración de 20 \mug/ml en este estudio. Los resultados indicaron que la dosificación mediante infusión subcutánea fue tan efectiva como la dosificación del bolo intravenoso y lograba concentraciones mínimas en suero similares. Los resultados también indican que los niveles de dosis estudiados están en la parte superior de la curva de respuesta a la dosis en este modelo y que la dosificación subcutánea es efectiva en el tratamiento de tumores de cáncer de mama. Por lo tanto, la administración subcutánea de dosis de mantenimiento es factible como parte de un régimen de tratamiento de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®.

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Ejemplo 4 I.V. Suministros de Bolo y Bolo subcutáneo de Anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® Disminuyen Efectivamente el Volumen del Tumor en el Ratón

El suministro de bolo subcutáneo es conveniente y de coste efectivo para el y los profesionales del cuidado de la salud. Los resultados del estudio descritos en este ejemplo indican que el suministro de bolo subcutáneo fue tan efectivo como el suministro de bolo intravenoso en reducir el tamaño del tumor de células mamarias en un ratón.

Este estudio se dispuso como se describe aquí en el Ejemplo 3 para la comparación de suministro de bolo intravenoso y de infusión subcutánea. Se insertó subcutáneamente un implante de liberación sostenida de estrógeno un día antes de la inoculación de las células tumorales como se describió en Ejemplo 3. Seis días después de la inoculación de las células tumorales, se realizó la medición inicial del tumor. Siete días después de la inoculación de las células tumorales, se suministró la primera dosis de control anticuerpo o anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®. Los grupos de animales, tipo de suministro, dosis de carga y dosis de mantenimiento se proporcionan en la Tabla 4. Los animales fueron dosificados una vez semanalmente durante 4 semanas.

TABLA 5

7

Los ratones fueron tratados según la información de la Tabla 4 y utilizando las técnicas descritas en el Ejemplo 3. La concentración en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se midió semanalmente antes de cada dosis i.v. semanal de mantenimiento según el procedimiento aquí descrito y utilizando técnicas estándar. La concentración de anticuerpo de control E25 en suero se determinó según técnicas de inmunoensayo estándar. La Tabla 6 muestra el incremento en las concentraciones en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® con el tiempo.

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TABLA 6

8

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La Tabla 7 muestra la eficacia relativa del suministro de bolo intravenoso y del suministro de bolo subcutáneo para los Grupos 1-5 habiendo alcanzado las concentraciones de anticuerpo en suero presentadas en la Tabla 6. Para este estudio, eficacia se midió como una disminución en el volumen del tumor. El volumen del tumor se midió dos veces semanalmente.

TABLA 7

9

Las Figuras 4A y 4B son diagramas gráficos de cambios en el volumen del tumor en el tiempo, algunos de cuyos datos se encuentran en la Tabla 7. La Figura 4A es un diagrama lineal del volumen del tumor respecto al tiempo. La Figura 4B es un diagrama semilogarítmico de los mismos datos, permitiendo que los puntos de prueba se vean más claramente. Los datos de la Tabla 7 y las Figuras 4A y 4B indican que, a pesar de que la respuesta relativa a la dosis no se observó entre grupos tratados con HERCEPTIN, la dosificación mediante bolo subcutáneo fue tan efectiva como la dosificación con el bolo intravenoso y logró concentraciones mínimas en suero similares.

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Ejemplo 5 Regímenes para Suministro Intravenoso y Subcutáneo de Anticuerpo anti-ErbB2

Según la descripción, procedimientos de suministro de anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, HERCEPTIN®) comprenden una carga frontal mayor del medicamento para lograr una concentración objetivo en suero en aproximadamente 4 semanas o menos, preferentemente 3 semanas o menos, más preferentemente 2 semanas o menos, y aún más preferentemente I semana o menos, incluyendo un día o menos. Según la descripción, esta dosificación inicial es seguida por una dosificación que mantiene la concentración de suero objetivo mediante dosis posteriores de cantidad igual o menor. Una ventaja de los procedimientos de la descripción es que la dosificación de mantenimiento puede ser menos frecuente y/o suministrada mediante inyección subcutánea, haciendo los regímenes del tratamiento de la descripción convenientes y de coste efectivo para el paciente y los profesionales médicos que administran el anticuerpo. Además, un régimen de dosis subcutánea de mantenimiento puede ser interrumpido mediante dosificación intravenosa (tal como infusión) cuando la quimioterapia del paciente requiere suministro de otros medicamentos mediante inyección intravenosa.

Para comprobar los siguientes regímenes de dosificación, sujetos humanos son seleccionados según los criterios descritos en el Ejemplo 1, anterior. El número de dosis inicial es una o más dosis suficientes para lograr una concentración objetivo eficaz en suero en aproximadamente 4 semanas o menos, preferentemente 3 semanas o menos, más preferentemente 2 semanas o menos, y aún más preferentemente 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos. El número de dosis de mantenimiento puede ser una o más dosis suficientes para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad, tal como una disminución en el volumen del tumor. La dosis de mantenimiento son iguales o menores que la dosis inicial o dosis, consistentes con un objeto de la invención de administrar anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® mediante regímenes que proporcionan una mayor carga frontal. Los regímenes de suministro específico de medicamento aquí descrito son representativos de la invención y no son limitativos.

En un ensayo, se suministra una dosis inicial de 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2
HERCEPTIN® a pacientes humanos mediante inyección intravenosa o subcutánea. Se suministra una dosis inicial (dosis de carga) mediante infusión intravenosa o inyección de bolo o preferentemente inyección de bolo subcutánea. Preferentemente se logra una concentración mínima objetivo en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® de aproximadamente 10-20 \mug/ml (promediada para todos los pacientes en el grupo de tratamiento) y se mantiene mediante dosis posteriores de anticuerpo anti-ErbB2 que son iguales o menores que la dosis inicial. En un procedimiento, una concentración objetivo mínima en suero se logra y se mantiene mediante suministros de una vez por semana de 2 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® mediante inyección intravenosa o subcutánea durante al menos ocho semanas. Alternativamente, para este o cualquier régimen de dosificación aquí descrito, se utiliza infusión subcutánea continua mediante bomba subcutánea para el suministro de dosis posteriores de mantenimiento.

En otro procedimiento, una dosis inicial (carga frontal) de 8 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se suministra mediante inyección intravenosa (infusión o inyección de bolo) o mediante inyección de bolo subcutánea. Esto es seguido por inyecciones de bolo intravenoso, infusión intravenosa, infusión subcutánea, o inyección de bolo subcutánea de 6 mg/kg a intervalos de 3 semanas para mantener una concentración mínima en suero de aproximadamente 10-20 \mug/ml, promediada para un grupo de tratamiento completo.

En otro procedimiento, una dosis inicial (carga frontal) de 12 mg/kg HERCEPTIN® anticuerpo anti-ErbB2 se suministra mediante inyección intravenosa (infusión o inyección bolo) o mediante inyección de bolo subcutánea. Esto es seguido por inyecciones de bolo intravenoso, infusión intravenosa, infusión subcutánea, o inyección de bolo subcutánea de 6 mg/kg a intervalos de 3 semanas para mantener una concentración mínima en suero de aproximadamente 10-20 \mug/ml.

Aún en otro procedimiento, una dosis inicial (carga frontal) de 8 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se suministra mediante infusión intravenosa o inyección de bolo, o preferentemente mediante inyección de bolo subcutánea o infusión. Esto es seguido por la administración de 8 mg/kg por semana o 8 mg/kg por 2-3 semanas para mantener una concentración mínima en suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® de aproximadamente 10-20 \mug/ml. Se suministran dosis de mantenimiento mediante infusión intravenosa o inyección de bolo, o preferentemente mediante infusión subcutánea o inyección de bolo.

En otro procedimiento, la dosis inicial de carga frontal es una serie de inyecciones intravenosas o subcutáneas, por ejemplo, una en cada uno de los días 1, 2, y 3 de al menos 1 mg/kg para cada inyección (donde la cantidad de anticuerpo anti-ErbB2 suministrada por la suma de inyecciones iniciales es más de 4 mg/kg), seguida por dosis de mantenimiento de 6 mg/kg una vez cada 3 semanas de intervalo para mantener una concentración objetivo mínima en suero (por ejemplo, aproximadamente 10-20 \mug/ml) de anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®. Las dosis de mantenimiento son suministradas mediante infusión intravenosa o inyección de bolo o mediante infusión subcutánea o inyección de bolo subcutánea.

Aún en otro procedimiento, la carga frontal es mediante infusión intravenosa de al menos 1 mg/kg, preferentemente 4 mg/kg en cada uno de cinco días consecutivos, seguida por repeticiones de este ciclo un número suficiente de veces para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad. Siguiendo a la dosis inicial o las dosis, pueden suministrarse dosis posteriores mediante infusión subcutánea o inyección de bolo si es tolerado por el paciente. Dicho suministro subcutáneo es conveniente y de coste efectivo para el paciente y los profesionales del cuidado de la salud que lo administran.

Aún en otro procedimiento, el anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN® se suministra inicialmente como al menos 2 infusiones intravenosas por semana durante tres semanas, seguidas por repeticiones de este ciclo para mantener concentración mínima eficaz en suero de anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®. La dosis es al menos 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, preferentemente al menos 5 mg/kg. El suministro del medicamento de mantenimiento puede ser intravenoso o subcutáneo.

Si el animal o paciente tolera el anticuerpo durante y después de una dosis inicial, el suministro de las dosis posteriores puede ser subcutáneo, proporcionando así mayor conveniencia y efectividad de coste para el paciente y profesionales del cuidado de la salud.

En estudios animales, una dosis inicial de más de 4 mg/kg, preferentemente más de 5 mg/kg suministrada mediante inyección intravenosa o subcutánea, es seguida por inyecciones de bolo subcutáneo de 2 mg/kg dos veces por semana (separadas por 3 días) para mantener una concentración mínima en suero de aproximadamente 10-20 \mug/ml. Además, donde se conoce que el animal o paciente tolera el anticuerpo, una dosis inicial de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® es opcional y preferentemente suministrada mediante inyección de bolo subcutánea seguida por inyecciones de mantenimiento subcutáneas.

Aunque aquí se describen concentraciones objetivas en suero con el propósito de comparar estudios animales y ensayos humanos, las concentraciones objetivo en suero en usos clínicos pueden diferir. La revelación proporcionada aquí guía al usuario en la selección de un régimen de suministro de medicamento de carga frontal que proporciona una concentración objetivo eficaz mínima en suero.

Los procedimientos aquí descritos opcionalmente incluyen el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® en combinación con un agente quimioterapéutico (distinto de un derivado antrociclina) para lograr la supresión de los síntomas de la enfermedad. El agente quimioterapéutico puede ser suministrado con el anticuerpo anti-
ErbB2HERCEPTIN® o separadamente y según un diferente calendario de dosificación. Por ejemplo, se incluye el suministro subcutáneo de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® con TAXOL®. Además, la inyección intravenosa o subcutánea de 8 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2HERCEPTIN®, seguida por inyección intravenosa o subcutánea de 6 mg/kg anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® cada 3 semanas se administra en combinación con un agente quimioterapéutico, tal como un taxoide (por ejemplo paclitaxel 175 mg/m^{2} cada 3 semanas) o un derivado de antraciclina (por ejemplo doxorubicin 60 mg/m^{2} o epirubicin 75 mg/m^{2} cada 3 semanas). Opcionalmente, donde se administra un derivado antraciclina, también se administra un cardioprotector (por ejemplo 600 mg/m^{2} ciclofosfamida cada 3 semanas). En otra combinación de terapia, anticuerpo anti-ErbB2 es administrado en una dosis de carga de más de 4 mg/kg, preferentemente más de 5 mg/kg, y más preferentemente de al menos 8 mg/kg. La dosis de carga es seguida por dosis de mantenimiento de al menos 2 mg/kg semanalmente, preferentemente 6 mg/kg cada 3 semanas. La combinación de terapia incluye la administración de un taxoide durante el tratamiento con anticuerpo anti-ErbB2. Según una realización, el taxoide es paclitaxel y se administra a una dosis de 70-100 mg/m^{2}/semana. Según otra realización, el taxoide es docetaxel y se administra a una dosis de 30-70 mg/m^{2}/semana.

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Ejemplo 6 HERCEPTIN® Administrado Intravenosamente Cada Tres Semanas en Combinación con Paclitaxel

Actualmente, la dosis recomendada de HERCEPTIN® es 2 mg/kg una vez semanalmente. Los pacientes serán administrados HERCEPTIN® cada tres semanas en lugar de semanalmente, junto con paclitaxel (175 mg/m^{2} cada tres semanas). La simulación del régimen de tratamiento propuesto sugiere que las concentraciones mínimas en suero serán de 17 mcg/ml, en el rango (10-20 mcg/ml) de las concentraciones objetivo mínimas en suero a partir de ensayos clínicos previos de HERCEPTIN® IV. Después de los primeros 12 pacientes se determinarán los parámetros PK, si la exposición se siente inadecuada, luego la dosis será incrementada a 8 mg/kg cada tres semanas para los 12 pacientes restantes.

Criterio de Inclusión

1) Mujeres \geq 18 años de edad

2) Cáncer de mama metastásico que sobreexpresa ErbB2 histológicamente confirmado

3) Pacientes que han sido recientemente diagnosticadas con enfermedad metastásica

4) Tienen un estado de funcionamiento de Karnofsky de \geq 70%

5) Dan consentimiento escrito informado antes de cualquier procedimiento de investigación de estudio específico con el entendimiento de que la paciente tiene el derecho a retirarse del estudio en cualquier momento, sin prejuicio.

Criterio de Exclusión

1) Mujeres embarazadas o lactantes

2) Mujeres con maternidad potencial a menos que (1) quirúrgicamente estéril o (2) utilizando medidas adecuadas de contracepción tales como anticonceptivos orales, dispositivo intra-uterino o procedimiento de contracepción de barrera conjuntamente con jalea espermicida.

3) Evidencia clínica o radiológica de metástasis CNS.

4) Historia de una enfermedad cardíaca significativa

5) LVEF \leq 50%

6) Ninguna terapia de taxano previa en ningún ajuste de tratamiento.

7) Ninguno de los siguientes valores hematológicos anormales de línea de fondo:

-

Hb menos de 9 g/dl

-

WBC menos de 3,0 x 10^{9}/l

-

Granulocitos menos de 1,5 x 10^{9}/l

-

Plaquetas menos de 100 x 10^{9}/l

8) Ninguna de las siguientes pruebas de funcionamiento de hígado anormal de línea de fondo:

-

Bilirrubina en suero mayor de 1,5 x ULN (límite superior normal)

-

ALT y/o AST mayor de 2,5 x ULN (mayor de 4,0 x ULN si hay metástasis de hígado o hueso)

-

Fosfatasa alcalina mayor de 2,5 x ULN (mayor de 4,0 x ULN si hay metástasis de hígado o hueso)

9) Las siguientes pruebas de función renal anormal de línea de fondo:

-

creatinina en suero mayor de 1,5 x ULN

10) Historial de otras condiciones médicas severas que podrían imposibilitar la participación del paciente en un estudio de investigación.

HERCEPTIN ®. Carga de dosis y programación: 8 mg/kg para la primera dosis. Dosis de mantenimiento y programación: 6 mg/kg cada 3 semanas.

Paclitaxel - 175 mg/m^{2} IV cada 3 semanas x 6 ciclos como una infusión de 3 horas.

NOTA: En el primer ciclo de tratamiento, el paclitaxel se dosificará 8 horas antes de la HERCEPTIN® para determinar el PK del paclitaxel solamente. La HERCEPTIN® se administrará 8 horas después delpaclitaxel solamente para el primer ciclo. En ciclos de tratamiento posteriores, la HERCEPTIN® se administrará antes del paclitaxel.

La duración total de este estudio es de 18 semanas. Los sujetos de estudio recibirán hasta un total de 6 dosis de HERCEPTIN®. Después de que el último sujeto haya recibido el último ciclo de paclitaxel, la recogida de datos para el análisis de seguridad y farmacocinético se detendrá, y el estudio se cerrará con el tratamiento especificado en el protocolo. Estos sujetos pueden continuar recibiendo la HERCEPTIN® +/- paclitaxel a discreción del investigador.

Se cree que el régimen de tratamiento anterior será efectivo en el tratamiento de cáncer de mama metastásico, a pesar de la infrecuencia con la cual la HERCEPTIN® se administra al paciente.

Aunque los aspectos particulares y realizaciones de la invención tal como se muestran y describen en detalle son completamente capaces de obtener los objetivos y proporcionar las ventajas indicadas aquí anteriormente, debe entenderse que es meramente ilustrativo de algunas de las realizaciones actualmente preferidas de la invención y que no se pretende ninguna limitación en los detalles de los procedimientos y artículos de fabricación mostrados diferentes a los descritos en las reivindicaciones adjuntas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9422478 A [0004]

\bullet WO 8906692 A [0005] [0089] [0126] [0177]

\bullet WO 9400136 A [0010]

\bullet US 5708156 A [0035]

\bullet US 4943533 A, Mendelsohn [0036]

\bullet WO 9640210 A [0036]

\bullet US 5183884 A [0037]

\bullet US 5480968 A [0037]

\bullet US 5968511 A, Akita and Sliwkowski [0037]

\bullet EP 599274 A [0038]

\bullet WO 9919488 A [0038]

\bullet WO 9220798 A [0047]

\bullet US 4816567 A [0059] [0060] [0094] [0104] [0106]

\bullet EP 404097 A [0063]

\bullet WO 9311161 A [0063]

\bullet US 4275149 A [0077]

\bullet US 8900051 W [0089]

\bullet US 9002697 W [0089]

\bullet WO 9014357 A [0089]

\bullet EP 0474727 A [0089]

\bullet DE 69031120 [0089]

\bullet US 9718385 W [0089]

\bullet WO 9817797 A [0089]

\bullet US 979185 A [0089]

\bullet US 5677171 A [0089]

\bullet US 5720937 A [0089]

\bullet US 5720954 A [0089]

\bullet US 5725856 A [0089]

\bullet US 5770195 A [0089]

\bullet US 5772997 A [0089]

\bullet US 982626 W [0089]

\bullet WO 985514 A [0089]

\bullet US 9906673 W [0089]

\bullet WO 9948527 A [0089]

\bullet WO 9316185 A [0110]

\bullet WO 9308829 A [0112]

\bullet WO 9404690 A [0114]

\bullet WO 9627011 A [0115]

\bullet US 4676980 A [0116] [0116]

\bullet WO 9100360 A [0116]

\bullet WO 92200373 A [0116]

\bullet EP 03089 A [0116]

\bullet WO 9411026 A [0130]

\bullet US 4485045 A [0132]

\bullet US 4544545 A [0132]

\bullet US 5013556 A [0132]

\bullet WO 8101145 A [0134]

\bullet WO 8807378 A [0134]

\bullet US 4975278 A [0134]

\bullet WO 9704801 A [0153]

\bullet US 3773919 A [0157]

\bullet EP 616812 A [0161]

\bullet US 60151018 B [0235]

\bullet US 60213822 B [0235]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletSlamon et al. Science, 1987, vol. 235, 177-182 [0002]

\bulletSlamon et al. Science, 1989, vol. 244, 707-712 [0002]

\bulletHudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 7159-7163 [0003]

\bulletDiFiore et al. Science, 1987, vol. 237, 78-182 [0003]

\bulletGuy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 10578-10582 [0003]

\bulletDrebin et al. Cell, 1985, vol. 41, 695-706 [0004]

\bulletDrebin et al. PNAS (USA), 1986, vol. 83, 9129-9133 [0004]

\bulletDrebin et al. Oncogene, 1988, vol. 2, 387-394 [0004]

\bulletDrebin et al. Oncogene, 1988, vol. 2, 273-277 [0004]

\bulletMyers et al. Meth. Enzym., 1991, vol. 198, 277-290 [0004]

\bulletHudziak et al. Mol. Cell. Biol., 1989, vol. 9 (3), 1165-1172 [0005]

\bulletFendly et al. Cancer Research, 1990, vol. 50, 1550-1558 [0005] [0177]

\bulletKotts et al. In Vitro, 1990, vol. 26 (3), 59A [0005]

\bulletSarup et al. Growth Regulation, 1991, vol. 1, 72-82 [0005]

\bulletShepard et al. J. Clin. Immunol., 1991, vol. 11 (3), 117-127 [0005]

\bulletKumar et al. Mol. Cell. Biol., 1991, vol. 11 (2), 979-986 [0005]

\bulletLewis et al. Cancer Immunol. Immunother., 1993, vol. 37, 255-263 [0005]

\bulletPietras et al. Oncogene, 1994, vol. 9, 1829-1838 [0005]

\bulletVitetta et al. Cancer Research, 1994, vol. 54, 5301-5309 [0005]

\bulletSliwkowski et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269 (20), 14661-14665 [0005]

\bulletScott et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 14300-5 [0005]

\bulletD'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, vol. 91, 7202-7206 [0005]

\bulletTagliabue et al. Int. J. Cancer, 1991, vol. 47, 933-937 [0006]

\bulletMcKenzie et al. Oncogene, 1989, vol. 4, 543-548 [0007]

\bulletMaier et al. Cancer Res., 1991, vol. 51, 5361-5369 [0007]

\bulletBacus et al. Molecular Carcinogenesis, 1990, vol. 3, 350-362 [0007]

\bulletStancovski et al. PNAS (USA), 1991, vol. 88, 8691-8695 [0008] [0090]

\bulletBacus et al. Cancer Research, 1992, vol. 52, 2580-2589 [0009]

\bulletXu et al. Int. J. Cancer, 1993, vol. 53, 401-408 [0010]

\bulletKasprzyk et al. Cancer Research, 1992, vol. 52, 2771-2776 [0010]

\bulletHancock et al. Cancer Res, 1991, vol. 51, 4575-4580 [0010]

\bulletShawver et al. Cancer Res, 1994, vol. 54, 1367-1373 [0010]

\bulletArteaga et al. Cancer Res., 1994, vol. 54, 3758-3765 [0010]

\bulletHarwerth et al. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, 15160-15167 [0010]

\bulletBaselga et al. J. Clin. Oncol., 1996, vol. 14, 737-744 [0011]

\bulletRavdin; Chamness. Gene, 1995, vol. 159, 19-27 [0012]

\bulletHynes; Stern. Biochim Biophys Acta, 1994, vol. 1198, 165-184 [0012]

\bulletBaselga et al. Oncology, 1997, vol. 11 (3), 43-48 [0012]

\bulletBaselga et al. Breast Cancer, Proceedings of ASCO, 1994, vol. 13 [0012]

\bulletNakamura et al. J. of Virology, October 1993, vol. 67 (10), 6179-6191 [0034]

\bulletRenz et al. J. Cell Biol., June 1994, vol. 125 (6), 1395-1406 [0034]

\bulletCarpenter et al. Ann. Rev. Biochem, 1987, vol. 56, 881-914 [0036]

\bulletHumphrey et al. PNAS (USA), 1990, vol. 87, 4207-4211 [0036]

\bulletKraus et al. PNAS (USA), 1989, vol. 86, 9193-9197 [0037]

\bulletPlowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 1746-1750 [0038]

\bulletPlowman et al. Nature, 1993, vol. 366, 473-475 [0038]

\bulletSemba et al. PNAS (USA), 1985, vol. 82, 6497-6501 [0039]

\bulletYamamoto et al. Nature, 1986, vol. 319, 230-234 [0039]

\bullet Antibodies. ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0040] [0042]

\bulletMoore et al. Cytotechnology, 1995, vol. 17, 1-11 [0043]

\bulletSchecter et al. Nature, 1984, vol. 312, 513 [0046]

\bulletDrebin et al. Nature, 1984, vol. 312, 545-548 [0046]

\bulletHolmes et al. Science, 1992, vol. 256, 1205-1210 [0047]

\bulletWen et al. Mol. Cell. Biol., 1994, vol. 14 (3), 1909-1919 [0047]

\bulletMarchionni et al. Nature, 1993, vol. 362, 312-318 [0047]

\bulletSliwkowski et al. J. Biol. Chem, 1994, vol. 269 (20), 14661-14665 [0048]

\bulletKabat et al. NIH Publ. No.91-3242, 1991, vol. I, 647-669 [0051]

\bulletZapata et al. Protein Eng., 1995, vol. 8 (10), 1057-1062 [0058]

\bulletKohler et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0059] [0094]

\bulletClackson et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0059] [0103]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0059] [0103]

\bulletMorrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855 [0060]

\bulletJones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0061] [0106]

\bulletReichmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-329 [0061]

\bulletPresta. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0061]

\bulletPlückthun. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer-Verlag, 1994, vol. 113, 269-315 [0062]

\bulletHollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0063] [0119]

\bullet Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs. Murakami et al. The Molecular Basis of Cancer. WB Saunders, 1995 [0073]

\bulletWilman. Prodrugs in Cancer Chemotherapy. Biochemical Society Transactions, 1986, vol. 14, 375-382 [0076]

\bullet Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery. Directed Drug Delivery. Humana Press, 1985, 247-267 [0076]

\bulletGoding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0095] [0100]

\bulletKozbor. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0097]

\bulletBrodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0097]

\bulletMunson et al. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0099]

\bulletSkerra et al. Curr. Opinion in Immunol., 1993, vol. 5, 256-262 [0102]

\bulletPlückthun. Immunol. Revs., 1992, vol. 130, 151-188 [[0102]

\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0103]

\bulletMarks et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0103]

\bulletWaterhouse et al. Nuc. Acids. Res., 1993, vol. 21, 2265-2266 [0103]

\bulletMorrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851 [0104]

\bulletRiechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0106]

\bulletVerhoeyen et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0106]

\bulletSims et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2296 [0107]

\bulletChothia et al. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901 [0107]

\bulletCarter et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285 [0107]

\bulletPresta et al. J. Immnol., 1993, vol. 151, 2623 [0107]

\bulletJakobovits et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 2551 [0109]

\bulletJakobovits et al. Nature, 1993, vol. 362, 255-258 [0109]

\bulletBruggermann et al. Year in Immuno., 1993, vol. 7, 33 [0109]

\bulletHoogenboom et al. J. Mol. Biol., 1911, vol. 227, 381 [0109]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol, 1991, vol. 222, 581-597 [0109]

\bulletMorimoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1992, vol. 24, 107-117 [0110]

\bulletBrennan et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0110]

\bulletCarter et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 163-167 [0143]

\bulletMillstein et al. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0112]

\bulletTraunecker et al. EMBOJ, 1991, vol. 10, 3655-3659 [0112]

\bulletSuresh et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0114]

\bulletShalaby et al. J. Exp. Med., 1992, vol. 175, 217-225 [0118]

\bulletKostelny et al. J. Immunol, 1992, vol. 148 (5), 1547-1553 [0119]

\bulletGruber et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 5368 [0119]

\bulletTutt et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 60 [0120]

\bullet Antibodies, ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0125]

\bulletCaron et al. J. Exp Med, 1992, vol. 176, 1191-1195 [0127]

\bulletShopes, B. J. Immunol., 1992, vol. 148, 2918-2922 [0127]

\bulletWolff et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 2560-2565 [0127]

\bulletStevenson et al. Anti-Cancer Drug Design, 1989, vol. 3, 219-230 [0127]

\bulletEpstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688 [0132]

\bulletHwang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4030 [0132]

\bulletMartin et al. J. Biol. Chem., 1982, vol. 257, 286-288 [0133]

\bulletGabizon et al. J. National Cancer Inst., 1989, vol. 81 (19), 1484 [0133]

\bulletMassey. Nature, 1987, vol. 328, 457-458 [0136]

\bulletNeuberger et al. Nature, 1984, vol. 312, 604-608 [0137]

\bulletLindmark et al. J. Immunol. Meth., 1983, vol. 62, 1-13 [0144]

\bulletGuss et al. EMBO J., 1986, vol. 5, 15671575 [0144]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0153] [0155]

\bullet Chemotherapy Service. Williams & Wilkins, 1992 [0161]

\bulletHudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1987, vol. 84, 7159 [0177]

\bulletCarter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285-4289 [0178]

\bulletFleiss, JL. Statistical Methods for Rates and Proportions. Wiley, 1981, 13-17 [0193]

<110> Genentech, Inc.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Dosificaciones para el Tratamiento con Anticuerpo anti-ErbB2s

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P1775R1PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-08-25

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/151,018

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-08-27

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/213,822

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-06-23

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<160> 15

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Claims (6)

1. Utilización del anticuerpo anti-ErbB2huMab 4D5-8 en la fabricación de un medicamento para su uso en un procedimiento para el tratamiento de un paciente humano diagnosticado con un cáncer de mama, caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de administrar al paciente una dosis inicial de 8 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2; y

administrar al paciente una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo en una cantidad que es de 6 mg/kg, en el que las dosis están separadas en el tiempo entre sí en tres semanas.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el procedimiento también comprende administrar una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que el agente quimioterapéutico es un taxoide, por ejemplo un paclitaxel o docetaxel.

4. Anticuerpo anti-ErbB2huMab 4D5-8 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de un paciente humano diagnosticado con un cáncer de mama caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de administrar al paciente una dosis inicial de 8 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2; y

administrar al paciente una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo en una cantidad que es de 6 mg/kg, en el que las dosis están separadas en el tiempo entre sí en tres semanas.

5. Anticuerpo anti-ErbB2 para su utilización según la reivindicación 4, en el que el procedimiento también comprende administrar una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico.

6. Anticuerpo anti-ErbB2 para su utilización según la reivindicación 5, en el que el agente quimioterapéutico es un taxoide, por ejemplo un paclitaxel o docetaxel.