CN100445380C - 治疗用合成寡核苷酸 - Google Patents

治疗用合成寡核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN100445380C
CN100445380C CNB008188580A CN00818858A CN100445380C CN 100445380 C CN100445380 C CN 100445380C CN B008188580 A CNB008188580 A CN B008188580A CN 00818858 A CN00818858 A CN 00818858A CN 100445380 C CN100445380 C CN 100445380C
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cell
6bases
bases
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB008188580A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1433469A (zh
Inventor
奈杰尔·C·菲利普斯
马里翁·C·菲利翁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Telesta Therapeutics Inc
Original Assignee
Bioniche Life Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioniche Life Sciences Inc filed Critical Bioniche Life Sciences Inc
Publication of CN1433469A publication Critical patent/CN1433469A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100445380C publication Critical patent/CN100445380C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Abstract

本发明提供一种包含2-20个碱基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)的组合物和方法，所述寡核苷酸选自(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是1-7的整数，n是1-12的整数，a和b是一个或多个As、Cs、Gs或Ts，其中所述序列诱导选自下列的反应：诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。

Description

治疗用合成寡核苷酸
发明领域
本发明涉及用于治疗癌症的寡核苷酸组合物。
发明背景
癌症是一种非正常细胞的异常净积聚，它主要由过度增殖、不适当的细胞死亡或二者结合所致。
增殖是通过细胞周期致使一个细胞分裂为两个细胞的细胞连续积聚。细胞周期的5个主要阶段是G0、G1、S、G2和M。在G0阶段，细胞是静止的。在任何时候，体内的大多数细胞处于该阶段。G1阶段期间，对应于分裂信号的细胞产生DNA合成所需的RNA和蛋白质。S-阶段期间(SE：早期S-阶段；SM：中期S-阶段；和SL：后期S-阶段)，细胞复制其DNA。G2阶段期间，构建蛋白质，为细胞分裂作制备。有丝分裂(M)阶段期间，细胞分裂为两个子细胞。细胞周期过程中的变化发生于所有癌症中，这种变化可由基因的过度表达、调节基因的突变或DNA损伤关卡的消失引起(Hochhauser D.，Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8：903，1997)。
与癌细胞不同，大多数正常细胞不会因为变化期的细胞衰亡而无限度地增殖。细胞衰亡是一种导致细胞生长停止的程序化细胞死亡反应(Dimri等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：20，1995)。据报道，DNA损伤，结肠、乳腺和卵巢癌细胞与拓扑异构体抑制剂的接触以及鼻咽癌细胞与顺铂的接触可通过诱导衰亡来防止这些细胞的增殖(Wang等，Cancer Res.58：5019，1998；Poele等，Br.J.Cancer 80：9，1999)。
合成寡核苷酸是在细胞中内在化的多阴离子序列(Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta 1197：95，1994)。据报道，合成寡核苷酸选择性地与核酸(Wagner，R.Nature：372：333，1994)、特异性细胞蛋白质(Bates等，J.Biol.Chem.274：26369，1999)和特异性核蛋白质结合(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252：207，1998)来抑制癌细胞的增殖。
据报道，合成的含鸟嘌呤(G)和可变数量的胸腺嘧啶(T)的27个碱基的序列(寡核苷酸GTn)，其中n 1或7并且其中碱基的数量20(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252：207，1998)通过序列与45kDa核蛋白质的特异性结合抑制癌细胞系的生长；但另据报道，其中碱基数量20的GTn对癌细胞系没有活性(Morassutti等，Nucleosides andNucleotides 18：1711，1999)。据报道，两种合成的用3’-氨基烷基修饰的15个碱基和29个碱基的富含GT的寡核苷酸形成G-四集体，该四集体与核仁蛋白结合并抑制癌细胞系的增殖(Bates等，J.Biol.Chem.274：26369，1999)。据报道，合成的6碱基TTAGGG-硫代磷酸酯在体内和体外抑制非洲淋巴瘤细胞的增殖，所述硫代磷酸酯具有与哺乳动物端粒重复序列相同的序列(Mata等，Toxicol.Applied Pharmacol.144：189，1997)。但另据报道，合成的6碱基TTAGGG-磷酸二酯不具有抗端粒酶的活性(US 5,643,890)。
细胞死亡可由促进细胞凋亡的免疫调节剂，或者由直接引发导致细胞死亡途径的凋亡诱导剂引起(Muzio等，Cell 85：817，1996；Levine，A.，Cell 88：323，1997)。细胞凋亡是一种主动的细胞死亡过程，其特征在于显著的形态学变化，这些变化包括核染质的缩聚、细胞皱缩、核破碎、原生质膜形成气泡并形成膜结合的细胞凋亡体(Wyllie等，Int.Rev.Cytol.68：251，1980)。细胞凋亡的分子标志是细胞核DNA分解为寡核小体长度的碎片，这是内源性内切核酸酶活化的结果(Wyllie A.，Nature 284：555，1980)。
半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶(Caspases)作为一种关键酶参与细胞凋亡的后期过程。半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶家族包括至少14种有关的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶。所有的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶都包含保守的QACXG(其中X是R、Q或G)五肽活性位点基元(Cohen G.，Biochim.Biophys.Acta 1366：139，1997)。许多半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶是作为无活性酶原被合成的，所述酶原在半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的特异性分解位点分解后被活化(Cohen G.，Biochim.Biophys.Acta 1366：139，1997)；或者它们作为无活性的酶被合成，这些酶需与用于活化的调节分子结合(Stennicke等，J.Biol.Chem.274：8359，1999)。
除了它们在细胞凋亡中的作用以外，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶还与B和T淋巴细胞的活化和增殖、炎症期间细胞因子的成熟、红细胞生成期间祖代细胞的分化和晶状体纤维的发育有关(Fadeel等，Leukemia 14：1514，2000)。关于B和T淋巴细胞，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3在B淋巴细胞以及CD4(+)、CD8(+)、CD45RA(+)和CD45RO(+)亚型的T淋巴细胞的活化中起作用(Alam等，J.Exp.Med.190：1879，1999)。此外，促细胞分裂剂和白介素-2对T淋巴细胞的刺激与半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶途径的活化和PARP的分解有关(Wilheim等，Eur.J.Immunol.28：891，1998)。关于细胞因子，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3活性是通过活化的T淋巴细胞释放IL-2(Posmantur等，Exp.Cell Res.244：302，1998)和促炎细胞因子白介素-16的加工和成熟所必需的(Zhang等，J.Biol.Chem.273：1144，1998)。关于红细胞生成，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的活化与红细胞生成的调节有关，据示该酶调节GATA-1，一种对于红细胞前体的成熟至关重要的核调节蛋白质(De Maria等，Nature 401：489，1999)。
细胞溶解是细胞的完全或部分破坏，它由免疫系统介导。活化的巨噬细胞和单核细胞产生包括，但不限于细胞因子的生物活性分子。细胞因子包括，但不限于白介素(IL)-1、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α。
IL-1β降低骨髓细胞对细胞减少性药物、放射和自体骨髓移植中使用药物的体外肿瘤细胞清除的敏感性(Dalmau等，Bone Marrow Transplant.12：551，1993)。
IL-6诱导B细胞分化，刺激IgG分泌(Taga等，J.Exp.Med.166：967，1987)，诱导细胞毒性T细胞分化(Lee等，Vaccine 17：490，1999)并促进巨核细胞成熟(Ishibashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8953，1989)，并且对癌细胞还具有抗增殖因子(Mori等，Biochem.Biophys.Res.Comm.257：609，1999；Alexandroff等，Biochem.Soc.Trans.25：270，1997；Takizawa等，Cancer Res.53：18，1993：Novick等，Cytokine 4：6，1992)和增殖前因子(proproliferative factor)的功能(Okamoto等，Cancer Res.57：141，1997；Okamoto等，Int.J.Cancer 72：149，1997；Chiu等，Clin.Cancer Res.2：215，1996；Lu等，Clin.Cancer Res.2：1417，1996)。
在鼠的肿瘤模型中，IL-10提高疫苗的效力(Kauffman等，J.Immunother.22：489，1999)并上调抗癌自体反应性T细胞的反应(Alleva等，Immunobiol.192：155，1995)。
IL-12单独和与其它细胞因子联合使用时，促进白细胞的成熟并诱导γ-干扰素的分泌。据报道，IL-12具有抗癌活性(Stine等，Annals NYAcademy of Science 795：420，1996；Chen等，Journal of Immunol.159：351，1997)，所述活性包括，但不限于活化特异性溶细胞性T淋巴细胞，活化天然杀伤细胞(NK)并诱导抗血管生成蛋白质IP-10和MiG。
TNF-α引起实体肿瘤的坏死(Porter等，Trends in Biotech.9：158，1991)，敏化癌细胞对γ放射引发的细胞凋亡(Kimura等，Cancer Res.59：1606，1999)并保护骨髓前体细胞，使其免受抗肿瘤剂的影响(Dalmau等，Bone Marrow Transplant.12：551，1993)。
然而，大多数现有技术的抗癌疗法，无论是涉及诱导细胞周期停滞、抑制增殖、诱导细胞凋亡，还是激发免疫系统的，都被证明不能满足临床的应用。这些疗法中的许多方法不够有效或具有毒性，具有明显的副作用，导致形成耐药性或免疫致敏，以及致患者虚弱。
因此，一直需要新的组合物和方法，所述组合物和方法能诱导癌细胞的细胞周期停滞、抑制癌细胞增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶、诱导癌细胞的细胞凋亡并刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
发明内容
本发明通过提供包含2-20个碱基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(下文称“序列”)的组合物和方法满足了这种需要，所述寡核苷酸选自(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是1-7的整数，n是1-12的整数，a和b是一个或多个As、Cs、Gs或Ts，并且其中所述序列诱导一种选自下列的反应：诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶、诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
将治疗动物癌症的有效量的包含序列和可药用载体的组合物施用于患癌症的动物，包括人。本发明的序列在下列方面具有出人意料的和令人惊奇的能力满足了医疗领域长足的未实现的需求并对动物，包括人具有重要的益处，所述方面是诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶并诱导癌细胞中细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
因此，本发明的一个目的是提供一种有效治疗动物，包括人的疾病的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种有效治疗癌症的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导细胞衰亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导细胞的细胞周期停滞的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导癌细胞的细胞周期停滞的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种抑制细胞增殖的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种抑制癌细胞增殖的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于Fas的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于TNFR1的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于p53/p21的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于p21/waf-1/CIP的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于p15ink4B的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于p16ink4的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于TGF-β1受体的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导非激素依赖性癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种诱导非耐药性癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种活化细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种活化癌细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种治疗自身免疫疾病的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种治疗淋巴细胞增殖性疾病的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种治疗感染的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种治疗炎症的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种调节T-或B-细胞活化的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种调节祖代细胞成熟的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种调节红细胞生成的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种调节细胞中转录因子的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种增强针对细胞的其它治疗剂的效果的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种增强针对癌细胞的化疗剂的效果的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种增强放射的抗肿瘤效果的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生细胞因子的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-1β的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-6的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-10的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-12的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生TNF-α的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种易于制备的组合物。
本发明的另一个目的是提供对接受者毒性最低的组合物。
在阅读了下列公开的技术方案和附录权利要求书的详细描述后，本发明的这些和其它目的、特征和优点将变得十分清晰。
附图说明
图1：用0μg/ml和100μg/ml的6碱基GT SEQ ID NO：25培养的Jurkat人T细胞白血病细胞的荧光[Fluo-3-AM]。
图2：不使用0μg/ml和100μg/ml的GT SEQ ID NOs：66、67、81、82的83培养的Jurkat人T细胞白血病细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3的活化(用细胞计数方法(A)和比色法(B)测定)。
图3：Jurkat人T细胞白血病细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的活化。(A)用0μg/ml和100μg/ml的6碱基GT SEQ ID NO：25培养的细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3的活化；(B)用0μg/ml和100μg/ml的6碱基GT SEQ ID NO：25培养的细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶7的活化(a)和PARP含量(b)。
具体实施方式
本发明提供一种包含2-20个碱基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)的组合物，所述寡核苷酸选自(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是1-7的整数，n是1-12的整数，a和b是一个或多个As、Cs、Gs或Ts，其中所述序列诱导选自下列的反应：诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
将治疗动物癌症的有效量的包含序列和可药用载体的组合物施用于患癌症的动物，包括人。本发明的序列在下列方面具有出人意料的和令人惊奇的能力满足了医疗领域长足的未实现的需求并对动物，包括人具有重要的益处，所述方面是诱导细胞周期停滞、抑制增殖、诱导细胞凋亡和活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
本发明采用的术语“序列”是指2-20个碱基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸，其中包含A、C、G和T碱基。
本发明采用的缩写“GT”、“AG”、“CG”、“GG”、“AGT”和“CGT”是指以任何顺序合成的包含指定碱基的序列。
本发明采用的术语“反应”是指诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
本发明采用的术语“治疗性治疗”和“有效量”是指有效诱导选自下列反应的量：诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
本发明采用的术语“悬浮肿瘤模型”和“实体肿瘤模型”是指原发性或继发性癌或肉瘤。
本发明采用的术语“化疗剂”是指一个国家或州政府的管理部门批准的，或者美国药典或其它通常知道的药典列出的用于治疗动物，包括人的癌症的任何药物。
本发明采用的术语“抗肿瘤”是指防止癌细胞的发育、成熟、增殖或扩散。
本发明采用的术语“增强”是指大于各种药物相加的活性的协同程度。
本发明采用的术语“协同”是指两种或多种药物协调作用。
给动物，包括人施用有效量的本发明序列是一种预防、治疗或消除疾病的治疗性治疗，所述疾病包括，但不限于癌症、类风湿关节炎、淋巴细胞增殖性疾病和哮喘。癌症包括，但不限于鳞状细胞癌、纤维肉瘤、类肉瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、骨肉瘤、皮肤黑素瘤、基底细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和由其生成的转移瘤。
序列的治疗有效性可通过不限于下列的方法得到增强：化学修饰碱基、糖或磷酸酯骨架，化学添加序列或者用包含适当序列的细菌质粒用生物技术扩增序列，将序列与生物或化学载体配合，或者将序列与组织型或细胞型定向的配体或抗体偶联。
通过使本发明的序列与可药用载体均匀、紧密地结合来制备包含一种或多种序列和可药用载体的组合物。可药用载体包括液体载体、固体载体或包括这两者。液体载体是水性载体、非水性载体或是这两者，并且包括，但不限于水性悬浮液、油性乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位置特异性乳液、长滞留乳液、粘性乳液、微乳和毫微乳。固体载体是生物载体、化学载体或是这两者，并且包括，但不限于病毒载体系统、颗粒、微粒、毫微颗粒、微球、毫微球、微泵、细菌细胞壁提取物和使序列缓释的生物降解或非生物降解的天然的或合成的聚合物。用于配合序列与固体载体的方法包括，但不限于直接吸附于固体载体的表面；直接地或者通过连接部分与固体载体的表面共价偶联；和与用于制备固体载体的聚合物共价偶联。任选地，序列可通过添加非离子或离子性聚合物，例如聚氧化乙烯脱水山梨醇一油酸酯(土温)或透明质酸来稳定。
优选的水性载体包括，但不限于水、盐水和可药用缓冲剂。优选的非水性载体包括，但不限于矿物油和中性油或其混合物。与用于使所述序列呈示于响应细胞的可药用载体无关，可任选地包括赋形剂。这些赋形剂包括，但不限于抗氧剂、缓冲剂和制菌剂，还可以包括悬浮剂和增稠剂。
可单独施用一种或多种序列，或者可将其与其它治疗形式联合施用，所述其它治疗形式包括，但不限于化疗剂、免疫治疗剂、抗菌剂、抗病毒剂或与放疗联合施用。化疗剂包括，但不限于抗代谢剂、DNA损害剂、微管破坏剂、微管稳定剂、肌动蛋白解聚剂、生长抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、嘌呤抑制剂、嘧啶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、CDK抑制剂、血管生成抑制剂和分化促进剂。
给药途径包括，但不限于口服、局部、皮下、透皮、真皮下、肌内、腹膜内、膀胱内、关节内、动脉内、静脉内、真皮内、颅内、损害部位内、肿瘤内、眼内、肺内、脊髓内、前列腺内、置入体腔、经鼻吸入、肺吸入、经皮、电介入途径。
根据给药途径，单位剂量体积优选为约0.001-100ml/剂，更优选为约0.01-50ml/剂，最优选为约0.1-30ml/剂。每剂给予的序列的量优选为约0.001-100mg/kg，更优选为约0.01-10mg/kg和最优选为约0.1-5mg/kg。本发明的序列或序列加治疗剂可以以单剂疗法、多剂疗法或在一个治疗方案中连续输注的形式给药一段时间，所述时间对于被治疗的疾病、接受治疗者的状况和给药途径而言是适宜的。此外，所述序列可以在所述治疗剂给药之前、同时或之后给予。
将有效增强化疗剂的抗肿瘤作用量的序列与化疗剂联合施用于患癌症的动物。每剂施用的治疗剂的量优选为约0.001-1000mg/m2或者约0.01-1000mg/kg，更优选约0.01-500mg/m2或者约0.01-500mg/kg并且更优选约0.1-100mg/m2或者约0.1-100mg/kg。施用的特定的序列和特定的治疗剂、每剂的量、给药方案和给药途径应由医师用本领域专业技术人员已知的方法决定，并且还应取决于癌症的类型、癌症的严重程度、癌症的位置和其它临床因素，如接受者的大小、体重和身体状况。此外，可任选地使用体外分析以帮助确定序列给药或序列加治疗剂给药的最佳范围。
虽不期望受到下列假说的限制，据认为本发明的序列形成一类新结构，并且它们不是作为反义RNAs、反义DNAs、三倍螺旋体形成的DNAs、端粒酶抑制剂、转录活化剂或转录抑制剂而起作用。
下列实施例将用于进一步举例说明本发明，而同时不对本发明构成任何限制。相反，在阅读本发明的说明书之后，对于本领域专业技术人员来说，应该清楚必需借助各种其它的实施方案、其改变的和等同的方案，在不背离本发明实质精神下来自我启发。
实施例1
序列的制备
磷酸二酯和硫代磷酸酯序列由HUKABEL Scientific Ltd(Montreal，Quebec，Canada)用EXPEDITETM 8900自动DNA合成系统(PersSeptiveBiosystems，Inc.，Farminghan，MA)和由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)用算盘分割的合成技术(Abacus Segmented Synthesis Technology)制备。除非另有说明，使用的序列是磷酸二酯序列。除非另有说明，在临用前，将序列分散到高压灭菌的去离子水或高压灭菌的药用缓冲剂中，例如，但不限于盐水。
实施例2
细胞和试剂
所有的细胞系均得自American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，MD)并且在ATCC建议的培养基中进行培养。表1显示了细胞系、它们的产地和它们的特性。
表1  细胞系
  细胞系   产地   特性
THP-1   人急性单核细胞性白血病   悬浮肿瘤模型p53无
MCF-7 人乳腺癌   实体瘤模型；非转移的；半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3-阴性的；雌激素-依赖的
JURKAT 人T细胞白血病   悬浮肿瘤模型；耐受非典型的多种药物的与p190-MRP蛋白有关
PC-3 人前列腺癌   实体肿瘤模型；转移性的p53突变的；雄激素-非依赖性的(激素不应的)
LNCaP 人前列腺癌   实体肿瘤模型；转移性的TGF-β1受体-阴性的；雄激素-依赖性的
OVCAR-3 人卵巢癌   实体肿瘤模型；转移性的p53突变的；p21/waf-1/Cip-1缺失的
SK-OV-3 人卵巢癌   实体肿瘤模型；转移性的p53缺失的；p21/waf-1/Cip缺失的；p15<sup>ink4B</sup>，p16<sup>ink4</sup>缺失的
HL-60   人早幼粒细胞白血病   悬浮肿瘤模型p53突变的
  EL-4   鼠T淋巴瘤   悬浮肿瘤模型
  A20   鼠B细胞白血病   悬浮肿瘤模型
  L-1210   鼠白血病   悬浮肿瘤模型
  D-17   犬骨肉瘤   实体肿瘤模型
  CF-51   犬乳腺癌   实体肿瘤模型
将细胞接种到6(1ml/孔)、24(0.5ml/孔)或96(0.1ml/孔)孔平底微滴板并保持在37℃下和5％CO2气氛中。除非另有说明，将2.5 X 105个细胞/ml与0μg/ml(对照)和100μg/ml(治疗的)的包含A、C、G和T的2-45个碱基的序列一起培养48小时。
实施例3
细胞增殖的测定
用二甲基噻唑-二苯基四唑翁(MTT)还原测定细胞增殖(Mosman等，J.Immunol.Methods 65：55，1983)。在570nm波长下用重叠的分光光度计阅读器(ELX800，Bio-TEK Instruments Inc.，Winooski，VT)测定MTT。
实施例4
Jurkat人白血病T细胞增殖的抑制
Jurkat人白血病T细胞是耐受非典型的多种药物的人悬浮肿瘤细胞模型。将Jurkat细胞与27碱基的GT和CT序列一起培养(表2)。
表2  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)<sub>13</sub>GSEQ ID NO：1-(27bases)   51
  GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGG-(G<sub>3</sub>T)<sub>6</sub>G<sub>3</sub>SEQ ID NO：2-(27bases)   23
  GGGGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGTGGG-(G<sub>5</sub>T)<sub>4</sub>G<sub>3</sub>SEQ ID NO：3-(27bases)   24
  GGGGGGGTGGGGGGGTGGGGGGGTGG-(G<sub>7</sub>T)<sub>3</sub>G<sub>3</sub>SEQ ID NO：4-(27bases)   11
  TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(TG)<sub>13</sub>TSEQ ID NO：5-(27bases)   45
  TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-(TC)<sub>13</sub>TSEQ ID NO：6-(27bases)   0
注：表中“bases”为“碱基”。
如表2所示，Jurkat T细胞的增殖被测试的GT序列抑制，但不被测试的CT序列抑制。
将Jurkat T细胞与3、6、9、12、14、15、18、21和24碱基的GT序列一起培养(表3)。
表3  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGT-(TG)<sub>1</sub>TSEQ ID NO：7-(3bases)   22
  GTG-(GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：8-(3bases)   46
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   36
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   48
  TGTGTGTGT-(TG)<sub>4</sub>TSEQ ID NO：11-(9bases)   45
  GTGTGTGTG-(GT)<sub>4</sub>GSEQ ID NO：12-(9bases)   47
  TGTGTGTGTGTG-(TG)<sub>6</sub>SEQ ID NO：13-(12bases)   49
  GTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>6</sub>SEQ ID NO：14-(12bases)   51
  TGTGTGTGTGTGTG-(TG)<sub>7</sub>SEQ ID NO：15-(14bases)   47
  GTGTGTGTGTGTGTG-(GT)<sub>7</sub>GSEQ ID NO：16-(15bases)   58
  TGTGTGTGTGTGTGTGTG-(TG)<sub>9</sub>SEQ ID NO：17-(18bases)   56
  GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>9</sub>SEQ ID NO：18-(18bases)   60
  TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)<sub>10</sub>TSEQ ID NO：19-(21bases)   60
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)<sub>10</sub>GSEQ ID NO：20-(21bases)   46
  TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(TG)<sub>12</sub>SEQ ID NO：21-(24bases)   54
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>12</sub>SEQ ID NO：22-(24bases)   56
注：表中“bases”为“碱基”。
如表3所示，3、6、9、12、14、15和18碱基的GT序列如同21和24碱基GT序列一样有效地抑制Jurkat T细胞增殖。
将Jurkat T细胞与6碱基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列一起培养(表4)。
表4  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   36
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   48
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   31
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   48
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   60
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   34
  AAGTAA-AA(GT)<sub>1</sub>AASEQ ID NO：27-(6bases)   13
  CCGTC<u>C-CC(GT)</u><sub><u>1</u></sub><u>CC</u>SEQ ID NO：28-(6bases)   11
TGGTTG-TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29-(6bases)   42
  ATGTAT-AT(GT)<sub>1</sub>ATSEQ ID NO：30-(6bases)   16
  AGGTGA-AG(GT)<sub>1</sub>GASEQ ID NO：31-(6bases)   10
  GAGTGA-GA(GT)<sub>1</sub>GASEQ ID NO：32-(6bases)   24
  GGGTCT-GG(GT)<sub>1</sub>CTSEQ ID NO：33-(6bases)   15
  CCGTGG-CC(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：34-(6bases)   37
  GGGTCC-GG(GT)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：35-(6bases)   20
  CTGTCT-CT(GT)<sub>1</sub>CTSEQ ID NO：36-(6bases)   19
  TCGTTC-TC(GT)<sub>1</sub>TCSEQ ID NO：37-(6bases)   20
  CGGTGC-CG(GT)<sub>1</sub>GCSEQ ID NO：38-(6bases)   16
  TTGTGG-TT(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：39-(6bases)   35
  GGGTTT-GG(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：40-(6bases)   31
  GGTTGG-GG(TT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：41-(6bases)   43
  GGAAGG-GG(AA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：42-(6bases)   22
  GGCCGG-GG(CC)GGSEQ ID NO：43-(6bases)   29
  GGGGGG-GG(GG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：44-(6bases)   26
  GGGAGG-GG(GA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：45-(6bases)   28
  GGGCGG-GG(GC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：46-(6bases)   23
  GGAGGG-GG(AG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：47-(6bases)   14
  GTGGGG-(GT)<sub>1</sub>G<sub>4</sub>SEQ ID NO：48-(6bases)   26
  TTAGGG-TT(AG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：49-(6bases)   45
注：表中“bases”为“碱基”。
如表4所示，6碱基GT序列抑制Jurkat T细胞的增殖。GT SEQ ID NO：25抑制60％增殖，AGT SEQ ID NO：49抑制45％增殖。用PHARM/PCS-4软件(Microcomputer Specialists，Philadelphia，PA)比较GT SEQ ID NO：25和AGT SEQ ID NO：49的相对效力，表明GT SEQ ID NO：25是AGTSEQ ID NO：49的效力的3.4倍。据报道，AGT SEQ ID NO：49-硫代磷酸酯抑制端粒酶的活性并诱导非洲淋巴瘤细胞的细胞凋亡(Mata等，Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189，1997)。
为测定端粒酶活性，用PCR-端粒重复扩增方法(TRAP)(Roche，Laval，Quebec，Canada)分析2 x 105个Jurkat T细胞的提取物。在1-100g/ml浓度下，GT SEQ ID NO：25-磷酸二酯表现出0-10％的抗端粒酶活性，而AGT SEQ ID NO：49-硫代磷酸酯表现出30-75％抗端粒酶活性。GT SEQ ID NO：25-硫代磷酸酯和GT SEQ ID NO：49-磷酸二酯都没有表现出任何抗端粒酶活性。
将Jurkat T细胞与2、3、4、5、6和7碱基的GT序列一起培养(表5)。
表5  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GT-(GT)<sub>1</sub>SEQ ID NO：50-(2bases)   38
  TG-(TG)<sub>1</sub>SEQ ID NO：51-(2bases)   50
  TGT-(TG)<sub>1</sub>TSEQ ID NO：7(3bases)   22
  GTG-(GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：8-(3bases)   46
  GTGG-G(TG)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：52-(4bases)   52
  TTGT-T(GT)<sub>1</sub>TSEQ ID NO：53-(4bases)   25
  GTGT-G(TG)<sub>1</sub>TSEQ ID NO：54-(4bases)   42
  TTGG-T(TG)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：55-(4bases)   44
  GGTG-G(GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：56-(4bases)   54
  TGTT-T(GT)<sub>1</sub>TSEQ ID NO：57-(4bases)   32
  GGTT-G(GT)<sub>1</sub>TSEQ ID NO：58-(4bases)   37
  TGTG-T(GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：59-(4bases)   52
  GGTGG-G(GT)<sub>1</sub>G<sub>2</sub>SEQ ID NO：60-(5bases)   50
  GGGTG-G<sub>2</sub>(GT)GSEQ ID NO：61-(5bases)   50
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   36
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   48
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   31
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   48
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   60
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   34
  TGGTTG-TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29-(6bases)   42
  GGGGTGG-G<sub>3</sub>(GT)<sub>1</sub>G<sub>2</sub>SEQ ID NO：62-(7bases)   41
  GGGTGGG-G<sub>2</sub>(GT)G<sub>3</sub>SEQ ID NO：63-(7bases)   28
  TGGGTGG-TG<sub>2</sub>(GT)<sub>1</sub>G<sub>2</sub>SEQ ID NO：64-(7bases)   55
  GGGTGGT-G<sub>2</sub>(GT)<sub>1</sub>G<sub>2</sub>TSEQ ID NO：65-(7bases)   48
注：表中“bases”为“碱基”。
如表5所示，2、3、4、5、6和7碱基的GT序列抑制Jurkat T细胞的增殖。
实施例5
HL-60人早幼粒细胞白血病细胞增殖的抑制
HL-60早幼粒细胞白血病细胞是p53突变的人悬浮肿瘤模型。将HL-60细胞与6碱基的GT序列一起培养(表6)。
表6  HL-60人早幼粒细胞白血病细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   7
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   13
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   13
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   18
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   35
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   16
注：表中“bases”为“碱基”。
如表6所示，6碱基的GT序列抑制HL-60细胞的增殖。
实施例6
MCF-7人乳腺癌细胞增殖的抑制
MCF-7人乳腺癌细胞是半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3阴性的、雌激素依赖性的人实体肿瘤模型。将MCF-7细胞(5 x 105个细胞/ml)与3和6碱基的GT序列一起培养(表7)。
表7  MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGT-(TG)TSEQ ID NO：7-(3bases)   -6
  GTG-(GT)GSEQ ID NO：8-(3bases)   18
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   6
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   31
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   7
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   41
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   41
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   20
注：表中“bases”为“碱基”。
如表7所示，6和7碱基的GT序列抑制MCF-7细胞的增殖。
实施例7
PC-3人前列腺癌细胞增殖的抑制
PC-3前列腺癌细胞是p53突变的、雄激素非依赖性的人实体肿瘤模型。将PC-3细胞(5 x 105个细胞/ml)与3和6碱基的GT序列一起培养(表8)。
表8  PC-3人前列腺癌细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGT-(TG)TSEQ ID NO：7-(3bases)   8
  GTG-(GT)GSEQ ID NO：8-(3bases)   13
  TGTGTG(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   16
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   37
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   14
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   26
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   38
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   18
注：表中“bases”为“碱基”。
如表8所示，3和6碱基的GT序列抑制PC-3细胞的增殖。
实施例8
LNCaP人前列腺癌细胞增殖的抑制
LNCaP前列腺癌细胞是TGF-β1受体阴性的、雄激素-非依赖性的、转移性人实体肿瘤模型。将LNCaP细胞(5 x 105个细胞/ml)与6碱基的GT序列一起培养(表9)。
表9  LNCaP人前列腺癌细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   -9
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   -4
  TTTGTT-TT(TG)TTSEQ ID NO：23-(6bases)   14
  GGTGGG-GG(TG)GGSEQ ID NO：24-(6bases)   17
  GGGTGG-GG(GT)GGSEQ ID NO：25-(6bases)   18
  TTGTTT-TT(GT)TTSEQ ID NO：26-(6bases)   22
注：表中“bases”为“碱基”。
如表9所示，6碱基的GT序列抑制LNCaP细胞的增殖。
实施例9
THP-1人急性单核细胞性白血病细胞增殖的抑制
THP-1急性单核细胞性白血病细胞是无p53的人悬浮肿瘤模型。将THP-1细胞(1.6 X 106个细胞/ml)与6碱基的GT序列一起培养(表10)。
表10  THP-1人急性单核细胞性白血病细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   0
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   11
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   8
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   6
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   15
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   1
注：表中“bases”为“碱基”。
如表10所示，6碱基的GT序列抑制THP-1细胞的增殖。
实施例10
OVCAR-3人卵巢癌细胞增殖的抑制
OVCAR-3卵巢癌细胞是p53突变的、p21/waf-1/Cip缺失的、转移性人实体肿瘤模型。将OVCAR-3细胞(5 x 105个细胞/ml)与2、6和18碱基的GT细胞一起培养并与6碱基的AGT序列一起培养(表11)。
表11  OVCAR-3人卵巢癌细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TG-(TG)<sub>1</sub>SEQ ID NO：51-(2bases)   23
  TTAGGG-TT(AG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：49-(6bases)   15
  GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>9</sub>SEQ ID NO：18-(18bases)   10
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   15
中“bases”为“碱基”。
如表11所示，2、6和18碱基的GT序列以及6碱基的AGT序列抑制OVCAR-3细胞的增殖。
实施例11
SK-OV-3人卵巢癌细胞增殖的抑制
SK-OV-3卵巢癌细胞是p53突变的、p21/waf-1/Cip缺失的、p15ink4B缺失的、p16ink4缺失的、转移性人实体肿瘤模型。将SK-OV-3细胞(5 x 105个细胞/ml)与2、6和18碱基的GT序列一起培养(表12)。
表12  SK-OV-3人卵巢癌细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TG-(TG)<sub>1</sub>SEQ ID NO：51-(2bases)   18
  TTAGGG-TT(AG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：49-(6bases)   11
  GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>9</sub>SEQ ID NO：18-(18bases)   6
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   12
注：表中“bases”为“碱基”。
如表12所示，2、6和18碱基的GT序列抑制SK-OV-3细胞的增殖。
实施例12
磷酸二酯和硫代磷酸酯序列对细胞增殖的抑制
据报道，通过用硫原子取代一个或多个磷酸酯基上的非桥氧原子修饰的天然磷酸二酯序列提高寡核苷酸序列在生物体液和细胞中对内切核酸酶的稳定性(Crooke等，Anticancer Drugs 6：609，1991)。
将Jurkat人白血病T细胞(表13)、LNCaP人前列腺癌细胞(5 x 105个细胞/ml)(表14)和MCF-7人乳腺癌细胞(5 x 105个细胞/ml)(表15)与具有氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)作为磷酸酯基的非桥接原子的6碱基的GT序列一起培养。
表13  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
Figure C0081885800231
表14  LNCaP人前列腺癌细胞增殖的％抑制
Figure C0081885800232
表15  MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制
Figure C0081885800241
如表13、14和15所示，6碱基的GT-磷酸二酯序列比6碱基的GT-硫代磷酸酯序列更有效地抑制Jurkat T、LNCaP和MCF-7细胞的增殖。
实施例13
混合的磷酸二酯和硫代磷酸酯序列对细胞增殖的抑制
将Jurkat人白血病T细胞(表16)和MCF-7人乳腺癌细胞(5 x 105个细胞/ml)(表17)与6碱基的GT SEQ ID NO：25一起培养，其中氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)是磷酸酯基的非桥接原子。
表16  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列*   ％抑制
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1 to 6)SEQ ID NO：25-(6bases)   60
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>T<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>s</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，2，4，5，6；sulfur atom 3)SEQ ID NO：25-(6bases)   17
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>T<sub>s</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>s</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，2，3，5，6；sulfur atom 4)SEQ ID NO：25-(6bases)   12
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，2，5，6；sulfur atom 3，4)SEQ ID NO：25-(6bases)   13
  G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>-G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>(oxygen atom 2，3，4，5；sulfur atom 1，6)SEQ ID NO：25-(6bases)   16
  G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，3，4，6；sulfur atom 2，5)SEQ ID NO：25-(6bases)   11
  G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>-G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(oxygen atom 3，4；sulfur atom1，2，5，6)SEQ ID NO：25-(6bases)   -13
  G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>-G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>)<sub>1</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(sulfur atom 1 to 6)SEQ ID NO：25-(6bases；phosphorothioate)   0
注：表中“oxygen atom”为“氧原子”；“sulfur atom”为“硫原子”；
注：表中“bases”为“碱基”。
*注：“o”代表磷酸酯基中的氧原子，“s”代表硫原子
表17  MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制
  序列*   ％抑制
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1 to 6)SEQ ID NO：25-(6bases；phosphodiester)   41
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>T<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>s</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，2，4，5，6；sulfur atom 3)SEQ ID NO：25-(6bases)   12
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>T<sub>s</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>s</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，2，3，5，6；sulfur atom 4)SEQ ID NO：25-(6bases)   0
  G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，2，5，6；sulfur atom 3，4)SEQ ID NO：25-(6bases)   43
  G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>-G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>(oxygen atom 2，3，4，5；sulfur atom 1，6)SEQ ID NO：25-(6bases)   12
  G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>-G<sub>o</sub>G<sub>s</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>(oxygen atom 1，3，4，6；sulfur atom 2，5)SEQ ID NO：25-(6bases)   13
  G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>-G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(G<sub>o</sub>T<sub>o</sub>)<sub>1</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(oxygen atom 3，4；sulfur atom 1，2，5，6)SEQ ID NO 25-(6bases)   -3
  G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>-G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>(G<sub>s</sub>T<sub>s</sub>)<sub>1</sub>G<sub>s</sub>G<sub>s</sub>；(sulfur atom 1 to 6)SEQ ID NO：25(6bases；phosphorothioate)   12
注：表中“oxygen atom”为“氧原子”；“sulfur atom”为“硫原子”；“phosphodiester”为“磷酸二酯”；“phosphorthioate”为“硫代磷酸酯”；“bases”为“碱基”。
*注：“o”代表磷酸酯基中的氧原子，“s”代表硫原子
如表16和17所示，用硫原子取代6碱基的GT SEQ ID NO：25的一个或多个磷酸酯基上的非桥接氧原子明显降低对Jurkat T和MCF-7细胞增殖的抑制作用。
实施例14
鼠癌细胞增殖的抑制
EL-4鼠淋巴瘤T细胞是一种悬浮肿瘤模型。将EL-4鼠淋巴瘤T细胞与6、18、27和33碱基的GT序列以及与15碱基的ACG序列一起培养(表18)。
表18  EL-4鼠T淋巴瘤细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   4
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases phosphorothioate)   -8
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(G<sub>1</sub>T)<sub>13</sub>GSEQ ID NO：1-(27bases)   1
  GTGTGTTTGGTGGTTTTGTTTGTTGTTTTTTTGSEQ ID NO：66-(33bases)   -1
  AACCACAAGCCCAACSEQ ID NO：67-(15bases)   -6
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   -2
  GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>9</sub>SEQ ID NO：18-(18bases)   -2
注：表中“phosphorothioate”为“硫代磷酸酯”；“bases”为“碱基”。
如表18所示，6、18、27和33碱基的GT序列以及15碱基的ACG序列不抑制EL-4鼠细胞的增殖。
A20鼠白血病B细胞是一种悬浮肿瘤模型。将A20鼠白血病B细胞与6碱基的GT序列一起培养(表19)。
表19  A20鼠B白血病细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub>SEQ ID NO：9-(6bases)   22
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(6bases)   9
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   5
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   9
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   11
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   15
注：表中“bases”为“碱基”。
如表19所示，6碱基的GT序列抑制A20鼠B白血病细胞的增殖。
实施例15
犬癌细胞增殖的抑制
D-17犬骨肉瘤细胞和CF-51犬乳腺癌细胞是实体肿瘤模型。将D-17犬骨肉瘤细胞(5 x 105个细胞/ml)(表20)和CF-51犬乳腺癌细胞(5 x 105个细胞/ml)(表21)与6、9、17、27和33碱基的GT序列并与15碱基的ACG序列一起培养。
表20  D-17犬骨肉瘤细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   18
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)<sub>13</sub>GSEQID NO：1-(27bases)   23
  GTGTGTTTGGTGGTTTTGTTTGTTGTTTTTTTGSEQ ID NO：66-(33bases)   23
  AACCACAAGCCCAACSEQ ID NO：67-(15bases)   20
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQ ID NO：10-(9bases)   15
  TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)<sub>8</sub>TSEQ ID NO：17-(17bases)   8
注：表中“bases”为“碱基”。
表21  CF-51犬乳腺癌细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ.ID NO：25-(6bases)   14
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(GT)<sub>13</sub>GSEQ ID NO：1-(27bases)   23
  GTGTGTTTGGTGGTTTTGTTTGTTGTTTTTTTGSEQ ID NO：66-(33bases)   23
  AACCACAAGCCCAACSEQ ID NO：67-(15bases)   20
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub>SEQID NO：10-(9bases)   15
  TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)<sub>8</sub>TSEQ ID NO：17-(17bases)   8
注：表中“bases”为“碱基”。
如表20和21所示，6、9、17、27和33碱基的GT序列以及15碱基的ACG序列抑制D-17和CF-51犬细胞的增殖。
实施例16
癌细胞增殖的抑制
表22概括了6碱基的GT SEQ ID NO：25对。
表22  人、鼠和犬癌细胞增殖的％抑制
  细胞   GG(GT)<sub>1</sub>GG(SEQ ID NO：25)
  人Jurkat   60
  人PC-3   38
  人MCF-7   41
  人HL-60   35
  人OVCAR-3   14
  人LNCaP   18
  人SK-OV-3   12
  人THP-1   15
  鼠EL-4   1
  鼠A20   11
  鼠L-1210   8
  犬D17   18
  犬CF-51   14
如表22所示，人癌细胞比犬癌细胞和鼠癌细胞对6碱基的GT SEQ ID NO：25产生的增殖抑制作用更敏感。
实施例17
两种6碱基的GT序列对增殖抑制的协同作用
将Jurkat人白血病T细胞与次最佳浓度(5.0g/ml)的6碱基的GT序列一起培养(表23)。
表23  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   5
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：26-(6bases)   -2
  GG(GT)<sub>1</sub>GG+TT(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25+SEQ ID NO：26   14
  TGGTTG-TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29-(6bases)   -1
  TGGTTG-TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：10-(6bases)   2
  TG(GT)<sub>1</sub>TG+TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29+SEQ ID NO：10   9
  GGTTGG-GG(TT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：41-(6bases)   4
  TTGTGG-TT(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：39-(6bases)   4
  GG(TT)<sub>1</sub>GG+<u>TT(G</u>T)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：41+SEQ ID NO：39   18
注：表中“bases”为“碱基”。
如表23所示，同时使用两种6碱基的GT序列具有协同抑制Jurkat T细胞增殖的作用。
实施例18
对化疗剂抗肿瘤作用的增强
在0、0.1、1.0或10.0μg/ml的5-氟尿嘧啶或顺铂的存在下，将Jurkat人白血病T细胞与1.0μg/ml 6碱基的GT SEQ ID NO：25和27碱基的GT SEQ ID NO：1一起培养(表24)。5-氟尿嘧啶是一种干扰DNA和RNA合成的抗代谢剂。顺铂是一种交联DNA并抑制DNA前体的烷基化试剂。
表24  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
Figure C0081885800281
如表24所示，6碱基的GT SEQ ID NO：25和27碱基的GT SEQ IDNO：1增强，并且GT SEQ ID NO：25增强0.1和1.0μg/ml的顺铂对Jurkat T细胞增殖的抗肿瘤作用。
在0、0.1、1.0或10.0μg/ml的5-氟尿嘧啶或他莫昔芬的存在下，将MCF-7人乳腺癌细胞(5 x 105个细胞/ml)与1.0μg/ml的6碱基的GTSEQ ID NO：25和27碱基的GT SEQ ID NO：1一起培养。他莫昔芬是一种雌激素拮抗剂。
表25  MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制
如表25所示，6碱基的SEQ ID NO：25增强0.1μg/ml 5-氟尿嘧啶和0.1μg/ml他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的抗肿瘤作用。27碱基的SEQ IDNO：1不增强5-氟尿嘧啶或他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的抗肿瘤作用。
实施例19
重复的6碱基的GT SEQ ID NO：25对增殖的抑制
将Jurkat人白血病T细胞与1、2、3和4重复的6碱基的GG(GT)1GG(SEQ ID NO：25)一起培养(表26)。
表26  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   60
  GGGTGGGGGTGG-[GG(GT)<sub>1</sub>GG]<sub>2</sub>SEQ ID NO：68-(12bases)   18
  GGGTGGGGGTGGGGGTGG-[GG(GT)<sub>1</sub>GG]<sub>3</sub>SEQ ID NO：69-(18bases)   5
  GGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGTGG-[GG(GT)<sub>1</sub>GG]<sub>4</sub>SEQ ID NO：70-(24bases)   13
注：表中“bases”为“碱基”。
如表26所示，6碱基的GT SEQ.ID NO：25对Jurkat T细胞增殖的抑制率为60％，而12碱基的GT SEQ ID NO：68、18碱基的GT SEQ ID NO：69和24碱基的GT SEQ ID NO：70对Jurkat T细胞增殖的抑制作用减弱。6碱基的GT SEQ.ID NO：25的熔化温度(Tm)为2.5℃，但GT SEQ IDNO：68的熔融温度升至56.8℃，GT SEQ ID NO：69的熔融温度为76.3℃，GT SEQ ID NO：70的熔融温度为86.3℃。
实施例20
由Bacillus Calmette-guerin(BCG)衍生的序列对增殖的抑制
据报道，BCG衍生的序列抑制体内肿瘤的生长(Kataoka等，Jpn.J.Cancer Res.83：244，1992)。另外据报道，当与IMC细胞预先混合并注射到CDF-1小鼠中时，A-2(SEQ ID NO：72)和BCG A-4(SEQ ID NO：74)对IMC肿瘤生长的抑制分别达88％和37％。
将Jurkat人白血病T细胞与由BCG衍生的45碱基的序列一起培养(表27)。
表27  Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制
  序列   ％抑制
  BCGA-1AAAGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAGSEQ ID NO：71(45bases) 6
  BCGA-2AAAAGAAGTGGGGTGCCCCCACGATCACCAACGATGGTGTGTCCASEQ ID NO：72-(45bases) 19
  BCGA-3TCCATCGCCAAGGAGATCGAGCTGGAGGATCCGTACGAGAAGATCSEQ ID NO：73-(45bases) 24
  BCGA-4ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCAACACGACGGCCACCGTGCTGSEQ ID NO：74-(45bases) 9
  BCGA-6ACGAGACCACCATCGTCGAGGGCGCCGGTGACACCGACGCCATCGSEQ ID NO：75-(45bases) 21
  BCGA-7GCCGAGAAGGTGCGCAACCTGCCGGCTGGCCACGGACTGAACGCTSEQ ID NO：76-(45bases) 4
  BCGM-3ACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGGSEQ ID NO：77-(45bases) 22
  BCG ALPHA-1CGACTACAACGGCTGGGATATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTASEQ ID NO：78-(45bases) 10
注：表中“bases”为“碱基”。
如表27所示，BCG衍生的序列对Jurkat T细胞增殖的抑制率≤24％。
实施例21
细胞周期停滞的诱导
使用CYCLETESTTM PLUS DNA市售检测盒(Becton Dickinson)测定细胞周期阶段。概括地说，如下得到细胞的核：将细胞膜溶于非离子洗涤剂中，用胰蛋白酶除去细胞的细胞支架和核蛋白，用RNA酶消化细胞RNA并用精胺稳定核染质。将碘化丙锭加到细胞核中并在安装有电子双重识别能力的流式细胞术(FACSCalibur，Becton Dickinson，San Jose，CA)中分析它们的荧光。用MODFIT LT软件(Verity Software House Inc.，Topsham，MA)分析在细胞周期的G0/G1、早期S(SE)、中期S(SM)、晚期S(SL)或G2/M阶段积聚的细胞。
将以指数生长的Jurkat人白血病T细胞(表28)和MCF-7人乳腺癌细胞(5 x 105个细胞/ml)(表29)与2、6、15、18、27和45碱基的包含A、C、G和T的序列一起培养。将细胞收集并离心，再测定细胞周期的阶段。
表28  Jurkat T人白血病细胞的细胞周期停滞的诱导
Figure C0081885800321
如表28所示，在Jurkat T细胞中，2、6和27碱基的GT序列诱导细胞周期的SE阶段停止，6碱基的CG和AGT，18碱基的GT和45碱基的BCGA-1序列诱导细胞周期的SM阶段停止，6碱基的AG序列诱导细胞周期的G0/G1阶段停止。
表29  MCF-7人乳腺癌细胞的细胞周期停滞的诱导
如表29所示，在MCF-7细胞中，2和6碱基的GT序列诱导细胞周期的SE阶段停止，6碱基的AGT序列和18碱基的GT序列诱导细胞周期的SM阶段停止。
实施例22
GT SEQ ID NO：25、AC SEQ ID NO：79和GT SEQ ID NO：25+AC SEQID NO：79诱导细胞周期停滞
将Jurkat人细胞白血病T细胞(1 X 106个细胞/ml)与6碱基的GT SEQID NO：25一起培养24小时，其中补充有6碱基的AC SEQ ID NO：79和6碱基的GT SEQ ID NO：25+6碱基的AC SEQ ID NO：79。GT SEQID NO：25和AC SEQ ID NO：79通过混合所述寡核苷酸(1∶1)并在65℃加热10分钟进行杂交。作为对照，将GT SEQ ID NO：25和AC SEQID NO：79在65℃加热10分钟(表30)。
表30  Jurkat人白血病T细胞的细胞周期停滞的诱导
如表30所示，6碱基的GT SEQ ID NO：25诱导细胞周期的SE阶段后期停止，而补充的6碱基的AC SEQ ID NO：79对细胞周期没有影响。GT SEQID NO：25和AC SEQ ID NO：79的杂交抵销GT SEQ ID NO：25对细胞周期停滞的诱导作用。这些数据证明，为具有有效性，本发明的序列必须是单链的。
实施例23
细胞凋亡的诱导
原生质膜磷脂酰丝氨酸的再分配和核基质蛋白(NuMA)的释放是正经历细胞凋亡的细胞的特征(Martin等，J.Exp.Med.，182：1545，1995；Miller等，Biotechniques，15：1042，1993)。
使用FITC-结合的膜联蛋白V(BD Pharmingen，San Diego，CA)通过流式细胞术测定细胞凋亡期间原生质膜中磷脂酰丝氨酸的再分配。用市售的ELISA检测盒(Oncogen/Calbiochem，Cambridge，MA)测定释放到上清液中的NuMA。
将Jurkat人白血病T细胞与50μM的3、4、5、6和7GT碱基序列、5碱基的ACGT序列、6碱基的AG、GG、AGT和CGT序列以及7碱基的GG序列一起培养。表31显示出凋亡的细胞的百分数(对磷脂酰-丝氨酸/膜联蛋白V染色(PS/A-V)阳性的)和由细胞释放的％NuMA。
表31  Jurkat T细胞白血病细胞的细胞凋亡的诱导
序列   凋亡的细胞％(PS/A-V染色阳性的)   释放的％NuMA(处理组对未处理组)
未处理细胞 4 0
  GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：2-(6bases)   27   69
  GG(GA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：45-(6bases)   27   74
  GG(GC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：46-(6bases)   16   11
  GG(GG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：44-(6bases)   5   0
  AA(GT)<sub>1</sub>AASEQ ID NO：27-(6bases)   20   56
  CC(GT)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：28-(6bases)   6   0
  TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   14   23
  GT(GT)<sub>1</sub>GTSEQ ID NO：10-(6bases)   33   90
  GG(GT)<sub>1</sub>SEQ ID NO：78-(4bases)   21   64
  (GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：52-(4bases)   24   60
  G(GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：56-(4bases)   24   112
  (GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：8-(3bases)   21   97
  T(GT)<sub>1</sub>SEQ ID NO：7-(3bases)   10   35
  GG(GT)<sub>1</sub>GSEQ ID NO：6-(5bases)   25   92
  G(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：60-(5bases)   25   120
  GG(GG)<sub>1</sub>GGGSEQ ID NO：63-(7bases)   12   26
  GGG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：62-(7bases)   30   123
  CG(GT)<sub>1</sub>ASEQ ID NO：80-(5bases)   6   9
注：表中“bases”为“碱基”。
如表31所示，3、4、5和6碱基的GT、AG、CG和AGT序列诱导Jurkat T细胞的细胞凋亡。5碱基的ACGT和6碱基的CGT以及GG序列不诱导JurkatT细胞的细胞凋亡。
实施例24
细胞内钙的增高(Ca2+)i
据报道，细胞内钙(Ca2+)的增高与细胞凋亡的诱导有关(Lam等，Mol.Endocrinol.7：686，1993)。用荧光探针Fluo-3-AM(Cell Permaant，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)跟踪(Ca2+)i。Fluo-3-AM荧光增强则表示(Ca2+)i增高。
将Jurkat人白血病T细胞与6碱基的GT SEQ.NO：25一起培养24小时。离心收集细胞，将其悬浮于含1％FBS的PBS中，并在37℃用10μMFluo-3-AM负载1小时。在488nm激发波长和530nm发射波长测定细胞荧光(FL1检测器)。在FACSCALIBUR上用程序CellQUEST(BectonDickinson)分析数据。
如附图1所示，Jurkat T细胞与6碱基的GT SEQ ID NO：25一起培养导致细胞荧光增强88％，表明(Ca2+)i增高了。
实施例25
细胞凋亡的诱导
通过与细胞表面受体结合的配体引发细胞凋亡，所述配体包括，但不限于Fas(CD95)和肿瘤坏死因子(TNF)。与Fas Ligand结合的Fas和与TNF Receptor 1结合的TNF引发细胞内产生导致半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶(caspases)活化的引号。半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶引发致命的与核DNA-碎裂有关的细胞凋亡完成的蛋白水解级联反应、核基质蛋白(NuMA)的释放并细胞底物接触的丧失。
将Jurkat人白血病T细胞(1 x 106/ml)与6和27GT碱基序列一起培养(表32)。如实施例23测定NuMA。
表32  Jurkat人白血病T细胞释放的％NuMA
  序列   释放的％NUMA
  GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-(G<sub>1</sub>T)<sub>13</sub>GSEQ ID NO：1-(27bases)   22
  GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGG-(G<sub>3</sub>T)<sub>6</sub>G<sub>3</sub>SEQ ID NO：2-(27bases)   49
  GGGGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGTGGG-(G<sub>5</sub>T)<sub>4</sub>G<sub>3</sub>SEQ ID NO：3-(27bases)   139
  GGGGGGGTGGGGGGGTGGGGGGGTGGG-(G<sub>7</sub>T)<sub>3</sub>G<sub>3</sub>SEQ ID NO：4-(27bases)   90
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   269
注：表中“bases”为“碱基”。
如表32所示，使用6碱基的GT SEQ ID NO：25的％NuMA释放大于使用27碱基的GT SEQ ID NOs：1、2、3和4的％NuMA释放。
实施例26
6碱基的GT SEQ ID NO：25和6碱基的AC SEQ ID NO：79对细胞凋亡的诱导
将Jurkat人细胞白血病T细胞与6碱基的GT SEQ ID NO：25一起培养24小时，其中补充有6碱基的AC SEQ ID NO：79和6碱基的GT SEQID NO：25+6碱基的AC SEQ ID NO：79。GT SEQ ID NO：25和AC SEQID NO：79通过混合所述序列(1∶1)并在65℃加热10分钟进行杂交。作为对照，将GT SEQ ID NO：25和AC SEQ ID NO：79在65℃加热10分钟(表33)。如实施例23评价细胞凋亡。
表33  Jurkat人白血病T细胞的细胞凋亡的诱导
  凋亡的细胞％(PS/A-V染色阳性的)   释放的NuMA％(未处理细胞对处理细胞)
  未处理细胞   4   0
  GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   27   69
  CC(AC)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：79-(6bases)   6   9
  GT(GT)<sub>1</sub>GT+CC(AC)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：25-(6bases)+SEQ IDNO：79-(6bases)   5   9
注：表中“bases”为“碱基”。
如表33所示，6碱基的GT SEQ ID NO：25诱导JurkatT细胞的细胞凋亡，但补充的6碱基的AC SEQ ID NO：79对细胞凋亡没有影响。GT SEQID NO：25和AC SEQ ID NO：79的杂交抵销GT SEQ ID NO：25的细胞凋亡的诱导作用。这些数据证明，为具有有效性，本发明的序列必须是单链的。
实施例27
草分支杆菌衍生的富含GT和富含AC的序列对增殖的抑制、细胞周期的停止和细胞凋亡的诱导作用
将Jurkat人白血病T细胞与草分支杆菌的murA基因(GenBank：Accession Number X99776)衍生的富含GT和富含AC的序列一起培养。如实施例3通过还原MTT测定增殖的抑制作用，如实施例21通过流式细胞术用碘化丙锭测定细胞周期的停止，以及如实施例23，通过流式细胞术用膜联蛋白-V-FITC评价细胞凋亡。
表34  Jurkat细胞增殖的抑制、细胞周期的停止和细胞凋亡的诱导
序列   ％抑制(增殖) 凋亡的细胞％ 细胞周期停滞
  AACCACAAGCCCAACSEQ ID NO：67-(15碱基)   0   4   无
  GTGTGTTTGGTSEQ ID NO：81-(11碱基)   22   23   G0/G1
  GGTTTTGTTTGSEQ ID NO：82-(11碱基)   20   25   未期SE
  TTGTTTTTTTTGSEQ ID NO：83-(11碱基)   21   16   SM
如表34所示，富含GT的SEQ ID NOs：81、82和83抑制Jurkat T细胞的增殖、诱导所述细胞的细胞周期停滞并诱导其细胞凋亡；但富含AC的SEQ ID NO：15对Jurkat T细胞的增殖、细胞周期停滞和细胞凋亡均没有抑制作用。
实施例28
GT序列对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活化的调节
半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶识别3种主要的肽底物序列：1)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-1、-4和-5)(SEQ IDNO：84)；2)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-2、-3和-7)(SEQ ID NO：85)；和3)Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD；半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-8和-10)(SEQ ID NO：86)(Thornberry等，J.Biol.Chem.272：17907，1997)。蛋白质靶中序列的识别导致靶的有限的和特异性的蛋白水解，正如在第一个实施例中，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3调节半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7的活化；正如在第二个实施例中，分解的结构蛋白质靶包括，但不限于核纤层蛋白；或者正如在第三个实施例中，活化的酶包括，但不限于PARP。
使用5’-C2酰胺间隔区臂与标准酰胺-羧基水溶性carbohexiimide缀合技术(Guy等，J.Chromatography.B.Biomed.Sci.Appl.706：149，1998)合成的寡核苷酸，通过化学保护的GT序列或化学保护的AC序列与化学保护的选自NH2-YVAD-COOH(SEQ ID NO：84)、NH2-DEVD-COOH(SEQID NO：85)和NH2-IEGD-COOH(SEQ ID NO：87)的序列化学共轭生成NH2-XXXD-COO-GT序列构成物。在共轭后，脱去反应性羧酸酯和反应性氨基的保护基。
包括，但不限于NH2-YVAD-COO-GT；NH2-DEVD-COO-GT；和NH2-I(L)EXD-COO-GT的肽-GT(本文称PGT)序列构成物被酶在D和GT之间的羧酸酯官能团处裂解，所述酶包括，但不限于半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶、与癌症转移有关的酶、胶原酶和金属蛋白酶。这类裂解导致半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶获得的GT序列从PGT中释放。由此产生的胞内半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活性的增高可，例如提高化疗剂对多种药物耐药的癌细胞的疗效或者增强对弱抗原刺激的免疫反应。
为测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的活化，使用制造商建议的条件，将对照组和处理组细胞洗涤、固定、渗透化并与识别活化形式的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的FITC-缀合抗体(Pharmingen，San Diego，CA)一起培养。在FACSCALIBUR上，使用程序CellQUEST(Becton Dickinson)，通过流式细胞术分析与活化的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3有关的荧光。或者，采用基于与颜色指示分子硝基苯胺缀合的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶特异性的肽的分解分析，通过比色法测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的活化，该分析是在405nm以分光光度分析法定量进行。
实施例29
GT SEQ ID NOs：66、81、82和83以及AGC序列SEQ ID NO：67对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的活化
将Jurkat T细胞白血病细胞与下列序列一起培养72小时：33碱基的GT SEQ ID NO：66；11碱基的GT SEQ ID NO：81(GT SEQ ID NO：66的碱基1-11)、11碱基的GT SEQ ID NO：82(GT SEQ ID NO：66的碱基12-22)、11碱基的GT SEQ ID NO：83(GT SEQ ID NO：66的碱基23-33)和15碱基的ACG SEQ ID NO：67。如实施例28，用FITC缀合抗体(Clone：C92-605)测定活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3(17-22kDa)。
如附图2A所示，33碱基的GT SEQ ID NO：66和11碱基的GT SEQID NOs：81、82和83各自诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原3转变为活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3，但15碱基的ACG SEQ ID NO：67不诱导半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原3转变为活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3。
也可如实施例28，经比色法测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化。如附图2B所示，在用33碱基的GT SEQ ID NO：66和11碱基的GT SEQID NOs：81、82和83处理的细胞中，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活性比对照细胞中高105％、77％、100％和60％，但在用15碱基的ACG SEQ IDNO：67处理的细胞中，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化与对照细胞大致相同。
实施例30
6碱基的GT SEQ ID NO：25对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3活性的活化
将Jurkat T细胞白血病细胞与6碱基的GT SEQ ID NO：25一起培养72小时。如实施例28，用比色法测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化。如附图3A所示，用6碱基的GT SEQ ID NO：25处理的细胞中半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化比对照细胞中高323％。
实施例31
GT SEQ ID NO：25对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-7的活化和PARP的分解
将Jurkat T细胞白血病细胞与6碱基的GT SEQ ID NO：25一起培养72小时。细胞用PBS洗涤三次，用10mM HEPES(pH 7.5，含5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、1.5nM抑肽酶、10mM亮抑蛋白酶肽和2.5μm原钒酸钠)溶解并测定溶解物的蛋白质含量(Bradford J.Anal.Biochem.72：248，1976)。
通过蛋白质印迹分析测定活化的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7和PARP的分解。将溶解物与Laemmli缓冲液(Laemmli U.Nature 15：680，1970)混合，振摇并与100℃加热4分钟。将Fifty jig蛋白质加到各泳道上，并在100V的恒定电压下(1.5h)，用10％(半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶)或17％(PARP)月桂基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质。将分得的蛋白质在PVDF膜上进行电印迹。用丽春红染色该膜监测相同的蛋白质负载量。
在4℃下用缓冲液将膜阻断过夜，所述缓冲液含有1％Tris-缓冲的盐水(2mM Tris-HCl，13.7mM NaCl，pH 7.6和0.1％聚乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯(土温20)(TBST)+5％脱脂奶粉。洗涤该膜并在室温下与鼠单克隆IgG抗-半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7抗体(Pharmingen)(用TBST+1％BSA以1∶1000稀释的)或者与鼠单克隆IgG抗-PARP抗体(用TBST+1％BSA以1∶1000稀释的)(Pharmingen)一起培养1小时。用与辣根过氧化物酶(用TBST+5％脱脂奶粉以1∶1000稀释的)(Pharmingen)缀合的羊抗鼠IgG测定与半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7或PARP结合的IgG。用加强的化学发光检测系统(ECL，Amersham，Corp.，Amersham，UK)展开印迹。
如附图3B所示，6碱基的GT SEQ ID NO：25诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原7(30kDa)转变为活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7(19-20kDa)以及活性PARP转变为失活的其85kDa降解产物。
实施例32
半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活化的正反馈放大
将Jurkat人白血病T细胞与下列序列一起培养72小时：NH2-YVAD-CO-GG(GT)GG、NH2-DEVD-CO-GG(GT)GG、NH2-IEGD-COO-GG(GT)GG、NH2-YVAD-CO-AACCACAAGCCCAAC、NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC和NH2-IEGD-CO-AACCACAAGCCCAAC。测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7的活化。
NH2-YVAD-CO-GT、NH2-DEVD-CO-GT和NH2-IEGD-COO-GT各自诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3以及非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7，但NH2-YVAD-CO-ACG、NH2DVED-CO-ACG和NH2-IEGD-CO-ACG不诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原3转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3或者非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7。
虽不期望受到下列假设的限制，但据认为在含半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的细胞内，基础半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活性调节半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的释放，所述酶通过蛋白水解/水解NH2-XXXD-COO-GT构成物活化GT序列。这通过释放的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活化的GT序列导致在细胞内半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活性(半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7的水平增高)的正放大。
实施例33
诱导细胞因子的产生
除非另有说明，在37℃和5％CO2中，将1 x 106个细胞与100μg/ml的各种测试序列一起培养48小时。在100μl培养上清液中，用合适的市售ELISA(BioSource，Camarillo CA)测定细胞因子IL-6、IL-10、IL-12、IL-1β和TNF-α的产生(pg/ml)。IL-12ELISA测定IL-12p70络合物和游离p40亚基。结果以与对照细胞相比，处理的细胞产生的细胞因子的增加“倍数”(x)表示。
将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与2、3、6、9、12、14、15和18碱基的GT序列一起培养并测定细胞因子IL-6的产生。(表35)。
表35  THP-1人急性单核细胞性白血病细胞产生的细胞因子
  序列   ↑.IL-6
  TG-(TG)<sub>1</sub>T SEQ ID NO：7-(3bases)   2.7x
  TG-(TG)<sub>1</sub> SEQ ID NO：51-(2bases)   2.9x
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub> SEQ ID NO：9-(6bases)   4.0x
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub> SEQ ID NO：10-(6bases)   5.0x
  TGTGTGTG-(TG)<sub>4</sub>T SEQ ID NO：11-(9bases)   5.4x
  GTGTGTGTG-(GT)<sub>4</sub>G SEQ ID NO：12-(9bases)   5.4x
  TGTGTGTGTGT-(TG)<sub>6</sub> SEQ ID NO：13-(12bases)   5.7x
  GTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>6</sub> SEQ ID NO：14-(12bases)   1.3x
  TGTGTGTGTGTGT-(TG)<sub>7</sub> SEQ ID NO：15-(14bases)   1.0x
  GTGTGTGTGTGTGTG-(GT)<sub>7</sub>G SEQ ID NO：16-(15bases)   2.6x
  TGTGTGTGTGTGTGTGT-(TG)<sub>9</sub> SEQ ID NO：17-(18bases)   2.2x
  GTGTGTGTGTGTGTGTGT-(GT)<sub>9</sub> SEQ ID NO：18-(18bases)   2.8x
注：表中“bases”为“碱基”。
如表35所示，2、3、6、9、12、14、15和18碱基的GT序列提高THP-1细胞产生的细胞因子IL-6的量。
将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与6碱基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列一起培养并测定细胞因子IL-12和IL-16的产生(表36)。
表36  THP-1人急性单核细胞性白血病细胞产生的细胞因子
  序列   ↑.IL-12   ↑.IL-6
  TGTGTG-(TG)<sub>3</sub> SEQ ID NO：9   1.8x   4.0x
  GTGTGT-(GT)<sub>3</sub> SEQ ID NO：10   2.2x   5.0x
  TTTGTT-TT(TG)<sub>1</sub>TT SEQ ID NO：23   3.5x   4.9x
  GGTGGG-GG(TG)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：24   3.7x   6.9x
  GGGTGG-GG(GT)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：25   2.3x   3.1x
  TTGTTT-TT(GT)<sub>1</sub>TT SEQ ID NO：26   3.5x   5.3
  AAGTAA-AA(GT)<sub>1</sub>AA SEQ ID NO：27   6.0x   12.8x
  CCGTCC-CC(GT)<sub>1</sub>CC SEQID NO：28   3.8x   12.6x
  TGGTTG-TG(GT)<sub>1</sub>TG SEQ ID NO：29   4.1x   10.5x
  ATGTAT-AT(GT)<sub>1</sub>AT SEQ ID NO：30   4.8x   9.8x
  AGGTGA-AG(GT)<sub>1</sub>GA SEQ ID NO：31   1.9x   4.9x
  GAGTGA-GA(GT)<sub>1</sub>GA SEQ ID NO：32   1.8x   5.8x
  GGGTCT-GG(GT)<sub>1</sub>CT SEQ ID NO：33   1.2x   3.1x
  CCGTGG-CC(GT)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：34   0.0x   10.8x
  GGGTCC-GG(GT)<sub>1</sub>CC SEQ ID NO：35   1.9x   21.3x
  CTGTCT-CT(GT)<sub>1</sub>CT SEQ ID NO：36   2.0x   15.9x
  TCGTTC-TC(GT)<sub>1</sub>TC SEQ ID NO：37   2.2x   12.9x
  CGGTGC-CG(GT)<sub>1</sub>GC SEQ ID NO：38   0.2x   6.9x
  TTGTG-TT(GT)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：39   0.0x   6.6x
  GGGTT-GG(GT)<sub>1</sub>TT SEQ ID NO：40   -1.2x   14.0x
  GGTTGG-GG(TT)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：41   3.3x   16.0x
  GGAAG-GG(AA)<sub>1</sub>G SEQ ID NO：42   4.1x   29.2x
  GGCCGG-GG(CC)GG SEQ ID NO：43   3.1x   17.1x
  GGGGGG-GG(GG)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：44   0.0x   15.1x
  GGGAGG-GG(GA)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：45   -1.6x   23.2x
  GGGCGG-GG(GC)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：46   2.3x   9.8x
  TTAGGG-TT(AG)<sub>1</sub>GG SEQ ID NO：49   2.0x   6.7x
如表36所示，6碱基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列提高THP-1细胞产生的细胞因子IL-12和IL-6的量。
表37概括了6碱基的序列对IL-12和IL-6合成的诱导。
表37  6碱基序列诱导的IL-6和IL-12合成
增加倍数   IL-12合成SEQ ID NOs：   IL-6合成SEQ ID NOs：
  ≤2.0   9，31，32，33，34，35，36，38，39，40，44，45，49
  ＞2.0和≤10.0   10，23，24，25，26，27，28，29，30，37，40，41，42，43，44，45   9，10，23，24，25，26，30，31，32，33，38，39，46，49
  ＞10.0   25，27，29，34，35，36，37，40，41，42，43，44，45
据报道，BCG衍生的序列A-3(SEQ ID NO：73)、A-4(SEQ ID NO：74)、A-6(SEQ ID NO：75)、A-7(SEQ ID NO：76)、M3(SEQ ID NO：77)和α1(SEQ ID NO：78)在体内活化NK细胞(Kataoka等，Jpn.J.Cancer Res.83：244，1992)。将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与45碱基的BCG-衍生序列一起培养并测定细胞因子IL-12和IL-6的产生(表38)。
表38  TOP-1人急性单核细胞性白血病细胞产生的细胞因子
  序列   ↑.IL-12   ↑.IL-6
  BCGA-1AAAGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAG SEQ ID NO：69-(45bases) 1.9x 2.6x
  BCGA-2AAAAGAAGTGGGGTGCCCCCACGATCACCAACGATGGTGTGTCCA SEQ ID NO：70-(45bases) 1.6x 3.9x
  BCGA-3TCCATCGCCAAGGAGATCGAGCTGGAGGATCCGTACGAGAAGATC SEQ ID NO：71-(45bases) 1.7x 2.5x
  BCGA-4ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCAACACGACGGCCACCGTGCTG SEQ ID NO：72-(45bases) 0.9x 1.8x
  BCGA-6ACGAGACCACCATCGTCGAGGGCGCCGGTGACACCGACGCCATCG SEQ ID NO：73-(45bases) 2.1x 3.9x
  BCGA-7GCCGAGAAGGTGCGCAACCTGCCGGCTGGCCACGGACTGAACGCT SEQ ID NO：74-(45bases) 0.5x N.D
  BCGM-3ACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGG SEQ ID NO：75-(45bases) 1.6x 2.8x
  BCG ALPHA-1CGACTACAACGGCTGGGATATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTA SEQ ID NO：76-(45bases) 1.1x 2.1x
注：表中“bases”为“碱基”。
如表38所示，45碱基的BCG衍生的序列极轻微地提高THP-1细胞产生的IL-12和IL-6的量。
实施例34
磷酸二酯和硫代磷酸酯序列诱导IL-12的产生
将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与6碱基的GT序列一起培养，所述序列具有作为磷酸酯基非桥接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并测定细胞因子IL-12的产生(表39)。
表39  THP-1急性单核细胞性白血病细胞产生的IL-12
Figure C0081885800431
Figure C0081885800441
如表39所示，用硫原子(硫代磷酸酯)替代磷酸酯基上的非桥接氧原子(磷酸二酯)明显减少THP-1细胞产生的IL-12的量。
将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与6碱基的GT SEQ ID NO：25一起培养，所述序列具有作为磷酸酯基非桥接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并测定细胞因子IL-12的产生(表40)。
表40  THP-1人急性单核细胞性白血病细胞产生的IL-12
Figure C0081885800442
注：表中“oxygen atom”为“氧原子”；“bases”为“碱基”；“sulfur atom”为“硫原子”；“position”为“位置”。
*注：“o”代表磷酸酯基中的氧原子，“s”代表硫原子如表40所述，用硫原子(硫代磷酸酯)替代6碱基的GT SEQ ID NO：25中的非桥接氧原子(磷酸二酯)明显减少THP-1细胞产生的IL-12的量。
实施例35
刺激人周围血单核细胞中细胞因子的合成
用Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech，Baie d’Urfee，Quebec，Canada)，通过密度梯度离心全血，从7名健康的人分离周围血单核细胞(下文称“PBMCs”)。将PBMCs与6碱基的GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培养并测定细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12的产生。
表41  人PBMC产生的细胞因子
  序列   IL-1β增加倍数均值+/-SD(范围)   IL-6增加倍数均值+/-SD(范围)   IL-10增加倍数均值+/-SD(范围)   IL-12增加倍数均值+/-SD(范围)
  TG(TG)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：9-(6bases)   1.2+/-0.4(0.8-1.5)   8.3+/-12.8(1.2-37.0)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   2.7+/-2.6(1.0-6.6)
  GT(GT)<sub>1</sub>GTSEQ ID NO：10-(6bases)   2.0+/-1.6(0.9-3.8)   9.8+/-14.2(0.8-39.1)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   4.0+/-6.3(0.9-18.1)
  TG(TG)<sub>4</sub>TGSEQ ID NO：13-(12bases)   2.4+/-1.9(0.9-4.5)   12.1+/-6.5(2.9-20.8)   1.2+/-0.4(0.9-1.9)   4.4+/-5.3(1.2-15.0)
  GT(GT)<sub>4</sub>GTSEQ ID NO：14-(12bases)   1.1+/-0.2(0.9-1.3)   2.0+/-1.5(0.9-4.9)   1.0+/-0.1(0.9-1.2)   2.0+/-1.1(0.9-2.6)
  TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   1.0+/-0.1(0.9-1.0)   11.8+/-9.0(1.3-25.6)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   1.1+/-0.3(0.9-1.6)
  GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO.24(6bases)   0.9+/-0.1(0.9-1.0)   15.9+/-14.9(0.7-37.1)   2.4+/-2.9(1.0-7.5)   2.3+/-1.6(0.9-5.5)
  GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   1.0+/-0.1(1.0-1.2)   20.9+/-18.0(1.6-50.0)   11.6+/-1.2(9.9-13.2)   13.2+/-11.5(1.0-26.8)
  TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   1.5+/-0.9(0.9-2.5)   5.8+/-8.0(0.5-21.7)   1.0+/-0.1(1.0-1.2)   1.6+/-1.3(0.8-4.5)
  AA(GT)<sub>1</sub>AASEQ ID NO：27-(6bases)   1.3+/-0.5(0.9-1.8)   9.6+/-7.3(1.8-16.0)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   2.4+/-2.2(0.8-6.7)
  CC(GT)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：28-(6bases)   2.1+/-1.8(0.8-4.1)   10.4+/-13.0(1.4-35.8)   1.0+/-0.1(1.0-1.1)   5.9+/-10.7(0.9-30.0)
  TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29-(6bases)   1.7+/-1.0(1.1-2.8)   9.3+/-12.1(0.8-33.8)   1.0+/-0.1(1.0-1.1)   3.3+/-4.2(0.8-12.7)
  AT(GT)<sub>1</sub>ATSEQ ID NO：30-(6bases)   1.1+/-0.2(1.0-1.4)   4.6+/-4.4(1.6-14.4)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   1.3+/-0.2(1.0-1.6)
  CT(GT)<sub>1</sub>CTSEQ ID NO：36-(6bases)   1.2+/-0.3(1.0-1.5)   5.3+/-3.6(0.9-10.6)   1.0+/-0.1(0.9-1.2)   1.2+/-0.3(0.9-1.8)
  TC(GT)<sub>1</sub>TCSEQ ID NO：37-(6bases)   1.2+/-0.4(0.9-1.6)   7.5+/-9.8(0.7-27.0)   1.0+/-0.1(1.0-1.1)   1.4+/-1.1(0.9-3.8)
  GG(TT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：41-(6bases)   3.2+/-3.0(0.8-6.5)   7.8+/-12.8(0.9-36.4)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   4.9+/-8.6(0.8-24.3)
  GG(AA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：42-(6bases)   3.5+/-3.9(0.8-8.0)   11.8+/-5.8(1.2-15.6)   1.1+/-0.2(0.9-1.5)   3.0+/-2.7(1.1-8.6)
  GG(CC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：43-(6bases)   1.5+/-0.9(0.8-2.5)   14.9+/-10.2(1.2-29.8)   1.2+/-0.3(1.0-1.8)   2.5+/-2.0(1.0-7.0)
  GG(GG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：44-(6bases)   7.1+/-9.4(0.8-17.9)   21.0+/-14.7(4.6-42.0)   1.7+/-1.6(0.9-4.6)   7.0+/-12.5(1.3-35.3)
  GG(GA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：45-(6bases)   13.6+/-14.9(1.2-30.2)   24.7+/-16.5(5.9-50.0)   6.0+/-5.5(2.1-15.5)   20.7+/-10.3(5.7-35.3)
  GG(GC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：46-(6bases)   1.2+/-0.3(1.0-1.5)   15.8+/-16.2(1.3-37.8)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   3.0+/-3.8(1.1-10.7)
注：表中“bases”为“碱基”。
实施例36
通过黑猩猩外周血液单核细胞合成细胞因子
如实施例35所述从4只健康的黑猩猩中分离PBMCs。将PBMCs与6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培养，并测定细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的生成(表41)。
表41  通过黑猩猩PBMC生成细胞因子
序列   IL-10增加倍数平均+/-SD(范围)   IL-12增加倍数平均+/-SD(范围)   TNF-α增加倍数平均+/-SD(范围)
  TG(TG)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：9-(6bases)   2.3+/-1.3(1.3-4.1)   13.5+/-8.9(2.8-21.1)   11.3+/-6.9(5.3-19.5)
  GT(GT)<sub>1</sub>GTSEQ ID NO：1-(6bases)   4.0+/-2.1(1.8-6.7)   14.0+/-8.5(3.0-21.3)   12.9+/-6.4(6.5-19.6)
  TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   1.5+/-0.6(1.0-2.4)   12.9+/-8.2(2.7-20.1)   9.0+/-5.5(4.1-14.4)
  GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   2.9+/-1.5(1.3-4.8)   14.3+/-9.1(3.0-22.5)   11.9+/-7.0(5.8-19.8)
  GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   2.5+/-1.5(1.4-4.6)   13.5+/-8.4(2.8-20.8)   11.7+/-6.7(5.9-19.6)
  TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   1.4+/-0.9(1.1-2.1)   12.3+/-8.5(2.5-20.1)   7.5+/-4.6(3.4-13.1)
  AA(GT)<sub>1</sub>AASEQ ID NO：27(6bases)   2.1+/-1.1(1.1-3.7)   13.2+/-8.2(2.8-19.8)   7.9+/-3.9(4.6-12.0)
  CC(GT)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：28-(6bases)   3.8+/-2.8(1.5-7.7)   13.3+/-8.4(2.8-20.4)   10.3+/-5.7(5.0-15.8)
  TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29-(6bases)   3.1+/-2.0(1.6-5.9)   13.6+/-8.8(2.9-21.9)   12.4+/-7.3(6.1-20.8)
  AT(GT)<sub>1</sub>ATSEQ ID NO：30-(6bases)   1.4+/-0.4(1.2-1.9)   10.7+/-7.0(2.5-18.6)   5.9+/-3.3(3.4-10.5)
  CT(GT)<sub>1</sub>CTSEQ ID NO：36-(6bases)   3.0+/-2.1(1.2-5.9)   13.4+/-8.9(2.8-20.4)   12.4+/-6.3(7.0-19.6)
  TC(GT)<sub>1</sub>TCSEQ ID NO：37-(6bases)   3.4+/-2.6(1.4-7.1)   14.1+/-10.0(2.4-24.9)   11.4+/-6.4(6.1-19.3)
  GG(TT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：41(6bases)   9.1+/-7.7(3.0-20.3)   15.3+/-10.0(2.9-25.9)   14.1+/-7.3(7.7+/-23.2)
  GG(AA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：42-(6bases)   9.9+/-8.9(2.6-22.7)   15.6+/-10.6(2.6-26.6)   14.4+/-7.1(8.0-22.9)
  GG(CC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：43-(6bases)   13.6+/-9.0(4.3-26.7)   15.1+/-10.2(2.8-26.1)   14.0+/-6.6(7.9-22.3)
  GG(GG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：44-(6bases)   11.2+/-9.1(3.9-24.3)   15.1+/-10.0(2.9-25.9)   13.8+/-6.5(7.6-21.8)
  GG(GA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：45-(6bases)   9.9+/-9.2(2.6-23.1)   15.9+/-10.7(2.9-26.9)   14.5+/-6.9(7.9-23.0)
  GG(GC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：46-(6bases)   4.7+/-3.4(1.7-9.3)   15.8+/-10.4(3.0-26.2)   14.1+/-6.6(8.3-21.7)
注：表中“bases”为“碱基”。
如表41所示，6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了黑猩猩PBMC细胞生成细胞因子IL10和IL-12以及TNF-α。
实施例37
通过恒河猴外周血液单核细胞合成细胞因子
如实施例35所述从4只健康的恒河猴中分离PBMCs。将PBMCs与6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培养，并测定细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的生成(表42)。
表42  通过恒河猴PBMC生成细胞因子
序列   IL-10增加倍数平均+/-SD(范围)   IL-12增加倍数平均+/-SD(范围)   TNF-α增加倍数平均+/-SD(范围)
  TG(TG)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：9-(6bases)   1.1+/-0.2(0.9-1.3)   10.6+/-4.2(5.6-14.3)   14.3+/-6.3(6.2-21.2)
  GT(GT)<sub>1</sub>GTSEQ ID NO：10-(6bases)   1.3+/-0.1(1.1-1.4)   10.7+/-4.1(6.1-15.8)   16.1+/-4.2(11.0-21.6)
  TT(TG)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：23-(6bases)   1.0+/-0.1(0.8-1.0)   6.7+/-3.6(3.6-11.7)   4.4+/-3.8(1.3-9.5)
  GG(TG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：24-(6bases)   1.0+/-0.1(1.0-1.1)   11.2+/-4.8(5.6-16.8)   14.5+/-5.4(7.7-20.0)
  GG(GT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：25-(6bases)   1.0+/-0.1(1.0-1.1)   10.6+/-4.7(5.5-16.5)   12.5+/-5.2(6.2-18.6)
  TT(GT)<sub>1</sub>TTSEQ ID NO：26-(6bases)   1.0+/-0.1(1.0-1.2)   4.9+/-2.9(2.6-8.8)   2.1+/-1.0(1.3-3.4)
  AA(GT)<sub>1</sub>AASEQ ID NO：27-(6bases)   0.9+/-0.1(0.9-1.0)   7.6+/-2.6(5.9-11.5)   6.0+/-5.0(2.4-13.4)
  CC(GT)<sub>1</sub>CCSEQ ID NO：28-(6bases)   1.1+/-0.2(0.9-1.2)   10.1+/-3.7(6.2-14.2)   14.2+/-3.7(9.6-18.6)
  TG(GT)<sub>1</sub>TGSEQ ID NO：29-(6bases)   1.1+/-0.2(0.9-1.2)   11.1+/-4.2(6.5-13.7)   16.5+/-2.7(14.0-19.1)
  AT(GT)<sub>1</sub>ATSEQ ID NO：30-(6bases)   1.9+/-1.4(1.0-4.0)   6.0+/-1.9(5.6-8.5)   6.9+/-4.7(2.2-13.4)
  CT(GT)<sub>1</sub>CTSEQ ID NO：36-(6bases)   1.0+/-0.1(0.9-1.1)   10.7+/-4.6(6.2-16.4)   15.3+/-3.6(11.2-19.8)
  TC(GT)<sub>1</sub>TCSEQ ID NO：37-(6bases)   1.1+/-0.2(0.9-1.3)   10.0+/-3.8(6.3-14.1)   14.7+/-3.1(13.7-19.1)
  GG(TT)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：41-(6bases)   1.9+/-1.5(1.0-4.1)   11.5+/-5.9(4.3-17.2)   14.1+/-8.2(2.5-20.7)
  GG(AA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：42-(6bases)   1.2+/-0.2(1.0-1.4)   11.9+/-5.4(5.9-17.1)   16.5+/-4.5(11.4-21.2)
  GG(CC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：43-(6bases)   1.0+/-0.2(0.8-1.2)   11.7+/-4.8(6.2-16.4)   16.9+/-3.5(13.9-21.1)
  GG(GG)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：44-(6bases)   2.1+/-1.0(1.1-3.5)   10.7+/-5.6(3.7-15.9)   13.9+/-8.5(2.0-20.9)
  GG(GA)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：45-(6bases)   1.1+/-0.1(1.0-1.3)   11.9+/-4.5(6.8-16.0)   16.7+/-4.6(11.6-21.5)
  GG(GC)<sub>1</sub>GGSEQ ID NO：46-(6bases)   1.2+/-0.2(1.0-1.4)   11.0+/-4.4(6.3-16.1)   16.8+/-4.1(11.9-21.8)
如表42所示，6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了恒河猴PBMC细胞生成细胞因子IL10、IL-12以及TNF-α。
实施例38
6碱基GT SEQ ID NO：25+5-氟尿嘧啶和6碱基GT SEQ ID NO：25+他莫昔芬中的6碱基GT SEQ ID NO：25对MCF-7人乳腺肿瘤的影响
将MCF-7人乳腺癌细胞作为异种皮移植物皮下植入到雌性裸BALB/c小鼠中。将小鼠分成6组，每组10只。在第0天，第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受6碱基GT SEQ ID NO：25，第3组小鼠接受5-氟尿嘧啶，第4组小鼠接受他莫昔芬，第5组小鼠接受6碱基GT SEQ ID NO：25+5-氟尿嘧啶，第6组小鼠接受6碱基GT SEQ ID NO：25+他莫昔芬。治疗4周后，将小鼠处死，并测定肿瘤质量。第1组小鼠具有最大的肿瘤质量，第2、3和4组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠小，第5和6组小鼠的肿瘤质量比第1、2、3和4组小鼠小。
实施例39
3和6碱基GT序列和45碱基BCGA-3序列对LNCaP人前列腺癌肿瘤的影响
将LNCaP人前列腺癌细胞作为异种皮移植物皮下植入到雄性裸nu/nu小鼠中。将小鼠分成5组，每组10只小鼠。在第0天，第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受3碱基SEQ ID NO：8，第3组小鼠接受6碱基GT SEQ ID NO：25，第4组小鼠接受6碱基AG SEQ ID NO：45，第5组小鼠接受45碱基BCG A-3 SEQ ID NO：69。治疗4周后，将小鼠处死，并测定肿瘤质量。第1组小鼠具有最大的肿瘤质量，第5组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠小，第2、3和4组小鼠的肿瘤质量比第1和5组小鼠小。
实施例41
3、6、8和27碱基序列对EL-4鼠T淋巴瘤的影响
将EL-4鼠T淋巴细胞植入到C57/BL6小鼠体内。将小鼠分成6组，每组10只小鼠。在第0天，第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受3碱基GT SEQ ID NO：8，第3组小鼠接受6碱基SEQ ID NO：25，第4组小鼠接受6碱基AG SEQ ID NO：45，第5组小鼠接受18碱基GT SEQ ID NO：18，第6组小鼠接受27碱基GT SEQ ID NO：1。治疗4周后，将小鼠处死，并测定肿瘤质量。第1组小鼠具有最大的肿瘤质量，第2、3、4、5和6组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠小。
实施例42
将人结肠癌细胞系作为粘着细胞培养物维持。将处于指数生长期的细胞用2-20碱基GT、GA、GC或GG序列以0μg/ml-100μl/ml的剂量处理24-72小时。通过MTT还原测定对细胞增殖的抑制，通过流动血细胞计数测定细胞周期停滞，通过膜联蛋白-V结合或NuMA释放测定细胞凋亡。在结肠癌细胞系中，GT、GA、GC或GG序列抑制增殖，诱导细胞周期停滞，并诱导细胞凋亡。
用盐水或者用在体外具有抗人结肠直肠癌细胞系的抗癌活性的2-20碱基GT、GA、GC或GG序列治疗皮下携带人结肠直肠癌细胞系的SCID小鼠。用在体外具有抗人结肠直肠癌细胞系的抗癌活性的2-20碱基GT、GA、GC或GG序列治疗的小鼠的肿瘤质量比用盐水治疗的小鼠显著减小。
虽然已经详细描述了本发明，并提供了其具体实施方案，但是显然本领域技术人员可在不背离其实质和范围的情况下对其作各种改变和改进。
     奈杰尔·菲利普斯
<110>
     马里奥·菲利翁
<120>治疗用合成寡核苷酸
<130>6857-21
<150>60/170,325
<151>1999-12-13
<150>60/228,925
<151>2000-08-29
<160>87
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>1
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg                           27
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>2
gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg                           27
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>3
gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg                           27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>4
gggggggtgg gggggtgggg gggtggg                           27
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>5
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgt                           27
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>6
tctctctctc tctctctctc tctctct                      27
<210>7
<211>3
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>7
tgt                                                3
<210>8
<211>3
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>8
gtg                                                3
<210>9
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>9
tgtgtg                                             6
<210>10
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>10
gtgtgt                                             6
<210>11
<211>9
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>11
tgtgtgtgt                                          9
<210>12
<211>9
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>12
gtgtgtgtg                                          9
<210>13
<211>12
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>13
tgtgtgtgtg tg                                      12
<210>14
<211>12
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>14
gtgtgtgtgt gt                  12
<210>15
<211>14
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>15
tgtgtgtgtg tgtg                14
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>16
gtgtgtgtgt gtgtg               15
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>17
tgtgtgtgtg tgtgtgtg            18
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>18
gtgtgtgtgt gtgtgtgt            18
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>19
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg t        21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>20
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt g        21
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>21
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg          24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>22
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgt          24
<210>23
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>23
tttgtt                              6
<210>24
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>24
ggtggg                              6
<210>25
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>25
gggtgg                              6
<210>26
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>26
ttgttt                              6
<210>27
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>27
aagtaa                              6
<210>28
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>28
ccgtcc                       6
<210>29
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>29
tggttg                       6
<210>30
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>30
atgtat                       6
<210>31
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>31
aggtga                       6
<210>32
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>32
gagtga                       6
<210>33
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>33
gggtct                       6
<210>34
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>34
ccgtgg                       6
<210>35
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>35
gggtcc                       6
<210>36
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>36
ctgtct                      6
<210>37
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>37
tcgttc                      6
<210>38
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>38
cggtgc                      6
<210>39
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>39
ttgtgg                      6
<210>40
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>40
gggttt                      6
<210>41
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>41
ggttgg                      6
<210>42
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>42
ggaagg                      6
<210>43
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>43
ggccgg                           6
<210>44
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>44
gggggg                           6
<210>45
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>45
gggagg                           6
<210>46
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>46
gggcgg                           6
<210>47
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>47
ggaggg                           6
<210>48
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>48
gtgggg                           6
<210>49
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>49
ttaggg                           6
<210>50
<211>2
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>50
gt                               2
<210>51
<211>2
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>51
tg                         2
<210>52
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>52
gtgg                       4
<210>53
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>53
ttgt                       4
<210>54
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>54
gtgt                       4
<210>55
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>55
ttgg                       4
<210>56
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>56
ggtg                       4
<210>57
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>57
tgtt                       4
<210>58
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>58
ggtt                         4
<210>59
<211>4
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>59
tgtg                         4
<210>60
<211>5
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>60
ggtgg                        5
<210>61
<211>5
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>61
gggtg                        5
<210>62
<211>7
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>62
ggggtgg                      7
<210>63
<211>7
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>63
gggtggg                      7
<210>64
<211>7
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>64
tgggtgg                      7
<210>65
<211>7
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>65
gggtggt                      7
<210>66
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>66
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg    27
<210>67
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>67
gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg    27
<210>68
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>68
gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg    27
<210>69
<211>27
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>69
gggggggtgg gggggtgggg gggtggg    27
<210>70
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>70
tgtgtg                           6
<210>71
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>71
gtgtgt                           6
<210>72
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>72
tttgtt                           6
<210>73
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>73
ggtggg                                               6
<210>74
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>74
gggtgg                                               6
<210>75
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>75
ttgttt                                               6
<210>76
<211>45
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>76
gccgagaagg tgcgcaacct gccggctggc cacggactga acgct    45
<210>77
<211>45
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>77
acgccgacgt cgtctgtggt ggggtgtcta ccgccaacgc gacgg    45
<210>78
<211>45
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>78
cgactacaac ggctgggata tcaacacccc ggcgttcgag tggta    45
<210>79
<211>6
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>79
ccaccc                                               6
<210>80
<211>5
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>80
cggta                                                5
<210>81
<211>11
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>81
gtgtgtttgg t               11
<210>82
<211>11
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>82
ggttttgttt g               11
<210>83
<211>12
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸
<400>83
ttgttttttt tg              12
<210>84
<211>4
<212>PRT
<213>合成肽
<400>84
Tyr Val Ala Asp
1
<210>85
<211>4
<212>PRT
<213>合成肽
<400>85
Asp Glu Val Asp
1
<210>86
<211>5
<212>PRT
<213>合成肽
<220>
<221>SITE
<222>(4)..(4)
<223>X＝Any Amino Acid
<400>86
Ile Leu Glu Xaa Cys
1               5
<210>87
<211>4
<212>PRT
<213>合成肽
<400>87
Ile Glu Gly Asp
1

Claims (5)

1.一种组合物，包含具有选自SEQ ID NOs：7-18、22-48、50-66、70-75、79和80-83的序列的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸。
2.权利要求1的组合物，其中所述序列选自SEQ ID NOs：7、8、9、10、22-48、50-65、70-75、79和80。
3.权利要求1的组合物，还包含可药用载体。
4.权利要求1的组合物，还包含化疗剂。
5.权利要求4的组合物，其中所述化疗剂选自抗代谢剂、烷化剂和激素拮抗剂。
CNB008188580A 1999-12-13 2000-12-12 治疗用合成寡核苷酸 Expired - Fee Related CN100445380C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17032599P 1999-12-13 1999-12-13
US60/170,325 1999-12-13
US22892500P 2000-08-29 2000-08-29
US60/228,925 2000-08-29

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008101740188A Division CN101491536B (zh) 1999-12-13 2000-12-12 治疗用合成寡核苷酸

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1433469A CN1433469A (zh) 2003-07-30
CN100445380C true CN100445380C (zh) 2008-12-24

Family

ID=26865979

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008101740188A Expired - Fee Related CN101491536B (zh) 1999-12-13 2000-12-12 治疗用合成寡核苷酸
CNB008188580A Expired - Fee Related CN100445380C (zh) 1999-12-13 2000-12-12 治疗用合成寡核苷酸

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008101740188A Expired - Fee Related CN101491536B (zh) 1999-12-13 2000-12-12 治疗用合成寡核苷酸

Country Status (18)

Country Link
US (2) US7157436B2 (zh)
EP (2) EP1238070B1 (zh)
JP (1) JP4772245B2 (zh)
KR (1) KR100829646B1 (zh)
CN (2) CN101491536B (zh)
AT (2) ATE370231T1 (zh)
AU (1) AU785212B2 (zh)
CA (1) CA2393808A1 (zh)
CZ (1) CZ20022372A3 (zh)
DE (2) DE60036019T2 (zh)
DK (2) DK1238070T3 (zh)
ES (2) ES2288883T3 (zh)
HU (1) HUP0300627A3 (zh)
IL (2) IL150196A0 (zh)
MX (1) MXPA02005842A (zh)
NO (1) NO330508B1 (zh)
PT (1) PT1238070E (zh)
WO (1) WO2001044465A2 (zh)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032610A1 (en) 1996-06-03 2003-02-13 Gilchrest Barbara A. Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
EP1181304B1 (en) 1999-04-08 2007-10-10 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of g-righ oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US7960540B2 (en) 1999-04-08 2011-06-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US8114850B2 (en) 1999-04-08 2012-02-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
CA2393808A1 (en) * 1999-12-13 2001-06-21 Bioniche Life Sciences Inc. Anti-cancer synthetic oligonucleotides
EP1313853B1 (en) 2000-08-29 2012-03-21 Bioniche Life Sciences Inc. Modulation of fas and fasl expression by a synthetic phosphodiester oligonucleotide and an anti-fas antibody
EP1985702A3 (en) * 2000-12-08 2010-08-18 Coley Pharmaceutical GmbH CPG-like nucleic acids and methods of use thereof
US7087586B2 (en) * 2001-04-24 2006-08-08 Bioniche Life Sciences, Inc. Oligonucleotide compositions and their use to induce differentiation of cells
JP4469603B2 (ja) 2001-08-17 2010-05-26 バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド アポトーシス誘導ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのコンホメーション−活性の関係
DE60208400T2 (de) 2001-10-03 2006-07-06 Bioniche Life Sciences Inc., Belleville Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide
KR20050009697A (ko) * 2002-04-22 2005-01-25 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도
AU2004226605A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
MXPA05012421A (es) * 2003-05-16 2006-02-22 Hybridon Inc Tratamiento sinergistico de cancer usando inmunomeros junto con agentes quimioterapeuticos.
JP2008531018A (ja) * 2005-02-24 2008-08-14 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激性オリゴヌクレオチド
EP1863538A4 (en) * 2005-03-09 2009-01-14 Baylor College Medicine DIRECT INVERSION OF CD4 + T CELL LYMPHOCYTE INHIBITOR FUNCTION VIA TOLL-TYPE 8 RECEIVER SIGNALING
US20090087456A1 (en) * 2005-09-07 2009-04-02 James Edward Eyles Adjuvanted vaccine
CN102439149B (zh) * 2009-02-12 2018-01-02 库尔纳公司 通过抑制针对胶质细胞衍生神经营养因子(gdnf)的天然反义转录物来治疗gdnf相关的疾病
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
WO2011008305A1 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Rna antagonists targeting gli2 for the treatment of leukemia
US20150045248A1 (en) * 2012-02-28 2015-02-12 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Method for identifying disease associated with abundance of tdp-43 in cell
EP4000597A1 (en) * 2020-11-17 2022-05-25 The Boots Company plc Tetrapeptide and compositions comprising tetrapeptides
WO2023122762A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Camp4 Therapeutics Corporation Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994008053A1 (en) * 1992-09-29 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
WO1996023508A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences
WO1997020924A1 (en) * 1995-12-04 1997-06-12 Saicom S.R.L A class of oligonucleotides, therapeutically useful as antitumoural agents
CN1193280A (zh) * 1995-08-14 1998-09-16 Icn药品公司 用于治疗的cd44基因表达的控制
CN1202900A (zh) * 1995-11-21 1998-12-23 Icn药品公司 用il－8和il－8受体的反义寡核苷酸抑制肿瘤生长

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3172815A (en) * 1962-04-24 1965-03-09 Warner Lambert Pharmaceutical Method for preparing reticulo-endo-thelial system stimulant and stimulant thereof
FR2160326B1 (zh) * 1971-11-19 1975-02-07 Anvar
US4152423A (en) * 1971-11-19 1979-05-01 Agence Nationale De Valorisation De La Recherche (Anvar) Immunological agents
US4010257A (en) * 1973-02-23 1977-03-01 Burroughs Wellcome Co. Biological extracts
US3976544A (en) * 1973-06-19 1976-08-24 The Agence Nationale De Valorisation De Le Recherche Water-soluble immunological adjuvants, in particular for vaccines, obtained from mycobacteria and related microorganisms and process for their extraction
FR2374042A1 (fr) * 1976-06-04 1978-07-13 Merieux Inst Nouveau medicament immunostimulant et son procede de preparation
JPS54140710A (en) * 1978-03-10 1979-11-01 Mitsui Toatsu Chem Inc Anti-tumor substance and its preparation
DE3011461C2 (de) * 1980-03-25 1986-10-30 Dr. Madaus & Co, 5000 Köln Verwendung von Propionibakterien
US4520019A (en) * 1982-04-29 1985-05-28 Ribi Immunochem Research, Inc. Stable composition and preparation thereof
US4579941A (en) * 1982-08-13 1986-04-01 Mitsuitoatsu Chemicals, Inc. Thermally-denatured deoxyribonucleic acid MD-011 and antitumor agent
US4663306A (en) * 1983-09-23 1987-05-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Pyridine-soluble extract-refined detoxified endotoxin composition and use
GB8404280D0 (en) * 1984-02-17 1984-03-21 Stanford J L Biological preparations
DE3423234A1 (de) * 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4744984A (en) * 1985-10-08 1988-05-17 Vetrepharm Research, Inc. Antiviral immunotherapeutic agent and preparation thereof
US4877611A (en) * 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
DE3723075A1 (de) * 1987-07-11 1989-01-19 Boehringer Mannheim Gmbh Eukaryotische expressionsvektoren mit multimeren enhancer-subelementen, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US4958013A (en) * 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
CA1340994C (en) * 1989-09-21 2000-05-16 Rudolf Edgar Dr. Falk Treatment of conditions and disease
WO1992007095A1 (en) * 1990-10-15 1992-04-30 Stratagene Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
IE920561A1 (en) * 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for thrombin and methods of use
WO1998017320A1 (en) * 1991-07-03 1998-04-30 Hyal Pharmaceutical Corporation Use of hyaluronan in gene therapy
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
DE69418183T2 (de) * 1993-01-29 1999-12-16 Vetrepharm Inc Immunotherapeutische zubereitung
US5567604A (en) * 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
CN1154702A (zh) * 1994-05-25 1997-07-16 海布里登公司 具有抗巨细胞病毒活性的寡核苷酸
ATE266734T1 (de) * 1994-08-30 2004-05-15 Commw Scient Ind Res Org Pflanzentraskriptionsregulator von circovirus
IN181358B (zh) * 1995-02-14 1998-05-30 Bioniche Inc
ZA964446B (en) * 1995-06-06 1996-12-06 Hoffmann La Roche Oligonucleotides specific for hepatitis c virus
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
CA2255822A1 (en) * 1996-05-20 1997-11-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services Oligonucleotides which specifically bind retroviral nucleocapsid proteins
PT1003525E (pt) * 1997-08-05 2003-03-31 Bioniche Life Sciences Inc Composicao e metodo para a regulacao da proliferacao e da morte celular
US6255473B1 (en) * 1997-08-29 2001-07-03 Duke University Presenilin-1 gene promoter
AP1775A (en) * 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
CA2393808A1 (en) * 1999-12-13 2001-06-21 Bioniche Life Sciences Inc. Anti-cancer synthetic oligonucleotides
US20020091095A1 (en) * 1999-12-13 2002-07-11 Phillips Nigel C. Modulation of Fas and FasL expression
CA2395493C (en) * 1999-12-28 2010-06-22 Bioniche Life Sciences Inc. Hyaluronic acid in the treatment of cancer
DE60208400T2 (de) * 2001-10-03 2006-07-06 Bioniche Life Sciences Inc., Belleville Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide
KR20050009697A (ko) * 2002-04-22 2005-01-25 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994008053A1 (en) * 1992-09-29 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
WO1996023508A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences
CN1193280A (zh) * 1995-08-14 1998-09-16 Icn药品公司 用于治疗的cd44基因表达的控制
CN1202900A (zh) * 1995-11-21 1998-12-23 Icn药品公司 用il－8和il－8受体的反义寡核苷酸抑制肿瘤生长
WO1997020924A1 (en) * 1995-12-04 1997-06-12 Saicom S.R.L A class of oligonucleotides, therapeutically useful as antitumoural agents

Also Published As

Publication number Publication date
ATE455851T1 (de) 2010-02-15
NO330508B1 (no) 2011-05-09
ATE370231T1 (de) 2007-09-15
DE60036019T2 (de) 2008-05-29
US20010041681A1 (en) 2001-11-15
EP1867718A2 (en) 2007-12-19
US7157436B2 (en) 2007-01-02
EP1867718A3 (en) 2008-04-02
IL150196A0 (en) 2002-12-01
EP1238070A2 (en) 2002-09-11
NO20022820D0 (no) 2002-06-13
JP2003517041A (ja) 2003-05-20
CN1433469A (zh) 2003-07-30
ES2288883T3 (es) 2008-02-01
WO2001044465A2 (en) 2001-06-21
KR20020079752A (ko) 2002-10-19
KR100829646B1 (ko) 2008-05-16
AU785212B2 (en) 2006-11-09
HUP0300627A2 (hu) 2004-06-28
AU1847901A (en) 2001-06-25
DE60043759D1 (de) 2010-03-11
WO2001044465A3 (en) 2001-11-29
MXPA02005842A (es) 2003-10-14
IL150196A (en) 2009-06-15
PT1238070E (pt) 2007-11-06
NO20022820L (no) 2002-08-08
US20070213291A1 (en) 2007-09-13
JP4772245B2 (ja) 2011-09-14
CN101491536A (zh) 2009-07-29
EP1867718B1 (en) 2010-01-20
CN101491536B (zh) 2012-07-04
EP1238070B1 (en) 2007-08-15
CA2393808A1 (en) 2001-06-21
ES2340807T3 (es) 2010-06-09
DE60036019D1 (de) 2007-09-27
DK1238070T3 (da) 2007-12-03
DK1867718T3 (da) 2010-04-12
HUP0300627A3 (en) 2005-11-28
CZ20022372A3 (cs) 2002-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100445380C (zh) 治疗用合成寡核苷酸
JP6885867B2 (ja) 組合せ腫瘍免疫療法
Krieg Development of TLR9 agonists for cancer therapy
EP2573176B1 (en) Tumour growth inhibitory compounds and methods of their use
Gray et al. CpG-B ODNs potently induce low levels of IFN-αβ and induce IFN-αβ-dependent MHC-I cross-presentation in DCs as effectively as CpG-A and CpG-C ODNs
US7662792B2 (en) Modulation of Fas and FasL expression
JP2020515625A (ja) 細胞死およびインターフェロン発現の差次的誘導のための組成物および方法
EP1313853B1 (en) Modulation of fas and fasl expression by a synthetic phosphodiester oligonucleotide and an anti-fas antibody
Tarhini et al. Early development of the toll-like receptor 9 agonist, PF-3512676, for the treatment of patients with advanced cancers
AU2007200536A1 (en) Therapeutically useful synthetic oligonucleotides
AU2001268863B2 (en) Modulation of FAS and FASL expression
WO2013007703A1 (en) CLASS A CpG OLIGONUCLEOTIDES FOR PREVENTION OF VIRAL INFECTION IN CATS
ES2383671T3 (es) Modulación de la expresión de Fas y FasL por un oligonucleótido-fosfodiéster sintético y un anticuerpo anti-Fas
AU2001268863A2 (en) Modulation of FAS and FASL expression
AU2001268863A1 (en) Modulation of FAS and FASL expression

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1056747

Country of ref document: HK

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20081224

Termination date: 20131212