KR20010020611A - 항산화제에 의한 과증식질병 치료의 향상 - Google Patents

Abstract

세포치사를 증가시키기에 유효한 양의 항산화제와 함께 비정상적인 세포증식을 나타내는 숙주에게 유효량의 항암제를 투여하는 것으로 이루어지는, 항암제의 세포치사활성을 증가시키는 방법. 또한 본발명은 항암제의 투여전에, 동시에, 투여후에 항산화제를 투여하는 것으로 이루어지는, 항암제에 대한 독성을 감소시키거나 비정상적으로 증식하는 세포의 충실성증식의 치료를 위해 투여된 항암제의 치ㄹ료지수를 증가시키는 방법을 포함한다.

Description

항산화제에 의한 과증식질병 치료의 향상{ANTIOXIDANT ENHANCEMENT OF THERAPY FOR HYPERPROLIFERATIVE CONDITIONS}

다양한 질병은 건선(乾癬)에서 악성 종양에 이르기까지 과증식 세포와 관련된다. 일반적으로, 이러한 질병은 정상적인 세포성장, 분화 또는 프로그램된 세포사멸(apoptosis)의 과정에 대한 조절을 상실함으로써 생긴다. 이러한 질병, 특히 종양에 관련된 많은 비정상성은 유전적 단계에서 일어난다. 항암제(또한 세포치사제로 알려져 있음)가 종종 과증식 질병의 치료에 사용된다. 항암제 치료는 다수의 악성질병에는 성공적이긴 하나, 대부분 진전된 질병을 갖는 환자의 생명을 연장시키거나 증상을 경감시키기 위해서 사용된다. 과증식 질병의 치료에 사용되는 두 그룹의 약물은 항대사물질 및 알킬화제이다. 항대사물질은 폴릭산, 푸린, 및 피리미딘 유도체로 다시 세분된다. 또한, 몇가지 천연산물 또는 이들의 유도체가 유사분열 저해제로 사용되어 왔다. 이들에는 백시나 알칼로이드, 및 포도필로톡신의 유도체가 포함된다. 다양하게 발현될 수 있는 비정상적인 세포 과증식의 유전적 기초를 이해하고, 이러한 심각한 질병을 성공적으로 치료하기 위한 치료방법을 개발하기 위한 노력이 여전히 남아 있다.

약 40년동안, 항대사산물인 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 이들 염기를 포함하는 뉴클레오시드(예, 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 또는 FdUrd)가 사람의 충실성종양(solid tumor)에 대해 효과적인 '표준'약물중에 남아있다. 5-플루오로우라실은 주로 결장직장(colorectal), 난소, 신장, 유방, 머리, 및 목 종양의 치료에 사용된다. 5-플루오로-2'-데옥시우리딘은 진전된 위장 선종(adenocarcinomas), 신장세포 암종, 진행자궁암, 및 머리와 목의 편평세포암종를 포함하는 충실성종양의 치료에 사용된다. 플루우로피리미딘의 투여로 유도되는 숙주-독성때문에 플루오로피리미딘 의 임상적 유용성이 제한된다. 플루오로피리미딘의 숙주-독성의 발현은 주로 위장 상피궤양, 혈액생성기능손상(myelosuppression), 더 적은 정도의 심장독성, 간독성 및 신경독성를 포함한다.

종양환자 집단은 5-플루오로우라실 및 5-플루오로-2'-데옥시우리딘의 치료에 내성이 없다. 5-플루오로우라실에 대한 불내증은 처음에 디히드로우라실 데히드로게나제(DHUDase, EC1.3.1.2), 즉 5-플루오로우라실의 분해경로에서 첫번째 효소의 저활성 또는 결핍에 기여한다. 그러나, 모든 불내성 환자가 감소된 디히드로우라실 데히드로게나제의 활성을 나타내는 것은 아니다. 더욱이, 플루오로피리미딘으로 치료한 종양이 저항을 갖게 되었음, 즉 이들 약물에 대한 내성이 생겼음이 나타났다.

결장직장암(CRC)은 결장세포의 클론 집단에서 변이가 축적되어 생기는 다단계 과정이다. p53 종양 억제유전자에서의 변이는 상대적으로 느리나, 결장직장암의 병원에서 흔히 일어나는 일로서, 후기선암 및 암종의 80%이상에서 일어난다(Fearon, et al., FASEB J. 6, 2789 (1992); Srivastarva, et al., Contemp. Oncol. April 63 (192); Kline, et al., Cancer (Phila,. 73, 28 (1994)). 진전된 질병에 대한 종래의 치료법, 예컨대 세포치사 화학요법 및 감마-방사능조사등은 증식세포에 DNA손상을 유도한다. 이러한 손상은 정의되지 않은 기작이기는 하지만, P53을 유도하고 순서대로 G1 세포주기중단시켜 세포증식을 저해하고, 몇몇 경우에는 세포사멸을 일으킨다. 따라서, 기능적인 P53이 결핍된 종양은 종종 이러한 치료에 내성이 있다(S.C. Fightetti et al., Cancer Res. 56, 689(1996); J.S.Kovack et al., Proc. Natl. Acad, Sci.U.S.A. 93, 1093(1996). 이는 기능적인 P53에 비의존적인 진전된 결장직장암의 치료법개발의 중요성이 강조되고 있다.

이제까지 진전된 결장직장암에 대해 가장 효과적인 단일 화학치료제는 여전히 5-FU이다. 5-FU의 활성대사산물인 5-플루오로데옥시우리딘-5--모노포스페이트(FdUMP)는 환원된 폴레이트의 존재하에 티미딜레이트 합성효소(TS)와 복합체를 형성함으로써 효소 활성을 저해하고 DNA합성의 전구체를 제거한다. 5-FU는 또한 RNA에 병합되어 RNA의 가공 및 기능을 변화시킨다. 비록 이러한 것이 세포치사와 어떠한 관계가 있는지는 알려져 있지 아니하다. 이전의 자료에 의하면, 비록 p53의 기능 상실이 크게 5-FU의 효능을 감소시킬지라도(B. Cohen et al., Cancer (Phila.) 67, 1859 (1991); Advanced Cancer Meta-Analysis Project, J.clin. Oncol. 10, 896(1992)), 5-FU는 p53-의존적 및 비의존적 경로를 이용한다는 것이다(Pritchard, et al., Pharmacol. Ther. 72, 149(1996)).

많은 질병의 성공적인 치료방법이 없다는 것을 고려할 때, 프로그램된 세포 치사(예, 세포사멸)를 포함하는 정상적인 세포 기능의 손상을 매개하는 중요한 생물학적 경로를 동정하고, 이러한 질병의 치료를 위한 방법 및 조성물을 동정하는 것이 유리할 것이다.

미국특허 제 5,035,878 및 5,294,430에서 디티오카바메이트가 항암제에 의해 야기된 골수의 혈액생성기능의 손상(myelosuppression)을 역전시킬 수 있다고 기재하고 있다.

따라서, 본발명의 목적은 양성종양 및 악성종양을 포함하는 비정상적인 세포증식질병의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본발명의 또다른 목적은 결장암의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본발명의 또다른 목적은 충실성종양의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본발명의 또다른 목적은 산재(散在)종양(diffuse tumor)의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본명세서에 구체적으로 기재된 항산화제를 포함하여 항산화제는 세포주기 중단을(G1, G2, S 및 M유형) 유도함으로써 비정상적인 세포증식의 치료를 위한 항암제의 효능을 향상시키는데 유용하다는 것을 알았다. 따라서, 일례에서, 본발명은 세포치사를 증가시키기에 유효한 양의 항산화제와 병용하여 비정상적인 세포증식을 나타내는 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 것으로 이루어지는, 항암제의 세포치사 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.

추가로, 항산화제가 없다면 세포주기중단과정을 종료시킬 수 있는 효소를 항산화제가 저해함으로써 세포주기중단을 유도할 뿐만 아니라 세포가 이 중단상태를 유지하도록 하고, 아마도 세포사멸을 유도할 것임을 알았다.

중요하게도, 또한 항산화제가 비정상적인 증식세포에 대한 항암제의 세포치사를 향상시킬 뿐만 아니라 정상적인 세포에 대한 세포치사를 감소시킴을 알았다. 따라서, 항산화제는 항암제의 효능을 증가시키고 독성을 감소시킨다. 정상세포에 대한 완화효과는 상피세포에서 나타난다. 특히, 이전에 미국 특허 제 5,035,878 및 5,294,430에서 Borch가 보고한 바와 같이, 항산화제가 백혈구이외에 다른 세포에 이러한 효과를 나타낸다는 것을 알았다

따라서, 본발명은 항암제의 투여전에, 투여와 같이, 또는 투여한 후에 항산화제를 투여하는 것으로 이루어지는 비정상적으로 증식하는 세포의 충혈성성장의 치료를 위해 투여된 항암제의 치료지수를 증가시키는 방법뿐만 아니라, 항암제의 투여전에, 투여와 함께, 투여한 후에 항산화제를 투여하는 것으로 이루어지는 비정상적으로 증식하는 세포의 충혈성성장의 치료를 위해 투여된 항암제의 독성을 감소시키는 방법을 포함한다.

적어도 어떤 세포주에서, 항산화제는 C/EBPβ의 번역후 변화에 영향을 미침으로써 항암제의 세포치사를 증가시킨다. C/EBPβ는 또한 NF_IL6, AGP/EBPβ, LAP, IL-6DBP,rNF_IL6 및 CRP2(5-11)로 알려져 있으며, 이들은 다양한 그룹의 핵 전사인자로서, 이들은 이들인자와 표적유전자의 인핸서 및/또는 프로모터의 조절 도메인간에 상호작용을 용이하게 하는 염기성 DNA결합 도메인 및 이합체 형성에 필요한 루신지퍼(leucine zipper) 모티브를 포함한다. C/EBPβ는 NF_IL6 반응성 요소를 통해 몇몇 급성기(acute-phase) 단백질 유전자를 활성화시키며, 이는 NF_IL6 반응성 요소가 핵 표적이며, C/EBPβ가 또한 알부민, c-fos, 및 몇몇 지방세포-특이적 단백질을 코딩하는 유전자를 조절한다는 것을 나타낸다. 더욱이, C/EBPβ는 인터루킨-1(IL-1) 및 인터루킨-8(IL-8)을 포함하는 염증성 면역반응, 과립구 매크로파지/콜로니-자극인자, 및 면역글로불린 유전자에 관련된 다양한 유전자의 활성화에 관련되어 있다. 따라서, C/EBPβ는 일련의 신호전달과 세포분화반응에 관련된 다면성 교차활성화제(pleiotropic transactivator)이다.

유일하지는 않을 수 있는 하나의 경로에서, 항산화제는 다음의 일련의 반응을 통해 항암제의 세포치사를 향상시킨다는 것을 알았다: (1) 항산화제는 cAMP의 수준을 증가시키고, cAMP는 C/EBPβ를 인산화시키는 단백질 키나제 A를 활성화시키고, C/EBPβ의 인산화는 C/EBPβ를 세포질에서 핵으로 위치를 변화시키고, 여기서 p21의 유도를 매개하고, p21이 세포성장을 중단시킨다; (2) 항산화제는 단백질 포스파타제2A(PP2A)의 저해를 통해 핵에서 C/EBPβ의 탈인산화를 저해한다. 메틸트랜스퍼라제 활성의 감소로 PP2A 활성저해가 일어나며, 메틸트랜스퍼라제는 PP2A의 활성 서브유니트을 카르복시메틸화시켜 PP2A를 활성형태로 유지하는데 관련된다. 메틸카르복실화의 감소로 기질인 C/EBPβ의 PP2A 효소적 탈인산화가 감소한다. 항산화제는 동시에 C/EBPβ의 인산화를 유도하고 C/EBPβ의 탈인산화를 저해함으로써, 세포의 핵에서 활성화형태의 C/EBPβ를 유지하여 사이클린-의존적 키나제 저해제인 p21^WAF1/CIP1의 계속적인 발현을 유도하여 세포주기를 중단시킨다.

따라서,더욱 일반적으로, 본발명은 세포내부로 항산화제를 투여하는 단계를 포함하는, 세포의 C/EBPβ 단백질의 핵위치화를 증기시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 C/EBPβ를 활성화형태, 즉 인산화된 형태로 유지하여 세포성장중단과 세포사멸을 유도한다.

비제한적인 예로서, 본발명은 항산화 활성을 나타내는 화합물(예, 피롤리딘디티오카바메이트("PDTC") 및 비타민 E 동족체, Trolox(상표명))이 G1 세포주기중단 및/또는 세포사멸을 유도함으로써 사람의 결장직장암 세포에서 DNA복제를 감소시킴을 설명하고 있다.

그러나, 항산화제 화합물은 정상적인 사람의 결장세포, 표피세포 또는 포유류 상피세포(표 1 참조)에는 아무런 영향이 없다. 세포주기중단은 야생형 P53에 비해 돌연변이 P53를 발현하는 결장직장암세포에서 더욱 두드러진다. 세포주기중단과 세포사멸의 유도는 사이클린-의존성 키나제 저해제인 P21^WAF1CIP1의 지속적인 유도와 관련된다. 5-FU와 병용하여 항산화제를 치료하는 경우에 비부착요구성 결장직장암세포 성장을 상당히 감소시킨다. 더욱이, 항산화제만으로 무흉선(atymic) 마우스의 확립된 결장직장암의 성장을 상당히 감소시키고, 5-FU와 병용하는 경우에 종양성장을 중단시키거나(Trolox(상표명)), 종양의 퇴화를 야기한다(피롤리딘디티오카르바이트).

계속적으로 에피토페-부착 C/EBPβ 단백질을 발현하는 DKO-1 세포(사람 결장직장암세포주)를 사용하여 C/EBPβ의 번역후 변형(인산화)이 C/EBPβ활성의 증가의 원인인지를 조사하였다. 면역침전법후에 [32P]오르토포스페이트로 생체내 표지한 결과, PDTC 포르스콜린(3R-3α, 4aβ, 5β, 6β, 6aα, 10, 10aβ, 10bα)-5-(아세틸록시)-3-(에테닐도데카히드로-6,10,10b-트리히드록시-3,4a,7,7,10a-펜타메틸-1H-나프토[2,1-b]-피란-1-온)에 대하여 단백질양의 변화는 없으나 에피토페-표지된 C/EBPβ의 인산화가 4배 내지 6배 증가하였다.

C/EBPβ내의 시험관내 인산화 자리를 지도화함으로써, C/EBPβ의 결실분석을 수행하였다. 단지 160 또는 200 COOH-말단 아미노산을 포함하는 절단된 C/EBPβ는 PDTC-유도 인산화에 대한 기질로서 좋지 않았으나, 305 COOH-말단 아미노산을 포함하는 절단된 C/EBPβ는 완전한 길이의 C/EBPβ만큼 효율적으로 PDTC에 의해 인산화 되었다. 236아미노산과 305아미노산사이에 아미노산 서열을 자세히 조사한 결과 이 영역이 공통적인 PKA 인산화 자리(Arg-X-Ser299-X)을 포함하고 있음이 밝혀졌다.

cAMP-의존성 단백질 카나제-매개 경로의 활성화에 이어서 C/EBPβ의 Ser299의 인산화는 C/EBPβ의 핵내 위치변화 및 세포내 변화된 산화환원전위에 대한 유전자의 후속적인 교차활성화에 있어서 핵심적이다.

단백질 포스파타제 2A(PP2A)에 의한 전사인자의 탈인산화로 핵내에서 C/EBPβ가 불활성화된다. 이 효소는 메틸트랜스퍼라제에 의해 PP2A의 촉매 서브유니트의 카르복시메틸화에 의해서 활성화된다. 추가의 실험에서, 단백질 포스파타제 2A의 촉매 서브유니트의 카르복시메틸화가 전형적인 항산화제인 PDTC에 의해서 저해되며, 추가로 카르복시메틸화의 상실은 메틸트랜스퍼라제의 활성을 저해함으로써 이루어진다. 이러한 결과는 항산화제가 단백질 포스파타제2A의 활성화형태를 유지에 관련된 메틸트랜스퍼라제의 저해를 통해, 핵에서 단백질 포스파타제2A에 의한 C/EBPβ의 탈인산화(따라서 불활성화)를 저해한다는 사실을 뒷받침한다. 메틸카르복실화의 감소로 기질인 C/EBPβ의 PP2A의 효소적 탈인산화가 감소한다. 추가로, 측정된 항산화제가 단백질 포스파타제 1(PP1)에는 거의 또는 아무런 영향이 없음을 알았다.

본발명은 국립보건원 수여번호 제 CA4613, GM53319 CA69457하에 연방정부의 자금으로 부분적으로 이루어졌으며, 미연방정부는 본발명에 대하여 일정한 권리를 가진다.

본발명은 의료 화학분야, 더욱 구체적으로는 과증식 질병의 치료 향상을 위한 항산화제에 관한 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

본명세서에 제시된 도면은 본발명의 바람직한 실시예를 예시할 뿐이며, 본발명의 범위를 이에 한정하려는 의도는 아니다.

도 1A은 PDTC의 농도에 대한 소프트 아가 형성단위 x 106 HCT15 및 HCT16 세포(대조구의 퍼세트로서)의 그래프이다. 이 그래프는 피롤리딘디티오카바메이트(PDTC) 및 비타민 E가 시험관내에서 부착-비의존성 성장을 저해한다는 것을 나타낸다. 배지만(대조구) 또는 피롤리딘디티오카바메이트(2.5-200μM) 또는 비타민 E(0.1-10mM)의 농도를 증가시켜 보충한 소프트 아가에 HCT115 또는 HCT116 세포를 플레이트 함으로써 소프트-아가 콜로니 형성을 측정하였다. 37℃에서 10일간 배양후에 콜로니를 세었다. 측정된 값은 4개에서 3회실험한 것의 대표값이다.

도 1B는 일련의 유식 세포측정기 분석을 나타내며, 이는 항산화제가 CRC세포에서 G1세포주기중단 및 세포사멸을 유도함을 나타낸다. 비동시 HCT116 또는 HCT115 세포가 피롤리딘디티오카바메이트(70μM) 또는 비타민 E(3mM)이 존재하거나 존재하지 않는 것중 어느 하나에서 자란다. 항산화제에 노출한후 24시간후에 세포를 수확하여 유식세포측정기로 분석하였다.

도 1C는 세포내 H₂O₂수준에 대한 시험 화합물을 처리한 후의 시간을 나타내는 막대 그래프이다. 도 1C는 세포내 산화화원전위와 세포주기중단과의 부정적인 관계를 나타낸다. 세포내 산화환원전위의 변화는 내부 H2O2수준을 측정하여 결정하였다. 배경 형광값은 각 측정된 수치에서 뺐다. 수치는 보정된 DHR 평균/10⁴세포 ±s.e.m.로 나타냈다. G1(주기) 또는 사멸(TUNEL-양성: 제곱)세포의 퍼센트는 유식세포측정기로 분석하였다.

도 1D는 N-아세틸시스테인, 비타민 C 및 카탈라제가 내부 H2O2 수준 및 세포주기 퇴화(progression)에 미치는 효과를 나타낸다. 피롤리딘디티오카바메이트(70μM) , 비타민 E(3mM), N-아세틸시스테인 (50μM) 또는 비타민 C(200μM)와 함께 24시간동안 HCT 15세포를 배양하였다. 도 1C에 나타낸 바와 같이 내부 H2O2수준과 세포주기 변화를 측정하였다. 추가로, 사람의 카탈라제에 대한 빈 플라스미드 또는 발현플라스미드로 세포를 일시적으로 형질감염시켜 24시간후에 상술한 바와 같이 분석하였다. 카탈라제-함유 세포에서 얻은 값에서 빈 플라스미드로 형질감염된 세포에서 얻은 수치를 빼고 이중 접시에서 평균±s.e.m.으로 발현하였다.

도 1E는 피롤리딘디티오카바메이트 및 비타민 E가 시험관에서 5-FU 또는 독소루비신에 의한 성장유도를 증가시켰다. 상술한 대로, 피롤리딘디티오카바메이트(70μM) 또는 비타민 E(3mM)의 존재 또는 부존재하는 경우에 5-FU(5 X 10^-8내지 5 X 10^-5M) 또는 독소루비신(1 X 10^-9내지 1 X 10^-6M)중 어느 하나의 농도를 증가시킨 소프프-아가에 HCT 116 및 HCT15 세포를 깔았다. 10일후에 콜로니를 세었고, 기본적인 콜로니 형성의 50%(±s.e.m.)를 감소시키기 위해 필요한 5-FU 또는 독소루비신의 농도로 IC₅₀값을 계산하였다. 값은 4개에서 3회 행한 시험의 대표값이다.

도 2A는 종양을 가진 마우스의 그래프와 관련사진이며, 이는 피롤리딘디티오카바메이트와 비타민 E가 사람의 CRC종양 이종이식의 야생형 p53에서 5-FU의 효능을 향상시켰음을 나타낸다. nu/nu마우스의 견갑골간에 경피로 HCT 116 CRC를 주사하였다. 일단 종양이 약 150mm³에 이르면, 동물에게 매주 피롤리딘디티오카바메이트(70μM) 또는 비타민 E(3mM), 5-FU(40mg/kg) 또는 식염수, 또는 항산화제와 5-FU 모두를 i.p.주입하였다. 상기 사진은 상기 처리후 4주후에 종양크기에 대한 치료의 효과를 나타낸다.

도 2B는 종양 부피(mm³)에 대한 다양한 시험물질로 처리한 후의 주수의 그래프이며, 이는 변이 p53 종양에 대한 첫번째 치료 및 샐비지(salvage) 식이요법으로서 5-FU 및 피롤리딘디티오카바메이트의 향상된 효능을 나타낸다. 상술한 바와 같이, HCT 15 유도-종양이 생성되었다. 그 다음 5-FU의 존재 또는 부존재하는 경우에 3주간 필로리딘디티오카바메이트로 처리하였다. 이러한 시점에서, 피롤리딘디티오카바메이트 및 5-FU의 복합치료를 받은 동물에서 2달간 치료를 중단하였다. 모든 다른 치료군은 나머지 3주간 5-FU와 필롤리딘디티오카바메이트 모두를 치료받았다.

도 3A 내지 3C는 피롤리딘디티오카바메이트가 p53을 경유하여 p21^WAF1/CIP1을 유도함을 나타낸다.

도 3A는 피롤리딘디티오카바메이트 치료후에 기능적 (HCT116)과 변이체 (HCT15)를 발현하는 사람의 CRC세포에서 p21^WAF1/CIP1의 단백질수준이 증가됨을 나타낸다. 나타낸대로 피롤리딘디티오카바메이트(70μM)로 CRC세포를 처리하고 웨스턴 블랏분석을 하였다.

도 3B는 사람의 CRC세포에서 피롤리딘디티오카바메이트에 의한 p21^WAF1/CIP1mRNA의 p53-독립적 유도를 나타낸다. 대수적으로 자라는 비동시성 사람 CRC세포를 70μM 피롤리딘디티오카바메이트함유하는 혈청-함유배지에서 배양하였다. 추가로, p53의 표적분해에 대해 HPV16E6을 함유하는 HCT116세포를 분석하였다. 지정된 시점에 세포를 모아서 폴리(A)mRNA분리를 위해 준비하였다. 1%(W/v) 포름알데히드/아가로스겔에서 샘플(3μg)을 전기영동하고 니트로셀룰스막으로 전이시켰다. 42℃에서³²P 표지된 p21^WAF1/CIP1프로브로 노던 플랏팅 혼성화를 수행하였다. 동일한 로딩과 전이를 위한 대조구로서 IB15를 사용하였다.

도 3C는 항산화제-유도 세포사멸에 p21^WAF1/CIP1발현이 요구됨을 보여준다. 기능적인(p21+/+) p21^WAF1/CIP1또는 결실된 p21^WAF1/CIP1중 어느 하나를 포함하는 HCT16세포를 소정의 피롤리딘디티오카바메이트 또는 비타민 E로 24시간동안 처리하고 TUNEL분석으로 세포사멸을 분석하였다. 수치는 퍼센트 GUNEL양성세포로 표시되고 3회측정의 평균±s.e.m.을 나타낸다.

도 4A는 피롤리딘디티오카바메이트이 NF_IL6 공통서열을 통해 p21^WAF1/CIP1전사활성을유도함을 나타낸다. 2.4킬로 염기쌍 p21^WAF1/CIP1프로모터 서열 및 변이체를 루시퍼라제 리포터유전자에 융합시켰다. TATA는 전사개시위치(+1로 정의)로부터 45bp에 위치한 p21^WAF1/CIP1의 TATA박스를 나타낸다. -2280, -2198, -2078, -1838, -1428 및 1138은 ㅁ라단 결실구조에 대한 5'말단점을 정의한다. -2280△NF_IL6 구조물은 NF_IL6자리에서 두개의 염기쌍 변이를 가진 완전한 프로모터를 포함한다. 모든 리포터 구조물을 HOCT 116 또는 HCT15 세포로 형질감염시키고, 24시간후에 항산화제-유도 루시퍼라제 활성을 상대적인 빛 단위(RLU)로 측정하였다. 루시퍼라제 활성을 CAT활성으로 바꾸고, 그 결과를 기본수준에 대해 활성배수롤 나타냈다.

도 4B는 피롤리딘디티오카바메이트치료가 C/EBPβ DNA결합활성을 유도함을 보여준다. 왼쪽패널: HCT116 및 HCT15 세포를 70μM 피롤리딘디티오카바메이트로 일정시간 처리하고, [γ-³²P] 표지된 p21-NF_IL6올리고뉴클레오타이드로 핵추출물을 배양하였다. 오른쪽 패널: 레인 1-3, 비교대조구를 12시간동안 피롤리딘디티오카바메이트를 처리한(레인 1), 비표지 야생형(레인2) 과량의 올리코뉴클레오타이드 및 변이(레인3) 올리고뉴클레오타이드로 처리한 HCT116세포로부터 유래된 핵추출물상에서 수행하였다. 레인 4-6, C/EBPα(페널 4),β(패널 5),δ(패널 6)다클론항체로 표면이동분석을 수행하였다.

도 4C 및 4D는 C/EBPβ가 C/EBPβ프로모터 활성을 자극할 수 있음을 나타낸다. C/EBPα,β, 또는δcDNA 및 3μg의 p21^WAF1/CIP1-루시퍼라제를 함유하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 발현 플라스미드로 HCT116(도 C) 및 HCT15(도 D)세포를 형질감염시켰다. 대조구 플라스미드는 도 4A에 포함된다.

도 4E는 C/EBPβ가 항산화제-유도 세포사멸에 대한 세포민감성을 조절함을 보여준다. 대조 HCT15세포 및 센스 또는 안티센스 C/EBPβ세포주를 24시간동안 10μM의 무리스테론 A 존재 또는 부존재하에서 및/또는 피롤리딘디티오카바메이트(70μM) 또는 비타민E(3mM)의 배양하였다. 200배 확대로 광현미경하에서 TUNEL양성 세포의 퍼센트로 세포사멸지수를 측정하였고, 수치를 3 샘플에 대해 편균±s.e.m.으로 나타냈다. 삽입은 10μM의 무리스테론 A의 존재 또는 부존재하에서 성장한 형질감염된 세포주에서 p21^WAF1/CIP1단배질수준에 대한 대표적인 웨스턴블랏을 나타낸다.

도 4F는 C/EBPβ 단백질수준의 증가가 시험관내에서 화학적치료제의 세포치사를 향상시킴을 나타낸다. 대조구 HCT15세포 및 센스C/EBPβ세포주를 10μM의 무리스테론 A로 유도하고 5-FU(1.5μM) 또는 독소루비신(0.1μM)에 24시간동안 노출시켰다. 도 4C에서 설명한 방법으로 세포사멸지수를 계산하였다.

도 5a 및 5b은 HCT 116 및 HCT 15세포의 증식상에서 상기 테스트 화합물의 효과측정으로서, 식염수, 비타민 E, PCTC, 5-FU, 및 비타민 E및 5-FU의 혼합으로 처리한 무흉선마우스로부터 유래된 결장직장세포 이종이식으로투어 BrDU-표지된 세포(전체 세포핵의 퍼센트; BrDU는 브로모데옥시우리딘을 말한다)의 성장을 나타내는 막대그래프이다.

도 6a 및 6b는 세포사멸에 대한 상기 테스트 화합물의 효과측정으로서, 식염수, 비타민 E, PCTC, 5-FU, 및 비타민 E및 5-FU의 혼합으로 처리한 무흉선마우스로부터 유래된 결장직장세포 이종이식으로투어 TUNEL-양성세포(전체 세포핵의 퍼센트; TUNEL은 TdT-매개 dUTP 닉말단 표지를 말한다)의 막대그래프를 나타낸다. 4%(v/v)파라포름알데히드에서 하룻밤 종양조직을 고정시키고, 표준조직학 방법에 따라 파라핀에 박는다. 단편을 미리 10mM시트레이트 완충액(pH 6.0)으로 처리하고 BrDU(Boehringer Mannbeim)에 대한 PC10 단클론항체로 배양하였다. 단편화된 DNA의 TdT표지화를 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 증식지수(전체 BrDU세포 핵의 퍼센트) 및 세포사멸지수(TUNEL)를 200배율의 광현미경하에서 세포의 퍼센트로서 측정하였다.

도 7A-7D는 PDTC처리가 변역후 변형을 통해 C/EBPβ DNA결합활성을 유도함을 설명한다.

(A)DKO-1 세포를 일정시간동안 70μM PDTC으로 처리하고, [γ-32P]-표지된 p21-NF_IL6올리코뉴클레오타이드(레인 1-9)로 핵추출물을 제조하였다. 특이성 분석: 레인 10-12, 비교대조구를 3시간동안 PDTC를 처리한(레인 5), 비표지 야생형(레인 11) 과량의 올리코뉴클레오타이드 및 변이(레인 12) 올리고뉴클레오타이드로 처리한 DKO-1세포로부터 유래된 핵추출물상에서 수행하였다. 레인 13-15, C/EBPα(페널 13),β(패널 14),δ(패널 15)다클론항체로 표면이동분석을 수행하였다. (B) 동일한 DKO-1 세포 배양물을 분리하고, 처리방법과 관려된 C/EBPβ mRNA 수준의 변화를 노던블랏분석법으로 측정하였다. IB15는 동일한 로딩과 전이에 대한 대조구이다. (C) 동일한 DKO-1세포 배양물을 [³²P]오르토포스페이트의 존재하에서 PDTC(70μM)로 처리하였다. 시작하기전에(0 시간) 또는 일정한 시간에 세포로부터 세포질 및 핵 부분의 C/EBPβ를 면역침전법으로 정제하였다. SDS-PAGE와 자기방사능법 또는 웨스턴블랏분석법(전체세포단배질의 100 μg/레인)으로 처리방법-관련 C/EBPβ의 위치화를 분석하였다. (D) PDTC(70μM)의 존재하에서 DKO-1 세포를 1시간동안 배양한 다음에, C/EBPβ의 분획화상의 처리방법관련 차이를 탐지하게 위해서 면역세포화학를 처리하였다. 모든실험에서, 시험관내에서 전사된 C/EBPβ단백질로 미리 배양된 전면역혈청 또는 1차적 안티-C/EBPβ항혈청으로 배양물은, 두번째 Cy3-접합 항체로 처리한 후에 어떠한 형광신호도 나타나지 않았다. 대표적인 광마이크로그래프는 PCTC처리전후에 있어서 안티-C/EBPβ염색된 세포를 나타낸다.

도 8A-8B는 cAMP 수준 및 PKA활성에 대한 PDTC의 효과를 설명한다. 일정시간 PDTC(70μM)로 DKO-1세포를 처리하였다. 세포용해물을 제조하여 (A)세포내 cAMP수준 또는 (B) PKA활성에 대해 분석하였다. 상기 수치는 단백질μg당 pmol 평균 ±s.e.m.으로 표시했으며 4회실험중 3회실험의 대표값을 나타낸다.

도 9A-9C는 PDTC가 Ser²⁹⁹에서 C/EBPβ를 인산화함을 도시한다. (A) 0μM(레인1), 70μM PDTC(레인 2), 또는 50μM 포르스콜린으로 처리한 [³²P]오르토포스페이트표지된 DKO-1세포(2mCi/ml.3h)의 내부 C/EBPβ을 안티-C/EBPβ항체로 면역침전시켰다. SDS-PAGE와 자동방사능법으로 표지된 단백질을 표시하였다. (B) 생체내 표지된 에피토프-택 C/EBPβ의 트립트 포스포펩티드 지도. FLAG-에피토페에 대한 항체로 PDTC 처리 또는 미처리 DKO-1세포로부터 면역침전된 야생형(WT) 및 변이체(Ala²⁹⁹)C/EBPβ를 트립신으로 분해하고, 전기영동 및 TLC로 상기 포스포텝티드를 분리하고, 자동방사능법으로 표시하였다. X^1,2를 계속적으로 인산화하였다. 변이체가 아닌 야생형 단백질로 형질감염된 세포에서 PDTC로 처리한 후에 포스포펩티드 X₃의 수준이 증가하였다. 원은 그 기원을 나타낸다. (C) PDTC로 처리 및 비처리 세포로 부터 얻은 야생형 C/EBPβ의 생체내 인산화와 C/EBPβ의 Ala 치환변이의 인산화비교. 자동방사능법(맨위) 및 C/EBPβ 면역블랏을 나타낸다.

도 10A-10B는 C/EBPβ의 PKA인산화가 핵으로 위치하는데 필수적이다. (A)동일한 DKO-1세포를 PDTC(0 μM또는 μ70M)로 3시간동안 처리하였다. 각 군에서 폴리(A)+ mRNA 및 단백질을 분리하고, C/EBPβ mRNA 및 단백질수준상에 처리방법과 관련한 변화를 노덧 또는 웨스턴 블랏법으로 측정하였다. IB15를 동일한 로딩과 전이에 대한 대조구로 나타냈다. (B) PDTC(0 μM또는 μ70M) 또는 PDTC 및 mPKI(미리스틸화된 단배질 키나제 A, 1μM)로 3시간동안 DKO-1세포를 처리하였다. 파라포름알데히드에 세포를 고정하고, C/EBPβ단백질은 면역형광 염색법으로 시각화하였다. mPKI만으로 세포를 처리한 경우에 C/EBPβ의 핵위치화를 유도할 수 없었다(자료는 나타내지 않음).

도 11는 PDTC가 단백질 포스파타제 2A의 촉매서브뉴니트의 카르복시메틸화를 저해함을 나타낸다. 3시간동안 [메틸-³H]S-아데노실 메티오닌 및/또는 70μM PDTC을 포함하는 혈청-함유배지에서 DKO-1세포를 배양하였다. 세포질 또는 핵부분을 준비하여, 표준방법을 사용하여 C/EBPβ를 면역침전시켰다. SDS-PAGE로 항원/항체 복합체를 분리하고, 형광법으로 PP2Ac의 존재를 탐지하였다. PDTC가 핵부분에서 메틸트랜스퍼라제를 저해하고 세포질부분을 더 적은 정도로 저해한다.

도 12는 PDTC는 PP2Ac의 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해한다. 37℃에서 30분간 PDTC 및 부분적으로 정제한 래트의 메틸트랜스퍼라제의 농도를 증가시키면서 [메틸-³H]S-아데노실 메티오닌의 존재하에서 PP2A(a 및 c 다이머)를 배양하였다. SDS-샘플 완충액으로 반응을 종료시켰다. SDS-PAGE로 샘플을 분리하고, 형광법으로 메틸화된 PP2A 촉매서브유니트의 존재를 시각화하였다. 나타낸 바와 같이, PDTC는 메틸트랜스퍼라제의 활성을 선택적으로 저해하여 용량에 의존적에 방식으로 PP2A의 촉매서브유니트를 카르복시메틸화시킨다.

도 13은 시간대 단백질 기질에 남아있는 방사능퍼센트의 그래프이다. 숫자는 PDTC가 PP2A를 저해하나 PP1를 저해하지 않는 것을 나타낸다. PDTC의 활성을 I2(선택적인 PP1 저해제)에 비교하고, 오카다산(PP2A과 PP1의 저해제)과 I2, 그리고 오카다산과 PDTC를 비교하였다. PDTC(테스트용)의 존재 및 부존재(대조구)하에서 DKO-1세포를 배양하였다. 상기 세포를 용해시킨 후에, 방사능 인산화된 C/EBPβ를 첨가하였다. 테스트 화합물을 첨가하고 용해물로 반응시켰다. 상기 단백질을 모아서, 단백질에 남아있는 방사능 포스페이트의 양을 측정하였다.

도 14는 PP2Ac 단백질 포스파타제로 전사인자 C/EBPβ와의 복합체를 형성함을 나타낸다. 페닐세파로스로 래트의 수용성 뇌추출물을 분획화하고 외부 PP2A 헤테로다이머(a-c 복합체)를사용하여 메틸트랜스퍼라제 활성을 분석하였다. 추가로, 소스 Q, 강음이온교환 및 겔여과 크로마토그래피로 메틸트랜스퍼라제의 활성 피크를 분획하였다. 도 14에 나타낸 부분정제된 메틸트랜스퍼라제는 겔여과 칼럼으로부터 최고의 메틸트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 메틸트랜스퍼라제 활성의 이 피크부분은 추가로 DEAE, 약음이온교환 및 모노Q, 다른 강음이온교환수지, 칼럼을 행했다. C/EBPβ와 PP2A 둘다 모두는 이러한 추가의 단계후에 탐지가능했다. 래트의 뇌추출물을 양성대조구(C/EBPβ 및 PP2Ac는 SDS-PAGE상에 약 45 및 36kDa로 이동한다 )로서 나타냈다.

p21 프로모터상의 특정위치에 결합하여 p21발현에 독립적인 p53을 유도하는 기작을 통해, 항산화제가 비정상적으로 증식하는 세포의 세포주기를 중단하고 세포사멸을 유도함을 발견하였다. 또한, 항산화제의 처리후에 단백질 키나제 A에 의한 C/EBPβ의 Ser299위치에서 부위특이적 인산화가 이 단백질의 핵위치화에 필수적임을 알았다.

또한, PP2A의 저해를 통해, 항산화제가 핵에서 C/EBPβ의 탈인산화를 막아 C/EBPβ의 불활성화 및 탈위치화를 시킴을 알았다. PP2A의 저해는 메틸트랜스퍼라제의 감소에 의해 야기되며, 메틸트랜스퍼라제는 PP2A의 촉매서브유니트를 카르복시메틸화하는 효소로서 활성형 PP2A의 유지에 관련된다. 메틸카르복실화의 감소로 기질인 C/EBPβ의 PP2A의 효소적 탈인산화가 감소하게 된다. C/EBPβ의 인산화를 유도함과 동시에 C/EBPβ의 탈인산화를 저해함으로써, 항산화제는 세포핵에서 C/EBPβ의 활성상태를 유지하여 p21^WAF1/CIP1의 발현을 계속적으로 유도하여 세포주기를 중단시킨다.

생채내 및 시험관내에서 PP2A 서브유니트의 카르복시메틸화의 원인인 메틸트랜스퍼라제는 독특한 유형의 카르복시메틸트랜스퍼라제이다. 포유동물의 유형 II 및 유형 III 카르복시메틸트랜스퍼라제는 PP2Ac 서브유니트를 카르복시메틸화하는 효소와는 실질적으로 다른 특성을 가지고 있는 것 같다. 단백질 카르복시 메틸트랜스퍼라제 유형 II는 D-아스파틸 및 L-아스파틸 잔기를 변형시켜 노화되면서 단백질에 축적되므로, 이들 아미노산을 함유하는 다른 단백질을 메틸화한다. 카르복시메틸트랜스퍼라제 유형 III는 단백질(G-단백질)의 C-말단의 앞에 있는 시스테인에서 단백질을 변형하고, 시스테인의 이소프레닐화 및 마지막 세개의 카르복시 말단 잔기의 절단이 필요하다. 시험관내에서 DKO-1 결장직장 세포주의 항산화제 처리에 의해 이 카르복시메틸트랜스퍼라제의 활성이 변화되지 않는다. 따라서, 시험관내 자료는 항산화제가 선택적으로 PP2Ac의 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해하나 G-단백질 메틸화를 저해하지 않는다.

또한, C/EBPβ, PP2A 및 메틸트랜스퍼라제로 이루어지는 신규한 고차원 단백질 복합체를 동정하였다. 따라서, 본발명의 또다른 구체예는 분리된 형태의 신규한 복합체가 예를 들면 70%로, 바람직하게는 80% 또는 90%의 순도로 존재한다. 이 효소를 분리하는 방법은 실시예 27에서 제공한다.

I. 본발명의 구체예

본명세서에서 기술한 기본적인 발견에 기초하여, C/EBPβ의 핵내위치화를 증가시키는 방법을 제공하며,이는 세포내부로 항산화제를 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 C/EBPβ단백질은 인산화된 활성상태로 유지하여 세포성장을 중단하고 세포사멸을 유도한다.

일례에서, 본발명은 세포치사를 증가시키기에 유효한 양의 항산화제와 함께 치료가 필요가 숙주에게 유효량의 항암제를 투여하는 것을 포함하는 항암제의 세포치사활성을 증가시키는 방법이다. 본명세서에 구체적으로 기재된 것을 포함하여 항산화제는 세포주기중단(G1,G2, S 및 M유형)을 유도하여 비정상적인 세포증식과 관련된 질병의 치료를 위한 항암제의 효능을 증가시키는데 유용함을 알았다. 이 방법은 C/EBPβ단백질은 인산화된 활성상태로 유지하여 세포성장을 중단하고 세포사멸을 유도함을 알았다. 또다른 예예서, 약리적 유효량의 화학적 치료제와 함께 또는 택일적으로 세포치사를 증가시키기에 유효량의 항산화제를 환자 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 비정상적인 세포과증식 질병에 대한 항암제나 화학적 치료제의 세포치사를 증가시켜 숙주, 예컨대 그러한 치료가 필요한 대상 또는 동물에서 C/EBPβ단백질은 인산화된 활성상태를 증가시키는 방법을 제공한다.

또다른 일례에서, 본발명은 항산화제와 함께 종양의 화학치료제 및 방사능치료법(radiation theraphy)중에서 선택되는 치료학적 유효량의 세포치사화학치료법을 숙주에게 투여하는 단계를 포함하는 종양질병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 대표적인 종양 화학치료제 및 항산화제는 다음에 열거하였다. 비정상적인 세포증식 상태를 개선할 수 있는 어떠한 방사능치료법도 본발명에 적합하며, 미립자 또는 전자기인 이온화조사(Ionizing radition)도 포함한다. 다양한 종양상태에 대해 적합하고 유효 투여량의 방사능치료가 잘 알려져 있다. 비제한적인 일례에서, 방사능치료는 적절한 시간동안, 예를 들면 6주까지 약 3,000 센티그레이(centigrey)내지 약 5,000 센티그레이의 투여량으로 감마조사를 하는 것이다.

본발명은 또한 약리적인 유효량의 항산화제를 투여하건, 항산화제와 항암제를 함께 투여하는 단계를 포함하는, 그러한 치료가 필요한 환자에서 세포성장의 중단 및 세포사멸을 유도하는 수단으로서 p21의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

추가로 본발명은 약리학적 유효량의 항산화제 또는 항산화제 및 항암제를 함께 투여하는 단계를 포함하는, 그러한 치료가 필요한 환자에서 세포주기중단과 세포사멸을 조절하는 방법에 관한 것이다.

또다른 일례에서, 본명세서에 자세히 기재된 효과를 달성하기 위해서, C/EBPβ, 또는 C/EBPβ에 실질적으로 상동성인 단백질을 유효량으로 투여함으로써 치료효과를 달성할 수 있다. 상기 단백질 또는 단백질 동족체를 단독으로나 항암제의 치료에 보조적으로 투여할 수 있다. C/EBPβ에 실질적으로 상동성인 단백질은 본명세서에서 형태-X1-Arg-X2-Ser-X3(여기서, X2는 298위치에서 C/EBPβ 아미노산이고, X1 및 X3는 C/EBPβ서열의 실질적으로 상동성을 갖는 펩티드서열을 둘러싼 펩티드를 말한다.)의 펩티드 서열을 포함하는 것 또는 형태-X1-Arg-X2-Ser-X3의 펩티드 서열로 구성되는 것으로 정의한다. 실질적인 상동성이라 함은 모서열과 실질적으로 동일한 기능을 수행하고 60%이상, 또는 더욱 바람직하게는 75%이상, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 또는 그이상 서열 동일성이 있는 단백질 또는 펩티드서열을 의미한다. 단백질의 효과적인 절달방법은 알려져 있으며 이 치료법의 효과를 증가시키기 위해서 본구체예와 함께 채택될 것이다.

또다른 일례에서, 탈인산화에 견딜 수 있는 안정화된 인산결합을 갖는 합성 Ser299 인산화된 C/EBPβ 동족체를 투여할 수 있을 것이다. 그러한 안정화된 포스페이트는 포스포로아미데이트 및 포스포네이트 동족체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본발명은 세포내부로 단백질포스파타제의 저해량의 항산화제를 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 단백질 포스파타제2A (PP2A)를 저해하는 방법을 제공한다. 본발명의 또다른 구체예에서, 메틸트랜스퍼라제 또는 메틸에스터라제-저해량의 항산화제를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, PP2A의 촉매서브유니트의 카르복시메틸화상태를 감소시키는 방법이 제공된다.

유일한 것은 아니지만 하나의 경로에서, 항산화제가 다음을 포함하는 일련의 반응을 통하여 항암제의 세포치사를 증가시킴을 알았다:

유일하지는 않을 수 있는 하나의 경로에서, 항산화제는 다음의 일련의 반응을 통해 항암제의 세포치사를 향상시킨다는 것을 알았다: (1) 항산화제는 cAMP의 수준을 증가시키고, cAMP는 C/EBPβ를 인산화시키는 단백질 키나제 A를 활성화시키로, C/EBPβ의 인산화는 C/EBPβ를 세포질에서 핵으로 위치를 변화시키고, 여기서 p21의 유도를 매개하고, p21이 세포성장을 중단시킨다; (2) 항산화제는 단백질 포스파타제2A(PP2A)의 저해를 통해 핵에서 C/EBPβ의 탈인산화를 저해한다. PP2A 활성저해는 메틸트랜스퍼라제 활성의 감소에 의해서 야기되며, 메틸트랜스퍼라제는 PP2A의 활성서브유니트을 카르복시메틸화시켜 PP2A를 활성화형태로 유지하는데 관련된다. 메틸카르복실화의 감소로 기질인 C/EBPβ의 PP2A 효소적 탈인산화가 감소한다. 항산화제는 동시에 C/EBPβ의 인산화를 유도하고 C/EBPβ의 탈인산화를 저해함으로써, 세포의 핵에서 활성화형태의 C/EBPβ를 유지하여 사이클린-의존적 키나제 저해제인 p21^WAF1/CIP1의 계속적인 발현을 유도하여 세포주기를 중단시킨다.

이러한 발견에 기초하여, 화합물이 세포의 핵에서 C/EBPβ단백질의 위치화를 증가시킬 수 있는 지를 측정함을 포함하는, 비정상적 세포증식의 치료를 위한 치료학적으로 유효한 화합물의 동정방법을 제공한다. 또다른 일례에서, C/EBPβ단백질의 Ser29에서 인산화를 증가시키는 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하는, 비정상적 세포증식의 치료를 위한 치료학적으로 유효한 화합물의 동정방법을 제공한다. 본방법은 소정의 시간동안(예컨대, 3시간) 37℃에서 테스트 화합물과 함께 선택된 세포주를 배양한 후에 핵부분의 C/EBPβ 면역침전법을 수행하는 것을 포함한다. 트립신 분해 및 TLC을 수행하여 C/EBPβ의 인산화를 확인하였다.

본명세서에 상세히 기술된 발견에 기초하여, 당업자는 본발명이 추가로 다음의 예를 포함하나 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다.

(1) Ser299에서 C/EBPβ의 인산화상태를 변화시키는 화합물의 능력을 측정함으로써 치료학적 유효 화합물을 동정하는 방법. 이 방법에서, 적어도 인산화된 C/EBPβ, a 및 c서브유니트를 포함하는 이량체형태의 단백질 포스파타제 2A, 메틸트랜스퍼라제 및 [메틸-3H]S-아데노실 메티오닌을 포함하는 용액에 테스트 화합물을 포함한다.

(2) 상기 (1) 또는 본기술분야의 당업작에게 명백하거나 잘 알려진 다른 방법을 사용하여 단백질 포스파타제 2a를 저해하는 화합물의 능력을 측정함으로써 치료학적 유효 화합물을 동정하는 방법.

(3) 단백질 포스파타제 2a의 카르복시메틸화 상태를 변화시키는 화합물의 능력을 측정함으로써 치료학적 유효 화합물을 동정하는 방법.

(4) 메틸트랜스퍼라제 활성을 변화시키는 화합물의 능력을 측정함으로써 치료학적 유효 화합물을 동정하는 방법.

(5) X1-Arg-X2-Ser-X3 형태의 펩티드 서열(여기서, X2는 298위치에서 C/EBPβ 아미노산이고, X1 및 X3는 C/EBPβ서열의 실질적으로 상동성을 갖는 펩티드서열을 둘러싼 펩티드를 말한다.)

(6) C/EBPβ의 핵내 보유시간 및 기능을 증가시키는 항산화제를 약리적 유효량으로 환자나 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 환자나 동물에 있어서 cAMP-의존성 단백질 키나제, 단백질 키나제 C, ras-의존성 MAP 키나제 및 칼슘-칼모둘린 의존성 키나제를 포함하나 이에 한정되지 않는 조절자에 의해서 유도되는 C/EBPβ의 인산화상태 및 기능을 향상시키는 방법.

(7) 약리적 유효량으로 항산화제를 환자나 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 환자나 동물에 있어서 cAMP-의존성 단백질 키나제, 단백질 키나제 C, ras-의존성 MAP 키나제 및 칼슘-칼모둘린 의존성 키나제를 포함하나 이에 한정되지 않는 조절자에 의해서 유도되는 C/EBPβ의 인산화상태 및 기능을 향상시키는 방법.

(8) 약리적 유효량으로 항산화제를 환자나 동물에게 투여하는 것을 포함하는 , 암질병을 나타내거나 진전될 위험에 있는 숙주, 예컨대 환자 또는 동물을 치료하는 방법.

(9) C/EBPβ 발현 및 기능의 핵위치화르 증가시키는 것을 포함하는, 암질병이 진전될 위험이 있는 환자 또는 동물을 치료하는 방법.

(10) C/EBPβ의 핵내 보유시간을 증가시키는 치료제를 치료학적 유효량으로 환자나 동물에게 투여하는 단계를 포함하며 상기 치료제는 항산화제 단독이나 항산화제와 함암제의 병용인 것으로 이루어지는, 양성 또는 악성종양을 포함하나 이에 한정되지않는 비정상적인 세포증식 질병을 갖는 환자의 치료방법.

(11) C/EBPβ활성화, C/EBPβ 인산화 및 핵내보유시간, PP2A의 촉매서브유니트의 카르복시메틸화의 PP2A저해, 및 메틸트랜스퍼라제 또는 메틸에스터라제의 저해를 단독으로 또는 함께 측정함으로써, 종양 및 세포증식 질병을 갖는 환자의 치료에 대한 반응의 진단 및 측정방법.

II. 항산화제

본명세서에 사용된 바와 같이, 항산화제라는 용어는 생리적 조건하에서 산화가능한 화합물의 산화를 방지하는 물질을 말한다. 일례에서, 화합물이 시험관내에서 내부에 산소라디칼을 생산할 수 있다면(reduce) 이러한 개시목적으로 그 화합물을 항산화제로 여겨진다. 산화된 조건하에서 항산화제를 세포추출울에 첨가하여 산화가능한 화합물의 효과를 평가할 수 있다. 비제한적인 예로서, 항산화제 스캐빈저 산소, 수퍼옥사이드 음이온, 과산화수소, 수퍼옥사이드 라디칼, 리포옥사이드 라디칼, 히드록시 라디칼, 또는 반응성 금속에 결합하여 리피드 단백질, 핵산등에 산화손상을 방지하는 것이다. 항산화제는 다음 분류의 화합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

A) 디티오카바메이트

디티오카바메이트는 특허나 과학문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 디티오카바메이트 및 관련화합물은 광범위하게 검토되었는데, 예를 들면 G.D Thorn 등의 "the Dithiocarbamates and Related Compounds" Elsevier, New York, 1962. 미국특허 제 5,035,878 및 5,294,430은 디티오카바메이트가 항암제 치료로 야기된 골수의 혈액생성기능에 대한 손상(혈액생성손상)을 역전시킬 수 있다고 기재하고 있다. 이 두 특허에는 본발명의 용도에 적합한 C/EBPβ의 핵위치화를 증가시킬 수 있는 약리적으로 허용되는 모든 디티오카바메이트가 기재되어 있다.

활성화합물

디티오카바메이트는 중금속 중독에 임상적으로 사용되는 전조금속 킬레이트이다. Baselt, R.C. F.W. J. Sunderman, et al(1977), "Comparisons of antidotal efficacy of sodium diethyldithiocarbamate, D-penicillamine and triethylenetetraamine upon acute toxicity of nickel carbonyl in rats" Res Commun Chem Pathol Pharmacol 18(4): 677-88; Menne, T. and K. Kaaber(1978), "Treatment of pomphoyx due to nickel allergy with chelating agens" Contact Dermatitis 4(5): 289-90; Sunderman, F.W.(1978), "Clinical response to therapeutic agents in poisoning from mercury vapor" Ann Clin Lab Sci 8(4): 259-69; Sunderman, F.W.(1979), "Efficacy of sodium diethyldithiocarbamate(dithocarb) in acute nicke carbonyl poisoning" Ann Clin Lab Sci 9(1) :1-10; Gale, G.R., A.B. Smith, et al., (1981), "Diethyldithiocarbamate in treatment of acute cadmium poisoning" Ann Clin Lab Sci 11(6):: 476-83; Jones, M.M. and M＞G.Cherian(1990), "The search for chelate antagonists for chronic cadmium intoxication" Toxicology 62(1): 1-25; Jones,S.G., M.A. Basinger, et al(1982), "A comparison of diethyldithiocarbamate and EDTA as antidotes for acute cadmium intoxication" RE Commun Chem Pathol Pharmacol 38(2):271-8; Pages, A., J.S.Cases, et al.(1985), "Dithiocarbamates in heavy metal poisoning: complexes of N,N-di(I-hydroxyethyl)dithodcarbamate with Zn(II), Cd(II), Hg(II), CH3Hg(II), and C6H5Hg(II): J.Inonrg Biochem 25(I): 35-42; Tandon, S.K., N.S. Hashmi, et al.(1990), "The lead-chelating effects of substituted dithiocarbamates" Biomed Environ Sci 3(3): 299-305.

디티오카바메이트는 또한 신장의 독성을 방지하기 위한 시스-플라티넘 화학요법에서 부수적으로 사용된다. Hacker, M.P., W.B. Ershler, et al.(1982). "Effect of disufiram(tetraethlthiuram disulfide) and diethydithocarbamates on the bladder toxicity and antitumor antivity of cyclophosphamide in mice" cancer Res 42(11):4490-4, Bodenner., 1986 #733; Saran, M. and Bors, W.(1990). "Radical ractions in vivo--an overvieww" Radiat. Environ. Biophys. 29(4):249-62.

현재 알콜남용에 사용되는 디티오카바메이트는 디술피람, 디에틸디티오카바메이트의 이량체이다. 디술푸람은 간의 알데히드 데하이드로게나제를 저해한다. Inoue, K.,and Fukunaga, et al., (1982). "Effect of disulfiram and its reduced matabolite, diethylthiocarbamate on aldehyde dehydrogenase of human erythrocyte" Life Sci 30(5)" 419-24.

디티오카바메이트가 HIV바이러스 복제를 저해하고 특이적인 T세포 서브군의 성숙을 향상시킨다는 것이 보고되었다. 이는 AID환자군에게 디에틸디티와바메이트의 임상적 시도를 유도하였다. Reisinger, E., et al., (1990). "Inhibition of HIV progression by dithocarb." Lancet 335:679.

디티오카르보실레이트는 A-SC(S)-B 구조의 화합물이고, 카르보디티올 또는 카르보디티올레이트로서 택일적으로 언급되는 티올항산화제로 알려진 일반적인 군의 일원이다. SC(S)부분이 치료활성에 필수적이고, A 및 B는 화합물의 효능 또는 독성에 역으로 형향을 미치지 않는 어떠한 그룹일 수 있다.

또다른 구체예에서, 디티오카바메이트에서 하나 또는 둘의 황원자를 셀레늄원자로 대체한다. 셀레늄원자로 황원자를 대체함으로써 어떤 경우에 상기 분자의 독성을 감소시킬 수 있어 환자가 더 잘 견딜 수 있다.

크기, 전하, 독성 및 안정도(장관과 같은 염기성 환경 이나 위장과 같은 산성환경에서 안정성을 포함)를 포함하여 화합물에 대해 원하는 특성을 부여할 수 있도록 당업자가 A 및 B를 선택할 수 있다. 또한, A 및 B의 선택은 화합물의 조직-분포 및 약동역학에 중요한 효과를 가진다. 상기 화합물은 신장에 의해 배출되어 제거되는 것이 바람직하다.

약리적으로 디티오카르복실레이트를 투여하는 장점은 티오에스터라제에 의해 생체내에서 효소적으로 절단되지 않으므로 생체내에서 연장된 수명을 가질 수 있다는 것이다.

바람직한 예에서, A는 수소 또는 약리적으로 허용가능한 양이온으로서 소디움, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 아연, 비스무쓰, 바륨, 구리, 코발트, 니켈 또는 카드뮴을 포함하나 이에 제한되지 않는다; 일반적으로 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레인산, 아스코르브산, 벤조산, 탄산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 나프탈렌디술폰산, 또는 폴리갈락트론산을 포함하나 이에 한정되지 않는 일반적으로 카르복시산, 유기산형성 염; 질소함유 헤테로환, 또는 구조식 NR⁴R⁵R⁶R⁷, 여기서, R⁴, R⁵, R⁶,R⁷는 각각 독립적으로 수소, C_1-6직쇄상, 분지, 또는 (C_4-6인 경우에) 시클릭알킬, 히드록시(C_1-6)알킬(여기서 하나이상의 히드록시그룹이 탄소원자중 어느하나에 위치함), 또는 아릴, N,N-디벤질에틸렌-디아민, D-글루코사민, 콜린, 테트라에틸암모늄, 또는 에틸렌디아민을 포함하나 이에 한정되지 않는 암모니아 또는 다른 수소생성염기로부터 형성되는 양이온이다.

또다른 일례에서, A가 부착된 분자로부터 생체내에서 절단가능한 생리적으로 절단가능한 이탈기일 수 있으며, 아실(아세틸, 프로피오닐, 및 부티릴을 포함), 알킬, 포스페이트, 술페이트 또는 술포네이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또다른 일례에서, B는 알킬, 아케닐, 아키닐, 알크아릴, 아르알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로알키닐, 아릴, 알크아릴, 수소, C_1-6알콕시-C_1-10알킬, C_1-6알킬티오-C_1-10알킬, NR²R³, -(CHOH)nCH₂OH (여기서 n은 0, 1,2,3,4,5, 또는 6이고), 알킬아세틸, 아킬프로피오닐, 및 알킬부티릴를 포함하는 (CH₂)nCO₂R1, 히드록시(C_1-6)알킬(여기서 하나이상의 히드록시그룹이 탄소원자중 어느하나에 존재함)이다.

또다른 일례에서, B는 NR²R³이고, 여기서 R²및 R³는 각각 독립적으로 알킬;-(CHOH)n(CH₂)nOH, 여기서 n은 0,1,2,3,4,5,6이고; -(CH₂)nCO₂R¹, -(CH₂)nCO₂R⁴; 히드록시(C_1-6)알킬-; 알케닐(비닐, 알릴 및 CH₃CH=CH-CH₂-CH₂를 포함함); 알킬(CO₂H), 알케닐(CO₂H), 알키닐(CO₂H) 또는 아릴, 여기서 아릴기는 상기한 바와 같이 치환가능하며, 예를 들면, NO₂, CH₃, t-부틸, CO₂H, 할로, p-OH기; 도는 R²및 R³는 -(CH₂)m-과 같은 브릿지를 구성할 수 있고, 여기서 m은 3,4,5,6,7,8,9, 또는 10이고 R⁴는 아세틸, 프로피오닐, 및 부티릴을 포함하는 알킬, 아릴, 알크아릴, 또는 아르알킬임.

또다른 일례에서, B는 헤테로시클릭 또는 알킬헤테로시클릭기이다. 헤테로사이클은 임의로 부분적으로나 완전히 수소화될 수 있다. 비제한적예는 페나진, 페노티아진, 피리딘 및 디히드로피리딘을 포함하는 상기 열거된 것들이다.

또다른 일레에서, B는 약리적으로 활성인 화합물 또는 약품의 잔기이다. 본명세서에서 사용된 약품이란 용어는 질병이나 질환의 처치,치료 또는 방지를 위한 약으로서 내부적으로 또는 외부적으로 사용되는 어떠한 물질을 말한다. -C(S)SA-기는 상기 약물에 직접적으로 부착되거나 어떠한 적합한 결합부분을 통해 결합될 수 있다.

또다른 일례에서, 디티오카바메이트는 AO₂C-R⁹-NR¹⁰-C(S)SA구조의 아미노산 유도체이고, 여기서 R⁹는 이가 B부분, 연결부분, 또는 자연적으로 존재하는 아미노산의 내부잔기(예컨대, 아민의 CH₃CH, 글리신의 CH₂, 라이신의 CH(CH₂)4NH₂, 등) 및 R¹⁰은 수소 또는 저급알킬이다.

또한, B는 하나이상의 디티오카바메이트기가 직접적으로 또는 적합한 연결기를 통해 부착된 폴리머일 수 있다. 바람직하게는 디티오카바메이트는 생체내 조건하에서 폴리머로부터 유리되어 적합한 시간동안 치료효과를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리머 자체는 또한 생체내에서 분해될 수 있다. 본명세서에서 사용된 생분해성 또는 생침식성이란 용어는 원하는 적용(보통 생체내 치료)에서 허용가능한 시간내, 보통 5년이내 바람직하게는 1년이내에, 25-37℃에서 PH6-8의 생리적 용액에 노출되어 분해되거나 용해되는 폴리머를 말한다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리머는 1시간 및 수주동안에 적용에 따라 분해된다.

다수의 분해성 폴리머가 알려져 있다. 비제한적인 예는 펩티드, 단백질, 뉴클레오단백질, 리포단백질, 글리코단백질, 합성 및 천연 폴리펩티드 및 폴리아미노산이며, 아르기닌, 라이신, 아스파탐산, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 글루타민, 히드록시라이신, 세린, 트레오닌, 및 타이로신을 포함하나 이에 한정되지 않은 폴리머; 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리언하이드라이드, 알부민 또는 콜라겐, 락토오스와 같은 당단위를 갖는 폴리사카라이드, 및 폴리카프로락탐과같은 폴리(a-히드록시산)을 포함하는 폴리오르토에스테르이다. 상기 폴리머는 임의의 폴리머 또는 블락폴리머일 수 있다.

또한, B 는 디티오카바마에트의 수용성을 증가시키는 그룹일 수 있으며, 그 예는 다음과 같다; -저급 알킬-O-R⁸(여기서, R⁸은 -PO₂(OH)^-M⁺또는 PO₃(M⁺)₂이고, 여기서 M⁺는 약리적으로 허용가능한 양이온임);-C(O)(CH₂)₂CO₂ ^-M⁺, 또는 -SO₃ ^-M⁺; -저급 알킬카르보닐-저급 알킬; -카르복시 저급 알킬; -저급 알킬아미노-저급 알킬; N,N-디-치환된 아미노저급 알킬-, 여기서 치환체는 각각 독립적으로 저급 알킬을 나타낸다; 피리딜-저급 알킬-; 이미다조일-저급 일킬-; 이미다조일-Y-저급 알킬,여기서 Y는 티오 똔느 아미노이고; 모르폴리닐-저급알킬; 피롤리디닐-저급 알킬; 티아졸리닐-저급 알킬-; 피페리디닐-저급 알킬; 모르폴리닐-저급히드록시알킬; N-필릴; 피페라지닐-저급 알킬; N-치환 피페라지닐-저급 알킬, 여기서 치환체는 저급알킬이고; 트리아조일-저급알킬; 테트라조일-저급알킬; 테트라조일아미노-저급 알킬; 또는 티아조일-저급알킬.

또다른 일예에서, B-C(S)S-SC(S)-B와 같은 이량체를 투여할 수 있다.

본명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 특별히 언급하지 아니하면, 포화직쇄, 분지 또는 시클릭(C₅이상인 경우에)의 C_1-10의 탄화수소(또는 저급 알킬, 즉 C_1-5)이며, 구체적으로 메틸,에틸,프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 시클로펜틸,이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 시클로헥실,시클로헥실메틸, 30메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 및 2,3-디메틸부틸이다. 상기 알킬기는 임의로 히드록시, 아미노, 모노-또는 디-치환 아미노로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 부분을 갖는 탄소중 어느하나가 치환될 수 있으며, 상기 치환기는 독립적으로 알킬, 아릴, 알크아릴, 또는 아르알킬이고; 아릴, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 술폰산, 술페이트, 포스폰산, 포스페이트 또는 포스포네이트, 또는 필요하면 비보호나 보호된 것일 수 있으며, 이들은 당업자에게 알려져 있으며, 예컨대 Greene등의 "Protective Groups in Organic Synthesis" John Wiley and Sons, Second Edition, 1991에 기재되어 있다.

본명세서에서 용어 "알케닐"은 특별히 언급하지 아니하면, 하나이상의 이중결합을 갖는 직쇄, 분지, 또는 시클릭 C_2-10의 탄화수소을 말한다.

용어 "아르알킬"이란 하나이상의 알킬치환체를 갖는 아릴기를 말한다.

용어 "알크아릴"이란 하나이상의 아릴치환체를 갖는 알킬기를 말한다.

용어 "할로(알킬, 알케닐, 또는 알키닐)이란 그 그룹에 하나이상의 수소가 할로겐원자로 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐기를 말한다.

본명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아릴"이란 페닐, 비페닐, 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐을 말한다. 상기 아릴기는 임의로 다음의 군에서 선택된 하나이상의 부분으로 치환될 수 있다; 알킬, 히드록시, 아미노, 일킬아미노, 아르아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 술폰산, 술페이트, 포스폰산, 포스페이트, 또는 포스포네이트, CO2H 또는 이의 약리적으로 허용되는 염, CO2(알킬, 아릴, 알크아릴 또는 아르알킬), 또는 글루타민, 필요하다면 보호되거나 보호되지 않으며, 이들은 본기술분야의 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들면 Greene등의 "Protective Groups in Organic Synthesis" John Wiley and Sons, Second Edition, 1991에 기재되어 있다.

본명세서에 사용된 바와 같이 용어 "알콕시"는 특별히 다른 언급이 없으면 -O-알킬 구조의 부분을 말한다.

본명세서에 사용된 바와 같이 용어 "아실"은 특별히 다른 언급이 없으면 구조식 C(O)R'을 갖는 기를 말하고, 여기서 R'은 알킬, 아릴, 알크아릴, 또는 아르알킬기이다.

본명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로시클릭"은 하나이상의 황, 산소, 또는 질소를 방향족 고리에 갖는 방향족 부분을 말한다. 비제한적인 예로는 페라진, 페노티아진, 푸릴, 피리딜, 피리미딜, 티에닐, 이소티아졸릴, 이미다졸일, 테트라졸릴, 피라지닐, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 퀴놀릴, 이소뮈놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조푸릴, 피아졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤지미다졸릴, 푸리닐, 모르폴리닐, 카르보졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,4-티아다졸릴, 이소옥살졸릴, 피롤릴, 피라졸ㄹ릴, 퀴나졸리닐, 피리다지닐, 피라지닐, 시놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 산티닐, 하이포잔티닐, 프테리디닐, 5-아자시티디닐, 5-아자우라실릴, 티아졸로피리디닐, 이미다졸로피리디닐, 피롤로피리미디닐, 피라졸로피리미디닐, 아데닌, N⁶-알킬푸린, N⁶-벤질푸린, N⁶-할로푸린, N⁶-비닐푸린, N⁶-아세틸레닉푸린, N⁶-아실푸린, N⁶-히드록시알킬푸린, N⁶-티오알킬 푸린, 티민, 시토신, 6-아자피리미딘, 2-메르캅토피리미딘, 우라실, N⁵-알킬피리미딘, N⁵-벤질피리미딘, N⁵-할로피리미딘, N⁵-비닐피리미딘, N⁵-아세틸레닉피리미딘, N⁵-아실피리미딘, N⁵-히드록시알킬푸린, 및 N⁵-티오알킬푸린 및 이소타졸릴. 상기 헤테로시클릭기를 임의로 아릴에 대해 기재한 치환기로 치환할 수 있다. 상기 헤테로시클릭기를 부분적으로나 전체적으로 바람직하게 수소화할 수 있다. 비제한적인 실시예로서 디히드로피리딘을 피리딘에 자리에 사용할 수 있다. 헤테로시클릭 염기상의 기능적 산소 및 질소기를 필요하거나 바람직하다면 반응순서동안 보호할 수 있다. 적합한 보호기는 본기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 다음이 포함된다; 트리메틸실릴, 디메틸헥실실릴, t-부틸디메틸실릴, 및 t-부틸디페닐실릴, 트리틸메틸, 알킬기, 아세틸기 및 프로피오닐기와 같은 아실기, 메틸술포닐기, 및 p-톨룰술포닐기.

본명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "히드록시알킬"이란 탄소원자에 결합된 하나이상의 수소기가 히드록시기로 치환된 C_1-6알킬기를 말한다.

용어 "약리적으로 허용가능한 유도체"라 함은 수용체에 투여시에 직접적 또는 간접적으로 모화합물을 제공할 수 있거나 그 활성을 나타내는 활성화합물의 유도체를 말한다.

용어 "약리적으로 허용가능한 양이온"이란 양전하를 가지며 약제,예컨대 염에서 짝양이온과 함게 투여할 수 있는 무기 또는 유기부분을 말한다. 약리적으로 허용되는 양이온은 본기술분야의 당업자에게 알려져 있으면 소디움, 포타슘, 및 4가 아민을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "생리적으로 절단될 수 있는 이탈기"라 함은 그 기가 결합된 분자로부터 생체내에서 절단가능한 부분을 말하며, 무기 또는 유기음이온, 약리적으로 허용가능한 양이온, 아실(아세틸 프로피오닐 및 부티릴을 포함하나 이에 한정되는 않는 (알킬)C(O)), 알킬,포스페이트, 술페이트 및 술포네이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "입체이성질체를 더한 조성물 또는 화합물"이라 함은 화합물중 단일 입체이성질체이 중량으로 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97, 98, 99 또는 100%를 함유하는 조성물 또는 화합물을 말한다.

용어 "아미노산"이라 함은 합성 및 천연 아미노산을 포함하며, 예컨대 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소루시닐, 프롤리닐, 페닐알라닐, 트립토파닐, 메티오니닐, 글리시닐, 세리닐, 쓰레오니닐, 시스테이닐, 타이로시닐, 아스파라지닐, 글루타미닐, 아스파노일, 글루타오일, 라이시닐, 아르기닐, 및 히스티디닐을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본명세서에서 사용된 "연결부분"이라 함은 두 화학잔기를 연결하는 이가 그룹을 말하며, 알킬, 알케닐, 아키닐, 아릴, 폴리알킬렌옥시(예컨대, [(CH₂)nO-]n, -C_1-6알콕시-C_1-10알킬-, C_1-6알킬티오-C_1-10알킬-, -NR³_, 및 -(COHO)nCH₂OH, 여기서 n은 각각 0,1,2,3,4,5, 또는 6이다)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

Thorn등의 2장에서 설명한 대로, 디티오카바메이트의 제조는 매우 간단하다. 일반적으로 알콜이나 수용액에서 2차 아민으로 이황화탄소의 반응에 의해 구조식 R₁R₂NCSSH 또는 R₁R₂NSSNa 의 화합물을 제조하였다. 소디움 디티오카바메이트가 생성되도록 NaOH의존재하에 이 방법을 수행하는 것이 통상적이다. 따라서, 예컨대 CS2NaOH 및 디메틸아민으로부터 소디움 디메틸디티오카바메이트를 제조한다. 본명세서에 참고문헌으로 병합된 Thorn등의 14쪽을 참고하라. Thorn등에 기재된 다른 일반적은 디티오카바메이트 화합물은 다음이 있다: N-메틸,N-에틸디티오카바메이트, 헥사메틸렌디티오카밤산, 소디움디(베타-히드록시에틸)디티오카바메이트, 소디움 N-메틸, N-시클로부틸메틸디티오카바메이트,소디움 N-알릴-N-시클로프로필메틸-디티오카바메이트,시클로헥실아밀디티오카바메이트, 디벤질-디티오카바메이트,소디움 디메틸렌-디티오카바메이트, 다양한 펜타메틸렌 디티오카바메이트, 소디움 필로리딘-N-카보디티오에이트, 소디움 피페리딘-N-카보디티오에이트, 소디움 모르폴린-N-카보디티오에이트, 알파-퍼루릴 디티오카바메이트 및 이미다졸린 디티오카바메이트.

B) 프로부콜 및 그의 유도체

프로부콜은 광범위하게 사용되는 식품첨가물인 2,[3]-ter-부틸-4-히드록시아니솔(BHA) 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀(BHT)와 화학적으로 관련된다. 그의 완전한 화학명은 4,4'-(이소프로필리덴디티오)비스(2,6-디-tert-부틸페놀)이다. 파르싸사라씨(Parthasarathy)에 대한 미국특허 제 5,262,439에는 프로부콜의 수용성을 증가시키는 에스테르기로 하나 또는 두개의 히드록시기를 치환한 수용성 프로부콜 동족체를 개시하고 있다. 일례에서, 수용성 유도체는 프로부콜의 모노 또는 디-숙신산 에스테르, 글루타르산에스테르, 아디프산에스테르, 수베르산 에스테르, 세바크산 에스테르, 아젤라산 또는 말산 에스테르로 이루어진 군에서 선택된다. 또다른 일예에서, 프로부콜 유도체는 카르복시산그룹에서 선택된 관능기를 포함하는 알킬 또는 알케닐을 함유하는 에스테르인 모노 또는 디에스테르이다. '439특허의 화합물이 본발명에 사용된다.

미국특허 제 5,155,250(본명세서의 참고문헌으로 병합됨)에서 2,6-디알킬-4-실릴페놀이 항아테롬성 동맥경화증제로 개시하고 있다. 동일한 화합물이 PCT공보 WO95/15760(1995년 6월 15일에 공개)에서 혈청 콜레스테롤저하제로 기술되어 있다. 미국특허 제 5,608,095호는 (본명세서에 참고문헌으로 병합됨) 알킬화된-4-실릴-페놀이 LDL, 저급플라스마 콜레스테롤의 과산화를 저해하고, VCAM-1의 발현을 저해하여, 아테로성 동맥경화증의 처리에 유용하다고 기재하고 있다. 이들 화합물이 또한 본발명에 사용될 수 있다.

C) N-아세틸 시스테인 및 그의 유도체

시스테인은 하나의 비대칭탄소를갖는 아미노산이다. 이는 L-입체이성질체, D-입체이성질체, 또는 L-입체이성질체와 D-입체이성질체의 혼합물로 존재한다. L-입체이성질체는 자연에 존재하는 형태이다.

N-아세틸시스테인(아세트아미드-메르캅토프로피온산, NAC)는 시스테인의 N-아세틸화된 유도체이다. 또한 이는 L-입체이성질체, D-입체이성질체, 하나의 입체이성질체가 더해진 인재한다. 용어 "입체이성질체가 더해진 조성물 또는 화합물"은 상기화합물중 단일 입체이성질체의 중량으로 95%이상, 바람직하게는 97%이상을 포함한다. 이러한 형태의 NAC중 어떠한 것은 본발명에서 항산화제로 전달된다. 일례에서, NAC 또는 이의 염의 티오에테르 또는 티오에스테르의 단일 이성질체(isomer), 바람직하게는 자연적으로 존재하는 L-입체이성질체가 치료방법에 사용된다.

N-아세틸시스테인는 항산화제 활성을 나타낸다(Smilksten, Knapp, Kuling and Rumack, N.Engl.J. Med. 1988, Vol 319, pp.1557-62; Knight, K.R., MacPhadyen, K., Lepore, D.A., Kuwata, N., Eadie, P.A., O'Brien, B.clinical Sci., 1991, Vol.81, pp.31-36; Ellis, E.F., Dodson, L.Y., Police, R.J., J. Neurosurg., 1991, Vol. 75, pp.774-779). 술파하이드릴 기능기는 특성이 잘 알려져 있고, 높은 반응성을 갖는 자유 라디칼 스캐빈저이다. N-아세틸시스테인은 세포구성성분을 환원상태로 유지하는데 중요한 글루타티온(또한 글루타밀시스테이닐글리신으로 알려진 트리-펩티드)의 제조를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Berggren, M,.,Dawson, J., Moldeus, P. FEBS Lett., 1984, Vol. 176, pp. 189-192). 글루타티온의 생성은 히드록시 라디칼의 전구체로 알려진 하이드로겐 퍼옥사이드를 불활성화시키는 효소인 글르타티온 퍼옥시다제의 활성을 향상시킬 수 있다(Lalitha, T., Keren, D., Yanni, S., Pharmacology and Toxicololgy, 1990, Vol.66, pp.56-61).

N-아세틸시스테인은 생체내에서 낮은 독성을 나타내고, 데프리닐보자 독성이 상당히 낮다(예컨대, 래트에서 정맥으로 LD₅₀이 N-아세틸시스테인 및 데프리닐에 대해서 각각, 1140 및 81 mg/kg이다.).

N-아세틸시스테인 및 그의 유도체는 예컨대 WO95/26719에 기재되어 있다. 이 공보에 기재된 유도체는 본발명에 따라 사용될 수 있다.

D) 카탈라제 및 피루베이트를 포함하나 이에 한정되지 않는 퍼옥사이드 스캐빈저

E) 디티오트레이톨 및 2-메르캅토에탄올을 포함하는 티올

F) TroloxTM,BHA, BHT, 아미노스테로이드 항산화제, 토코페롤 및 그의 동족체 및 라자로이드를 포함하나 이에 한정되지 않는 리피드과산화의 저해제인 항산화제

G) 각각 플라보노이드, 페놀성 화합물, 카라테노이드 및 알파 리포산과 병행하여, 또는 단독으로 산화제 비타민(비타민 C, E, 또는 합성 또는 천연 약전구체 또는 이들의 동족체)를 포함하는 식이 항산화제

H) 비스테로이드성 항염증약품, COX-2저해제, 아스피린-기재 화합물 및 퀴에르세틴을 포함하나 이에 한정되지 않는, 리폭시게나제 및 시클로옥시게나제의 저해제

I) 유비퀴놀 및 티올 항산화제, 글루타티온, Se 및 리포산을 포함하나 이에 한정되지 않는 신체에 의해 제조되는 항산화제

J) 합성 페놀성 항산화제: 페이지 I 및 II 약물 대사효소의 유도제

III 항암제

본명세서에서 사용된 용어 "항암제"는 비정상적인 세포증식을 감소시키는 어떠한 물질을 말한다. 항암제는 여러가지 문헌에 기재되어 있으며, Martindale, "The Extra Pharmacopoeia, 31th Edition, Royal Pharmaceutical Society (1996)을 포함한다.

항암제는 다음을 포함한다:

(i) 항엽산(antifolate);

(ii) 항대사물질(푸린 항대사산물, 시타라빈, 푸다라빈, 플록스우리딘, 6-메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실을 포함하는 5-플루오로피리미딘, 베타-L-1,3,-디옥솔아닐 시티딘과 같은 시티딘 및 6-티오글루아닌을 포함함);

(iii) 히드록시우레아;

(iv) 유사분열 저해제(CPT-11,에토포사이드(VP-21), 탁솔 및 빈크리스틴을 포함);

(v) 알킬화제(부설판, 클로로암부실, 시클로포스파미드, 이포파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 및 티오테파를 포함하나 이에 한정되지 않음);

(vi) 비전형적인(nonclassical) 알킬화제, 플라티넘 함유 화합물, 플레오마이신, 항-종양 항생제, 항트라시클린, 안트라세네디온, 토포아이소머 II저해제, 호르몬제(코르티모스테로이드, 덱사메타손, 프리드니손, 및 메틸프리드니손을 포함하나 이에 한정되지 않음); 및

(vii) 플록시메스테론 및 메틸테스토스테론과 같은 안드로겐, 디에틸스틸베스테롤과 같은 에스트로겐, 타목시펜과 같은 항에스트로겐, 루프롤라이드와같은 LJRH동족체, 플루타미드와 같은 항안드로겐, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로겐스테론, 아스파라기나제, 카르무스틴, 로무스틴, 헥사메틸멜라닌, 다카바진, 미토탄, 스트렙토조신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 레바마솔, 및 루코보린.

항암제의 더욱 포괄적인 목록은 다음을 포함한다: 항암제가 아세글라콘; 아클라루비신; 알트레트아민; 아미노글루테티미드; 5-아미노글리불린산; 암사크린; 아나스트로졸; 안시타빈 히드로클로라이드; 17-1A 항체; 항림프구 면역글로불린; 항암제 A10; 아스파란기나제; 페가스파르가제; 아자시티딘; 아자티오프린; 바티마스타트; 벤조포피린 유도체; 비칼루트아미드; 비스안트렌 히드로클로라이드; 블레오마이신; 술페이트; 브레퀴나르 소디움; 브록스우리딘; 부술판; 캄파쓰-IH; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르보쿠온; 카르모퍼; 카르무스틴; 클로람부실; 클로로조토신; 크로모마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 코린박테리윰 파르붐; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루빈신 히드로클로라이드; 데시타빈; 디바지쿠온; 디클로로디에틸술파이드; 디뎀닌 B; 도세탁셀; 독시플루리딘; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 데키노마이신; 데다크렉세이트; 엘리프티늄; 엘무스틴; 엔로플라틴; 엔오시타빈; 에피루비신 히드로클로라이드; 에스타무스틴 소디움 포스페이트; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드; 파드로졸 히드로클로라이드; 카자라빈; 펜레티나이드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루타미드; 포름에스탄; 포테무스틴; 갈륨 니트레이트; 젠시타빈; 구스페리무스; 호모하링토닌; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 임프로술판 토실레이트; 이놀리모마브; 인터루킨-2; 이리노테칸; JM-216; 레트로졸; 리튬 가몰레네이트; 로바플라틴; 로무스틴; 로니다민; 마포스파미드; 멜파란; 메노가릴; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소디움; 미보플라틴; 밀테포신; 미소미다졸; 미토브로톨; 미토구아존 디히드로클로라이드; 미조리빈; 모피다몰; 멀티알킬펩타이드; 무로모납(Muromonab)-CD3; 무스틴 히드로클로라이드; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 네달플라틴; 닐루타미드; 니무스틴 히드로클로라이드; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; PCNU; 페노스타틴; 페플로마이신 술페이트; 피포브로만; 피라르루빈신; 피리트렉심; 이세티오네이트; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 포르피머 소디움; 프리드니무스틴; 프로카르바진 히드로클로라이트; 랄티트렉세드; 라니무스틴; 라족산; 로글레티미드; 로퀸니멕스; 세브리플라틴; 세무스틴; 시롤리무스; 시조피란; 소부족산; 소디움 브로메브레이트; 스파르포스산; 스파르포세이트 소디움; 스렙토조신; 술로페너; 타크로리무스; 타목시펜; 테가퍼; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모졸로미드; 테니포사이드; 테스톨락톤; 테트라소디움 네소테트라페닐포르핀-술페네이트; 티오구아닌; 티오이노신; 티오테파; 토포테칸; 토레미펜; 트레오술판; 트리메트렉세이트; 트로포스파미드; 종양 전이 인자; 우베니멕스; 우라무스틴; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신 술페이트; 빈오렐빈 타르트레이트; 보로졸; 진오스타틴; 졸리모마브 아리톡스; 및 조루비신 히드로클로라이드.

IV 비정상적인 세포과증식 상태

다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 비정상적인 세포증식 질병에 대해 항암제의 세포치사를 증가시키기 위해 항산화제를 사용할 수 있다:

비정상적인 세포증식이 유두종, 선종, 섬유종, 연골종, 골종, 지방종, 혈관종, 림프관종, 평활근종, 횡문근종, 수막종, 신경종, 신경절신경종, 모반, 갈색세포종, 신경초종, 섬유선종, 기형종, 포상기태(hydatidiform), 과립막, 브렌너(Brenner) 종양, 남화아세포종, 힐라세포종(hilar cell tumor), 정관간엽, 간질세포종양, 갑산성종을 포함하는 양성종양;

신장세포암(renal cell carcinoma), 전립성암, 방광암, 선암, 섬유육종(fibrosarcoma), 연골암, 골암, 지방암, 혈액육종, 림프관암, 평활근암, 횡문근암, 골수백혈병, 적백혈병, 다발성골수종, 신경교종, 경막혈종, 갑산성종, 방광육종 엽상(CTCL), 피부에 우선적인 또는 피부침윤성 피부종양(예컨대, 기저세포암, 편형세포암, 흑색종, 및 보웬스 질병), 카포시암, 및 점막조직의 전악성(premalignant) 및 악성질병, 중추신경계 종양(신경아세포종)을 포함하는 악성종양;

균상식육종, 건선, 피부근염, 류마티스관절염, 바이러스, 전염성연속종, 여성생식관의 재악성(remalignant) 및 악성 질병를 포함하는 과증식 및 전종양 손상;

물론, 이 방법으로 치료가능한 구체적인 상태는 결장직장암, 난소암, 골암, 신장암, 유방암, 위장암, 췌장암, 흑색종, 조혈성종양 예컨대 림프종, 백혈병, 플라즈마세포 이상종, 다발성 골수종 및 아밀로도시스(amylodosis)을 포함한다.

또한 항산화제는 심장혈관성 과증식 질병, 예컨대 포스트- 및 를 치료하기 위한 항암제와 함께 사용될 수 있다.

V 약리학적 조성물

약리적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 존재하에 임의로 항암제와 함께 유효량의 항산화제를 전신 또는 국소적으로 투여함으로써, 상기 질병중 어느 하나를 앓고 있는 포유동물, 특히 사람을 포함하는 숙주를 치료할 수 있다. 항암제의 세포치사 효과를 증가시키기 위해 사용될 때 항암제의 처리전, 동시에, 또는 후에, 항산화제를 투여할 수 있다. 항암제의 투여를 위한 방법 및 투여량은 당업자에게 잘 알려져 있으며, The Physician's Desk Reference, Martindale's The Extra Pharmacopeia 및 Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics를 포함하는 다수의 문헌에 기재되어 있으며, 표준방법을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다.

표적 질병을 치료하기 위해서 유효투여량으로 항산화제를 피하로, 정맥으로, 근육내로, 복막내로, 비경구로, 경구로, 점막밑으로, 흡입으로, 서방성 패치를 이용한 경피로, 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 본명세서에 기재된 모든 질병에 대한 일반적으로 전신 투여량은 1회 하루투여량 또는 나누어진 하루투여량으로 하루당 체중Kg당 0.01 mg/kg 내지 500mg/Kg 범위이다. 국소적용에 대한 일반적인 투여량은 활성 화합물의 중량으로 0.001 내지 100% 범위이다.

치료할 질병에 관련된 바람직하지 못한 증후 및 임상징후를 경감시키기 위해서 충분한 시간동안 상기 화합물을 투여한다.

심각한 독성효과가 없이 생체내에서 치료량의 화합물을 환자에게 전달하기 위해서, 약리적으로 허용되는담체 또는 희석제에 상기 활성화합물을 포함한다.

약제조성물중의 활성화합물의 농도는 본기술분야의 전문가에게 알려진 다른 인자뿐만 아니라 약물의 흡착, 불활성화, 및 분비속도등에 의존적이다. 또한, 투여량 수치는 경감시켜야할 질병의 심각도에 따라 다를 것이다. 추가로 특별한 대상에 있어서는 조성물을 투여하고 이를 감독하는 사람의 전문적 판단 및 환자에 따라 시간에 걸쳐서 구체적이 투여요법을 결정해야 할 것이고, 본명세서에서 설정한 투여량 범위는 단지 예시적일뿐이며, 청구된 조성물의 실제 또는 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 한번에 활성성분을 투여하거나, 더작은 투여량으로 나누어 간격을 달리하여 투여할 수 있다.

전신전달을 위한 바람직한 투여방식을 경구이다. 경구 조성물은 일반적으로 안정한 희석제나 먹을 수 있는 담체를 포함할 것이다. 이들은 젤라틴 캡슐로 포장되거나 정제로 압착될 것이다. 경구 치료투여를 위해서는, 활성화합물을 부형제에 병합시키고, 정제, 트로치, 및 캡슐형태로 사용한다. 약리적으로 호환성이 있는 결합제 및/또는 보조물질이 조성물의 일부로 포함된다.

졍제, 알약, 캡슐, 트로치, 기타등등은 다음의 성분이나 유사한 성질을 갖는 화합물을 포함할 수 있다; 미세결정 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 녹말 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수전분과 가은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스와 같은 윤활제; 콜로이드성 실리콘 디옥사이드와 같은 광택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸살리실레이트 또는 오렌지향과 같은 향료.

투여량 단위가 캡슐일 때, 캡슐은 상기 물질에 더하여 지방오일과 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 또한, 투여량 단위형태가 투여량 단위의 물리적 형태를 변형할 수 있는, 예컨대 당코팅, 셀락, 또는 다른 장내 작용제와 같은 다양한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 원하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성물질, 또는 원하는 물질을 보충할 수 있는 물질, 예컨대 항생제, 항균제, 항염증제, 항바이러스제, 또는 다른 면역억제제와 혼합할 수 있다.

비경구, 내피로, 피하로, 또는 국소적용용 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다:주사용 물, 식염수, 고정오일, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질알콜 또는 메틸파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 소디움 바이술파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민아세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액; 소디움클로라이드 또는 소디움 히드록시드와 같은 삼투압 조절제. 비경구 제제는 유리나 플라스틱으로 제조된 앰플에 봉입되거나 1회용 주사기, 또는 다투여 바이럴에 포함시킬 수 있다.

정맥투여의 경우에, 바람직한 담체는 생리식염수, 멸균수, Cremophor EL(상표명, BASF, Parsipany, NJ) 또는 포스페이트 완충식염수(PBS)이다.

바람직한 구체예에서, 이식체 및 미세캡슐화 전달시스템을 포함하는 조절방출 제제와 같이 신체로부터 빠른 제거로부터 화합물을 보호하기 위한 담체와 함께 활성화합물을 제조한다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 및 생호환성 폴리머를 포함할 수 있다. 그러한 제제의 제조방법은 본기술분야의 전문가에게 명백할 것이다. 상기 물질은 또한 Alza Corporation, Nova Pharmaceutical, Inc.으로부터 상업적으로 구입할수도 있다. 리포좀 현탁액(바이러스항체에 대한 단클론항체로 감염된 세포를 표적화하는 리포좀)도 또한 약리적으로 허용가능한 담체로서 바람직하다. 본기술분야에서 알려진 방법에 따라, 예를 들면, 미국특허 제 4,522,811(본문헌을 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에기재된 방법으로 이들을 제조할 수 있다. 무기용매에 적합한 리피드(예컨대, 스테아롤 포스파티딜 에탄올아민, 스테아롤 포스파티딜 콜린, 아라키돌 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤)를 용해한 후에, 증발시키고, 용기의 표면에 건조된 얇은 리피드필름은 남김으로써 리포좀 제제를 제조할 수 있다. 그다음 용기를 손으로 흔들어 용기의 옆면으로부터 리피드가 없는 물질로 하고 리피드 집합체를 분산시켜 리포좀 현탁액을 제조한다.

국소적용을 위한 적합한 운반체 또는 담체를 종래의 방법, 예컨대 로션, 현탁액, 연고, 크림, 겔, 스프레이, 팅크, 분말, 페이스트, 서방성 경피패치, 직장, 협막, 코 또는 경구점막에 대ㅎ나 적용용 좌약일 수 있다. 전신투여를 위해서 상기 열거한 것에 더하여, 농후제, 완화제, 및 안정제를 국소용 조성물에 사용할 수 있다. 농후제의 예로는 페트롤라텀, 비스왁스, 잔탄검 또는 폴리에틸렌, 솔비톨과 같은 습윤제, 미네랄 오일, 라노일 및 이의 유도체 또는 스쿠알렌과 같은 완화제를 포함할 수 있다. 다수의 용액과 연고는 특히 눈에 적용을 위해서는 시판되고 있다.

VI 예시적인 실시예

다음의 실시예는 본발명의 다양한 구체예를 설명하기 위한 것으로 본발명의 보호범위를 이에 한정하려는 의도는 아니다.

실시예 1

Americal type culture collection에서 부터 HCT 116 및 HCT15 사람 CRC세포를 얻었다. J. Pietenpol(Vanderbilt University, TN)이 T.Waldman에 의한 HCT로부터 생성된 p21^WAF1/CIP1-/- 종양세포을 제공하였고 HPV E6-형질감염된 HCT 116을 W.S. El-Deiry (University of Pennsylvania, PA)[W.S.El-Deiry et al., Cell 75, 817 (1993)]가 제공하였다. 본연구에서 사용한 모든 종양세포주는 고함량 글로코스 및 10% 열활성화된 소태아의 혈청(FBS), 비필수아미노산, L-글루타민, 및 페니실리 G소디움(100 U/ml) 및 스트렙토마이신 술페이트(100mg/ml)을 보충된 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지(DMEM)(GIBCO BRI.)에서 37℃에서 50% CO₂공기하에 배양하였다. 부착-비의존성 배양에서 피롤리딘디티오카바메이트(Sigma Chemical Co., MA), 비타민 E 동족체(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복시산: vit (E)(Aldrich), 5-FU(Hoffmann-LaRoche Inc. Nutley, NJ), 또는 독소루비신의 영향을 결정하기 위해서, 테스트할 물질과 함께 1% FBS 및 0.4%아가가 보충된 DMEM에서 10 X 10³세포/35mm 플레이트로 HCT 116 및 HCT15를 깔았다. 10일 후에 Omnicon 이미지 분석기로 콜로니수를 정량화했다. 10일후에 직경이 50마이크론보다 큰 콜로니를 양수로 계산했다. 예비실험에서 25-200μM 및 0.1-10mM에서는 피롤리딘디티오카바메이트 및 비타민 E는 CRC세포 성장 효율에 아무런 영향이 없었다. 더 큰농도에서 비특이적 세포치사를 나타냈다.

실시예 2

I.G.Nicoletti et al., J. Immunol. Methods. 139, 271(1991)에 기재된 방법으로 세포막을 용해하고, 프로피듐 아이오다이드(50mg/ml)로 핵을 염색하고, Becton Dickinson FACSORT형광-활성화 세포 소터(sorter)로 정량화하였다. MODFIT-DNA분석 소프트웨어로 각 세포주기상에서 핵비율을 결정하였다. ApopTaq Plus In Situ Apoptosis Detection Kit(Oncor, Gaithersburg, MD)를 사용하여 제조자의 설명대로 형광현미경이나 유식세포측정기로 사멸세포를 측정하였다. 요약하면, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)로 사멸동안 DNA단편화에 의해 생성된 DNA의 자유 3'OH 기에 디곡시제닌-표지된 뉴클레오타이드를 첨가하였다. FTC-접합 항-디곡시제닌 항체로 디곡시제닌을 탐지하였다. 형광-활성화 세포소터로 분석을 수행하였고, 형광현미경(Zeiss)을 사용하여 FITC염색을 시각화하였다.

실시예 3

특이적 형광염료 프로브로서 디히드로오르토다민 1234(DHR)을 사용하여 유식 세포측정기로 세포내 H₂O₂수준을 측정하였다(G.Rothe, A.Emmendorffer, A. Oser, J. Roesler, G. Valet, J. Immun. Methods 138, 133(1991); J. A. Royall, H. Ischiropoulos, Arch. Biochem. Biophysics 302, 348(1993)). 24시간까지 1mM DHR과 피롤리딘디티오카바메이트(70μM) 또는 비타민 E(3mM)을 포함하는 DMEM배지에서 CRC세포를 배양하였다. 트립신분해후에, 인산염 완충액에서 2% FBS로 트립신 활성을 중지시키고 세포를 1% 파라포름알데히드(Sigma)에 고정시켰다. 488nm의 여기원 과 580nm의 방출파장을 갖는 Becton-Dickenson FACS Vantage 유식세포측정기를 사용하여 각 샘플에 대해 1x10⁴세포의 세포 로다민 123 형광강도를 측정하였다. PC-Lysis(Becton dckenson) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 히스토그램을 분석하였다. 비어있는 웰에서 얻은 배경형광을 각각의 읽은 수치에서 뺐다.

실시예 4

Harlan Sparque-Dawley Company로부터 4-6주령 숫컷 무흉선 Balb/c nu/nu마우스를 얻었고 시험하기전 2주이상을 격리하였다. 단체 및 연방보호규칙에 따라 동물시험을 행했다. 상기한 바와 같이 10% FBS가 보충된 DMEM배지에서 HCT 116 및 HCT15 CRC세포주를 배양하였다. 연속적으로 2회 트립신을 처리하고, 5분간 300g에서 원심분리하고, 2회세척하여 세포를 수확하고, 멸균인산 완충액에 재현탁하였다. 0.2ml에서 1 X 10⁶세포를 7-10주령 숫컷 누드마우스의 견갑골에 피하로 투여하였다.

실시예 5

매주 최대 길이, 넓이, 및 높이를 측정하여 종양부피를 얻었다. 일단 종양이 평균크기 120-150mm³이 되면, 매주 피롤리딘디티오카바메이트70), 비타민 E, 5-FU, 또는 식염수를 i.P 투여하거나, 피롤리딘디티오카바메이트와 병용하여 비타민 E 또는 5-FU를 6주간 동물에게 투여하였다. 교차실험으로서, 상기 치료를 (비타민 E를 제외하고) 3주간 투여한 후에, 피롤리딘디티오카바메이트 및 5-FU(식염수, 피롤리딘디티오카바메이트 또는 5-FU 단독)의 병용치료 또는 피롤리딘디티오카바메이트 및 5-FU를 불연속적으로 치료를 남아있는 3주간 하였다. 예비실험에서, LD50과 유효투여경로를 확립하기 위해서 30일간 피롤리딘디티오카바메이트, 비타민 E, 5-FU를 단일투여량으로 투여하였다(자료없음). 연구의 종료시점까지 종양부피를 매주 기록하였다.

실시예 6

4%(v/v) 파라포름알데히드에서 종양세포를 하룻밤 고정시키고 표준조직학적 절차에 따라 파라핀에 박았다. BrDU 염색을 기재된 [Holmgren et al., Nature Med. 1, 149 (1955)]대로 수행하였다. 기재된 대로 단편화된 DNA의 TdT 표지(TUNEL)를 하였다. 200배율로 현미경하에서 계산한 세포의 퍼센트로 증식지수(BrDU)와 사멸지수(TUNEL)를 측정하였다. HCT 116 및 HCT15-유도 변이체(처리와 무관하게)에 대한 증식성지수는 각각 53.1±5.2 및 63.1±7.2 이다.

실시예 7

웨스턴 블랏분석을 위해서, 50mM Tris-Cl pH 7.4, 300mM Nacl, 2mM EDTA, 0.5% Nonidet-40, 0.5mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 아프로티닌(1㎍/ml), 펩스타틴(1㎍/ml), 및 루펩틴(2㎍/ml)에 세포를 용해하였다. 100mg의 추출물(Bradford 분석에 의해 결정)을 12% SDS-PAE 겔에 적용하고 0.2μM 포어 니트로셀루로스 막으로 전이시켰다(Schleicher and Schuell). 최종농도 0.1㎍/ml로 P21WAF1/CIPI, p53, p27 또는 C/EBPβ(Santa Cruz)에 대한 항체로 블랏을 탐지하였다. 세척후에, 블랏을 당나귀-항-토끼 또는 염소-항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥사다제 컨주게이트와 함께 배양하고, Enhanced Chemiluminescence (amersham, Arlington Height, IL)을 사용하여 전개하였다.

실시예 8

[M. Schwab, K.Alitalo, H.E.,Varmus, J.M. Bishop, Nature(Lond.) 303, 497(1983)]기재된 대로 RNA를 추출하였다. 폴리(A)+ mRNA를 1%(w/v)아가로스포름알데히드 겔을 통해 전기영동하고, [(Coffey et al., Cancer Res. 47, 4590(1987))]이전에 기재된 방법으로 노덧블랏을 수행하였다. B.vogelstein(John Hopkins Oncology Center, altimore,MD)이 사람의 p21^WAF1/CIPIcDNA프로브를 제공하였고, 임의의 프라이머 연장방법으로 [³²P]dCTP를 표지하였다. 43℃에서 혼성화 및 혼성화후 세척을 하였다. 동일한 로딩 및 전이의 대조구로 IB15를 사용하였다[P.E. Danielson, et al., DNA 7, 261(1988)]

실시예 9

B.Vogelstein[W.El-Deiry, et al., Cell 75, 817(1993)]이 사람의 p21^WAF1/CIPI프로모터 구조물를 제공하였다. 제조자의 지시에 따라(GIBCO BRL) CELLFECTIN으로 형질감염하기전에 CRC세포주를 50% 컨플루언스(confluence)로 넘치게 배양하였다. 모든 루시퍼라제 분석을 위하여, 형질감염된 전체 DNA를 pBSKII+ pCMV-염기의 첨가로 일정하게 유지하였다. L. Sealy (Vanderbilt University, TN)가 모든 pCMV-C/EBP발현벡터를 제공하였다. pCMV-CAT를 유전자발현의 내부 대조구로서 형질감염시켰다. 형질감염 12시간후에, 선택된 세포를 70μM 피롤리딘디티오카바메이트로 처리하였다. 처리 24시간후에, 세포용해물을 제조하고 [A.Misra-Press, C.S.Rim, H.Yao, M.S. Roberson, P.J.S. Stork, J. Biol. Chem. 270, 14587(1995)]에 기재된 방법으로 루시퍼라제활성을 분석하였다. 루시퍼라제활성을 CAT활성으로 표준화하고 그 결과를 기본수준에 대한 활성배수로 보고하였다.

실시예 10

3'말단에 사람의 p21^WAF1/CIPIcDNA 개시자리를 포함하는 2.4Kb 게놈단편을 루시퍼라제 리포터벡터의 Hind III자리로 서브클로닝시키고, 공개된 p21^WAF1/CIPI프로모터서열(GeneBank)에 대한 지정된 내부 p21^WAF1/CIPI프라이머를 사용하여 PCR 을 수행함으로써 pGL-2기본(Promega)-p21^WAF1/CIPI결실 변이체(D2198-D1138)를 제조하였다. 각각의 경우에, PCR산물을 pGL2-기본에 서브클로닝하고 이중사슬 DNA서열분석법으로 상기 서열을 분석하였다. Muta-Gene M13 시험관 돌연변이야기 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 NF_IL6 인식자리를 돌연변이시켰다. 원하는 TT 내지 AA 염기쌍변화의 존재를 DNA서열분석으로 확인하였다.

실시에 11

야생형과 NF_IL6변이체 p21WAF1/CIPI 프로모터서열에서 염기 1884 내지 1904에 대응하는 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다(야생형, GTACTTAAGAAATATTGAAT 및 ATTCAATATTTCTTAAGTAC; 변이체; GTACAAAAGAAATATTGAAT 및 ATCAATATTTCTTTTGTAC). 200μCi γ-³²P표지된 ATP 및 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 200ng의 각 올리고뉴클레오타이드을 말단표지화하였다. 얻어진 말단표지 올리고를 접합시키고 겔로 정제하였다. 항산화제로 처리한 CRC세포의 핵추출제조 및 전기영도이동속도분석(EMSA)에 대한 조건은 [Kalioff, et al., Science 253, 786(1991)]에 기재되어 있다. 항혈청을 첨가한 경우에, 핵추출물 및 2㎕ C/EBP α, β, δ다클론항체(Santa Cruz)를 실온에서 10분간 배양한 후에 방사능표지된 프로브를 첨가하였다.

실시예 12

소프트아가 종양형성 생체외모델에서 피롤리딘디티오카바메이트 또는 비타민 E의 양을 증가시키면서 두 사람 결장직장암 세포주, HCT116(야생형 p53) 및 HCT15(변이체 p53)을 처리하였다. @ 및 비타민 E모두 HCT 116 및 HCT 15세포의 비부착요구성 성장에서 용량의 의존성 감소를 야기하였다(도 1A). 이분석을 결장(HCA-7, Dif, RKO, SW620), 유방(MCF-7, MDA-MB23), 및 위장(Hs 746T)에서 유래한 다양한 종양세포주에 확대하였다. 이러한 농도에서, 두 항산화제는 P53의 상태와 독립적으로 시험한 종양세포주의 비부착요구성 성장을 저해하였다(Difi, RKO, 자료를 나타내지 않음).

24시간동안 피롤리딘디티오카바메이트 (70μM) 또는 비타민 E(3mM)로 HCT116 HCT15 CRC 세포를 처리한 후에 프로피듐 아이오다이드로 염색 및 유식세포측정기로 분석한 결과, 두 화합물이 G1피클에서 상당한 세포축적을 유도함이 나타났으며, 이는 소프트아가에서 관찰된 @ 또는 비타민 E의 성장저해효과의 원인이 세포주기중단 및/또는 세포사멸임을 제시한다(도 1B). 이들 세포주기중단과 이들화합물의 항산화특성고의 관계를 조사하기 위해서, 세포내 산화환원전위(내부 H₂O₂수준)와 G1세포주기중단 또는 세포사멸을 나타내는 세포의 퍼센트(유식 25세포측정기법)를 항산화제-처리 세포에서 24시간동안 정량화하였다.

도 1C에서 나타낸 바와 같이, @과 비타민 E 모두는 두 세포주에서 내부 H₂O₂수준을 상당히 감소시켰으며, @가 더 효과적인 환원제이었다. 게다가, 이 H₂O₂수준의 감소는 이들세포에서 G1세포주기유도 및 TUNEL-양성세포핵의 출현과 관련된다. HCT15세포를 막-통과 항산화제인 N-아세틸-L-시스테인(NAC) 및 식이 항산화제인 비타민C의 처리결과, H₂O₂가 감소하고 세포사멸이 유도되었으며(1D),이는 세포주기퇴화엣 있어서 반응성 산호종의 역할을 지지한다. 항산화제가 H₂O₂보다는 반응성산소종을 통해 세포내 산화환원수치를 변화시키기 때문에, HCT15세포는 일신적으로 사람 카탈라제를코딩하는 발현플라스미드로 형질감염시켰다. 과발현 카탈라제는 수준을 크기 감소시켰고 이들세포에서 세포주기중단 및 세포사멸을 유도하여, 이들 항산화제처리 세포에서 관찰된 세포주기영향의 주요한 조절자로서 H₂O₂가 관여하게 된다.

추가로 항산화제가 5-FU 및 독소루비신의 세포치사효능을 증가시키는지를 조사하기 위해서, 각 약품의 IC₅₀값을 @ (70μM) 또는 비타민 E(3mM)의 존재 또는 부존재하에 소프트 아가에서 배양된 HCT 116 및 HCT15의 15세포에 대해 조사하였다(두 세포주에서 이들 화합물에 대한 대략적인 IC₅₀수치). 5-FU 및 독소루비신 각각의 단독으로 처리한 세포에 비해서, @ 또는 비타민 E가 이들 두화합물에 대한 IC₅₀수치를 감소시켰다(도 1E). 이러한 효과는 @에서 더 뚜렷하며, 아마도 이는 그의 잠재적인 환원력의 크기를 나타낸다. 세포의 섭취기작 및 5-FU 및 독소루빈신의 기작은 상당히 다르다. 따라서, @ 또는 비타민 E가 이러한 경로에서 변화를 통해 5-FU 및 독소루빈신의 세포치사를 조절하는 것 같다.

실시예 13

무흉선 마우스에서 종양 이종이식(zenograft)으로써 HCT 116 또는 HCT 15를 배양함으로써 @ 또는 비타민 E의 치료효능을 생체내에서 조사하였다. palable 종양을 확립한 후에(평균 종양부피 150mm3), @, 비타민 E, 및/또는 5-FU 또는 음성대조구로서 식염수를 매주 동물에게 i.p.주입하였다. HCT116의 결과는 도2A에 나타냈다. 4주후에, 대조 마우스를 희생하여 절차에 따라서 종양부피를 측정하였다. 개별적으로 @ , 비타민 E 및 5-FU는 식염수처리 대조구에 비해 종양부피를 상당히 감소시켰다. @ 또는 비타민 E의 추가는 5-FU의 효과를 상당히 증가시켰다. 완전히 종야을 제거한 모든 9마리 동물에서, 2달동안 복합치료를 중단한 후에 종양 25의 재성장의 어떠한 징후도 관찰되지 않았다. 병용요법이 이들 변이체 p53CRC세포에서 더욱 효과적이라는 점을 제외하고젖 HCT 15-유래 이종이식에서도 유사한 결과가 나타났다.

확립된 HCT 15- 유래 종양세서 @ 및 5-FU의 생체내 효능을 추가로 조사하기 위해서, 단일치료제에서 상당한 차리가 확립된후에 마우스를 병용치료한 것과 교차하였다(도2B). 처음에 치료를 받지 않는 마우스는 3주쯤에 큰 종양(2780±257 mm3)을 만들었다. 이시점에서 @과 5-FU로 이들 마우스를 처리함으로써 이들 진전된 손상의 크기를 감소시켰다(6주: 1184±96mm3). 병용치료(5-FU 및 @)와 교차함으로써 또한 처음에 단독치료제만을 투여받은 마우스의 종양크기가 감소하였다. 초기에 5-FU 및 @만으로 치료한 동물에 있어서 1864±190mm3 에서 660±82 mm3 및 1325±210mm3에서 637±231mm3으로 종양크기가 감소하였다. 이러한 결과는 시험관내 발견을 보충하는 것이며, 항산화제가 CRC세포에서 5-FU의 효능을 상당히 증가시켰음을 나타낸다.

체중변화 또는 주요기관의 육안해부학적 및 현미경적 조사로 판단할 때, 작용체-유도 독성의 어떠한 징후도 마우스에서 관찰되지 않았다. 부검에서, 모든 종양은 종양크기나 치료요법과 관계없이 중앙회저를 심하게 나타냈다. @ 및 5-FU를 처리한 마우스는 종양이 더이상 존재하지 않기때문에, 이 치료그룹을 분석에서 제외시켰다. 나머지 종양의 면역조직학적 분석은 치료요법과 관계없이 높은 증식지수를 나타냈다. 그러나 두 이종이식모델에서 사멸지수는 비타민 E의 처리후에 약 5배 증가했다(도 2C). 대조적으로, 5-FU의 세포사멸지수는 변이체 p53(HCT 15)에 비해 야새형 p53을 발현하는 세포에서 더 높았으며, 이는 5-FU 세포치사에서 p53-매개 세포사멸의 역할을 뒷받침한다. 비타민 E 및 5-FU의 병용치료는 추가로 변이체 p53 유전적 배경에서 조차도 이들 종양에서 사멸지수를 증가시켰다. 변이체 p53 HCT 15세포에서 비타민 E와 5-FU-유도 세포사멸의 분명한 상승효과는 항산화제가 세포사멸신호경로를 재확립할 수 있음을 제시한다.

실시예 14

G1세포주기중단의 조절 및 잇따른 세포사멸은 p53 및 사이클린-의존성 키나제저해제, 예컨대 p21^WAF1/CIPI를 포함하는 다수의 세포단백질에 기여한다. 웨스턴 블랏분석에 의하면(도 3A), @은 HCT 116 및 HCT15세포에 24시간동안 p53 또는 p27단백질에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 이와 대조적으로, p21^WAF1/CIPI단백질 및 mRNA수준은 @처리후 한시간이내에 증가하고 24시간동안 유지된다(도 1B ).

유비퀴틴-매개 단백질분해를 통한 p53를 불활성화시키는 사람의 파필로마바이러스(HPV) E6을 발현하는 HCT 116세포에서 항산화효과가 약해지지 않기 때문에, @에 의한 p21^WAF1/CIPImRNA의 유도는 p53에 독립적이다(도 3B)(Scheffner, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 88, 5523 (1991); Crook, et al., Oncogene 6, 873(1991)). 비타민 E로 처리한 HCT 116 및 HCT 15세포에서 p21^WAF1/CIPI발현상에서 비슷한 증가가 관찰되었다.

항산화제에 의한 p21^WAF1/CIPI의 발현이 이들 세포주기중단에 필수적인지를 결정하기 위해서, 모 HCT116 세포 또는 세포를 @ 또는 비타민 E로 24시간동안 처리하여 p21^WAF1/CIPI의 표적중단시켰다(도 3C). 두가지 세포유형모두에서, 항산화제-매개 세포사멸이 상당히 감소하였으며, 이는 p21^WAF1/CIPI가 항산화제 매개-세포사멸상에서 중추적인 역할을 수행함을 나타낸다.

실시예 15

p21^WAF1/CIPI의 유도가 항산화제의 전자활성에 의존적인지 여부를 확인하기 위해서, 루시퍼라제 리포터 유전자에 연결된 p21^WAF1/CIPI의 프로모터의 2.4Kb단편으로 HCT 116 및 HCT 15를 형질감염시켰다. @로 형질전환된 세포를 처리함으로써 HCT 116 및 HCT 15에서 p21^WAF1/CIPI의 프로모터 활성이 약 5배 유도되었으며, 이는 p21^WAF1/CIPI의 mRNA와 단백질의 p53-독립적 유도와 일치한다(도 4A). 이 프로모터의 일련의 결실은 p21^WAF1/CIPI프로모터의 @ 반응요소가 뉴클레오타이드 2078 및 -1874사이에 존재함을 설명한다. 부위특이적 돌연변이로 이 자리를 파괴함으로써 @의 루시퍼라제활성 유도를 제거하였으며, 이는 NF_IL6자리가 @-유도 p21^WAF1/CIPI전사에 필수적임을 나타낸다.

전사인자의 CCAAT/인핸서 결합 단백질(C/EBP)군의 일원이 NF_IL6 공통서열을 인식한다(S.Akira and T.Kishimoto, Immunol Rev. 127, 25(1992); Landschulz et al., Genes Dev.2 786(1988); Cao et al., 상기문헌 5,1553 (1991); Chang, et al., Mol. Cell. Biol. 10, 6642(1990); Williams et al., 상기문헌, 5, 1553 (1991); Akira et al., EMBO, J. 9, 1897(1990); Poli et al., Cell 63, 25 643(1990)). 이들 인자는 다른 bZIP단백질과 호모다이머 또는 헤테로다이머의 ㅎ여성을 용이하게 하는 루신지퍼(bZIP)이량체 형성도메인에 인접한 염기성 DNA-결합영역을 포함한다. 흥미롭게도, C/EBPα는 비록 세포사멸과 관계가 밝혀지지 않았을 지라도 p21^WAF1/CIPI의 전사를 더 잘되도록 조절하며 마우스 전지방세포(preadipocyte)에서 세포증식을 저해한다.

24시간동안 HCT 116 및 HCT 15로 p21^WAF1/CIPINF_IL6부터 얻은 핵추출물 및 p21^WAF1/CIPINF_IL6시스변이를 함유하는³²P표지된 올리고뉴클레오타이드로 전기영동이동분석(EMSA)에 의해 결정한 결과(도 4B; 왼쪽패널), @처리후에 에 대한 DNA결합활성이 증가되었다. 변이체 NF_IL6 공통서열(레인 3)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 아니라, NF_IL6공통서열을 포함하는 비표지 올리고뉴클레오타이드(오른쪽 패널: 레인 2)의 50배 몰랄 과량으로 이동복합체와 경쟁되었으며, 이는 유도된 복합체가 NF_IL6 시스요소에 특이적임을 나타낸다. 유도된 복합체의 수퍼쉬프트(supershift)분석은 이동된 복합체가 C/EBPβ(레인 5)과 NF_IL6 시스요소와의 상호작용때문이지, C/EBPβ(레인 5)와 C/EBPα(레인 4) 또는 C/EBPδ(레인 6)과의 상호작용때문이 아니다.

C/EBPβ가 p21^WAF1/CIPI의 전사활성에 영향을 미치는지를 확인하기 위해서, C/EBPα, β 또는 δ를 코딩하는 진핵발현플라스미드를 완전한 길이의 p21^WAF1/CIPI-루시퍼라제 프로모터 구조물을 갖는 HCT 116 또는 HCT15세포에 형질감염시켰다(도 4C 및 4D). C/EBPβ의 형질감염으로 p21^WAF1/CIPI투여량-의존방식으로 강하게 활성화시켰고, NF_IL6의 변이는 이 자극을 제거하였다. 이와 대조적으로, C/EBP α,또는 δ는 p21 프로모터활성을 자극하지 못하였다.

마지막으로, 엑디손 유도성 프로모터의 조절하에 센스방향 및 안티센스방향으로 사람의 C/EBPβ cDNA 로 안전하게 형질전환된 HCT15세포주를 생성하여, 세포사멸신호경로에서 C/EBPβ의 기능적 역할을 조사하였다. 구성적으로 발현된 C/EBPβ cDNA가 세포사멸을 유도할 가능성을 제거하기 위해서, 엑디손(무리스테론 A)-유도성 발현시스템(Invitrogen, Carlsobad, CA)을 사용하였다. 사람 C/EBPβcDNA를 편리한 효소절단자리에서 pIND로 서브클로닝시켰다. 센스 및 안티센스 C/EBPβ서열을 포함하는 구조물을 이중사슬 DNA서열분석으로 확인하였다. 형질감염전에, pIND-C/EBPβ구조물을 PmeI로 직선화하고 정제하였다. 제조자의 설명에 따라 CELLFECTIN을 사용하여 5㎍의 pVgRXR(Invitrogen) 및 10㎍ pIND-C/EBPb로 HCT15세포를 형질감염시켰다. 24시간후에, 형질감염된 클론을 선택하기 위해서 1mg/ml 제네티신(Geneticin) 및 10mg/ml 푸로마이신(GIBCO BRL)가 보충된 배지로 세포를 이동시켰다. 2주후에, 제한 희석화로 항생제-내성 세포를 서브클로닝하였다. C/EBPβ단백질의 발현 및 잇따른 p21^WAF1/CIPI의 유도를 결정하고, 10무리스테론 A으로 24시간동안 유도하고 웨스턴블랏을 수행하였다. 3개의 독립 양성 클론을 사용하여 실질적으로 동일한 결과로 분석하였다.

이들 세포주 각각에서 유래된 클론의 대표적인 자료는 도 4E 및 F에 나타냈다. C/EBPβ 과발현은 자극되지 않은 기본수준에 비해 p21^WAF1/CIPI단백질 수준을 증가시켰다(도 4E: 삽입). 또한, C/EBPβ유도는 항산화제의 존재 및 부존재시에 이들세포의 사멸지수를 증가시켰다. 추가로, 안티센스 mRNA유도에 의한 C/EBPβ발현의 억제는 이들세포에서 항산화제-유도 세포사멸을 없앴다(도 4E). 과발현C/EBPβ의 존재시에 5-FU 또는 독소루비신에 대한 사멸지수의 증가로 C/EBPβ유도는 결장암세포에 대한 항산화제효과를 조절한다는 추가의 증거를 결정하였다(도 4F). C/EBPβ과발현이 없는 경우에, 5-FU는 20%까지 사멸지수를 증가시켰으나,독소루비신은 사멸을 유도하지 않았다. 5-FU 또는 독소루비신의 존재하에 이들 세포가 C/EBPβ과발현을 유도할 때, 세포사멸을 각각 70 및 80%까지 증가한다. 이와 함께, 이들 자료는 항산화제에 의한 사멸유도가 적어도 부분적으로는 전사인자 C/EBPβ의 활성화를 통한 p21^WAF1/CIPI의 p53-독립적 유도가 매개한다는 것을 나타낸다.

비록 최근에 보고에 의하면 신장상피에서 NF-kB DNA결합활성의 유도가 혈청퇴화후에 세포사멸을 진행시킨다고 알려져 있을 지라도, 또다른 전사인자, NF_IL6은 TNFα-매개 세포사멸에 대한 내성을 부여한다. @은 인산화의 저해 및 프로테아솜-매개 그의 저해제(IkBs)의 분해를 통해 NF-kB활성이 낮도록 조절했다. 이연구에서 사용된 @의 양으로는 이들 CRC세포에서 어떠한 NF-kB DNA 결합활성의 감소도 없었다. 추가로, 최근에 p21^WAF1/CIPI의 유도가 NF-kB전사활성을 증가시켜, 이들 세포에서 항산화효과가 NF-kB활성에 의해서 매개되지 않는 것 같다. 이러한 연구는 전자인자, C/EBPβ의 유도가 화학적 치료제-매개 세포사멸에 대해 CRC세포를 민감하게 한다.

C/EBPβ의 활성화는 두 결장암세포주에서 직접적으로 또는 간접적으로 p21^WAF1/CIPI유전자 발현을 유도하여 G1세포주기중단 및 세포사멸을 유도하였다. 기능적 p53에 독립적으로 이 전사인자를 유도하는 @ 및 비타민 E의 항산화력은 DNA손상제의 효능에 중요한 생물학적 결과를 가진다. 두 5-FU 및 독소루비신은 DNA손상유도를 통해 이들의 세포치사효과가 주로 나타난다. 이러한 손상은 알려지지 않은 기작으로 p53의 유도의 신호가 되고 차례로 세포증식과 세포사멸을 저해한다. p53의 변이가 진전된 CRC종양의 80%에 거쳐 일어나기 때문에, 이들 변이는 DNA-손상제, 예컨대 5-FU에 대한 진전된 결장암 종양의 상대적으로 낮은 반응속도의 원인이다. 비록 5-FU가 특별히 국소,야생형 p53, 결장암의 치료에 효과적일지라도, 이러한 성공율은 진전된, 종종 변이 p53-함유 결장암을 갖는 환자의 15-20%로 떨어진다. 따라서, p53-매개 세포사멸의 필요를 지나치는 항산화제의 능력(사람에서 얻을 수 잇는 용량으로 본 연구를 통해사용된)은 진전된 결장암 및 다른 충실성종양에 대해 항산화제와 화학치료의 병용치료의 유용성을 설명한다.

실시예 16

도 5a 및 5b는 HCT 116 및 HCT 15의 증식에 시험화합물이 미치는 효과의 측정수단으로서, 식염수, 비타민E, PDTC, 5-FU 및 비타민 E와 5-FU의 병용으로처리한 무흉선 마우스에서 유래된 결장세포 이종이식편의 BrDU-표지된 세포(전체세포핵의 퍼센트)의 막대그래프이다. 도 6a 및 6b는 세포사멸에 시험화합물이 미치는 효과의 측정수단으로서, 식염수, 비타민E, PDTC, 5-FU 및 비타민 E와 5-FU의 병용으로처리한 무흉선 마우스에서 유래된 결장세포 이종이식편의 TUNEL-양성세포(전체세포핵의 퍼센트)의 막대그래프이다. 종양조직을 4%(v/v)파라포름알데히드에 하룻밤 고정시키고, 표준조직학적 방법으로 파라핀에 묻었다. 10mM시트레이트 완충액(pH 6.0)으로 단면을 전처리하고, BrDU(Boehringer Mannheim)에 대한 PC 10단클론 항체로 반응시켰다. 단편화돤 DNA의 TdT표지(TUNEL)을 제조자의 지시대로 수행하였다. 200배율 현미경하에서 세포퍼센트를 세어 증식지수(BrDU) 및 사멸지수(TUNEL)을 결정하였다.

실시예 17

도 7에 나타낸 바와 같이, PDTC처리는 번역후변형에 의해 C/EBPβ DNA결합활성을 유도한다. (A) 70μM PDTC로 일정시간동안 DKO-1세포를 처리하고, [γ-₃₂P]-표지된 p21-NF_IL6올리고뉴클레오타이드(레인 1-9)로 핵추출물을 제조하였다. 특이성분석: 레인 10-12, PDTC로 3시간동안 처리된(레인 5), 과량의 비표지 야생형 올리고뉴클레오타이드(레인 11) 및 변이올리고뉴클레오타이드(12)로 처리한 DKO-1세포에서 유래된 핵추출물에 비교대조실험을 행하였다. 레인 13-15, C/EBPα(레인 13), β(레인 14) 또는 δ(레인15) 다클론항체로 수퍼쉬프트분석을 하였다. (B) 동일한 DKO-1세포를 PDTC(70μM)로 일정시간 처리하였다. 폴리(A)를 분석하고 C/EBPβ mRNA상의 처리관련변화를 노던블랏으로 분석하였다. IB15는 로딩 및 전이의 대조구로서 보였다. (C) [³²P]오르토포스페이트의 존재하에 동일한 DKO-1배양물을PDTC(70μM )로 처리하였다. 시작하기전에(0 시간) 또는 일정한 시간에 세포로부터 세포질 및 핵 부분의 C/EBPβ를 면역침전법으로 정제하였다. SDS-PAGE와 자기방사능법 또는 웨스턴블랏분석법(전체세포단배질의 100 μg/레인)으로 처리방법-관련 C/EBPβ의 위치화를 분석하였다. (D) PDTC(70μM)의 존재하에서 DKO-1 세포를 1시간동안 배양한 다음에, C/EBPβ의 분획화상의 처리방법관련 차이를 탐지하게 위해서 면역세포화학를 처리하였다. 모든실험에서, 시험관내에서 전사된 C/EBPβ단백질로 미리 배양된 전면역혈청 또는 1차적 안티-C/EBPβ항혈청으로 배양물은, 두번째 Cy3-접합 항체로 처리한 후에 어떠한 형광신호도 나타나지 않았다. 대표적인 광마이크로그래프는 PCTC처리전후에 있어서 안티-C/EBPβ염색된 세포를 나타낸다.

실시예 18

도 8은 cAMP 수준 및 PKA활성에 대한 PDTC의 효과를 설명한다. 일정시간 PDTC(70μM)로 DKO-1세포를 처리하였다. 세포용해물을 제조하여 (A)세포내 cAMP수준 또는 (B) PKA활성에 대해 분석하였다(실험방법을 참조). 상기 수치는 단백질μg당 pmol 평균 ±s.e.m.으로 표시했으며 4회실험중 3회실험의 대표값을 나타낸다.

실시예 19

도 9는 PDTC가 Ser²⁹⁹에서 C/EBPβ를 인산화함을 도시한다. (A) 0μM(레인1), 70μM PDTC(레인 2), 또는 50μM 포르스콜린으로 처리한 [³²P]오르토포스페이트표지된 DKO-1세포(2mCi/ml.3h)의 내부 C/EBPβ을 안티-C/EBPβ항체로 면역침전시켰다. SDS-PAGE와 자동방사능법으로 표지된 단백질을 표시하였다. (B) 생체내 표지된 에피토프-택 C/EBPβ의 트립트 포스포펩티드 지도. FLAG-에피토페에 대한 항체로 PDTC 처리 또는 미처리 DKO-1세포로부터 면역침전된 야생형(WT) 및 변이체(Ala²⁹⁹)C/EBPβ를 트립신으로 분해하고, 전기영동 및 TLC로 상기 포스포텝티드를 분리하고, 자동방사능법으로 표시하였다. X_1,2를 계속적으로 인산화하였다. 변이체가 아닌 야생형 단백질로 형질감염된 세포에서 PDTC로 처리한 후에 포스포펩티드 X₃의 수준이 증가하였다. 원은 그 기원을 나타낸다. (C) PDTC로 처리 및 비처리 세포로 부터 얻은 야생형 C/EBPβ의 생체내 인산화와 C/EBPβ의 Ala 치환변이의 인산화비교. 자동방사능법(맨위) 및 C/EBPβ 면역블랏을 나타낸다. (D) C/EBPβ내의 Ser299의 인산화는 핵으로의 단백질전위에 필수적이다. PCMV-C/EBPβ(WT) 또는 pCMV-C/EBPβ(Ala²⁹⁹)로 DKO-1세포를 형질감염시키고, 3시간동안 PDTC로 처리하였다. 실험방법에 기재된 대로 면역세포화학법으로 C/EBPβ단백질을 보이게 했다.

실시예 20

도 10은 C/EBPβ의 PKA인산화가 핵으로 위치하는데 필수적임을 나타낸다. (A)동일한 DKO-1세포를 PDTC(0 μM또는 μ70M)로 3시간동안 처리하였다. 각 군에서 폴리(A)+ mRNA 및 단백질을 분리하고, C/EBPβ mRNA 및 단백질수준상에 처리방법과 관련한 변화를 노덧 또는 웨스턴 블랏법으로 측정하였다. IB15를 동일한 로딩과 전이에 대한 대조구로 나타냈다. (B) PDTC(0 μM또는 μ70M) 또는 PDTC 및 mPKI(미리스틸화된 단배질 키나제 A, 1μM)로 3시간동안 DKO-1세포를 처리하였다. 파라포름알데히드에 세포를 고정하고, C/EBPβ단백질은 면역형광 염색법으로 시각화하였다. mPKI만으로 세포를 처리한 경우에 C/EBPβ의 핵위치화를 유도할 수 없었다(자료는 나타내지 않음).

실시예 21

도 11는 PDTC가 단백질 포스파타제 2A의 촉매서브뉴니트의 카르복시메틸화를 저해함을 나타낸다. 3시간동안 [메틸-³H]S-아데노실 메티오닌 및/또는 70μM PDTC을 포함하는 혈청-함유배지에서 DKO-1세포를 배양하였다. 세포질 또는 핵부분을 준비하여, 표준방법을 사용하여 C/EBPβ를 면역침전시켰다. SDS-PAGE로 항원/항체 복합체를 분리하고, 형광법으로 PP2Ac의 존재를 탐지하였다. PDTC가 핵부분에서 메틸트랜스퍼라제를 저해하고 세포질부분을 더 적은 정도로 저해한다.

실시예 22

도 12는 PDTC는 PP2Ac의 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해한다. 37℃에서 30분간 PDTC 및 부분적으로 정제한 래트의 메틸트랜스퍼라제의 농도를 증가시키면서 [메틸-³H]S-아데노실 메티오닌의 존재하에서 PP2A(a 및 c 다이머)를 배양하였다. SDS-샘플 완충액으로 반응을 종료시켰다. SDS-PAGE로 샘플을 분리하고, 형광법으로 메틸화된 PP2A 촉매서브유니트의 존재를 시각화하였다. 나타낸 바와 같이, PDTC는 메틸트랜스퍼라제의 활성을 선택적으로 저해하여 용량에 의존적에 방식으로 PP2A의 촉매서브유니트를 카르복시메틸화시킨다.

실시예 23

PP2A활성에 대한 PDTC의 직접적이고 특이한 효과를 결정하기 위해서, DKO-1세포를 먼저 17M PDTC로 3시간동안 처리하였다. 세포용해물을 만들로 37℃에서 인산화된 C/EBPβ(포스페이트기가 방사능표지됨)의 존재하에 다음의 시약으로 처리하였다; I2(선택적인 PP1저해제), 오카다산(선택적인 PP2A 및 PP1저해제), PDTC, I2 및 PDTC, 그리고 오카다산 및 PDTC. 도 13에서 나타낸 바와 같이, PDTC는 DKO-1추출물에서 포스파타제 활성을 저해하여 인산화형태의 C/EBPβ를 유지한다. 이 효과는 항산화제를 제거하면 가역적이다. 이 결과는 PP2A 포스파타제의 PDTC저해와도 일치한다. 이와 대조적으로, PP1포스파타제 특이적 저해제인 I2는 동일한 조건하에서 C/EBPβ의 탈인산화를 방지하지 못한다. 예상되는 바와 같이, 비특이적 포스파타제 저해제인 오카다산은 모든 DKO-1포스파타제 활성을 저해하여 C/EBPβ의 탈인산화를 방지한다. 이러한 결과는 PDTC와 같은 항산화제가 C/EBPβ의 탈인산화에 관련된 PP2A와 같은 일군의 포스파타제의 특이적 저해제임을 나타낸다.

실시예 24

다수의 정상세포 및 종양세포주에서 세포증식이나 세포사멸에 대한 PDTC의 효과를 측정하였다. 세포증식을 저해하는 PDTC의 농도로서 IC₅₀를 나타냈다. 그 결과를 표 1에 제공하였다. 나타낸 바와 같이, PDTC는 정상적인 세포의 성장을 방해하지 않으나 유방암, 위암, 골암, 및 췌장암 세포의 성장을 실질적으로 저해한다.

세포증시에 대한 PDTC의 효과(세포증식의 저해 또는 세포사멸의 유도에 필요한 IC₅₀)

정상세포
표피세포	600 μM
1차 결장세포	500 μM
1차 포유동물의 상피	650 μM
비형질전환된 래프의 장상피세포	450 μM
유방암세포
MCF-7	13 μM
MCF-10WT	5 μM
MCF-10HRas	5 μM
MDA-MB231	10 μM
MDA-MB-468	20 μM
위장암
Hs 746 T	35 μM
N-87	40 μM
골암
Saos-2	10 μM
췌장암
AsPol	70 μM
PANC-1	75 μM
BxPc3	100 μM

실시예 25

항산화제가 정상세포에서 세포사멸을 유도하는지 여부를 측정하기 위해서, 정상 및 암세포를 24시간동안 70μM PDTC와 함께 배양하고 DNA단편을 대조구 퍼센트로서 측정하였다. 표 2 및 3에서 나타난 바와 같이, 정상적인 세포주(1차 결장세포)는 PDTC에 노출 24후에 상당한 DNA단편을 나타내지 않았으나, 종양세포(야생형 p53HCA-7, HCT 116, 변이 p53 HCT15, DLD-1, DKO-3세포)는 실질적인 DNA단편을 나타냈다.

시험관내에서 PDC가 CRC세포에서는 사멸을 유도하나 정상세포에서는 그러하지 아니함(I)

세포유형	PDTC처리(70μM)후 DNA단편(%)
	3시간	6시간	12시간	24시간
1차 결장세포	101±10	109±9	107±10	130±16
야생형 p53 HCA-7	111±13	126±17	154±19	302±35
HCT 116	108±11	131±21	198±23	367±49

시험관내에서 PDC가 CRC세포에서는 사멸을 유도하나 정상세포에서는 그러하지 아니함(II)

세포유형	PDTC처리(70μM)후 DNA단편(%)
1차 결장세포	101±10	109±9	107±10	130±16
변이체 p53 HCT 15	145±12	259±18	673±34	979±34
DLD-1	213±17	296±21	712±34	876±46
DKO-3	223±11	478±16	896±16	1116±54

상기 표에서 진한부: AOVA로 결정한 결과 미처리된 세포(P<0.01)와 상당히 다르다

실시예 26

표 2 및 3에서 나타낸 바와 같이, PDTC는 쥐의 소장 및 결장에서 5-FU의 독성을 실질적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 PDTC가 항암제의 세포치사효과를 증가시킬 뿐만 아니라, 동시에 세포치사제에 노출된 정상세포에 경감효과를 가진다.

실시예 27

C/EBPβ, PP2A 및 메틸트랜스퍼라제로 이루어지는 신규한 다성분 복합체를 분리하고 최초로 특징을 결정하였다. 이 복합체는 PP2A 및 세포분열 및 세포사멸를 포함하나 이에 한정되지 않는 아래 전사의 조절에 중요한 역할을 한다.

공동면역침전법에 의하면 최초로 전사인자 C/EBPβ가 PP2Ac단백질 포스파타제와 복합체를 형성함을 설명한다. 이 신규 복합체는 PP2A에 의한 C/EBPβ의 인산화상태 조절에 기계적으로 중요한 역할을 한다.

추가적으로, C/EBPβ/PP2Ac 복합체는 또한 C/EBPβ의 촉매서브유니트를 카르복시메틸화하는 메틸트랜스퍼라제도 포함되는 것으로 나타났다. 래트 뇌의 수용성 추출물을 페닐-세파로스로 분획화하고 외부 PP2A 헤테로다이머(AC 복합체)를 사용하여 메틸트랜스퍼라제 활성을 분석하였다. 추가로, 소스 Q(강음이온교환) 및 겔여과 크로마토그래피로 메틸트랜스퍼라제의 활성 피크를 분획하였다. 도 14에 나타낸 부분정제된 메틸트랜스퍼라제는 겔여과 칼럼으로부터 최고의 메틸트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 메틸트랜스퍼라제 활성의 이 피크부분은 추가로 DEAE(약음이온교환 ) 및 모노Q(다른 강음이온 교환수지)칼럼을 행했다. C/EBPβ와 PP2A 둘다 모두는 이러한 추가의 단계후에 탐지가능했다. 래트의 뇌추출물을 양성대조구(C/EBPβ 및 PP2Ac는 SDS-PAGE상에 약 45 및 36kDa로 이동한다 )로서 나타냈다.

본발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 이전에 기술된 상세한 설명으로부터 본발명의 변형 및 변화가 명백할 것이다. 그러한 변화가 다음의 특허청구범위의 범위내에 포함될 것이다.

Claims (30)

1. 세포치사를 증가시키에 유효한 양의 항산화제와 함께 유효량의 항암제를 치료가 필요한 숙주에게 투여하는 것으로 이루어지는, 비정상적인 세포증식 질병에 대한 항암제의 세포치사활성을 향상시키는 방법.
2. 항암제의 투여와 같이, 투여하기 전에, 또는 투여한 후에, 항산화제를 투여하는 것으로 이루어지는, 비정상적으로 증식하는 세포의 충실성 성장(solid growth)의 치료를 위해 투여되는 항암제에 대한 독성을 감소시키는 방법.
3. 항암제의 투여와 같이, 투여하기 전에, 또는 투여한 후에, 항산화제를 투여하는 것으로 이루어지는, 비정상적으로 증식하는 세포의 충실성 성장의 치료를 위해 투여되는 항암제의 치료지수를 증가시키는 방법.
4. 세포의 내부로 항산화제를 투여하는 것으로 이루어지는, 세포에서 C/EBPβ의 핵위치화(nuclear localization)를 증가시키는 방법.
5. 저해하기에 충분한 양의 항산화제에 메틸트랜스퍼라제를 접촉시키는 것으로이루어지는, 단백질 포스파타제 2A에 작용하는 메틸트랜스퍼라제에 의한 단백질 포스파타제 2A의 촉매(catalytic) 서브유니트의 카르복시메틸화를 저해하는 방법.
6. C/EBPβ의 Ser299위치에서 인산화를 촉진시키는 화합물의 능력을 분석하는 것으로 이루어지는, 항암제의 세포치사를 증가시키는 화합물의 동정방법.
7. 단백질 포스파타제 2A의 카르복시메틸화를 저해하는 화합물의 능력을 분석하는 것으로 이루어지는, 항암제의 세포치사를 증가시키는 화합물의 동정방법.
8. X2는 298위치의 C/EBPβ 아미노산이고, X2 및 X3는 C/EBPβ에 실질적인 상동성을 갖는 측면 펩타이드 서열인 X1-Arg-X2-Ser-X3의 형태를 갖는 펩타이드 서열.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 비정상적 세포 증식은 결장직장암(colorectal cancer)인 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 비정상적인 세포 증식은 유방암인 방법.
11. C/EBPβ, PP2A, 및 PP2A의 서브유니트를 카르복시메틸화하는 메틸트랜스퍼라제로 이루어지고 순도가 70%이상인, 단백질 복합체.
12. 인산화된 형태 또는 인산화되지 않은 형태로 C/EBPβ또는 C/EBPβ에 실질적인 상동성을 갖는 단백질을 숙주에게 투여하는 것으로 이루어지는, 숙주의 비정상적인 세포 증식 질병을 치료하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, C/EBPβ에 실질적인 상동성을 갖는 단백질은 X2는 298위치의 C/EBPβ 아미노산이고, X2 및 X3는 C/EBPβ에 실질적인 상동성을 갖는 측면 펩타이드 서열인 X1-Arg-X2-Ser-X3의 형태의 펩타이드 서열로 이루어지거나 포함하고, 여기서 실질적인 상동성이라함은 60%이상의 서열동일성을 가지고 모서열(parent sequence)과 실질적으로 동일한 기능을 하는 단백질 또는 펩타이드 서열을 의미하는, 방법.
14. 안정화된 인산결합 또는 탈인산화에 내성이 있는 이들의 동족체을 갖는 합성 C/EBPβ 동족체.
15. 제 15 항에 있어서, 상기 탈인산화에 내성이 있는 이들의 동족체는 포스포아미데이트 또는 포스포네이트 동족체인 합성 C/EBPβ 동족체.
16. 제 1항, 2항, 3항, 4항, 또는 5항에 있어서, 상기 항산화제는 디티오카바네이트인 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 디티오카바네이트는 A-SC(S)-B구조이고,

    여기서 A는 수소 또는 약리적으로 허용가능한 양이온이며,

    B는 알킬, 아케닐, 아키닐, 알크아릴, 아르알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로알키닐, 아릴, 알크아릴, 수소, C_1-6알콕시-C_1-10알킬, C_1-6알킬티오-C_1-10알킬, NR²R³, -(CHOH)nCH₂OH (여기서 n은 0, 1,2,3,4,5, 또는 6이고), 알킬아세틸, 아킬프로피오닐, 및 알킬부티릴를 포함하는 (CH₂)nCO₂R1, 히드록시(C_1-6)알킬(여기서 하나이상의 히드록시그룹이 탄소원자중 어느하나에 존재함),

    또는 NR²R³이고, 여기서 R²및 R³는 각각 독립적으로 알킬;-(CHOH)n(CH₂)nOH, 여기서 n은 0,1,2,3,4,5,6이고; -(CH₂)nCO₂R¹, -(CH₂)nCO₂R⁴; 히드록시(C_1-6)알킬-; 알케닐(비닐, 알릴 및 CH₃CH=CH-CH₂-CH₂를 포함함); 알킬(CO₂H), 알케닐(CO₂H), 알키닐(CO₂H) 또는 아릴, 여기서 아릴기는 상기한 바와 같이 치환가능하며, 예를 들면, NO₂, CH₃, t-부틸, CO₂H, 할로, p-OH기; 도는 R²및 R³는 -(CH₂)m-과 같은 브릿지를 구성할 수 있고, 여기서 m은 3,4,5,6,7,8,9, 또는 10이고 R⁴는 아세틸, 프로피오닐, 및 부티릴을 포함하는 알킬, 아릴, 알크아릴, 또는 아르알킬임, 또는

    부분적으로나 완전히 수소화될 수 있는 헤테로시클릭 또는 알킬헤테로시클릭기인 방법.
18. 제 1항, 2항, 3항, 4항, 5항 또는 6항에 있어서, 상기 항산화제는 프로부콜 또는 프로부콜의 모노에스테르나 디에스테르인 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 프로부콜의 히드록시기중 하나 또는 두개가 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 수베르산, 세바크산, 마젤란산, 또는 말레인산으로 치환한 것인 방법.
20. 제 1항, 2항, 3항, 4항, 5항 또는 6항에 있어서, 상기 항산화제가 2,6-디알킬-4-시릴페놀인 방법.
21. 제 1항, 2항, 3항, 4항, 5항 또는 6항에 있어서, 상기 항산화제가 N-아세틸 시스테인인 방법.
22. 제 1항, 2항, 3항, 4항, 5항 또는 6항에 있어서, 상기 항산화제가 퍼옥시다제의 스캐빈저, 티올, 리피드 과산화의 저해제, 식이 항산화제, 리포옥시게나제 및 시클로옥시게나제의 저해제, 생체에 의해서 만들어진 항산화제, 및 합성 페놀성 항산화제로 이루어지는 군에서 선택된 것인 방법.
23. 제 1항, 2항, 3항, 6항 또는 7항에 있어서, 상기 항암제가 아세글라콘; 아클라루비신; 알트레트아민; 아미노글루테티미드; 5-아미노글리불린산; 암사크린; 아나스트로졸; 안시타빈 히드로클로라이드; 17-1A 항체; 항림프구 면역글로불린; 항암제 A10; 아스파란기나제; 페가스파르가제; 아자시티딘; 아자티오프린; 바티마스타트; 벤조포피린 유도체; 비칼루트아미드; 비스안트렌 히드로클로라이드; 블레오마이신; 설페이트; 브레퀴나르 소디움; 브록스우리딘; 부술판; 캄파쓰-IH; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르보쿠온; 카르모퍼; 카르무스틴; 클로람부실; 클로로조토신; 크로모마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 코린박테리윰 파르붐; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루빈신 히드로클로라이드; 데시타빈; 디바지쿠온; 디클로로디에틸술파이드; 디뎀닌 B; 도세탁셀; 독시플루리딘; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 데키노마이신; 데다크렉세이트; 엘리프티늄; 엘무스틴; 엔로플라틴; 엔오시타빈; 에피루비신 히드로클로라이드; 에스타무스틴 소디움 포스페이트; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드; 파드로졸 히드로클로라이드; 카자라빈; 펜레티나이드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루타미드; 포름에스탄; 포테무스틴; 갈륨 니트레이트; 젠시타빈; 구스페리무스; 호모하링토닌; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 임프로술판 토실레이트; 이놀리모마브; 인터루킨-2; 이리노테칸; JM-216; 레트로졸; 리튬 가몰레네이트; 로바플라틴; 로무스틴; 로니다민; 마포스파미드; 멜파란; 메노가릴; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소디움; 미보플라틴; 밀테포신; 미소미다졸; 미토브로톨; 미토구아존 디히드로클로라이드; 미조리빈; 모피다몰; 멀티알킬펩타이드; 무로모납(Muromonab)-CD3; 무스틴 히드로클로라이드; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 네달플라틴; 닐루타미드; 니무스틴 히드로클로라이드; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; PCNU; 페노스타틴; 페플로마이신 술페이트; 피포브로만; 피라르루빈신; 피리트렉심; 이세티오네이트; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 포르피머 소디움; 프리드니무스틴; 프로카르바진 히드로클로라이트; 랄티트렉세드; 라니무스틴; 라족산; 로글레티미드; 로퀸니멕스; 세브리플라틴; 세무스틴; 시롤리무스; 시조피란; 소부족산; 소디움 브로메브레이트; 스파르포스산; 스파르포세이트 소디움; 스렙토조신; 술로페너; 타크로리무스; 타목시펜; 테가퍼; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모졸로미드; 테니포사이드; 테스톨락톤; 테트라소디움 네소테트라페닐포르핀-술페네이트; 티오구아닌; 티오이노신; 티오테파; 토포테칸; 토레미펜; 트레오술판; 트리메트렉세이트; 트로포스파미드; 종양 전이 인자; 우베니멕스; 우라무스틴; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신 술페이트; 빈오렐빈 타르트레이트; 보로졸; 진오스타틴; 졸리모마브 아리톡스; 및 조루비신 히드로클로라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
24. 제 1항, 2항, 3항 또는 12항에 있어서, 상기 비정상적인 세포 증식이 양성 종양인 방법.
25. 제 1항, 2항, 3항 또는 12항에 있어서, 상기 비정상적인 세포증식이 악성 종양인 방법.
26. 제 1항, 2항, 3항 또는 12항에 있어서, 상기 비정상적인 세포증식이 과증식 또는 전종양(preneoplastic) 손상인 방법.
27. 제 1항, 2항, 3항 또는 12항에 있어서, 상기 비정상적인 세포증식이 유도종, 선종, 섬유종, 연골종, 골종, 지방종, 혈관종, 림프종, 평활근종, 횡문근종, 수막종, 신경종, 신경절신경종, 모반, 갈색세포종, 신경초종, 섬유선종, 기형종, 포상기태(hydatidiform), 과립막, 브렌너(Brenner) 종양, 남화아세포종, 힐라세포종(hilar cell tumor), 정관간엽, 간질세포종양, 감산성종, 신장세포암(renal cell carcinoma), 전립성암, 방광암, 선암, 섬유육종(fibrosarcoma), 연골암, 골암, 지방암, 혈액육종, 림프관암, 평활근암, 횡문근암, 골수백혈병, 적백혈병, 다발성골수종, 신경교종, 경막혈종, 갑산성종, 방광육종 엽상(CTCL), 피부에 우선적인 또는 피부침윤성 피부종양, 카포시암, 및 점막조직의 전악성(premalignant) 및 악성질병, 중추신경계 종양, 균상식육종, 건선, 피부근염, 류마티스관절염, 바이러스, 전염성연속종, 여성생식관의 재악성(remalignant) 및 악성 질병으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
28. 제 1항, 2항, 3항 또는 12항에 있어서, 상기 비정상적인 세포증식이 결장암, 난소암, 골암, 신장암, 유방암, 위암, 췌장암, 흑색종(melanoma) 및 조혈성 종양(hematopoietic tumor)으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
29. 제 1항, 2항, 3항, 또는 12항에 있어서, 상기 비정상적인 세포증식이 심장혈관질병인 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 상기 심장혈관질병이 혈관성형술후 재협착증인 방법.