ITMI952539A1 - Classe di oligonucleotidi fosfodiesterici ad attivita' citotossica composizioni farmaceutiche che li contengono e loro uso - Google Patents
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Abstract
Nuova classe di oligonucleotidi fosfodiesterici in grado di esercitare un'attività citotossica selettiva verso cellule tumorali, aventi sequenza nucleotidica di formula (I): (FORMULA I) con orientamento 5'-3' o 3'-5', in cui N ed N', uguali o diversi tra loro, sono scelti nel gruppo costituito da A, T, G e C; x può variare da 0 a 8; a, b, c, d, e, f e g, uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 4; a', b', c', d', c', f' e g', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 8; ed a", b", c", d", e", f" e g", uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 e 16.Vengono inoltre descritte delle composizioni farmaceutiche contenenti almeno uno dei suddetti oligonucleotidi fosfodiesterici ed il loro uso terapeutico come agenti antitumorali.
Description
Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
classe di oligonucleotidi fosfodiesterici ad attività citotossica, composizioni farmaceutiche che li contengono e loro uso terapeutico come agenti antitumorali."
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda una nuova classe di oligonucleotidi fosfodiesterici aventi attività citotossica selettivamente per le cellule tumorali.
STATO DALLA TECNICA
Uno dei principali obiettivi della ricerca sul cancro è l'identificazione di farmaci in grado di agire selettivamente sulle cellule tumorali, senza danneggiare quelle normali. Gli antitumorali attualmente utilizzati in protocolli clinici non discriminano tra cellule neoplastiche e cellule sane, in quanto il loro bersaglio è genericamente la replicazione del DNA o l'interferenza con metaboliti. Il differenziale di tossicità osservato nelle cellule tumorali, che consente l'impiego clinico dei suddetti antitumorali, è dovuto al fatto che la cellula trasformata si divide e metabolizza più rapidamente rispetto a quella normale. Le conseguenze della mancanza di bersagli tumorali specifici nel meccanismo di azione dei chemioterapici convenzionali sono gli inevitabili effetti collaterali a livello sistemico.
Negli ultimi anni gli oligonucleotidi sono stati studiati quali agenti antitumorali. Infatti, rispetto ai farmaci convenzionali, gli acidi nucleici, che possono essere efficacemente assunti dalle cellule mediante meccanismi di endocitosi recetto-mediata e/o pinocitosi, offrono maggiori possibilità di agire selettivamente su determinati bersagli, guali ad esempio prodotti di oncogeni o di geni della farmaco-resistenza, in quanto la loro azione si basa sulla specifica sequenza di basi con la quale l'informazione genetica viene codificata.
Tuttavia, l'uso di sequenze nucleotidiche in terapia umana è fortemente limitata dal breve tempo di emivita degli oligonucleotidi normali nel siero e nelle cellule, dovuto alla presenza delle RNasi. Questa limitazione è stata superata utilizzando degli oligonucleotidi in cui la catena fosfatidica intemucleosidica fosse modificata ad esempio con fosfotriesteri, fosfonati e fosforotioati, maggiormente resistenti all'attacco delle nucleasi; inoltre per agevolare l'ingresso di tali oligonucleotidi nelle cellule, sul cui meccanismo sono state formulate diverse ipotesi, agli oligonucleotidi sono state legate vantaggiosamente delle catene di poli-L-lisina o dei residui colesterici.
Recenti esperimenti sui topi hanno dimostrato che gli oligonucleotidi, somministrati per via intravenosa, intraperitoneale ed altre vie,possono raggiungere concentrazioni farmacologicamente attive negli organi bersaglio e sono molto ben tollerati a livello sistemico (Vlassov V.V. et al., FEBS LETTEHS, 327:271-274; 1991).
Le suddette sequenze oligonucleotidiche possono agire secondo diversi meccanismi d'azione e target cellulari (Hèléne C. e Toulmè J.J., Biochimica et Biophysica Acta, 1049: 99-125; 1990). L'approccio attualmente più studiato nel trattamento,dei tumori consiste nell'utilizzo di oligonucleotidi antisenso; in questo caso l'arresto della traduzione di specifici mRNA avviene emulando il naturale processo di regolazione dell'emivita degli mRNA presente nelle cellule.Più precisamente,un oligonucleotide complementare ad una specifica sequenza di mRNA forma degli ibridi parziali DNA-RNA che portano al blocco della traduzione del messaggio e/o alla loro degradazione. Tuttavia, l'applicazione di tale strategia presenta delle notevoli difficoltà e svantaggi dovuti essenzialmente al basso tempo di emivita extra ed intra-cellulare degli oligonucleotidi rispetto al rapido turnover degli mRNA.
Un'altra strategia che fonda la sua azione più a monte rispetto a quella antisenso è la formazione della tripla elica intermolecolare di DNA. Questo approccio è meno studiato del precedente ma offre la potenzialità di attuare un blocco direttamente a livello della trascrizione. Anche in questo caso si riscontrano dei limiti di applicabilità dovuti principalmente alla necessità di identificare opportune regioni del gene nelle quali siano presenti sequenze omopuriniche/omopirimidiniche.
In particolare, sempre in base a tale meccanismo d'azione, la stessa Richiedente ha trovato che un oligonucleotide con sequenza è in grado di inibire la trascrizione dell' mRNA del gene mdrl, nella linea cellulare tumorale MDR, che codifica per una glicoproteina di transmembrana responsabile della farmaco-resistenza (Scaggiante B. et al., FEBS Letters, 352: 380-384; 1994).
Infine, gli oligonucleotidi possono essere utilizzati anche come bersaglio di particolari proteine. E' noto che interazioni tra DNA a singolo filamento e/o RNA e le proteine sono alla base di essenziali meccanismi di regolazione della replicazione, trascrizione, riparo, ricombinazione del DNA o della maturazione e traduzione degli mRNA. Queste proteine sono presenti in tutti gli organismi viventi, dai procarioti agli eucarioti, e sono note come "single-strand DNA-binding protein" (SSB). Le SSB spesso non riconoscono delle sequenze precise, quanto piuttosto dei motivi precisi (Holligsworth M.A. et al., Nucleic Acids Research, 22: 1138-1146; 1994).
A. Aharoni et al. (Nucleic Acids Research, 1993. Voi. 21, No. 22, p. 5521-5528) descrivono la capacità di diversi segmenti di DNA, tra cui la sequenza d(GT)10, di legare una nuova proteina.
denominata PGB, identificata nei fibroblasti umani; tuttavia, non viene suggerito alcun significato biologico dell'affinità della suddetta sequenza per tale proteina.
Nello stato della tecnica non sono finora note delle sequenze oligonucleotidiche in grado di legare proteine con effetto citotossico specifico e selettivo sulle cellule neoplastiche. SOMMARIO
La Richiedente ha ora trovato una nuova classe di oligonucleotidi fosfodiesterici con sequenza corrispondente alla formula (I):
con orientamento 5'—3f o 3'-5'· in cui N ed Ν', uguali o diversi tra loro, sono scelti nel gruppo costituito da A, T, G e C; x può variare da 0 a 8; a, b, c, d, e, f e g, uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 4; a', b', c', d', e', f' e g', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 8; ed a'', b'*, c'', d1', e'', f1' e g'', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 16,
ad esclusione delle sequenze
Tali oligonucleotidi fosfodiesterici sono sorprendentemente in grado di esercitare un'attività citotossica selettiva per le cellule tumorali.
Costituiscono ulteriore oggetto della presente invenzione delle composizioni farmaceutiche contenenti almeno uno dei suddetti oligonucleotidi fosfodiesterici ed il loro uso nel trattamento dei tumori.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Le caratteristiche ed i vantaggi della nuova classe di oligonucleotidi fosfodiesterici, del loro uso terapeutico come agenti antitumorali e delle composizioni farmaceutiche che li contengono, secondo la presente invenzione, saranno maggiormente illustrati nel corso della seguente descrizione dettagliata.
Le suddette sequenze di oligodeossiribonucleotidi corrispondenti alla formula (I) sono in grado di agire da specifici e selettivi agenti antitumorali. In tali sequenze oligonucleotidiche, N ed N1 sono scelti nel gruppo costituito da A, T, G e C, e preferibilmente sono T o G. Inoltre dette sequenze:
- contengono un numero di nucleotidi totali variabile da 15 a 50. preferibilmente da 20 a 40;
- contengono un ninnerò di T nucleotidi variabile da 10 a 40, preferibilmente da 16 a 32;
- contengono un numero di G nucleotidi variabile da 1 a 25, preferibilmente da 2 a 10.
Tra gli oligonucleotidi di formula (I), la sequenza
e restanti variabili essendo 0, è già nota nello stato della tecnica; tuttavia viene descritta esclusivamente la capacità di detto oligonucleotide di inibire la produzione di una glicoproteina responsabile della farmacoresistenza nella linea cellulare tumorale MDR, inibendo la trascrizione del relativo mRNA con il meccanismo della tripla elica molecolare di DNA (Scaggiante B. et al; riferimento sopra citato).
Anche la sequenza
corrispondente alla formula (I) in cui N=G, N'=T, x=l, a=a'=l, a’’=8, b=b''=l e b=0, le restanti variabili essendo 0, è già nota nello stato della tecnica, ma non le viene attribuita alcuna attività biologica specifica (A. Aharoni et al.; .riferimento sopra citato).
Tra gli oligonucleotidi fosfodiesterici dell’invenzione, si dimostrano particolarmente attivi quelli aventi le seguenti sequenze:
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=0, a=l, a'=2, a’’=8, b=b’'=1 e b'=0, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=0, a=l, a'=3, a''=6, b=b’’=l e b’=0, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=0, a-1, a'=4, a''=5, b=b,,=l e b'=0, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=0, a=l, a'=5 ed a''=4. b=b''=1 e b'=0, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=2, a=b=l, a'=6, a''=4,b'=2 e b''=1, le reastanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=0, a=b=l, a'=7. a''=4,b'=0 e b''=l, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N-N'=G, x=3, a=b=l, a'=3. a''=5.b'=b''=l, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T,x=2, a=b=c=d=l,a'=2,b'=5· c'=4,d'=3 ed a’'=b''=c''=d''=1, le restanti variabili essendo 0;
corrispondente alla formula (I) in cui N=N'=T, x=7, a=b=l, a'=8, b'=7 e a''=b''-l, le restanti variabili essendo 0.
Gli oligonucleotidi dell'invenzione possono inoltre essere derivatizzati alle funzioni fosfatidiche internucleosidiche, ai gruppi fosfato terminali, alle basi ed agli zuccheri, secondo i metodi noti nello stato della tecnica, allo scopo di incrementarne la resistenza all'attacco delle nucleasi extra ed intracellulari. In particolare le sequenze oligonucleotidiche dell'invenzione possono venire chimicamente modificate a dare gli analoghi metilfosfonati, fosforamidati,α-anomeri, fosforotioati, fosforoditioati e fosforoseleniati.
A scopo illustrativo ma non limitativo della presente invenzione, vengono riportati i seguenti esempi.
ESEMPIO 1
Preparazione degli oligonucleotidi di formula (I) secondo la presente invenzione.
Gli oligonucleotidi fosfodiesterici secondo la presente invenzione sono stati sintetizzati mediante un sintetizzatore automatico di DNA della Applied Biosystem, modello 380 B, utilizzando il metodo delle fosforamiditi, con procedura standard in scala di 1 μΜ. Gli oligonucleotidi cosi ottenuti,sono stati quindi deprotetti mediante riscaldamento a 56eC per tutta la notte.
La purificazione è stata quindi eseguita mediante FPLC su colonna MONO Q HR 5/5. utilizzando un gradiente di bicarbonato di ammonio.
Gli oligonucleotidi così purificati sono stati liofilizzati e sospesi in 300 μΐ di NaCl (0,9 %p)· La loro concentrazione è stata determinata spettrofotochimicamente alla lunghezza d'onda di 260 nm, alla temperatura di 60*C.
Il grado di purezza degli oligonucleotidi così ottenuti, calcolato mediante elettroforesi denaturante su gel al 15% di poliacrilammide in acido acetico (0,1 M)/ urea (7M), è risultata essere compresa tra 80 e 90%. La resa è compresa tra 30 e 60%.
Gli oligonucleotidi sono stati infine sterilizzati mediante filtrazione su membrane con porosità pari a 0,2 μm.
ATTIVITÀ' BIOLOGICA
Le sequenze oligonucleotidiche secondo la presente invenzione hanno dimostrato la capacità di esercitare, anche solo dopo un'unica somministrazione,una significativa e specifica attività citotossica in linee tumorali umane. Inoltre la selettività dell'azione citotossica delle suddette sequenze per cellule tumorali è stata dimostrata dalla mancanza di effetti in cellule umane normali.
In particolare, i test di tossicità sono stati eseguiti su diverse linee di cellule umane; sono state utilizzate:.
- linea linfoblastica CCRF-CEM,per un modello di tumore liquido; - linea epitelioide di adenocarcinoma del colon LoVo 109, per un modello di tumore solido;
- linea monocitìca U937, per un modello di tumore solido, in particolare linfoma.
I risultati dei diversi modelli sperimentali hanno indicato che le sequenze oligonucleotidiche secondo la presente invenzione sono molto attive sia in tumori di tipo liquido (linfoblastico) che si tipo solido (linfoide), ed hanno una buona attività in tumori di tipo solido epitelioide.
ESEMPIO 2
Valutazione della citotossicità degli oligonucleotidi secondo la presente invenzione su cellule tumorali CCRF-CEM.
In un terreno RPMI 1640 contenente siero di vitello fetale 10%p, Hepes 20 mM,penicillina 100 U/ml, streptomicina 100 μg/ml,L-Gln 2 mM, sono state coltivate cellule tumorali CCRF-CEM.
Le cellule sono state seminate alla densità di 5·104 cellule/ml in microtiter da 96 pozzetti (100 pi di sospensione cellulare, pari a 5·103 cellule totali per pozzetto).
Dopo 24 ore di incubazione, direttamente nel terreno di coltura sono stati aggiunti, in concentrazioni variabili da 2,5 a 30 UM, gli oligonucleotidi di sequenza da SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO:10 secondo al presente invenzione.
L'effetto della somministrazione dei suddetti oligonucleotidi sulla crescita e vitalità cellulari viene valutato a tempi di 24, 48 e 72 ore, mediante incorporazione del colorante 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolilbromuro (ΜΤΓ), aggiunto alla concentrazione di 0,5 mg/ml.
Dopo 4 ore di incubazione con il colorante, le cellule sono state centrifugate a 400xg per 8 minuti. Dopo aver tolto il terreno mediante aspirazione, le cellule sono state disgregate ed il colorante è stato solubilizzato con 200 pi di DMS0.
Il colore sviluppatosi è stato letto spettrofotometricamente utilizzando un lettore di piastre automatico alla doppia lunghezza d'onda di 540 e 690 nm.
La percentuale di crescita cellulare è stata determinata in rapporto ad un controllo interno di cellule non trattate, assunto come il 100% della crescita. I risultati così ottenuti sono di seguito illustrati nella tabella 1.
Tabella 1 Effetto citotossico degli oligonucleotidi secondo la presente invenzione su cellule CCRF-CEM , dopo 72 ore dall' aggiunta delle sequenze stesse.
I dati sopra riportati evidenziano una significativa riduzione della crescita cellulare, visibile dopo 48 ore dall'aggiunta dell'oligonucleotide dell'invenzione.
Inoltre, gli effetti citotossici della sequenza SEQ ID NO:3 sono stati valutati, per concentrazioni pari a 7.5 μΜ, su cellule CCRF-CEM, dopo 24, 48 e 72 ore dall'aggiunta della sequenza stessa, evidenziando una riduzione percentuale della crescita cellulare pari al 5% dopo 24 ore,e pari a 31% dopo 48 ore.
ESEMPIO 3
Valutazione dell'importanza dell'unità ripetitiva (GT) nella specificità dell'azione citotossica degli oligonucleotidi della presente invenzione.
Allo scopo di verificare l’importanza dell'unità ripetitiva (GTn) nelle sequenze secondo la presente invenzione, è stata valutata l’attività citotossica di sequenze oligonucleotidiche in cui l'unità ricorrente fosse (CTn), (ATn), (GCn) e (GAn), e più precisamente delle seguenti sequenze oligonucleotidiche:
Tali sequenze, sintetizzate e purificate come descritto nell'Esempio 1, sono state somministrate ad una concentrazione pari a a cellule CCRF-CEM, secondo la procedura descritta nell'Esempio 2. I risultati, rilevati dopo 72 ore dall'aggiunta delle sequenze stesse, sono di seguito riportati nella Tabella 2. Tabella 2 Effetto citotossico di oligonucleotidi con svariate unità ricorrenti sulla crescita di cellule CCRF-CEM, dopo 72 ore dall'aggiunta delle sequenze stesse.
I risultati sopra riportati indicano che gli oligonucleotidi con unità ricorrenti (CT), (AT) e (GC) non sono in grado di alterare significativamente la crescita delle cellule, mentre l'oligonucleotide (GA) è scarsamente tossico solo se utilizzato ad elevate concentrazioni (15μΜ), con un'inibizione della crescita cellulare pari al 52%.
ESEMPIO 4
Selettività dell'attività citotossica degli oligonucleotidi della presente invenzione.
Sono state condotte delle prove sperimentali volte a verificare la selettività dell'azione citotossica degli oligonucleotidi di formula (I) e la mancanza di effetti citotossici in cellule umane normali.
Sono state utilizzate:
- colture primarie di linfociti ottenuti da sangue periferico, seminati a 5x105 cellule/ml (5x104 cellule/pozzetto); tali linfociti sono stati utilizzati sia in fase resting, che attivati con 10 μg/ml di lectina 24 ore prima di aggiungere gli oligonucleotidi;
- colture primarie di fibroblasti di pelle umana.
Le suddette cellule sono state trattate con 1*oligonucleotide fosfodiesterico SEQ ID NO:3 dell'invenzione e con la sequenza (CT) sopra descritta, secondo il procedimento descritto nell'Esempio 2.
I risultati ottenuti sono di seguito riportati nella Tabella 3· Tabella 3 Assenza di effetti citotossici degli oligonucleotidi secondo la presente invenzione in colture di cellule umane normali, dopo 72 ore dall'aggiunta delle sequenze stesse.
I risultati sopra illustrati evidenziano la mancanza di effetti citotossici significativi delle sequenze dell'invenzione sulla crescita e vitalità di colture primarie di cellule normali, indicando perciò un'attività altamente selettiva dei suddetti oligonucleotidi verso cellule tumorali.
ESSÌPIO 5
Valutazione della citotossicità degli oligonucleotidi secondo la presente invenzione in linee tumorali umane farmaco-sensibili e farmaco-resistenti.
Alla luce dell'enorme importanza che la farmaco-resistenza riveste nel trattamento di molti tumori umani in fase primaria o dopo parziale remissione, sono state svolte delle prove sperimentali di citotossicità nelle seguenti linee tumorali: - linea di linfoblasti farmaco-resistente CEM-VLB100;
- linea farmaco-sensibile di cellule epitelioidi derivate da adenocarcinoma del colon LoVo 109;
- linea farmaco-resistente di cellule epitelioidi derivate da adenocarcinoma del colon LoVo Dx;e
- linea di monociti derivati da linfoma U937·
Tali cellule sono state trattate con gli oligonucleotidi fosfodiesterici SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:9 della presente invenzione, secondo il procedimento descritto nell'Esempio 2.
I risultati ottenuti sono di seguito riportati nella Tabella 4. Tabella 4 Citotossicità degli oligonucleotidi (15 μM) secondo la presente invenzione in linee tumorali umane farmaco-sensibili e farmaco-resistenti, dopo 72 ore dall'aggiunta delle sequenze stesse.
I dati sopra riportati dimostrano che gli oligonucleotidi fosfodiesterici secondo la presente invenzione sono in grado di esercitare effetti citotossici molto significativi anche in linee farmaco-resistenti, soprattutto se di origine linfoblastica. Gli oligonucleotidi secondo la presente invenzione possono essere vantaggiosamente utilizzati nel trattamento dei tumori sia liquidi che solidi, ed in particolare tra i primi i tumori di origine linfoblastica e tra i secondi i linfomi.
Detti oligonucleotidi vengono assunti dalle cellule mediante meccanismi di pinocitosi e di endocitosi recetto-mediata. Secondo un'ipotesi di meccanismo non limitativa della presente invenzione, gli oligonucleotidi fosfodiesterici corrispondenti alla formula (I) sono in grado di legare selettivamente e sequestrare delle proteine essenziali alla vitalità ed alla crescita delle cellule tumorali, ed in particolare alcune proteine nucleari che potrebbero venire espresse solo in cellule trasformate. In questo caso, a differenza di altri composti citotossici, verrebbe attuato un blocco specifico e selettivo delle proteine essenziali per proliferazione tumorale, preservando allo stesso tempo la vitalità delle cellule normali. Inoltre, l'interazione oligonucleotide-proteina proteggerebbe l'acido nucleico dalla degradazione intracellulare,.consentendo il raggiungimento di effetti farmacologici specifici a dosi inferiori rispetto a quelle utilizzate nei sistemi antisenso o a tripla elica.
Costituiscono ulteriore oggetto delle composizione farmaceutiche contenenti come principio attivo una quantità terapeuticamente efficace di almeno un oligonucleotide fosfodiesterico con sequenza corrispondente alla formula (I).
Per dette composizioni è indicata la somministrazione sistemica sia orale che parenterale, oltre che topica e transderraica; tra le somministrazioni parenterali sono preferite le vie intravenosa, intramuscolare, rettale ed intravaginale.
La dose terapeuticamente efficace varia a seconda della via di somministrazione e delle modalità di applicazione, nonché della gravità della patologia; varia inoltre in relazione all'età, al peso ed alle condizioni generali di salute del paziente.
Le composizioni dell'invenzione comprendono tutte le formulazioni con eccipienti farmaceuticamente accettabili, adatte a somministrare il principio attivo nella forma più adeguata alla patologia e comunque tale da rendere gli oligonucleotidi dell'invenzione notevolmente biodisponibili.
In particolare, possono essere vantaggiosamente utilizzate delle soluzioni o sospensioni iniettabili, comprendenti i suddetti oligonucleotidi in soluzione salina, in soluzione fisiologica, in soluzione Ringer o nelle soluzioni comunemente utilizzate nello stato della tecnica; dette soluzioni e sospensioni iniettabili sono particolarmente adatte a somministrazioni per via generale, endovenosa, sottocutanea ed intramuscolare.
Sono inoltre adatte delle formulazioni solide o semi-solide, in forma di inserti, gel e pomate per somministrazione topica. In particolare gli oligonucleotidi dell'invenzione possono essere vantaggiosamente preparati in forma di polvere, compressa o liofilo, da sciogliere in soluzione immediatamente prima dell'uso parenterale.
Sono inoltre particolarmente vantaggiose le formulazioni liposomiali comunemente utilizzate nello stato della tecnica, sia per uso parenterale che topico.
Per le formulazioni orali sono privilegiate polveri granulari, compresse, confetti e capsule; sono possibili composizioni a rilascio controllato, note nello stato della tecnica.
Per la somministrazione dermica e transdermica le composizioni preferite sono creme, pomate e gel, in cui il principio attivo può essere incluso in microsfere a lento rilascio.
(ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: "Nuova classe di oligonucleotidi fosfodiesterici ad attività citotossica, composizioni farmaceutiche che li contengono e loro uso terapeutico come agenti antitumorali."
Claims (28)
- RIVENDICAZIONI 1. Oligonucleotide fosfodiesterico con sequenza corrispondente alla formula (I): con orientamento 5'-3' o 3,-5', in cui N ed N', uguali o diversi tra loro, sono scelti nel gruppo costituito da A, T, G e C; x può variare da 0 a 8; a, ’b, c, d, e, f e g, uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 4; a', b', c', d', e', f e g', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 8; ed a" , b'', c'', d'', e'', f'' e g'', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 16, ad esclusione degli oligonucleotidi con sequenze SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO:11.
- 2. L'oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che N ed N’sono scelti tra T e G.
- 3- L'oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di contenere un numero di nucleotidi variabile da 15 a 50-
- 4. L'oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 3. caratterizzato dal fatto che detto numero di nucleotidi varia da 20 a 40.
- 5. L’oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di contenere un numero di T nucleotidi variabile da 10 a 40.
- 6. L'oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 5. caratterizzato dal fatto che detto numero di T nucleotidi varia da 16 a 32.
- 7. L'oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di contenere un numero di G nucleotidi variabile da 1 a 25·
- 8. L'oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 7. caratterizzato dal fatto che detto numero di G nucleotidi varia da 2 a 10.
- 9. L1oligonucleotide naturale secondo la rivendicazione 1, scelto nel gruppo costituito dalle sequenze SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:3. SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7. SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9 e SEQ ID N0:10.
- 10. Uso di oligonucleotidi fosfodiesterici con sequenza corrispondente alla formula (I): con orientamento 5'~3' o 3'_5'. in cui N ed Ν', uguali o diversi tra loro, sono scelti nel gruppo costituito da A, T, G e C; x può variare da 0 a 8; a, b, c, d, e, f e g, uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 4; a', b', c', d', e', f e g*, uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 8; ed a'', b'', c'', d'', e1', f1' e g1', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 1É, nel trattamento dei tumori.
- 11. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che in detti oligonucleotidi fosfodiesterici N ed N' sono scelti tra T e G.
- 12. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi fosfodiesterici contengono un numero di nucleotidi variabile da 15 a 50.
- 13. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi fosfodiesterici contengono un numero di T nucleotidi variabile da 10 a 40.
- 14. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi fosfodiesterici contengono un numero di G nucleotidi variabile da 1 a 25.
- 15. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi fosfodiesterici sono scelti nel gruppo costituito dalle sequenze SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5. SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10.
- 16. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti tumori sono tumori liquidi.
- 17. L'uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti tumori sono tumori solidi.
- 18. L'uso secondo la rivendicazione 17, caratterizzato dal fatto che detti tumori solidi sono linfomi.
- 19. Composizione farmaceutica contenente come principio attivo una quantità terapeuticamente efficace di almeno un oligonucleotide fosfodiesterico con sequenza corrispondente alla formula (I) : con orientamento 5'-3' o 3,-5'. in cui N ed Ν', uguali o diversi tra loro, sono scelti nel gruppo costituito da A, T, G e C; x può variare da 0 a 8; a, b, c, d, e, f e g, uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 4; a', b', c’, d', e', f e g', uguali o diversi tra lóro, possono variare da 0 a 8; ed a", b'', c'', d’’, e'', f'' e g'', uguali o diversi tra loro, possono variare da 0 a 16, in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.
- 20. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19. caratterizzata dal fatto che in detto oligonucleotide naturale N ed N' sono scelti tra T e G.
- 21. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, caratterizzata dal fatto che detto oligonucleotide naturale contiene un numero di nucleotidi variabile da 15 a 50.
- 22. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19. caratterizzata dal fatto che detto oligonucleotide naturale contiene un numero di T nucleotidi variabile da 10 a 40.
- 23- La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19. caratterizzata dal fatto che detto oligonucleotide naturale contiene un numero di G nucleotidi variabile da 1 a 25.
- 24. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, caratterizzata dal fatto che detto oligonucleotide naturale è scelto nel gruppo costituito dalle sequenze SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2.SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5. SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7,SEQ ID N0:8,SEQ ID NO:9 e SEQ ID N0:10.
- 25· La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, caratterizzata dal fatto di essere somministrata per via orale, parenterale, topica o transdermica.
- 26. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, caratterizzata dal fatto di essere in forma di soluzione o sospensione iniettabile.
- 27. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, caratterizzata dal fatto di essere in forma di polvere granulare, compressa, confetto, capsula, liofilo o liposomi.
- 28. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19. caratterizzata dal fatto di essere in forma di crema, pomata o gel.
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