PT1238070E

PT1238070E - Oligonucleótidos sintéticos úteis sob o ponto de vista terapêutico

Info

Publication number: PT1238070E
Application number: PT00981117T
Authority: PT
Inventors: Nigel C Phillips; Mario C Filion
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Priority date: 1999-12-13
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2007-11-06
Also published as: CA2393808A1; WO2001044465A2; JP4772245B2; AU1847901A; DE60036019D1; EP1867718A3; WO2001044465A3; DK1238070T3; NO330508B1; NO20022820D0; US20070213291A1; IL150196A; HUP0300627A3; DE60043759D1; US7157436B2; DE60036019T2; CN101491536A; KR20020079752A; ES2340807T3; MXPA02005842A

Description

SrMflCÕS ÚTEIS SOB O KMTO Dl A presente invenção tem por objecto uma composição de oligonucleótidos para o tratamento de cancro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro e uma acumulação de uma rede aberrante de células atípicas, que pode resultar de um excesso de proliferação, uma insuficiência da morte das células ou uma combinação das duas. A proliferação e o culminar de uma progressão de células através do ciclo celular resultante da divisão de uma célula em duas células. As cincos fases principais do ciclo das células são G0, Gi, S, G2 e M. durante a fase G0, as células estão inactivas A maior parte das células do corpo, num dado momento, estão nesse estado. Durante a fase Gi, as células respondem a sinais para se dividirem, produzirem o ARN e as proteínas necessárias para a síntese do ADN. Durante a fase S (SP, fase S precoce; SM, fase S media; e SI, fase S tardia) , as células replicam o seu ADN. Durante a fase G2, as proteínas são elaboradas na preparação para a =.·.. ..v, v. das células. Durante a fase mitótíca (M) , a célula divide-se em duas células filhas. As alterações na progressão do oiclo das células ucorrcu em todos os cancros e poaem resultar numa sobre-ux|u;uxvto de genes, numa uxtxçlu dos genes reguladores uu numa anulação dos pontos de controlo dos danos no ADN (Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8: 903, 1997) .

Ao contrário das células do cancro, a maior parte das células normais não podem proliferar indefinidamente devido a um processo designado por senescência celular. A senescência celular é uma resposta programada da morte das células, que leva a paragem do crescimento das células (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 20, 1995). Os danos do ADN, a exposição das células do cancro do cólon, da mama e dos ovários a inibidores de topoisomerase e a exposição das células do cancro nasofaríngeo a cisplatina têm sido referenciados como prevenindo a proliferação destas células por meio da indução da senescência (Wang et al., Câncer Res. 58: 5019, 1998; Poele et al., Br. J. Câncer 80: 9, 1999).

Os oligonucleótidos sintéticos são sequências polianiónicas que estão internalizadas nas células (Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta 1197: 95, 1994). Os oligonucleótidos sintéticos são referidos por se ligarem selectivamente aos ácidos nucleicos (Wagner, R. Nature: 372: 333, 1994), a proteínas celulares específicas (Bates et al., J. Biol. Chem. 274:26369, 1999) e a proteínas nucleares específicas (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem. 252: 207, 1998) para inibir a proliferação das células do cancro.

As sequências sintéticas de 27 bases contendo guanina (G) e quantidades variáveis dê timína (T) (oligonucleótido GTn), em que o símbolo n é á. 1 ou d 7 e em que o Mssitro de bases é 20 (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem. 252: 207, 1998), sido referidas por inibirem o crescimento das linhas celulares do cancro por ligação específica da sequência a uma provaciM nuclear de 45 kDa, ma que GTn, em que o número de bases é < 20, são referidas por serem inactivas contra as linhas celulares de cancro (Morassutti et al., Nucleosides and Nucleotides 18: 1711, 1999). Dois oligonucleótidos sintéticos ricos em GT, de 15 e 29 bases, com modificações de 3'-aminoalquilo, têm sido referidos por formarem quartetos de G que se ligam â nucleolina e que inibem a proliferação das linhas celulares de cancro (Bates et al., J. Biol. Chem. 274: 26369, 1999). O fosforotioato sintético de 6 bases TTAGGG, com uma sequência idêntica a sequência de repetição de telómero de mamíferos, é relatado por inibir a proliferação das células do linfoma de Burkitt in ritro e in vivo (Mata et al., Toxicol. Applied Pharmacol. 144: 189, 1997). Contudo, o fosfodiéster sintético de 6 bases TTAGGG é referido por não ter actividade anti-telomerase (patente de invenção norte-americana US N°: 5.643.890). A morte das células é efectuada por mediadores imunitários que promovem a apóptose e por indutores de apóptose que iniciam directamente processos que levam a morte das células (Muzio et al., Cell 85: 817, 1996; Levine, A. Cell 88: 323, 1997). A apóptose e um processo activo de morte celular, caracterizado por alterações morfológicas diversas, que incluem a condensação da cromatina nuclear, o enrugamento das células, a desintegração nuclear, o rompimento do envelope nuclear das células da membrana do plasma e a formação de corpos apoptóticos ligados a membrana (Wyllie et ai., Int. Rev. Cytol. 68: 251, 1980). Uma sarsa molecular da apóptose é a degradação do ADN nuclear das células nos fragmentos com comprimentos oligonucleossomais em resultado da activação das endonucleases endógenas (Wyllie A. Nature 284: 555, 1980). M caspases (proteases específicas de cisterna e aspar-íiloò têm sido 1 rplicauna como as soísíkvms chave na execução ãa último estado da apóptose. A família das caspases consiste em pelo menos catorze proteases de cisteína e aspartilo relacionadas, Todas as caspases contem um elemento conservado do sítio activo do pentapéptido QACXG que o símbolo X representa R, Q ou G) (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366: 139, 1997). Sintetizou-se um certo número de caspases como pró-enzimas inactivas que são activadas no seguimento da clivagem em sítios de clivagem específicos das caspases (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366: 139, 1997) ou como enzimas inactivas que requerem a associação com moléculas reguladoras para activação (Stennicke et al., J. Biol. Chem. 274: 8359, 1999) .

Para além do seu papel na apóptose, as caspases estão envolvidas na activação e na proliferação de linfócitos B e T, na maturação das citocinas durante a inflamação, na diferenciação das células progenitoras durante a eritropoiese e no desenvolvimento de fibras de lentes (Fadeel et al., Leukemia 14: 1514, 2000). No que respeita aos linfócitos B e T, a caspase 3 é tratada durante a activação dos linfócitcs B e dos sub-conjuntos de linfócitos T, CD4(+), CD8(+), €04 tRA : e CD45RO ( + ) (Alam et al., J. Exp. Med. 190: 1879, 1999). Além disso, a estimulação de linfócitos T por agentes mitogénicos e por interleucina-2, está associada com a activação da via das caspases e com a clivagem de PARP (Wiiheim sst al., Eur. J. Immunol. 28: 891, 1938). No que respeita às citocinas, a actividade da caspase 3 e necessária para a libertação de IL-2, por meio de linfócitos T activados (Posmantur et al., Exp. Cell Res. 244: 302, 1998) e para o tratamento e maturação da cítocina pró-inflamatória, inter-leucína 16 (Zhang et al., J. Biol. Chem. 273: 1144, 1998). No que respeita à eritropoiese, a activação da caspase estê envolvida na rhhlliaçáh da eritropoiese e tem mostrado <p:g modula GATA-1, urra proteína reguladora nuclear, crucial para a maturação dos precursores dos eritróides (De Maria et al., Nature 401: 489, 1999). A citólise é a destruição completa ou parcial de uma célula e é mediada pelo sistema imunitário. Os macrófagos e os monócitos activados produzem moléculas bioactivas que incluem, mas não se limitam, às citocinas. As ci' incluem, mas não se limitam, a interleucina (IL)-1, beta, IL- 6, IL-10, IL_ 12 e FNT-alfa. A IL-l-beta reduz a sensibilidade das células da medula óssea aos fármacos cito-redutores, a radiação e a depuração das células de tumores in vitro com fármacos na transplantação autóloga de medula óssea (Dalmau et al., Bone Marrow Transplant. 12: 551, 1993). A IL-6 induz a diferenciação das células B, estimula a secreção de IgG (Taga et al., J. Exp. Med. 166: 967, 1987), induz a diferenciação das células T citotóxicas (Lee et al., Vaccine 17: 490, 1999), promove a maturação megacariocitica (Ishibashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:8953, 1989) e funciona tanto como factor anti-proliferativo (Mori et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 257: 609, 1999; Alexandroff et al., Biochem. Soc. Trans. 25: 270, 1997; Takizawa et al., Câncer Res. 53: 18, 1993: Novick et al., Cytokine 4:6, 1992) como factor pró-proliferõtivo (Okamoto et al., Câncer Res. 51: 141, 1997; Okamoto et al., Int. J. Câncer 72:149, 1997; Chiu et al., Clin. Câncer Res. 2: 215, 1996; Lu et al., Clin. Câncer Fes. 2: 1417, 1996) para as téiuduus do cancro. A IL-10 potência a eficácia de ¥&cl?iãíí em modelos de tumor de muríno (Kauffman et ai., 1, Immunother. 22:489, 1999) e sobrerregula as respostas das células T auto- A IL-12, isoladamente e em combinação com outras citocinas, promove a maturação de leucócitos e induz a secreção do interferão gama. A IL-12 é referenciada por ter actividade anti-cancro (Stine et ai., Armais NY Academy of Science 795: 420, 1996; Chen et al., Journal of Immnnol. 159: 351, 1997) incluindo, mas não se limitando, a activação de lisÊáeitos T citoliticos específicos, activação de células assassinas naturais (AN) e indução das proteínas anti-angiogénicas IP-10 e MiG. O FNT-alfa causa a necrose de tumores sólidos (Porter et al., Trends in Biotech. 9:158, 1991), sensibiliza as células do cancro para a apóptose induzida pela radiação gama (Kimura et al., Câncer Res. 59: 1606, 1999) e protege as células precursoras da medula óssea dos efeitos dos agentes antineoplásicos (Dalmau et al., Bone Marrow Transplant. 12: 551, 1993).

Contudo, a maior parte das terapias anti-cancro da técnica anterior, quando dirigidas a indução da paragem do ciclo das células, inibição da proliferação, indução da apóptose ou estimulação do sistema imunitário, provaram ser menos do que adequadas para aplicações clínicas. Muitas destas terapias são ineficientes ou tóxicas, têm efeitos colaterais adversos significativos, resultam no desenvolvimento da resistência a droga ou na imuno-sensibilização e são debilitantes para o seu receptor.

Por isso, há uma necessidade contínua de «csas composições e novos processos, que induzam a paragem do ciclo das células em oiluias de cancro, inibam a prbllferáç&õ de células de cancro, activem as caspases nas eíiiulâs do cancro, induzam a apóptose em células de cancro e estimulem a produção de citocinas por meio de células do sistema imunitário. A presente invenção preenche esta necessidade de providenciar ama composição e um processo, que compreendam os oligonucleótidos sintéticos 3'-OH, 5'-OH da SEQ ID N°. 45: ggçagg e em que a sequência induz uma resposta seleccionada no grupo que consiste em indução da paragem do ciclo da célula, inibição da proliferação, activaçâo de caspases e indução de apóptose em células de cancro e produção de citocinas por células do sistema imunitário. Uma composição que compreende a sequência SEQ ID N°. 45 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico é administrada a um animal, incluindo a um ser humano, que tenha um cancro, numa quantidade efectiva para tratar o cancro no animal. A capacidade inesperada e surpreendente da sequência para induzir a paragem do ciclo das células, inibir a proliferação, activar as caspases e induzir a apóptose nas células do cancro e para estimular a produção de citocina por meio das células do sistema imunitário, dirige-se a uma necessidade não preenchida e sentida a muito tempo nas técnicas médicas e providencia um benefício importante para animais, incluindo os seres humanos.

De acordo com isto, constitui um dbjboto da presente invenção, providenciar uma composição e um processo eficazes para tratar uma doença num animal, incluindo num ser humano.

Outro objecto d» presente Aivoi^.áo. e prOvidwnviwt uma e um processo efectivos para tratar um cancro,

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a senescência nas células.

Um outro objecto da presente invenção, e providenciar uma composição e um processo que induz a paragem do ciclo das células, nas células.

Um outro objecto da presente Ininutç&vÇ é providenciar uma composição e um processo que induz a paragem do ciclo das células, nas células de cancro.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que inibe a proliferação das células.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que inibe a proliferação das células de cancro.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose nas células.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um prccesço que induz a apóptose em células de cancrc.

Um objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células independentes de Fas.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de FNRTI.

Um outro C:biv:'n c da presente invenção, é uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de um ρύΰ/ροΐΐ

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de um pi:/CIP.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de um pl5'::x'si

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de um ρΐβ«

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de caspase 3.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de receptor de FCT-beta 1.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de dependência da hormona.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que induz a apóptose em células de cancro independente de resistência ao fármaco.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um prccesso que activa caspases nas células.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que activa caspases nas células de cancro.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo para tratar uma doença auto-imunitária.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo para tratar uma doença linfoproliferativa.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo para tratar uma infecção.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo para tratar uma inflamação.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo para modular a activação das células T ou B. 0% oux.ru objecto da presente invenção, é providenciar u:xo composição e um processo para modular a maturação da célula progenitora.

Um outro objecto da presente invenção, e providenciar uma composição e um processo para modular a eritropoiese.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e urs processo para modular os factores de transcrição nas células.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que potencie o efeito de outros agentes terapêuticos nas células.

Um outro objecto da presente invenção, ê providenciar uma composição e um processo que potencie o efeito de agentes quimioterapêuticos nas células de cancro.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que potencie o efeito antineoplásico da radiação.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que estimule a produção de citocína pelas células do sistema imunitário.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que estimule a produção de IL-1 beta pelas células do sistema imunitário.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que estimule a produção de IL-6 pelas células do sistema Iríunitluiol

Um outro objecto da presente . . ? é providenciar uma composição e um processo que estimule a produção de IL-10 pelas células do sistema imunitário.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que estimule a produção de IL-12 pelas células do sistema imunitário.

Um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição e um processo que estimule a produção de FNT-a por células do sistema imunitário. um outro objecto da presente invenção, é providenciar uma composição que seja simples de preparar.

Um outro objecto da presente invenção, e providenciar uma composição que seja minimamente tóxica para o receptor.

Estes e outros objectos, caracteristicas e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes após uma revisão da descrição detalhada que se segue dos enquadramentos descritos e das reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1. Fluorescência [Fluo-3-ΑΜ] das células T de leucemia humana de Jurkat, incubadas com 0 pg/mL e 100 pg/mL de 6 bases GT, SEQ ID N°. 25 (comparação). FIG. 2. Activação de caspase 3 em células T de leucemia humana de Jurkat, Incubadas com 0 pg/mL e 100 pg/mL de GT, ÇEQ ID N°s. 66, 67, 31, 82 e 83, medidos citometricamente (A) e colorimetricamente íB) FIG. 3. Attvivuçic de caspase em T de leucemia humana do Jurkat. (A) de caspase 3 em células

incubadas com 0 pg/mh e 100 pg/ph de 6 bases GT, SEQ ID Ν°. 25; (Β) Activação de caspase 7 (a) e teor PARP (b) em células incubadas com 0 pg/mL e 100 dg/sbL de 6 bases GT, SEQ ID N°. 25 (comparação). A presente invenção tem por objecto uma composição compreendendo uma sequência sintética de nucleótidos de fosfodiéster 3'-OH, 5'-OH da SEQ ID N°. 45: gggagg, em que a sequência induz uma resposta seleccionada no grupo que consiste na indução da paragem do ciclo das células, inibição da proliferação, activação de caspases e indução de apóptcse em células de cancro e produção de citocinas por células do sistema imunitário. Uma composição que compreende a sequência SEQ ID N°. 45 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, é administrada a um animal, incluindo um ser humano, com cancro, numa quantidade efectiva para o tratamento do cancro no animal, incluindo no ser humano. A capacidade inesperada e surpreendente da sequência para induzir a paragem do ciclo das células, inibir a proliferação, activar as caspases e induzir a apóptcse nas células do cancro e para estimular a produção de citocina por meio das células do sistema imunitário, dirige-se a uma necessidade não preenchida e sentida a muito tempo nas técnicas médicas e providencia um benefício importante para animais, incluindo os seres humanos.

Tal como se utiliza aqui, o termo "sequência", refere-se a uma sequência sintética de oligonucleótidos 3'-QH, 5'-OH, de 2 a 20 bases, que compreende as bases A, C, G e T bases.

Tal como se utiliza aqui, as abreviaturas "GT", "AG", "CGwj "AGT" e "CGT" referem-se às sequências que compreendem as bases sintetizadas, designadas em qualquer ordem.

Tal como se utiliza aqui, o termo "resposta" refere-se a indução da paragem do ciclo de células, h inibição da proliferação, activação ae caspases e indução de apóptose, em células de cancro e estimulação da produção de citocina por células do sistema imunitário.

Tal como se utiliza aqui, as expressões "tratamento terapêutico" e "quantidade efectiva para" referem-se a uma quantidade de uma sequência efectiva para induzir a apóptose, em células de cancro e estimulação da produção de citocina por células do sistema imunitário.

Tal como se utiliza aqui, as expressões "modelos de tumores em suspensão" e "modelos de tumores sólidos" referem-se a carcinomas ou sarcomas primários ou secundários.

Tal como se utiliza aqui, o termo "quimioterapêutico" é qualquer agente aprovado por uma agência reguladora de um pais ou um governo de um estado ou listado na farmacopeia dos Estados Unidos ou noutras farmacopeias geralmente reconhecidas para tratar cancros em animais, incluindo em seres humanos.

Tal como se utiliza aqui, o termo "antineoplásico" refere-se à prevenção do desenvolvimento, proliferação ou dispersão das dllulãs do cancro.

Tal como se utiliza aqui, o termo ''pold&pdis" ao grau de sinergia que é maior do que uma imi ia iiaa-ík: adicional dte cada agente.

Tal como se utiliza aqui, o termo "sinergia" refere-se a uma acção coordenada de dois ou mais agentes. A administração de uma quantidade efectiva da sequência SEQ ID N°. 45 da presente invenção a um animal, incluindo a um ser humano, ê um tratamento terapêutico que previne, trata ou elimina uma doença incluindo, mas não se limitando, ao cancro, artrite reumatóide, distúrbios iinfoproliferativos e asma. Os cancros incluem, mas não se limitam, a carcinoma das células escamosas (células planas que formam a superfície do epitéiio), fibrosarcoma, carcinoma da sarcóide, melanoma, cancro mamário, cancro do pulmão, cancro colorectal, cancro renal, osteosarcoma, melanoma cutâneo, carcinoma das células basais, cancro pancreático, cancro da bexiga, cancro do cérebro, cancro dos ovários, cancro da próstata, leucemia, linfoma e metástases derivadas deles. A eficácia terapêutica de uma sequência pode ser aumentada por processos que incluem, mas não se limitam, a modificação química da base, açúcar ou estrutura de fosfato, complemento químico ou amplificação sob o ponto de vista biotecnológico das sequências que utilizam plasmidos bacterianos contendo as sequências apropriadas, complexação das sequências com veículos químicos ou biológicos ou acoplamento das sequências com ligandos ou anticorpos dirigidos ao tipo de tecido ou ao tipo de célula.

As composições que compreendem a sequência SEQ ID N°. 45 e um veiculo aceitável sob um ponto de vista farmacêutico, são preparadas pondo em associação uniforme e íntima a sequência e c veículo aceitável sob o ponto de vista

Os veículos aceitáveis sob o ponto de vista incluem veículos cpícpIvs sólidos ou ambos. Os ψχίααΐϋ*: lifbidos são veículos oqupgvSí veículos não aquosos ou ambos e incluem, nas não se limitam, a suspensões aquosas, emulsões oleosas, emulsões de água em óleo, emulsões de água em Óleo em água, emulsões específicas do sítio e emulsões de longa duração, emulsões pegajosas, microemulsões e nanoemulsões. Os veículos sólidos são veículos biológicos, veículos químicos ou ambos e incluem, mas o se limitam, a sistemas de vectores virais, partículas, micropartículas, nanopartícuias, microesferas, nanoesferas, mini-bombas extractos de paredes de células bacterianas e polímeros naturais ta sintéticos, biodegradáveis ou não biodegradáveis, que permitem uma libertação sustentada das sequências. Os processos utilizados para complexar uma sequência com um veículo sólido incluem, mas não se limitam, a absorção directa à superfície do veículo sólido; acoplamento covalente a superfície do veículo sólido, quer directamente ou por via de uma parte da ligação; e acoplamento covalente ao polímero utilizado para fazer o veículo sólido. Eventualmente, pode estabilizar-se uma sequência por meio da adição de polímeros iónicos ou não iónicos, tais como, mono-oleatos de polioxietileno-sorbitano (Tweens) ou ácido hialurónico.

Os veículos aquosos preferidos incluem, mas não se limitam, a água, solução salina e tampões aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Os veículos não aquosos preferidos incluem, mas não se limitam, a um óleo mineral e um óleo neutro e as suas misturas. Eventualmente, podem incluir-se excipientes, independentemente do veículo aceitável sob o porto de vista farmacêutico utilizado para apresentar a sequência às que respondem. Estes incluem, mas não se limitam, a antioxidantes, e agentes bacterío-estáticos e podem incluir agentes cte e agentes de espessamento. A sequência SEQ ID N°. 45 pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outras modalidades terapêuticas incluindo, mas não se limitando, a agentes quimioterapêu-ticos, agentes imunoterapêuticos, agentes anti-microbianos, agentes antivirais ou em combinação com terapia de radiação. Os agentes quimioterapêuticos incluem, mas não se limitam, a antimetabolitos, agentes nocivos ao ADN, de desestabilização de microtúbulos, de estabilização de microtúbulos, de despolimerização de actina, de inibição do crescimento, de inibição da topoisomerase, de inibição de HMG-CoA, de inibição da purina, de inibição da pirimidina, de inibição de metaloproteinase, de inibição CDC (cinase dependente de ciclina), de inibição da angiogenese e agentes de potenciação da diferenciação.

As vias de administração incluem, mas não se limitam, a administração oral, tópica, subcutânea, transdérmica, subdérmica, intramuscular, intraperitonial, intravesical, intra-articular, intra-arterial, intravenosa, intradérmica, intracraniana, intralesional, intratumoral, intra-ocular, intrapulmonar, intra-espinal, intraprostática, colocação dentro das cavidades do corpo, inalação nasal, inalação pulmonar, impressão na pele e electrocorporação.

Consoante a via de administração, o volume por dose é, preferencialmente de cerca de 0,001 a 100 mL por dose, mais preferencialmente, de cerca de 0,01 a 50 mL por dose e, ainda mais preferencialmente, de cerca de 0,1 a 30 mL por dose. Preferencialmente, a quantidade de sequência administrada por dose varia entre cerca de 0,001 e 100 mg/kg, mais preferencialmente, entre cerca de 0,01 e 10 mg/kg e, ainda mais preferencialmente, entre cerca de 0./1 e 5 mg/kg. A sequência OiQ 13 N°. 45 ou a sequência mais m agente terapêutico, podem ser administrados num tratamento de dose única, em tratamentos de doses múltiplas ou infundidos continuamente num esquema e durante um período de tempo apropriados â doença a ser tratada, as condições do receptor e a via de administração. Além disso, a sequência pode ser administrada antes, ao mesmo tempo ou depois da administração do agente terapêutico. A sequência SEQ ID N°. 45 em combinação com o agente quimioterapêutico é administrada ao animal que tem um cancro, numa quantidade efectiva para potenciar o efeito anti-neoplásico do agente quimioterapêutico. Preferencialmente, a quantidade de agente terapêutico administrada por dose, é de cerca de 0,001 a 1.000 mg/m2 ou de cerca de 0,01 a 1.000 mg/kg, mais preferencialmente, de cerca de 0,01 a 500 mg/m2 ou de cerca de 0,01 a 500 mg/kg e, ainda mais preferencialmente, de cerca de 0,1 a 100 mg/m2 ou de cerca de 0,1 a 100 mg/kg. A sequência particular e o agente terapêutico particular administrados, a quantidade por dose, o esquema de dosagem e a via de administração, devem ser decididos pelo médico, utilizando processos conhecidos dos especialistas nesta técnica e dependerão do tipo de cancro, da severidade do cancro, da localização do cancro e de outros factores clínicos, tais como, a dimensão, o peso e a condição física do receptor. Além disso, podem eventualmente utilizar-se ensaios in vitro para ajudar a identificar os intervalos óptimos para a administração da sequência e para a administração da sequência mais o agente terapêutico.

Embora não pretendendo estar ligados as hipóteses que se seguem, pensa-se que a sequência SEQ ID N°. 45 da presente invenção pertence a uma nova família de estruturas e não funciona corno ARN anti-paralelo, ADN anti-paralelo, hélice tripla formando WJ, inibidor de telomerase, activador da transcrição ou inibidor da transcrição.

Os exemplos que se seguem irão servir para ilustrar melhor a presente invenção sem, ao mesmo tempo, contudo, constituírem qualquer limitação da mesma.

Preparação das sequências

As sequências de fosfodiéster e fosforotioato foram preparadas por HUKABEL Scientific Ltd, (Montreal, Quebec, Canadá), utilizando o sistema automatizado de síntese de ADN 8900 (PersSeptive Biosystems, Inc., Farminghan, MA) e pela Sigma-Genosys (Woodlands, TX), utilizando a tecnologia da síntese segmentada Abacus. A menos que seja afirmado de outra forma, as sequências utilizadas foram sequências de fosfodiéster. A menos que seja indicado de outra forma, imediatamente antes da utilização, as sequências foram dispersas em água desionizada numa autoclave ou num tampão aceitável sob o ponto de vista farmacêutico em autoclave, tal como, mas não se limitando, a solução salina.

Exemplo 2 Células e reagentes

Todas as linhas de células foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e foram postas em cultura num meio recomendado pela ATCC. O quadro 1 mostra as linhas de células, as suas origens e as suas propriedades.

Quadro 1

Linhas de Células LINHA UI ORIGEM PROPRIEDADES L&ucmis nonocitica aguda de tumor em suspensão s-S-3 numar.a h:mll MCF-7 1 Cancro da mama humano Modelo de tumor sólido; caspase 3 negativa não metastásico; dependente de estrogénio Leucemia das células T humanas Modelo de tumor em suspensão atípico associado a resistência a vários fármacos com proteína pl90-MRP da próstata humano Modelo de tumer sólido; p53 metastásico mutado; independente de androgénio (hormona refractária) LNCaP Cancro da próstata humano Modele de tumor sólido; negativo ao receptor I de FCT-beta metastásico; dependente de androgénio OVCAR-3 Cancro dos ovários humano Modelo de tumor sólido; ρ53 metastásico mutado; p21/waf l/Clitví eliminado SK-OV-3 Cancro dos ovários humano Modelo de tumor sólido; p53 metastásico eliminado; p21/waf 1/Clip-l eiiminado; pl6inW elimina-do Leucemia pronielocítica humana Modelo de tumor em suspensão p53 mutado EL-4 Linfcma T de murino Modelo de tumor em suspensão Leucemia das células B de murino Modelo de tumor em suspensão L-1213 Leucemia de murino 'Modelo de tumor em suspensão C-17 Osteosarcoma canino Modelo de tuaor sólido CF-51 Cancro da glândula mamária de caninos Modelo de tumor sólido

Semearam-se as células em microplacas de fundo plano com 6 cavidades (1 mL/cavidade) , 24 cavidades (0,5 mL/c&yid&dsíj ou 96 cavidade (0,1 mL/cavidade) e manteve-se a 37 "C, em atmosfera de C02 a 5 %. A menos que seja dito de outra forma, incubaram-se 2,5 X 10* tóêlalat/s&i. com 0 pg/mL (controlo) e 100 pq/mL (tratadas) de sequências de 2 a 45 bases, contendo A, C, Ge T, durante 48 horas.

Exemplo 3

Medição da proliferação de células

Mediu-se a proliferação das células utilizando a redução com dimetiltiazol-difeniltetrazólio (MTT) (Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983). Mediu-se o MTT a um comprimento de onda de 570 nm, utilizando um leitor de espectrofotómetro em placas múltiplas (ELX800, Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, VT).

Exemplo 4

Incubaram-se células T de Jurkat com sequências de 6 bases GT, AG, CG, GG, AGT e CGT (quadro 2).

Quadro 2 % de inibição da proliferação das células T de Jurkat de leucemia humana SEQUÊNCIA % DE INIBIÇÃO TGTGTG-(TG)s SEQ ID N°. 9-(6 bases) 36 3 E Q ID N°. 10-(6 bases) -vi ¥*··. TTTGTT-TT (TG) 7.: SEQ ID N°. 23-(6 bases) GGTGGG-GG-(TG) ;GG SEQ ID N°. 24-(6 bases) 48 GGGTGG-GG(GT)iGG jsEQ ID N°. 25-(6 bases) i % de inibição da proliferação das células T de i Jurkat de leucemia humana v*'; 'l. í .....QG GQCUÇ';: fsÉQ ID N°.26-(6 bases) | \ AAGIAA-AA i GT) jM :j SEQ ID N°. 27-(6 bases) | 13 fccGTcc-ccTGTMÍE'' íSEQ ID N°. 28-(6 bases) | 5 TGGTTG-TG (GT) :;TG 1' SEQ ID N°. 29-36 bases) i i AT GT AT - AT (GT) jM (SEQ ID N°. 30-(6 bases) j AGGTGA-AG(GT) QG, !SEQ ID N°. 31-(6 bases) j 10 i ÍGAGTGA-GA(GT) iGA \ i (SEQ ID N°. 32-(6 bases) ij Í'gggtct-ggTgtT7S'~ N ζ: ! |SEQ ID N°. 33-(6 bases) ( i [CCGTGG-CC(GT) vGG SEQ ID N°. 34-(6 bases) 1 37 |GGGTCC-GG(GT)iCC j SEQ ID N°. 35-(6 bases) i 1 !CTGTCT-CT(GTj iCT SEQ ID N°. 36-(6 bases) i ij TCGTTC-TC(GT):ÍTC SEQ ID N°, 37-(6 bases) 1 20 | CGCTGC-CG(GT) :GC SEQ ID N°. 38-(6 bases) i i TTGTGG-TT(GT)iGG SEQ ID N°. 39-(6 bases) 1 | íabus;: ( 31 | GGTT^G-GG ÍTT) -^GG AS ; % de inibição da proliferação das células T de Jurkat de leucemia humana SEQUÊNCIA % DE INIBIÇÃO SEQ ID N°. 41-(6 bases) GGAAGG-GGíS) iGC SEQ ID N°. 42-(6 bases) 22 GGCCGG-CC(CC)GG SEQ ID N°. 43-36 bases) 29 GGGGGG-GG(GG) iGG SEQ ID N°. 44-(6 bases) 26 GGGAGG-GG(GA) rGG SEQ ID N°. 45-(6 bases) GGGCGG-GG(GC) . Λ v SEQ ID N°. 46-(6 bases) GGAGGG-GG(AG)JK .V V SEQ ID N°. 47-(6 bases) GTGGGG-(GT) SEQ ID N°. 48-(6 bases) 26 TTAGGG-TT (AG) pSG SEQ ID N°. 49-(6 bases) 45

Tal como se mostra no quadro 2, as sequências de 6 bases GT inibiram a proliferação das células T de Jurkat. A SEQ ID N°. 25 de GT inibiu 60 % da proliferação e a SEQ ID N°. 49 de AGT inibiu 45 % da proliferação. A comparação da potência relativa da SEQ ID Nc. 25 de GT e da SEQ ID N°. 49 de AGT, utilizando o software PHARMIPCS-4 (Microcomputer Specialists, Phiiadelphia, PA), mostrou que a potência da SEQ ID N°. 25 de GT era ?,4 vezes a da SEQ ID N°. 49 de AGT. A SEQ ID N°. 49 de AGT de fosforotioato é referida como inibindo a actividade de telomerase e por induzir a apcptose em células de línfoma de Burkitt (Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189, 1997).

Para determinar a actividade da telomerase, fez-se um ensaio com extractos de 2 x 10" células T de Jurkat, utilizando o protocolo de amplificação da repetição telomérica de RCP (PART, TRAP na terminologia inglesa) (Roche, Lavai, Quebec, Canadá). A concentrações entre 1 e 100 pg/mL, a SEÇ ID N°. 25 de GT de fosfodiéster mostrou entre 0 e 10 % de actividade anti-telomerase, enquanto que a SEQ ID N°. 49 de AGT de fosforotioato mostrou entre 30 e 75 % de actividade anti-telomerase. Nem o fosforotioato da SEQ ID N°. 25 de GT nem o fosfodiéster da SEQ ID N°. 49 de GT, mostraram qualquer actividade anti-telomerase.

Exemplo 5 (comparação)

Inibição da proliferação de células pelas sequências de fosfodiéster e fosfoiotioato Já foi referida a modificação das sequências naturais de fosfodiéster por substituição de um átomo de enxofre por um átomo de oxigénio que não estava em ponte em um ou mais dos grupos fosfato, para aumentar a estabilidade das sequências de oligonucleótidos em relação as endonucleases em fluidos e células biológicas (Crooke et al., Anticancer Drugs 6:609, 1991).

As células T de Jurkat da leucemia humana (quadro 3), as células de cancro da próstata humana LNCaP (5 x 10'' células/mL) (quadro 4) e as células do cancro da mama humano MCF-7 (5 x Kr oéltilmsMLi (quadro 5), foram incubadas com sequências de 6 bases GT, rendo quer oxigénio (fosfodiéster) quer enxofre (fosforotioato) como o átomo não em ponte no grupo fosfato.

Quadro 3 % de inibição da proliferação das úélaiâà T Jurkat de leucemia humana % cl; 2:)i 1 s ΓQM; GTGTGT-(GT)3 bases) SEQ ID N10 fosfodiéster, fosforotioato FGSFGROTIOATO 0 TTTGTT-TT (TG)iTT (6 bases) SEQ ID N°. 23 fosfodiéster, fosforotioato 31 4 Sultâu-Qu·- (TGÍ (6 bases) SEQ .G; N°. 24 f osf odiester, f osf orotioato 48 6 GGGTGG-GG(GThGG (6 bases) SEQ ID N°. 25 fosfodiéster, fosforotioato 60 0 TTGTTT-TT(GT) .ΓΓ (6 bases) SEQ ID N°. 26 fosfodiéster, fosforotioato 34 0

Quadro 4

Quadro 5 i de inibição da proliferação das células do cancro da mama humano MCF-7 % de : tduCÀi SEQUÊNCIA FOSFODIÉSTER FOSFOROTIOATO :ÇT:j · 'Τ: ··':·. (Ç baSCS) SEQ ID N°. 9 fosfodiéster, fosfcrctioato 6 6 ÇTÇÇçf · ·Ό\· ·. (6 bases) SEQ ID N°. 10 fosfodiéster, fosforotioato 31 12 TTTGTT-TT(TG) jTT (6 bases) SEQ ID N°. 23 fosfodiéster, fosforotioato 7 8 GGTGGG-GG-(TG) iSG (6 bases) SEQ i3 N°. 24 fosfodiéster, fosforotioato 41 12 GGGTGG-GG (GT)iGG (6 bases) SEQ ID N°. 25 fosfodiéster, fosforotioato 1L TTGTTT-TT (GT)-TT (6 bases) SEQ ID N°. 26 fosfodiéster, fosforotioato 20 6

Tal como se mostra nos quadros 3, 4 e 5, as sequências de fosfodiéster com 6 bases GT inibiram a proliferação das células T de Jurkat, LNCaP e MCF-7 mais efectivamente do que as sequências de fosforotioato com 6 bases GT.

Exemplo 6 (comparação)

Inibição da proliferação das células por meio de sequências mistas de fosfodiéster e fosforotioato

Incubaram-se células T de Jurkat de leucemia humana (quadro 6) e células do cancro da mama humano MCF-7 (5 x líu células/mL) (quadro 7), com a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT em que, quer o oxigénio (fosfodiéster) ou c enxofre ~fosforotioato)era o átomo que não estava em ponte no grupo fosfato.

Quadro 6 % de inibição da proliferação aas células T Jurkat de ieucemia humana inDQIbbllJJu· a DE INIBIÇÃO " (átomo de oxigénio 1 a 6) SEÇ 1D N°. 23-(6 bases; fosfodiésterj 60 (GST0) ;(átomo de oxigénio 1, 2, 4, 5, 6; átomo de enxofre 3) SEQ ID N°. 25-(6 bases) vílvlii çí-do (átomo de oxigénio 1, 2, 3, 5, E; átomo de enxofre 4) SEQ ID N°. 25-(6 bases) 12 =-0·;: O"; Λ 0 ) X -OÇv (átomo de Oxigénio 1, 2, 5, 6; átomo de enxofre 3, 4) SEQ ID N°. 25-36 bases) 13 Cí:::£sfíÍS:-;Τ.;-::3ξ.λϊ5·.;;--CiS-Sv íG0T0) 1¾¾ (átomo de oxigénio 2, 2, 4, 5; átomo de enxofre 1, 6) SEQ ID N°. 25-(6 bases) 16 (átomo de oxigénio 1, 3, 4, 6; átomo de enxofre 2, 5: SEQ ID N° . 25-(6 bases) 11 "•-'.(g3I0j (átomo de oxigénio 3, 4; átomo de SEQ ID N° . 25-(6 bases) "li (átomo de enxofre 1 a 6) SEQ ID N°. 25-(6 bases; fosforotioato) 0 1 *Nota: "o" representa tm átomo de oxigénio e "s" representa tm átomo de s enxofre no grupo fosfato j

Quadro 7 1 de inibição da proliferação dau csl;.;/: su ds ssnçiO . ;.· ;;;husaio; 1 DE INIBIÇÃO :¾¾ :..5 00^0 de OXÍÇéniO Si 6) SEQ ID N*. 25-(6 bases; fcsfcdioster) i X 1 % àe inibição da proliferação das células do cancro da mama MCF-7 SEQUÊNCIA* % DE INIBIÇÃO ígct2; x::*Pí (átomo de oxigénio 1, 2, 3, 5, 6; átomo de erxoire 4) SEQ ID N°. 25-(6 bases) 0 átomo de enxofre 3, 4) SEQ IJ N°, 25-(6 bases) 43 (GqT0) (átomo de oxigénio 2, 2, 4, 5; átomo de enxofre 1, 6) SEQ IC N°. 25-(6 bases) 12 G0G3G0ToGsG0-G0Gs (GCT0) (átomo de oxigénio 1, 3, 4, 6; átomo de enxofre 2, 5) SEQ ID N°. 25-(6 bases) i3 i -i(átomo de oxigénio 3, 4; átomo de SEQ ID N°. 25-(6 bases) «AASif ΑΙΡΑ-ΙΑΙΑ (¾¾) j.Sfbs (átomo ae enxofre 1 a 6) SEQ ID N°, 25-(6 bases; fosforotioato) 12 *Nota: "c" representa um átomo de oxigénio e "s" representa um átomo de enxofre no grupo fosfato

Tal como se mostra nos quadros 6 e 7, a substituição de um átomo de enxofre por um átomo de oxigénio que não está em ponte, em um ou mais dos grupos fosfato da SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT, resultou numa diminuição significativa na inibição da proliferação de células T de Jurkat e células MCF-7.

Exemplo 7 (comparação)

Indução da paragem do ciclo de células

Determinou-se o estado do ciclo das células utilizando um kit comercial CYCLETEST™ PLUS DNA (Becton Dickinson). Em resumo, obtiveram-se as células dos núcleos por dissolução da memorana da célula num detergente não iónico, eliminando o cito-esqueleto da célula e as proteínas nucleares com tripsina, digerindo o ARN celular com RNase e estabilizando a cromatina nuclear com espermina. Adicionou-se iodeto de propidio ao núcleo da célula e analisou-se a sua fluorescência num citómetro de fluxo equipado com capacidades de descriminação electrónica de dobletos (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) . A acumulação das células em - . as fases precoces S (SE), média S (SM), tardia S S ou G2/M do ciclo das células foram analisados utilizando o software MODFIT LT (Verity Software House Inc., Topsham, MA).

As células T de Jurkat de leucemia humana (quadro 8) e as células do cancro da mama humano MCF-7 (5 x 1CÚ células/mL) (quadro 9) que cresceram exponencialmente, foram incubadas durante 24 horas com sequências de 2, 6, 15, 18, 27 e 45 bases contendo A, C, G e T. Recolheram-se as centrifugaram-se e determinou-se o estado do ciclo das células.

Quadro 8 | Indução da paragem do cicio de células em células T de Jurkat de leucemia| i humana % das células na fase: íAR;·: : SE ! SM \ SL í G2/M Ϊ Paragem* Células não tratadas i 31,4 I________-__________________________________________________________i............... 19,1 14,3 | 11, 6 { 23, 6(Nenhuma i: ' i hl· Nú Ú S-R·· 1 ;q· A ; ‘ v '.' , , ( •RO |:SI fitòsl | i i •tf "f | . i i 1 1 _ ; .·.·.<·. V í· : ; λ: ! I .·:· j ?S ) Ri, :: jslÚ IS Kh, 2-1¾¾¾¾} : : i ; 1................................ ] 1-1,¾ 3 Ú. -·3ί s oúasí í isosi : i ; .............J i : j 3 j | i ...................... ^ ~..........: l· ..... 1 OÚ 9 : li, ;'í i :-1,¾¾ : iCi : M )·"::· itóR ! tf IR, ISA bssSiú s ; 3 ~ j j 3 j :L....................................................................L....__________.Ϊ................í................Ϊ............ ! 3 i i: 1 i ! :: ·· : :;·?· ·?·?:* ’> ·: úlv : : ! ·\··.·'{· ».· ; ·>>.·.·.*:.<·. ·: .·>.'·> λ.*ί· I v·:·:· rSRR Ih ih\ 11---¾¾ 0¾¾¾¾¾¾ ) i f ; :'úl Ai. a-RRc- j: I i ShfilRcURS 1 3 S L : ' ; iiçS ; ia, 1; si* ! (R* 5¾¾ R- t:A *¥:>;:!: SsaSíR ; i ; ; \ .........................; St-R l j *..···::-. Mmt \ ...............i........................ 1 RÇh ;C€3 Rll s : 7 -, : 5 11:, ¾ i 33.1, V ; ia, 1 SIS 1 ía«; (An-mí- í t——:_____________________________________________—____________a.___________:_;_____________i indução da paragem do ciclo de células em células T de Jurkat sás sssfesKia | humana 1 !: % das células na fase: \ :Paragem* SEQ ID N°. 4 3- -g bases: GGsGT)jGG SEQ ID N° . 25-(6 í>3.í5* £; (GiT)nG SEQ ID N°. i—(27 Cases) (GiT) 13G SEQ ID N°. 1-(27 bases; fcsforotioato) * Íw.ww.wv.w^y. SEQ ID K°. 2-(27 bases)

Nenhuma (G5T) 4G3 SEQ ID N°. 3-(27 bases)

Nenhuma (G7T) ;!));; SEQ ID N°. 4-(27 bases) ·: } v‘ : ,v, :·,·

Nenhuma

AACCACAAGCCCAAC SEQ ID N°. 67— (i5 bases)

YrtYIYWl^Y^Yl^Yl^yVVYYVWWYWWYYYYYWWk-VWYYYYYVWevy

Nenhuma TT (AG)]GG SEQ ID N°. 49-(6 bases)

4A ^NNNNNNNNSSNSNNNN^jiNNNNNNNNNNNNNNNNV SM médio (GT)9 SEQ ID N°. sií- ÍIS bases! SM médio BCG A-l SM médio

Nenhuma SEQ ID N°. 71-(45 bases) BCG A-3 SEQ ID N°. 73-(45 basesj (TG) SEQ ID N°. 51-(2 bases) v.v.v.v.v.awAv.

Tal como se mostra no quadro 8, nas células T de Jurkat, as sequências de 2, 6 e 27 bases GT induziram a paragem na fase SE do ciclo das células, as sequências de 6 bases de CG e AGT, 18 bases de GT e 45 bases de BCG A-i induziram a paragem na fase SM do ciclo das células e a sequência de 6 bases de AG induziu a paragem na fase Gq/Gí do ciclo da célula.

Quadro 9

Indução da paragem do ciclo de células em células de cancro da mama . s das cé lulas na fase: ____________.._______________________..._______0:1.-1:... Ct .ií, 'i- Ξ............- W ): qdd:·;:· : ! 11,¾ /Td-xiv: h :.· ÍO , :'*· A ; : ..______________________________________________„_____________________________1................. m I í Λ SC l | 1 ... . CEQ: ID i:I"-;o ! 'i 2 , '6: I ... . i O ~ . ~ i Jiifj . ~ : 'i ¥; ·, í ! ss moais ; -j ·. :* v. $ :«; : MQê W*. \ d ·· : 1 :·: &&&&< \ D,lí: I /dM j 1.1,7 |.ÍM: ........ 1 .......)......i............... 7* Ovb 5 17,7 5:.717 Orisl \ SEO ID N°. 51-(2 bases) = i t X

Tal como se mostra no quadro 9 nas células MCF-7, as sequências de 2 e 6 bases GT induziram a paragem na fase SE do ciclo das células, uma sequência de 6 bases AGT e uma sequência de 18 bases GT induziram a paragem na fase SM do ciclo das células.

Exemplo 8 (comparação)

Indução da paragem do ciclo de células peia SEQ ID N°. 25 de GT, SEQ ID N°. 79 de AC e SEQ ID N°. 25 de GT i- SEQ ID N°. 79

de AC

Fez-se a incubação de células T de Jurkat de leucemia humana (1 X 10e células/mL), durante 24 horas, com a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT complementada com a SEQ ID N°. 79 de 6 bases AC e â SEÇ ID N°. 25 de 6 bases GT + a SEQ ID N°. 79 de

6 bases AC. A SEQ ID N°. 25 de GT e a SEQ ID N°. 79 de AC foram hibridadas por meio da mistura de oligonucleótidcs (a 1:1) e o aquecimento durante 10 minutos, a 65 °C. Como controlos, aqueceram-se, durante 10 minutos, a 65 °C, as SEQ ID N°. 25 de GT e SEQ ID N°. 79 de AC (quadro 10).

Quadro 10 % das células na fase: QaKó SE SM SL •'v ·. >:·’! Paragem Células não tratadas 31,7 152 13,7 14,0 25,4 Nenhuma GG(GT)::Pt SEQ ID N°. 25-(6 bases) 28,0 45,8 14,0 11,3 0,9 SE final cc(ac; jCc SEÇ ID N°. 79-(6 bases) 36,0 10,4 13,4 9,7 30,5 Nenhuma GT (GT): - (AC)ipC: nenhuma SEQ ID N°. 25 - SEQ ID N°. 79- (12 bases) 35,0 13,0 10,1 8,7 33,2 Nenhuma

Tal como se mostra no quadro 10, a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT induziu a paragem no fim da fase SE do ciclo das células, enquanto a SEQ ID N°. 79 de 6 bases AC

complementares não teve efeito no ciclo das células. A

hibridação da SEQ ID N°. 25 de GT e da SEQ ID N°. 79 de AC neutralizou a indução da paragem do ciclo das células pela SEQ ID N°. 25 de GT. Estes dados demonstram que, para serem efectivas, as sequências da presente invenção devem ter uma estrutura helicoidal simples.

Exemplo 9

Indução da apóptose A redistribuição da fosfatidiiserina na membrana do plasma e a libertação da proteína matriz nuclear (NuMA), são características das células que sofrem apóptose (Martin et al. J. Exp. Med., 182:1545, Biotechniques, 15:1042, 1993). 1995;

Miller et al. A redistribuição da fosfatidilserina na membrana do plasma durante a apóptose foi medida por citometria de fluxo utilizando anexina V conjugada com ITCF (isotiocianato de fluoresceina, FITC na terminologia inglesa) (BD Pharmingen, San Diego, CA) . A libertação de NuMA no sobrenadante foi determinada utilizando um kit comercial de ELISA (Cncogen/Calbiochem, Cambridge, MA).

As células T de Jurkat de leucemia humana foram incubadas com 50 μΜ de sequências com 3, 4, 5, 6 e 7 bases GT, uma sequência de 5 bases ACGT, sequências de 6 bases AG, GG, AGT e CGT e uma sequência de 7 bases GG. O quadro 11 mostra a % de células na apóptose (positiva para a coloração com fosfatidilserina/anexina V (FS/A-V) e a percentagem de SiíMA libertada das células.

Quadro 11

Indução da apóptose em células T de Jurkat de leucemia humana SEQUÊNCIA % de células em apóptose (positiva para a coloração de FS/A-V) % de NuMA libertada (células tratadas versus não tratadas) Células não tratadas 4 0 GC- (GThGG SEQ ES N°. 2-(6 uases) 27 69 GG ·&&:; ;<>A í invenção) SEQ ID N°. 45-(6 bases) 27 74 lã: Ή GG ,í -b:0:::Q SEQ ID N°. 44-(6 bases) ϊ Q SEQ ID St: 27-(6 bases) 20 56 iódUôdP da apóptose em células T de Jurkat de leucemia humaria 1 de células apópeose para a coloração de FS/A-V) 1 de OíUiS. libertada (SOO: :0 r c trataaas versas não tratadas) i.CC fGT) SEQ ID N° . 2E- (6 bases) % 0 ijiit! ; -'v.w rp rp SEQ ·;□ N°. 26-(6 bases) ΊΑ GT(GT)ύ'ΙΤ iSEQ ID N°. 10-(6 basesj 03 K ; .1,1.: v; r. ? ·'· · ·’ 4 &.·<£: ::;,·£ 1 :(GT)iGG SEQ ID N°. 52- (4 bases) "ti G (GT)Çs SEQ ID N°, 56-(4 bases) ti 110 SEQ ID N°. 8- (3 bases) Ά li? s (GT) SEQ ID N°. 7- (3bases) 1.0 so GG(GT)A SEQ ID N°. 6-(5 bases) A· G(GThS-3 SEQ ID N° . 60- (5 bases) Os 11:0 GG (GG)iGGG SEQ ID N°. 63-(7 bases) 10 GGG(GT);,S:3 SEQ ID N°. 62-(7 bases) 30 123 1 CG(GThA SEQ ID N°. 8C — (5 bases) 6 9 j

Tal como se mostra no quadro 11, as sequências de 3, 4, 5, e 6 bases GT, AG, CG e AGT induziram a apóptose das células T de Jurkat. As sequências com 5 bases ACGT e 6 bases CGT e GG não induziram a apóptose nas células T de Jurkat.

Exemplo 10 (comparação)

Os aumentos do cálcio intracelular foram relatados como estando associados com a indução da apóptose (Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993) . Seguiu-se o utilizando a sonda fluorescente Fluo-3-ΑΜ (Cell Permaant, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . Um aumento da fluorescência de Fluo-3-ΑΜ é indicativo de um aumento do sCitÇ:,

Incubaram-se as células T de Jurkat de leucemia humana, durante 24 horas, com a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT. Colheram-se as células por centrifugação, suspenderam-se em SBF (soro bovino fetal), contendo SBF a 1 % e carregaram-se com Fluo-3-ΑΜ 10 μΜ, durante 1 hora, a 37 Mediu-se a fluorescência das células a uma excitação de 488 nm e a uma emissão de 530 nm (detector FL1). Analisaram-se os dados num FACSCALIBUR, utilizando o programa CellQUEST (Becton Dickinson).

Como se mostrou na figura 1, a incubação das células T de Jurkat com a sequência SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT causou um aumento de 88 % na fluorescência das células, indicativo de um aumento em (Ca'"').

Exemplo 11

Indução da produção de citocina A menos que seja indicado de outra forma, incubou-se 1 x 10í; células com 100 pg/mL de cada uma das sequências

ensaiadas, durante 48 horas, a 37 °C, em Cy:> a 5 %. A produção das citocinas IL-β, IL-16, IL-12, IL-l-beta e FNT-alfa foi determinada em pg/mL, em 100 gb de sobrenadante de cultura, utilizando o kit comercial de ELISA apropriado (BioSource, Camarillo CA) . A ELISA de IL-12 mede tanto o complexo de IL-12 p70 ccmo a subunidade p40 livre. Os resultados estão expressos como um aumento de (x) "vezes" na produção de citocinas pelas células tratadas, comparadas com as células de controlo.

As células da leucemia monocítica, aguda, humana THP-1 foram incubadas com sequências de 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 e 18 bases GT e determinou-se a produção de citocina IL-6 (quadro 12).

Quadro 12

Produção de citocina por células ae leucemia monocítica, aguda, humana THP-1 i & ; ' TG-(TG)XT SEQ ID N°. 7-(3 bases) 2, 7x TG-(TG), SEQ ID N°. 51-(2 bases) 2, 9x TGTGTG-(Th.: SEQ ID N°. 9-(10 bases) 4, Ox GTGTGT-(GT)3 SEQ ID N°. 10-(6 bases) 5, Ox SEQ ID N°. 11-(9 bases) 5, 4x GTGTGTGTG-(GT)4G SEQ ID N°. 12-(9 bases) 5, 4x SEQ ID N°. 13-(12 bases) 5, 7χ * SEQ ID N°. 14-(L2 bases) 1,3x TGTGTGTGTGTGT-(TG) SEQ ID N° . 15-(14 bases) 1, Gx í ; n - ,, SEQ ID N°. 16-(15 bases) 2, 6x TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)9 SEQ ID N°. 17-(18 bases) 2 f ít. x ID N°, 18-(18 bases) 2, 8x

Tal como se mostra no quadro 12, as sequências de 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 e 18 bases GT aumentaram a produção de células THP-1 da citocina IL-6.

As; células de leucemia monocítica, aguda, humana THP-1, foram incubadas com sequências de 6 bases GT, AS, CG, GG, AGT e CGT e determinou-se a produção das citocinas IL-12 e IL-E (quadro 13j.

Quadro 13

Produção de citocina por células de leucemia monocítica, aguda, humana THP-1 SEQUÊNCIA * IL-12 # IL-6 TGTGTG-(TG)2 SEQ ID N°. 9 \ \ GTGTGT- (GT) ).......................................... SEQ ID N°. 10 1 rusi: : XuX j TTTGTT-TT(TG) iTT SEQ ID N°. 23 |.......-ϊ'ΓΙ'χ.......Γ......?7§ϊ GGTGGG-GG (TG) rSG SEQ ID N°. 24 3,7 x 6, 9x GGGTGG-GG(GT)iGG SEQ ID N°. 25 2,3x 3, lx ITGTIT-TT(GT)iTT SEQ ID N°. 26 '·: >V\> MGQM-MíSflu.M. SEQ ID N°. 27 6, Ox I 8 < 8 X CÇQ:rCÇ-C(l(S'T)::;ÇC SEQ ID N°. 28 3,8x 12,: Sx TGGTTG-TG (GT)XTG SEQ ID N°. 29 4, lx IP, DA ATGTAT-AT(GT) iAT SEQ ID N°. 30 4,8x 9,8x ΑΑζΓΜΙΐ-ΑρουΤίί,δΑ SEQ ID N°. 31 ' > /-¾¾ . :!· '·-">· v Gíhj ; umg : m oEQ ii5 D ' < Jr 1 ? 8.x. Sçix SSGTÇT-ísGÇfflç iCQ SEQ ID N°. 33 i LX i.lç | (GIQ QEQ- ID D'-, J4 D.f Sx GGGTCC-GG(GT)iCC SEQ ID N°. 35 i , | ·<· Ar tz | €7oDíOT'"€T(di::)g::i seq id n°. 36 2, Ox OTT!r^-fC'{.<*T}jTÇ SEQ ID N°. 37 2,2;x Í2í 3Ç CGGQÇQ-CG (GT) ;:DC SEQ ID N°. 38 0, 2x 6, 9x TTGTG-TT (GT) ;.GD SEQ ID N° . 39 0, Ox 6, 6x GGGTT-GG(GT)iTT SEQ ID N°. 40 -1,2x 14,Οχ ! GGTTGG-GG(TT) SEQ ID N°. 41 16,Ox GGAAG-GG (AA) iG SEQ ID N°. 42 4, lx 29,2x 3 v ‘Lx, ilíls: j GGGGGG-GGÍGGhGG SEQ ID N°. 44 0, 0x 15, lx (ÍIID^DS SEQ ID N°. 45 invenção -1,6x 23,2x

Tal como se mostra no quadro 13, as sequências de 6 bases GT, .¾¾ CG, GG, AGT e CGT aumentaram a produção das células de THP-1 das citocinas IL-12 e IL-6. 0 quadro 14 resume a indução da síntese de IL-12 e IL-6 por sequências ae 6 bases.

Quadro 14 Sínteses de IL-6 e IL-12 por sequências de 6 bases Aumento de vezes N°s. da SEQ ID da síntese de IL-12 N°s. da SEQ ID da síntese de IL-6 « ·*$·;:.· *<%. *<.< ty<;· ·.·.<- ·.*· ·> ?: .·.·:·:·:· y . ·.·:· s y ·.····.··>· ·.·· *.\v íiu clh Au iA AÀ 49 >·!>0 : * '·. v> . ·. ·· ··': q · .. ·>:·. í - --1. α· - ··' ·: ···; q; 1 •-.i-V·;}·.. Α’χ ,y ·:« 1 V(. ·>'.· : ;· vU·: ,·· ........ ..... . . . í '·'> ·'···> ;·:<..· ·.· ··< ..· ·.·:··>( .· e ; -SÇ.y IS, AU RCíl h, AU AA ϊ d :r:i, n·* m iíh :it, « 44, i:i \ ν' ·:· \1 y | A. A, Aí, u, Ά A, | i · .· '·> ,! ; , 1 .v -'ϊ.- y - ·

As sequências A-3 (SEQ ID N°. 73), A-4 (SEQ ID N°. 74), A-6 (SEQ ID N°. 75), A-7 (SEQ ID N°. 76), M3 (SEQ ID N°. 77) e alfa 1 (SEQ ID N°. 78) derivadas de BCG são referidas por activarem in vivo as células AN (Kataoka et al. Jpn. J. Câncer Res. 83:244, 1992). As células de leucemia monocítica, aguda, humana THP-1 foram incubadas com sequências de 45 bases derivadas de BCG e determinou-se a produção das citocinas IL-12 e IL-6 (quadro 15).

Quadro 15 (comparação) í Produção de citocina por células de leucemia monocítica, aguda, í; humana U;Y····

Produção de citocina por células de leucemia monocítica, humana aguda, GGGGCTTCTTGCACTCGGCATAG SEQ IT N°. SA-mUsi bases) ; '•v*:·''·'· - - '-· • ·?·. ·:·.··:·.-·:· χ. ........ : \:···.;··.% GATCACCAACGATGGTGTGTCCA SEQ ID íbt 70-(45 bases) Li X t, L-S. BCG A-3 i 2Λ A7'v:u':uL':7: xA.éáxJlvÀoálirO TGGAGGATCCGTACGAGAAGATC SEQ ID N°. 71-(45 bases) 1.. 7 x 2, 5x BCG A-4 GCAACACGACGGCCACCGTGCTG SEQ ID N°. 72-(45 bases) és BCG A-6 CGCCGGTGACACCGACGCCATCG SEQ ID N°. 73-(45 bases) Ix BCG A-7 GCCGAGAAGGTGCGCAACCTGC CGGCTGGCCACGGACTGAACGCT SEQ ID N°. 74-(45 bases) 0, 5x N.D. BCG M-3 ACGCCGACGTCGTCTGTGGTGG GGTGTCTACCGCCAACGCGACGG SEQ ID N°. 75-(45 bases) l,6x Ο,ΒΚ BCG ALFA-1 CGACTACAACGGCTGGGATATC AACACCCCGGCGTTCGAGTGGTA SEQ ID N°. 76-(45 bases) 1 í is ; i 1, íx j í

Tal como se mostra no quadro 15, as sequências de 45 bases derivadas de BCG aumentaram minimamente a produção das células THP-1 de IL-2 e IL-6.

Exemplo 12 (comparação) da produção de IL-12 por sequências de fosfodiéster e fosforotioato

Incubaram-se células de leucemia monocítica, aguda, humana THP-1 com sequências de 6 bases GT, tendo como átomo de não iigação em ponte um átomo de oxigénio (fosfodiéster) ou um átomo de enxofre (fosforotioato) nos grupos fosfato e determinou-se a produção de citocina IL-12 (quadro 16).

Quadro 16 | AUoUúvlv de IL-12 por células de leucemia monocítica, aguda, humana .........sSStg ......... ·> ^ ' \6 bases) SEQ ID N°. 9 fosfodiéster, fosforotioato I, Sx -0, Ix GTGTGT-(GT)3 (6 bases) | SEQ ID N0. 10 fosfodiéster, fosforotioato j -0,2x TTTGTT-TT(TG);(6 bases) SEQ ID N°. 23 fosfodiéster, fosforotioato 3, 5x o, lx GGTGGG-GG-(TG) vhh (6 bases) SEQ ID N°. 24 fosfodiéster, fosforotioato 3, 7x -0, lx GGGTGG-GG{GT)]GG (6 bases) SEQ ID N°. 25 fosfodiéster, fosforotioato 2, ox 0, Ox TTGTTT-TTiGTi (6 bases) SEQ ID N°. 26 fosfodiéster, fosforotioato 3, 8x -0, lx

Tal como se mostra no quadro 16, a substituição de um átomo de enxofre (fosforotioato) por um átomo de oxigénio fora da ponte (fosfodiéster), nos grupos fosfato, resultou numa diminuição significativa da produção de células THP-1 de IL-12.

Incubaram-se células de leucemia monocítica, aguda, humana THP-1 com a sequência SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT, tendo quer um átomo de oxigénio (fosfodiéster) ou um átomo de enxofre (fosforotioato) como o átomo não ligado em ponte ncs grupos fosfato e determinou-se a produção aa citocina IL-12 (quadro 17).

Quadro 17

Produção de IL-12 por células de leucemia monocitica, aguda, humana 1,7 ' ' ,<ALoiac de oxigénio 1 a 6} SEQ ID N°. 25- (óbases; fosfodiéster) (átomo ae oxigénio 1, 2, 4, 5, 6; átomo de enxofre 3) SEQ ID N°. 25- (óbases) 0,1 iG0T2) (átomo ae oxigénio 1, 2, 3, 5, 6; átomo de enxofre 4) SEQ ID Xo. - íi! bases) 0, 2x ' (Gs?s) (átomo de oxigénio 1, 2, 5, 6; átomo de enxofre 3, 4) SEQ ID N°. 25-(6 bases) 0, 5x ' ' " (átomo de oxigénio 2, 3, 4, 5; átomo de enxofre 1, 6) SEQ ID N°. 25-(6 bases) 'Mx (átomo de oxigénio 1, 3, 4, 6; átomo de enxofre 2, 5) SEQ ID N°. 25- (óbases) | {G0T0) (átomo de oxigénio 3, 4; átomo de SEQ ID N°. 25-(6 bases) çQT<?:,ϊΦ,Q- Q·.· \ , 1',-; ;p:,Q(átomo de enxofre 1 a 5) SEQ ID N® . 25- (óbases; fosforotioatc) 0 *Nota: "o" representa um szímc· de oxigénio e "s" representa um átomo de enxofre no grupo fosfato

Tal como se mostra no quadro 17, a substituição de um átomo de enxofre (fosforotioato) por um átomo de oxigénio não ligado em ponte (fosfodiéster), na SEQ ID N°. 25 dê 6 bases GT resultou numa diminuição significativa na produção de células IHP-1 de IL-12.

Exemplo 13

Estimulação das sínteses de citocina em células mononucleares de sangue periférico humano

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (aqui, "CMSPs") a partir de 7 seres humanos saudáveis por meio de Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Baie dMJrfée, Quebec, Canadá), por meio da centrifugação com um gradiente de densidade de sangue completo. Incubaram-se as CMSPs com sequências de 6 bases GT, AGS, CGT, AG, CG e GG e determinou-se a produção das citocinas IL-l-beta, IL-6, IL-10 e IL-12.

Quadro 18

Prodnção de citocina por meio de CMSF humanas SEQUÊNCIAS vezes de aumento de IL-l-beta: media +/- DP (intervalo) vezes de aumento de IL-6 : média +/- DP (intervalo) vezes de aumento de IL-10: média +/- DP (intervalo) vezes de aumento de IL-12: média +/- DP (intervalo) TGÍTG):TG SEQ ID N°. bases) 9-(6 1,2+/- 0,4 (0,8 - 1,5) 8,3 +/- 12,8 (1,2 - 37,C) 1,0 +/- 0,1 (0,9 - 1,1) 2,7 +/- 2,6 (1,0 - 6,6) GI(GI! iGT SEQ ID N°. bases) 10-(6 2, C +/- 1,6 ti, 5 ”3,8) 9,8 +/- 14,2 (0,8 - 39,1) 1,0 +/- 0,1 (0,9 - 1,1) 4,0 +/- 6,3 (0,9 - 18,1) TG(IG)4TG SEQ ID N°. bases) 13-(12 2,4+/- 1,9 (0,9 - 4,5) 12,1 +/- 6,5 (2,9 - 20,8) 1,2 +/- 0,4 tí/S - 1,9) 4,4 +/- 5,3 (1,2 - 15,0) gi(gt;4gt SEQ ID N° . bases) 14-(12 1,1 +/- 0,2 :t, i - ,.(.:¾ 2, C +/- 1,5 - 4,9) 1,0 +/- 0,1 (0,9 - 1,2) 2,0 +/- 1,1 (0,9 - 2,6) pm ÍíííSRS; Ííí ; , - (0,9 - 1,0) :o,r +0- μ· (1,3 - 25,6) ' 'V'. ·Λν·'" y yd,· ÍM - ΪΑΪ bt- - USi ........................................., í SEQ ID N°. t, : feStísi &; ____________________ 24-(6 ííaS ÍS, £ (0,9 - 1,0) ....................... {0/7 - 37,1} : .....................................[ .¾¾ 5·/·.- 3:,* (1,0 - -tié 3 ,· 3 ):'·' ij.fi' (0,9 - 5,5) í I SE3 ID N°. ta : I 25-(6 :::1..¾ :0),3 +/-- t.Sy£> +/-- L + § - Á'ãi . . .........................................Vj A" liei: 5.Í/S - aiaS) :............. 1,5 +/- o,s 5,8 + /- 6,0 1, 0 +/- 0, 1 1,6 + /- 1,3 ii/+*<·: (0,S - 2,5) (0,5 - /¾¾ ........................................... í..;·, ;>- 1,2.. (0,3 - 4,-51 í .........................................J ' && í; ÍJ.Í. :· :···'.··; x ;ι·· ’ ·· bases) . ................... i,i: +;*·> t,t ti. i , ),:2:) I . ......J iM -tt- i,i (1,8 - 16,0) 1 ! ...................................1 ():,:/1 ->/-, í3,< ti, :? - 1,1} t-'- í,t | (0,8 - 6,7) i CC (C-I) jCC SEQ ID N°. bases) ti; -.-,1( 2,i tt-:,a (0,8 - 4-1) i 10,4 ti- 13, C j tti - 35,8) | i,i it- 0,1 i ti/íi - 1,1) ; : 5,9 + /- bÍ,-: : (0,9 - :t:/t:t | DA DV tbítss : VIV: Wií? ' ÉA iOSSSb ................ ........................ vav x E x; Á;Ã: u;· Ai:: A AAA: £. A:;:A:Á >> :ç Si; lle-í.-GGGG;:; 1 DÃ :íí: I d-? íí-"íõ : ......... 1:.-1 ' • _[_ (: iiifsf-0+1-,: 'ίγϊ: ;u:u— G G .o x- SEQ ID ::·Γ'' v 29- (6 II uu: - Mi 5¾.¾ » IIMg 5 IA ~ 7, li A,·? - 11,7; AT(GI)iAT 4,6 + ,5- 4,4 1,0 e 1 -- 0,1 1,3 +/- C, 2 5 SEQ ID N°. 33-(6 1 (1,0 - 1,4) (1,6 (1,0 - 1,6) i bases) 5 CT(GT)iCT I 1,2 + /- 0,3 5,3 +/- 3,6 1,0+/- 0,1 | 1,2 -+.1-- 0,3 | SEQ ID N°. 36-(6 1 (1,0 - 1,5) (0,9 - 10,6) (0,9 - 1,2) (0,9 - l.-«: s bases) 5 ,5 ....... ——f.——————————————— ----—----------------A—----------------------------------- —-1 TC(GT),TC 1 U2 +/- 0,Ç 1, 0 +/- 0,1 1,4 +/- 1,1 5 SEQ ID N°. 3 7-(6 7,5 +/- I s (0,9 - 1,6) (0,7 O r- Cs| (1,0 - 1,1) (0,9 - 3,8) $ bases) GG (AA) iGG 3,5 +/- 3,9 11,8 +/- 5,8 1 1, 1 +/- 0,2 1 3,0 +/- 2,7 1 SEQ ID N°. 42-(6 (0,8 - (1,2 - 15,6) i (0,9 - 1,5) ·· :- >;: $ bases) i| ί DgíccíTgA"· +/- 10,2 \ 1,2 +/- 0,3 : 2,5 +/- 2,0 1 SEQ ID N°. 43-(6 1,5 +/- 0,9 14,9 1 U-í 1,8) ; j (0,8 - 2,5) (1,2 - 29,8) j (1,0 · 'MG I bases) ; j ————————————————————————————————————————————————— —Í-——·—————————————— 4_________________________________Ç GG(GG)iGG +/- 14,7 1 1,7 +/- 1,6 i 7,0 +/- 12,5 I 44-(6 7,1 +/- 9, 4 21,0 SEQ ID N°. í : 5 (0,8 - 17,9) (4,6 - 42,0) 5 (0,9 - 4,6) 5 (1,3 ~ 35,3) ; bases) í i l| GG(GA) iGG | (invenção) 13,6 +/- 14,9 24,: + /- 16,5 i 6,0 +/- 5,5 1 20,7 +/- 10,3 I SEQ ID N°. 45-(6 (1,2 - M.I: (5,9 - 50,0) I (2,1 - n+a: 1 íl·," - 35,3) l bases) I j ! GG(GC)iGG +/- 16,2 5 1 3,0 +/- 3,8 l 1,2 +/- 0,3 15,8 S 1, 0 +/- 0,1 SEQ ID N°. 4b-lb (1,0 - 1,5) (1,3 - 37,3) | (0,9 - I; 1 \ GUI - 10,7) | bases: Ί ;

Tal como se mostra no quadro 18, as sequências de 6 bases GT, AGT, CGT, AG, CG e GG aumentaram a produção de células CMSP humanas das citocinas IL-l-beta, IL-6, IL-10 e IL-12.

Exemplo 14 Sínteses de citocina por células mononucleares de sangue periférico de chimpanzé

Isolaram-se CMSPs a partir de 4 chimpanzés saudáveis, tal como no exemplo 13. Incubaram-se as CMSPs com sequências de 6 bases GT, AGT, CGT, AG, CG e GG e determinou-se a produção das citocinas IL-10, IL-12 e FNT-alfa (quadro 19).

Produção de Quadro cxtocma por meio vezes de aumento IL-10: media +/- DF (intervalo) 19 de CMSP de chimpan vezes de aumento ae IL-12: média +/- DP (intervalo) zés ________________________________________ vezes de aumento de FNT-alfa: meara DP (intervalo) TGÍTGhTG SEQ ID Nc. 9 —(6 bases! 2,3 +/- 1,3 (1,3 - 4,1) 13,5 +/- 8,9 (2,8 - 21,1) 11,3 +/- 6,9 DL: 5 - 19,5) GI(GILGT SEQ ID N°. 10-(6 bases) 4,0+/- 2,1 (1,8 - 6,7) ttU +/- 8,5 (3,0 - 21,3) 12,9 +/- 6,4 (6,5 - 19,6) II (TG) iTT SEQ ID N23-(6 bases: 1,5 + /- 0,6 (1,0 - 2,4) 12,9 +/- 8,2 (2,7 - 1Z. : 9,0 +/- 5,5 (4,1 - 14,4) GG (TG) [GG SEQ ID N°. 24-(6 bases! 2, 9 + /- 1,5 (1,3 - 4,8) 14,3 +/- 9,1 (3,0 - 22,5) 11,9 +/- 7,0 (5,8 - 19,8) GG(GT) iGG SEQ ID N°. 25-16 bases) 2,5 +/- 1,5 (1,4 - 4,6! 13,5 +/- 8,4 (2,8 - 20,8) 11,7 +/- 6,7 (5,9 - 19,6) II (GI):IT SEQ ID N°. 26-(6 bases) 1,4+/- 0,9 (1,1 - 2,1) 12,3 +/- 8,5 - 20,1) 7,5 +/- 4,6 (3,4 - :¾¾ AA5GI) íAA SEQ ID N" 27-Í6 bases! 2,1 +/- 1,1 (1,1 - 3,7) 13,2 +/- 8,2 (2,8 - 19,8) 7,9 +/- 3,9 (4,6 - 12,0) CC(GT) -CC SEQ ID N°. 28-16 bases) 3,8 +/- 2,8 0,5 - 7,7) 13,3 +/- 8,4 (2,8 - 20,4) 10,3 +/- 5,7 (5,0 - 15,8) TG(GT) :TG SEQ ID N°. 29-Í6 bases) 3,1 +/- 2,0 (1,6 - 5,9) 13,6 +/- 8,8 (2,9 - 21,9) 12,4 +/- 7,3 (6,1 - ATÍGT) ;AT SEQ ID N°. 30-Í6 bases) 1,4 O- 0,4 (1,2 - 1,9) 10,7 +/- 7,0 (2,5 - 18,6) 5,9 +/- 3,3 (3,4 - 10,5) CT(GT);CT SEQ ID N°. 36-i6 bases) 3,0 +/- 2,1 (1,2 - 5,9) 13,4 >;·- 8,9 (2,8 - 20,4) 12,4 ···;···· 6,3 Γ:,·ϊ - 19,6) TC(GT)iTC SEQ ID N°. 37-(6 bases) 3,4 +/- 2, E tl,4 - 7,1) 14,1 +/- 10,0 (2,4 - 24,9) 11,4 +/-6,4 (6,1 - 19,3) Gíj (TT} íGG SEQ ID N°. 41-f6 bases) 9,7 +/- 7,7 15,3 ui·:- 10,0 (2,9 - 25,9) 14,1 +/- 7,3 (7,7 +/- 23,2) :GG:P.Í.; SEQ ID N°. 42-16 bases) 9,9 +/- 8,5 (2,6 - 22,7) 15,6 +/- 1C, 6 14,4 +/- 7,1 i (8, C - 22,9) : GG(CC)[GG 13,d —!— 9,0 15,1 +/- 10,2 14,C +/- 6,6 : 32:¾¾ ID N°. ;'í: bases) (4,3 - (2rS - 26,1) (7,9 - 22,3) GGÍGGiiGG E I N°. 44-í6 bases) 11,2 UÒ- 9,1 (3,9 - 24,3) 15,1 10,0 (2,9 - 25,9) 13,8 -/- C,S (7,6 - 21,S) GG ;GG ; Λ.'v1y:G.V.\'úv. 5 i +/- 9,2 15,9 +/- 10,7 +/- 6,9 SEQ ID K°. 45-(6 bases) (2,6 - 23,1) U i - i Mn (7,9 - 23,0) 1.3G ID K°. 46-(6 bases: 4/ f +/- .3/4 ! 5. i *.:··· 10,4 ; (3,0 - 26,2) | 14, i +/- 6, 6 (8,3 - 21,7)

Tal como se mostra no quadro 19, as sequências de 6 bases GT, AGT, CGT, AG, CG e GG aumentaram a produção de células CMSP de chimpanzé das citocinas IL-10, TL-12 e FNT-alfa.

Exemplo 15 Sínteses de citocina por células mononucleares de sangue periférico de macacos rhesus

Isolaram-se CMSPs a partir de 4 macacos rhesus saudáveis, tal como no exemplo 13. Incubaram-se as CMSPs com sequências de 6 bases GT, AGT, CGT, AG, CG e GG e determinou-se a produção das citocinas IL-6, IL-12 e FNT-alfa (quadro 20) .

Quadro 20 : Produção de citocina por meio de CMSP de macacos rhesus SEQUÊNCIAS vezes de aumento de IL-10: média +/- DP (intervalo) vezes de aumento de IL-12: media +/- DP (intervalo) vezes de aumento de FNT-alfa: média +/- DP (intervalo) TG {'1'G): TG 1,1 +/- 0,2 10,6 +/- 4,2 14,3 +/- 6,3 SEQ ID N°. 9- (6 bases) (0,9 - 1,3) (5,6 - 14,3) (6,2 - 21,2) GT(GT)iGT 1,3 +/- 0,1 10,7 +/- 4,1 16,1 +/- 4,2 SEQ ID N°. 10-í 6 bases) (1,1 - 1,4) (6,1 - 15,8) (11,0 - 21,6) TT(TG)iTT 1,0 +/- 0,1 6,7+/- 3,6 4,4 +/- 3,8 SEÇ ID N°. 23-(6 bases) (0,8 - 1,0) (3,6 - 11,7) (1,3 - 9,5) GGfTGhGG 1,0 +/- 0,i 11,2 +/- 4,8 14,5 +/- 5,4 SEQ ID N°. 24-Í6 bases) (1,0 - 1,1) (5,6 - (7,7 - 20,0} GG(GT) :GG 1,0 +/- 0,1 10,6 +/- 0,7 12,5 +/- 5,2 SEQ ID N°. 25-(6 bases) (1,0 - 1,1) :¾.¾ - 16,5) (6,2 - 18,6) TT (GT ) iTT 1,0 +/- Ítt 4,9 s —-2,9 2, 1 +/- 1,0 SEQ xa N°. 26-(6 bases) :1,:1 - 1,2) (2,6 - 8,8) (1,3 - 3,4) &ís (GT! iAA d. 9 r.í·.- 0,1 7,6 +/- 2,6 6, 0 > s·' ·-· £ / 0 ? SEQ ID N°. 2τ- (6 bases) (0,9 - 1,0) (5,9 - 11, 5) (2,4 - j vvíGT) ,CC 1,1 +/- 0,2 10,1 +/- 3,/ 14,2 +/- 3,7 : SEQ ID K°. 28-(6 bases) íi,d - 1,3: : (:-(,3( (9,6 - (¾¾¾ .'.'.'.i 1,1 +7- Ò, 2 C . +7- 4,2 16, 5 +7-** 2, 7 $; o jo u29—'6 bases) :(¾.¾ -1,13 (6,5 - :i; d (14,0 - (:((: ÇC: iAT 1,9 +/- 1,4 6,0 +/- L, ΐ; 6, J +/- 4,7 SEQ ID N°. 30 — j6 bases) : '· ·:·" ; «:,S - (::1, 4:( .·;;;·y ó.Ciy I... fQy ; ··. ·>' j B-; 5 fi.< £

Produção de ç i.íçcs.ÇiS por meio de CMSP de macacos ri e s u s ' -víIv-avAs:.:.··w..;.:- vezes de aumento r D ' ϋ Ϊ média -i·· EF (intervalo) vezes de aumento de IL- 12: média +/- DP f intervalo! vezes cie alimento de FNT-alfa; média t/- DP SEQ ID N°. 36— I€ bases) (0,9 - 1,1) ..........τ;Γ;:/η;:;;'···:......... lá·.· * is, ·; ··;·· ;: £3: Si:* , q!;·''" ::/è · --t,V: .....J______________ 1A .v y ;· .3. :-':λ v. ,· ' ... ··: · ·>:· · * y - - 7 ¾ v i- ··' ; ·'· 7 < 2' . .· .* -.· y -v-Qv > í ·-" n,v:-:- .¾¾¾ ,:ρ·ν ·ν':' Ν <·-.% "· &:·&£·£;£;: : :· 0· ' ; 1 tn · r·, t. ·. <-.< ;> V " «T· / «:*. " :·\ 1; Φ ‘ 1 - ύ.·ί I.U"· -/··- 4:,S ' i i '* u: ,1·;:·::^. η- , Ο" VuVVfbT: m.S - i.::·: :u _________________„______4 í;.í «.··- inm rt-- s.í. nn q,ú ; SEQ ID 8*. 44-16 bases) (1,1 - 3,5) (3,7 - u,s: (2,0 - 20,9) GG(GA)(invenção) 1,1 +/- 0,1 11,9 +/- 4,5 16,7 +/- 4,6 SEQ ID H°. 45-(6 bases) (1,0 - 1,3) (6,8 - (11,6 - 21,5) GGSGCliGG 1,2 +/- 0,2 11,0 +/- 4,4 16,8 +/- 4,1 SEQ ID N°. 46-36 bases) (1,0 - 1,4) (6,3 - 16,1) ; H -: ç::

Tal como se mostra no quadro 20, as sequências de 6 bases GT, AGT, CGT, AG, CG e GG aumentaram a produção de células CMSP de macaco rhesus das citocinas IL-10, 11,-12 e

Exemplo 16 (comparação)

Efeito das sequências SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT, da SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT + 5 - fluorouracilo e da SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT + tarnoxifen em tumores da mama humanos MCF-7

Implantaram-se, sub-cutaneamente, como xenoenxertos, células do cancro da mama humano MCF-7, em ratos fêmea, pelados, BALB/c. Dividiram-se os ratos em 6 grupos de 10 ratos. No dia 0, o grupo 1 de ratos recebeu solução salina, o grupo 2 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT, o grupo 3 de ratos recebeu 5~fluorouracilo, o grupo 4 de ratos recebeu tarnoxifen, o grupo 5 de ratos recebeu a SEÇ ID N°. 25 de 6 bases GT + 5-fluorouracilo e o grupo 6 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT + tarnoxifen. Passadas 4 semanas de tratamento, sacrificaram-se os ratos e determinou-se a massa do tumor. Os ratos do grupo 1 tinham a maior massa do tumor, os ratos dos grupos 2, 3 e 4 tinham uma menor massa do tumor do que os ratos do grupo 1 e os ratos dos grupos 5 e 6 tinham menos massa do tumor do que os ratos dos grupos 1, 2, 3 e 4.

Exemplo 17

Efeito das sequências com 3 e 6 bases GT e da sequência de 45 bases BCG A-3 em LNCaP de tumores do cancro da próstata humanos

Implantaram-se, sub-cutaneamente, como xenoenxertos, células LNCaP do cancro da próstata humana, em ratos macho, pelados, nu/nu. Dividiram-se os ratos em 5 grupos de 10 ratos. No dia 0, o grupo 1 de ratos recebeu solução salina, o grupo 2 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 8 de 3 bases, o grupo 3 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT, o grupo 4 de ratos recebeu a SEQ ID n°. 45 de 6 bases AG e o grupo 5 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 69 de 45 bases BCG A-3. Passadas 4 semanas de tratamento, sacrificaram-se os ratos e determinou-se a massa do tumor. Os ratos do grupo 1 tinham a maior massa do tumor, os ratos do grupo 5 tinham uma menor massa do tumor do que os ratos do grupo 1 e os ratos dos grupos 2, 3 e 4 tinham menos massa do tumor do que os ratos dos grupos 1 e 5.

Exemplo 18

Efeito das sequências com 3, 6, 8 e 21 bases nas .Uri;, c. s T de hnfornas de murino EL-4

Implantaram-se células T de linfoma de murino EL-4 em ratos Cividiram-se os ratos em 6 grupos de 10 rates.

No dia 0, o grupo 1 de ratos recebeu solução salina, o grupo 2 de ratos recebeu a SEQ ID N°, 8 de 3 bases GT, o grupo 3 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 25 de 6 bases GT, o grupo 4 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 45 de 6 bases AG, o grupo 5 de ratos recebeu a SEQ ID Nc. 18 de 18 bases GT e o grupo 6 de ratos recebeu a SEQ ID N°. 1 ae 27 bases GT. Passadas 4 semanas de tratamento, sacrificaram-se os ratos e determinou-se a massa do tumor. Os ratos do grupo 1 tinham a maior massa do tumor, os ratos dos grupos 2, 3, 4, 5 e 6 tinham uma menor massa do tumor do que os ratos do grupo 1.

Exemplo 19

Mantiveram-se linhas de células do cancro do cólon humano como culturas de células aderentes. Trataram-se as células na fase de crescimento exponencial com sequências de 2-20 bases GT, GA, GC ou GG, num intervalo de dosagem de 0 pg/mL até 100 pg/mL, durante 24-72 horas. Mediu-se a inibição da proliferação das células por redução com MTT, paragem do ciclo das células por citometria de fluxo e apóptose por meio da ligação de anexina V ou libertação de NuMA. As sequências de GT, GA, GC ou GG inibiram a proliferação, induziram a paragem do ciclo das células e induziram a apóptose em linhas de células do cancro do cólon. massa

Ratos SCID portadores de linhas de células do cancro colorectal humano subcutâneas, foram tratados com solução salina ou com sequências de 2-26 bases GT, GA, GC ou GG, com uma actividade anti-cancro contra as linhas de células de cancro colorectal humano, ín vitro. Os ratos tratados com as giqdênciés de 2-20 bases GT, GA, GC ou GG, tendo actividade znti-cancro contra as linhas de células de cancro colorectal diítòeS',· ín vitro, mostram urra redução significativa na do tumor, comparada com a dos ratos tratados com solução salina.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Phillíp, Nigel Fíllon, Mario <120> Oligonucleótidos Sintéticos Úteis Sob o Ponto de Vista Terapêutico V ; Ú>· 2; ·.. . ·' w ·.· ’·;· · v: yy ΐ5ϋ /17 0, 3/ g ..· é v, · "\ I Jí Sul" Iví - t 7 <1U0> 60/22B, /2 5 < " á': -¾ V· -.S- -.y ^ s'· ·'/ "22 - ;n v. 27 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 27 <212 > ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 1 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg <210> 2 > 27

<212> ADN <213> úiiJo Sintético tAtOt' ,2 ,·'? 'WVÓ' .·'> ,'Χ !·' ,·'? ."5 s'X-V ΛΧΛΧ ·''>'?" 'X .•'-λ',’-'Ν ·,'Χ,·Χ· :-χ ··:·; vJ ·.;.·: ν·) '<. V4 0'ν·: :·->· ·.£ ν· *·<: ^ >.ο \?ί gi ' λ: <210> 3 <211> 27

<212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético ν'- .* Λΐ χ. Ο X χ ν : : : gggggtgggd gdtggggiTigg gggtggg

<210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético ί íj 0 4

Sfggfxfigíí' 07 2772 gogo fggtggg

<210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 5

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgt <210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético 02002-0 0

<210> 7 <211> 3 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético tgt <211> 3 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210 > 9 <211> 6 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <>· <210> 10 -'211 > 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético <40G> 11 tgtgtgtgt <210> 12

<211 > 9 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético

<210> 13 <211> 12 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético

<210> 14 <211> 12 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético <4QG> 14 gtgtgtgtgt gt <210> i5 <21 i> 14

<212> ADN <2i.3> Oliaonucleótido Sintético <·.· .y. .·-> X ...y 7.· <y ,.v - :>-\í

<210> 16 <211> 15 <212 > ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <4 022 1.7 tgtgtgtgtg tgtgtgtf

<210> 18 <211> 18 <2i2> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> gtgtgfcgtgt gítgtgtgt <2107 19 <2117 21

<212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

L tgtgtgtgtg tgtgtgtgtç

<210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Çintétieo

< 210 > 21 <211> 24 <212 > ADN <213> Oiigonucleótido Sintético <tpg> 21 tgt-gtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg

<210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético ftgtgtftgt ftgtgtgtgt gtgi

<210> 23 <211> 6 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético

<212> AON <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 25 <2il> 6 <212> ADN

<2i3> Oligonucleótido Sintético < 2:10 > 26 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 26 ttgttt

<21Q> 27 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <40G> 27

aagtaa <210> 28 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 28 ccçtcc

<210> 29 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 30 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 30 Atgtat

<210> 31 <211> 6 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <4 00> 31 <2Χ0> 32 <211> 6 <212> ADM <213> Oligonucleótido Sintético <210> 33

<211> 6 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético

<210> 34 <211> 6 < 212 > ADN <213> Oiigonucleótido Sintético

<210> 35 <211> 6 <212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético

<210> 36 6

<212> ADN <213> Oiigonucleótido Sintético ctgtct <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 37 tcgttc

<210> 38 <21i> 6 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético •V. -‘x <210> 39 <211> 6 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210> 40 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 40 gggttt < 210 > 41 <211> 6 <212> ADO <213> Oligonucleótido Sintético 42 gg <211> 6

<212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210> 43 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético 4 ^ Ν-'-,'ί ggccgg

<210> 44 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 44

<210> 45 <2il> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 46 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético .·' ,·ύ ·ί\V. χ /'· 'Mi -a te gqgggq

<210> 47 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético 47

<210> 48 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido .Sintético

<I:0O>. 48 <210> 49 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <1DD> ;I8 t tag gg

<212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <21Q> 51 <211> 2 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210> 52 <211> 4 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 53 <211> 4 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<400> 53 ttgt <210> 54 <211> 4 <212> ADW <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 55 <211> 4 <2Χ1> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 56 <211> 4 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210> 57 <211> 4 < 212 > ADN <213> Oligonucleótido Sintético tgtt

<210> 58 <212> MM tilit Oligonucleótido Sintético

<210> 59 <211> 4 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210> 60 <211> 5 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 61 <211 > 5 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 62 <211> 7 <212 > ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<21Q> 64 <211> 7 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <ADD> 0! tafgtgs

<210> 65 <211> 7 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <4SD> Só d 7 C 7 - <210> 66 <m> 27

<212> ADN <2132 Oligonucleótido Sintético <4c;> 66 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg <210> 67 <211> 27

<2-12 > ADN <213? Oligonucleótido Sintético t; ij ί, ό’ο' ; Ç .*5 -n o·: 3 ·; "v t . n y? :t v - 3 ·;ν^ ·.·· γ í . . íí :í ¥: ·¥

<210> 68 <211> 27 < 212 > ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <432> CS çCfgCiggfcl gccggCgt-gg gCgtggg <210> 69 <211> 27

0212 > ADN <213> Oligonucleótido Sintético <'4δ·0>· C2 3232230733 3333322333 ggfÇggg <210> 70

<21l> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético -3:· 3 7,3 CIO 71

<210> 72 <2:11> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<400> 72 tttgtt <210> 73 <211> 6 <212> ADN

<213> Oligonucleótido Sintético <210> 74 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 75 <211> 6 <212 > ADN <2132 Oligonucleótido Sintético ttgttt <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <40G> 16 gccgagaagg tgcgcaacct gccggctggc cacggactga acgct 45

<210> 77 <211> 45 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 77 acgccgacgt cgtctgtggt ggggtgtcta ccgccaacgc gacgg 45

<210> 78 <211> 45 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 78

cgactacaac ggctgggata tcaacacccc ggcgttcgag tggta 45 <210> 79 <211> 6 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 79

ccacec <2ii> 80 <211> 5 <212 > ADN <2I3> Oligonucleótido Sintético <210> 81 <211> 11 <212> ΆΠΝ <213> Oligonucleótido Sintético

<210> 82 <211> 11 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético ggttttgttt g

<210> 83 <211> 12 <212> ADN <213> Oligonucleótido Sintético <400> 83 ttgttttttt tg <210> 84

<£'H> 4 <212> PRT <213> Péptido Sintético

Tir Vai

Aia Asp 1 <210> 85 <211> 4

<212> PRT <213> Péptido Sintético

Asp Glu Vai Asp 1

<210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Péptido Sintético <22 0> <221> SÍTIO <222> (4)..(4) <223> X = Qualquer Aminoácido 11 e Leu Glu Xaa C i s

<210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Péptido Sintético

Ile Glu Gli Asp

Lisboa, 24 de Outubro de 2007

Claims

1. Composição caracterizada pelo facto de compreender uma sequência sintética de nucleótidos de fcsfodiéster 3'-OH, 5'-OH da SEQ ID N°. 45: gggagg e ainda compreender um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de compreender ainda um agente quimiotera-pêutico.

3. Composição, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo facto do agente quimioterapêutico se seleccionar no grupo que consiste num anti-metabolito, um agente de alquilação ou um antagonista de hormona.

4. Utilização de uma composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de um medicamento para a indução de uma resposta seleccionada no grupo que consiste na indução da paragem do ciclo da célula, inibição da proliferação, activação de caspases e indução de apóptose em células de cancro e produção de citocinas por células do sistema imunitário, em que as citocinas se seleccionam no grupo que consiste em IL-l-beta, IL-6, IL-10, IL-12 e FNT-alfa.

5. Utilização de uma composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações i a 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de um medicamento para o tratamento do cancro.

6. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 a 5, caracterizada peio facto de o cancro se seleccic- nar no grupo que consiste em carcinoma primário, carcinoma secundário, sarcoma primário e sarcoma secundário.

7. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de o cancro se seleccionar no grupo que con-siste em leucemia, linfoma, cancro da mama, da próstata, colorectal, dos ovários e dos ossos. Lisboa, 24 de Outubro de 2007