CZ20022372A3 - Terapeuticky pouľitelné syntetické oligonukleotidy - Google Patents
Terapeuticky pouľitelné syntetické oligonukleotidy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022372A3 CZ20022372A3 CZ20022372A CZ20022372A CZ20022372A3 CZ 20022372 A3 CZ20022372 A3 CZ 20022372A3 CZ 20022372 A CZ20022372 A CZ 20022372A CZ 20022372 A CZ20022372 A CZ 20022372A CZ 20022372 A3 CZ20022372 A3 CZ 20022372A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- bases
- cells
- cancer
- group
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 117
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 80
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 76
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 69
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 62
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 47
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 41
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 claims description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 28
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 25
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 25
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 16
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 16
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 16
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 14
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 14
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 12
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 10
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 9
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 claims description 4
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 claims description 4
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 208000011646 secondary carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 claims 2
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 219
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 44
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 42
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 40
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 33
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 29
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 27
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 26
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 24
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 16
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 14
- 102000004041 Caspase 7 Human genes 0.000 description 12
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 12
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 11
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 11
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 11
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 8
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 5
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 5
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 5
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 5
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 4
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 3
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 3
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 3
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 3
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 3
- -1 poly (oxyethylene) Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000187481 Mycobacterium phlei Species 0.000 description 2
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940055036 mycobacterium phlei Drugs 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- AOUOVFRSCMDPFA-QSDJMHMYSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AOUOVFRSCMDPFA-QSDJMHMYSA-N 0.000 description 1
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYYARFHFWYKNLF-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,4-dimethylphenyl)diazenyl]-3-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1N=NC1=C(O)C(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C12 YYYARFHFWYKNLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 101001057129 Bacillus cereus Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 208000005440 Basal Cell Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- WTYQNWDZSGLSLW-UHFFFAOYSA-O CC1=CSC(C)=N1.C1=CC=CC=C1[NH+]1C(C=2C=CC=CC=2)=NN=N1 Chemical compound CC1=CSC(C)=N1.C1=CC=CC=C1[NH+]1C(C=2C=CC=CC=2)=NN=N1 WTYQNWDZSGLSLW-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101100005766 Caenorhabditis elegans cdf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102100031690 Erythroid transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710100588 Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000573199 Homo sapiens Protein PML Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 description 1
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100369989 Mus musculus Tnfaip3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000700655 Mycobacterium leprae (strain TN) Serine-rich antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021010 Nucleolin Human genes 0.000 description 1
- XVZUMQAMCYSUMS-SIUGBPQLSA-N OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 XVZUMQAMCYSUMS-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101000933603 Rattus norvegicus Protein BTG1 Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003138 coordinated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002435 cytoreductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000547 effect on apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 102000054896 human PML Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 101150025333 murA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000025020 negative regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000012106 negative regulation of microtubule depolymerization Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010044762 nucleolin Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000020775 positive regulation of microtubule depolymerization Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N sodium metavanadate Chemical compound [Na+].[O-][V](=O)=O CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000003277 telomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910000166 zirconium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3513—Protein; Peptide
Description
Terapeuticky použitelné syntetické oligonukleotidy
Oblast techniky
Předkládaný vynález se vztahuje ke složení oligonukleotidů pro léčbu rakoviny.
Dosavadní stav techniky
Rakovina je aberantní čisté hromadění atypických buněk, které může být výsledkem nadbytečného množení, nedostatečného odumírání buněk nebo kombinací obou. Množení je vyvrcholením vývoje buňky buněčnými cykly, jejichž výsledkem je dělení jedné buňky do dvou buněk. Pět hlavních fází buněčného cykluje Go, Gi, S, G2 a Μ. V průběhu fáze Go jsou buňky v klidu. Většina buněk v organismu je v kterémkoliv čase v této fázi. Ve fázi Gi buňky jako odpověď na signály vyvolávající dělení naprodukují RNA a proteiny nezbytné pro syntézu DNA. V průběhu S-fáze (SE, raná S-fáze; SM, střední S-fáze a SL, pozdní S-fáze) replikují buňky svoji DNA. V průběhu G2 fáze jsou vytvářeny proteiny, připravované pro buněčné dělení. V průběhu mitotické (M) fáze jsou buňky rozděleny do dvou dceřiných buněk.Změny ve vývojovém buněčném cyklu se vyskytují ve všech rakovinách a mohou být výsledkem nadexprese genů, mutací regulačních genů nebo zrušení bodů, kontrolujících poškození DNA (Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8: 903, 1997).Na rozdíl od rakovinných buněk nemohou normální buňky proliferovat donekonečna, v důsledku procesu nazývaného buněčné stárnutí. Buněčné stárnutí je naprogramované odumření buněk, vedoucí k omezení růstu buněk (Dimri et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 20, 1995). Bylo zjištěno, že poškození DNA, ovlivnění rakovinných buněk tlustého střeva, plic a vaječníků inhibitory topoisomerasy a ovlivnění nasofaryngálních rakovinných buněk cis platinovými komplexy zamezuje množení těchto buněk indukcí stárnutí buněk (Wang et al. Cancer Res. 58:5019, 1998; Poele et al. Br. J. Cancer 80: 9, 1999). Syntetické oligonukleotidy jsou polyaniontové sekvence, které jsou zabudovány v buňkách (Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197: 95, 1994). Bylo popsáno, že syntetické oligonukleotidy, které se specificky váží k nukleovým kyselinám (Wagner, R. Nátuře 372: 333, 1994) a ke specifickým buněčným proteinům (Bates et al. J. Biol. Chem. 274: 26369, 1999) a ke specifickým proteinům buněčného jádra (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252: 207, 1998), inhibují proliferaci rakovinných buněk.
Bylo zjištěno, že syntetické sekvence o 27 basích, obsahující guanin (G)a různá množství thyminu (T) (oligonukleotidy GTn), kde n je větší než 1 a menší než 7 a počet basí je větší než 20 (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252: 207, 1998) inhibují růst buněčných linií specifickou • · · · vazbou sekvence k proteinu 45 kDa, zatímco GTn, které mají počet basí menší než 20, jsou vůči liniím rakovinných buněk inaktivní (Morassutti et al. Nucleosides et Nucleotides 18: 1711,
1999). Byly popsány dva syntetické oligonukleotidy, bohaté na GT, o 15 až 29 basích s 3' aminoalkylovými modifikacemi, které tvoří D-kvartety, které se váží k nukleolinu a inhibují proliferaci rakovinných buněčných linií (Bates et al. J. Biol. Chem. 274: 16369, 1999). U syntetického TTAGGG-fosforothioátu o 6 basích, který má sekvenci identickou se savčí telomerickou opakující se sekvencí, bylo zjištěno, že inhibuje proliferaci buněk Burkittova lymfomu in vitro i in vivo (Mata et al. Toxicol. Applied. Pharmacol. 144: 189, 1997). Syntetický TTAGGG-fosfodiester o 6 basích však žádnou antitelomerasovou aktivitu nevykazuje (US Patent No: 5 643 890). Buněčný úhyn je ovlivněn imunitními mediátory, které promotují apoptosu a induktory apoptosy, které přímo iniciují metabolické dráhy vedoucí k úhynu buňky (Muzio et al. Cell 85: 817, 1996; Levine, A. Cell 88: 323, 1997). Apoptosa je aktivní proces úhynu buňky, který je charakterisovaný odlišnými morfologickými změnami, které obsahují kondensaci jaderného chromatinu, svraštění buňky, desintegraci jádra, porušení plasmatické membrány a tvorbu apoptotických tělísek, vázaných na membránu (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68: 251, 1980). Hlavním důkazem apoptosy je degradace buněčné jaderné DNA na fragmenty oligonukleosomální délky, jako výsledek aktivace endogenních endonuklas (Wyllie et al. Nátuře 284: 555, 1980). V provedení posledního stadia apoptosy jsou zahrnuty jako klíčový enzym cystein - aspartyl - specifické proteasy (caspasy). Všechny tyto proteasy obsahují konservovaný QACXG (kde X je R, Q nebo G) pentapeptidový motiv aktivního místa (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1336: 139, 1997). Mnohé caspasy jsou syntetizovány jako inaktivní pro enzymy, které jsou aktivovány v průběhu štěpení na specifických štěpných místech proenzymu (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366: 139, 1997) nebo jako inaktivní enzymy, které pro aktivaci vyžadují asociaci s regulačními molekulami (Stennicke et al. J. Bopl. Chem. 274: 8359, 1999).
Kromě jejich úlohy při apoptose jsou tyto enzymy (capsasy) zahrnuty v aktivaci a proliferaci B a T lymfocytů, ve zrání cytokinu při zánětu, v diferenciaci progenitoru buněk v průběhu erythropoiesis a ve vývoji vláken čoček (Fadeel et al. Leukemia 14: 1514, 2000).
S ohledem na B a T lymfocyty je caspasa 3 vytvářena v průběhu aktivace B lymfocytů a CD4 (+), CD8 (+), CD45RA (+) a CD45RO (+) podsouborů T lymfocytů (Alam et al. J. Exp. Med. 190: 1879, 1999). Kromě toho je stimulace T lymfocytů mitogeny a interleukinem-2 spojena s aktivací metabolické dráhy caspasy a se štěpením PARP (Wilheim et al. Eur. J. Immunol. 28: 891, 1998). Co se týče cytokinů, je aktivita caspasy 3 nezbytná pro uvolnění IL-2 aktivovanými T lymfocyty (Posmantur et al. Esp. Cell Res. 244: 302, 1998) a pro tvorbu a zrání prozánětlivého cytokinu, interleukinu-16 (Zhang et al. J. Biol. Chem. 273: 1144, 1998).
· · · · · • · · • · ·
S ohledem na erythropoesu je caspasová aktivace zahrnuta v regulaci erythropoesy a bylo zjištěno, že ovlivňuje GATA-1, jaderný regulační protein, rozhodující o zrání erythroidních prekursorů (De Maria, et al. Nátuře 401: 489, 1999).
Cytolysa je úplnou nebo částečnou destrukcí buňky a je zprostředkována imunitním systémem. Aktivované makrofágy a monocyty produkují bioaktivní molekuly, které patří, ale bez omezení, k cytokinům. K těmto cytokinům patří, ale bez omezení, interleukin (IL)-1, IL-1 beta, IL-6, IL-10, IL-12 a TNF-alfa.
IL-1 beta snižuje citlivost buněk kostní dřeně vůči cytoreduktivním léčivům, vůči radiaci a vůči in vitro čištění rakovinných buněk léčivy v autologních transplantátech kostní dřeně (Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
IL-6 indukuje diferenciaci B buněk, stimuluje sekreci IgG (Taga et al. J. Exp. Med. 166:967, 1987), indukuje diferenciaci cytotoxických T buněk (Lee et al. Vaccine 17:490, 1999), podporuje zrání megakaryocytů (Ishibashi et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8953, 1989) a účinkuje jako anti-proliferační faktor (Moři et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 257: 609, 1999); Alexadroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993; Novick et al. Cytokine 4:6, 1992), tak i jako proliferační faktor (Okamoto et al. Cancer res. 57:141, 1997; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer res. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer res. 2:1417, 1996) pro rakovinné buňky.
IL-10 zesiluje účinnost vakciny v myších tumorových modelech (Kauffman et al. J. Immunother. 22: 489, 1999) a zvyšuje odpovědi protirakovinných autoreaktivních T buněk (Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995).
IL-12 sám i v kombinaci s jinými cytokiny podporuje zrání leukocytů a indukuje vylučování interferonu-gama. Bylo zjištěno, že IL-12 má antirakovinnou aktivitu (Stíne et al. Annals NY Academy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351, 1997), včetně, ale bez omezení aktivace specifických cytolytických T-lymfocytů, aktivace přirozených zabij ečů (NK) buněk a indukce anti-angiogenních proteinů IP-10 a MiG.
TN-alfa způsobuje nekrosu pevných nádorů (Porter et al. Trends in Biotech. 9:158, 1991), zcitlivuje rakovinné buňky vůči apoptose indukované gama zářením (Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999) a chrání prekursory buněk kostní dřeně před účinky antineoplastických činidel (Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
Většina z dosavadních protirakovinných terapií, pokud byla směrována na indukci omezení buněčného dělení, inhibici proliferace, indukci apoptosy nebo stimulaci imunitního systému, byla však shledána méně než vhodnou pro klinické aplikace. Většina z těchto léčebných postupů je neúčinná nebo toxická, má průkazné nežádoucí postranní účinky, • · • · · • · · ·« jejím výsledkem je resistence vůči léčivu nebo imunitní přecitlivělost a jsou pro příjemce oslabující.
Existuje tedy stálá potřeba pro nové přípravky a způsoby, které indukují konec dělení buněk v rakovinných buňkách, indukují apoptosu v rakovinných buňkách a stimulují produkci cytokinu buňkami imunitního systému.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález splňuje shora uvedenou potřebu a poskytuje prostředek a způsob obsahující 3'-OH a 5-OH syntetický oligonukleotid o 2 až 20 basích (dále jen „sekvence“), vybraný ze skupiny, zahrnující (GxTy)n, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)„, (GxTy)„b, (TyGx)nb, a(GxTy)nb a a(TyGx)nb, kde x a y je celé číslo od 1 do 7, n je celé číslo od 1 do 12 a b je jeden nebo více z As, Cs, Gs nebo Ts a kde tato sekvence indukuje odpověď vybranou ze skupiny, zahrnující indukci zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspasy a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému. Prostředek obsahující sekvenci a farmaceuticky přijatelný nosič, je podáván živočichovi, včetně člověka, který má rakovinu, v množství účinném pro léčbu rakoviny v tomto živočichovi. Neočekávaná a překvapující schopnost sekvence indukovat zastavení buněčného cyklu, inhibovat proliferaci, aktivovat caspasy a indukovat apoptosu v rakovinných buňkách a stimulovat produkci cytokinu buňkami imunitního systému vyplňuje dlouho nevyplněnou potřebu v medicině a poskytuje důležitý užitek živočichům, včetně člověka.
V souhlase s tím je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout prostředek a účinný způsob léčby choroby u živočicha, včetně člověka.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a účinný způsob léčby rakoviny.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje úhyn buněk.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje zastavení buněčného cyklu v buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje zastavení buněčného cyklu v rakovinných buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který inhibuje proliferaci buněk.
• · · ·
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který inhibuje proliferaci rakovinných buněk.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na Fas.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na TNFR1.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na p53/p21.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na p21/waf-l/CIP.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na pl5ink4B.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na ρ 16ink4.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na caspase 3.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na TGF-beta 1 receptorů.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na hormonech.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který indukuje apoptosu v rakovinných buňkách, nezávisle na resistenci vůči léčivu.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který aktivuje caspasy v buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby, který aktivuje caspasy v rakovinných buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby autoimunitní chorobu.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby lymfoproliferativní choroby.
• · • 4 4 • · · · • 4 4 4 4 4 • · · ·
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby infekce.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob léčby zánětu.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob ovlivnění aktivace T- nebo B-buněk.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob ovlivnění zrání progenítorových buněk.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob ovlivnění erythropoesy.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob ovlivnění transkripčních faktorů v buňkách.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který násobí účinek terapeutických činidel na buňku.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který násobí účinek chemoterapeutických činidel na rakovinné buňky.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který násobí anti-neoplastický účinek ozáření.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který stimuluje produkci cytokinů buňkami imunitního systému.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který stimuluje produkci IL-1 beta buňkami imunitního systému.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který stimuluje produkci IL-6 buňkami imunitního systému.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který stimuluje produkci IL-10 buňkami imunitního systému.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který stimuluje produkci IL-12 buňkami imunitního systému.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek a způsob, který stimuluje produkci ΤΝΈ- α buňkami imunitního systému.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek, který je snadno připravit.
• · • · • · · • · · · 4
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek, který je minimálně toxický pro příjemce.
Tyto a další předměty, uspořádání a výhody předkládaného vynálezu se stanou zřejmými na základě následujícího detailního popisu uveřejněného provedení a připojených patentových nároků.
Předkládaný vynález poskytuje prostředek obsahující syntetickou 3 ΌΗ, 5ΌΗ oligonukleotid (sekvenci), vybranou ze skupiny, sestávající z (GxTy)n, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb a a(TyGx)nb, kde x a y je celé číslo od 1 do 7, n je celé číslo od 1 do 12 a b je jeden nebo více z As, Cs, Gs nebo Ts a kde tato sekvence indukuje odpověď vybranou ze skupiny, zahrnující indukci zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspasy a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.
Prostředek obsahující sekvenci a farmaceuticky přijatelný nosič je podáván živočichovi, včetně člověka, který má rakovinu, v množství účinném pro léčbu rakoviny v tomto živočichovi. Neočekávaná a překvapující schopnost sekvence indukovat zastavení buněčného cyklu, inhibovat proliferaci, aktivovat caspasy a indukovat apoptosu v rakovinných buňkách a stimulovat produkci cytokinů buňkami imunitního systému vyplňuje dlouho nevyplněnou potřebu v medicíně a poskytuje důležitý užitek živočichům, včetně člověka.
Tak jak je používáno zde, označuje termín „sekvence“ 3'-OH, 5'-OH syntetické oligonukleotidy obsahující od 2 do 20 basí A, C, G a T.
Zde používané zkratky „GT“, „AG“, „CG“, „GG“, „AGT“ a „CGT“ označují sekvence obsahující uvedené base, syntetizované v libovolném pořadí.
Jak je používán zde, označuje termín „odpověď“ indukci zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a stimulaci produkce cytokinů v buňkách imunitního systému.
Zde používaný termín „terapeutické ovlivnění“ a „účinné množství pro“ označují množství sekvence, účinné pro indukci zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a stimulaci produkce cytokinů buňkami imunitního systému. Zde používané slovní spojení „model suspensního tumoru “ a „model pevného tumoru“ označují primární nebo sekundární karcinomy nebo sarkomy.
• » • · 4 • · · • · ·
Zde používané slovní spojení „chemotherapeutikum“ je libovolné činidlo, schválené správními úřady okrsku nebo vládou státu nebo uvedené v US lékopisu nebo jiném obecně uznávaném lékopisu pro léčbu rakoviny u živočichů, včetně člověka.
Zde používaný termín „antineoplastický“ označuje zabraňování vývoji, zrání, množení nebo šíření rakovinných buněk.
Zde používaný termín „násobí“ označuje stupeň synergismu, který je vyšší než aditivní aktivita daného činidla.
Zde používaný termín „synergismus“ označuje koordinovaný účinek dvou nebo více činidel.
Podání účinného množství sekvence podle předkládaného vynálezu živočichovi, včetně člověka je therapeutické ovlivnění, které zabraňuje , brání nebo eliminuje chorobu, včetně, ale bez omezení, rakovina, reumatická artritida, lymfo-proliferativní poruchy a astma. Rakoviny jsou, ale bez omezení, karcinom buněk deskového epitelu, fibrosarkom, sarkoidní karcinom, melanom, rakovina prsu, rakovina plic, rakovina tlustého střeva a konečníku, rakovina ledvin, osteosarkom, kožní melanom, karcinom basálních buněk, karcinom pankreatu, rakovina močového měchýře, rakovina mozku, rakovina vaječníků, rakovina prostaty, leukemie, lymfom a od nich odvozené metastázy.
Terapeutická účinnost sekvence může být zvýšena způsoby, zahrnujícími, ale bez omezení, chemickou modifikaci base, sacharidovou nebo fosfátovou kostru, chemicky doplněné nebo biotechnologicky zesílené sekvence, tvorba komplexů sekvencí s biologickými nebo chemickými nosiči nebo navázání sekvencí na ligandy nebo protilátky, směrované na typy buněk nebo tkání.
Přípravky obsahující jednu nebo více sekvencí a farmaceuticky přijatelný nosič jsou připraveny uniformním a těsným spojením sekvence a farmaceuticky přijatelného nosiče. Farmaceuticky přijatelné nosiče obsahují kapalné nosiče, pevné nosiče nebo obojí a obsahují, ale bez omezení, nevodné nosiče, olejové emulse, emulse voda v oleji, emulse voda v oleji ve vodě, místně specifické emulse, emulse s dlouhou dobou účinku, lepivé emulse, mikroemulse a nanoemulse. Pevnými nosiči jsou biologické nosiče, chemické nosiče nebo obojí a včetně, ale bez omezení, systémy virových vektorů, částice, mikročástice, nanočástice, mikrosféry, nanosféry, minidávkovače, extrakty z bakteriálních stěn a biologicky odbouratelné nebo neodbouratelné přírodní nebo syntetické polymery, které umožňují prodloužené uvolňování sekvencí. Způsoby, použité pro tvorbu komplexů sekvence s pevným nosičem zahrnují, ale bez omezení, přímou • · * • 9 9 9 • 9 9 · 9 • 9 · • 9 · adsorpci na povrch pevného nosiče; kovalentní vazbu na povrch pevného nosiče, buď přímo nebo prostřednictvím můstkové části a kovalentní vazbu na polymer, použitý pro tvorbu pevného nosiče. Sekvence může být případně stabilisována přidáním neiontového nebo iontového polymeru, jako jsou monooleáty poly(oxyethylen)sorbitanu (Tweeny) nebo kyselina hyaluronová.
Výhodné vodné nosiče zahrnují, ale bez omezení, vodu, fysiologický roztok a farmaceuticky přijatelné pufry. Výhodné nevodné nosiče obsahují, ale bez omezení, minerální olej, neutrální olej a jejich směsi. S výhodou mohou být obsaženy excipienty bez ohledu na farmaceuticky přijatelný nosič pro zaměření sekvence na odpovídající buňky. Tyto excipienty zahrnují, ale bez omezení, antioxidanty, pufry a bakteriostaty a mohou obsahovat suspendující látky zahušťující látky.
Jedna nebo více sekvencí může být podávána sama nebo ve spojení s jinými léčebnými způsoby, včetně, ale bez omezení, chemoterapeutických činidel, imunoterapeutických činidel, antimikrobiálních činidel, antivirových činidel nebo v kombinaci s radiační terapií. Chemoterapeutická činidla zahrnují, ale bez omezení, antimetabolity, poškození DNA, destabilisaci mikrotubulů, stabilisaci mikrotubulů, depolymerisaci aktinu, inhibici růstu, inhibici topoisomerasy, inhibici HMG-CoA, inhibici purinu, inhibici pyrimidinů, inhibici metaloproteinasy, inhibici CDK, inhibici angiogenese a různá zesilovací činidla.
Způsoby podání zahrnují, ale bez omezení, orální, místní, subkutánní, transdermální, subdermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravesikální, intraartikulární, intraarteriální, intravenosní, intradermální, intrakraniální, intralesionální, inratumorální, intraokulární, intrapulmonární, intraspinální, intrapro statickou, umístění do tělesných dutin, nasální inhalaci, pulmonální inhalaci, impresi do kůže nebo elektroporaci.
V závislosti na způsobu podání je objem dávky výhodně od 0,0001 do 100 ml na dávku, výhodněji od 0,01 do 50 ml na dávku a nejvýhodněji od 0,1 do 30ml na dávku. Je výhodné, když množství podané sekvence na dávkuje od 0,001 do 100 mg/kg, výhodnější od 0,01 do 10 mg/kg a nejvýhodnější od 0,1 do 5 mg/kg. Sekvence nebo sekvence plus terapeutické činidlo mohou být podány jedno dávkovým způsobem, více dávkovým způsobem nebo kontinuální inťusí podle předpisu a po dobu, vhodnou pro léčbu dané choroby, stavu příjemce a způsobu podání. Sekvence může být podána před, současně nebo po podání léčebného činidla.
*· · • · 9
9 9
9 9 9
9 9999
9 9
9
9
9
9
9
Sekvence ve spojení s chemoterapeutickým činidlem je podávána živočichovi, který má rakovinu, v množství, účinném pro násobení antineoplastického účinku chemoterapeutického činidla. Množství terapeutického činidla podávaného v dávce je výhodně od 0,001 do 1 000 mg/m2 nebo od 0,01 do 1 000 mg/kg, výhodnější od 0,01 do 500 mg/m2 nebo od 0,01 do 500 mg/kg nebo nejvýhodnější od 0,1 do 100 mg/m2 nebo od 0,1 do 100 mg/kg. Podávaná jednotlivá sekvence a jednotlivé terapeutické činidlo, množství na dávku, receptura dávky a způsob podání jsou na rozhodnutí praktika, používajícího způsoby, známé odborníkům v této oblasti a budou záviset na typu rakoviny, rozsahu rakoviny, umístění rakoviny a ostatních klinických faktorech, jako je velikost, hmotnost a fysický stav příjemce. Kromě toho mohou být případně pro určení optimálního rozsahu podávání sekvence a pro podání sekvence spolu s terapeutickým činidlem použity testy in vitro. I když nechceme být zavázáni následující hypothesou, předpokládá se, že sekvence podle předkládaného vynálezu tvoří novou skupinu příbuzných struktur, a že neúčinkují jako protisměrné RNA, protisměrné RNA, DNA tvořící trojnásobnou spirálu (triple helix), inhibitory telomeras, aktivátory transkripce nebo inhibitory transkripce. Následující příklady mají sloužit pro další ilustraci předkládaného vynálezu, aniž by, současně zakládaly jakékoliv jeho omezení. Na druhé straně je třeba jasně rozumět, že použití různých jiných provedení, modifikací a jejich ekvivalentů, po přečtení zde uvedeného popisu, není odborníky v tomto oboru chápáno jako odbočení od záměru tohoto vynálezu.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1. Fluorescence [Fluo-3-AM] lidských leukemických Jurkat T buněk, inkubovaných s 0 pg/ml a 100 pg/ml sekvence o šesti basích GT SEQ ID NO:25,
Obrázek 2. Aktivace caspasy 3 v lidských leukemických buňkách Jurkat T, inkubovaných s 0 pg/ml a 100 pg/ml GT SEQ ID NO:66, 67, 81, 82 a 83, měřená cytometricky (A) a kolorimericky (B).
Obrázek 3. Aktivace caspasy 3 v lidských leukemických buňkách Jurkat T. (A) Aktivace caspasy 3 v buňkách, inkubovaných s 0 pg/ml a 100 pg/ml GT SEQ ID NO:25 o šesti basích; (B) Aktivace caspasy 7 (a) a obsahu PARP (b) v buňkách inkubovaných 0 pg/ml a 100 pg/ml GT SEQ ID NO:25 o šesti basích.
Příklady provedení wnálezu
Příklad 1
Příprava sekvencí • · 0 •
« 0 0000 • 00 ·
♦ 000 • 0 0« · · · 0* · 0 0· · ·
0· 0000
Fosfodiesterové a fosfothioátové sekvence byly připraveny podle HUKABEL Scientific Ltd., (Montréal, Québec, Canada), při použití EXPEDITE™ 8900 automated DNA synthesis systém (PersSeptive Biosystems, lne., Farminghan, MA) a SIGMA-Genosys (Woodlands, TX) a Abacus Segmented Synthesis Technology. Pokud není uvedeno jinak, byly použité sekvence fosfodiesterovými sekvencemi. Pokud není uvedeno jinak, bezprostředně před použitím, byly sekvence dispergovány ve sterilní deionisované vodě nebo ve sterilním farmaceuticky přijatelném pufru, jako například, ale bez omezení, ve fysiologickém roztoku.
Příklad 2
Buňky a reagencie
Všechny buněčné linie byly získány ve Sbírce typových kultur (American Type Culture Collection, ATCC, Rockwille, MD) a byly kultivovány v mediu doporučeném ATCC. Tabulka 1 ukazuje buněčné linie, jejich původy a jejich vlastnosti.
Tabulka 1
Buněčné linie
| Buněčná linie | Původ | Vlastnosti |
| THP-1 | Lidská akutní monocytická leukemie | Model suspensního tumoru p53 nula |
| MCF-7 | Lidská rakovina plic | Model pevného tumoru; nemetastázující, caspase 3 negativní, závislá na estrogenu |
| JURKAT | Lidská leukemie T buněk | Suspensní model tumoru, atypická resistence vůči více léčivům spojená s pl90-MRP proteinem |
| PC-3 | Lidská rakovina prostaty | Model pevného tumoru; metastázový mutovaný p53; nezávislý na androgenech (odolný hormonům) |
| LNCaP | Lidská rakovina prostaty | Model pevného tumoru; metastázový TGF-β 1 receptor negativní; závislý na androgenech |
| OVCAR-3 | Lidská rakovina vaječníků | Model pevného tumoru; metastázový mutovaný p53; deletovaný |
·« *
Β* ♦ ·♦· • · · • ·· ·· • Β * ·
Β · »
Β · · ·· BBB·
| P21/waf-l/Cip-l | ||
| SK-OV-3 | Lidská rakovina vaječníků | Model pevného tumoru; metastázový mutovaný p53; deletovaný |
| P21/waf-l/Cip-l; pl 5ink4B, p 16ink4 delece | ||
| HL-60 | Lidská promyelocytická leukemie | Suspensní model tumoru p53 mutovaný |
| EL-4 | Myší T lymfom | Suspensní model tumoru |
| A-20 | Myší leukemie B buněk | Suspensní model tumoru |
| L-1210 | Myší leukemie | Suspensní tumorový model |
| D-17 | Psí osteosarkom | Model pevného tumoru |
| CF-51 | Rakovina mléčné žlázy psa | Model pevného sarkomu |
Buňky byly inkubovány v 6 jamkových (1 ml/jamku), 24 jamkových (0,5 ml/jamku) nebo 96 jamkových (0,1 ml/jamku) kultivačních deskách s plochým dnem a byly udržovány při 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Pokud není uvedeno jinak, bylo inkubováno 2,5 x 105 buněk/ml s 0 pg/ml (kontrola) a 100 pg/ml (ovlivnění) sekvencí o 2 až 45 basích, obsahujících A, C, G a T po 48 hodin.
Příklad 3
Měření buněčné proliferace
Proliferace buněk byla měřena použitím redukce (MTT) dimethylthiazol-difenyl-tetrazolium (Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983). MTT bylo měřeno pří vlnové délce 570 nm při použití spektrofotometru na vyhodnocování kultivačních desek (ELX800, Bio-TEK Instruments lne., Winoosky, VT).
Příklad 4
Inhibice proliferace T buněk Jurkat lidské leukemie
Jurkat T buňky lidské leukemie jsou atypickým modelem lidského suspensního tumoru • fc fc · fc« fc • fcfc • · · · • · fcfcfcfc • fcfc • · · fcfc ·· fcfcfc fcfc fcfcfcfc resistentního vůči více léčivům. Jurkat buňky byly inkubovány se sekvence GT a CT (27 basí) tabulka 2.
Tabulka 2 % inhibice proliferace Jurkat T buněk lidské leukemie
| Sekvence | % inhibice |
| GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)i3G SEQ ID NO: 1-(27 basí) | 51 |
| GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGG-(G3T)6G3 SEQ ID NO:2-(27 basí) | 23 |
| GGGGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGTGGG-(G5T)4G3 SEQ ID NO:3-(27 basí) | 24 |
| GGGGGGGTGGGGGGGTGGGGGGGTGG-(G7T)3G3 SEQ ID NO:4-(27 basí) | 11 |
| TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(TG)i3T SEQ ID NO:5-(27 basí) | 45 |
| TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-(TC)i3T SEQ ID NO :6-(27 basí) | 0 |
Jak je uvedeno v tabulce 2, byla proliferace Jurkat T buněk inhibována testovanými sekvencemi GT, ale ne testovanou sekvencí CT. Jurkat T buňky byly inkubovány se sekvencemi GT o 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 a 24 basích (tabulka 3).
Tabulka 3 % inhibice proliferace leukemických lidských Jurkat T buněk
Sekvence % inhibice
TGT- (TG)iT 22
SEQ ID NO : 7- (3 basí)
GTG-(GT)iG 46
SEQ ID NO : 8- (3 basí)
TGTGTG- (TG)3 36
SEQ ID NO : 9- (6 basí)
GTGTGT- (GT)3 • 9 • · 9 • · · • · * · * · »··· · • · · a · · • · ♦ • · • a 9 · 9
9999
SEQ ID NO : 10- (6 basí)
TGTGTGTGT- (TG)4T 45
SEQ ID NO : 11- (9 basí)
GTGTGTGTG- (GT)4G 47
SEQ ID NO : 12- (9 basí)
TGTGTGTGTGTG- (TG)6 49
SEQ ID NO : 13-(12 basí)
GTGTGTGTGTGT-(GT)6 51
SEQ ID NO : 14-(12 basí)
TGTGTGTGTGTGTG- (TG)7 47
SEQ ID NO : 15-(14 basí)
GTGTGTGTGTGTGTG- (GT)?G 58
SEQ ID NO : 16-(15 basí)
TGTGTGTGT GTGTGTGTG- (TG)9 56
SEQ ID NO : 17-(18 basí)
GTGTGTGTGTGTGTGTGT- (GT)9 60
SEQ ID NO : 18-(18 basí)
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT- (TG)i0T 60
SEQ ID NO : 19-(21. basí)
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG- (GT)i0G 46
SEQ ID NO : 20- (21 basí)
TGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG- (TG)i2 54
SEQ ID NO : 21-(24 basí)
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT- (GT)J2 56
SEQ ID NO : 22- (24 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 3, GT sekvence o 3, 6, 9, 12, 14, 15, a 18 basích inhibovaly proliferaci Jurkat T buněk stejně účinně jako sekvence GT o 21 a 24 basích.
Jurkat T buňky byla inkubovány se sekvencemi GT, AT, CG, GG, AGT a CGT o 6 basích (tabulka 4).
• fl fl · · fl • · fl • · · · • flflfl·· fl · · • fl · fl· ·*·· • fl fl fl fl • fl • fl fl · fl • · • * • · • flflfl
| Tabulka 4 | |
| Sekvence | % Inhibice |
| TGTGTG- (TG)3 SEQ ID NO : 9- (6 basí) | 36 |
| GTGTGT- (GT)3 SEQ ID NO : 10- (6 basí) | 48 |
| TTTGTT-TT (TG)j TT SEQ ID NO : 23- (6 basí) | 31 |
| GGTGGG-GG (TG)iGG SEQ ID NO : 24- (6 basí) | 48 |
| GGGTGG-GG (GT)iGG SEQ ID NO:25-(6- basí) | 60 |
| TTGTTT-TT (GT)tTT SEQ ID NO :26-(6- basí) | 34 |
| AAGTAA-AA (GT)iAA SEQ ID NO:27-(6- basí) | 13 |
| CCGTCC-CC (GT)iCC SE ID NO : 28- (6 basí) | 11 |
| TGGTTG-TG (GT)iTG SEQ ED NO : 29- (6 basí) | 42 |
| ATGTAT-AT (GT)iAT SE ID NO : 30- (6 basí) | 16 |
| AGGTGA-AG (GT)iGA SEQ ID NO : 31-(6 basí) | 10 |
| GAGTGA-GA (GT)iGA SEQ ID NO : 32- (6 basí) | 24 |
| GGGTCT-GG (GT)iCT SEQ ID NO : 33- (6 basí) | 15 |
| CCGTGG-CC (GT)iGG SEQ ID NO : 34- (6 basí) | 37 |
| GGGTCC-GG (GT)iCC SEQ ID NO : 35- (6 basí) | 20 |
| CTGTCT-CT (GT)iCT | 19 |
φφ » φ · • * » · • φ φ··φ wv • φ « • · * · • · · # φ φφφ ·· · ·» *·**
φ φ · ·« · te
| SEQ ID NO : 36- (6 basí) | |
| TCGTTC-TC (GT)iTC SE ID NO : 37-(6 basí) | 20 |
| CGGTGC-CG (GT),GC SEQ ID NO : 38-(6 basí) | 16 |
| TTGTGG-TT (GT)iGG SEQ ID NO : 39- (6 basí) | 35 |
| GGGTTT-GG (GT)iTT SEQ ID NO : 40-(6 basí) | 31 |
| GGTTGG-GG (TT)jGG SEQ ID NO : 41-(6 basí) | 43 |
| GGAAGG-GG (AA)iGG SEQ ID NO : 42- (6 basí) | 22 |
| GGCCGG-GG (CC)GG SEQ ID NO : 43- (6 basí) | 29 |
| GGGGGG-GG (GG)iGG SEQ ID NO : 44- (6 basí) | 26 |
| GGGAGG-GG (GA)iGG SEQ ID NO : 45- (6 basí) | 28 |
| GGGCGG-GG (GC)iGG SEQ ID NO : 46- (6 basí) | 23 |
| GGAGGG-GG (AG)iGG SEQ ID NO : 47-(6 basí) | 14 |
| GTGGGG- (GT)iG4 SE ID NO : 48-(6 basí) | 26 |
| TTAGGG-TT (AG)iGG SEQ ID NO : 49- (6 basí) | 45 |
Jak je uvedeno v tabulce 4, GT sekvence o 6 basích inhibovaly proliferaci buněk Jurkat. GT SEQ ID NO:25 inhibovala proliferaci ze 60 % a AGT SEQ ID NO:49 inhibovala proliferaci ze 45 %. Srovnání relativní síly GT SEQ ID NO:25 a AGT SEQ ID NO:49 pomocí PHARM/PCS4 Software (Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA) ukázalo, že síla GT SEQ ID NO.25 je 3,4násobná vzhledem AGT SEQ ID NO:49. Bylo zjištěno, že AGT SEQ ID NO:49 fosfothioát inhibuje telomerasovou aktivitu a indukuje apoptosu v buňkách Burkittova lymfomu (mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189, 1997). Pro určení telomerasové aktivity byly pomocí PCR• · ·♦
9999 • tt «
>· «tt * « 9 9 • · · · • · ···» • · · ·
tt «·
9 9 tt 9 • · • ♦ ««·· telomerického opakovaného zesilovacího způsobu (TRAP) (Roche, Laval, Québec, Canada) testovány extrakty z 2 x 105 Jurkat T buněk. Při koncentracích mezi 1 až 100 pg/ml vykazoval fosfodiester GT SEQ ID NO:25 0 až 10 % antitelomerasové aktivity, zatímco fosfothioát AGT SEQ ID NO:49 vykazoval 30 až 75 % antitelomerasové aktivity. Ani fosfothioát GT SEQ ID NQ:25, ani GT SEQ ID NO:49 fosfodiester nevykazoval žádnou antitelomerasovou aktivitu.
Jurkat T buňky byly inkubovány s GT sekvencemi o 2, 3, 4, 5, 6 a 7 basích (tabulka 5).
Tabulka 5 % inhibice proliferace Jurkat lidských leukemických T buněk
| Sekvence | % inhibice |
| GT- (GT)i | 38 |
| SEQ ID NO:50-(2 base) TG-(TG)j | 50 |
| SEQ ID NO : 51-(2 base) TGT- (TG)iT | 22 |
| SEQ ID NO : 7 (3 base) GTG- (GT)iG | 46 |
| SE ID NO : 8- (3 base) GTGG-G (TG)iG | 52 |
| SE ID NO : 52- (4 base) TTGT-T (GT)iT | 25 |
| SEQ ID NO : 53- (4 base) GTGT-G (TG)iT | 42 |
| SE ID NO : 54- (4 base) TTGG-T (TG),G | 44 |
| SE ID NO : 55- (4 base) GGTG-G (GT)iG | 54 |
| SEQ ID NO : 56- (4 base) TGTT-T (GT)iT | 32 |
| SEQ ID NO : 57- (4 base) GGTT-G (GT)iT | 37 |
• · · * · • · • · · · · • · · · · • · · · · · • ······· ·
| SEQ ID NO : 58- (4 base) | |
| TGTG-T (GT)iG SEQ ID NO : 59- (4 base) | 52 |
| GGTGG-G (GT)iG2 SEQ ID NO : 60- (5 base) | 50 |
| GGGTG-G2 (GT)G SEQ ID NO : 61- (5 base) | 50 |
| TGTGTG- (TG)3 SEQ ID NO : 9- (6 base) | 36 |
| GTGTGT- (GT)3 SE ID NO : 10- (6 base) | 48 |
| TTTGTT-TT (TG)iTT SEQ ID NO : 23- (6 base) | 31 |
| GGTGGG-GG (TG)iGG SEQ ID NO : 24- (6 base) | 48 |
| GGGTGG-GG (GT)iGG SEQ ID NO : 25- (6 base) | 60 |
| TTGTTT-TT (GT)iTT SEQ ID NO : 26- (6 base) | 34 |
| TGGTTG-TG (GT)iTG SEQ ID N029-(6 base) | 42 |
| GGGGTGG-G3(GT)G2 SEQ ID NO : 62- (7 base) | 41 |
| GGGTGGG-G2(GT)G3 SEQ ID NO : 63- (7 base) | 28 |
| TGGGTGG-TG2(GT)iG2 SEQ ID NO:64-(7 base) | 55 |
| GGGTGGT-G2(GT)iG2T SEQ ID NO : 65- (7 base) | 48 |
Jak je uvedeno v tabulce 5, GT sekvence o 2, 3, 4, 5, 6 a 7 basích inhibují proliferaci Jurkat T buněk.
• · · · • · · · · ·· ·· • · · · • · ·
Příklad 5
Inhibice proliferace HL-60 lidských promyelotických leukemických buněk.
HL-60 promyelotické leukemické buňky jsou modelem pro p53 mutovaný lidský suspensní tumor. HL-60 buňky byly inkubovány s GT sekvencemi (tabulka 6).
Tabulka 6 % inhibice proliferace HL-60 lidských promyelotických leukemických buněk
Sekvence
TGTGTG-(TG)3 SEQ ID NO : 9- (6 basí) GTGTGT- (GT)3 SEQ ID NO : 10- (6 basí) TTTGTT-TT (TG)iTT SEQ ID NO : 23- (6 basí) GGTGGG-GG(TG)iGG SEQ ID NO : 24- (6 basí) GGGTGG-GG(GT)iGG SEQ ID NO : 25- (6 basí) TTGTTT-TT(GT)iTT SEQ ID NO : 26- (6 basí) % inhibice
Jak uvádí tabulka 6, GT sekvence o 6 basích inhibují proliferaci HL-60 buněk.
Příklad 6
Inhibice proliferace MCM-7 buněk lidské rakoviny plic
MCF-7 buňky lidské rakoviny plic jsou caspasa 3 negativním, na estrogenů závislým modelem lidského pevného tumoru. MCF-77 buňky (5 χ 105 buněk/ml) bylo inkubováno se GT sekvencemi o 3 a 6 basích (tabulka 7).
Tabulka 7 % inhibice proliferace MCF-7 lidských buněk plicní rakoviny • ·
| Sekvence | c |
| TGT- (TG)iT | -6 |
| SEQ ID NO : 7- (3 base) | |
| GTG- (GT)G | 18 |
| SEQ ID NO : 8- (3 base) | |
| TGTGTG-(TG)3 | 6 |
| SEQ ID NO : 9- (6 basí) | |
| GTGTGT-(GT)3 | 31 |
| SEQ ID NO : 10-(6 basí) | |
| TTTGTT-TT(TG)iTT | 7 |
| SEQ ID NO : 23- (6 basí) | |
| GGTGGG-GG(TG)iGG | 41 |
| SEQ ID NO : 24- (6 basí) | |
| GGGTGG-GG(GT)iGG | 41 |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | |
| TTGTTT-TT(GT)!TT | 20 |
| SEQ ID NO : 26- (6 basí) |
% inhibice
Jak je uvedeno v tabulce 7, GT sekvence o 6 a 7 basích inhibovaly proliferaci buněk MCF-7.
Příklad 7
Inhibice proliferace lidských PC-3 buněk rakoviny prostaty
PC-3 buňky rakoviny prostaty jsou mutovaným, na androgenech závislým modelem lidského pevného tumoru. PC-3 buňky (5 x 105 buněk/ml) byly inkubovány s GT sekvencemi o 3 a 6 basích (tabulka 8).
Tabulka 8 % inhibice proliferace lidských PC-3 buněk rakoviny prostaty fit
| Sekvence | c |
| TGT-(TG)T | 8 |
| SEQ ID NO : 7- (3 base) | |
| GTG- (GT)G | 13 |
| SEQ ID NO : 8- (3 base) | |
| TGTGTG (TG)3 | 16 |
| SEQ ID NO : 9- (6 basí) | |
| GTGTGT- (GT)3 | 37 |
| SEQ ID NO : 10- 6 basí | |
| TTTGTT-TT (TG)iTT | 14 |
| SEQ ID NO : 23- (6 basí) | |
| GGTGGG-GG (TG)iGG | 26 |
| SEQ ID NO : 24- (6 basí) | |
| GGGTGG-GG (GT),GG | 38 |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | |
| TTGTTT-TT (GT)iTT | 18 |
| SEQ ID NO : 26- (6 basí) |
% inhibice
Jak je uvedeno v tabulce 8, GT sekvence o 3 a 6 basích inhibují proliferaci PC-3 buněk.
Příklad 8
Inhibice proliferace lidských LNCaP buněk rakoviny prostaty
LNCaP buňky lidské rakoviny prostaty jsou TGF-beta 1 receptor negativním, na androgenu nezávislým modelem metastásujícího pevného tumoru. LNCaP buňky (5 x 105 buněk/ml) bylo inkubováno s GT sekvencemi o 6 basích (tabulka 9).
Tabulka 9 % inhibice proliferace LNCaP lidských buněk rakoviny prostaty • * • ·
Sekvence % inhibice
TGTGTG-(TG)3 SEQ ID NO : 9- (6 basí) GTGTGT-(GT)3 SEQ ID NO : 10-(6 basí) TTTGTT-TT(TG)TT SEQ ID NO : 23-(6 basí) GGTGGG-GG(TG)GG SEQ ID NO : 24- (6 basí) GGGTGG-GGO(GT)GG SEQ ID NO : 25- (6 basí) TTGTTT-TT(GT)TT SEQ ID NO : 26- (6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 9, GT sekvence o 6 basích inhibovaly proliferaci LNCaP buněk.
Příklad 9
Inhibice proliferace THP-1 lidských buněk akutní monocytické leukemie
THP-1 buňky lidské akutní monocytické leukemie jsou modelem p53 nula lidského suspensního tumoru. THP-1 buňky (1,6 x 106 buněk/ml) bylo inkubováno s GT sekvencemi o 6 basích (tabulka 10).
Tabulka 10 % inhibice proliferace THP-1 lidských buněk akutní monocytické leukemie • · ··· · • ·
Sekvence % inhibice
TGTGTG-(TG)3
SEQ ID NO : 9- (6 basí) GTGTGT-(GT)3
SEQ ID NO : 10-6 basí 111GTT-TT (TG)JT SE ID NO : 23- (6 basí) GGTGGG-GG(TG),GG SEQ ID NO : 24- (6 basí) GGGTGG-GG(GT)iGG SEQ ID NO : 25- (6 basí)
SEQ ID NO : 26- (6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 10, GT sekvence o 6 basích inhibovaly proliferaci THP-1 buněk.
Příklad 10
Inhibice proliferace lidských OVCAR-3 buněk rakoviny vaječníků
OVCAR-3 lidské buňky rakoviny vaječníků jsou modelem p53, p21/waf/Cip deletovaného, mutovaného, metastásujícího pevného lidského tumoru. OVCAR buňky (5 χ 105 buněk/ml) bylo inkubováno s GT sekvencemi o 2, 6 a 18 basích a AGT sekvencí o 6 basích (tabulka 11).
Tabulka 11 % inhibice proliferace lidských OVCAR-3 buněk rakoviny vaječníků
Sekvence % inhibice
TG-(TG)i
SEQ ID NO : 51-(2 base)
4444
44
4 · · · · · ···· ·· * ·· * • 4 4444 4444 444 4
4 4 4 4 4 4 4 4
4 44 4 44 4444
TTAGGG-TT(AG)iGG 15
SEQ ID NO : 49- (6 basí)
GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)9 10
SEQ ID NO : 18-(18 basí)
GGGTGG-GG(GT), GG 15
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 11, GT sekvence o 2, 6 a 18 basích a AGT sekvence o 6 basích inhibují proliferaci OVCAR-3 buněk.
Příklad 11
Inhibice proliferace lidských SK-OV-3 buněk rakoviny vaječníku
Buňky SK-OV-3 rakoviny vaječníku jsou modelem p53, p21/waf-l/Cip deletovaného, pl5ink4B deletovaného, metastásujícího pevného tumoru. SK-OV-3 buňky (5 x 105 buněk/ml) bylo inkubováno s GT sekvencemi o 2, 6 a 18 basích (tabulka 12).
Tabulka 12 % inhibice proliferace lidských buněk SK-OV-3 rakoviny vaječníku
Sekvence % inhibice
TG-(TG)i 1
SEQ ID NO : 51-(2 base)
TTAGGG-TT(AG)iGG 11
SE ID NO : 49- (6 basí)
GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)9 6
SEQ ID NO : 18-(18 basí)
GGGTGG-GG(GT)iGG 12
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 12, GT sekvence o 2, 6 a 18 basích inhibovaly proliferaci buněk SKOV-3.
Příklad 12
Inhibice proliferace buněk sekvencemi fosfodiesteru a fosfothioátu ·· ··»· • · · • · · • · · · • · · · · · • · ·
·* ·♦ • · · · • fc · » · ··· ·
Bylo popsáno, modifikace přirozených sekvencí fosfodiesterů substitucí atomu síry za nemůstkový kyslíkový atom v jedné nebo ve více fosfátových skupinách zvyšuje stabilitu oligonukleotidových sekvencí vůči endonukleasám v biologických tekutinách a v buňkách (Crooke et al. Anticancer Drugs 6:609, 1991).
Jurkat lidské leukemické T buňky (tabulka 13), lidské buňky LNCaP rakoviny prostaty (5 x 105 buněk /ml) (tabulka 14) a MCF-7 lidské buňky rakoviny plic (5 x 105 buněk/ml)(tabulka 15), byly inkubovány s GT sekvencemi o 6 basích, které mají jako nemůstkový atom ve fosfátové skupině buď kyslík (fosfodiester) nebo síru (fosfothioát).
Tabulka 13 % inhibice proliferace lidských Jurkat leukemických T buněk
| Sekvence | % inhibice | |
| FOSFODIESTER FOSFOTHIOÁT | ||
| TGTGTG- (TG)3 (6 basí) SEQ ID NO : 9 fosfodiester ; fosfothioát | 37 | 17 |
| GTGTGT- (GT)3 (6 basí) SEQ ID NO : 10 fosfodiester; fosfothioát | 44 | 0 |
| TTTGTT-TT(TG)iTT (6 basí) SEQ ID NO : 23 fosfodiester; fosfothioát | 31 | 4 |
| GGTGGG-GG(TG)iGG (6 basí) SEQ ID NO : 24 fosfodiester ; fosfothioát | 48 | 6 |
| GGGTGG-GG(GT)!GG (6 basí) SEQ ID NO : 25 fosfodiester; fosfothioát | 60 | 0 |
| TTGTTT-TT(GT)iTT (6 basí) SEQ ID NO : 26 fosfodiester ; fosfothioát | 34 | 0 |
Tabulka 14 % inhibice proliferace lidských LNCaP buněk rakoviny prostaty
| 26 | • 4 * · · 9 < • · 0 · · · 1 0 0 0 9 0 0 · 0 · 9 0 1 | |
| » 0 0 0 | 0 0 0 0 1 0 0« 0 | |
| Sekvence | % inhibice | |
| Fosfodiester fosfothioát | ||
| TGTGTG- (TG)3 (6 basí) SEQ ID NO : 9 fosfodiester; fosfothioát | -9 | -16 |
| GTGTGT-(GT)3 (6 basí) SEQ ID NO : 10 fosfodiester ; fosfothioát | -4 | -20 |
| TTTGTT-TT(TG)iTT (6 basí) SEQ ID NO : 23 fosfodiester ; fosfothioát | 14 | -11 |
| GGTGGG-GG(TG)iGG (6 basí) SEQ ID NO : 24 fosfodiester ; fosfothioát | 17 | -17 |
| GGGTGG-GG(GT),GG (6 basí) SEQ ID NO : 25 fosfodiester ; fosfothioát | 18 | -8 |
| TTGTTT-TT(GT)iTT (6 basí) | 22 | -1 |
SEQ ID NO : 26 fosfodiester ; fosfothioát
Tabulka 15 % inhibice proliferace MCF-7 lidských buněk rakoviny plic
| Sekvence | % inhibice | |
| fosfodiester | fosfothioát | |
| TGTGTG-(TG)3 (6 basí) SEQ ID NO : 9 fosfodiester; fosfothioát | 6 | 6 |
| GTGTGT-(GT)3 (6 basí) SEQ ID NO : 10 fosfodiester ; fosfothioát | 31 | 12 |
| TTTGTT-TT(TG),TT (6 basí) SEQ ID NO : 23 fosfodiester ; fosfothioát | 7 | 8 |
| GGTGGG-GG (TG)iGG (6 basí) SEQ ID NO : 24 fosfodiester; fosfothioát | 41 | 12 |
| GGGTGG-GG(GT)iGG (6 basí) SEQ ID NO : 25 fosfodiester ; fosfothioát | 41 | 12 |
| TTGTTT-TT(GT)iTT (6 basí) | 20 | 6 |
·»«· • « » ft » · » · · • · * • · · · • » ···· · · · * • « · « ♦ · • « · r4· ·
SEQ ID NO : 26 fosfodiester ; fosfothioát
Jak je uvedeno v tabulkách 13, 14 a 15, GT fosfodiesterové sekvence o 6 basích inhibovaly proliferaci Jurkat T, LNCap a MCF-7 buněk účinněji než GT fosfothioátové sekvence o 6 basích.
Příklad 13
Inhibice proliferace buněk smíšenými fosfodiesterovými a fosfothioátovými sekvencemi
T buňky Jurkat lidské leukemie (tabulka 16) a buňky MCF-7 lidské rakoviny plic (5 x 105 buněk/ml) (tabulka 17) byly inkubovány s GT SEQ ID NO:25 o 6 basích, přičemž nemůstkovými atomy ve fosfátové skupině byly buď kyslík (fosfodiester) nebo síra (fosfothioát).
Tabulka 16 % inhibice proliferace Jurkat lidských leukemických T buněk
Sekvence % inhibice
G0G0G0T0G0G0-G0G0 (GoTo)iGoGo (kyslíkový atom 1 až 6)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GoGoGsToGoGo-GoGo(GsTo)iGoGo (kyslíkový atom 1, 2, 4, 5, 6 ; atom síry 3)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GoGoGoTs GoGo-GoGo (GoTs)iGoGo (kyslíkový atom 1, 2, 3, 5, 6 ; atom síry 4)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GoGoGsTsGoGo-GoGo(GsTs)iGoGo (atom kyslíku 1, 2, 5, 6 ; atom síry 3, 4)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GsGoGoTs GoGs-GsGo (GoTo)iGoGs ( atom kyslíku 2, 3, 4, 5 ; atom síry 1, 6)
SEQ ID NO : 25- (6 basí) • · · · • 4 • · · · • · · · · 4 4
9 9 4 · · 9 99 * πο 9 9 9999 9999 999 9
2θ 999 999 9 9 ·
9 99 · 999999
GoGsGoToGsGo-GoGs(GoTo)iGsGo (atom kyslíku 1, 3, 4, 6 ; atom síry 2, 5)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GsGsGoToGsGs-GsGs(GoTo)iGsGs (atom kyslíku 3, 4 ; atom síry 1, 2, 5, 6)
SE ID NO : 25-(6 basí)
G, G, G, T, GsGs-GsGs(GsTs)iGsGs (atom síry 1 až 6) 0
SEQ ID NO : 25- (6 basí; fosfothioát) *Poznámka: „o“ představuje atom kyslíku a „s“ představuje atom síry ve fosfátové skupině.
Tabulka 17 % inhibice proliferace NCF-7 lidských buněk rakoviny plic
Sekvence % inhibice
G0G0G0T0G0G0-G0G0 (GoTo)iGoGo (atom kyslíku 1 to 6) 41
SEQ ID NO : 25- (6 basí ;fosfodiester)
G0G0GST0G0G0-G0G (GSTo)iGaGo (atom kyslíku 1, 2, 4, 5, 6 ; atom síry 3)
SEQ ID NO:25-(6 basí)
GoGoGoTsGoGo-GoGo(GoTs)i=GoGo (atom kyslíku 1, 2, 3, 5, 6 ;atom síry 4)
SEQ ID N025-(6 basí)
GoGoGsTsGoGo-GoGo(GsTs)igoGo (atom kyslíku 1, 2, 5, 6 ; atom síry 3, 4)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GsGoGoToGoGs-GsGo(GoTo)jGoGs (atom kyslíku 2, 3, 4, 5 ; atom síry 1, 6)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GoGsGoToGsGo-GoGs(GoTo)jGsGo (atom kyslíku 1, 3, 4, 6 ; atom síry2, 5) ··· ······ · · ··· ·· · · · ···· · · · · · • ······· · · · · · ·· · · · · · ·
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GsGSGoToGsGs-GsGs(GoTo)iGsGs (atom kyslíku 3, 4 ; atom síry 1, 2, 5, 6)
SEQ ID NO 25-(6 basí)
GsGsGsTsGsGs-GsGs (GsTs)iGsGs ; (atom síry 1 až 6) 12
SEQ ID NO : 25 (6 basí: fosfothioát) *Poznámka: „o“ představuje atom kyslíku a „s“ znázorňujě atom síry ve fosfátové skupině.
% inhibice proliferace myších T buněk EL-4 lymfomu
Sekvence
GGGTGG-GG (GT)iGG SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GGGTGG-GG(GT),GG
SEQ ID NO : 25- (6 basí fosfothioát)
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GiT)i3G
SEQ ID NO : 1- (27 basí)
GTGTGTTTGGTGGTTTTGTTTGTTGTTTTTTTG SE ID NO : 66- (33 basí)
AACCACAAGCCCAAC
Jak je uvedeno v tabulkách 16 a 17, substituce atomu síry nemůstkovým kyslíkovým atomem v jedné nebo více fosfátových skupinách GT SEQ ID NO:25, měla za výsledek signifikantní snížení inhibice proliferace buněk Jurkat a MCF-7.
Příklad 14
Inhibice proliferace myších rakovinných buněk
T buňky EL-4 lymfomu jsou modelem suspensního tumoru. T buňky myšího EL-4 lymfomu byly inkubovány s GT sekvencemi o 6, 18, 27 a 33 basemi a s ACG sekvencí o 15 basích (tabulka 18).
Tabulka 18 % inhibice • · · ·
SEQ ID NO : 67-(15 basí)
GTGTGT- (GT)3 -2
SE ID NO : 10- 6 basí
GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)9 -2
SEQ ID NO : 18-(18 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 18, GT sekvence o 6, 18, 27 a 33 basích a ACG sekvence o 15 basích neinhibovaly proliferaci myších buněk EL-4.
B buňky A20 myší leukemie jsou modelem suspensního tumoru. Myší B buňky A20 leukemie byly inkubovány s GT sekvencemi o 6 basích (tabulka 19).
Tabulka 19 % inhibice proliferace A20 myších leukemických B buněk
Sekvence % inhibice
TGTGTG- (TG)3 SEQ ID NO : 9- (6 basí) GTGTGT- (GT)3 SEQ ID NO : 10- (6 basí)
TTTGTT-TT (TG),TT
SEQ ID NO : 23- (6 basí) GGTGGG-GG(TG)iGG
Z SEQ ID NO : 24- (6 basí)
GGGTGG-GG(GT)iGG SEQ ID NO:25-(6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 19, inhibují GT sekvence o 6 basích proliferaci buněk A20 myší leukemie.
Příklad 15
Inhibice proliferace psích rakovinných buněk
D-17 buňky psího osteosarkomu a CF-51 buňky rakoviny psí mléčné žlázy jsou modelem pevného tumoru. Buňky D-17 psího osteosarkomu (5 χ 105 buněk/ml) (tabulka 20) a buňky CF-51 rakoviny psí mléčné žlázy (5 χ 105 buněk/ml) (tabulka 21) byly inkubovány s GT sekvencemi o 6, 9, 17, 27 a 33 basích a s ACG sekvencí o 15 basích.
Tabulka 20 % inhibice proliferace buněk D-17 psího osteosarkomu
Sekvence % inhibice
GGGTGG-GG(GT) i GG 18
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)i3G 23
SEQ ID NO : 1- (27 basí)
GTGTGTTTGGTGGTTTTGTTTGTTGTTTTTTTG 23
SEQ ID NO : 66- (33 basí)
AACCACAAGCCCAAC 20
SEQ ID NO : 67-(15 basí)
GTGTGT-(GT)3 15
SEQ ID NO : 10-(9 basí)
TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)8T 8
SEQ ID NO : 17-(17 basí)
Tabulka 21 % inhibice proliferace CF-51 buněk psí mléčné žlázy
Sekvence % inhibice
GGGTGG-GG(GT)iGG SEQ. ID N025-(6 basí)
| 32 | • · · • · · · 1 • · • · |
| GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)3G SEQ ID NO : 1- (27 basí) | 23 |
| GTGTGTTTGGTGGTTTTGTTTGTTGTTTTTTTG SE ID NO : 66- (33 basí) | 23 |
| AACCACAAGCCCAAC SEQ ID NO : 67-(15 basí) | 20 |
| GTGTGT-(GT)3 SEQ ID NO : 10- 9 basí | 15 |
| TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)gT SE ID NO : 17-(17 basí) | 8 |
Jak je uvedeno v tabulkách 20 a 21, GT sekvence o 6, 9, 17, 27 a 33 basích a ACG sekvence o 15 basích inhibují proliferaci psích jak D-17, tak i CF-51 buněk.
Příklad 16
Inhibice proliferace rakovinných buněk
Přehled inhibice proliferace lidských, myších a psích buněk GT SEQ ID NO:25 o 6 basích je v tabulce 22.
Tabulka 22 % inhibice proliferace lidských, myších a psích rakovinných buněk
Buňky
GG(GT)iGG (SEQ ID NO:25)
Lidské Jurkat 60
Lidské PC-3 38
Lidské MCF-7 41
Lidské HL-60 35
Lidské OVCAR-3 14
Lidské LNCaP 18
Lidské SK-OV-3 12
Lidské THP-1 15
Myší EL-4 1
Myší A20 • ·
4·· · * · 4 4 4 4
444· 44 4 44 4
4444444 44 44 4 4
444 444 444
4 44 4 444444
Myší L-1210 PsíD 17 Psí CF-51
Jak je uvedeno v tabulce 22, jsou lidské rakovinné buňky citlivější než psí rakovinné buňky a myší rakovinné buňky vůči inhibici proliferace GT sekvencí SEQ ID NO:25 o 6 basích.
Příklad 17
Synergický účinek dvou GT sekvencí o 6 basích na inhibici proliferace
Sekvence % inhibice
GGGTGG-GG(GT)iGG 5
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
TTGTTT-TT(GT)iGG -2
SEQ ID NO : 26- (6 basí)
GG (GT)iGG+TT(GT)iGG 14
SEQ ID NO : 25 + SEQ ID NO : 26
TGGTTG-TG(GT)iTG -1
SEQ ID NO : 29- (6 basí)
TGGTTG-TG(GT)iTG 2
SEQ ID NO : 10- (6 basí)
TG (GT) 1ITG + TG(GT)iTG 9
SEQ ID NO : 29 + SEQ ID NO : 10
GGTTGG-GG(TT)jGG 4
SEQ ID NO : 41- (6 basí)
TTGTGG-TT (GT)iGG 4
SEQ ID NO : 39- (6 basí)
GG(TT)iGG+TT(GT)!GG 18
SEQ ID NO:41 + SEQ ID NO:39
Jak je uvedeno v tabulce 23, má současné použití dvou GT sekvencí o 6 basích synergický vliv na inhibici proliferace Jurkat T buněk.
• · · · · · • » • · · • · · · ·
• ·
Příklad 18
Násobení antineoplastického účinku chemoterapeutických léčiv
Lidské Jurkat leukemické T buňky byly inkubovány s 1,0 pg/ml GR SEQ ID NO:25 o 6 basích a s GT SEQ ID NO:1 o 27 basích v přítomnosti 0, 0,1, 1,0 nebo 10,0 pg/ml 5fluoruracilu nebo cis-platiny (tabulka 24), 5-fluoruracil je antimetabolit, který interferuje se syntézou DNA a RNA. Cis-platina je alkylační činidlo, které příčně síťuje DNA a inhibuje prekursory DNA.
Tabulka 24 % inhibice proliferace Jurkat lidských leukemických T buněk
Sekvence % inhibice
5-fluoruracil (pg/ml)
| 0,0 | 0,1 | 1,0 | 10,0 | |
| 5-fluoruracil | 0 | 3 | 14 | 38 |
| GG(GT)iGG-(6 basí) | 0 | 10 | 21 | 40 |
| SEQ ID NO : 25 při 1,0 pg/ml | ||||
| (GT)í3G- (27 basí) | 3 | 15 | 25 | 41 |
SEQ ID NO : 1 při 1,0 pg/ml
Cis-platina (pg/ml)
| 0,0 | 0,1 | 1,0 | 10,0 | |
| Cis-platina | 0 | 7 | 29 | 73 |
| GG(GT)iGG-(6 basí) | 0 | 14 | 38 | 76 |
| SEQ ID NO : 25 při 1,0 pg/ml | ||||
| (GT)13G-(27 basí) | 3 | 18 | 35 | 76 |
SEQ ID NO : 1 při 1,0 pg/ml
Jak je uvedeno v tabulce 24, GT SEQ ID NO:25 o 6 basích GT SEQ ID NO:1 o 27 basích násobí antineoplastický účinek 0,1 a 1,0 pg/ml 5-fluoruracilu na proliferaci Jurkat T buněk a GT SEQ ID NO:25 násobí neoplastický účinek 0,1 a 1,0 pg/ml cis-platiny na proliferaci Jurkat T buněk.
4
4444 * ·
4 4 · 44
4444444 4 4
4 4 4 4 4
4 444
Lidské buňky MCF-7 rakoviny plic (5 x 105 buněk/ml) byly inkubovány s 1,0 pg(ml GT SEQ ID NO:25 o 6 basích a GT SEQ ID NO: 1 o 27 basích v přítomnosti 0, 0,1, 1,0 a 10,0 pg/ml 5fluoruracilu nebo tamoxifenu (tabulka 25). Tamoxifen je antagonista estrogenů.
Tabulka 25 % inhibice proliferace lidských MCF-7 buněk rakoviny plic
Sekvence % inhibice
5-fluoruracil (pg/ml)
| 0,0 | 0,1 | 1,0 | 10,0 | |
| 5-fluoruracil | 0 13 | 28 | 28 | |
| GG(GT)iGG-(6 basí) | 6 | 24 | 36 | 33 |
| SEQ ID NO : 25 při 1,0 pg/ml | ||||
| (G,T)13G(27 basí) | 8 | 24 | 35 | 33 |
SE ID NO : 1 při 1,0 pg/ml tamoxifen pg/ml
| o,o | 0,1 | 1,0 | 10,0 | |
| Tamoxifen | 0 | 10 | 18 | 15 |
| GG (GT)iGG-(T basí) | 6 | 21 | 24 | 31 |
| SEQ ID NO : 25 při 1,0 pg/ml | ||||
| (GT)i3G- (27 basí) | 8 | 19 | 24 | 20 |
SEQ ID NO : 1 při 1,0 pg/ml
Jak je uvedeno v tabulce 25, SEQ ID NO:25 o 6 basích násobí neoplastický účinek 0,1 pg/ml 5-fluoruracilu a 0,1 pg/ml tamoxifenu na proliferaci MCF-7 buněk. SEQ ID NO: 1 o 27 basích nenásobí neoplastické aktivity 5-fluoruracilu nebo tamoxifenu na proliferaci buněk MCF7.
Příklad 19
Inhibice proliferace opakováními GT SEQ ID NO:25 o 6 basích
Lidské Jurkat leukemické T buňky byly inkubovány s 1, 2, 3 a 4 opakováními GG(GT)iGG (SEQ ID NO:25) (tabulka 26).
•0 ·0··
00
0 · 0 0 0 0 • · ♦ · 00 · 0· · 0 0000000 0 0 00 0 0 000 000 000
0 00 0 000000
Tabulka 26 % inhibice proliferace lidských Jurkat leukemických T buněk
Sekvence % inhibice
GGGTGG-GG(GT),GG 60
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GGGTGGGGGTGG-[GG(GT)iGG]2 18
SEQ ID NO : 68-(12 basí)
GGGTGGGGGTGGGGGTGG-[GG(GT),GG]3 5
SEQ ID NO : 69-(18 basí)
GGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGTGG-[GG(GT)iGG]4 13
SEQ ID NO : 70- (24 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 26, inhibice proliferace Jurkat T buněk byla 60 % s GT SEQ ID NO:25 o 6 basích a snižovala se s GT SEQ ID NO:68 o 112 basích, GT SEQ ID NO:69 o 18 basích a GT SEQ ID NO:70 o 24 basích. Bod tání (Tm) GT SEQ ID NO:25 o 6 basích byl 2,5 °C a zvyšoval se na 56,8 °C u GT SEQ ID NO:68, na 76,3 °C u GT SEQ ED NO:69 a na 86,3 °C u GT SEQ ID NO:70.
Příklad 20
Inhibice proliferace sekvence odvozené od Bacillus Calmette guerin (BCG)
Bylo popsáno, že sekvence odvozené od BCG inhibují růst tumoru in vivo (Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992). A-2 (SEQ ID NO:72) a BCG-4 (SEQ ID NO: 71) kromě toho, jsou-li smíseny s IMC buňkami a injikovány do CDF-1 myší, inhibují růst IMC tumoru z 88 %, případně z 37 %.
Lidské leukemické Jurkat T buňky byly inkubovány se sekvencemi o 45 basích odvozenými od BCG (tabulka 27).
Tabulka 27 % inhibice proliferace lidských leukemických Jurkat T buněk Sekvence % inhibice
BCGA-1
AAAGAGGGGCATGACCCGGTGC GGGGCTTCTTGCACTCGGCATAG SEQ ID NO : 71 (45 basí) • f · · * * • » <t « · » · »· * • ·«·«··» · ♦ « · · ·
BCGA-2
AAAAGAAGTGGGGTGCCCCCAC GATCACCAACGATGGTGTGTCCA SEQ ID NO : 72- (45 basí)
BCGA-3
TCCATCGCCAAGGAGATCGAGC TGGAGGATCCGTACGAGAAGATC SEQ ID NO : 73- (45 basí)
BCG A-4
ACCGATGACGTCGCCGGTGACG GCAACACGACGGCCACCGTGCTG SEQ ID NO : 74- (45 basí)
BCG A-6
ACGAGACCACCATCGTCGAGGG CGCCGGTGACACCGACGCCATCG SEQ ID NO : 75- (45 basí)
BCG A-7
GCCGAGAAGGTGCGCAACCTGC CGGCTGGCCACGGACTGAACGCT SE ID NO : 76- (45 basí)
BCGM-3
ACGCCGACGTCGTCTGTGGTGG GGTGTCTACCGCCAACGCGACGG SE ID NO : 77- (45 basí)
BCG ALPHA-1
CGACTACAACGGCTGGGATATC AACACCCCGGCGTTCGAGTGGTA SEQ ID NO : 78- (45 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 27, sekvence odvozené od BCG inhibovaly proliferaci Jurkat T buněk =< 24 %.
Příklad 21
Indukce zastavení buněčného cyklu
4» 4···
4« 9 9
9 4 4 «4
4 4444 4 4 4
4 4 4 4
4« 4 44
4« 4 4
4 4 4 4
4 4 ·
4 4 4 4
4 4 ·
44 44*4
Stadium buněčného cyklu bylo určeno pomocí CYCLETEST™ PLUS DNA komerčního setu (Becton Dickinson). Jenom v krátkosti, buněčná jádra byla získána rozpuštěním buněčné membrány v neionogenním smáčedle, eliminací buněčného cytoskeletu a jaderných proteinů trypsinem, digesci buněčné RNA RNAsou a stabilizací jaderného chromatinu sperminem.
K buněčným jádrům byl přidán propidium jodid ajejich fluorescence byla měřena průtokovým cytometrem, vybaveným elektronickým zařízením na rozlišování dubletů (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA). Hromadění buněk ve fázích Go/Gl, raná S (SE), střední S (SM), pozdní S (SL) nebo G2/M buněčného cyklu bylo analyzováno pomocí MODFIT LT software (Verity Software House lne., Topsham, MA).
Exponenciálně rostoucí lidské leukemické Jurkat T buňky (tabulka 28) a lidské MCF-7 buňky rakoviny plic (5 x 105 buněk/ml) (tabulka 29) byly inkubovány po 24 h se sekvencemi o 2, 6, 15, 18, 27 a 45 basích, obsahujících A, C, GaT. Buňky byly spojeny a centriíugovány a bylo stanoveno stadium buněčného cyklu.
Tabulka 28
Indukce zastavení buněčného cyklu u lidských Jurkat leukemických T buněk % buněk ve fázi:
| Go/Gj | SE | SM | SL | G2/M | Zastavení* | |
| Neovlivněné buňky | 31,4 | 19,1 | 14,3 | 11,6 | 23,6 | žádná |
| GG(GT)iGG | 28,5 | 46,3 | 14,6 | 10,7 | 0,0 | konec SE |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | ||||||
| TT(GT)iTT | 32,6 | 11,5 | 12,8 | 10,7 | 32,4 | konec |
| SEQ ID NO : 26- (6 basí) | G2/M | |||||
| (slabý) | ||||||
| GT(GT)iGT | 30,8 | 41,9 | 16,8 | 10,2 | 0,3 | konec SE |
| SEQ ID NO : 10- (6 basí) | ||||||
| AG(GT),GA | 35,2 | 29,1 | 10,4 | 8,2 | 17,1 | střed SE |
| SEQ ID NO : 31-(6 basí) | ||||||
| GG (AA)i GG | 48,0 | 19,8 | 8,5 | 5,8 | 34,1 | konec |
| SEQ ID NO : 42-(6 basí) | GoIGi | |||||
| GG(CC)iGG | 26,5 | 21,3 | 22,8 | 10,7 | 18, | konec SM |
| SEQ ID NO : 43 (6 basí) | (slabý) | |||||
| GG(GT)iGG | 34,9 | 14,8 | 15,0 | 10,6 | 24,7 | žádná |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí fosfothioát) |
4* « · · • 0 0» • · 0··· • 0 ·
9/ 9 »0 ·*·»
9 9 * • 9 9 9 · • ·«·
99 00» 0
| (GiT)13G | 40,6 | 35,6 | 14,2 | 9,3 | 0,3 | konec SE |
| SEQ ID NO : 1- (27 basí) | ||||||
| (G,T)13G SEQ ID NO : 1- (27 basí fosfothioát) | 33,7 | 17,6 | 13,2 11,0 | 24,5 | žádná | |
| (G3T)6G3 SEQ. ID NO : 2- (27 basí) | 34,3 | 15,5 | 13,6 | 10,3 | 26,4 | žádná |
| (G5T)4G3 SEQ ID NO : 3- (27 basí) | 40,5 | 13,3 | 12,9 | 9,7 | 23,6 | žádná |
| (G7T)3G3 SEQ ID NO : 4- (27 basí) | 36,5 | 16,3 | 13,8 | 11,1 | 22,3 | žádná |
| AACCACAAGCCCAAC SEQ ID NO : 67- 15 basí | 39,6 | 13,5 | 12,8 | 9,5 | 24,6 | žádná |
| TT(AG)iGG SEQ ID NO : 49- (6 basí) | 24,6 | 37,2 | 19,5 | 5,9 | 12,8 | střed SM |
| (GT)9 SEQ ID NO : 18-(18 basí) | 24,2 | 26,7 24,0 1 | 8,7 | 16,4 | střed SM | |
| BCG A-l SEQ ID NO : 71- (45 basí) | 19,8 | 31,7 | 22,5 | 14,0 | 12,0 | střed SM |
| BCG A-3 SEQ ID NO : 73- (45 basí) | 32,3 | 20,2 | 14,1 | 12,0 | 21,4 | žádná |
| TG SEQ ID NO : 51-(2 base) | 23,1 | 52,3 | 14,8 | 9,8 | 0,0 | konec SE |
) Jak je uvedeno v tabulce 28, u Jurkat T buněk, indukují GT sekvence o 2, 6 a 27 basích j zastavení buněčného cyklu ve fázi SE, CG a AGT sekvence o 6 basích, GT sekvence o 18 basích a BCG A-l o 18 basích indukují zastavení buněčného cyklu ve fázi SM a AG sekvence o ‘ 6 basích indukují zastavení buněčného cyklu ve fázi Gq/Gi.
Tabulka 29
Indukce zastavení buněčného cyklu v lidských MCF-7 buňkách rakoviny plic % buněk ve fázi:
| Go/G | SE | SM | SL | g2/m | Zastavení* | |
| Neovlivněné buňky | 23,6 | 14,4 | 10,8 | n,i | 40,1 | žádná |
| GG(GT)iGG | 21,9 | 27,6 | 22,2 | 10,9 | 17,4 | konec SM |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | |||
| TT(AG)iGG | 20,0 18,6 25,7 20,7 | 15,0 | střed SM |
| SEQ ID NO : 49- (6 basí) (GT)9 SEQ ID NO : 18- 18 basí | 25,3 31,6 16,9 10,5 15,7 | střed SM | |
| TG | 17,2 36,4 13,4 14,1 | 17,9 | konec SE |
| SEQ ID NO : 51-(2 base) |
Jak je uvedeno v tabulce 29, v případě MCF-7 buněk GT sekvence o 2 a 6 basích indukují zastavení buněčného cyklu ve fázi SE, AGT sekvence o 6 basích a GT sekvence o 18 basích indukují zastavení ve fázi SM buněčného cyklu.
Příklad 22
Indukce zastavení buněčného cyklu účinkem GT SEQ ID NO:25, AC SEQ ID NO:79 a GT SEQ ID NO:25 + AC SEQ ID NO:79
Lidské Jurkat leukemické T buňky (1 x 106 buněk/ml) byly inkubovány po 24 h s GT SEQ ID NO:25 o 6 basích, s komplementární SEQ ID NO:79 o 6 basích a GT SEQ ID NO: o 6 basích + AC SEQ ID NO:79 o 6 basích. GT SEQ ID NO:25 a AC SEQ ID NO:79 byly hybridisovány smísením oligonukleotidů (1:1) a zahřátím po 10 min na 65 °C. Jako kontroly byly po 10 min zahřívány na 65 °C GT SEQ ID NO:25 a AC SEQ ID NO:79 (tabulka 30).
Tabulka 30
Indukce zastavení buněčného cyklu u lidských Jurkat leukemických T buněk % buněk ve fázi:
| Go/Gi | SE | SM | SL | G2/M | zastavení* | |
| Neovlivněné buňky | 31,7 | 15,2 | 13,7 | 14,0 | 25,4 | žádné |
| GG(GT)iGG | 28,0 | 45,8 | 14,0 | 11,3 | 0,9 | konec SE |
| SEQ ID NO : 25-(6 basí) | ||||||
| CC(AC),CC | 36,0 | 10,4 | 13,4 | 9,7 | 30,5 | žádné |
| SEQ ID NO : 79- (6 basí) | ||||||
| GT(GT)i GT + CC(AC)1CC | 35,0 | 13,0 | 10,1 | 8,7 | 33,2 | žádné |
SEQ NO :25 + SEQ NO: 79- (12 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 30, GT SEQ ID NO:25 indukovala zastavení na konci fáze SE buněčného cyklu, zatímco komplementární AC SEQ ID NO:79 neměla žádný vliv na buněčný cyklus. Hybridisace GT SEQ ID NO:25 a AC SEQ ID NO:79 neutralizovala zastavení buněčného cyklu, indukované GT SEQ ID NO:25, Tyto údaje demonstrují, že sekvence podle předkládaného vynálezu musí být jedno vláknové, aby byly účinné.
Příklad 23
Indukce apoptosy
Redistribuce fosfatidylserinu z plasmatické membrány a uvolnění proteinové matrix jádra (NuMA) je charakteristické pro buňky, u kterých probíhá apoptosa (Martin et al. J. Exp. Med., 182:1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15:1042, 1993).
Tato redistribuce fosfatidylserinu v plasmatické membráně v průběhu apoptosy byla měřena průtokovou cytometrií použitím FITC-konjugovaného annexinu V (BD Pharmingen, San Diego, CA). Uvolnění NuMA do supernatantu bylo měřeno pomocí komerčního ELISA kitu /Oncogen/Calbiochem, Cambridge, MA).
Lidské Jurkat leukemické T buňky byly inkubovány s 50 μΜ GT sekvencí o 3, 4, 5, 6 a 7 basích, ACGT sekvence o 5 basích, AG, GG, AGT a CGT sekvencemi o 6 basích a GG sekvencí o 7 basích. Tabulka 31 ukazuje % buněk v apoptose (positivní na fosfatidylserin/annexin V barvení (PS/A-V)) a % NuMA uvolněných z buněk.
Tabulka 31
Indukce apoptosy v leukemických Jurkat T buňkách
| Sekvence | % buněk v apoptose (positivní na PS/A-VC barvení) | % uvolněných NuMA buněk (uvolněné versus neovlivněné buňky) |
| GG(GT)iGG | 27 | 69 |
| SEQ ID NO : | 2- (6 basí) | |
| GG(GA)iGG | 27 | 74 |
| SEQ ID NO : | 45- 6 basí) | |
| GG(GC),GG | 16 | 1 |
| SEQ ID NO : | 46- (6 basí) | |
| GG(GG)iGG | 5 | 0 |
| SEQ ID NO : | 44- (6 basí) | |
| AA(GT),AA | 20 | 56 |
| SEQ ID NO : | 27- (6 basí) |
| CC(GT)1CC | 6 | 0 |
| SEQ ID NO : 28- (6 basí) | ||
| TT(GT)iTT SEQ ID NO : 26- (6 basí) | 14 | 23 |
| GT(GT)iGT SEQ ÍD NO : 10- 6 (basí) | 33 | 90 |
| GG(GT)i SEQ ID NO : 78- (4 basí) | 21 | 64 |
| (GT),G SEQ ID NO:52-(4 basí) | 24 | 60 |
| G(GT)iG SEQ ID NO : 56- (4 basí) | 24 | 112 |
| (GT)jG SEQ ID NO : 8- (3 basí) | 21 | 97 |
| T(GT)i SEQ ID NO : 7- (3 basí) | 10 | 35 |
| GG(GT)jG SEQ ID NO : 6- (5 basí) | 25 | 92 |
| G(GT)iGG SEQ ID NO : 60- (5 basí) | 25 | 120 |
| GG(GG)iGGG SEQ ID NO : 63- (7 basí) | 12 | 26 |
| GGG(GT),GG SE ID NO : 62- (7 basí) | 30 | 123 |
| CG(GT)!A SEQ ID NO : 80- (5 basí) | 6 | 9 |
Jak je uvedeno v tabulce 31, GT, AG, CG a AGT sekvence o 3, 4, 5 a 6 basích indukovaly apoptosu Jurkat T buněk. Sekvence ACGT o 5 basích, CGT o 6 basích a CG sekvence neindukovaly apoptosu Jurkat T buněk.
···· • · · • ····
Příklad 24
Zvýšení intracelulární koncentrace vápníku (Ca2+)j
Ve spojení s indukcí apoptosy je popsáno zvýšení intracelulární koncentrace vápníku (Ca2+)j (Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993). Koncentrace vápníku (Ca2+); byla stanovena použitím fluorescenční sondy Fluo-3-AM (Cell Permaant, Molecular probes, Inc., Eugene, OR). Zvýšení Fluo-3-AM fluorescence je měřítkem zvýšení koncentrace (Ca2+);.
Lidské leukemické Jurkat T buňky byly inkubovány po 24 h s GT sekvencí SEQ ID NO:25 oo 6 basích. Buňky byly spojeny centrifugací, suspendovány v PBS, obsahujícím 1 %
PBS a bylo na ně působenolO μΜ Fluo-3-AM po 1 h při 37 °C. Fluorescence buněk byla měřena při excitaci při 488 nm a emisi při 530 nm (FL1 detektor). Údaje byly analyzovány na FACSCALIBUR použitím programu CellQUEST (Becton Dickinson).
Jak je uvedeno na obrázku 1, inkubace Jurkat T buněk s GT SEQ ID NO:25 o 6 basích způsobila 88% zvýšení buněčné fluorescence, příznaku zvýšení (Ca2+)i.
Příklad 25
Indukce apoptosy
Apoptosa může být iniciována ligandy, které se váží na receptory buněčného povrchu, včetně, ale bez omezení, Fas (CD95) a faktoru tumorové nekrosy (TNF). Navázání Fas k receptorů pro Fas a navázání TNF k receptorů pro TNF iniciuje intracelulární signalizaci, jejímž výsledkem je aktivace cystein aspartylových proteas (caspas). Caspasy iniciují provedení letální proteolytické kaskády apoptosy, které je spojeno s fragmentací jaderné DNA, uvolněním jaderných matricových proteinů (NuMA) a ztrátu kontaktu s buněčnými substráty.
Lidské leukemické Jurkat T buňky (1 x 106 buněk/ml) byly inkubovány s GT sekvencemi o 6 a 27 basích (tabulka 32). NuMA bylo stanoveno jako v příkladu 23.
Tabulka 32 % NuMA uvolněných z lidských leukemických T buněk Sekvence
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GiT)i3G SE ID NO : 1-(27 basí)
GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGG-(G3T)6G3 SEQ ID NO : 2- (27 basí)
GGGGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGTGGG-(G5T)4G3 SEQ ID NO : 3- (27 basí) % uvolněných NuMA 22
139 ··· · • · ·· ····
GGGGGGGTGGGGGGGTGGGGGGGTGGG-(G7T)3G3 90
SEQ ID NO : 4- (27 basí)
GGGTGG-GG(GT)iGG 269
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 32, % uvolnění NuMA GT SEQ ID NO:25 o 6 basích bylo vyšší než % uvolnění NuMA GT SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4.
Příklad 26
Indukce apoptosy GT SEQ ID NO:o 6 basích a AC SEQ ID NO:79 o 6 basích
Lidské leukemické Jurkat T buňky byly inkubovány po 24 hodin s GT SEQ ID
NO:25 o 6 basích, s komplementární AC SEQ ID NO:79 o 6 basích a GT SEQ ID NO;25 + AC SEQ ID NO:79 o 6+ basích. GT SEQ ID NO:25 a AC SEQ ID NO:79 byly hybridizovány smísením sekvencí v poměru 1:1a zahřátím směsi na 65 °C po 10 minut.
Jako kontroly byly na 10 minut na 65 °C zahřátý GT SEQ ID NO:25 a AC SEQ ED NO:79 (tabulka 33). Apoptosa byla vyhodnocena jako v příkladu 23.
Tabulka 33
Indukce apoptosy v lidských leukemických Jurkat T buňkách % apoptotických buněk % uvolněných NuMA (positivní na PS/A-V barvení) (neovlivněné versus ovlivněné)
Neovlivněné buňky 4
GG(GT)!GG 27
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
CC(AC)!CC 6
SEQ ID NO : 79- (6 basí)
GT(GT)iGT + CC(AC),CC 5
SEQ ID NO : 25- (6 basí) + SEQ ID
NO : 79- (6 basí)
Jak je uvedeno v tabulce 33, GT SEQ ID NO:25 o 6 basích indukovaly apoptosu Jurkat T buněk, zatímco komplementární AC SEQ ID NO:79 neměly žádný vliv na apoptosu. Hybridizace GT SEQ ID NO:25 a AC SEQ ED NO:79 kromě toho neutralizovala indukci * ·
• · · · · · apoptosy, vyvolanou GT SEQ ED NO:25. Tyto údaje dokazují, že aby byla daná sekvence účinná, musí být jedno vláknová.
Příklad 27
Inhibice proliferace, zastavení buněčného cyklu a indukce apoptosy sekvencemi odvozenými od Mycobacterium phlei, které obsahují mnoho GT a AC
Lidské leukemické Jurkat T buňky byly inkubovány se sekvencemi odvozenými od murA genu z. Mycobacterium phlei, které obsahují mnoho GT a AC (GenBank: přístupové číslo X997776). Inhibice proliferace byla měřena podle redukce MTT jako v příkladu 3, zastavení buněčného cyklu bylo stanoveno průtokovou cytometrií, při použití propidium jodidu jako v příkladu 21 a apoptosa byla vyhodnocena průtokovou cytometrií, použitím Annexin-VFITC, jako v příkladu 23.
Tabulka 34
Inhibice proliferace, zastavení buněčného cyklu a indukce apoptosy v Jurkat buňkách
| Sekvence | % inhibice (proliferace) | % buněk v apoptose | zastavení buněčného cyklu |
| AACCACAAGCCCAAC SEQ ID NO : 67- (15 basí) | 0 | 4 | žádný |
| GTGTGTTTGGT SEQ ID NO : 81-(11 basí | 22 | 23 | Go/Gi |
| GGTTTTGTTTG SEQ ID NO : 82-(11 basí) | 20 | 25 | konec SE |
| TTGTTTTTTTTG SEQ ID NO : 83-(11 basí) | 21 | 16 | SM |
Jak je uvedeno v tabulce 34, sekvence SEQ ID NO:81, 82 a 83, obsahující mnoho GT, indukovaly proliferaci, indukci zastavení buněčného cyklu a současně indukovaly apoptosu u Jurkat T buněk, zatímco SEQ ID NO. 15, obsahující mnoho AC, neinhibovala proliferaci a zastavení buněčného cyklu, ani neindukovala apoptosu u Jurkat T buněk.
Příklad 28
Modulace caspasové aktivity GT sekvencemi
Caspasy rozpoznávají 3 hlavní peptidové substrátové sekvence: 1) Tyr-Val-Ala-Asp (YVAD, caspasa-1,-4 a -5) (SEQ ID NO : 84); 2) Asp-Glu-Val-Asp (DEVD, caspasa-2,-3 a-7) (SEQ ID NO : 85) a 3) Ile- (Leu)-Glu-X-Asp (I (L) EXD ; caspasa-8 a-10) (SEQ ID NO : 86) (Thornberry et al. J.Biol. Chem. 272 : 17907, 1997). Rozpoznání sekvence v cílovém proteinu má za výsledek omezenou a specifickou proteolysu cíle a, jako v prvním příkladu, modulaci aktivace caspasy 7 caspasou 3 nebo, jako ve druhém příkladu, degradaci strukturních cílových proteinů, zahrnující, ale bez omezení, na lamina nebo, jako ve třetím příkladu, aktivaci enzymů, včetně, ale bez omezení, PARP.
Sekvenční konstrukty NH2-XXXD-COO-GT jsou tvořeny chemickou konjugací chemicky chráněné GT sekvence nebo chemicky chráněné AC sekvence s chemicky chráněným peptidem, vybraným ze skupiny, sestávající z NH2-YVAD-COOH (SEQ ID NO : 84), NH2-DEVD-COOH (SEQ ID NO : 85) a NH2-IEGD-COOH (SEQ ID NO : 87) pomocí nukleotidů, syntetizovaných s 5'-C2 amidickým můstkem a standardní amíd-karboxylovou konjugační technikou ve vodě rozpustných carboheximidů (Guy et al. J. Chromatography. B. Biomed. Sci. Appl. 706 : 149, 1998). Reaktivní karboxylátová a reaktivní aminoskupina jsou po konjugaci zbaveny chránících skupin.
GT peptidové (dále jen PGT) sekvenční konstrukty včetně, ale bez omezení, NH2-YVAD-COO-GT; NH2-DEVD-COO-GT; NH2-I(L)EXD)-COO-GT a NH2-I(L)EXD)COO-GT, jsou štěpeny na karboxylové skupině mezi D a GT sekvencí enzymy, včetně, ale bez omezení, caspasami, enzymy spojenými s rakovinnými metastásami, kolagenasami a metaloproteinasami. Toto štěpení má za výsledek uvolnění GT sekvencí aktivujících caspasu z PGT. Výsledné zvýšení intracelulární caspasové aktivity může, například, zesílit terapeutický účinek chemoterapeutických činidel na rakovinné buňky, resistentní vůči více léčivům nebo zesílit imunitní odpověď vůči slabým antigenním podnětům.
Pro určení caspasové aktivity byly kontroly a ovlivněné buňky promyty, fixovány, permeabilizovány a inkubovány s FITC-konjugovanou protilátkou, která rozpozná aktivní formu caspasy (Pharmingen, San Diego, CA), podle protokolu doporučeného výrobcem. Fluorescence spojená s aktivní caspasou 3 se analyzuje průtokovou cytometrií na FACSCALIBUR, použitím programu CellQUEST (Becton Dickinson). Jiným způsobem je caspasová aktivita určena kolorimetricky, použitím testu, založeného na štěpení caspasových specifických proteinů, konjugovaných s barevnou signální molekulou p-nitroanilidu, který může být stanoven kvantitativně spektrofotometru při 450 nm.
• »
·♦ · • · · • · · · • · · · · * • · · ·· ·
Příklad 29
Aktivace caspasy 3 sekvencemi GT SEQ ID NO:66, 81, 81 a 83 a AGC sekvencí SEQ ID NO:67
Leukemické Jurkat T buňky byly inkubovány po 72 h s GT SEQ ID NO:66 o 33 basích; SEQ ID NO:81 o 11 basích (base 1 až 11 od GT SEQ ID NO:66), GT SEQ ID NO:82 o 11 basích (base 12 až 22 od GT SEQ ID NO:66)), GT SEQ ID NO:83 (base 2, až 33 od GT SEQ ID NO:66 a ACG SEQ ID NO:67 o 11 basích. Aktivní caspasa 3 (17 až 22 kDa) byla stanovena pomocí TITC-konjugované protilátky (klon: C92-605) jako v příkladu 28.
Jak je uvedeno na obrázku 2A, GT SEQ ID NO:66 o 33 basích a GT SEQ ID NO:81, 82 a 83 o 11 basích indukovaly konversi inaktivní pro-caspasy 3 na aktivní caspasu 3, zatímco ACG SEQ ID NO:67 o 15 basích neindukovaly přeměnu neaktivní pro-caspasy 3 na aktivní caspasu 3.
Aktivace caspasy 3 byla také určena kolorimetricky jako v příkladu 28. Jak je uvedeno na obrázku 2B, aktivita caspasy 3 v buňkách ovlivněných sekvencemi GT SEQ ID NO:66 o 33 basích a GT SEQ ID NO:81, 82 a 83 o 11 basích byla o 105 %, 77 %, 100 % a 60 % vyšší než v kontrolních buňkách, zatímco v buňkách ovlivněných sekvencí ACG SEQ ID NO:67 o 15 basích, byla aktivita caspasy 3 přibližně stejná jako v kontrolních buňkách.
Příklad 30
Aktivace aktivity caspasy 3 sekvencí GT SEQ ID NO:25 o 6 basích
Jurkat T leukemické buňky byly inkubovány po 72 h se sekvencí GT SEQ ID NO:25. Aktivace caspasy 3 byla určena kolorimetricky jako v příkladu 28. Tak jak je uvedeno na obrázku 3 A, byla aktivace caspasy 3 v buňkách, ovlivněných sekvencí SEQ ID NO:25 o 323 % vyšší než v kontrolních buňkách.
Příklad 31
Aktivace caspasy-7 a štěpení PARP sekvencí GT SEQ ID NO:25
Jurkat T leukemické buňky byly inkubovány 72 hodin se sekvencí SEQ ID NO:25 o basích. Buňky byly promyty 3x s PBS, lyžovány s 10 mM HEPES pH 7,5, obsahujícím 5 mM MgCb, 1 mM dithiotreitolu, 1,5 nM aprotininu, 10 mM leupeptinu a 2,5 μΜ vanadičnanu sodného a byl stanoven obsah proteinu v lysátu (Bradford J. Anal. Biochem. 72:248, 1976).
Aktivovaná caspasa 7 a štěpení PARP bylo stanoveno Western blottovou analysou. Lysát byl smísen s Laemmliho pufrem (Laemmli U. Nátuře 15:680, 1970), promísen a zahříván
9 ♦ • ·♦·· 4 · ···*
4
na 100 °C po 4 minuty. Padesát pg proteinu bylo přidáno do každé vzorkové kapsy a proteiny byly separovány elektroforesou v 10% (caspasa) nebo v 17% (PARP) polyakrylamidovém gelu, obsahujícím dodecylsulfát sodný (SDS-PAGE) při konstantním napětí 100 V po 1,5 hodiny. Separované proteiny byly elektroblotovány na PVDF membráně. Rozdělení proteinu bylo sledováno barvením membrány Ponceau červení.
Membrána byla blokována přes noc při 4 °C pufrem obsahujícím 1 % íysiologického roztoku, pufrovaného Trisem (2 mM Tris-HCl, 13,7 mM NaCl, pH 7,6 a 0,1 % monolaurátu polylethylensorbitanu (Tween 20) (TBST) + 5 % odtučněného sušeného mléka. Membrána byla promyta a inkubována po 1 hod při teplotě místnosti s myší monoklonální IgG anti-caspasa 7 protilátkou (Pharmingen) (ředění 1:1 000 v TBST + 1 % BSA) nebo s myší monoklonální IgG anti) PARP protilátkou (ředěnou 1:1 000 v TBST +1 % BSA) (Pharmingen). IgG vázaný na caspasu 3 nebo na PARP byl detekován s ovčím anti-myší IgG, konjugovanou s křenovou peroxidasou (ředěným 1:1 000 v TBST+5 % odtučněného sušeného mléka) (Pharmingen). Bloty byly vyvinuty detekčním systémem se zesílenou chemiluminiscencí (ECL, Amersham, Corp., Amersham, UK).
Jak je uvedeno na obrázku 3B, GT SEQ ID NO:25 o 6 basích indukovala přeměnu inaktivní pro-caspasy 7 (30 kDa) na aktivní caspasu 7 (19-20 kDa) a aktivní PARP na jeho inaktivní 85 kDa degradační produkt.
Příklad 32
Zesílení aktivace caspasy positivní zpětnou vazbou
Lidské Jurkat leukemické T buňky byly inkubovány po 72 h s NH2-YVAD-CO-GG (GT) GG, NH2-DEVD-CO-GG(GT)GG, NH2-IEGD-COO-GG(GT)GG, nh2-yvad-coAACCACAAGCCCAAC, NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC a NH2-IEGD-COAACCACAAGCCCAAC. Byla stanovena aktivace caspasy 3 a caspasy 7.
NH2-YVAD-CO-GT, NH2-DEVD-CO-GT a NH2-IEGD-COO-GT indukují přeměnu inaktivní caspasy 3 na aktivní caspasu 3 a inaktivní caspasy 7 na aktivní caspasu 7, zatímco NH2-YVAD-CO-ACG, NH2DVED-CO-ACG a NH2IEGDCO-ACG neindukují přeměnu inaktivní caspasy 3 na aktivní caspasu 3 nebo inaktivní caspasy 7 na aktivní caspasu 7.
I když následující hypothesa není zcela doložena, předpokládá se, že basální caspasová aktivita v buňkách, obsahujících caspasu, zprostředkuje proteolyticko-hydrolytické uvolnění GT sekvencí, aktivujících caspasu, z NH2XXXD-COO-GT konstruktů. Důsledkem toho je positivní zesílení caspasové aktivity (zvýšených hladin caspasy 3 a caspasy 7) v buňkách, uvolněním GT sekvencí, aktivujících caspasu.
• · • · * • ••fcfc • ·
fcfc ·♦··
Příklad 32
Indukce produkce cytokinů
Pokud není stanoveno jinak, bylo 1 x 106 buněk inkubováno s 100 pg/ml jednotlivých testovaných sekvencí po 48 h při 37 °C v 5% CO2. Produkce cytokinů IL-6, IL-10, IL-12, IL-1 beta a TNF-alfa byla stanovena v pg/ml ve 100 pl supernatantech kultur, použitím vhodné komerčně dostupné ELISA (BioSource, Camarillo, CA). IL-12 ELISA měří jak IL-12 p70 komplex, tak i volnou p40 podjednotku. Výsledky jsou vyjádřeny jako „násobky“ (x) zvýšení produkce cytokinů v ovlivněných buňkách ve srovnání s kontrolními buňkami.
THP-1 lidské monocytické buňky akutní leukemie byly inkubovány s GT sekvencemi o 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 a 18 basích a byla stanovena produkce cytokinů IL-6 (tabulka 35).
Tabulka 35
Produkce cytokinů v THP lidských monocytických buňkách akutní leukemie
Sekvence zvýšení IL-6
TG-(TG)iXT SEQ ID NO : 7- (3 base) 2,7 x
TG-(TG)i SEQ ID NO : 51- (2 base) 2,9 x
TGTGTG-(TG)3 SEQ ID NO : 9- (6 basí) 4,0 x
GTGTGT-(GT)3 SEQ ID NO : 10- (6 basí) 5,0 x
TGTGTGTG-(TG)4T SEQ ID NO : 11- (9 basí) 5,4 x
GTGTGTGTG-(GT)4G SEQ ID NO : 12- (9 basí) 5,4 x
TGTGTGTGTGT-(TG)6 SEQ ID NO : 13- (12 basí) 5,7 x
GTGTGTGTGTGT-(GT)6 SEQ ID NO : 14- (12 basí) 1,3 x
TGTGTGTGTGTGT-(TG)7 SEQ DNA :15-(14 basí) 1,0 x
GTGTGTGTGTGTGTG-(GT)7G SEQ ID NO : 16- (15 basí) 2,6 x
TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)9 SEQ ID NO : 17- (18 basí) 2,2 x
GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)9 SEQ ID NO : 18- (18 basí) 2,8 x
Jak je uvedeno v tabulce 35, GT sekvence o 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 a 18 basích zvyšovaly produkci cytokinů IL-6 v buňkách THP-1.
Lidské monocytické buňky akutní leukemie byly inkubovány s GT, AG, CG, GG, AGT a CGT sekvencemi o 6 basích a byla stanovena produkce cytokinů IL-12 a IL-6 (tabulka 36).
»··· ·· ·* r · 0 « *
0 0·
Tabulka 36
Produkce cytokinů THP-1 lidskými monocytickými buňkami akutní leukemie
SEKVENCE
TGTGTG-(TG)3 SEQ ID NO : 9 GTGTGT-(GT)3 SEQ ID NO: 10 TTTGTT-TT TG,TT SEQ ID NO : 23 GGTGGG-GG TG)iGG SEQ ID NO : 24 GGGTGG-GG(GT)iGG SEQ ID NO : 25 TTGTTT-TT(GT)iTT SEQ ID NO : 26 AAGTAA-AA (GT)jAA SEQ ID NO : 27 CCGTCC-CC(GT)!CC SE ID NO : 28 TGGTTG-TGGTJG SEQ ID NO : 29 ATGTAT-AT(GT)iAT SEQ ID NO : 30 AGGTGA-AG GTjGA SEQ ID NO : 31 GAGTGA-GA GT)iGA SEQ ID NO : 32 GGGTCT-GG GT)iCT SEQ ID NO : 33 CCGTGG-CC(GT),GG SE ID NO : 34 GGGTCC-GG GTiCC SEQ ID NO:35 CTGTCT-CT (GT)iCT SEQ ID NO : 36 TCGTTC-TC(GT)]TC SEQ ID NO : 37 CGGTGC-CG(GT)iGC SEQ ID NO : 38 TTGTG-TT(GT)iGG SEQ ID NO : 39 GGGTT-GG(GT)iTT SEQ ID NO : 40 GGTTGG-GG(TT)iGG SEQ ID NO : 41 GGAAG-GGCAAjjG SEQ ID NO : 42 GGCCGG-GG(CC)GG SEQ ED NO:43 GGGGGG-GG(GG)iGG SEQ ID NO : 44 GGGAGG-GG(GA)iGG SEQ ID NO: 45 GGGCGG-GG(GC)iGG SEQ ID NO : 46 TTAGGG-TT(AG)iGG SEQ ID NO : 49
| zvýšení IL-12 | zvýšení IL- |
| I,8x | 4,0x |
| 2,2x | 5,0x |
| 3,5x | 4,9x |
| 3,7x | 6,9x |
| 2,3x | 3,lx |
| 3,5x | 5,3x |
| 6,0x | 12,8x |
| 3,8x | 12,6x |
| 4,lx | 10,5x |
| 4,8x | 9,8x |
| l,9x | 4,9x |
| l,8x | 5,8x |
| l,2x | 3,lx |
| O,Ox | 10,8x |
| l,9x | 21,3x |
| 2,Ox | 15,9x |
| 2,2x | 12,9x |
| 0,2x | 6,9x |
| O,Ox | 6,6x |
| -l,2x | 14,Ox |
| 3,3x | 16,0x |
| 4,lx | 29,2x |
| 3,lx | 17,lx |
| 0,0x | 15,lx |
| -l,6x | 23,2x |
| 2,3x | 9,8x |
| 2,0x | 6,7x |
'* ·>*
I · · 1 • Β ·*··
Jak je uvedeno v tabulce 36, GT, AG, CG, AGT a CGT sekvence o 6 basích zvyšují produkci cytokinů IL-12 a IL-6 v THP-1 buňkách.
Tabulka 37 sumarizuje indukci IL-12 a IL-6 syntézu sekvencemi o 6 basích.
| Tabulka 37 Syntéza IL-6 a IL-12 indukovaná sekvencemi o 6 basích | ||
| Násobné zvýšení | IL-12 syntéza | IL-6 syntéza |
| SEQ ID NO: | SEQ ID NO: | |
| < nebo = 2,0 | 9, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 44, 45, 49 | |
| > 2,0 a < nebo =10,0 | 10, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, | 9, 10, 23,24, 25, 26, 30,31, |
| 30,37, 40,41,42, 43,44, 45 | 32, 33, 38, 39, 46, 49 | |
| >10, | 25, 27, 29, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 45 |
U BCG odvozených sekvencí A-3 (SEQ ID NO:73), A-4 (SEQ ID NO:74), A-6 (SEQ ID NO:75), A-7 (SEQ ID NO:76, M3 (SEQ ID NO:77) a alfa 1 (SEQ ID NO:78) bylo zjištěno, že aktivují NK buňky in vivo (Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992). Byly inkubovány lidské buňky akutní monocytické leukemie s BCG odvozenými sekvencemi o 45 basích a byla stanovena produkce cytokinů IL-12 a IL-6 (tabulka 38).
Tabulka 38
Produkce cytokinů lidskými THP-1 buňkami akutní monocytické leukemie
Sekvence IL-12
BCG A-l
AAAGAGGGGCATGACCCGGTGC 1,9 x
GGGGCTTCTTGCACTCGGCATAG SEQ ID NO : 69- (45 basí)
BCG A-2
AAAAGAAGTGGGGTGCCCCCAC GATCACCAACGATGGTGTGTCCA
IL-6
2,6 x
1,6 x
3,9 x
tt* * • · · • » · » • « « · · « • · · ·· · ·* · ·« *» • « · * • · · • · · • · · ·· **··
| SEQ ID NO : 70- (45 basí) | ||
| BCG A-3 | ||
| TCCATCGCCAAGGAGATCGAGC TGGAGGATCCGTACGAGAAGATC SEQ ID NO : 71- (45 basí) BCG A-4 | 1,7 x | 2,5 x |
| ACCGATGACGTCGCCGGTGACG GCAACACGACGGCCACCGTGCTG SEQ ID NO : 72- (45 basí) BCG A-6 | 0,9 x | 1,8 x |
| ACGAGACCACCATCGTCGAGGG CGCCGGTGACACCGACGCCATCG SEQ ID NO : 73- (45 basí) BCG A-7 | 2,1 x | 3,9 x |
| GCCGAGAAGGTGCGCAACCTGC CGGCTGGCCACGGACTGAACGCT SEQ ID NO : 74- (45 basí) BCGM-3 | 0,5 x | nestanoveno |
| ACGCCGACGTCGTCTGTGGTGG GGTGTCTACCGCCAACGCGACGG SEQ ID NO : 75- (45 basí) BCG ALPHA-1 | 1,6 x | 2,8 x |
| CGACTACAACGGCTGGGATATC AACACCCCGGCGTTCGAGTGGTA SEQ ID NO : 76- (45 basí) | 1,1 x | 2,1 x |
Jak je uvedeno v tabulce 38, sekvence odvozené od BCG o 45 basích zvyšují minimálně produkci IL-12 a IL-6 v buňkách THP-1.
Příklad 34
Indukce produkce IL-12 fosfodiesterovými a fosfothioátovými sekvencemi
Lidské THP-1 buňky akutní monocytické leukemie byly inkubovány s GT sekvencemi o 6 basích, které měly buď kyslíkový atom (fosfodiester) nebo atom síry *· ··»£ ·« *
« «
Λ * • 9
9*9 • ···» • » • · « · • 0 ·· » · · · * · ty * · ty t· ··*· (fosfothioát) jako nemůstkový atom ve fosfátových skupinách a byla stanovena produkce cytokinu IL-12 (tabulka 39).
Tabulka 39
Produkce IL-12 lidskými THP-1 buňkami akutní monocytické leukemie
| Sekvence | zvýšení fosfodiester | fosfothioát |
| TGTGTG-(TG)3 (6 basí) SEQ ID NO : 9 fosfodiester; fosfothioát | l,8x | -0,lx |
| GTGTGT-(GT)3 (6 basí) SEQ ID NO : 10 fosfodiester; fosfothioát | 2,2x | -0,2x |
| TTTGT-TT (TG)iTT (6 basí) SEQ ID NO : 23 fosfodiester; fosfothioát | 3,5x | O,lx |
| GGTGGG-GG(TG)iGG (6 basí) SEQ ID NO : 24 fosfodiester; fosfothioát | 3,7x | -O,lx |
| GGGTGG-GG(GT)!GG (6 basí) SEQ ID NO : 25 fosfodiester; fosfothioát | 2,Ox | O,Ox |
| TTGTTT-TT(GT)iTT (6 basí) SEQ ID NO : 26 fosfodiester ; fosfothioát | 3,8x | O,lx |
Jak je uvedeno v tabulce 39, měla substituce atomu síry (fosfothioát) za nemůstkový atom kyslíku (fosfodiester) ve fosfátové skupině za důsledek průkazné snížení produkce IL-12 v THP-1 buňkách.
Lidské THP-1 buňky akutní monocytické leukemie byly inkubovány s GT sekvencí SEQ ID NO:25 o 6 basích, která měla jako nemůstkový atom ve fosfátové skupině buď kyslík (fosfodiester) nebo síru (fosfothioát) a byla stanovena produkce cytokinu IL-12 (tabulka 40).
Tabulka 40
Produkce IL-12 lidskými THP-1 buňkami akutní monocytické leukemie
Sekvence zvýšení ·· · • ·
GoGoGoToGoGo-GoGo(GoTo)iGoGo; (kyslíkový atonrbase 1 až 6) 2,0x
SEQ ID NO : 25-(6 basí)
G0G0GJ0G0G0-G0G0 (GsTo)iGoGo ;(kyslíkový atom:base 1,2,4,5,6; 0,lx atom síry base 3)
GoGoGoToGoGo-GoGo(GoTo)iGoGo; (kyslíkový atom:base 1,2,3,5,6; 0,2x
Atom síry base 4)
SEQ ID NO : 25-(6 basí)
GoGoGJoGoGo-GoGo(GsTs)iGoGo ; (kyslíkový atom:base 1,2,5,6; 0,5x atom síry base 3,4) (SEQ ID NO:25-(6 basí)
GoGoGoTSGoGo-GoGo(GoTs)iGoGo ; (kyslíkový atom:base 2,3,4,5; -0, lx atom síry: base 1,6)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GoGoGsT5GoGo-GoGo (GoTo)iGoGo ; (kyslíkový atom:base 1,3,4,6; -0,lx atom síry: poloha 2,5)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GsGsGoToGsGs-GsGo(GoTo)iGoGs; (kyslíkový atom: polohy 3,4; 0,0x atom síry: poloha 1,2,5,6 SEQ ID NO : 25- (6 basí)
GsGsGsTsGsGs-GsGs(GsTs)iGsGs; (atom síry: poloha 1 až 6) 0,0x atom síry: poloha 2, 5)
SEQ ID NO : 25- (6 basí)
G, G, GoToG, Gs-G, Gs (GoTo) tGsG,; ( atom síry: polohy 1 až 6) 0,0x
SEQ ID NO : 25- (6 basí) *Poznámka: „o“ představuje atom kyslíku a „s“ představuje atom síry ve fosfátové skupině.
Jak je uvedeno v tabulce 40, substituce atomu síry (fosfothioát) za nemůstkový atom kyslíku (fosfodiester) v GT SEQ ID NO:25 měla za výsledek průkazné snížení produkce IL-12 v buňkách THP-1.
• · • ·
Příklad 35
Stimulace syntézy cytokinů v lidských jednojaderných periferních krevních buňkách
Periferní jednojaderné krevní buňky (dále jen „PBMC“) byly isolovány ze sedmi zdravých lidských jedinců pomocí Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Baie ďUrfée, Québec, Canada) z celé krve centriíugací v gradientu hustoty. PBCMS byly inkubovány se GT, AGT, CGT, AG, CG a GG sekvencemi o 6 basích a byla stanovena produkce cytokinů IL-1 beta, IL-6, IL-10 a IL-12.
Tabulka 41
Produkce cytokinu lidskými PBMC
Sekvence
IL-1 beta IL-6 IL-10 IL-12 násobné zvýšení násobné zvýšení násobné zvýšení násobné zvýšení průměr ± SD (rozsah) průměr ± SD (rozsah) průměr ± SD (rozsah) průměr ± SD (rozsah)
| TG(TG)iTG | 1,2 +/-0,4 | 8,3 +/-12,8 | 1,0+/-0,1 | 2,7 +/-2,6 |
| SEQ ID NO : 9- (6 basí) | (0,8-1,5) | (1,2-37,0) | (0,9-1,1) | (1,0-6,6) |
| GT(GT)1GT | 2,0+/-1,6 | 9,8 +/-14,2 | 1,0+/-0,1 | 4,0 +/-6,3 |
| SEQ ID NO : 10- (6 basí) | (0,9-3,8) | (0,8-39,1) | (0,9-1,1) | (0,9-18,1) |
| TG(TG)4TG | 2,4+/-1,9 | 12,1+/-6,5 | 1,2+/-0,4 | 4,4+/-5,3 |
| SEQ ID NO : 13-(12 basí) | (0,9-4,5) | (2,9-20,8) | (0,9-1,9) | (1,2-15,0) |
| GT(GT)4GT | 1,1+/-0,2 | 2,0+/-1,5 | 1,0+/-0,1 | 2,0+/-1,1 |
| SEQ ID NO : 14-(12 basí) | (0,9-1,3) | (0,9-4,9) | (0,9-1,2) | (0,9-2,6) |
| TT(TG)iTT | 1,0+/-0,1 | 11,8+/-9,0 | 1,0+/-0,1 | 1,1+/-0,3 |
| SEQ ID NO : 23- (6 basí) | (0,9-1,0) | (1,3-25,6) | (0,9-1,1) | (0,9-1,6) |
| GG(TG)iGG | 0,9+/-0,1 | 15,9+/-14,9 | 2,4 +/-2,9 | 2,3 +/-1,6 |
| SEQ ID NO. 24 (6 basí) | (0,9-1,0) | (0,7-37,1) | (1,0-7,5) | (0,9-5,5) |
| GG(GT),GG | 1,0+/-0,1 | 20,9+/-18,0 | 11,6+/-1,2 | 13,2+/-11,5 |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | (1,0-1,2) | (1,6-50,0) | (9,9-13,2) | (1,0-26,8) |
| TT(GT)]TT | 1,5 +/- 0,9 | 5,8 +/- 8,0 | 1,0+/- 0,1 | 1,6+/-1,3 |
| SEQ ID NO : 26- (6 basí) | (0,9-2,5) | (0,5-21,7) | (1,0-1,2) | (0,8-4,5) |
• ·
| AA(GT),AA | 1,+/-0,5 | 9, +/- 7,3 | 1,0+/-0,1 | 2,4 +/- 2, 2 |
| SEQ ID NO : 27- (6 basí) | (0,9-1,8) | (1,8-16,0) | (0,9-1,1) | (0, 8-6, 7) |
| CC(GT),CC | 2,1 +/-1,8 | 10,4 +/-13,0 | 1,0+/-0,1 | 5,9+/-10,7 |
| SEQ ID NO : 28-(6 basí) | (0,8-4,1) | (1,4-35,8) | (1,0-1,1) | (0,9-30,0) |
| TG(GT), G | 1,7+/-1,0 | 9,3+/-12,1 | 1,0+/-0,1 | 3,3+/-4,2 |
| SEQ ID NO : 29- (6 basí) | (1,1-2,8) | (0,8-33,8) | (1,0-1,1) | (0,8-12,7) |
| AT(GT)iAT | 1,1 +/-0,2 | 4,6 +/- 4,4 | 1,0+/-0,1 | 1,3 +/- 0,2 |
| SEQ ID NO : 30- (6 basí) | (1,0-1,4) | (1,6-14,4) | (0,9-1,1) | (1,0-1,6) |
| CT(GT),CT | 1,2+/-0,3 | 5,3 +/-3,6 | 1,0+/-0,1 | 1,2+/-0, 3 |
| SEQ ID NO : 36- (6 basí) | (1,0-1,5) | (0,9-10,6) | (0,9-1,2) | (0,9-1,8) |
| TC(GT)iTC | 1,2+/-0,4 | 7,5+/-9,8 | 1,0+/-0,1 | 1,4+/-1,1 |
| SEQ ID NO : 37- (6 basí) | (0,9-1,6) | (0,7-27,0) | (1,0-1,1) | (0,9-3,8) |
| GG(TT)iGG | 3,2 +/- 3,0 | 7,8 +/- 12,8 | 1,0+/- 0,1 | 4,9 +/- 8,6 |
| SEQ ID NO : 41- (6 basí) | (0,8-6,5) | (0,9-36,4) | (0,9-1,1) | (0,8-24,3) |
| GG(AA)iGG | 3,5 +/- 3,9 | 11,8+/-5,8 | 1,1 +/-0,2 | 3,0 +/- 2,7 |
| SEQ ID NO : 42- (6 basí) | (0,8-8,0) | (1,2-15,6) | (0,9-1,5) | (1,1-8,6) |
| GG(CC)iGG | 1,5+/-0,9 | 14,9+/-10,2 | 1,2+/-0,3 | 2,5 +/-2,0 |
| SEQ ID NO : 43- (6 basí) | (0,8-2,5) | (1,2-29,8) | (1,0-1,8) | (1,0-7,0) |
| GG(GG),GG | 7,1 +/-9,4 | 21,0+/-14,7 | 1,7+/-1,6 | 7,0+/-12,5 |
| SEQ ID NO : 44- (6 basí) | (0,8-17,9) | (4,6-42,0) | (0,9-4,6) | (1,3-35,3) |
| GG(GA)iGGG | 13,6+/-14,9 | 24,7+/-16,5 | 6,0 +/-5,5 | 20,7+/-10,3 |
| SEQ ID NO : 45-.(6 basí) | (1,2-30,2) | (5,9-50,0) | (2,1-15,5) | (5,7-35,3) |
| GG(GC),GG | 1,2 +/-0,3 | 15,8+/-16,2 | 1,0+/-0,1 | 3,0 +/-3,8 |
| SEQ ID NO : 46- (6 basí) | (1,0-1,5) | (1,3-37,8) | (0,9-1,1) | (1,1-10,7) |
Jak je uvedeno v tabulce 41, sekvence GT, AGT, CGT, AG, CG a GG o 6 basích zvyšují produkci cytokinů IL-1 beta, IL-6, IL-10 a IL-12 v lidských PBMC buňkách.
Příklad 36
Syntéza cytokinů v jednojaderných periferních krevních buňkách šimpanze
PBMC byly isolovány ze 4 zdravých šimpanzích jedinců jako v příkladu 35. Šimpanzí buňky PBMC byly inkubovány se GT, AGT, CGT, AG, CG a GG sekvencemi o 6 basích a byla stanovena produkce cytokinů IL-10, IL-12 a TNF-alfa (tabulka 41).
• 9
9999
Tabulka 41
Produkce cytokinů šimpanzími PBMC
| Sekvence | IL-10 násobné zvýšení | IL-12 násobné zvýšení | TNF-alfa násobné |
| zvýšení | |||
| průměr ± SD | průměr ± SD | průměr ± SD | |
| (rozsah) | (rozsah) | (rozsah) | |
| TG(TG),TG | 2,3 +/- 1,3 | 13,5 +/- 8,9 | 11,3+/- 6,9 |
| SEQ ID NO : 9- (6 basí) | (1,3-4,1) | (2,8-21,1) | (5,3-19,5) |
| GT(GT),GT | 4,0+/-2,1 | 14,0+/-8, | 12,9+/-6,4 |
| SEQ ID NO : 1- (6 basí) | (1,8-6,7) | (3,0-21,3) | (6,5-19,6) |
| TT(TG)iTT | 1,0+/- 0,6 | 12,9+/- 8,2 | 9,0 +/- 5,5 |
| SEQ ID NO : 23- (6 basí) | (1,0-2,4) | (2,7-20,1) | (4,1-14,4) |
| GG (TG)iGG | 2,9 +/- 1,5 | 14,3+/-9,1 | 11,9+/-7,0 |
| SEQ ID NO : 24- (6 basí) | (1,3-4,8) | (3,0-22,5) | (5,8-19,8) |
| GG(GT)iGG | 2,5+/-1,5 | 13,5+/-8,4 | 11,7+/-6,7 |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | (1,4-4,6) | (2,8-20,8) | (5,9-19,6) |
| TT(GT)iTT | 1,4+/-0,9 | 12,3+/-8,5 | 7,5+/-4,6 |
| SEQ ID NO : 26- (6 basí) | (1,1-2,1) | (2,5-20,1) | (3,4-13,1) |
| AA(GT)iAA | 2,1+/-1,1 | 13,2+/-8,2 | 7,9+/-3,9 |
| SEQ ID NO : 27 (6 basí) | (1,1-3,7) | (2,8-19,8) | (4,6-12,0) |
| CC(GT)iCC | 3,8 +/- 2,8 | 13,3 +/- 8,4 | 10,3 +/-5,7 |
| SEQ ID NO : 28- (6 basí) | (1,5-7,7) | (2,8-20, 4) | (5,0-15, 8) |
| TG(GT)jTG | 3,1+/-2,0 | 13,6+/-8,8 | 12,4+/-7,3 |
| SEQ ID NO : 29- (6 basí) | (1,6-5,9) | (2,9-21,9) | (6,1-20,8) |
| AT(GT)jAT | 1,4+/-0,4 | 10,7+/-7,0 | 5,9+/-3,3 |
| SEQ ID NO : 30- (6 basí) | (1,2-1,9) | (2,5-18,6) | (3,4-10,5) |
| CT(GT),CT | 3,0+/-2,1 | 13,4+/-8,9 | 12,4 +/-6,3 |
| SEQ ID NO : 36-(6 basí) | (1,2-5,9) | (2,8-20,4) | (7,0-19,6) |
| TC(GT)iTC | 3,4 +/- 2,6 | 14,1 +/-10,0 | 11,4+/-6,4 |
| SEQ ID NO : 37- (6 basí) | (1,4-7,1) | (2,4-24,9) | (6,1-19,3) |
| GG(TT)iGG | 9,7 +/- 7,7 | 15, 3 +/-10,0 | 14, +/-7,3 |
| SEQ ID NO : 41 (6 basí) | (3,0-20,3) | (2,9-25,9) | (7,7 +/-23,2) |
• · · · •· · · · · • · . . · 0
| GG(AA),GG | 9,9+/-8,9 | 15,6+/-10,6 | 14,4+/-7,] |
| SEQ ID NO : 42- (6 basí) | (2,6-22,7) | (2,6-26,6) | (8,0-22,9) |
| GG(CC)!GGG | 13,6 +/-9,0 | 15,1 +/-10,2 | 14,0+/-6,6 |
| SEQ ID NO : 43- (6 basí) | (4,3-26,7) | (2,8-26,1) | (7,9-22,3) |
| GG(GG)iGGG | 11,2+/-9,1 | 15,1 +/-10,0 | 13,8 +/-6,5 |
| SEQ ID NO : 44- (6 basí) | (3,9-24,3) | (2,9-25,9) | (7,6-21,8) |
| GG(GA)iGG | 9,9+/-9,2 | 15,9+/-10,7 | 14,5 +/-6,9 |
| SEQ ID NO : 45- (6 basí) | (2,6-23,1) | (2,9-26,9) | (7,9-23,0) |
| GG(GC)iGG | 4,7 +/-3,4 | 15,8+/-10,4 | 14,1 +/-6,6 |
| SEQ ID NO : 46- (6 basí) | (1,7-9,3) | (3,0-26,2) | (8,3-21,7) |
Jak je uvedeno v tabulce 41, sekvence GT, AGT, CGT, AG, CG a GG o 6 basích zvyšují produkci cytokinů IL-10 a IL-12 a TNF-alfa v PBMC buňkách šimpanze.
Příklad 37
Syntéza cytokinu v jednoj aderných periferních krevních buňkách opice rhesus
PBMC byly isolovány ze 4 zdravých jedinců opice rhesus jako v příkladu 35. Buňky
PBMC byly inkubovány se sekvencemi GT, AGT, CGT, AG, CG a GG o 6 basích a byla měřena produkce cytokinů IL-62, IL-12 a TNF-alfa (tabulka 42).
Tabulka 42
Produkce cytokinu buňkami PBMC u opice rhesus
| Sekvence | IL-10 násobné zvýšení průměr ± SD (rozsah) | IL-12 násobné zvýšení průměr ± SD (rozsah) | TNF-alfa násobné zvýšení průměr ± SD (rozsah) | |
| TG(TG)iTG | 1,1 +/-0,2 | 10,6+/-4,2 | 14,3 +/-6,3 | |
| SEQ ID NO : | 9- (6 basí) | (0,9-1,3) | (5,6-14,3) | (6,2-21,2) |
| GT(GT),GT | 1,3 +/-0,1 | 10,7+/-4,1 | 16,1 +/-4,2 | |
| SEQ ID NO : | 10- (6 basí) | (1,1-1,4) | (6,1-15,8) | (11,0-21,6) |
| TT(TG)iTT | 1,0+/-0,1 | 6,7 +/-3,6 | 4,4 +/-3,8 | |
| SEQ ID NO : | 23- (6 basí) | (0,8-1,0) | (3,6-11,7) | (1,3-9,5) |
| GG(TG)iGG | 1,+/-0, | 11,2+/-4,8 | 14,5+/-5,4 |
• · • · • ··
| SEQ ID NO : 24- (6 basí) | (1,0-1,1) | (5,6-16,8) | (7,7-20,0) |
| GG(GT)iGG | 1,0+/-0,1 | 10,6+/-0,7 | 12,5+/-5, 2 |
| SEQ ID NO : 25- (6 basí) | (1,0-1,1) | (5,5-16,5) | (6,2-18,6) |
| TT(GT),TT | 1,0+/-0,1 | 4,9+/-2,9 | 2,1+/-1,0 |
| SEQ ID NO : 26- (6 basí) | (1,0-1,2) | (2,6-8,8) | (1,3-3,4) |
| AA(GT)]AA | 0,9+/-0,1 | 7,6 +/-2,6 | 6,0 +/-5,0 |
| SEQ ID NO : 27- (6 basí) | (0,9-1,0) | (5,9-11,5) | (2,4-13,4) |
| CC(GT)iCC | 1,1+/-0,2 | 10,1+/-3,7 | 14,2+/-3,7 |
| SEQ ID NO: 28- (6 basí) | (0,9-1,2) | (6,2-14,2) | (9,6-18,6) |
| TG(GT),TG | 1,1+/-0,2 | 11,1+/-4,2 | 16,5+/-2,7 |
| SEQ ID NO: 29-(6 basí) | (0,9-1,2) | (6,5-15,7) | (14,0-19,1) |
| AT(GT),AT | 1,9+/-1,4 | 6,0+/-1,9 | 6,9+/-4,7 |
| SEQ ID NO: 30- (6 basí) | (1,0-4,0) | (5,6-8,5) | (2,2-13,4) |
| CT(GT)iCT | 1,0+/-0,1 | 10,7+/-4,6 | 15,3+/-3, 6 |
| SEQ ID NO: 36- (6 basí) | (0,9-1,1) | (6,2-16,4) | (11,2-19,8) |
| TC(GT),TC | 1,1+/-0,2 | 10,0+/-3,8 | 14,7 +/-3,1 |
| SEQ ID NO : 37- (6 basí) | (0,9-1,3) | (6,3-14,1) | (13,7-19,1) |
| GG(TT)iGG | 1,9+/-1,5 | 11,5+/-5,9 | 14,1+/-8,2 |
| SEQ ID NO : 41- (6 basí) | (1,0-4,1) | (4,3-17,2) | (2,5-20,7) |
| GG(AA)iGG | 1,2+/-0,2 | 11,9+/-5,4 | 16,5+/-4, 5 |
| SEQ ID NO : 42- (6 basí) | (1,0-1,4) | (5,9-17,1) | (11,4-21,2) |
| GG(CC)!GG | 1,0+/-0,2 | 11,7+/-4,8 | 16,9+/-3,5 |
| SEQ ID NO : 43- (6 basí) | (0,8-1,2) | (6,2-16,4) | (13,9-21,1) |
| GG(GG)]GG | 2,1+/-1,0 | 10,7+/-5,6 | 13,9+/-8,5 |
| SEQ ID NO : 44- (6 basí) | (1,1-3,5) | (3,7-15,9) | (2,0-20,9) |
| GG(GA)iGG | 1,1+/-0,1 | 11,9+/-4,5 | 16,7+/-4,6 |
| SEQ ID NO : 45- (6 basí) | (1,0-1,3) | (6,8-16,0) | (11,6-21,5) |
| GG(GC)iGG · | 1,2 +/-0,2 | 11,0+/-4,4 | 16,8+/-4,1 |
| SEQ ID NO : 46- (6 basí) | (1,0-1,4) | (6,3-16,1) | (11,9-21,8) |
Jak je uvedeno v tabulce 42, sekvence GT, AGT, CGT, AG, CG a GG o 6 basích zvýšily produkci cytokinů IL-10, IL-12 a TNF-alfa v PBMC buňkách opice rhesus.
Příklad 38
Vliv GT SEQ ID NO: 25 o 6 basích, GT SEQ ID NO:25 + 5-fluorouracilu a GT SEQ ID NO:25 o 6 basích + tamoxifenu na MCF-7 lidské tumory plic
Buňky lidské MCF-7 rakoviny plic byly implantovány podkožně jako cizí štěpy do samiček BALB/c myší bez srsti. Myši byly rozděleny do 5 skupin po 10 myších. V den 0 obdržela skupina myší 1 fysiologický roztok, skupina myší 2 obdržela SEQ ID NO:8 o 3 basích, skupina myší 3 obdržela GT SEQ ID NO:25 o 6 basích, skupina myší 4 obdržela AG SEQ ID NO:45 o 6 basích a skupina 5 obdržela BCG A-3 SEQ ID NO:69 o 45 basích. Po 4 týdnech byly myši utraceny a byla vyhodnocena hmota tumoru. Skupina myší 1 měla největší hmotu tumoru, skupiny myší 2, 3 a 4 měly menší hmotu tumoru než skupina myší 1 a skupiny 5 a 6 měly menší hmotu tumoru než skupiny myší 1, 2, 3 a 4.
Příklad 39
Vliv GT sekvencí o 3 a 6 basích a BCG A-3 sekvence o 45 basích na lidské LNCaP tumory rakoviny prostaty
LNCaP buňky lidské rakoviny prostaty byla implantovány podkožně jako cizí štěpy do samečků bezsrstých myší nu/nu. Myši byly rozděleny do 5 skupin po 10 myších.
V den 0 obdržely myši skupiny 1 fysiologický roztok, skupina 2 obdržela SEQ ID NO:8 o 3 basích, skupina 3 obdržela SEQ ID NO:25 o 6 basích, skupina myší 4 obdržela BCG A-3 SEQ ID NO:69 o 45 basích. Po 4 týdnech působení byly myší utraceny a byla zjištěna hmotnost tumoru. Myši skupiny 1 měly nejvyšší hmotnost tumoru, skupina myší 5 měla menší hmotnost tumoru než skupina myší 1 a skupiny myší 2, 3 a 4 měly menší hmotnost tumoru než skupiny 1 a 5.
Příklad 41
Vliv sekvencí o 3, 6, 8 a 27 basích na myší EL-4 T lymfom
Buňky EL-4 myšího T lymfomu byly implantovány myším C57/BL6. Myši byly rozděleny do 6 skupin po 10 myších. V den 0 obdržela skupina myší 1 fysiologický roztok, skupina myší 2 obdržela GT SEQ ID NO:8 o 3 basích, skupina myší 3 obdržela SEQ ID NO:25 o 6 basích, skupina myší 4 obdržela AG SEQ ID NO:45 o 6 basích, skupina myší 5 obdržela GT SEQ ID NO: 18 o, 18 basích a skupina myší 6 obdržela GT SEQ ID NO: 1 o 27 basích. Po 4 týdnech působení byly myši utraceny a byla zjištěna hmotnost tumoru. Skupina myší 1 měla nejvyšší hmotnost tumoru, skupiny 2, 3, 4, 5 a 6 měly menší hmotnost tumoru než skupina myší
1.
·· • ♦ ♦ • · • · ··*· ·· ····
Příklad 42
Buněčné linie rakoviny lidského tlustého střeva byly udržovány jako adherentní buněčné kultury. Buňky ve fázi exponenciálního růstu byly ovlivněny sekvencemi GT, GA, GC nebo GG o 2 až 20 basích v rozsahu dávky 0 pg/ml až 100 pg/ml po 24 až 72 hodin. Inhibice proliferace buněk byla měřena pomocí MTT redukce, zastavení buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie a apoptosa vazbou annexinu-V nebo uvolněním NuMA. Sekvence GT, GA, GC nebo GG inhibují proliferaci, indukují zastavení buněčného cyklu a indukují apoptosu v buněčných liniích rakoviny tlustého střeva.
SCID myši nesoucí podkožní buněčné linie lidské rakoviny tlustého střeva a konečníku byly ovlivněny fysiologickým roztokem nebo sekvencemi GT, GA, CG nebo GG o 2 až 20 basích, které vykazují in vitro protirakovinnou aktivitu proti buněčným liniím lidské rakoviny tlustého střeva a konečníku. Myši ovlivněné sekvencemi GT, GA, CG nebo GG o 2 až 20 basích, vykazujícími in vitro protirakovinnou aktivitu vůči buněčným liniím lidské rakoviny tlustého střeva a konečníku, vykázaly průkazné snížení hmotnosti tumoru ve srovnání s myšemi, ovlivněnými pouze fysiologickým roztokem.
I když tento vynález byl detailně popsán s ohledem na jeho specifická provedení, bude odborníkům v tomto oboru zřejmé, že v něm mohou být provedeny různé změny a modifikace, aniž by bylo odbočeno od jeho záměru a rozsahu.
Claims (34)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje 3'-OH, 5'-OH syntetickou fosfodiesterovou nukleotidovou sekvencí o 2 až 20 basích, vybranou ze skupiny, zahrnující (GxTy)n, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb a a(TyGx)nb, kde x a y jsou celá čísla mezi 1 a 7, n je celé číslo mezi 1 a 12, a a b jsou jedno nebo více As, Cs, Gs nebo Ts.
- 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 2 až 15 basí.
- 3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 2 až 10 basí.
- 4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 2 až 7 basí.
- 5. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 4 base.
- 6. Prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny, zahrnující SEQ ID NO: 7 až 18, 23 až 47, 50 až 66 a 81 až 83..
- 7. Prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 7 až 10, 22 až 65, 70 až 75, 79 a 80.
- 8. Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 9, 10, 23 až 49, 70 až 75 a 79.
- 9. Prostředek podje nároku laž8, vyznačující se tím, že obsahuje navíc farmaceuticky přijatelný nosič.
- 10. Prostředek podle nároku laž9, vyznačující se tím, že obsahuje navíc chemoterapeutické činidlo.
- 11. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že chemoterapeutické činidlo je vybráno ze skupiny, zahrnující antimetabolit, alkylační činidlo a hormonálního antagonistů.
- 12. Způsob, vyznačující se tím, že se přípravek obsahující 3 -OH, 5 '-OH fosfodi esterovou nukleotidovou sekvenci o 2 až 20 basích, vybranou ze skupiny, zahrnující (θχΤγ)η, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)„b, a(GxTy)„b a a(TyGx)nb, kde x a y jsou celá čísla mezi 1 a 7, n je celé číslo mezi 1 a 12, a a b jsou jedno nebo více As, Cs, Gs nebo Ts, podává živočichovi, který má rakovinu, v množství dostatečném pro indukci odpovědi, vybrané ze skupiny, zahrnující vyvolání zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.
- 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 2 až 15 basí.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 2 až 10 basí.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se t i m, že tato sekvence obsahuje 2 až 7 basí.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že tato sekvence obsahuje 6 basí.
- 17. Způsob, vyznačující se tím, že se prostředek obsahující fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 7 až
- 18, 23 až 47, 50 až 66 a 81 až 83 podává živočichovi, který má rakovinu, v množství dostatečném pro indukci odpovědi, vybrané ze skupiny, zahrnující vyvolání zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.16. Způsob, vyznačující se tím, že se prostředek obsahující fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 7 až 10, 22 až 65, 70 až 75 a 79 podává živočichovi, který má rakovinu, v množství dostatečném pro indukci odpovědi, vybrané ze skupiny, zahrnující vyvolání zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, ·4·44 4 4 4 44 ···* »·4 ·44 ·· „4 4 ♦4 ·4 ·4 4 aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.
- 19. Způsob podle nároku 12 nebo 17, vyznačující se tím, že indukce apoptosy je nezávislá na buněčné vlastnosti, vybrané ze skupiny, zahrnující Fas, p53/p21, p21/waf-l/CIP, pl^ink4B, pigink4, resistencj na léčivo, caspasu 3, TGF-beta 1 receptor a závislost na hormonu.
- 20. Způsob podle nároku 12 nebo 17, vyznačující se tím, že cytokiny jsou vybrány ze skupiny, zahrnující IL-l-beta, IL-6, IL-10, IL-12 a TNF-alfa.
- 21. Způsob podle nároku 12 nebo 17, vyznačující se tím, že rakovina je vybrána ze skupiny, zahrnující primární karcinom, sekundární karcinom a primární sarkom a sekundární sarkom.
- 22. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že rakovina je vybrána ze skupiny, zahrnující leukémii, lymfom, rakovinu plic, rakovinu prostaty, rakovinu tlustého střeva a konečníku, rakovinu vaječníků a rakovinu kostí.
- 23. Způsob podle nároku 12 nebo 17, vyznačující se tím, že zahrnuje navíc farmaceuticky přijatelný nosič.
- 24. Způsob podle nároku 12 nebo 17, vyznačující se tím, že zahrnuje navíc chemoterapeutické činidlo.
- 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že chemoterapeutické činidlo je vybráno ze skupiny, zahrnující antimetabolit, alkylační činidlo a hormonálního antagonistů.
- 26. Způsob, vyznačující se tím, že se přípravek obsahující 3'-OH, 5'-OH fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci o 2 až 20 basích, vybranou ze skupiny, zahrnující (GxTy)n, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)„b, a(GxTy)nb a a(TyGx)nb, kde x a y jsou celá čísla mezi 1 a 7, n je celé číslo mezi 1 a 12, a a b jsou jedno nebo více As, Cs. Gs nebo Ts, podává živočichovi, který má rakovinu, v množství, které je účinné pro léčbu této rakoviny u živočicha.·· »*·· »#«» • * • 1 » 19 9 ·
- 27. Způsob, vyznačující se tím, že se přípravek obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 7 až 18, 23 až 47, 50 až 66 a 81 až 83 podává živočichovi, který má rakovinu, v množství, které je účinné pro léčbu rakoviny v živočichovi.
- 28. Použití prostředku, zahrnujícího 3'-OH, 5'-OH fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci o 2 až 20 basích, vybranou ze skupiny, zahrnující (GxTy)„, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb a a(TyGx)nb, kde x a y jsou celá čísla mezi 1 a 7, n je celé číslo mezi 1 a 12, a a b jsou jedno nebo více As, Cs. Gs nebo Ts, pro přípravu léčiva pro vyvolání odpovědi vybrané ze skupiny, zahrnující vyvolání zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.
- 29. Použití prostředku, zahrnujícího 3'-OH, 5'-OH fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci o 2 až 20 basích, vybranou ze skupiny, zahrnující (GxTy)n, (TyGx)n; a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb a a(TyGx)nb, kde x a y jsou celá čísla mezi 1 a 7, n je celé číslo mezi 1 a 12, a a b jsou jedno nebo více As, Cs. Gs nebo Ts, pro přípravu léčiva pro léčbu rakoviny u zvířete nebo člověka.
- 30. Použití prostředku, zahrnujícího fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci, vybranou ze skupiny, kterou tvoří SEQ ID NO: 7 až 18, 23 až 47, 50 až 66 a 81 až 83, pro přípravu léčiva pro vyvolání odpovědi vybrané ze skupiny, zahrnující vyvolání zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukci apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.
- 31. Použití prostředku, zahrnujícího fosfodiesterovou nukleotidovou sekvenci, vybranou ze skupiny, kterou tvoří SEQ ID NO: 7 až 18, 23 až 47, 50 až 66 a 81 až 83, pro přípravu léčiva pro léčbu rakoviny u zvířete nebo člověka.
- 32. Použití prostředku podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 pro přípravu léčiva pro vyvolání odpovědi vybrané ze skupiny, zahrnující vyvolání zastavení buněčného cyklu, inhibici proliferace, aktivaci caspas a indukcí apoptosy v rakovinných buňkách a produkci cytokinů buňkami imunitního systému.·«· · · ·· * · · tt ♦ · · · · β tt ···· * • · · >» »· • · · • · · «« ·
- 33. Použití prostředku podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 pro přípravu léčiva pro léčbu rakoviny.
- 34. Použití prostředku podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, kde přípravek je použitelný pro vyvolání odpovědi u živočicha majícího rakovinu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17032599P | 1999-12-13 | 1999-12-13 | |
| US22892500P | 2000-08-29 | 2000-08-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022372A3 true CZ20022372A3 (cs) | 2002-11-13 |
Family
ID=26865979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022372A CZ20022372A3 (cs) | 1999-12-13 | 2000-12-12 | Terapeuticky pouľitelné syntetické oligonukleotidy |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7157436B2 (cs) |
| EP (2) | EP1238070B1 (cs) |
| JP (1) | JP4772245B2 (cs) |
| KR (1) | KR100829646B1 (cs) |
| CN (2) | CN100445380C (cs) |
| AT (2) | ATE455851T1 (cs) |
| AU (1) | AU785212B2 (cs) |
| CA (1) | CA2393808A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20022372A3 (cs) |
| DE (2) | DE60043759D1 (cs) |
| DK (2) | DK1238070T3 (cs) |
| ES (2) | ES2288883T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0300627A3 (cs) |
| IL (2) | IL150196A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02005842A (cs) |
| NO (1) | NO330508B1 (cs) |
| PT (1) | PT1238070E (cs) |
| WO (1) | WO2001044465A2 (cs) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030032610A1 (en) | 1996-06-03 | 2003-02-13 | Gilchrest Barbara A. | Method to inhibit cell growth using oligonucleotides |
| EP1181304B1 (en) | 1999-04-08 | 2007-10-10 | Antisoma Research Limited | Antiproliferative activity of g-righ oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin |
| US7960540B2 (en) | 1999-04-08 | 2011-06-14 | Advanced Cancer Therapeutics, Llc | Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin |
| US8114850B2 (en) | 1999-04-08 | 2012-02-14 | Advanced Cancer Therapeutics, Llc | Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin |
| US6949520B1 (en) * | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
| MXPA02005842A (es) * | 1999-12-13 | 2003-10-14 | Bioniche Life Sciences Inc | Oligonucleotidos sinteticos terapeuticamente utiles. |
| MXPA03001812A (es) | 2000-08-29 | 2004-05-21 | Bioniche Life Sciences Inc | Modulacion de la expresion del sindrome de alcohol fetal y del ligando del sindrome de alcohol fetal.. |
| ATE398175T1 (de) * | 2000-12-08 | 2008-07-15 | Coley Pharmaceuticals Gmbh | Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung |
| US7087586B2 (en) * | 2001-04-24 | 2006-08-08 | Bioniche Life Sciences, Inc. | Oligonucleotide compositions and their use to induce differentiation of cells |
| EP1417307B1 (en) * | 2001-08-17 | 2009-04-15 | Bioniche Life Sciences Inc. | Oligonucleotide compositions and their use to induce apoptosis |
| PT1432450E (pt) * | 2001-10-03 | 2006-05-31 | Bioniche Life Sciences Inc | Trietilenoglicol-colesteril-oligonucleotidos terapeuticamente uteis |
| CN101160399A (zh) * | 2002-04-22 | 2008-04-09 | 拜奥尼茨生命科学公司 | 寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用 |
| EP1608403A2 (en) * | 2003-04-02 | 2005-12-28 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd. | Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application |
| JP2006528697A (ja) * | 2003-05-16 | 2006-12-21 | イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | イムノマーを化学療法剤と組み合わせて用いる、癌の相乗的処置 |
| AU2006216493A1 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunostimulatory oligonucleotides |
| CN101184852A (zh) * | 2005-03-09 | 2008-05-21 | 贝勒医学院 | 通过toll样受体8信号传导直接逆转cd4+调节性t细胞的抑制作用 |
| GB2443591B (en) * | 2005-09-07 | 2010-04-28 | Secr Defence | Adjuvanted vaccine |
| EP2396408B1 (en) * | 2009-02-12 | 2017-09-20 | CuRNA, Inc. | Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf |
| GB0906234D0 (en) | 2009-04-14 | 2009-05-20 | Secr Defence | Vaccine |
| KR100998365B1 (ko) | 2009-06-29 | 2010-12-06 | 압타바이오 주식회사 | 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체 |
| WO2011008305A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Rna antagonists targeting gli2 for the treatment of leukemia |
| JP6155533B2 (ja) * | 2012-02-28 | 2017-07-05 | 国立大学法人東京農工大学 | Ｔｄｐ−４３細胞内存在量関連疾患の認定方法 |
| EP4000597A1 (en) * | 2020-11-17 | 2022-05-25 | The Boots Company plc | Tetrapeptide and compositions comprising tetrapeptides |
| WO2023122762A1 (en) * | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Camp4 Therapeutics Corporation | Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas |
Family Cites Families (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3172815A (en) * | 1962-04-24 | 1965-03-09 | Warner Lambert Pharmaceutical | Method for preparing reticulo-endo-thelial system stimulant and stimulant thereof |
| US4152423A (en) * | 1971-11-19 | 1979-05-01 | Agence Nationale De Valorisation De La Recherche (Anvar) | Immunological agents |
| FR2160326B1 (cs) * | 1971-11-19 | 1975-02-07 | Anvar | |
| US4010257A (en) * | 1973-02-23 | 1977-03-01 | Burroughs Wellcome Co. | Biological extracts |
| US3976544A (en) * | 1973-06-19 | 1976-08-24 | The Agence Nationale De Valorisation De Le Recherche | Water-soluble immunological adjuvants, in particular for vaccines, obtained from mycobacteria and related microorganisms and process for their extraction |
| FR2374042A1 (fr) * | 1976-06-04 | 1978-07-13 | Merieux Inst | Nouveau medicament immunostimulant et son procede de preparation |
| JPS54140710A (en) * | 1978-03-10 | 1979-11-01 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Anti-tumor substance and its preparation |
| DE3011461C2 (de) * | 1980-03-25 | 1986-10-30 | Dr. Madaus & Co, 5000 Köln | Verwendung von Propionibakterien |
| US4520019A (en) * | 1982-04-29 | 1985-05-28 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Stable composition and preparation thereof |
| US4579941A (en) * | 1982-08-13 | 1986-04-01 | Mitsuitoatsu Chemicals, Inc. | Thermally-denatured deoxyribonucleic acid MD-011 and antitumor agent |
| US4663306A (en) * | 1983-09-23 | 1987-05-05 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Pyridine-soluble extract-refined detoxified endotoxin composition and use |
| GB8404280D0 (en) * | 1984-02-17 | 1984-03-21 | Stanford J L | Biological preparations |
| DE3423234A1 (de) * | 1984-06-23 | 1986-02-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor |
| US4744984A (en) * | 1985-10-08 | 1988-05-17 | Vetrepharm Research, Inc. | Antiviral immunotherapeutic agent and preparation thereof |
| US4877611A (en) * | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
| DE3723075A1 (de) * | 1987-07-11 | 1989-01-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Eukaryotische expressionsvektoren mit multimeren enhancer-subelementen, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
| US4958013A (en) * | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
| CA1340994C (en) * | 1989-09-21 | 2000-05-16 | Rudolf Edgar Dr. Falk | Treatment of conditions and disease |
| WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
| IE920561A1 (en) * | 1991-02-21 | 1992-08-26 | Gilead Sciences | Aptamer specific for thrombin and methods of use |
| CA2268476A1 (en) * | 1991-07-03 | 1998-04-30 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Use of hyaluronan in gene therapy |
| US5582981A (en) * | 1991-08-14 | 1996-12-10 | Gilead Sciences, Inc. | Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target |
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| US5523389A (en) * | 1992-09-29 | 1996-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of human immunodeficiency virus |
| DK0681479T3 (da) * | 1993-01-29 | 1999-11-08 | Vetrepharm Inc | Immunterapeutisk præparat |
| US5567604A (en) * | 1993-04-23 | 1996-10-22 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides |
| CN1154702A (zh) * | 1994-05-25 | 1997-07-16 | 海布里登公司 | 具有抗巨细胞病毒活性的寡核苷酸 |
| JPH10505233A (ja) * | 1994-08-30 | 1998-05-26 | コモンウェルス サイエンティフック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション | シルコウイルス由来の植物転写調節因子 |
| US5643890A (en) * | 1995-01-31 | 1997-07-01 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences for use in treatment of cancer and other diseases |
| IN181358B (cs) * | 1995-02-14 | 1998-05-30 | Bioniche Inc | |
| ZA964446B (en) * | 1995-06-06 | 1996-12-06 | Hoffmann La Roche | Oligonucleotides specific for hepatitis c virus |
| US5990299A (en) * | 1995-08-14 | 1999-11-23 | Icn Pharmaceuticals, Inc. | Control of CD44 gene expression for therapeutic use |
| SK66098A3 (en) * | 1995-11-21 | 1998-11-04 | Icn Pharmaceuticals | Inhibition of tumor growth by antisense oligonucleotides for il-8 and il-8 receptor |
| IT1277025B1 (it) * | 1995-12-04 | 1997-11-04 | Cooperativa Centro Ricerche Po | Classe di oligonucleotidi fosfodiesterici ad attivita' citotossica composizioni farmaceutiche che li contengono e loro uso |
| US6015710A (en) * | 1996-04-09 | 2000-01-18 | The University Of Texas System | Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids |
| WO1997044064A2 (en) * | 1996-05-20 | 1997-11-27 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Oligonucleotides which specifically bind retroviral nucleocapsid proteins |
| EP1003525B1 (en) * | 1997-08-05 | 2002-11-20 | Bioniche Life Sciences Inc. | Composition and method for regulating cell proliferation and cell death |
| US6255473B1 (en) * | 1997-08-29 | 2001-07-03 | Duke University | Presenilin-1 gene promoter |
| TR200503031T2 (tr) * | 1999-09-25 | 2005-09-21 | University Of Iowa Research Foundation | İmmünostimülatör nükleik asitler |
| MXPA02005842A (es) * | 1999-12-13 | 2003-10-14 | Bioniche Life Sciences Inc | Oligonucleotidos sinteticos terapeuticamente utiles. |
| US20020091095A1 (en) * | 1999-12-13 | 2002-07-11 | Phillips Nigel C. | Modulation of Fas and FasL expression |
| JP4215429B2 (ja) * | 1999-12-28 | 2009-01-28 | バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド | 癌治療におけるヒアルロン酸 |
| PT1432450E (pt) * | 2001-10-03 | 2006-05-31 | Bioniche Life Sciences Inc | Trietilenoglicol-colesteril-oligonucleotidos terapeuticamente uteis |
| CN101160399A (zh) * | 2002-04-22 | 2008-04-09 | 拜奥尼茨生命科学公司 | 寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用 |
-
2000
- 2000-12-12 MX MXPA02005842A patent/MXPA02005842A/es active IP Right Grant
- 2000-12-12 PT PT00981117T patent/PT1238070E/pt unknown
- 2000-12-12 DE DE60043759T patent/DE60043759D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 CN CNB008188580A patent/CN100445380C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-12 JP JP2001545542A patent/JP4772245B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-12 EP EP00981117A patent/EP1238070B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 DK DK00981117T patent/DK1238070T3/da active
- 2000-12-12 CN CN2008101740188A patent/CN101491536B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-12 DK DK07015976.9T patent/DK1867718T3/da active
- 2000-12-12 CZ CZ20022372A patent/CZ20022372A3/cs unknown
- 2000-12-12 EP EP07015976A patent/EP1867718B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 WO PCT/CA2000/001467 patent/WO2001044465A2/en active IP Right Grant
- 2000-12-12 ES ES00981117T patent/ES2288883T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 AT AT07015976T patent/ATE455851T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-12-12 US US09/735,363 patent/US7157436B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-12 DE DE60036019T patent/DE60036019T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 HU HU0300627A patent/HUP0300627A3/hu unknown
- 2000-12-12 CA CA002393808A patent/CA2393808A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-12 AT AT00981117T patent/ATE370231T1/de active
- 2000-12-12 AU AU18479/01A patent/AU785212B2/en not_active Ceased
- 2000-12-12 KR KR1020027007557A patent/KR100829646B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-12-12 IL IL15019600A patent/IL150196A0/xx unknown
- 2000-12-12 ES ES07015976T patent/ES2340807T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-06-12 IL IL150196A patent/IL150196A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-13 NO NO20022820A patent/NO330508B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-12-18 US US11/641,542 patent/US20070213291A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20022372A3 (cs) | Terapeuticky pouľitelné syntetické oligonukleotidy | |
| ES2226414T3 (es) | Estimulacion del sistema inmunitario. | |
| Munakata et al. | Lipid nanoparticles of Type-A CpG D35 suppress tumor growth by changing tumor immune-microenvironment and activate CD8 T cells in mice | |
| KR20090057468A (ko) | 톨-유사 수용체(ｔｌｒ) 리간드 및 항바이러스제의 조성물 | |
| Mizuno et al. | Simultaneous delivery of doxorubicin and immunostimulatory CpG motif to tumors using a plasmid DNA/doxorubicin complex in mice | |
| Gray et al. | CpG-B ODNs potently induce low levels of IFN-αβ and induce IFN-αβ-dependent MHC-I cross-presentation in DCs as effectively as CpG-A and CpG-C ODNs | |
| US7662792B2 (en) | Modulation of Fas and FasL expression | |
| ES2581480T3 (es) | Compuestos inhibidores de crecimiento tumoral y métodos de uso de los mismos | |
| US20070071717A1 (en) | Treatment of B cells with IL-21 and B cell activators induces Granzyme B production | |
| Kausch et al. | Antisense oligonucleotide therapy in urology | |
| AU2007200536A1 (en) | Therapeutically useful synthetic oligonucleotides | |
| ES2383671T3 (es) | Modulación de la expresión de Fas y FasL por un oligonucleótido-fosfodiéster sintético y un anticuerpo anti-Fas | |
| EP1313853B1 (en) | Modulation of fas and fasl expression by a synthetic phosphodiester oligonucleotide and an anti-fas antibody | |
| AU2001268863B2 (en) | Modulation of FAS and FASL expression | |
| Tarhini et al. | Early development of the toll-like receptor 9 agonist, PF-3512676, for the treatment of patients with advanced cancers | |
| Kim et al. | Expression of UNC93A induced by CpG-DNA-liposome complex in mice | |
| AU2001268863A2 (en) | Modulation of FAS and FASL expression | |
| AU2001268863A1 (en) | Modulation of FAS and FASL expression | |
| Gray | Regulation of interferon alpha beta induction and dendritic cell function by CpG oligodeoxynucleotides |