JP4772245B2 - 治療上有用な合成オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、癌治療用オリゴヌクレオチド組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
癌は、異型細胞の異所性網状蓄積であり、過剰な増殖、細胞死の不全、またはその２つの組合せの結果生じ得る。
【０００３】
増殖は、結果として１つの細胞を２つの細胞に分割する細胞周期による細胞進行の極致である。細胞周期の５つの主要な期は、Ｇ0、Ｇ1、Ｓ、Ｇ2およびＭである。Ｇ0期中、細胞は静止状態である。体内のほとんどの細胞が、常にこの段階にある。Ｇ1期中、細胞は、分裂するためのシグナルに応答し、ＲＮＡおよび、ＤＮＡ合成に必要なタンパク質を産生する。Ｓ期（ＳＥ：初期Ｓ期、ＳＭ：中間Ｓ期、およびＳＬ：後期Ｓ期）中、細胞は、それらのＤＮＡを複製する。Ｇ2期中、タンパク質が、細胞分裂のために合成される。分裂（Ｍ）期中、細胞は、２つの娘細胞に分裂する。細胞周期進行における変化が、すべての癌で起こり、遺伝子の過剰発現、調節遺伝子の突然変異、またはＤＮＡ損傷チェックポイントの抑止の結果起こり得る(Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8: 903, 1997)。
【０００４】
癌細胞と異なり、たいていの正常細胞は、細胞老化と呼ばれる過程により、無限に増殖することはできない。細胞老化は、細胞の成長停止を引き起こすプログラム細胞死応答である(Dimri et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:20, 1995)。ＤＮＡ損傷、結腸癌、乳癌および卵巣癌細胞のトポイソメラーゼ阻害剤への曝露、ならびに鼻咽頭癌細胞のシスプラチンへの曝露は、老化の誘発によりこれらの細胞増殖を防止することが報告されている(Wang et al. Cancer Res. 58:5109, 1998; Poele et al. Br. J. Cancer 80:9, 1999)。
【０００５】
合成オリゴヌクレオチドは、細胞中にインターナライズされるポリアニオン性配列である(Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994)。核酸に(Wagner, R. Nature: 372:333, 1994)、特定の細胞タンパク質に(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999)に、および特定の核タンパク質(Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)に、選択的に結合して癌細胞の増殖を抑制する合成オリゴヌクレオチドが報告されている。
【０００６】
グアニン（Ｇ）および可変量のチミン（Ｔ）を含有する合成２７塩基配列（オリゴヌクレオチドＧＴｎ）（ここで、ｎは、１以上または７以下であり、塩基数は、２０以上である）(Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)は、４５ｋＤａの核タンパク質に特異的に結合する配列によって癌細胞系の成長を抑制することが報告されているのに対し、ＧＴｎ（ここで、塩基数は２０以下である）は、癌細胞系に対して不活性であることが報告されている(Morassuitti et al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999)。３’アミノアルキル修飾を有する１５および２９塩基の２つのＧＴリッチな合成オリゴヌクレオチドは、ヌクレオリンに結合するＧ四分子を形成し、癌細胞系の増殖を抑制することが報告されている(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999)。哺乳動物テロメア反復配列の配列と同一の配列を有する合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホロチオエートは、in vitroおよびin vivoにて、バーキットリンパ腫細胞の増殖を抑制することが報告されている(Mata et al. Toxicol. Applied Pharmacol. 144:189, 1997)。しかしながら、合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホジエステルは、抗テロメラーゼ活性を有さないことが報告されている（米国特許第５，６４３，８９０号）。
【０００７】
細胞死は、アポトーシスを促進する免疫媒介物質により、および細胞死を引き起こす経路を直接開始するアポトーシス誘発物質により達成される(Muzio et al. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997)。アポトーシスは、核クロマチンの凝集、細胞収縮、核壊変、原形質膜の小疱形成、および膜結合アポトーシス体の形成を含む特有の形態学的変化を特徴とする活性細胞死プロセスである(Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980)。アポトーシスの分子的特徴は、内因性エンドヌクレアーゼの活性化の結果としての、細胞核ＤＮＡのオリゴヌクレオソーム長断片への分解である(Wyllie A. Nature 284:555, 1980)。
【０００８】
カスパーゼ（システイン−アスパルチル−特異的プロテアーゼ）は、アポトーシスの後期段階の実行に重要な酵素として含意されてきた。カスパーゼファミリーは、少なくとも１４の関連システインアスパルチルプロテアーゼから構成される。すべてのカスパーゼは、保存ＱＡＣＸＧ（ここで、Ｘは、Ｒ、ＱまたはＧである）ペンタペプチド活性部位モチーフを含有する(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997)。多数のカスパーゼは、カスパーゼ特異的切断部位での切断後に活性化される不活性プロ酵素として(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997)、または活性化用調節分子との会合を要する不活性酵素として(Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999)合成される。
【０００９】
カスパーゼは、アポトーシスでの役割のほかに、ＢおよびＴリンパ球の活性化ならびに増殖、炎症中のサイトカイン成熟、赤血球新生中の前駆細胞の分化、ならびに水晶体線維の発達に関与する(Fadeel et al. Leukemia 14:1514, 2000)。ＢおよびＴリンパ球に関して、カスパーゼ３は、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のＣＤ４（＋）、ＣＤ８（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）およびＣＤ４５ＲＯ（＋）サブセットの活性化中にプロセシングされる(Alam et al. J. Exp. Med. 190:1879, 1999）。さらに、分裂促進因子およびインターロイキン−２によるＴリンパ球の刺激は、カスパーゼ経路の活性化およびＰＡＲＰ切断に関連する(Wilheim et al. Eur. J. Immunol. 28:891, 1998)。サイトカインに関して、カスパーゼ３活性は、活性化Ｔリンパ球によるＩＬ−２の放出に(Posmantur et al. Exp. Cell Res. 244:302, 1998)、および炎症誘発性サイトカインインターロイキン−１６のプロセシングおよび成熟に(Zhang et al. J. Biol. Chem. 273:1144, 1998)必要である。赤血球新生に関して、カスパーゼ活性化は、赤血球新生調節に関与し、赤血球前駆体の成熟に極めて重要なＧＡＴＡ−１、核調節タンパク質を調節することがわかっている(De Maria, et al. Nature 401:489, 1999)。
【００１０】
細胞溶解は、細胞の完全または部分的破壊であり、免疫系により媒介される。活性化マクロファージおよび単球は、サイトカインを含むが、それらに限定されない生理活性分子を産生する。サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−アルファが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
ＩＬ−１ベータは、細胞減少性薬剤、照射および自家骨髄移植にて薬剤を用いたin vitroでの腫瘍細胞パージングに対する骨髄細胞の感受性を減少する(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993)。
【００１２】
ＩＬ−６は、Ｂ細胞分化を誘発し、ＩｇＧ分泌を刺激し(Taga et al. J. Exp. Med. 166:967, 1987)、細胞障害性Ｔ細胞分化を誘発し(Lee et al. Vaccine 17:490, 1999)、巨核球成熟を促進し(Ishibashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8953, 1989)、癌細胞のための抗増殖因子(Mori et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 257:609, 1999; Alexandroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993: Novick et al. Cytokine 4:6, 1992)およびプロ増殖因子 (Okamoto et al. Cancer Res. 57:141, 1997; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer Res. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer Res. 2:1417, 1996)の両方として機能する。
【００１３】
ＩＬ−１０は、マウス腫瘍モデルにおけるワクチンの有効性を高め(Kauffman et al. J. Immunother. 22: 489, 1999)、また抗癌自己反応性Ｔ細胞応答を上方制御する(Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995)。
【００１４】
ＩＬ−１２は、単独で、および他のサイトカインと組み合わせて、白血球の成熟を促進し、インターフェロン−ガンマの分泌を誘発する。ＩＬ−１２は、特定の細胞溶解性Ｔリンパ球の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化ならびに抗血管新生タンパク質ＩＰ−１０およびＭｉＧの誘発を含むが、これらに限定されない抗癌活性を有することが報告されている(Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351, 1997)。
【００１５】
ＴＮＦ−アルファは、固形腫瘍の壊死をもたらし(Porter et al. Trends in Biotech. 9:158, 1991)、癌細胞をガンマ照射誘発アポトーシスに対して敏感にし(Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999)、抗悪性腫瘍剤の影響から骨髄前駆細胞を保護する(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551,1993)。
【００１６】
しかしながら、細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、アポトーシスの誘発または免疫系の刺激に関するものであろうと、ほとんどの従来技術の抗癌治療は、臨床用途に適するに至らないことが判明している。これらの治療の多くは、効果がないか、または毒性があり、かなりの不都合な副作用を有し、結果として薬物耐性または免疫感作の発生をもたらし、レシピエントを衰弱させる。
【００１７】
したがって、癌細胞にて細胞周期停止を誘導し、癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞にてカスパーゼを活性化し、癌細胞にてアポトーシスを誘発し、免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激する新規組成物および方法が引き続き必要である。
【００１８】
［発明の概要］
本発明は、（ＧxＴy）n、（ＴyＧx）n、ａ（ＧxＴy）n、ａ（ＴyＧx）n、（ＧxＴy）nｂ、（ＴyＧx）nｂ、ａ（ＧxＴy）nｂ、ａ（ＴyＧx）nｂ（ここで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（これ以降、「配列」）を含む組成物および方法であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発する組成物および方法を提供することにより、この要求を満たす。
【００１９】
配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、癌を有する、ヒトを含む動物に、上記動物において癌を治療するのに有効な量で投与される。癌細胞において細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、カスパーゼを活性化する、およびアポトーシスを誘発する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激する、配列の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療技術における長い間切実に感じられてきた満たされてない要求に対処するものであり、ヒトを含む動物のために重要な有益性を提供する。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、ヒトを含む動物において、疾患を治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、癌を治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、細胞において老化を誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、細胞において細胞周期停止を誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、癌細胞において細胞周期停止を誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、癌細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、細胞においてアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、癌細胞においてアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、癌細胞においてＦａｓ非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、癌細胞においてＴＮＦＲ１非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ５３／ｐ２１非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ２１／ｗａｆ−１／ＣＩＰ非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ１５ink4B非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ１６ink4非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、癌細胞においてカスパーゼ３非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３６】
本発明の別の目的は、癌細胞においてＴＧＦ−ベータ１受容体非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、癌細胞においてホルモン依存性に非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、癌細胞において薬剤耐性に非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、細胞においてカスパーゼを活性化する組成物および方法を提供することである。
【００４０】
本発明の別の目的は、癌細胞においてカスパーゼを活性化する組成物および方法を提供することである。
【００４１】
本発明の別の目的は、自己免疫疾患を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４２】
本発明の別の目的は、リンパ球増殖疾患を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、感染を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４４】
本発明の別の目的は、炎症を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４５】
本発明の別の目的は、ＴまたはＢ細胞活性化を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４６】
本発明の別の目的は、前駆細胞成熟を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４７】
本発明の別の目的は、赤血球新生を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４８】
本発明の別の目的は、細胞における転写因子を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４９】
本発明の別の目的は、細胞に対する他の治療薬の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００５０】
本発明の別の目的は、癌細胞に対する化学療法剤の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００５１】
本発明の別の目的は、照射の抗腫瘍性効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００５２】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるサイトカイン産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５３】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１ベータ産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５４】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−６産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５５】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１０産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５６】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１２産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５７】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＴＮＦ−α産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５８】
本発明の別の目的は、調製するのが容易である組成物を提供することである。
【００５９】
本発明の別の目的は、レシピエントにとって最小限の毒性である組成物を提供することである。
【００６０】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下に開示される実施形態の詳細な説明および上記特許請求の範囲を読んだ後に明らかになるであろう。
【００６１】
［発明の詳細な説明］
本発明は、（ＧxＴy）n、（ＴyＧx）n、ａ（ＧxＴy）n、ａ（ＴyＧx）n、（ＧxＴy）nｂ、（ＴyＧx）nｂ、ａ（ＧxＴy）nｂ、ａ（ＴyＧx）nｂ（ここで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（これ以降、「配列」）を含む組成物であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停止の誘発、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発する組成物を提供する。
【００６２】
配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、癌を有する、ヒトを含む動物に、ヒトを含む動物において癌を治療するのに有効な量で投与される。癌細胞において細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、アポトーシスを誘発する、およびカスパーゼを活性化する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激する、配列の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療技術において長い間切実に感じられてきた満たされてない要求に対処するものであり、ヒトを含む動物のために重要な有益性を提供する。
【００６３】
本明細書中で使用する「配列」という言葉は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ塩基を含む２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’ＯＨ合成オリゴヌクレオチドを指す。
【００６４】
本明細書中で使用する「ＧＴ」、「ＡＧ」、「ＣＧ」、「ＧＧ」、「ＡＧＴ」および「ＣＧＴ」という略語は、任意の順序で合成される指定塩基を含む配列を指す。
【００６５】
本明細書で使用する「応答」という言葉は、癌細胞における細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生の刺激を指す。
【００６６】
本明細書中で使用する「治療上の処置」および「に有効な量」という語句は、癌細胞において、細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、カスパーゼを活性化する、およびアポトーシスを誘発する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激するのに有効な配列の量を指す。
【００６７】
本明細書中で使用する「懸濁(suspension)腫瘍モデル」および「固形腫瘍モデル」という語句は、原発もしくは転移性癌腫または肉腫を指す。
【００６８】
本明細書中で使用する「化学療法」という語句は、国もしくは州政府の管理機関により是認されているか、または、米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方にて列挙されている、ヒトを含む動物において癌を治療するためのいずれの薬剤を指す。
【００６９】
本明細書中で使用する「抗腫瘍性」という言葉は、癌細胞の発達、成熟、増殖または展開を防止することを指す。
【００７０】
本明細書で使用する「増強する」という言葉は、各薬剤の加法的活性よりも大きな相乗作用の程度を指す。
【００７１】
本明細書中で使用する「相乗作用」という言葉は、２つまたはそれ以上の薬剤の協調作用を指す。
【００７２】
ヒトを含む動物への、有効量の本発明の配列の投与は、癌、慢性関節リウマチ、リンパ球増殖性疾患およびぜん息を含むが、これらに限定されない疾患を防止、治療または除去する治療上の処置である。癌としては、扁平上皮癌、線維肉腫、類肉腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、およびそれら由来の転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
配列の治療上の有効性は、塩基、糖もしくはリン酸骨格を化学的に修飾すること、配列を化学的に補うか、または適切な配列を含有する細菌プラスミドを用いて配列を生物工学的に増幅すること、生物学的もしくは化学的キャリアと配列の複合体を形成すること、あるいは組織型もしくは細胞型指向性リガンドまたは抗体に配列を連結することを含むが、これらに限定されない方法により増加されてもよい。
【００７４】
１つまたはそれ以上の配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、配列および薬学的に許容可能なキャリアを均一かつ密接に会合させることにより調製される。薬学的に許容可能なキャリアとしては、液体キャリア、固体キャリアあるいはその両方が挙げられる。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キャリアあるいはその両方であり、懸濁水溶液、油性乳濁液、油中水型乳濁液、水中油中水型乳濁液、部位特異的乳濁液、長期滞留乳濁液、粘着性乳濁液、ミクロエマルションおよびナノエマルションが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリアまたはその両方であり、ウイルスベクター系、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、および配列を持続性放出することが可能な生分解性または非生分解性の天然もしくは合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアと配列の複合体を形成するのに用いる方法としては、固体キャリアの表面への直接吸着、直接的な、または結合部分を介した固体キャリアの表面への共有結合、および固体キャリアを作製するのに用いるポリマーへの共有結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、配列は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン）もしくはヒアルロン酸のような非イオン性またはイオン性ポリマーの添加により安定化され得る。
【００７５】
好ましい水性キャリアとしては、水、生理食塩水、および薬学的に許容可能な緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアとしては、鉱油および中性油、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、応答細胞に配列を呈するのに用いられる薬学的に許容可能なキャリアに関係なく、賦形剤が含まれてもよい。これらの賦形剤としては、酸化防止剤、緩衝液、および静菌薬が挙げられるが、これらに限定されず、沈殿防止剤および増粘剤も挙げることができる。
【００７６】
１つまたはそれ以上の配列は、単独で、または化学療法剤、免疫療法剤、抗菌剤、抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない他の治療上の様式と併用して、もしくは放射線治療と併用して、投与されてもよい。化学療法剤としては、代謝拮抗物質、ＤＮＡ損傷剤、微小管不安定化剤、微小管安定化剤、アクチン脱重合剤、成長抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ抑制剤、プリン抑制剤、ピリミジン抑制剤、メタロプロテイナーゼ抑制剤、ＣＤＫ抑制剤、血管新生抑制剤、および分化促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
投与経路としては、経口、局所、皮下、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内、関節内、動脈内、静脈内、皮内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、髄腔内、前立腺内、体腔内配置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕、およびエレクトロコーポレイション(electrocorporation)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
投与経路に依存して、一回用量についての容量は、好ましくは一回用量につき約０．００１〜１００ｍｌ、より好ましくは一回用量につき約０．０１〜５０ｍｌ、最も好ましくは一回用量につき約０．１〜３０ｍｌである。好ましくは、一回用量につき投与される配列量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。配列または配列および治療薬は、治療される疾患、レシピエントの状態および投与経路に適切なスケジュールに基づいて、かつ適切な期間にわたって、単一用量治療、複数用量治療、または連続的に注入され得る。さらに、配列は、治療薬の投与前に、その投与と同時に、またはその投与後に投与され得る。
【００７９】
化学療法剤と組み合わせた配列は、化学療法剤の抗腫瘍性効果を増強するのに有効な量で、癌を有する動物に投与される。好ましくは、一回用量につき投与される治療薬の量は、約０．００１〜１０００ｍｇ／ｍ2または約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｍ2または約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｍ2または約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与される特定の配列および特定の治療薬、一回用量についての量、用量スケジュールおよび投与経路は、当業者に既知の方法を用いて、実行者により決定されるべきであり、癌の型、癌の重度、癌の位置、ならびにレシピエントの大きさ、重さおよび物理的状態のような他の臨床因子に依存するであろう。さらに、in vitroアッセイは、配列投与ならびに配列および治療薬投与のための最適範囲を同定する助けのために任意に用いてもよい。
【００８０】
以下の仮説によって拘束されることを望まないものであるが、本発明の配列は、構造の新たなファミリーを形成し、それらはアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、三重らせん体形成ＤＮＡ、テロメラーゼ抑制剤、転写活性化因子または転写抑制剤として機能しないと思われる。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を、本発明をさらに説明するのに役立つであろうが、その際に、本発明のいかなる限定をも構成しない。反対に、様々な他の実施形態、変更およびそれらの均等物に対する方策がなされてもよく、本明細書中の説明を読んだ後に、これらが、本発明の精神から逸脱することなく当業者に示唆されるであろうことは明らかに理解されるべきである。
【００８２】
実施例１
配列の調製
ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列は、ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）８９００自動化ＤＮＡ合成システム(PersSeptive Biosystems, Inc., Farminghan, MA)を用いて、HUKABEL Scientific Ltd, (Montreal, Quebec, Canada)により、およびAbacus Segmented合成技術を用いて、Sigma-Genosys(Woodlands, TX)により調製された。別記しない限りは、使用する配列は、ホスホジエステル配列であった。別記しない限りは、使用する直前に、高圧滅菌した脱イオン水、または生理食塩水のような（しかし、それに限定されない）高圧滅菌した薬学的に許容可能な緩衝液中に、配列を分散した。
【００８３】
実施例２
細胞および試薬
すべての細胞系は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から得られ、ＡＴＣＣが推奨する培地中で培養した。表１は、細胞系、それらの由来、およびそれらの特性を示す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
細胞を、６（１ｍｌ／ウェル）、２４（０．５ｍｌ／ウェル）または９６（０．１ｍｌ／ウェル）ウェルの平底マイクロプレートにて播種し、５％ＣＯ2雰囲気中にて３７℃で維持した。別記しない限り、２．５×１０5細胞／ｍｌを、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含有する２〜４５塩基配列０μｇ／ｍｌ（対照）および１００μｇ／ｍｌ（処理）とともに、４８時間インキュベートした。
【００８６】
実施例３
細胞増殖の測定
ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）還元(Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983)を用いて、細胞増殖を測定した。ＭＴＴは、マルチプレート分光光度計読取り装置(ELX800, Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, VT)を用いて、５７０ｎｍの波長にて測定した。
【００８７】
実施例４
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞増殖の抑制
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞は、異型多数薬剤耐性ヒト懸濁腫瘍細胞モデルである。ジャーカット細胞を、２７塩基ＧＴおよびＣＴ配列（表２）とともにインキュベートした。
【００８８】
【表２】
【００８９】
表２に示すように、ジャーカットＴ細胞増殖は、試験したＧＴ配列により抑制されたが、試験したＣＴ配列によっては抑制されなかった。
【００９０】
ジャーカットＴ細胞を、３、６、９、１２、１４、１５、１８、２１および２４塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表３）。
【００９１】
【表３】
【００９２】
表３に示すように、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列は、２１および２４塩基ＧＴ配列と同程度に効果的に、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。
【００９３】
ジャーカットＴ細胞を、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列とともにインキュベートした（表４）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
表４に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。ＧＴ配列番号２５は、増殖を６０％抑制し、ＡＧＴ配列番号４９は、増殖を４５％抑制した。ＰＨＡＲＭ／ＰＣＳ−４ソフトウェア(Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA)を用いたＧＴ配列番号２５およびＡＧＴ配列番号４９の相対効力の比較により、ＧＴ配列番号２５の効力は、ＡＧＴ配列番号４９の効力の３．４倍であることがわかった。ＡＧＴ配列番号４９ホスホロチオエートは、バーキットリンパ腫細胞において、テロメラーゼ活性を抑制し、アポトーシスを誘発することが報告されている(Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189, 1997)。
【００９６】
テロメラーゼ活性を測定するために、２×１０5個のジャーカットＴ細胞からの抽出物を、ＰＣＲテロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）(Roche, Laval, Quebec, Canada)を用いてアッセイした。１〜１００μｇ／ｍｌの濃度にて、ＧＴ配列番号２５−ホスホジエステルは、０〜１０％の抗テロメラーゼ活性を示したのに対し、ＡＧＴ配列番号４９−ホスホロチオエートは、３０〜７５％の抗テロメラーゼ活性を示した。ＧＴ配列番号２５−ホスホロチオエートおよびＧＴ配列番号４９−ホスホジエステルはいずれも、抗テロメラーゼ活性を示さなかった。
【００９７】
ジャーカットＴ細胞を、２、３、４、５、６および７塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表５）。
【００９８】
【表５】
【００９９】
表５に示すように、２、３、４、５、６および７塩基ＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。
【０１００】
実施例５
ＨＬ−６０ヒト前骨髄球白血病細胞増殖の抑制
ＨＬ−６０前骨髄球白血病細胞は、ｐ５３突然変異ヒト懸濁腫瘍モデルである。ＨＬ−６０細胞を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表６）。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
表６に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＨＬ−６０細胞増殖を抑制した。
【０１０３】
実施例６
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞増殖の抑制
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞は、カスパーゼ３陰性、エストロゲン依存性のヒト固形腫瘍モデルである。ＭＣＦ−７細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、３および６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表７）。
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
表７に示すように、６および７塩基ＧＴ配列は、ＭＣＦ−７細胞増殖を抑制した。
【０１０６】
実施例７
ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞増殖の抑制
ＰＣ−３前立腺癌細胞は、ｐ５３突然変異、アンドロゲン非依存性のヒト固形腫瘍モデルである。ＰＣ−３細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、３および６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表８）。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
表８に示すように、３および６塩基ＧＴ配列は、ＰＣ−３細胞増殖を抑制した。
【０１０９】
実施例８
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞増殖の抑制
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞は、ＴＧＦ−ベータ１受容体陰性、アンドロゲン非依存性の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＬＮＣａＰ細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表９）。
【０１１０】
【表９】
【０１１１】
表９に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＬＮＣａＰ細胞増殖を抑制した。
【０１１２】
実施例９
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞増殖の抑制
ＴＨＰ−１急性単球性白血病細胞は、ｐ５３欠損ヒト懸濁腫瘍モデルである。ＴＨＰ−１細胞（１．６×１０6細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１０）。
【０１１３】
【表１０】
【０１１４】
表１０に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞増殖を抑制した。
【０１１５】
実施例１０
ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞増殖の抑制
ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞は、ｐ５３突然変異、ｐ２１／ｗａｆ−１／Ｃｉｐ欠失の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＯＶＣＡＲ−３細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、２、６および１８塩基ＧＴ配列ならびに６塩基ＡＧＴ配列とともにインキュベートした（表１１）。
【０１１６】
【表１１】
【０１１７】
表１１に示すように、２、６および１８塩基ＧＴ配列ならびに６塩基ＡＧＴ配列は、ＯＶＣＡＲ−３細胞増殖を抑制した。
【０１１８】
実施例１１
ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞増殖の抑制
ＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌細胞は、ｐ５３突然変異、ｐ２１／ｗａｆ−１／Ｃｉｐ欠失、ｐ１５ink4B欠失、Ｐ１６ink4欠失の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＳＫ−ＯＶ−３細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、２、６および１８塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１２）。
【０１１９】
【表１２】
【０１２０】
表１２に示すように、２、６および１８塩基ＧＴ配列は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞増殖を抑制した。
【０１２１】
実施例１２
ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列による細胞増殖の抑制
１つまたはそれ以上のリン酸基上の非架橋酸素原子を、硫黄原子で置換することによる天然のホスホジエステル配列の修飾は、生物学的液体および細胞におけるエンドヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド配列の安定性を増加させることが報告されている(Crooke et al. Anticancer Drugs 6:609, 1991)。
【０１２２】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表１３）、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表１４）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表１５）を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
表１３、１４および１５に示すように、６塩基ＧＴ−ホスホジエステル配列は、６塩基ＧＴ−ホスホロチオエート配列よりも効果的に、ジャーカットＴ、ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞増殖を抑制した。
【０１２７】
実施例１３
混合ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列による細胞増殖の抑制
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表１６）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表１７）を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした。ここで、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）が、リン酸基上の非架橋原子であった。
【０１２８】
【表１６】
【０１２９】
【表１７】
【０１３０】
表１６および１７に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５の１つまたはそれ以上のリン酸基上の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換することにより、ジャーカットＴおよびＭＣＦ−７細胞増殖の抑制の著しい減少という結果を生じた。
【０１３１】
実施例１４
マウス癌細胞増殖の抑制
ＥＬ−４マウスリンパ腫Ｔ細胞は、懸濁腫瘍モデルである。ＥＬ−４マウスリンパ腫Ｔ細胞を、６、１８、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列とともにインキュベートした（表１８）。
【０１３２】
【表１８】
【０１３３】
表１８に示すように、６、１８、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列は、ＥＬ−４マウス細胞増殖を抑制しなかった。
【０１３４】
Ａ２０マウス白血病Ｂ細胞は、懸濁腫瘍モデルである。Ａ２０マウス白血病Ｂ細胞を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１９）。
【０１３５】
【表１９】
【０１３６】
表１９に示すように、６塩基ＧＴ配列は、Ａ２０マウスＢ白血病細胞増殖を抑制した。
【０１３７】
実施例１５
イヌ癌細胞増殖の抑制
Ｄ−１７イヌ骨肉腫細胞およびＣＦ−５１イヌ乳腺癌細胞は、固形腫瘍モデルである。Ｄ−１７イヌ骨肉腫細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表２０）およびＣＦ５１−イヌ乳腺癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表２１）を、６、９、１７、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列とともにインキュベートした。
【０１３８】
【表２０】
【０１３９】
【表２１】
【０１４０】
表２０および２１に示すように、６、９、１７、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列は、Ｄ−１７およびＣＦ−５１イヌ細胞増殖の両方を抑制した。
【０１４１】
実施例１６
癌細胞増殖の抑制
６塩基ＧＴ配列番号２５によるヒト、マウスおよびイヌ癌細胞増殖の抑制を表２２に要約する。
【０１４２】
【表２２】
【０１４３】
表２２に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５による増殖の抑制に対して、ヒト癌細胞は、イヌ癌細胞およびマウス癌細胞よりも感受性が高い。
【０１４４】
実施例１７
増殖の抑制に対する２つの６塩基ＧＴ配列の相乗効果
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、最適下限濃度（５．０μｇ／ｍｌ）の６塩基ＧＴ配列（表２３）とともにインキュベートした。
【０１４５】
【表２３】
【０１４６】
表２３に示すように、２つの６塩基ＧＴ配列の同時使用は、ジャーカットＴ細胞増殖の抑制に対して相乗効果があった。
【０１４７】
実施例１８
化学療法薬剤の抗腫瘍性効果の増強作用
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、５−フルオロウラシルまたはシスプラチン０、０．１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの存在下にて、１．０μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１とともにインキュベートした（表２４）。５−フルオロウラシルは、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を妨害する代謝拮抗物質である。シスプラチンは、ＤＮＡを架橋して、ＤＮＡ前駆体を阻害するアルキル化剤である。
【０１４８】
【表２４】
【０１４９】
表２４に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１は、ジャーカットＴ細胞増殖に対して、５−フルオロウラシル０．１および１．０μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強し、ＧＴ配列番号２５は、ジャーカットＴ細胞増殖に対するシスプラチン０．１および１．０μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強した。
【０１５０】
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、５−フルオロウラシルまたはタモキシフェン０、０．１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの存在下にて、１．０μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１とともにインキュベートした（表２５）。タモキシフェンは、エストロゲン拮抗物質である。
【０１５１】
【表２５】
【０１５２】
表２５に示すように、６塩基配列番号２５は、ＭＣＦ−７細胞増殖に対して、５−フルオロウラシル０．１μｇ／ｍｌおよびタモキシフェン０．１μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強した。２７塩基配列番号１は、ＭＣＦ−７細胞増殖に対する５−フルオロウラシルまたはタモキシフェンの抗腫瘍性活性を増強しなかった。
【０１５３】
実施例１９
６塩基ＧＴ配列番号２５の反復による増殖の抑制
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＧ（ＧＴ）1ＧＧ（配列番号２５）の１、２、３および４反復とともにインキュベートした（表２６）。
【０１５４】
【表２６】
【０１５５】
表２６に示すように、ジャーカットＴ細胞増殖の抑制は、６塩基ＧＴ配列番号２５を用いた場合６０％であり、１２塩基ＧＴ配列番号６８、１８塩基ＧＴ配列番号６９および２４塩基ＧＴ配列番号７０を用いた場合、減少した。６塩基ＧＴ配列番号２５の融点（Ｔｍ）は２．５℃であり、ＧＴ配列番号６８を用いた場合５６．８℃に、ＧＴ配列番号６９を用いた場合７６．３℃に、ＧＴ配列番号７０を用いた場合８６．３℃に増加した。
【０１５６】
実施例２０
バチルスカルメットゲラン（ＢＣＧ）由来配列による増殖の抑制
ＢＣＧ由来配列は、in vivoにて腫瘍成長を抑制すると報告されている(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992)。さらに、Ａ−２（配列番号７２）およびＢＣＧ Ａ−４（配列番号７４）は、ＩＭＣ細胞と予め混合して、ＣＤＦ−１マウスに注射すると、それぞれ８８％および３７％分ＩＭＣ腫瘍成長を抑制することが報告されている。
【０１５７】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、ＢＣＧ由来の４５塩基配列とともにインキュベートした（表２７）。
【０１５８】
【表２７】
【０１５９】
表２７に示すように、ＢＣＧ由来配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を２４％以下で抑制した。
【０１６０】
実施例２１
細胞周期停止の誘導
ＣＹＣＬＥＴＥＳＴ（商標）ＰＬＵＳ ＤＮＡ市販用キット(Becton Dickinson)を用いて、細胞周期段階を測定した。要するに、非イオン性界面活性剤中に細胞膜を溶解し、トリプシンを用いて細胞骨格および核タンパク質を除去して、細胞ＲＮＡをＲＮアーゼで消化して、核クロマチンをスペルミンで安定化することにより、細胞からの核を得た。ヨウ化プロピジウムを細胞核に添加して、それらの蛍光を、電子二重識別能力を装備したフローサイトメーター(FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA)にて分析した。細胞周期のＧ0／Ｇ１、初期Ｓ（ＳＥ）、中間Ｓ（ＳＭ）、後期Ｓ（ＳＬ）またはＧ2／Ｍ期における細胞の蓄積を、ＭＯＤＦＩＴ ＬＴソフトウェア(Verity Software House Inc., Topsham, MA)を用いて分析した。
【０１６１】
指数関数的に成長するジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表２８）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表２９）を、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含有する２、６、１５、１８、２７および４５塩基配列とともに、２４時間インキュベートした。細胞を収集して、遠心分離し、細胞周期段階を測定した。
【０１６２】
【表２８】
【０１６３】
表２８に示すように、ジャーカットＴ細胞において、２、６および２７塩基ＧＴ配列は、細胞周期のＳＥ期における停止を誘導し、６塩基ＣＧおよびＡＧＴ、１８塩基ＧＴおよび４５塩基ＢＣＧ−Ａ−１配列は、細胞周期のＳＭ期における停止を誘導し、６塩基ＡＧ配列は、細胞周期のＧ0／Ｇ1期における停止を誘導した。
【０１６４】
【表２９】
【０１６５】
表２９に示すように、ＭＣＦ−７細胞において、２および６塩基ＧＴ配列は、細胞周期のＳＥ期における停止を誘導し、６塩基ＡＧＴ配列および１８塩基ＧＴ配列は、細胞周期のＳＭ期における停止を誘導した。
【０１６６】
実施例２２
ＧＴ配列番号２５、ＡＣ配列番号７９およびＧＴ配列番号２５＋ＡＣ配列番号７９による細胞周期停止の誘導
【０１６７】
ジャーカットヒト細胞白血病Ｔ細胞（１×１０6細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列番号２５、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋６塩基ＡＣ配列番号７９とともに、２４時間インキュベートした。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、このオリゴヌクレオチド（１：１）を混合し、６５℃にて１０分間、加熱することによりハイブリダイズした。対照として、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、６５℃にて１０分間、加熱した（表３０）。
【０１６８】
【表３０】
【０１６９】
表３０に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、細胞周期のＳＥ期の末期における停止を誘導したのに対し、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９は、細胞周期に対する効果がなかった。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９のハイブリダイゼーションは、ＧＴ配列番号２５による細胞周期停止の誘導を無効にした。これらのデータは、効果的であるためには、本発明の配列は、一本鎖でなくてはならないことを実証している。
【０１７０】
実施例２３
アポトーシスの誘発
原形質膜ホスファチジルセリンの再分布および核マトリックスタンパク質（ＮｕＭＡ）の放出は、アポトーシスを受けている細胞の特質である(Martin et al. J. Exp. Med., 182:1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15:1042, 1993)。
【０１７１】
ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ(BD Pharmingen, San Diego, CA)を用いたフローサイトメトリーにより、アポトーシス中の原形質膜におけるホスファチジルセリンの再分布を測定した。市販用ＥＬＩＳＡキット(Oncogen/Calbiochem, Cambridge, MA)を用いて、上清へのＮｕＭＡ放出を測定した。
【０１７２】
ジャーカット白血病Ｔ細胞を、３、４、５、６および７ＧＴ塩基配列、５塩基ＡＣＧＴ配列、６塩基ＡＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列、ならびに７塩基ＧＧ配列５０μＭとともにインキュベートした。表３１は、アポトーシス（ホスファチジルセリン／アネキシンＶ染色（ＰＳ／Ａ−Ｖ）に関して陽性）の状態にある細胞％および細胞から放出されるＮｕＭＡ％を示す。
【０１７３】
【表３１】
【０１７４】
表３１に示すように、３、４、５および６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＡＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発した。５塩基ＡＣＧＴおよび６塩基ＣＧＴおよびＧＧ配列は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発しなかった。
【０１７５】
実施例２４
細胞内カルシウム（Ｃａ2+）iの増加
細胞内カルシウム（Ｃａ2+）iの増加は、アポトーシス誘発に関連があることが報告されている(Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993)。（Ｃａ2+）iは、蛍光プローブＦｌｕｏ−３−ＡＭ(Cell Permaant, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)を用いて追跡される。Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ蛍光の増加は、（Ｃａ2+）iの増加を示す。
【０１７６】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともに、２４時間インキュベートした。遠心分離により、細胞を収集し、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に懸濁させ、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ １０μＭとともに、３７℃にて１時間負荷した。４８８ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光（ＦＬ１検出器）にて、細胞蛍光を測定した。プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴ(Becton Dickinson)を用いて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲにてデータを分析した。
【０１７７】
図１に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５とともにジャーカットＴ細胞をインキュベーションすることにより、細胞蛍光の８８％増加をもたらし、（ＣＡ2+）iの増加を示した。
【０１７８】
実施例２５
アポトーシスの誘発
アポトーシスは、Ｆａｓ（ＣＤ９５）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むが、これらに限定されない細胞表面受容体に結合するリガンドによって開始され得る。ＦａｓリガンドへのＦａｓ結合、およびＴＮＦ受容体１へのＴＮＦ結合が、細胞内シグナル伝達を開始し、結果としてシステインアスパルチルプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化を生じる。カスパーゼは、核ＤＮＡ断片化、核マトリックスタンパク質（ＮｕＭＡ）の放出および細胞基質接触の損失に関連したアポトーシス実行の致死的タンパク質分解カスケードを開始する。
【０１７９】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（１×１０6／ｍｌ）を、６および２７ＧＴ塩基配列とともにインキュベートした（表３２）。ＮｕＭＡは、実施例２３と同様に測定した。
【０１８０】
【表３２】
【０１８１】
表３２に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５を用いた場合のＮｕＭＡ放出％は、２７塩基ＧＴ配列番号１、２、３および４を用いた場合のＮｕＭＡ放出％よりも多かった。
【０１８２】
実施例２６
６塩基ＧＴ配列番号２５および６塩基ＡＣ配列番号７９によるアポトーシスの誘発
ジャーカットヒト細胞白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋６塩基ＡＣ配列番号７９とともに、２４時間インキュベートした。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、この配列（１：１）を混合し、６５℃にて１０分間、加熱することによりハイブリダイズする。対照として、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、６５℃にて１０分間、加熱した（表３３）。アポトーシスは、実施例２３と同様に評価した。
【０１８３】
【表３３】
【０１８４】
表３３に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発したのに対し、相補的ＡＣ配列番号７９は、アポトーシスに対する効果がなかった。さらに、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９のハイブリダイゼーションは、ＧＴ配列番号２５のアポトーシス誘発を無効にした。これらのデータは、効果的であるためには、本発明の配列は、一本鎖でなくてはならないことを実証する。
【０１８５】
実施例２７
チモテ菌(Mycobacterium phlei)由来のＧＴリッチおよびＡＣリッチな配列による、増殖の抑制、細胞周期停止およびアポトーシスの誘発
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、チモテ菌のｍｕｒＡ遺伝子(ジーンバンク：アクセッション番号Ｘ９９７７６）由来のＧＴリッチまたはＡＣリッチな配列とともにインキュベートした。増殖の抑制は、実施例３と同様に、ＭＴＴの還元により測定し、細胞周期停止は、実施例２１と同様に、ヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーにより検出し、アポトーシスは、実施例２３と同様に、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリーにより評価した。
【０１８６】
【表３４】
【０１８７】
表３４に示すように、ＧＴリッチな配列番号８１、８２および８３は、ジャーカットＴ細胞の増殖を抑制し、この細胞にて細胞周期停止を誘導し、この細胞のアポトーシスを誘発したのに対し、ＡＣリッチな配列番号１５は、ジャーカットＴ細胞の増殖を抑制せず、この細胞にて細胞周期停止も誘導せず、また、この細胞のアポトーシスをも誘発しなかった。
【０１８８】
実施例２８
ＧＴ配列によるカスパーゼ活性化の調節
カスパーゼは、３つの主要なペプチド基質配列：１）Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＹＶＡＤ、カスパーゼ−１、−４および−５）（配列番号８４）、２）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ、カスパーゼ−２、−３および−７）（配列番号８５）および３）Ｉｌｅ−（Ｌｅｕ）−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｉ（Ｌ）ＥＸＤ、カスパーゼ−８および−１０）（配列番号８６）を認識する(Thornberry et al. J. Biol. Chem. 272:17907, 1997)。タンパク質標的における配列認識は、第１の例：カスパーゼ３によるカスパーゼ７の調節と同様に、または第２の例：ラミンを含むが、これらに限定されない構造タンパク質標的の分解と同様に、または第３の例：ＰＡＲＰを含むが、これらに限定されない酵素の活性化と同様に、標的の限られた、かつ特異的なタンパク質分解という結果を生じる。
【０１８９】
ＮＨ2−ＸＸＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴ配列構築物は、５’−Ｃ2アミドスペーサーアームを用いて合成したオリゴヌクレオチド、および標準アミド−カルボキシル水溶性カルボヘキシイミド結合法(Guy et al. J. Chromatography. B. Biomed. Sci. Appl. 706:149, 1998)を用いて、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８４）、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８５）およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８７）からなる群から選択される化学的に保護されたペプチドへの、化学的に保護されたＧＴ配列または化学的に保護されたＡＣ配列の化学結合により生成される。反応性カルボキシレートおよび反応性アミン基は、結合後に脱保護される。
【０１９０】
ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯＯ−ＧＴ、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯＯ−ＧＴ、およびＮＨ2−Ｉ（Ｌ）ＥＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴを含むが、これらに限定されないペプチド−ＧＴ（以降、ＰＧＴ）配列構築物は、カスパーゼ、癌転移関連酵素、コラゲナーゼおよびメタロプロテイナーゼを含むが、これらに限定されない酵素により、ＤおよびＧＴ配列間のカルボキシレート官能基にて切断される。かかる切断により、ＰＧＴからカスパーゼ活性化ＧＴ配列の放出が生じる。その結果得られる細胞内カスパーゼ活性の増加は、例えば、複数薬剤耐性癌細胞における化学療法剤の治療上の効果または弱い抗原性刺激に対する免疫応答を高める。
【０１９１】
カスパーゼ活性化を測定するために、対照および処理細胞を洗浄し、固定し、透過化処理し、製造者が推奨する条件を用いてカスパーゼの活性体を認識するＦＩＴＣ−結合抗体(Pharmingen, San Diego, CA)とともにインキュベートした。活性カスパーゼ３と関連する蛍光は、プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴ(Becton Dickinson)を用いて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲにてフローサイトメトリーにより分析する。あるいは、カスパーゼ活性化は、着色レポーター分子ｐ−ニトロアニリドに結合したカスパーゼ特異的ペプチドの切断に基づくアッセイを用いて、比色的に測定するが、それは４０５ｎｍの波長にて分光光度的に定量することができる。
【０１９２】
実施例２９
ＧＴ配列番号６６、８１、８２および８３、ならびにＡＧＣ配列番号６７によるカスパーゼ３の活性化
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、３３塩基ＧＴ配列番号６６、１１塩基ＧＴ配列番号８１（ＧＴ配列番号６６の塩基１〜１１）、１１塩基ＧＴ配列番号８２（ＧＴ配列番号６６の塩基１２〜２２）、１１塩基ＧＴ配列番号８３（ＧＴ配列番号６６の塩基２３〜３３）、および１５塩基ＡＣＧ配列番号６７とともに、７２時間インキュベートした。活性カスパーゼ３（１７〜２２ｋＤａ）は、実施例２８と同様に、ＦＩＴＣ結合抗体（クローン：Ｃ９２−６０５）を用いて測定した。
【０１９３】
図２Ａに示すように、３３塩基ＧＴ配列番号６６および１１塩基ＧＴ配列番号８１、８２および８３各々は、不活性プロカスパーゼ３の活性カスパーゼ３へのプロセシングを誘発したのに対し、１５塩基ＡＣＧ配列番号６７は、不活性プロカスパーゼ３の活性カスパーゼ３へのプロセシングを誘発しなかった。
【０１９４】
カスパーゼ３活性化はまた、実施例２８と同様に、比色的に測定した。図２Ｂに示すように、３３塩基ＧＴ配列番号６６および１１塩基ＧＴ配列番号８１、８２および８３処理細胞におけるカスパーゼ３活性化は、対象細胞における活性化よりも、１０５％、７７％、１００％および６０％高いのに対して、１５塩基ＡＣＧ配列番号６７処理細胞では、カスパーゼ３活性化は、対照細胞とほぼ同じであった。
【０１９５】
実施例３０
６塩基ＧＴ配列番号２５によるカスパーゼ３活性の活性化
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、６塩基ＧＴ配列番号とともに、７２時間インキュベートした。カスパーゼ３活性化は、実施例２８と同様に、比色的に測定した。図３Ａに示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５処理細胞におけるカスパーゼ３活性化は、対照細胞における活性化よりも３２３％高かった。
【０１９６】
実施例３１
ＧＴ配列番号２５によるカスパーゼ−７の活性化およびＰＡＲＰ切断
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともに、７２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオトレイトール、１．５ｎＭアプロチニン、１０ｍＭロイペプチンおよび２．５μｍオルトバナジン酸ナトリウムを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、を用いて溶解させて、溶解産物のタンパク質含有量を測定した(Bradford J. Anal. Biochem. 72:248, 1976)。
【０１９７】
活性化されたカスパーゼ７およびＰＡＲＰ切断は、ウェスタンブロット解析により検出された。溶解産物を、Laemmli緩衝液(Laemmli U. Nature 15:680, 1970)と混合し、振盪し、１００℃にて４分間加熱した。タンパク５０μｇを、各レーンに添加し、１０％（カスパーゼ）または１７％（ＰＡＲＰ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて、約１．５時間、１００Ｖの一定電圧で電気泳動することにより、タンパクを分離した。分離したタンパクを、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。膜のポンソーレッド染色により、均等なタンパク負荷をモニターした。
【０１９８】
１％トリス緩衝食塩水（２ｍＭトリス−ＨＣｌ、１３．７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６、および０．１％ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）（ＴＢＳＴ）＋５％脱脂粉乳を含有する緩衝液を用いて、４℃にて一晩、膜をブロックした。膜を洗浄して、マウスモノクローナルＩｇＧ抗カスパーゼ７抗体(Pharmingen)（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中にて１：１０００希釈）またはマウスモノクローナルＩｇＧ抗ＰＡＲＰ抗体（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中にて１：１０００希釈）(Pharmingen)とともに、室温にて１時間インキュベートした。カスパーゼ７またはＰＡＲＰに結合したＩｇＧを、ホースラディッシュペルオキシダ−ゼに結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＴＢＳＴ＋５％脱脂粉乳中にて１：１０００希釈）(Parmingen)を用いて検出した。ブロットは、強化化学発光検出システム(ELC, Amersham, Corp., Amersham, UK)を用いて発色させた。
【０１９９】
図３Ｂに示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、不活性プロカスパーゼ（３０ｋＤa）の活性カスパーゼ７（１９〜２０ｋＤａ）へのプロセシング、および活性ＰＡＲＰの不活性８５ｋＤa分解産物へのプロセシングを誘発した。
【０２００】
実施例３２
カスパーゼ活性化の正のフィードバック増幅
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣ、ＮＨ2−ＤＶＥＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣ、およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣとともに、７２時間インキュベートした。カスパーゼ３およびカスパーゼ７活性化を測定した。
【０２０１】
ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＧＴ、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯ−ＧＴ、およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯＯ−ＧＴ各々は、活性カスパーゼ３への不活性カスパーゼ３のプロセシング、および活性カスパーゼ７への不活性カスパーゼ７のプロセシングを誘発するのに対し、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＡＣＧ、ＮＨ2−ＤＶＥＤ−ＣＯ−ＡＣＧ、およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯ−ＡＣＧは、活性カスパーゼ３への不活性カスパーゼ３のプロセシング、および活性カスパーゼ７への不活性カスパーゼ７のプロセシングを誘発しない。
【０２０２】
以下の仮説によって拘束されることを望まないものであるが、カスパーゼ含有細胞内での基本的カスパーゼ活性は、タンパク質分解／加水分解によるＮＨ2−ＸＸＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴ構築物からのカスパーゼ活性化ＧＴ配列の放出を媒介すると思われる。このことが、放出されるカスパーゼ活性化ＧＴ配列による細胞内のカスパーゼ活性の正の増幅（カスパーゼ３およびカスパーゼ７のレベル増加）という結果を生じる。
【０２０３】
実施例３３
サイトカイン産生の誘発
別記しない限り、１×１０6細胞を、各試験配列１００μｇ／ｍｌともに、５％ＣＯ2中にて３７℃で４８時間インキュベートした。サイトカインＩＬ−６，ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦ−アルファの産生を、適切な市販用ＥＬＩＳＡ(BioSource, Camarillo CA)を用いて、培養上清１００μｌ中で、ｐｇ／ｍｌにて測定した。ＩＬ−１２ＥＬＩＳＡは、ＩＬ−１２ｐ７０複合体および遊離ｐ４０サブユニットの両方を測定する。結果は、対照細胞と比較して、処理細胞によるサイトカイン産生の「倍」（×）増として表す。
【０２０４】
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、２、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−６の産生を測定した（表３５）。
【０２０５】
【表３５】
【０２０６】
表３５に示すように、２、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞のサイトカインＩＬ−６産生を増加させた。
【０２０７】
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した（表３６）。
【０２０８】
【表３６】
【０２０９】
表３６に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＧＣＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞のサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６産生を増加させた。
【０２１０】
表３７は、６塩基配列によるＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘発を要約する。
【０２１１】
【表３７】
【０２１２】
ＢＣＧ由来の配列Ａ−３（配列番号７３）、Ａ−４（配列番号７４）、Ａ−６（配列番号７５）、Ａ−７（配列番号７６）、Ｍ３（配列番号７７）およびアルファ１（配列番号７８）は、in vivoでＮＫ細胞を活性化することが報告されている(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992)。ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、４５塩基ＢＣＧ由来配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した（表３８）。
【０２１３】
【表３８】
【０２１４】
表３８に示すように、４５塩基ＢＣＧ由来配列は、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２およびＩＬ−６産生を最低限に増加させた。
【０２１５】
実施例３４
ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列によるＩＬ−１２産生の誘発
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２の産生を測定した（表３９）。
【０２１６】
【表３９】
【０２１７】
表３９に示すように、リン酸基上の非架橋酸素原子（ホスホジエステル）を硫黄原子（ホスホロチオエート）で置換することは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２産生の著しい減少という結果を生じた。
【０２１８】
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２の産生を測定した（表４０）。
【０２１９】
【表４０】
【０２２０】
表４０に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５において非架橋酸素原子（ホスホジエステル）を硫黄原子（ホスホロチオエート）で置換することは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２産生の著しい減少という結果を示した。
【０２２１】
実施例３５
ヒト末梢血単核細胞におけるサイトカイン合成の刺激
末梢血単核細胞（これ以降、「ＰＢＭＣ」）は、全血の密度勾配遠心分離により、フィコール・ハイパック(Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Quebec, Canada)により、７人の健常者から単離した。ＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生を測定した。
【０２２２】
【表４１】
【０２２３】
表４１に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列は、ヒトＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を増加させた。
【０２２４】
実施例３６
チンパンジー末梢血単核細胞によるサイトカイン合成
実施例３５と同様に、４匹の健常なチンパンジーから、ＰＢＭＣを単離した。チンパンジーＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を測定した（表４２）。
【０２２５】
【表４２】
【０２２６】
表４２に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列は、チンパンジーＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１２ならびにＴＮＦ−アルファの産生を増加させた。
【０２２７】
実施例３７
アカゲザル末梢血単核細胞によるサイトカイン合成
実施例３５と同様に、４匹の健常なアカゲザルから、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を測定した（表４３）。
【０２２８】
【表４３】
【０２２９】
表４３に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列は、アカゲザルＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を増加させた。
【０２３０】
実施例３８
ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍に対する６塩基ＧＴ配列番号２５＋５−フルオロウラシル、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋タモキシフェンの６塩基ＧＴ配列番号２５の効果
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、雌ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに、異種移植片として皮下に移植する。マウスを、１０匹のマウスの６群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５を与え、群３マウスには、５−フルオロウラシルを与え、群４マウスには、タモキシフェンを与え、群５マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５＋５−フルオロウラシルを与え、群６マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５＋タモキシフェンを与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大きな腫瘍サイズを有し、群２、３および４マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有し、群５および６マウスは、群１、２、３および４マウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。
【０２３１】
実施例３９
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌腫瘍に対する３および６塩基ＧＴ配列ならびに４５塩基ＢＣＧ Ａ−３配列の効果
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞を、雄ヌードｎｕ／ｎｕマウスに、異種移植片として皮下に移植する。マウスを、１０匹の５群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、３塩基配列番号８を与え、群３マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５を与え、群４マウスには、６塩基ＡＧ配列番号４５を与え、群５マウスには、４５塩基ＢＣＧ Ａ−３配列番号６９を与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大きな腫瘍サイズを有し、群５マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有し、群２、３および４マウスは、群１および５マウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。
【０２３２】
実施例４１
ＥＬ−４マウスＴリンパ腫に対する３、６、８および２７塩基の効果
ＥＬ−４マウスＴリンパ腫細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに移植する。マウスを、１０匹の６群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、３塩基ＧＴ配列番号８を与え、群３マウスには、６塩基配列番号２５を与え、群４マウスには、６塩基ＡＧ配列番号４５を与え、群５マウスには、１８塩基ＧＴ配列番号１８を与え、群６マウスには、２７塩基ＧＴ配列番号１を与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大きな腫瘍サイズを有し、群２、３、４、５および６マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。
【０２３３】
実施例４２
ヒト結腸癌細胞系を、付着細胞培養物として維持する。指数関数的成長相における細胞を、０μｇ／ｍｌ〜１００μｌ／ｍｌの用量範囲にて、２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で２４〜７２時間処理する。細胞増殖の抑制をＭＴＴ還元により測定し、細胞周期停止をフローサイトメトリーにより測定し、アポトーシスをアネキシン−Ｖ結合またはＮｕＭＡ放出により測定する。ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列は、結腸癌細胞系において、増殖を抑制し、細胞周期停止を誘導し、アポトーシスを誘発する。
【０２３４】
皮下ヒト結腸直腸癌細胞系を有するＳＣＩＤマウスを、生理食塩水、あるいはin vitroでヒト結腸直腸癌細胞系に対して抗癌活性を有する２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で処理する。in vitroでヒト結腸直腸癌細胞系に対して抗癌活性を有する２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で処理したマウスは、生理食塩水で処理したマウスと比較して、腫瘍サイズの有意な減少を示す。
【０２３５】
本発明について、それらの特定の実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな改変および変更がなされ得ることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートしたジャーカットヒトＴ白血病細胞の蛍光［Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ］。
【図２】細胞計算的に（Ａ）および比色的に（Ｂ）測定した０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのＧＴ配列番号６６、６７、８１、８２および８３なしでインキュベートしたジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞におけるカスパーゼ３の活性化。
【図３】ジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞におけるカスパーゼの活性化。（Ａ）０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした細胞におけるカスパーゼ３の活性化、（Ｂ）０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした細胞におけるカスパーゼ７の活性化（ａ）およびＰＡＲＰ内容物（ｂ）。
【配列表】
［発明の分野］
本発明は、癌治療用オリゴヌクレオチド組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
癌は、異型細胞の異所性網状蓄積であり、過剰な増殖、細胞死の不全、またはその２つの組合せの結果生じ得る。
【０００３】
増殖は、結果として１つの細胞を２つの細胞に分割する細胞周期による細胞進行の極致である。細胞周期の５つの主要な期は、Ｇ0、Ｇ1、Ｓ、Ｇ2およびＭである。Ｇ0期中、細胞は静止状態である。体内のほとんどの細胞が、常にこの段階にある。Ｇ1期中、細胞は、分裂するためのシグナルに応答し、ＲＮＡおよび、ＤＮＡ合成に必要なタンパク質を産生する。Ｓ期（ＳＥ：初期Ｓ期、ＳＭ：中間Ｓ期、およびＳＬ：後期Ｓ期）中、細胞は、それらのＤＮＡを複製する。Ｇ2期中、タンパク質が、細胞分裂のために合成される。分裂（Ｍ）期中、細胞は、２つの娘細胞に分裂する。細胞周期進行における変化が、すべての癌で起こり、遺伝子の過剰発現、調節遺伝子の突然変異、またはＤＮＡ損傷チェックポイントの抑止の結果起こり得る(Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8: 903, 1997)。
【０００４】
癌細胞と異なり、たいていの正常細胞は、細胞老化と呼ばれる過程により、無限に増殖することはできない。細胞老化は、細胞の成長停止を引き起こすプログラム細胞死応答である(Dimri et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:20, 1995)。ＤＮＡ損傷、結腸癌、乳癌および卵巣癌細胞のトポイソメラーゼ阻害剤への曝露、ならびに鼻咽頭癌細胞のシスプラチンへの曝露は、老化の誘発によりこれらの細胞増殖を防止することが報告されている(Wang et al. Cancer Res. 58:5109, 1998; Poele et al. Br. J. Cancer 80:9, 1999)。
【０００５】
合成オリゴヌクレオチドは、細胞中にインターナライズされるポリアニオン性配列である(Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994)。核酸に(Wagner, R. Nature: 372:333, 1994)、特定の細胞タンパク質に(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999)に、および特定の核タンパク質(Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)に、選択的に結合して癌細胞の増殖を抑制する合成オリゴヌクレオチドが報告されている。
【０００６】
グアニン（Ｇ）および可変量のチミン（Ｔ）を含有する合成２７塩基配列（オリゴヌクレオチドＧＴｎ）（ここで、ｎは、１以上または７以下であり、塩基数は、２０以上である）(Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)は、４５ｋＤａの核タンパク質に特異的に結合する配列によって癌細胞系の成長を抑制することが報告されているのに対し、ＧＴｎ（ここで、塩基数は２０以下である）は、癌細胞系に対して不活性であることが報告されている(Morassuitti et al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999)。３’アミノアルキル修飾を有する１５および２９塩基の２つのＧＴリッチな合成オリゴヌクレオチドは、ヌクレオリンに結合するＧ四分子を形成し、癌細胞系の増殖を抑制することが報告されている(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999)。哺乳動物テロメア反復配列の配列と同一の配列を有する合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホロチオエートは、in vitroおよびin vivoにて、バーキットリンパ腫細胞の増殖を抑制することが報告されている(Mata et al. Toxicol. Applied Pharmacol. 144:189, 1997)。しかしながら、合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホジエステルは、抗テロメラーゼ活性を有さないことが報告されている（米国特許第５，６４３，８９０号）。
【０００７】
細胞死は、アポトーシスを促進する免疫媒介物質により、および細胞死を引き起こす経路を直接開始するアポトーシス誘発物質により達成される(Muzio et al. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997)。アポトーシスは、核クロマチンの凝集、細胞収縮、核壊変、原形質膜の小疱形成、および膜結合アポトーシス体の形成を含む特有の形態学的変化を特徴とする活性細胞死プロセスである(Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980)。アポトーシスの分子的特徴は、内因性エンドヌクレアーゼの活性化の結果としての、細胞核ＤＮＡのオリゴヌクレオソーム長断片への分解である(Wyllie A. Nature 284:555, 1980)。
【０００８】
カスパーゼ（システイン−アスパルチル−特異的プロテアーゼ）は、アポトーシスの後期段階の実行に重要な酵素として含意されてきた。カスパーゼファミリーは、少なくとも１４の関連システインアスパルチルプロテアーゼから構成される。すべてのカスパーゼは、保存ＱＡＣＸＧ（ここで、Ｘは、Ｒ、ＱまたはＧである）ペンタペプチド活性部位モチーフを含有する(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997)。多数のカスパーゼは、カスパーゼ特異的切断部位での切断後に活性化される不活性プロ酵素として(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997)、または活性化用調節分子との会合を要する不活性酵素として(Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999)合成される。
【０００９】
カスパーゼは、アポトーシスでの役割のほかに、ＢおよびＴリンパ球の活性化ならびに増殖、炎症中のサイトカイン成熟、赤血球新生中の前駆細胞の分化、ならびに水晶体線維の発達に関与する(Fadeel et al. Leukemia 14:1514, 2000)。ＢおよびＴリンパ球に関して、カスパーゼ３は、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のＣＤ４（＋）、ＣＤ８（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）およびＣＤ４５ＲＯ（＋）サブセットの活性化中にプロセシングされる(Alam et al. J. Exp. Med. 190:1879, 1999）。さらに、分裂促進因子およびインターロイキン−２によるＴリンパ球の刺激は、カスパーゼ経路の活性化およびＰＡＲＰ切断に関連する(Wilheim et al. Eur. J. Immunol. 28:891, 1998)。サイトカインに関して、カスパーゼ３活性は、活性化Ｔリンパ球によるＩＬ−２の放出に(Posmantur et al. Exp. Cell Res. 244:302, 1998)、および炎症誘発性サイトカインインターロイキン−１６のプロセシングおよび成熟に(Zhang et al. J. Biol. Chem. 273:1144, 1998)必要である。赤血球新生に関して、カスパーゼ活性化は、赤血球新生調節に関与し、赤血球前駆体の成熟に極めて重要なＧＡＴＡ−１、核調節タンパク質を調節することがわかっている(De Maria, et al. Nature 401:489, 1999)。
【００１０】
細胞溶解は、細胞の完全または部分的破壊であり、免疫系により媒介される。活性化マクロファージおよび単球は、サイトカインを含むが、それらに限定されない生理活性分子を産生する。サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−アルファが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
ＩＬ−１ベータは、細胞減少性薬剤、照射および自家骨髄移植にて薬剤を用いたin vitroでの腫瘍細胞パージングに対する骨髄細胞の感受性を減少する(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993)。
【００１２】
ＩＬ−６は、Ｂ細胞分化を誘発し、ＩｇＧ分泌を刺激し(Taga et al. J. Exp. Med. 166:967, 1987)、細胞障害性Ｔ細胞分化を誘発し(Lee et al. Vaccine 17:490, 1999)、巨核球成熟を促進し(Ishibashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8953, 1989)、癌細胞のための抗増殖因子(Mori et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 257:609, 1999; Alexandroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993: Novick et al. Cytokine 4:6, 1992)およびプロ増殖因子 (Okamoto et al. Cancer Res. 57:141, 1997; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer Res. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer Res. 2:1417, 1996)の両方として機能する。
【００１３】
ＩＬ−１０は、マウス腫瘍モデルにおけるワクチンの有効性を高め(Kauffman et al. J. Immunother. 22: 489, 1999)、また抗癌自己反応性Ｔ細胞応答を上方制御する(Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995)。
【００１４】
ＩＬ−１２は、単独で、および他のサイトカインと組み合わせて、白血球の成熟を促進し、インターフェロン−ガンマの分泌を誘発する。ＩＬ−１２は、特定の細胞溶解性Ｔリンパ球の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化ならびに抗血管新生タンパク質ＩＰ−１０およびＭｉＧの誘発を含むが、これらに限定されない抗癌活性を有することが報告されている(Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351, 1997)。
【００１５】
ＴＮＦ−アルファは、固形腫瘍の壊死をもたらし(Porter et al. Trends in Biotech. 9:158, 1991)、癌細胞をガンマ照射誘発アポトーシスに対して敏感にし(Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999)、抗悪性腫瘍剤の影響から骨髄前駆細胞を保護する(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551,1993)。
【００１６】
しかしながら、細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、アポトーシスの誘発または免疫系の刺激に関するものであろうと、ほとんどの従来技術の抗癌治療は、臨床用途に適するに至らないことが判明している。これらの治療の多くは、効果がないか、または毒性があり、かなりの不都合な副作用を有し、結果として薬物耐性または免疫感作の発生をもたらし、レシピエントを衰弱させる。
【００１７】
したがって、癌細胞にて細胞周期停止を誘導し、癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞にてカスパーゼを活性化し、癌細胞にてアポトーシスを誘発し、免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激する新規組成物および方法が引き続き必要である。
【００１８】
［発明の概要］
本発明は、（ＧxＴy）n、（ＴyＧx）n、ａ（ＧxＴy）n、ａ（ＴyＧx）n、（ＧxＴy）nｂ、（ＴyＧx）nｂ、ａ（ＧxＴy）nｂ、ａ（ＴyＧx）nｂ（ここで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（これ以降、「配列」）を含む組成物および方法であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発する組成物および方法を提供することにより、この要求を満たす。
【００１９】
配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、癌を有する、ヒトを含む動物に、上記動物において癌を治療するのに有効な量で投与される。癌細胞において細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、カスパーゼを活性化する、およびアポトーシスを誘発する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激する、配列の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療技術における長い間切実に感じられてきた満たされてない要求に対処するものであり、ヒトを含む動物のために重要な有益性を提供する。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、ヒトを含む動物において、疾患を治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、癌を治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、細胞において老化を誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、細胞において細胞周期停止を誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、癌細胞において細胞周期停止を誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、癌細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、細胞においてアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、癌細胞においてアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、癌細胞においてＦａｓ非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、癌細胞においてＴＮＦＲ１非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ５３／ｐ２１非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ２１／ｗａｆ−１／ＣＩＰ非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ１５ink4B非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ１６ink4非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、癌細胞においてカスパーゼ３非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３６】
本発明の別の目的は、癌細胞においてＴＧＦ−ベータ１受容体非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、癌細胞においてホルモン依存性に非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、癌細胞において薬剤耐性に非依存的にアポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、細胞においてカスパーゼを活性化する組成物および方法を提供することである。
【００４０】
本発明の別の目的は、癌細胞においてカスパーゼを活性化する組成物および方法を提供することである。
【００４１】
本発明の別の目的は、自己免疫疾患を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４２】
本発明の別の目的は、リンパ球増殖疾患を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、感染を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４４】
本発明の別の目的は、炎症を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４５】
本発明の別の目的は、ＴまたはＢ細胞活性化を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４６】
本発明の別の目的は、前駆細胞成熟を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４７】
本発明の別の目的は、赤血球新生を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４８】
本発明の別の目的は、細胞における転写因子を調節するための組成物および方法を提供することである。
【００４９】
本発明の別の目的は、細胞に対する他の治療薬の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００５０】
本発明の別の目的は、癌細胞に対する化学療法剤の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００５１】
本発明の別の目的は、照射の抗腫瘍性効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００５２】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるサイトカイン産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５３】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１ベータ産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５４】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−６産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５５】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１０産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５６】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１２産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５７】
本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＴＮＦ−α産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００５８】
本発明の別の目的は、調製するのが容易である組成物を提供することである。
【００５９】
本発明の別の目的は、レシピエントにとって最小限の毒性である組成物を提供することである。
【００６０】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下に開示される実施形態の詳細な説明および上記特許請求の範囲を読んだ後に明らかになるであろう。
【００６１】
［発明の詳細な説明］
本発明は、（ＧxＴy）n、（ＴyＧx）n、ａ（ＧxＴy）n、ａ（ＴyＧx）n、（ＧxＴy）nｂ、（ＴyＧx）nｂ、ａ（ＧxＴy）nｂ、ａ（ＴyＧx）nｂ（ここで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（これ以降、「配列」）を含む組成物であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停止の誘発、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発する組成物を提供する。
【００６２】
配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、癌を有する、ヒトを含む動物に、ヒトを含む動物において癌を治療するのに有効な量で投与される。癌細胞において細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、アポトーシスを誘発する、およびカスパーゼを活性化する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激する、配列の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療技術において長い間切実に感じられてきた満たされてない要求に対処するものであり、ヒトを含む動物のために重要な有益性を提供する。
【００６３】
本明細書中で使用する「配列」という言葉は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ塩基を含む２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’ＯＨ合成オリゴヌクレオチドを指す。
【００６４】
本明細書中で使用する「ＧＴ」、「ＡＧ」、「ＣＧ」、「ＧＧ」、「ＡＧＴ」および「ＣＧＴ」という略語は、任意の順序で合成される指定塩基を含む配列を指す。
【００６５】
本明細書で使用する「応答」という言葉は、癌細胞における細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生の刺激を指す。
【００６６】
本明細書中で使用する「治療上の処置」および「に有効な量」という語句は、癌細胞において、細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、カスパーゼを活性化する、およびアポトーシスを誘発する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を刺激するのに有効な配列の量を指す。
【００６７】
本明細書中で使用する「懸濁(suspension)腫瘍モデル」および「固形腫瘍モデル」という語句は、原発もしくは転移性癌腫または肉腫を指す。
【００６８】
本明細書中で使用する「化学療法」という語句は、国もしくは州政府の管理機関により是認されているか、または、米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方にて列挙されている、ヒトを含む動物において癌を治療するためのいずれの薬剤を指す。
【００６９】
本明細書中で使用する「抗腫瘍性」という言葉は、癌細胞の発達、成熟、増殖または展開を防止することを指す。
【００７０】
本明細書で使用する「増強する」という言葉は、各薬剤の加法的活性よりも大きな相乗作用の程度を指す。
【００７１】
本明細書中で使用する「相乗作用」という言葉は、２つまたはそれ以上の薬剤の協調作用を指す。
【００７２】
ヒトを含む動物への、有効量の本発明の配列の投与は、癌、慢性関節リウマチ、リンパ球増殖性疾患およびぜん息を含むが、これらに限定されない疾患を防止、治療または除去する治療上の処置である。癌としては、扁平上皮癌、線維肉腫、類肉腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、およびそれら由来の転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
配列の治療上の有効性は、塩基、糖もしくはリン酸骨格を化学的に修飾すること、配列を化学的に補うか、または適切な配列を含有する細菌プラスミドを用いて配列を生物工学的に増幅すること、生物学的もしくは化学的キャリアと配列の複合体を形成すること、あるいは組織型もしくは細胞型指向性リガンドまたは抗体に配列を連結することを含むが、これらに限定されない方法により増加されてもよい。
【００７４】
１つまたはそれ以上の配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、配列および薬学的に許容可能なキャリアを均一かつ密接に会合させることにより調製される。薬学的に許容可能なキャリアとしては、液体キャリア、固体キャリアあるいはその両方が挙げられる。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キャリアあるいはその両方であり、懸濁水溶液、油性乳濁液、油中水型乳濁液、水中油中水型乳濁液、部位特異的乳濁液、長期滞留乳濁液、粘着性乳濁液、ミクロエマルションおよびナノエマルションが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリアまたはその両方であり、ウイルスベクター系、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、および配列を持続性放出することが可能な生分解性または非生分解性の天然もしくは合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアと配列の複合体を形成するのに用いる方法としては、固体キャリアの表面への直接吸着、直接的な、または結合部分を介した固体キャリアの表面への共有結合、および固体キャリアを作製するのに用いるポリマーへの共有結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、配列は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン）もしくはヒアルロン酸のような非イオン性またはイオン性ポリマーの添加により安定化され得る。
【００７５】
好ましい水性キャリアとしては、水、生理食塩水、および薬学的に許容可能な緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアとしては、鉱油および中性油、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、応答細胞に配列を呈するのに用いられる薬学的に許容可能なキャリアに関係なく、賦形剤が含まれてもよい。これらの賦形剤としては、酸化防止剤、緩衝液、および静菌薬が挙げられるが、これらに限定されず、沈殿防止剤および増粘剤も挙げることができる。
【００７６】
１つまたはそれ以上の配列は、単独で、または化学療法剤、免疫療法剤、抗菌剤、抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない他の治療上の様式と併用して、もしくは放射線治療と併用して、投与されてもよい。化学療法剤としては、代謝拮抗物質、ＤＮＡ損傷剤、微小管不安定化剤、微小管安定化剤、アクチン脱重合剤、成長抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ抑制剤、プリン抑制剤、ピリミジン抑制剤、メタロプロテイナーゼ抑制剤、ＣＤＫ抑制剤、血管新生抑制剤、および分化促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
投与経路としては、経口、局所、皮下、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内、関節内、動脈内、静脈内、皮内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、髄腔内、前立腺内、体腔内配置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕、およびエレクトロコーポレイション(electrocorporation)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
投与経路に依存して、一回用量についての容量は、好ましくは一回用量につき約０．００１〜１００ｍｌ、より好ましくは一回用量につき約０．０１〜５０ｍｌ、最も好ましくは一回用量につき約０．１〜３０ｍｌである。好ましくは、一回用量につき投与される配列量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。配列または配列および治療薬は、治療される疾患、レシピエントの状態および投与経路に適切なスケジュールに基づいて、かつ適切な期間にわたって、単一用量治療、複数用量治療、または連続的に注入され得る。さらに、配列は、治療薬の投与前に、その投与と同時に、またはその投与後に投与され得る。
【００７９】
化学療法剤と組み合わせた配列は、化学療法剤の抗腫瘍性効果を増強するのに有効な量で、癌を有する動物に投与される。好ましくは、一回用量につき投与される治療薬の量は、約０．００１〜１０００ｍｇ／ｍ2または約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｍ2または約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｍ2または約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与される特定の配列および特定の治療薬、一回用量についての量、用量スケジュールおよび投与経路は、当業者に既知の方法を用いて、実行者により決定されるべきであり、癌の型、癌の重度、癌の位置、ならびにレシピエントの大きさ、重さおよび物理的状態のような他の臨床因子に依存するであろう。さらに、in vitroアッセイは、配列投与ならびに配列および治療薬投与のための最適範囲を同定する助けのために任意に用いてもよい。
【００８０】
以下の仮説によって拘束されることを望まないものであるが、本発明の配列は、構造の新たなファミリーを形成し、それらはアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、三重らせん体形成ＤＮＡ、テロメラーゼ抑制剤、転写活性化因子または転写抑制剤として機能しないと思われる。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を、本発明をさらに説明するのに役立つであろうが、その際に、本発明のいかなる限定をも構成しない。反対に、様々な他の実施形態、変更およびそれらの均等物に対する方策がなされてもよく、本明細書中の説明を読んだ後に、これらが、本発明の精神から逸脱することなく当業者に示唆されるであろうことは明らかに理解されるべきである。
【００８２】
実施例１
配列の調製
ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列は、ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）８９００自動化ＤＮＡ合成システム(PersSeptive Biosystems, Inc., Farminghan, MA)を用いて、HUKABEL Scientific Ltd, (Montreal, Quebec, Canada)により、およびAbacus Segmented合成技術を用いて、Sigma-Genosys(Woodlands, TX)により調製された。別記しない限りは、使用する配列は、ホスホジエステル配列であった。別記しない限りは、使用する直前に、高圧滅菌した脱イオン水、または生理食塩水のような（しかし、それに限定されない）高圧滅菌した薬学的に許容可能な緩衝液中に、配列を分散した。
【００８３】
実施例２
細胞および試薬
すべての細胞系は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から得られ、ＡＴＣＣが推奨する培地中で培養した。表１は、細胞系、それらの由来、およびそれらの特性を示す。
【００８４】
【表１】
細胞を、６（１ｍｌ／ウェル）、２４（０．５ｍｌ／ウェル）または９６（０．１ｍｌ／ウェル）ウェルの平底マイクロプレートにて播種し、５％ＣＯ2雰囲気中にて３７℃で維持した。別記しない限り、２．５×１０5細胞／ｍｌを、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含有する２〜４５塩基配列０μｇ／ｍｌ（対照）および１００μｇ／ｍｌ（処理）とともに、４８時間インキュベートした。
【００８６】
実施例３
細胞増殖の測定
ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）還元(Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983)を用いて、細胞増殖を測定した。ＭＴＴは、マルチプレート分光光度計読取り装置(ELX800, Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, VT)を用いて、５７０ｎｍの波長にて測定した。
【００８７】
実施例４
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞増殖の抑制
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞は、異型多数薬剤耐性ヒト懸濁腫瘍細胞モデルである。ジャーカット細胞を、２７塩基ＧＴおよびＣＴ配列（表２）とともにインキュベートした。
【００８８】
【表２】
表２に示すように、ジャーカットＴ細胞増殖は、試験したＧＴ配列により抑制されたが、試験したＣＴ配列によっては抑制されなかった。
【００９０】
ジャーカットＴ細胞を、３、６、９、１２、１４、１５、１８、２１および２４塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表３）。
【００９１】
【表３】
表３に示すように、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列は、２１および２４塩基ＧＴ配列と同程度に効果的に、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。
【００９３】
ジャーカットＴ細胞を、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列とともにインキュベートした（表４）。
【００９４】
【表４】
表４に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。ＧＴ配列番号２５は、増殖を６０％抑制し、ＡＧＴ配列番号４９は、増殖を４５％抑制した。ＰＨＡＲＭ／ＰＣＳ−４ソフトウェア(Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA)を用いたＧＴ配列番号２５およびＡＧＴ配列番号４９の相対効力の比較により、ＧＴ配列番号２５の効力は、ＡＧＴ配列番号４９の効力の３．４倍であることがわかった。ＡＧＴ配列番号４９ホスホロチオエートは、バーキットリンパ腫細胞において、テロメラーゼ活性を抑制し、アポトーシスを誘発することが報告されている(Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189, 1997)。
【００９６】
テロメラーゼ活性を測定するために、２×１０5個のジャーカットＴ細胞からの抽出物を、ＰＣＲテロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）(Roche, Laval, Quebec, Canada)を用いてアッセイした。１〜１００μｇ／ｍｌの濃度にて、ＧＴ配列番号２５−ホスホジエステルは、０〜１０％の抗テロメラーゼ活性を示したのに対し、ＡＧＴ配列番号４９−ホスホロチオエートは、３０〜７５％の抗テロメラーゼ活性を示した。ＧＴ配列番号２５−ホスホロチオエートおよびＧＴ配列番号４９−ホスホジエステルはいずれも、抗テロメラーゼ活性を示さなかった。
【００９７】
ジャーカットＴ細胞を、２、３、４、５、６および７塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表５）。
【００９８】
【表５】
表５に示すように、２、３、４、５、６および７塩基ＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。
【０１００】
実施例５
ＨＬ−６０ヒト前骨髄球白血病細胞増殖の抑制
ＨＬ−６０前骨髄球白血病細胞は、ｐ５３突然変異ヒト懸濁腫瘍モデルである。ＨＬ−６０細胞を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表６）。
【０１０１】
【表６】
表６に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＨＬ−６０細胞増殖を抑制した。
【０１０３】
実施例６
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞増殖の抑制
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞は、カスパーゼ３陰性、エストロゲン依存性のヒト固形腫瘍モデルである。ＭＣＦ−７細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、３および６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表７）。
【０１０４】
【表７】
表７に示すように、６および７塩基ＧＴ配列は、ＭＣＦ−７細胞増殖を抑制した。
【０１０６】
実施例７
ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞増殖の抑制
ＰＣ−３前立腺癌細胞は、ｐ５３突然変異、アンドロゲン非依存性のヒト固形腫瘍モデルである。ＰＣ−３細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、３および６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表８）。
【０１０７】
【表８】
表８に示すように、３および６塩基ＧＴ配列は、ＰＣ−３細胞増殖を抑制した。
【０１０９】
実施例８
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞増殖の抑制
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞は、ＴＧＦ−ベータ１受容体陰性、アンドロゲン非依存性の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＬＮＣａＰ細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表９）。
【０１１０】
【表９】
表９に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＬＮＣａＰ細胞増殖を抑制した。
【０１１２】
実施例９
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞増殖の抑制
ＴＨＰ−１急性単球性白血病細胞は、ｐ５３欠損ヒト懸濁腫瘍モデルである。ＴＨＰ−１細胞（１．６×１０6細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１０）。
【０１１３】
【表１０】
表１０に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞増殖を抑制した。
【０１１５】
実施例１０
ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞増殖の抑制
ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞は、ｐ５３突然変異、ｐ２１／ｗａｆ−１／Ｃｉｐ欠失の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＯＶＣＡＲ−３細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、２、６および１８塩基ＧＴ配列ならびに６塩基ＡＧＴ配列とともにインキュベートした（表１１）。
【０１１６】
【表１１】
表１１に示すように、２、６および１８塩基ＧＴ配列ならびに６塩基ＡＧＴ配列は、ＯＶＣＡＲ−３細胞増殖を抑制した。
【０１１８】
実施例１１
ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞増殖の抑制
ＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌細胞は、ｐ５３突然変異、ｐ２１／ｗａｆ−１／Ｃｉｐ欠失、ｐ１５ink4B欠失、Ｐ１６ink4欠失の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＳＫ−ＯＶ−３細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、２、６および１８塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１２）。
【０１１９】
【表１２】
表１２に示すように、２、６および１８塩基ＧＴ配列は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞増殖を抑制した。
【０１２１】
実施例１２
ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列による細胞増殖の抑制
１つまたはそれ以上のリン酸基上の非架橋酸素原子を、硫黄原子で置換することによる天然のホスホジエステル配列の修飾は、生物学的液体および細胞におけるエンドヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド配列の安定性を増加させることが報告されている(Crooke et al. Anticancer Drugs 6:609, 1991)。
【０１２２】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表１３）、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表１４）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表１５）を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした。
【０１２３】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
表１３、１４および１５に示すように、６塩基ＧＴ−ホスホジエステル配列は、６塩基ＧＴ−ホスホロチオエート配列よりも効果的に、ジャーカットＴ、ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞増殖を抑制した。
【０１２７】
実施例１３
混合ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列による細胞増殖の抑制
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表１６）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表１７）を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした。ここで、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）が、リン酸基上の非架橋原子であった。
【０１２８】
【表１６】
【表１７】
表１６および１７に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５の１つまたはそれ以上のリン酸基上の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換することにより、ジャーカットＴおよびＭＣＦ−７細胞増殖の抑制の著しい減少という結果を生じた。
【０１３１】
実施例１４
マウス癌細胞増殖の抑制
ＥＬ−４マウスリンパ腫Ｔ細胞は、懸濁腫瘍モデルである。ＥＬ−４マウスリンパ腫Ｔ細胞を、６、１８、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列とともにインキュベートした（表１８）。
【０１３２】
【表１８】
表１８に示すように、６、１８、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列は、ＥＬ−４マウス細胞増殖を抑制しなかった。
【０１３４】
Ａ２０マウス白血病Ｂ細胞は、懸濁腫瘍モデルである。Ａ２０マウス白血病Ｂ細胞を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１９）。
【０１３５】
【表１９】
表１９に示すように、６塩基ＧＴ配列は、Ａ２０マウスＢ白血病細胞増殖を抑制した。
【０１３７】
実施例１５
イヌ癌細胞増殖の抑制
Ｄ−１７イヌ骨肉腫細胞およびＣＦ−５１イヌ乳腺癌細胞は、固形腫瘍モデルである。Ｄ−１７イヌ骨肉腫細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表２０）およびＣＦ５１−イヌ乳腺癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表２１）を、６、９、１７、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列とともにインキュベートした。
【０１３８】
【表２０】
【表２１】
表２０および２１に示すように、６、９、１７、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列は、Ｄ−１７およびＣＦ−５１イヌ細胞増殖の両方を抑制した。
【０１４１】
実施例１６
癌細胞増殖の抑制
６塩基ＧＴ配列番号２５によるヒト、マウスおよびイヌ癌細胞増殖の抑制を表２２に要約する。
【０１４２】
【表２２】
表２２に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５による増殖の抑制に対して、ヒト癌細胞は、イヌ癌細胞およびマウス癌細胞よりも感受性が高い。
【０１４４】
実施例１７
増殖の抑制に対する２つの６塩基ＧＴ配列の相乗効果
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、最適下限濃度（５．０μｇ／ｍｌ）の６塩基ＧＴ配列（表２３）とともにインキュベートした。
【０１４５】
【表２３】
表２３に示すように、２つの６塩基ＧＴ配列の同時使用は、ジャーカットＴ細胞増殖の抑制に対して相乗効果があった。
【０１４７】
実施例１８
化学療法薬剤の抗腫瘍性効果の増強作用
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、５−フルオロウラシルまたはシスプラチン０、０．１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの存在下にて、１．０μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１とともにインキュベートした（表２４）。５−フルオロウラシルは、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を妨害する代謝拮抗物質である。シスプラチンは、ＤＮＡを架橋して、ＤＮＡ前駆体を阻害するアルキル化剤である。
【０１４８】
【表２４】
表２４に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１は、ジャーカットＴ細胞増殖に対して、５−フルオロウラシル０．１および１．０μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強し、ＧＴ配列番号２５は、ジャーカットＴ細胞増殖に対するシスプラチン０．１および１．０μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強した。
【０１５０】
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、５−フルオロウラシルまたはタモキシフェン０、０．１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの存在下にて、１．０μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１とともにインキュベートした（表２５）。タモキシフェンは、エストロゲン拮抗物質である。
【０１５１】
【表２５】
表２５に示すように、６塩基配列番号２５は、ＭＣＦ−７細胞増殖に対して、５−フルオロウラシル０．１μｇ／ｍｌおよびタモキシフェン０．１μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強した。２７塩基配列番号１は、ＭＣＦ−７細胞増殖に対する５−フルオロウラシルまたはタモキシフェンの抗腫瘍性活性を増強しなかった。
【０１５３】
実施例１９
６塩基ＧＴ配列番号２５の反復による増殖の抑制
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＧ（ＧＴ）1ＧＧ（配列番号２５）の１、２、３および４反復とともにインキュベートした（表２６）。
【０１５４】
【表２６】
表２６に示すように、ジャーカットＴ細胞増殖の抑制は、６塩基ＧＴ配列番号２５を用いた場合６０％であり、１２塩基ＧＴ配列番号６８、１８塩基ＧＴ配列番号６９および２４塩基ＧＴ配列番号７０を用いた場合、減少した。６塩基ＧＴ配列番号２５の融点（Ｔｍ）は２．５℃であり、ＧＴ配列番号６８を用いた場合５６．８℃に、ＧＴ配列番号６９を用いた場合７６．３℃に、ＧＴ配列番号７０を用いた場合８６．３℃に増加した。
【０１５６】
実施例２０
バチルスカルメットゲラン（ＢＣＧ）由来配列による増殖の抑制
ＢＣＧ由来配列は、in vivoにて腫瘍成長を抑制すると報告されている(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992)。さらに、Ａ−２（配列番号７２）およびＢＣＧ Ａ−４（配列番号７４）は、ＩＭＣ細胞と予め混合して、ＣＤＦ−１マウスに注射すると、それぞれ８８％および３７％分ＩＭＣ腫瘍成長を抑制することが報告されている。
【０１５７】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、ＢＣＧ由来の４５塩基配列とともにインキュベートした（表２７）。
【０１５８】
【表２７】
表２７に示すように、ＢＣＧ由来配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を２４％以下で抑制した。
【０１６０】
実施例２１
細胞周期停止の誘導
ＣＹＣＬＥＴＥＳＴ（商標）ＰＬＵＳ ＤＮＡ市販用キット(Becton Dickinson)を用いて、細胞周期段階を測定した。要するに、非イオン性界面活性剤中に細胞膜を溶解し、トリプシンを用いて細胞骨格および核タンパク質を除去して、細胞ＲＮＡをＲＮアーゼで消化して、核クロマチンをスペルミンで安定化することにより、細胞からの核を得た。ヨウ化プロピジウムを細胞核に添加して、それらの蛍光を、電子二重識別能力を装備したフローサイトメーター(FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA)にて分析した。細胞周期のＧ0／Ｇ１、初期Ｓ（ＳＥ）、中間Ｓ（ＳＭ）、後期Ｓ（ＳＬ）またはＧ2／Ｍ期における細胞の蓄積を、ＭＯＤＦＩＴ ＬＴソフトウェア(Verity Software House Inc., Topsham, MA)を用いて分析した。
【０１６１】
指数関数的に成長するジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表２８）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）（表２９）を、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含有する２、６、１５、１８、２７および４５塩基配列とともに、２４時間インキュベートした。細胞を収集して、遠心分離し、細胞周期段階を測定した。
【０１６２】
【表２８】
表２８に示すように、ジャーカットＴ細胞において、２、６および２７塩基ＧＴ配列は、細胞周期のＳＥ期における停止を誘導し、６塩基ＣＧおよびＡＧＴ、１８塩基ＧＴおよび４５塩基ＢＣＧ−Ａ−１配列は、細胞周期のＳＭ期における停止を誘導し、６塩基ＡＧ配列は、細胞周期のＧ0／Ｇ1期における停止を誘導した。
【０１６４】
【表２９】
表２９に示すように、ＭＣＦ−７細胞において、２および６塩基ＧＴ配列は、細胞周期のＳＥ期における停止を誘導し、６塩基ＡＧＴ配列および１８塩基ＧＴ配列は、細胞周期のＳＭ期における停止を誘導した。
【０１６６】
実施例２２
ＧＴ配列番号２５、ＡＣ配列番号７９およびＧＴ配列番号２５＋ＡＣ配列番号７９による細胞周期停止の誘導
【０１６７】
ジャーカットヒト細胞白血病Ｔ細胞（１×１０6細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列番号２５、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋６塩基ＡＣ配列番号７９とともに、２４時間インキュベートした。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、このオリゴヌクレオチド（１：１）を混合し、６５℃にて１０分間、加熱することによりハイブリダイズした。対照として、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、６５℃にて１０分間、加熱した（表３０）。
【０１６８】
【表３０】
表３０に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、細胞周期のＳＥ期の末期における停止を誘導したのに対し、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９は、細胞周期に対する効果がなかった。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９のハイブリダイゼーションは、ＧＴ配列番号２５による細胞周期停止の誘導を無効にした。これらのデータは、効果的であるためには、本発明の配列は、一本鎖でなくてはならないことを実証している。
【０１７０】
実施例２３
アポトーシスの誘発
原形質膜ホスファチジルセリンの再分布および核マトリックスタンパク質（ＮｕＭＡ）の放出は、アポトーシスを受けている細胞の特質である(Martin et al. J. Exp. Med., 182:1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15:1042, 1993)。
【０１７１】
ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ(BD Pharmingen, San Diego, CA)を用いたフローサイトメトリーにより、アポトーシス中の原形質膜におけるホスファチジルセリンの再分布を測定した。市販用ＥＬＩＳＡキット(Oncogen/Calbiochem, Cambridge, MA)を用いて、上清へのＮｕＭＡ放出を測定した。
【０１７２】
ジャーカット白血病Ｔ細胞を、３、４、５、６および７ＧＴ塩基配列、５塩基ＡＣＧＴ配列、６塩基ＡＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列、ならびに７塩基ＧＧ配列５０μＭとともにインキュベートした。表３１は、アポトーシス（ホスファチジルセリン／アネキシンＶ染色（ＰＳ／Ａ−Ｖ）に関して陽性）の状態にある細胞％および細胞から放出されるＮｕＭＡ％を示す。
【０１７３】
【表３１】
表３１に示すように、３、４、５および６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＡＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発した。５塩基ＡＣＧＴおよび６塩基ＣＧＴおよびＧＧ配列は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発しなかった。
【０１７５】
実施例２４
細胞内カルシウム（Ｃａ2+）iの増加
細胞内カルシウム（Ｃａ2+）iの増加は、アポトーシス誘発に関連があることが報告されている(Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993)。（Ｃａ2+）iは、蛍光プローブＦｌｕｏ−３−ＡＭ(Cell Permaant, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)を用いて追跡される。Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ蛍光の増加は、（Ｃａ2+）iの増加を示す。
【０１７６】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともに、２４時間インキュベートした。遠心分離により、細胞を収集し、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に懸濁させ、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ １０μＭとともに、３７℃にて１時間負荷した。４８８ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光（ＦＬ１検出器）にて、細胞蛍光を測定した。プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴ(Becton Dickinson)を用いて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲにてデータを分析した。
【０１７７】
図１に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５とともにジャーカットＴ細胞をインキュベーションすることにより、細胞蛍光の８８％増加をもたらし、（ＣＡ2+）iの増加を示した。
【０１７８】
実施例２５
アポトーシスの誘発
アポトーシスは、Ｆａｓ（ＣＤ９５）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むが、これらに限定されない細胞表面受容体に結合するリガンドによって開始され得る。ＦａｓリガンドへのＦａｓ結合、およびＴＮＦ受容体１へのＴＮＦ結合が、細胞内シグナル伝達を開始し、結果としてシステインアスパルチルプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化を生じる。カスパーゼは、核ＤＮＡ断片化、核マトリックスタンパク質（ＮｕＭＡ）の放出および細胞基質接触の損失に関連したアポトーシス実行の致死的タンパク質分解カスケードを開始する。
【０１７９】
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（１×１０6／ｍｌ）を、６および２７ＧＴ塩基配列とともにインキュベートした（表３２）。ＮｕＭＡは、実施例２３と同様に測定した。
【０１８０】
【表３２】
表３２に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５を用いた場合のＮｕＭＡ放出％は、２７塩基ＧＴ配列番号１、２、３および４を用いた場合のＮｕＭＡ放出％よりも多かった。
【０１８２】
実施例２６
６塩基ＧＴ配列番号２５および６塩基ＡＣ配列番号７９によるアポトーシスの誘発
ジャーカットヒト細胞白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋６塩基ＡＣ配列番号７９とともに、２４時間インキュベートした。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、この配列（１：１）を混合し、６５℃にて１０分間、加熱することによりハイブリダイズする。対照として、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、６５℃にて１０分間、加熱した（表３３）。アポトーシスは、実施例２３と同様に評価した。
【０１８３】
【表３３】
表３３に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発したのに対し、相補的ＡＣ配列番号７９は、アポトーシスに対する効果がなかった。さらに、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９のハイブリダイゼーションは、ＧＴ配列番号２５のアポトーシス誘発を無効にした。これらのデータは、効果的であるためには、本発明の配列は、一本鎖でなくてはならないことを実証する。
【０１８５】
実施例２７
チモテ菌(Mycobacterium phlei)由来のＧＴリッチおよびＡＣリッチな配列による、増殖の抑制、細胞周期停止およびアポトーシスの誘発
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、チモテ菌のｍｕｒＡ遺伝子(ジーンバンク：アクセッション番号Ｘ９９７７６）由来のＧＴリッチまたはＡＣリッチな配列とともにインキュベートした。増殖の抑制は、実施例３と同様に、ＭＴＴの還元により測定し、細胞周期停止は、実施例２１と同様に、ヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーにより検出し、アポトーシスは、実施例２３と同様に、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリーにより評価した。
【０１８６】
【表３４】
表３４に示すように、ＧＴリッチな配列番号８１、８２および８３は、ジャーカットＴ細胞の増殖を抑制し、この細胞にて細胞周期停止を誘導し、この細胞のアポトーシスを誘発したのに対し、ＡＣリッチな配列番号１５は、ジャーカットＴ細胞の増殖を抑制せず、この細胞にて細胞周期停止も誘導せず、また、この細胞のアポトーシスをも誘発しなかった。
【０１８８】
実施例２８
ＧＴ配列によるカスパーゼ活性化の調節
カスパーゼは、３つの主要なペプチド基質配列：１）Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＹＶＡＤ、カスパーゼ−１、−４および−５）（配列番号８４）、２）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ、カスパーゼ−２、−３および−７）（配列番号８５）および３）Ｉｌｅ−（Ｌｅｕ）−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｉ（Ｌ）ＥＸＤ、カスパーゼ−８および−１０）（配列番号８６）を認識する(Thornberry et al. J. Biol. Chem. 272:17907, 1997)。タンパク質標的における配列認識は、第１の例：カスパーゼ３によるカスパーゼ７の調節と同様に、または第２の例：ラミンを含むが、これらに限定されない構造タンパク質標的の分解と同様に、または第３の例：ＰＡＲＰを含むが、これらに限定されない酵素の活性化と同様に、標的の限られた、かつ特異的なタンパク質分解という結果を生じる。
【０１８９】
ＮＨ2−ＸＸＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴ配列構築物は、５’−Ｃ2アミドスペーサーアームを用いて合成したオリゴヌクレオチド、および標準アミド−カルボキシル水溶性カルボヘキシイミド結合法(Guy et al. J. Chromatography. B. Biomed. Sci. Appl. 706:149, 1998)を用いて、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８４）、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８５）およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８７）からなる群から選択される化学的に保護されたペプチドへの、化学的に保護されたＧＴ配列または化学的に保護されたＡＣ配列の化学結合により生成される。反応性カルボキシレートおよび反応性アミン基は、結合後に脱保護される。
【０１９０】
ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯＯ−ＧＴ、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯＯ−ＧＴ、およびＮＨ2−Ｉ（Ｌ）ＥＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴを含むが、これらに限定されないペプチド−ＧＴ（以降、ＰＧＴ）配列構築物は、カスパーゼ、癌転移関連酵素、コラゲナーゼおよびメタロプロテイナーゼを含むが、これらに限定されない酵素により、ＤおよびＧＴ配列間のカルボキシレート官能基にて切断される。かかる切断により、ＰＧＴからカスパーゼ活性化ＧＴ配列の放出が生じる。その結果得られる細胞内カスパーゼ活性の増加は、例えば、複数薬剤耐性癌細胞における化学療法剤の治療上の効果または弱い抗原性刺激に対する免疫応答を高める。
【０１９１】
カスパーゼ活性化を測定するために、対照および処理細胞を洗浄し、固定し、透過化処理し、製造者が推奨する条件を用いてカスパーゼの活性体を認識するＦＩＴＣ−結合抗体(Pharmingen, San Diego, CA)とともにインキュベートした。活性カスパーゼ３と関連する蛍光は、プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴ(Becton Dickinson)を用いて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲにてフローサイトメトリーにより分析する。あるいは、カスパーゼ活性化は、着色レポーター分子ｐ−ニトロアニリドに結合したカスパーゼ特異的ペプチドの切断に基づくアッセイを用いて、比色的に測定するが、それは４０５ｎｍの波長にて分光光度的に定量することができる。
【０１９２】
実施例２９
ＧＴ配列番号６６、８１、８２および８３、ならびにＡＧＣ配列番号６７によるカスパーゼ３の活性化
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、３３塩基ＧＴ配列番号６６、１１塩基ＧＴ配列番号８１（ＧＴ配列番号６６の塩基１〜１１）、１１塩基ＧＴ配列番号８２（ＧＴ配列番号６６の塩基１２〜２２）、１１塩基ＧＴ配列番号８３（ＧＴ配列番号６６の塩基２３〜３３）、および１５塩基ＡＣＧ配列番号６７とともに、７２時間インキュベートした。活性カスパーゼ３（１７〜２２ｋＤａ）は、実施例２８と同様に、ＦＩＴＣ結合抗体（クローン：Ｃ９２−６０５）を用いて測定した。
【０１９３】
図２Ａに示すように、３３塩基ＧＴ配列番号６６および１１塩基ＧＴ配列番号８１、８２および８３各々は、不活性プロカスパーゼ３の活性カスパーゼ３へのプロセシングを誘発したのに対し、１５塩基ＡＣＧ配列番号６７は、不活性プロカスパーゼ３の活性カスパーゼ３へのプロセシングを誘発しなかった。
【０１９４】
カスパーゼ３活性化はまた、実施例２８と同様に、比色的に測定した。図２Ｂに示すように、３３塩基ＧＴ配列番号６６および１１塩基ＧＴ配列番号８１、８２および８３処理細胞におけるカスパーゼ３活性化は、対象細胞における活性化よりも、１０５％、７７％、１００％および６０％高いのに対して、１５塩基ＡＣＧ配列番号６７処理細胞では、カスパーゼ３活性化は、対照細胞とほぼ同じであった。
【０１９５】
実施例３０
６塩基ＧＴ配列番号２５によるカスパーゼ３活性の活性化
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、６塩基ＧＴ配列番号とともに、７２時間インキュベートした。カスパーゼ３活性化は、実施例２８と同様に、比色的に測定した。図３Ａに示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５処理細胞におけるカスパーゼ３活性化は、対照細胞における活性化よりも３２３％高かった。
【０１９６】
実施例３１
ＧＴ配列番号２５によるカスパーゼ−７の活性化およびＰＡＲＰ切断
ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともに、７２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオトレイトール、１．５ｎＭアプロチニン、１０ｍＭロイペプチンおよび２．５μｍオルトバナジン酸ナトリウムを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、を用いて溶解させて、溶解産物のタンパク質含有量を測定した(Bradford J. Anal. Biochem. 72:248, 1976)。
【０１９７】
活性化されたカスパーゼ７およびＰＡＲＰ切断は、ウェスタンブロット解析により検出された。溶解産物を、Laemmli緩衝液(Laemmli U. Nature 15:680, 1970)と混合し、振盪し、１００℃にて４分間加熱した。タンパク５０μｇを、各レーンに添加し、１０％（カスパーゼ）または１７％（ＰＡＲＰ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて、約１．５時間、１００Ｖの一定電圧で電気泳動することにより、タンパクを分離した。分離したタンパクを、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。膜のポンソーレッド染色により、均等なタンパク負荷をモニターした。
【０１９８】
１％トリス緩衝食塩水（２ｍＭトリス−ＨＣｌ、１３．７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６、および０．１％ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）（ＴＢＳＴ）＋５％脱脂粉乳を含有する緩衝液を用いて、４℃にて一晩、膜をブロックした。膜を洗浄して、マウスモノクローナルＩｇＧ抗カスパーゼ７抗体(Pharmingen)（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中にて１：１０００希釈）またはマウスモノクローナルＩｇＧ抗ＰＡＲＰ抗体（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中にて１：１０００希釈）(Pharmingen)とともに、室温にて１時間インキュベートした。カスパーゼ７またはＰＡＲＰに結合したＩｇＧを、ホースラディッシュペルオキシダ−ゼに結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＴＢＳＴ＋５％脱脂粉乳中にて１：１０００希釈）(Parmingen)を用いて検出した。ブロットは、強化化学発光検出システム(ELC, Amersham, Corp., Amersham, UK)を用いて発色させた。
【０１９９】
図３Ｂに示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、不活性プロカスパーゼ（３０ｋＤa）の活性カスパーゼ７（１９〜２０ｋＤａ）へのプロセシング、および活性ＰＡＲＰの不活性８５ｋＤa分解産物へのプロセシングを誘発した。
【０２００】
実施例３２
カスパーゼ活性化の正のフィードバック増幅
ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣ、ＮＨ2−ＤＶＥＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣ、およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣとともに、７２時間インキュベートした。カスパーゼ３およびカスパーゼ７活性化を測定した。
【０２０１】
ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＧＴ、ＮＨ2−ＤＥＶＤ−ＣＯ−ＧＴ、およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯＯ−ＧＴ各々は、活性カスパーゼ３への不活性カスパーゼ３のプロセシング、および活性カスパーゼ７への不活性カスパーゼ７のプロセシングを誘発するのに対し、ＮＨ2−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＡＣＧ、ＮＨ2−ＤＶＥＤ−ＣＯ−ＡＣＧ、およびＮＨ2−ＩＥＧＤ−ＣＯ−ＡＣＧは、活性カスパーゼ３への不活性カスパーゼ３のプロセシング、および活性カスパーゼ７への不活性カスパーゼ７のプロセシングを誘発しない。
【０２０２】
以下の仮説によって拘束されることを望まないものであるが、カスパーゼ含有細胞内での基本的カスパーゼ活性は、タンパク質分解／加水分解によるＮＨ2−ＸＸＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴ構築物からのカスパーゼ活性化ＧＴ配列の放出を媒介すると思われる。このことが、放出されるカスパーゼ活性化ＧＴ配列による細胞内のカスパーゼ活性の正の増幅（カスパーゼ３およびカスパーゼ７のレベル増加）という結果を生じる。
【０２０３】
実施例３３
サイトカイン産生の誘発
別記しない限り、１×１０6細胞を、各試験配列１００μｇ／ｍｌともに、５％ＣＯ2中にて３７℃で４８時間インキュベートした。サイトカインＩＬ−６，ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦ−アルファの産生を、適切な市販用ＥＬＩＳＡ(BioSource, Camarillo CA)を用いて、培養上清１００μｌ中で、ｐｇ／ｍｌにて測定した。ＩＬ−１２ＥＬＩＳＡは、ＩＬ−１２ｐ７０複合体および遊離ｐ４０サブユニットの両方を測定する。結果は、対照細胞と比較して、処理細胞によるサイトカイン産生の「倍」（×）増として表す。
【０２０４】
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、２、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−６の産生を測定した（表３５）。
【０２０５】
【表３５】
表３５に示すように、２、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞のサイトカインＩＬ−６産生を増加させた。
【０２０７】
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した（表３６）。
【０２０８】
【表３６】
表３６に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＧＣＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞のサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６産生を増加させた。
【０２１０】
表３７は、６塩基配列によるＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘発を要約する。
【０２１１】
【表３７】
ＢＣＧ由来の配列Ａ−３（配列番号７３）、Ａ−４（配列番号７４）、Ａ−６（配列番号７５）、Ａ−７（配列番号７６）、Ｍ３（配列番号７７）およびアルファ１（配列番号７８）は、in vivoでＮＫ細胞を活性化することが報告されている(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992)。ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、４５塩基ＢＣＧ由来配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した（表３８）。
【０２１３】
【表３８】
表３８に示すように、４５塩基ＢＣＧ由来配列は、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２およびＩＬ−６産生を最低限に増加させた。
【０２１５】
実施例３４
ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列によるＩＬ−１２産生の誘発
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２の産生を測定した（表３９）。
【０２１６】
【表３９】
表３９に示すように、リン酸基上の非架橋酸素原子（ホスホジエステル）を硫黄原子（ホスホロチオエート）で置換することは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２産生の著しい減少という結果を生じた。
【０２１８】
ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２の産生を測定した（表４０）。
【０２１９】
【表４０】
表４０に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５において非架橋酸素原子（ホスホジエステル）を硫黄原子（ホスホロチオエート）で置換することは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２産生の著しい減少という結果を示した。
【０２２１】
実施例３５
ヒト末梢血単核細胞におけるサイトカイン合成の刺激
末梢血単核細胞（これ以降、「ＰＢＭＣ」）は、全血の密度勾配遠心分離により、フィコール・ハイパック(Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Quebec, Canada)により、７人の健常者から単離した。ＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生を測定した。
【０２２２】
【表４１】
表４１に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列は、ヒトＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を増加させた。
【０２２４】
実施例３６
チンパンジー末梢血単核細胞によるサイトカイン合成
実施例３５と同様に、４匹の健常なチンパンジーから、ＰＢＭＣを単離した。チンパンジーＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を測定した（表４２）。
【０２２５】
【表４２】
表４２に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列は、チンパンジーＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１２ならびにＴＮＦ−アルファの産生を増加させた。
【０２２７】
実施例３７
アカゲザル末梢血単核細胞によるサイトカイン合成
実施例３５と同様に、４匹の健常なアカゲザルから、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を測定した（表４３）。
【０２２８】
【表４３】
表４３に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列は、アカゲザルＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を増加させた。
【０２３０】
実施例３８
ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍に対する６塩基ＧＴ配列番号２５＋５−フルオロウラシル、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋タモキシフェンの６塩基ＧＴ配列番号２５の効果
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、雌ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに、異種移植片として皮下に移植する。マウスを、１０匹のマウスの６群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５を与え、群３マウスには、５−フルオロウラシルを与え、群４マウスには、タモキシフェンを与え、群５マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５＋５−フルオロウラシルを与え、群６マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５＋タモキシフェンを与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大きな腫瘍サイズを有し、群２、３および４マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有し、群５および６マウスは、群１、２、３および４マウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。
【０２３１】
実施例３９
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌腫瘍に対する３および６塩基ＧＴ配列ならびに４５塩基ＢＣＧ Ａ−３配列の効果
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞を、雄ヌードｎｕ／ｎｕマウスに、異種移植片として皮下に移植する。マウスを、１０匹の５群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、３塩基配列番号８を与え、群３マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５を与え、群４マウスには、６塩基ＡＧ配列番号４５を与え、群５マウスには、４５塩基ＢＣＧ Ａ−３配列番号６９を与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大きな腫瘍サイズを有し、群５マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有し、群２、３および４マウスは、群１および５マウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。
【０２３２】
実施例４１
ＥＬ−４マウスＴリンパ腫に対する３、６、８および２７塩基の効果
ＥＬ−４マウスＴリンパ腫細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに移植する。マウスを、１０匹の６群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、３塩基ＧＴ配列番号８を与え、群３マウスには、６塩基配列番号２５を与え、群４マウスには、６塩基ＡＧ配列番号４５を与え、群５マウスには、１８塩基ＧＴ配列番号１８を与え、群６マウスには、２７塩基ＧＴ配列番号１を与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大きな腫瘍サイズを有し、群２、３、４、５および６マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。
【０２３３】
実施例４２
ヒト結腸癌細胞系を、付着細胞培養物として維持する。指数関数的成長相における細胞を、０μｇ／ｍｌ〜１００μｌ／ｍｌの用量範囲にて、２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で２４〜７２時間処理する。細胞増殖の抑制をＭＴＴ還元により測定し、細胞周期停止をフローサイトメトリーにより測定し、アポトーシスをアネキシン−Ｖ結合またはＮｕＭＡ放出により測定する。ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列は、結腸癌細胞系において、増殖を抑制し、細胞周期停止を誘導し、アポトーシスを誘発する。
【０２３４】
皮下ヒト結腸直腸癌細胞系を有するＳＣＩＤマウスを、生理食塩水、あるいはin vitroでヒト結腸直腸癌細胞系に対して抗癌活性を有する２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で処理する。in vitroでヒト結腸直腸癌細胞系に対して抗癌活性を有する２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で処理したマウスは、生理食塩水で処理したマウスと比較して、腫瘍サイズの有意な減少を示す。
【０２３５】
本発明について、それらの特定の実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな改変および変更がなされ得ることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートしたジャーカットヒトＴ白血病細胞の蛍光［Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ］。
【図２】細胞計算的に（Ａ）および比色的に（Ｂ）測定した０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのＧＴ配列番号６６、６７、８１、８２および８３なしでインキュベートしたジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞におけるカスパーゼ３の活性化。
【図３】ジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞におけるカスパーゼの活性化。（Ａ）０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした細胞におけるカスパーゼ３の活性化、（Ｂ）０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした細胞におけるカスパーゼ７の活性化（ａ）およびＰＡＲＰ内容物（ｂ）。
【配列表】
Claims (12)
- ３'−ＯＨ，５'−ＯＨ合成ホスホジエステルヌクレオチド配列、化学療法剤、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、癌を治療するための組成物であって、前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列は配列番号８−１０、２５、２６、４１−４３、４５及び４６からなる群から選択される、組成物。
- 前記化学療法剤は、代謝拮抗物質、アルキル化剤又はホルモン拮抗物質である、請求項１に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号８である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号９である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号１０である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号２５である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号２６である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号４１である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号４２である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号４３である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号４５である、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記合成ホスホジエステルヌクレオチド配列が配列番号４６である、請求項１又は２に記載の組成物。
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