HU227921B1 - Készítmény és eljárás sejtproliferáció és sejtpusztulás szabályozására - Google Patents

Description

Képviselő:

Dannbia

Szabadalmi ás Védjegy Iroda Kft. Budapest

Készítmény és eljárás sejtproliferáció és sejtpusztulás szabályozására

A találmány tárgyát mycobacterium eredetű DNS-t (B-DNSt; és egy első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítmény képezi, amelyben a B-DNS hatásosan választ indukál valamely állat érzékeny sejtjeiben. Közelebbről, a találmány tárgyát hócoba otéri u;r phlei eredetű DNS-t dá-DNS-tá és egy első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítmény képezi, amelyben az MDNS gátolja érzékeny sejtek proliferációját, és azokban apoptózist vált ki, valamint az immunrendszer érzékeny sejtjeit bíoaktlv -molekulák termelésére készteti.

A találmány tárgyát képezi rovásba a találmány szerinti készítmények alkalmazása rák kezelésére, Ezen felül feltárunk még eljárásokat Ή-DbS előáll írására és alkalmazására.

Aktus zárnunk: «152 2- 51i 7 / KA

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható rákos elváltozások kezelésére ás megelőzésére.

Több magvú organizmusokban, valamely szövetet alkotó sejtek számat a sejcproiiferáciö sebességének a sejtpusztulás sebességével kisebbített értéke határozza meg. Apoptőzison sejtpusxtriás genetikailag programozott, nem gyulladásos, energiafüggő formáját értjük szövetekben, amely például, de anélkül, hogy igényünkot azokra korlátoznánk, felnőtt szöveteiben megy végbe. Az apoptözls négy, egymást követő lépést foglal magában: ·!) a sejtpusziulásnak történő elköteleződést, exsracelluláris vagy intracelluláris kiváltó okok által; (2) sejtpusztolást, Intracelluláris proteázok és nukleonok, aktiválódása által; (3) az elhalt sejt bekebelezödését más sejtekbe; és {4} az elhalt sejt l.efoontödását. a fagocltasejtek i.i zoszömáiban ISteller H.: Science 267, 1445 U9SS)}. A sejtöröliferáoiő, se jtapoptőzis, vagy ezek kombinációfának szabályozásában bekövetkező rendellenességek különböző betegségek patogenezlsével hozhatók kapcsolatba, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, rákkal, idegrendszeri degenerációval, autoimmun- és szívbetegségekkel.

Apoptözls kiváltható sejtfelszíni, receptorokhoz, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, Fás- ]üő95~) receptorhoz [French és munkatársai: •Journal ot Celi Siology 113, 355 :1993)] és 1. típusú tumor nekrózis faktor receptorhoz iTNFRl-hez) kötődő 1 i. ga mit mokkái. A Fást Fas-hoz kötődve, a TNF TNFRi-hez kötődve intraceliuláris jelátvitelt indít meg, amely ciszteín-aszpartilproteázok (,,s'aspaee-ok) aktiválódását eredményezi, amelyek viszont megindítják az apoptózzs végrehajtásához vezető letáiis proteoiitikus kaszkádot, amely a nukleáris DMS fragmentáiődásával, nukleáris mátrixproteinek (,,n;.;ciea.r rozs proteiné, NuMA) kiszabadulásával, és sejtszubsztrátkontaktas elvesztésével jár (Muzío és munkatárséti: Cell SS, 817 ti 99 Υ j ...

Apoptözis váltható ki intracailu1áris proteinekkel is, például, de anélkül, hogy igényünket azokra korlakoznánk, p53Zp2i-szabáiyozókkal (Levine A..: Cell. 88, 823 (1997)1. A p53/p£l apoptózist közvetítő gének, például - de anélkül., hogy igényünket azokra korlátoznánk szabadgyökök keletkezését eredményező^ proteineket kódoló gének expresszi óját indukáló transzkripciós faktorként hat, amely proteinek viszont a sejt mitokonórizmainak károsodását okozzák, miáltal azok tartalma a oitoplazmáha szivárog, és apoptotikus ,,caspa.se-ezimekef aktivál (Pólyák és munkatársai: Natúré 389, 300 (1997)1.

Rákon atípusos sejtek rendellenes felhalmozódását értjük, amelynek oka lehet túlzott prolifsráeió, elégtelen apoptözis, vagy a kettő kombinációja. Rákok létrejöttének ontogenezisében szerepet fcuiajdonitanak apoptőzíssal· kapcsolatos génekben, például - de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk Fás-, TNFRI- és p53/p2i~ génekben létrejött mótátünknak {Levine A. : deli 88, 328 (1397;; Fisher D„: Cell 78, 529 (1994)1. Az apoptözis nem csat rákos patogenezzse, de azok rákellenes terápiával szemben mutatott reziszteneiájának valóséinüsége szempontj á b 61 i s i én y e g e s .

Az apoptözisindukci.óval szemben mutatott rezisztencia a többszörös drogrezisztencia („mai tzp.l e öreg nőnemeik ADR) fonto-s meghatározó elemévé vált, amely magyarázatot adhat a kezelési kudarcok jelentős részére. Az ADR, azaz strukturális és funkcionális tekintetben egymássá), rokonságban nem álló kemoterápiás hatóanyagokkal, szemben mutatott egyidejű rezisztencia, lehet vele született, és szerzett. Azaz, egyes rákok eleve nem reagálnak terápiára, míg más, eleinte terápiára érzékeny rákokban, drogrezisztencia. alakul ki. Míg kemoterápiás hatóanyagok elsődlegesen úgy fejtik ki terápiás hatásukat, hogy «poptézist váltanak ki. ráksejtekben, a terápiás hatóanyag hatásosságát megszüntető drogrezisztencia közvetlenül vagy közvetetten csökkent mértékű apoptözishoz vezet, és általánosságban, rossz prognózist jelent a különböző rákoknál.

Citoiizisen a sejt teljes vagy részleges megsemmisülését értjük, amelyet az immnnrendsaer közvetít. A lei rácban Immunrendszeren monocitákst, makrofágokat és ieukociákat értünk. Aktivált makrofágok és monociták bioaktív molekulákat termeinek, amelyek felgyorsítják, ampiif í kái. jak és modulálják a válaszokat valamely állat érzékeny sejtjeiben. Termelésen szintézist és szekréciót értünk, ilyen bioaktív molekulák például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, eitokinek és reaktív oxigénvegyületek.

eitokinek, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a felsoroltak; intetlenkin-1 {IL1) , ί n f e r .1 e u k i.n - 6 {J L - 6}, i n t e r 1 eu k i n- 10 (IL-19), in t e r1éu kin-12 :IL-Ü. és GN-CSF. Az lü-lí egymagában, vagy más cítokinekkei kombinálva elősegíti leukocíták érését, például, be anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra. korlátoznánk, 8-dmfoczták, CD4+ T-sejtek, Göd T-sejtek os NKsejtek í ,,nufurai kilier'”; NK) érését, és kiváltja az interferon-gamma szekrécióját. Az lL-12-rŐi leírták, hogy bizonyos ráksejtekben rákellenes hatása van (Stine és munkatársai; AnnaIs NY Academy of Science 795, 420 (1996) ; Chen és munkatársai: Journal of Tmwnoíogy 159, 351 (1997)1. Ez az aktivitás például, d.e anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, specifikus citoiitikas T-limfocIták akti vádé iában, természetes öiősejfcek (NK) aktivációsában és az IP-lö-nek, valamint Mlg-nek elnevezett anti-angiogén. proteinek indukciójában nyilvánul meg, Az 1FI0 gátolja rákok növekedését és metaoztázisok létrejöttét, gátolja a tumor indukált neovaszkulari zádöt, továbbá, NK-sejteket aktivál [Angillo és munkatársai:: Annals NY Academy of Sciences 7 95, 158 (1996)1:. A GM-CSF-rol leírták, hogy bizonyos ráksejtek esetében rák kialakulását elősegítő hatása van (Hswkyarő és munkatársai; Journal of Uroiogy 150, 514 (19931 ] .

Reaktív oxígénvegyöietek például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, nitrogén-oxld, szóperoxidgyökök és hidroxilgyökök. A nitrogén--oxld, szuperoxídgyofcök és hidroxilgyökök - más hatások mellett apoptözzst és dtoiizist 'váltanak ki érzékeny célsejtekben.

*

Biológiai és kémiai eredetű, természetes ás szintetikus feszi menyei, például, hektár lmokból származó készítmények alkalmazását leírták érzékeny sejtek st Imoláiásóra vagy gátlására valamely állatban, .dycobaoterinm-fa jókból származó sejtfaikészítményeket alkalmaztak betegségek, például rákok kezelésére tiásd a 4 503 048 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leíráséi. Ilyen készítmények alkalmazásával elért kedvező terápiás eredmények azonban változóak és ellentmondásosak, és - úgy tűnik - függnek a kész! tmény előállításának, tisztításának és beadásának módjától; valamint a készítmény stabilitásától.

A technika megelőző állása szerinti rákellenes hatóanyagok legkevésbé sem bizonyultak megfelelőnek klinikai alkalmazásra. Szamos ilyen hatóanyag hatástalan, FBI sebetf és munkatársai: Science 274, 373 (19.96)!, toxikus, jelentős meilékhatásokkal bir fhamm és munkatársai: Journal of üroiogy 15 3, 1444 (1995)), drogrez.isztenoía vagy immanérzékenyités kialakulásához vezet, és legyengíti a recipienst. Ezen felül, számos ilyen hatóanyag hatásossága Fás-, főiül·- vagy p53/p21-függő.

Szükség van tehát új terápiás hatóanyagokra, amelyek gátolják ráksejtek proiiferáciőiát, apoptozis váltanak ki, és az immunrendszer érzékeny sejtjeit oitokinak és reaktív oxigénvegyületek termelésére késztetik, tzeknex a terápiás hatóanyagoknak alkalmasaknak keli lenniük rákéilenes hatóanyagokként, és más rákellenes hatóanyagok kiegészítő terápiájaként történő alkalmazásra. hiegészitő terápiáról akkor beszélünk, ha a hatóanyag alkalmas más rákellenes hatőanya·* ♦ 0* »« « * > X A'

X * ^Γ 0 *♦ gokkal együtt alkalmazva a kezelés hatékonyságának fokozására. Ezen felül, ilyen terápiás hatóanyagok előállításának egyszerűnek és viszonylag olcsónak kell lennie; azok hatásának az egymástól függetlenül előállított tételek vonatkozásában reprodukáibatönak kell lennie; aktivitásuknak stabilnak keli maradnia az idő elteltével; és azok ráksejtekre kifej tett hatása minimális mértékű tozicifással járó beadási rendek szerint elérhető keli, hogy legyen.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldás lényegét;.

A találmány szerinti megoldással a fenti igényt kívántok kielégíteni, olyan készítmény kifejlesztésével, amely myoobacterium eredetű DbS-t (B-DNS-t) és egy első, gyögyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, amely választ indukál valamely állat érzékeny sejtjeiben. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi éhezőbe o toriam phle.i DKS-t íM-DNS-t} és egy első, gyógyászatiíag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítmény, amely például - de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra kor léteznénk a következő válaszokat vélt ki: gátolja érzékeny sejtek, például - de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk ···, ráksejtek proliieráoiöját, és azokban apopfdzist vált ki, valamint az immunrendszer érzékeny sejtjeit bioaktiv molekulák termelésére készteti.

Az M-DNS-t tartalmazó készítmény egyszerűen és viszonylag olcsón előállítható, aktivitása az egymástól függetlenül előállított tételek vonatkozásóban reprodukálna tó, aktivztása az idő elteltével stabil, és minimális mértékű toKioltással járó beadási rendek szerint adagolva hatásos.

M~DKS~t éhzcofeac tórium phiei (M. phle.il organizmusból állítottunk elő lizozim- és proteináz-K-emésztéssel, nátrium-dodeci1-szulfát kezeléssel, íenolextrakcióvai és etanolprecipitációval ÍM. phiei DNS}. Más eljárás szerint, M-DNSt előállíthatunk úgy, hegy M. páiey sejteket roncsolunk, a szilárd komponenseket Összegyűjtjük, és M-DNS-ből, valamint M. ph.lzy eredetű sejtfalból álló komplexet ί,,Μ-DNA. - M. psley cell mali compiex; MCC; állítunk elő. h feldolgozás során ez M-DNS degradáciőgának minimalizálására DNáz-mentes reagenseket alkalmazunk. Az HCC-boi fenolextrakcióva.1 és etanolprecipitérrévaI állítunk e lő M-DNS-t ÍMüC-DNS-ti ,

Az M-DNS-t és egy első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó· M-DNS-készitményt olyan dózisban adjuk be állatnak, amely elegendő érzékeny sejtek proliferácíöjának gátlására, és azokban apoptózis kiváltására, továbbá az immunrendszer érzékeny sejtjeit biosktiv molekulák termelésére készteti, ilyen első, győgyászatiíag elfogadható hordozóanyagként például, de anélkül, hogy igényűnket a felsoroltakra korlátoznánk, alkalmazhatunk folyékony hordozóanyagokat, szilárd hordozóanyagokat vagy mindkettőt. Folyékony hordozóanyagokként alkalmazhatunk például, de anélkül, hogy Igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, vizes bázisa hordozóanyagot, non vizes názzsü hordozóanyagot vagy mindkettőt,. Szilárd hordozóanyagokként adtkalmazkatünk például, de anélkül; hogy igényünket, a felsoroltakra korlátoznánk, kémiai úton szintetizált hordozóanyagokat és tér« ♦♦ mé.szetes hordozóanyagokat- Vizes bázisú hordozóanyag lehat például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, Az, fiziológiás söoldat vagy fiziológiás pufférak. Nem vizes bázisú hordozóanyagokként megemlíthetjük például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következőket: olajokat, vagy más, hidrofób, folyékony készítményeket és iíposzómákat. Természetes hordozóanyagokként aikalmazhatunk például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, proteinmentesitett, iipidmentesitett,· mosott A- phiey sejtfalat, amelyben az H-DNS a óh phiey eredetű sejtfalon, azzal alkotott komplexként (MAC-ként) van jelene.

Ezen felül, az M-DNS-t beadhatjuk egy második, gyogyászatilag elfogadható hordozóanyagban, Ilyen második, győgyászatilag elfogadható hordozóanyagok például,· de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, lehetnek folyékony hordozóanyagok és/vagy szilárd hordozóanyagok. Folyékony hordozóanyag ismét csak lehet vizes bázisú hordozóanyag, nem vizes bázisú hordozóanyag vagy mindkettő. Szilárd hordozóanyagként ismét csak alkalmazhatunk kémiai úton szintetizált hordozóanyagokat ős természetes hordozóanyagé ka t A találmány szerinti h-Dbo~készítmények alkalmasak betegség megelőzésére, kezelésére és eliminálására. Azok különösen előnyösen alkalmazhatók nem kívánt és szabólyozstian sejtproiiferáoiö: által közvetített betegségek, például rákos betegségek kezelésére- Az M-BVS-kész ítmény alkalmazható továbbá kiégeszitő terápiaként, egyéb rákellenes ható»» (.,.

anyacjok hatásosságának fokozására. Ilyen hatóanyagok példáal, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a kővetkezők; drogok, immunst imulánsok, antigének, ellenanyagok, vakcinák, radioaktív és kemoterápiás hatóanyagok, genetikai úton előállított, biológiai technológiával módosított és kémiai úton szintetizált hatóanyagok, valamint „sejthalálmolekulákat'' megcélzó, azokat aktiváló vagy inakéiváiő, és érzékeny sejtek proiiferáciőját gátló, azokban apoptőzist előidéző hatóanyagok.

Ennek megfelelően,, célúi tűztük ki valamely állat érzékeny sejtjeiben terápiás választ kiváltó készítmények és eljárások kifejlesztését.

A találmány szerinti megoldás további célja érzékeny sejtek proliferációgáh gátió készítmények és eljárások kifejlesztése volt.

Továbbá, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célunk az volt, hogy érzékeny sejtek apotózisát kiváltó készítményeket és eljárásokat dolgozzunk ki,

A találmány szerinti megoldás további célja apoptőzist Fas-receptortól függetlenül kiváltó készítmények és eljárások kidolgozása volt.

A találmány szerinti megoldás további célja TNFR1receptortői függetlenül apoptőzist kiváltó készítmények és eljárások kidolgozása volt.

Ezen felül, célul tűztük ki olyan készítmények és eljárások kidolgozását, amelyek pS3/p21-tői függetlenül váltanak kz apoptőzist.

*

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek droqrezi.sztenciátöl függetlenül apoptózist váltanak ki.

Ezen felül, a találmány szerinti megoldás célja érzékeny sejtekben ,,capss.se''-akii vitástást kiváltó készítmények és eljárások kidolgozása volt.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kifejlesztése volt, amelyek az immunrendszer érzékeny sejtjeimen olyan választ váltanak ki, amely bioaktiv molekulák termelésében nyilvánul meg.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és elzárások kifejlesztése volt, amelyek az immunrendszer érzékeny sejtjeit broaktiv molekulák termelésre késztetik.

Ugyancsak célul tűztük ki olyan készítmények és eljárások kidolgozását, amelyek az immunrendszer érzékeny sejtjeit citokinek termelésre késztetik.

Az említetteken felül, célul tűztük ki olyan készítmények és eljárások kidolgozását, amelyek az immunrendszer érzékeny sejtjeit 1L-S termelésre késztetik.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kifejlesztése volt, amelyek az immunrendszer érzékeny sejtjeit 1L-I0 termelésre késztetik.

Ezen felül, a találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek az immunrendszer érzékeny sejtjeit IL-12 termelésére késztetik.

.»* «··♦

Ugyancsak célul fűztük ki olyan készítmények és eljárások kidőlgozásáz, amelyek az ímiaunrendszer érzékeny sejtjeit reaktív ozzgénvegyületek termelésre késztetik.

Célul tűztük továbbá olyan készítmények ás eljárások kifejlesztését, amelyek hatásosak rák megelőzésére valamely állatban.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek alkalmasak rak hatékony kezelésére valamely állatban.

á találmány szerinti megoldás további célja olyan készítménye?: és eljárások kidolgozása volt, amelyek hatásosak rák eliminálására valamely állatban.

Továbbá, célúi tűztük ki olyan készítmények és eljárások kidolgozását, amelyek hatásosak egyéb rákellenes terápiák kiegészítő terápiájaként.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek hatásosak kémiai rákellenes hatóanyagok (kemoterapeutikernek) kiegészítő terápiájaként.

Ezen télül, a találmány szerinti megoldás célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek hatásosak biológiai rákellenes hatóanyagok kiegészítő terápiájaként ,

Továbbá, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célunk az volt, hogy broiőyiaí technológiákkal módosított rákellenes hatóanyagok kiégészztő terápiádaként hatásos készétményeket és eljárásokat dolgozzunk ki.

Λ * 9 Φ ·.·

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek hatásosak rákellenes vakolnák kiegészítő terápiájaként.

Az említetteken felül, a találmány szerinti megoldás célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek hatásosak nukleinsav alapú rákellenes vakolnák kiegészítő terápiájaként.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények és eljárások kidolgozása volt, amelyek hatásosak sugárterápia kiegészítő terápiájaként.

Céinl tűztük továbbá, nem terjesen differenciálódott sejtek végső dífferencíálódását kiváltó készítmények és eljárások kidolgozását.

Továbbá, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célunk az volt, hogy nagy mennyiségekbsn előállítható ké s ζ ítmé n ye két fe j1essz ün k ki.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények kifejlesztése volt, amelyek viszonylag olcsón előáll1thatók.

Célul tűztük ki továbbá olyan készítmények kifejlesztését, amelyek, az egymástól függetlenül, előállított tételek vonatkozásában reprodukálható aktivitást mutatnék.

A találmány szerinti megoldás további, célja olyan készítmények kifejdesziése volt, amelyek stabilak maradnak az idő elteltével.

Célul, tűztük továbbá olyan készítmények kifejlesztését, melyek hatásosak maradnak az idő elteltével.

Jft.

A találmány szerinti megoldás további célja olyan készítmények kifejlesztése veit, amelyek minimális mértékben toxikusai: a recipiensrs.

A találmány szerinti megoldás további, célja olyan készítmények kifejlesztése volt,- amelyek nea okoznak anaphyiaxias reakciót a recipiensten.

Ezen felül, a találmány szerinti megoldás célja olyan készítmények kidolgozása volt, amelyek nem érzékenyitik a recipienst tuberkuiin-bönpróbákra,

A találmány ismertétéit és további célkitűzései még világosabbakká válnak a találmány szerinti megoldás alábbi részletes feltárása és a csatolt igénypontok alapján,

A következőkben ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat .

Az 1, ábrán lt, pbiey eredeté DNS és MCC-DN3 olígonukieotid-elonzlását ábrázoltuk,

A 2, ábrán HT-I376-, HT-1.197-, Β-16--Ώ--, THR-1-, RAN264.7-, Jer kát-, Ht-tO·-, HL-nO-NX-i-ráksejtek prolii érádéjának gátlását ábrázoltuk M, tn.loy eredetű tüü (2.A1, MCéDNS (2.B), bor jót imusz-DNS (2. A t 2.B; és béringsperma-DNS (2.A. & 2,B) alkalmazásával. Az eredményeket átlagérték, e/SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján.

A 3. ábrán HT-Í376-, HT-1197-, B-16-FI-,. THP-.1-, BAW264,7-, Jurkat-, HL-6J- és HD-60-MX-l-ráksejtok proliiéraelejának gátlását ábrázoltuk doü alkalmazásával. Az eredményeket átlagérték e/-SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján «

A 4. ábrán humán leukémiás IHP-1-monocíták proli.ferásiójának gátlását ábrázoltuk ál póioy eredete bal. NCC-DNe, HCC és hit-12 alkalmazásával.. Az eredményeket 3 független, kísérlet adatai alapján számítottuk ki, és átlagérték a/-3m értékekben, adtuk meg.

Az 5. ábrán HT-liél-nak (5.Aj és ΗΤ-1376-nek elnevezett

15.8} humán, hólyagráksejtek proliterációjának gátlását ábrázoltuk MCC és PPS alkalmazásával. Az eredményeket átlagérték + /-SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján.

A 6. ábrán DNS-fragmentáeió indukcióját ábrázoltuk humán, leukémiás THB-I-monocítákban PBS, hering-sperma-DNS, valamint kezeletlen és DNáz-I-enzimmel kezeit áh pnley eredetű DNS és MCÜ alkalmazásával. Három, hasonló eredményeket adó elvégzett kísérletből az egyik adatait ábrázoltuk, .A 7. ábrán DNS-fragmentácíó indukcióját ábrázoltuk humán, leukémiás ΊΉΡ-I-monocltákban PBS, kezeletlen és humán, leukémiás TüD-l-monocifákból, béring-sperma-DNS, valamint kezeletlen, és DNáz-I-enzímmel kezeit Pl phrey eredetű DNS, valamint hIL-12 alkalmazásával. Három elvégzett, hasonló eredményeket adó kísérletből az egyik adatait ábrázoltuk,

A 8. ábrán DNS-fragmentácíó indukcióját ábrázoltuk HT1197-nek (3.AS és HT-1376-nak (8.B; elnevezett, humán höiyagráksejlekben MCC és hlL-iz alkalmazásával. Három elvégzett, hasonló eredményeket adó kísérletből az egyik adatait ábrázoltuk.

A. 9. ábrán HÓI, A, pórén ereset! DNS, kód-Dón és her 1 ngsp e rma -DNS a 1 k a lma zás áva i. el őd. dó z e 11 NudA~ f e 1 s z a b adu iást ábrázoltunk botsán, leukémzás THr-1 -monocitákbdi, Ar eredményeket átlagérték O~sd értékekben adtok meg, 3 független kísérlet adatai alapján.

A lö. ábrán kezeletlen és DNáz-l-enzimmei kezelt ét.

ph.ley DNS, MCC-Dhb és MAG al kalmar ás árai előidézett bukiAfelszabadulást ábrázoltunk harsán, leukémiás TH3-l-monocitákbó.1, Az eredményeket átlagérték t/~SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján.

A 11. ábrán növekvő koncentrációjú Hf~137g~hak és HTllö7-nek elnevezett, humán hőlyagráksejtekböi MCC alkalmazásával előidézett huMA-felszabadulást ábrázoltunk. Az eredményeket átlagérték a/-SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján,

A 12. ábrán 1 mg/ml MCC vagy 100 gg/ml MCC alkalmazásával előidézett NuMA-felszabadulást ábrázoltunk HT-i137-nek 02. A) és HT-1376-nak 02.B; elnevezett, humán hólyagráksejtekből, 48 órás adótartam alatt. Az eredményeket átlagérték á/'-SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján.

A 13. ábrán huMA-felszabadulást ábrázoltunk ábS, CH--11e.llenanyagok, ZS4-ellenanyagok, ék páiey eredetű DNS, CH'11-eilenanyagok és M. phi-sy DNS, valamint 234-ellenanyagok és át pnley DdS jelenlétében inknbált uurkat-sejtekböi.

A 14 - ábrán 733. ék pniey eredetű Otb valamint ultrahangkezeit, BstUT-emésztett, autokiávozott és meiiiezett ét pnley DNS alkalmazásával előidézett duMA-felszabadulást ábrázoltunk humán, leukémiás THr-l-monocrtákbőí.

A 15. ábrán MCu és DKáz-1 - kezelt h'CC IQ-es jelzésű hepatőmavona1ra kifejtett rákellenes aktivitását ábrázoltuk tengerimaiacokhan. Az eredményeket átlagérték +/~S'D értékekben adtuk meg, 7-7 állatot számláló kísérleti csoportok adatai alapján.

A. 16. ábrán az MCC-cítotoxikus tatása indikátorának, tekintett LDH-felszabadul ást ábrázoltuk Ηϊ-1197-nek ás HT1376-~nak elnevezett humán höiyagrákssjtekből. Az eredményeket átlagérték é/-SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai alapján.

A 17. ábrán Ih-u, .IL~12~ és GM-CSF-termelés MCC~ stimulációját ábrázoltuk uT~119?~nek és ΗΤ-1375-nak elnevezett humán höiyagráksejtökben, humán THP-I-monocifákban, egéreredetű makrofágukban, egér-eredetű RAW-264.7-usonooi.tákban és egéreredetű leesel fezben. Az eredményeket átlagérték. + /-SD értékekben adtuk meg, 3 független kísérlet adatai aiapjan.

A 13, ábrán CDié-receptor ellent ellenanyagok hatását mutatjuk be humán THP-l-monocrbák MCC---DMS- és MCC-indukált

1L-12-termelésére.

A 19. ábrán cythochaiasín-D hatását mutatjuk he humán

ΤΗΡ-1-monocité.k M. nblev eredetű DNS, MCC-DNS és MCC alkalmazásával indukált in-12-termelésére.

A 2ü. ábrán kezeletlen és D-Náz-1-enzimmel kezelt MCCDNS, MCC és uegressin© hatását ábrázoltuk egéreredetű makrcfágok Ib-lz-termelésére.

A 21. ábrán egéreredetű RAb-lüé.7-monociták b0~ rermelésének MCC alkalmazásával történő stimulációját ábrazoltak.

A 22, ábrán 1L-6-, IL-1Ö-, 1L-12- és GM-CSF-termelődés 50 mg/kg MCC intraperitonnáiis injektálásával kiváltott stimuiáciöj át ábrázoltuk CD-p--eper ebben.

A 23. ábrán IL- íz-terme biáas 6,6 mg/kg MCC intravénás injektálásával kiváltott stimulációját ábrázoltuk CD-iegerekben,

A 24. ábrán az MCC stabilitását mutatjuk bs, 6 hónapos tárolás során.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány terápiás készítményre vonatkozik, amely bakteriális dezoxiribonukleinsavat ÍDMS-t) és egy első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, amely hatásos valamely állat - az embert is beleértve - érzékeny sejtjeiben válasz kiváltására. Közelebbről, a találmány mycobacterium. eredetű DNS-t (B-DNS-id és egy első, gyógyászat ilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítményre vonatkozik, amely hatásos valamely állat érzékeny sejtjeiben válasz kiváltására. Még közelebbről, a találmány .Myoobacterium púiéi DNS-t íM-udS-t! és egy első, gyogyászatideg elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítményre vonatkozik, amely hatásosan gátolja érzékeny sejtek proliferáoiőját, és azokban apoptózist vált ki, valamint az immunrendszer érzékeny sejtjeit bioaktiv molekulák termelésére készteti,

A találmány szerinti, M-DbC-t tartalmazó készítmény egyszerűen és viszonylag olcsón előállítható, aktiválása az egymástól függetlenül előállított tételek vonatkozásában, reprodukálható, stabil marad az idő elteltével. Továbbá, az minimálisan - ha egyáltalán - toxikus a recipíensrc, nem. okoz pozitív tuberkulinreakciót a reoípiensben, és ritkán vált ki anaphylaxiás választ & reoípiensben, még ismételt beadások esetén is.

A találmány gyakorlatba vétele során számos bakteriális faj alkalmazható, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következők; Corynsfora baktériumok, Corynebacterium-f a jók, Rhodococcus -faj ok, £' un a cserz un··- rajok, Sor de t el la -fa j ok, oson eb oh i u -f a j o k, Üst ezüa~f a jók, kocardia-faj ok és .hyrcőuc téri um~f azok. Előnyösen, a bakteriális Db‘S-t dycobacterium-fajbói állítjuk elő, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, M. phiey, AL smegmatis, M. fortuiíuin, AL kansasii, H. f abe.ro aios.is, AL bovis, Ab vaccase és AL aviun fajokból, legelőnyösebben., a mycobacteriális DNS-t M. pöiey elnevezésű Hycobacterium-fajbói állítjuk elő.

Az tí-DKS terápiás aktivitását fokozhatjuk például -- de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk a következő eljárásokkal: ugyanabból, vagy más bakteriális fajból származó stimuláló szekvenciák vagy DMS-konformáciők kémiai úton történő indnkálásáva1 vagy biotechnolögai úton történő amplifíkálásávai; vagy ugyanabból vagy más bakteriális fajból származó megfelelő stimuláló szekvenciákat vagy DhS-konformáciőkaf tartalmazó piazmidok alkalmazásával. Ezen felül, az M~DLS terápiás aktivitását fokozhatjuk például. úgy, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra kor0 * lakoznánk, hogy az M-DNS-t ás szintetikus vagy biológiai hordozón, azzal alkotott komplexként állítjuk elő; vagy az É-BNS-t szövettípust vagy sejttípust megcélzó 1lgandnmükhöz vagy ellenanyagokhoz kapcsoljuk.

Az E-DES-t egy első, gyógyászatiíag elfogadható hordozóanyagban szereljük ki, úgy, hogy az M-DNS-t és annak hordozóját érintkezhetjük. Előnyösen, az M-DNS-kész Ítményt úgy állítjuk elő, hogy az H-DhS-t egyenletesen és közvetlenül folyékony hordozóanyaggai, szilárd hordozóanyaggal vagy mindkettővel érintkeztek jük. Folyékony hordoz<öanyagként alkalmazhatunk például, de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, vizes bázisú hordozóanyagokat, nem vizes bázisú hordozóanyagokat, vagy mindkettőt. Szilárd hordozóanyagokként alkalmazhatunk például, de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, kémiai úton szintetizált és természetes hordozóanyagokat.

.Amennyiben az M-DES-t vizes bázisú hordozóanyagba;·· adjuk be, azt vízben, fiziológiás sóoidatban, vagy gyógyászatilau elfogadható pufferhen szuszpendáijuk, például - de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk elegyítéssel, uitrahangkezeiéssel és/vagy mikrofiuidírálássál .

Amennyiben sz hh-bbS-t nem vizes bázisú hordozóanyagban adjuk be, azt például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznáryk, neutrális olajjal, digliceriddei, trlgiiceriddel, kosztol íplddel, Íróiddal, olajjal vagy azok valamilyen eíegyével emuigeáijak, ahol olajon többszörösen teli tátién es telített zsírsavak megfelelő arányú keverékét értjük, ilyenek például, de anélkül, ángy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következők: szójaolaj, repceolaj, páimaolaj, olívaolaj és mygiiol, ahol a zsírsavakat alkotó szénatomok száma 12 és 22 közé esik, és a zsírsavak lehetnek telítettek vagy telítetlenek, Adott esetben, a neutrális olajban töltéssel rendelkező dióidét vagy foszfoiipidet szaszpendáIhatunk,

Amennyiben a beadást természetes hordozóanyagban, például, de anélkül, hogy igényünket arra korlátoznánk, MC'C~ ben végezzük, az M-DNS intakt oiigonukleoiidstrüktúráját megőrizzük, és azt A. ρόζον sejtfalon, azzal alkotott komplexként állítjuk elő az ACC előállítása során. Az ACC-ben, az A-DAS viszonylag feidúsnít mennyiségben van jelen, az intakt Ah póaey sejtekben található M-DNS mennyiségéhez képest, és az M--DNS sokkal, könnyebben hozzáférhető érzékeny sejtek számára, mént az Al phiey sejtekben található M-DNS. Világos, hogy az M-DAS alkalmazásával kapcsolatban, leirt eljárások MCü esetében is alkalmazhatók.

A találmány szerinti, A-DAS-t és első, gyógyászatiiag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítmény beadható egy második, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban is. Az M-DNS-késsitBényt és második, gyógyászatiiag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítményeket úgy állíthatjak elő, hogy az A~DNS~készítményt egyenletesen és közvetienhi folyékony hordozóanyaggal, szilárd hordozóanyaggal. zagy mindkettővel érintkeztetjuk. folyékony hordozóanyagként alkalmazhatunk peidáül, de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, vizes oázisé, hordozóanyagokat, nem vizes háφτ *· « * « :

zisú hordozóanyagokat, vagy mindkettőt... Szilárd hordozóanyagokként alkalmazhatunk például, de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, kémiai ütőn szintetizált és természetes hordozóanyagokat.

Mind az H-übS, mind. az M-DES-kész!tmény beadható olajos emulzióként, vlz-az-olajban típusú emulzióként, vagy olaja-vizben típusú emulzióként. Továbbá, azok beadhatók például - de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk liposzómák, helyspecifikus emulziók, retard emulziók# viszkózus emulziók, mikroemuizzók, nanoemuiziók, mikrorészecskék, mikrogömbok, nanogombök, nanorészaoskék és minipumpák képezte hordozóanyagokban, különböző természetes és szintetikus polimerekkel· együtt, amelyek lehetővé teszik az M-DNS tartós felszabadulását; a mínipumpákat vagy polimereket azon hely közeiébe ültetjük foe, ahová a hatóanyagot el kívánjuk juttatni. Polimerek, és azok alkalmazásának leírását találjuk például Erem és munkatársai közleményében [Journal of heürosurgery 74, 441 (1991)j. Ezen felül, M-DES és foí-DES-készifmények vivőanyagok bármelyikével, azok oszszességévei, vagy azok bármilyen kombinációjával együtt alkalmazhatok, tekintet nélkül arra, hogy milyen hordozóanyagot alkalmaztunk első és második, győgyászatilag elfogadható hordozóanyagként az N-DNS érzékeny sejtek számára történő prezentálására. Ilyen vivöanyagok például, de anélkül,· hogy igényünket a felsor ol bakra korlátó znánk, lehetnek a ntiox i dán s o k, puf far ek, baki e r lösz tuti kumok, szüszpendáló és sűrítőanyagok.

valamint

Anélkül, hogy igényünket a következő feltevésre korié— hoznánk, abból a ,fedtéteiesésből. indultunk ki, hogy az h— DNS terápiás hatása például, de anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a következőkön alapul: intracelluláris szignálátadás meginditásán, amely érzékeny sejtek apoptőzisát eredményezi, valamint cítokinek és reaktív oxigéxzvegyüietek termelődésének stimuláiásán, ami érzékeny sejtek citolizisét és apoptőzisát idézi elő. Az apoptózis és citoiizis - külön-külön és kombinációban - mind rákellenes, mind egyéb terápiát kiegészítő hatású. Azaz, a találmány szerinti M-DNS-készftmény alkalmazható rákellenes hatóanyagként egymagában; vagy alkalmazható a kezelés hatékonyságának növelésére egyéb rákellenes hatóanyag alkalmazását megelőzően, annak alkalmazásával egy időben, vagy azt követően.

Az M-DNS-készítményt olyan mennyiségben adjuk be, amely hatásos terápiás válasz kiváltására. Az M-DNS beadandó dózisa függ a kezelendő állapottól, az adott készíhménytöl és más klinikai faktoroktól, péidá.ni a recípiens testtömegétől és állapotától, valamint a beadás módjától. Előnyösen, az M-DNS beadott mennyisége körülbelül 0,00001 mg/kg és körülbelül 100 m/kg között van dózisonként; előnyösebben 0,0001 mg/kg és körülbelül 50 m/kg között van dózisonként; és iegelönyösebben körülbelül 0,001 mg/kg és: körülbelül 10 m/kg között van dózisonként.

Amennyiben az d-bhs-t düC-ként adjuk be, az MGu léiStartalma előnyösen körülbelül 0,00001 mg/kg és körülbelül 100 mg/kg között e lőnyö sebben., van dözísónként,

0/0001 mg/kg és körülbelül 50 m/kg között var: dózisonként; és legelőnyösebben,, körülbelül 0,001 mg/kg és körülbelül. 10 m/kg között van dózisonként,

A készítményt beadhatjuk például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, szájon, át (orálisan;, lokálisan, szubkután, zntramuszkulátisan, intraperitoneáiisan, intravénásán, intradermálisan, intrathecálisan, láziéba, tumorba, hólyagba, 1nirsvaginalisan, íntraokulárlsan, íntrarektáiisan, int r apu i mon á r i s an, i n t r a s zp i n á 11 s an, transzdermélisan, szubdermálisan, testüregekbe, nazális inhalálással, puimonáris inhalálással, bőrbe történő benyomással vagy elektroporációvai, A beadás módjától függően, egy-egy oázis térfogata, előnyösen körülbelül 0,001 mi és 100 ml között van; előnyösebben körülbelül 0,01 m.i és 50 mi között van, és 1 egeiönyösehben, körülbelül 0,1 mi és körülbelül 30 mi között van. Az M-DNS-készítmény beadható egyetlen dózis beadásából, álló kezeléssel, vagy több dózis adagolásából álló kezeléssel a kezelendő rákos betegségnek, a reoipiens állapotának és a beadás módjának megfelelő beadási rend szerint és időtartam alatt.

Az M-DüS beadása nem iamtunizáoiös eljárás, hanem terápiás kezelés, amely alkalmas betegségek, például, de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, rákok megelőzésére, kezelésére vagy eliminálására. Ilyen rákok például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következők; squaziosus sejtes karcinőma, fibroszarkóma, szarkoíd karcinőma, melanbma, emlőrák, tüdőrák, kelőrektális rák, veserák, oezteo szar kőma, bőmé 1 anöma, hazái ·** · ♦

sejtes karcinőma, hasnyálrdrigyrák, hőiyagrák, petefészekrák, leukémia, limföma; és azokból szármázó áttétek.

Az MCC hatásosságát megtartja ultrahangkezelést és autóktávozást követc-em amely kezelés csökkenti az M-DNSbázispárban mért hosszúságát, valamint GpC-metilezést követően, amely megszünteti a „purin-purín-C-G-pírimiáínpírimidin palínáróaa oilgonukleotidszekvenciák aktivitását .

Ezen felni, az M-DNS nem várt és meglepő tulajdonságának felismerése - azaz,· hogy apoptözist vált ki különböző rákos sejtvonaiakban, például, de anélkül, hogy Igényünket a felsoroltakra. korlátoznánk, kés-rendellenes., p52/£l~ rendellenes és drogrezisztens tumorsejtvonalakban - régi, és eddig kielégítetlen .szükségletet céloz meg az orvosi gyekorlatban, és fontos előnyüket biztosit állatok - az embert is beleértve - számára.

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban, konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjak szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. Ellenkezőleg, világos, hogy a találmánynak különböző egyéb megvalósítási módjai, módosításai és egyenértékű megoldásai lehetségesek, amelyek a leírás alapján szakember számára nyilvánvalóak, anélkül, hogy a találmány a találmányi gondolattól vagy annak oltalmi korétól eltérnénk.

2, pél-da

MCC előállítása Mycobacherőuzs pfeley baktériumokból

MCC-i ájuicéaubezi az; pndey baktériumokból áliivottunk elő illö-es jelzésű törzsből) . AL pinieyt az „Kísérletes Biológiai és Orvostani Intézet ),,Testitől Tűr Exper Imentai Bioiogie and Aiedizio, Borsiéi, Németország) intézetből szereztünk be, és azt szaszpenziőként tároltuk, steril tejben, -S0^oC-on, A M. phley baktériumokat Petraganitápközegen tenyésztettük íDifeo Labs, letroit, MI, USA), és „Bacto Ac-Ievestáptalajban szaporítottuk ÍDifco Labs) it20 napig, A sejteket centrifugában végzett ülepiléssel gyűjtöttük össze. Az alábbi eljárásban alkalmazott valamennyi. reagenst ügy választottuk meg, hogy elősegítse a Ab páiey DNS Intakt oligounkleotidstruktürájának megőrzését.

Körülbelül 400 gramm sejtet (nedves tömeg) tettünk, autoklávozott,· körülbelül 1200 mi térfogatú keverőgépbe, A sejteket magas fokozaton, .30-60 másodpercig homogén!zártuk. A keverést követően, a sejteiegyhez € mi DNsz-mentes Tusén80-at és 200-iöö ml autoklávozott vizet adtunk. Ezután, a teljes sejtszuszpenziöt alacsony fokozaton ismét homogenizáltuk, körülbelül 10 másodpercig.

A sejtek roncs-olását ultrahangkezeiéssel végeztük. Ötszáz -(500) mi sejtszuszpenziöt, amelyben a sejtek tették ki a térfogat 50-70%-át - mértünk egy liter térfogaté: antokiavozott főzőpohárba, és a sejteket ultrahangos tűk, Az ultrahangosért elegyet autoklávozott lombikban, jégen tároltuk a frakcionálási eljárásig. Az intakt sejteket alacsony fcrdulats zárnom végzett oentrif ugatással. távoli totf.uk el. Az alacsony fordatalazámon végzett centrifagálésből származó felüluszót. 1 érán át, 22 óeO g~n, 15^&C~on centrifugáltuk, és az utóbbi oentrifugálásből származó felülúszöt ·'♦ « «*

ΦΧ ♦

eltávoiltottűk,

A. 27 500 g-n végzett centri fuga léséé 1 származó éledezőt auteklávozott keverőgépbe vitték át, és alacsony fokozaton végzett keveréssel autoklávozcttdeionizált vízben szuszpandái tek. Ezt st szuszpenziót 1 órán át ismét 27 500 g~n, l5°C~on centrifugáltuk, és a feiélászót megint eltávolítót··· tok. Az üledéket auiokiávozott, deionizált vízben szuszpendáituk, és az esetlegesen visszamaradt intakt sejtek eltávolítása céljából .5 percig, 350 g-n centrifugáltuk.. A fe~ iíHuszőt leöntöttük, és a nyers sejtfalfrakciót 1 órán át, 27 SCO g-n, 15^öC-on végzett centrifugálássa1 ülepítették,

A nyers sejtfaifrakciót proteolitikas enzimekkel történő emésztéssel profeínroentesltettük, ügyelve arra, hegy műveletek során lobétőség szerint DNáz-mentes reagenseket alkalmazzunk a készítmény DNS-tartaimának optimalizálására, és a készítményben található DNS oiigonukleoéidstruktűrájának megőrzésére, A körülbelül 400 g teljes sejtből, nyert nyers sejtfaifrakciót alacsony fokozaton végzett keveréssel 1 liter, 0,05 mol/l Dbáz-mentes Tris-HCÍ-'ben szusspendáituk, Azután a nyers sejtfaifrakcíót alaposan szuszpendáituk, ahhoz 50 mg nbáz-mentes tri.pszinl adtunk (Ságra Chemical Co./, és a szuszpenziót, S órán át, 35^cC-on mágneses keverőüzemmel kevertük,

Trípszínes kezelést követően, a trzpszinnel kezelt nyers sejtfaisznszpenzi.ő minden egyes literére számítva 50 ng büáz-mentes pronázt. adtunk (Amersham Canada Limited, O&kviiie, Cntari.oí a szuszpenziőhoz. A szuszpenziót Iz-i.g órán át, 35*C-on, mágneses keverőeloromé1 kevertük.

,:

«φ

FroteoJ.it 1 kun emésztést követően, a nyers sejtfalfrakciót uetergenssei és fenollal Irpidmentesítettük. A szuszpenzióhoz, annak minden, egyes literére számítva 60 mcj Dház-mentes íréit (Sióra Chemical Co.; ; 2,0 mi Ddáz-mentes, lOOi-os fenolt; vagy ISO mi,· 90 vegyes-fenolt o..yz. Chemical hot) adtunk. A szuszpenziöt tartalmazó lombikot, aluminiumfőliávai lazán lefedtük, 60~80°C~ra melegítettük, és 1 órán át kevertük. A szuszpeuziót 10 percig, 10 000 g-n. centrifugáltuk. A feiüiüszöfrakciöt és az ülepített anyag aiat.fi folyadékot eltavoizfettük, Az ülepített frakciót körülbelül 1 liter autoklávozott, deionizáit vízben. történd szuszpendáiással. háromszor mostuk, és 10 percig, 16 000 g~n centrifágáltuk.

A mosott, protein- és lipidmentesitett ACC-t úgy iiofilízaltuk, hegy a szuszperzíót autoklávozott, kis mennyiségű autoklávozott vizet tartalmazó iiofiiizáiő lombikba, vittük át. A teljes sejteket tartalmazó kiindulási anyag nedves tömegének minden 20 grammjára egy, 200 mi térfogatú iioíilizálő lombikot alkalmaztunk. Az MCC-szuszpenzíot kéregszeröen fagyasztottuk, oly mbdon, hogy a lombikot szilárd széndioxiddal. (szárazjéggel; hűtött efanolban görgettük, blúzán a lombik tartalma megfagyott, azt izofilizáió készülékhez csatlakostahtuk (Virtis Co,, Inc. Gardiner, NY), és iíofiilzáituk, A irof iüzálásf követően, a mintát autoklávozott, csavaros kupaké tartályba vittük át, ás -20“C-on, vízmentes kaicium-sznltátot tarfcaimazé exszikkátorban táró itu.k .

X

Hacsak kifejezetten, másképp nem kötöttük kz, a liofilizáit MCC-t autoklávozott, deionizált vízben vagy gyógyászatilag elfogadható, Dház-mentes pufferben - például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk fiziológiás sőoidatban vagy PBS-ben szuszpendáltak, és ultrahangkezeléssel emulgeáituk. Adott esetben, az emulgeáit MCC-elegyet mikrofiuidízárással emulgeáltuk, 15 Öbölé 000 psi nyomást alkalmazva egy átfolyásnál. Az MCCszuszpenzzöt vagy aszeptikus körülmények mellett dolgoztuk lel, vagy autokiávozással sterilizáltuk.

2. példa

M-DNS tisztítása MCC-foőI és M, phiey sejtekből

MCC-t az 1. példában ismertetettek szerint állítottunk elő, M-DPS-t MCC-bol tisztítottunk (MCC-DMS) fenol/kloroform/izoamílalkohol extrakólóval és etanoipreeípitáozövai („Sztori Arotocois in Afoieoaiar Síciogy, 3. kiadás, szert.z nusubel és munkatársai, John diley & Sons Inc., New York. USA; . Váratlan módon azt találtuk, hogy az MCC száraz tömegének mintegy 3,oi-a M-DNS-ként extraháiható.

M-DNS-t (A, phiey eredetű DNS-t) A. phieyfoől tisztítottunk, oly módon, hogy éh phiey (110-es jelzésű törzs) sejteket 5 mi térfogatú, DKáz-montes 50 mmol/1 Trís-HCl és 5 mmol/1 SDTA )pH--TC ö; összetételű pufferben sznszpendáztünk, a szuszpenzzöhez 1 mg/ml koncentrációig öház-mentes lizezzmot iSigsza Cftemzcal Co A adtunk, és az elegyet áö percig,- 3T^:-'C-on inkubáituk. Az elegyhez 0,1 mg/ml kozzcentráeíöig: Dliáz-menles ,, Pzmteikasmz ΙΑ /Lile Technológiás,

Burlington, Ontario, Kanada) enzimet, 1% koncentrációig nátríum-dodecil-szuifátot (BioRad, Richmond, CA) adtunk, és azt 10 percig, bó^C-on tovább inkubáltuk. Az M-DN3 t fenol/ kloroform/ízoamiila 1kohol eiegyekkel extraháltak, és etanolia.1 precipi táituk.

Hacsak kifejezetten másképp nem kötöttük ki, a iiofiLizáit M-DNS-fc autoklsvozott, deionizált vízben vagy gyógyászat Hág elfogadható, DNáz-mentes pafferben - például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk -, fiziológiás sóoldatban vagy FBS-ben nitrahangoztnk. Az MCC, a M-DNS, és a Ab phley DNS rima./us-amaöocyta lizátum ,,QCL~ iOOCA-reagenskésziettai (Bio Nhiftaker, Walkersville, AD) történő meghatározás szerint nem tartalmazott endof.oxinokat►

3, példa [Bakteriális DNS - bakteriális sejtfal] komplex előállítása, és bakteriális DNS előállítása más bakteriális fajokból [Bakteriális DNS - bakteriális sejtfal] komplexet állátót tank elő Ab smegmatis, M.. fóréul tors, Nfocardia art erőiden, üorynebac tersem pár van, tb kan sasai, tb tüberoaiosis, M. bovis baktériumokból, az 1 . példában leírtak szerint. Bakteriális rtíB-t [bakteriális DNS - bakteriális sejtfal] komplexekből és intakt baktériumokból tisztítottunk, a 2. példában ismertetettek szerint eljárva.

** ♦ ** ♦.* «Α»φ '» >♦♦♦ * « φ * * ·♦♦ * * * χ * * ♦ ♦ φ **·» φφ,Α « « _{Ο <ν}

4. példa

DNáz-keaelés

Egy-egy (1-1) ug M-DNS~t tartalmazd NCC-DNS-t, M. pádey eredetű DNS-t és MCC~t emésztettünk 1 nemzetközi egységnyi (,,.i dér nádorai :n.:ii ID) RNáz-mentes DNáz-I~enzi.mm.el (Lile Technology) 1 óráig, 25°C~on, a következő összetételű pufferhem 20 mrnol/1 Trís-HCi . (pH-8,4 ) ; 2 manói/1 MgCly és 50 mmol/1 KC1. A. DNáz-l-enzimet égy inakéivá! tu.k_; hegy az elegyhez EDTA-t adtunk 2,5 mmci/i koncentrációig, és lö percig, 55°C-on hevítettük. A BNás-I mind az egyszálú, mind a dupiaszálh DNS-t emészd. DNáz~I~enzimmei végzett emésztés a DNS csaknem tel jes degradálódását eredméxxyezi. A Fegreodcd (Bioniche, Inc. London, Ontario, Kanada) olyan készítmény, amely 1 mg mycofcakteriális setíalexfcraktuxsoi és 20 μ! NF~ásványioIajat tartalmaz 1 ml térfogatú, BBS és 0,05 térfogat-% Tween-SD összetételű elegyben.

5. példa

MCC-DNS és M. phley eredetű DNS Összehasonlítása

MCC-DNS-t és M. püiey eredetű DNS-t 52-os agarézgélen elektroforetizáltnnk (3 éra; 100 V), szakember számára ismert eljárásokkal. A DNS moiekelatcmeg-megosziását gélfotopásztázással határoztuk meg, ,, 1 D Máin Arograd sort var d alkalmazásával (Advance American Biotecnnology, Fd) érten, CA) ..

idd az az !., ábrán látható, a M, páiey eredetű DBS esetében körülbelül 5 bázispártöl (bp) körülbelül 10 000 bádspáriq terjedd méretű ollgonukl.eot idők széles skálája

ΦΦ X ♦ * ** ** «φ»φ *·* * φ φ φ ·» χφφ ·♦.♦ ψ ♦ * «X * V » * *Φ φ · «Φ χ χ figyeibetb meg a genomi eredetű í>12 000 bo; DNS mellett No MCC-DNS körülbelül 5-tői körülbelül 250 bázispárig tér jedő tartományba eső oligonukleotídckaf tartalmaz, abban fő esik van jelen mintegy 40 házaspárnak megfelelően, é kis mennyiségű genomi eredetű NNS-t tartalmaz.

á. példa

Sejtek és reagensek

Valamennyi sejtvonalat, kivéve az 0C2- és SW260 sejtvonalakat, az „ibaerloan Type Col tűre Col Jestiorü (ATCC Rockvilie, MDj gyűjtöményebbi szereztük be, és azokat a ATCC által ajánlott tápközegben tenyésztettük. Az OC2- é SN260~sej-tvonalakat Dr. J.N. Coilíns bocsátotta rendelkező síinkre („Dniversitv College Cork.'y Cork., rreland), é azokat lök FCS-sei kiegészített DNEM-tápközegben tenyész tettük. A vizsgálatainkban alkalmazott sejtvonalakat, azo eredetét és jellemzőit az 1. táblázatban összegeztük.

1. táblázat .Kísérleteinkben az alábbi sejt vona 1 a kát a lka liaa 2t uk

Sejtvona.1	Eredet	Jeiiemzők
TuR-l	Humán akut monocitás leukémia
Hl,-60:	Humán prcmieiocitás leukémia
Hl,-60 MX-1	Humán prom.iel oc it ás	Atipusos drog-
	leukenia	rezisztencia míxo- xastronra
totJ 264.7	Eper monocitás leukémia
JURKAT	Humán T~iimfofclaszt
HT-1376	Humán hólyag-	Mutáció a p53/p21-
	kareámama	génben, MDR
HT-1197	Humán hólyag- ka re ingna
3-16-Fi	Egér meianora
3W26J	Ibimé n vastagbél a d e n 0 ka r ο ί n óma	EAo-L-rezisztencia
06 2	Humán nyelőcső- karcinőma
US1034	Humán vakbél-	Szokásos haté-
	karcInőma	anyagokra rezisztens MDR.

Egérereoetu makrotágokat aőstóny CDl-egerékből nyer-

tünk, amelyeket intraneté, tonnái isan 1,5 mi steril eremetféle tioglikolát-tapievessei eltettünk be íDífco, metróit, MI; . A. peritoneális exudátumot {>85% makrofág) a 4. napon, összegyűl tettük, SBSS-ben oentnfogálással mostuk, és 10% FCS~sel, 2 mmol/1 L-glutaminnal és 20 mmoi/l HSPES-sei kiegészített uPjüI-lüsO-tápközegben {Life Technologies! tenyésztettük. A sejteket 18 óráig hagytuk letapadni, majd a ie nem tapadt sejteket előmelegített tápközeggel történő óvatos mosással eitávolitottuk.

Egéreredetű lépteiteket úgy kaptunk, hogy a szövetet steril, rozsdamentes acélszürőkön átpasszirozcnk. Sejtszuszpenziókat Lympholyte-A sejtszétválasztó tápközegre retegeztük (CedarLane, Hornöy, Ontario, Kanada), és a vörösvértestek és elhalt sejtek eltávolítása céljából 30 percig, 2200 fordulatXperc-eei centrifugál tűk, A kapott sejteket 10%. FCS-sel, 2 mmoi/I L-giutaminnai és 20 mmol/1 HEPES-sel kiegészített RBMI-ielO-tápközegben {Life Technologies) tenyésztettük.

Hacsak kifejezetten másképp nem kötöttük ki, a sejteket 5 lyukú, lapos fenekű, sejttenyésztö lemezekre oltottuk ki 3x10'' sejt/mi - líü sejt/ml koncentrációban, és 37 “C-on, 3% ο·?, atmoszférában tartottuk lenn.

Sorjűtimusz-DMS-t, heringsperma-DNS-t és Kscneriouaa coli 1 ipopoIiszacharidot {LFS-t? a „Sigma Chemical Ce. cégtől szereztünk be. Rektvzbiuinz humán IL-i.z-t (hXL-12) a „k t D Systems’'' {Minneapoi.is, HN; bocsátotta rendeikezesünkre .

* 0

X ·*♦ χ *

X X 0 * 0 ΧΛβ «0 * * 0 0 X * * X ν

00** *χ,0 0 0 »0 **

7. példa

Sej tproliferáció gátlása

A s e j t p r ο 1 1 f e r á o i ö t dí ne t ί 1t 1 az c i - di fenil t o r t r az ο 11 un bromid- (MTT-) redukciós eljárás alkalmazásával határoztuk Kiég [Mosman és munkatársai: Journal of Tmmunoiogical Methods 65, 55 (19335]. Röviden, 100 el, 5 mg/ml koncentrációjú, PBS-ben. oldott MT'i’-t (5igm.a Aidrich; adtunk a lemezek xsélyületeihez, 'Négy (4) óra elteltével, savas izopropanoit, azaz 1 ml térfogatú, 9,04 normál, izopropaxxolban. odott HCl~t adtunk a. mélyeletekhez, és a redukált MTT menynyi segét 570 nm hullámhosszon mértük.

HT-I376-, HT-1197-, B-16-F1-, THR-Í-, RAW-2 64J?-,

Jurkat-, HL-60- és üL-50-MX-l- sejteket inkubáitunk 24 órán át 0 ug/mi és 10 gg/ml közé eső koncentrációjú M. phley eredetű DNS, HCC-BNS, heringsperma-DNS és bor j átimusz-BbS jelenlétében. A M. püiey eredetű DNS (2,A ábra; és az NCCDNS (z.B ábra) valamennyi tesztelt tumorsat ivónál esetében dózisfüggő módon gátolta a pro!iterációt, még a beringsperma-DNS (2,A és 2.B ábrák; és a borjűtimusz-DNS (2.A és 2.R ábrák) egyik vizsgáit sejtvonal esetében sem. gátolta a prolit©rációt.

HT-137S-, HT--1197-, Β-15-ki-, THR~1~, RAd-264 . ?-,

5s.rc.at··, HL-Su- és HL-60-bX-1 - sejteket inkubáitunk 24 órán ét 0 ug/mi és 10 ug/mi közé eső koncentrációjü MCC-vei. Az MCC valamennyi tesztelt tumorsajtvonal esetében dózisfüggő módon gátolta a pro!iterációt (3, ábra).

Humán leukémiás 1HB-1 -monoci. tákat inkubáitunk 2 4 órán át 0 ug./ml és 10 ug/mi közé eső koncentráció jű A. pndey *'* φ' φΦ ♦«♦·»♦· * Φ X * Φ ΦΦΧ φχ χ * ♦ * * Φ * Φ X *♦♦.* «Φ* Φ* 9« ΦΦ eredetű DES-sel, MCC-DMS-sel, ikCC-vei vagy hlhlr-vei., A hlL~I2 ne® gátolta a proliferáclót (4. ábra}.

HT-1197- (5.A ábra) és aT-1376- (5.3 ábra) elnevezésű humán aolyagráksejteket i.nkubáitnnk 20 órán át 0 pg/ml és 100 ug/ml közé eső koncentrációié MCC~vei vagy LPS-ssz. A.z MCC gátolta a proliferáclót. Az LPS nsis gátolta a proli feráciőt ..

A Ai. phley eredetű DM5, MCC-DNS és MCE - amennyiben az első gyógyászatiiag elfogadható hordozóanyag M. phiey sejtfal ~ valamennyi vizsgált tumorsejtvonai proiá ferációját gátolta. Ezzel szemben, az LPS - amely egyes tumorsegtvonalakban apoptózis kiváltására képes nem-specifikus immunstimulánsként ismert (Izguíerdo és munkatársai: Anticancer Drugs 7, 795 )1996)] a h.l'L-12 - amelyet egyes tumorsejtvonalakban apoptézist kiváltani képes cl tokánként tartanak számon [Stine és munkatársai : Annáié NY Academy of Science 795, 420 (1996))-, valamint a borjűtímusz eredetű DNS és heringsperma-DMó egyik vizsgált tumorsat tvona.1 proliiéradóját se® gátolta. A fenti eredmények azt mutatják, hogy az M-DNS felelős a vizsgált tumorsejtvonaiak proliferáciőjának gátlásáért, és egyéb eredetű DNS-ek (heringsperma-DMS és borjütimusz-DNS) ne® képesek helyettesíteni az M-DNS-t, Ezek az adatok arra utalnak továbbá, hogy az M-DNS sejtproliferáclót gátló hatása nem tudható be nem-specifikus iramú üsd múl. á c tón a k (L P S ~ h a t á s n a k) vagy c 11 o k 1 na k 11. v i t á z n a k (hiE-lr-aktivitásnak). Megjegyzendő továbbá, hogy a gátolt ráksejtek közt vannak pS3/p21-rendellenes és drogrezrsztens, ΗΪ-1376-nak elnevezett humán holyagráksejtek, vara* *♦ Μ<

** * ♦ * « Χφ « * * » * X * a, ♦ XX ** χ.* ♦<

mint atipusös drogrezisztens, Hb-üO-NX-i-nek elnevezett buráén prcmielocitás leukémiáséjtek.

8. példa

Apoptóg.i.sindu.kcxó a DNS-fragroentá-ció vigg-gálaba alapján

Apoptözisnak áldozatul eső sejtekre jellemző a celluiáris DNS nukíeoszóma méretű fragmentumokra történő fragmsntálődása, Nukisoszöma méretű tr a essen tárnokon, agarőz-géieleketrofcrézís szerint körülbelül £00 bázispár hosszúságban eltérő DNS-fragmentumokat értünk (Newell, és munkatársai; Natúré 357, £36 {1990)1. A fragmentáciő meghatározására a is nem tapadt sejteket 200 g-n, 10 percig végzett csntrlfugálással összegyűjtöttük. A ie nem tapadt sejtek üledékét és a visszamaradó letapadt sejteket 0,5 mi, hipotőnzás ilzlspnfferrel lizáltattuk [10 mmoi/1 Tris-puf£er; 1 mmol/i EDDA; ö,£% Trítén-X-1.00 (pH-7,5)]. A lízátumekat 13 000 g-n, 10 percig centrifugáltuk:, és a fragmentálődott DNS-t tartalmazó felülászőkat egy éjszakán át, -£0^öC-on,

50% izopropanol	é s 0,5	mei./l NaCl	összetételű elegy	ben pre-
cigi tártuk. A	precipi tátumofcat	centrifugalássál	ossze-
gyűjtöttük, és	3 őrén	át, 100 V	mellett, 0,7%-os	agaröz-
géleken végzett	elektrr	xforézlssei	ana1izéitűk„

Humán leukémiás THE™1-monociták sznszpenzros tenyészetét 4 8 őrén. át a következők jelenlétében inkubáltuk; EBS; 1 ng/ml, kezeletlen vagy DNáz -Ί-kezeit .Ni jersey DN5 'vagy MCC; vagy kezeletlen üeringsperma-DNS (lásd 6. ábra; . A ék ph.iey eredetű DNS t£ . sáv) és NcC i'4. sáv) jelentős mértékű DNS-fragmentáciöt váltott ki, mig a BBS (1. sáv), DNáz-i»ϊ »*♦ φ

kezelt 3ί, phley DNS (.3. sáv), DNáz-I-kezelt MCC (5. sáv) és heringsperma-DNS tű. sáv) nem Idézett elő DNS-f ra ginen táelét. A nukl eos zóna méretű DNS ••fragmentumok molekulatömegét 123 fcp léptékű „DNS-létra (Life Technologies) alapján határoztuk meg Íb~sáv).

Humán leukémiás TNL-l-monooiták azuszpenziős tenyészetét it órán át a következők jelenlétében Ínkubáituk; PBS; ΐ ug/ml kezeletlen vagy DNáz-T-kezeit óh pniey eredetű DNS vagy heringsperma-DNS; vagy hlb-12 (7. ábra) . A áh phley DNS jelentős mértékű DNS-f. ragmentációt idézett elő (5, sáv), míg a DNáz-l-kezelt fh phiey DNS (4. sáv) , beringsperma-DNS (3. sáv), DNáz-I-kezeit heringsperxea-DNS í2. sáv), hIL-1'2 (I. sáv) ás DBS (6. sáv) nem váltott ki DNSfragmentációt. A nukleoszöraa méretű DNS-fragmentumok molekulatömegét 123 bp léptékű DNS-létra (Life Technologies) alapján határoztuk meg (L-sáv).

HT-rl97~ és HTlüvo-eínsvezésü humán hólyagráksejteket ínkabáltunk 48 órán át 1 ng/mi MCC vagy bIL-12 jelenlétében (8. ábra) . Az MCC jelentős mértékű DNS-fragmentáciőt Idézett elő a ie nem tapadt BT-ilv- (8.A ábra, 2. sáv) és HT1376-· (8,B ábra; 2. sáv) sejtekben, de nem váltott ki ΝΝΒί ragmentációt a letapadt HT-I17- >8.A ábra, 3. sáv) és RT1376- (8,δ ábra; 3. sav) sejtekben. A DBS (8.A ás 8.B át-

r a k; s. sav;.	hih-iz (8.A és 8.δ abrak; 4. sáv).	DNáz-l-
kezelt MCC (3	.A és 8.B ábrák; 7. sáv), vaísmánt a	kezel és
elhagyása nem	váltott k) DNS-fragmsntációt a le nem	tapadt

HT-1197- és HT-13?S-sej bekben. A nukleoszőma. méretű DNSfragmentumok molekulatömegét 128 bp léptékű DNS-létra (Life λ * ** -χ #

Technoiogiesί alapján határoztuk meg (8.A és 8,B ábrák; i,.

sáv) .

ámeunyíben az M-DNS oi.igonukieotidstruktúráját megőriztük, és M. phiey sejtfallal alkotott komplexként alkalmaztak, a 11, p-hley eredetű DNS és MCC apoptózisf váltott ki humán leukémiás IHr-I-monooitákban, valamint ΗΤ-1197-nek és

HT1376-nak elnevezett humán höiyagráksejtekben, még a heríngsperma-DNS, hTL-12, valamint DNáz-I-kezelt M. phley DNS ás HCC nem. idézett elő apoptózist ezekben a sejtekben, A fentiek alapján arra következtettünk, hogy az M-DNS felelős az apoptözis kiváltásáért a vizsgáit rákos sejtvar.ua lakban; továbbá, az M-DNS oligonukleotidjafnak intaktnak kell lenniük Íűbáz-I-kezeléc); és az N-DNS egyéb DNS-ekkei (például herIngsperma-BhS-selj nem helyettesíthető. Eredményeink azt is igazolják, hogy az apoptözis M-DNS-sei történd indukciója nem tudható be .nem-specifikus immun»timulációs hatásnak íLPS-hatásnak) .

9, példa

Apoptózisxndukcié a nukleáris mi totikus profceinapparátus s-solubíligáei ójának meghatározása alapján („,naclear aatrix proféin^; NuMA)

Az apoptőzzsra feltűnő, a sejt magjában végbemenő, NuNA szoiubiizációjábói és kiszabadulásából eredő morfológiai változások jellemzők. NuKA szolubiilzációjónak és felszabadulásának mégha tarozására tenyésztett sejtek felüiúszóját eltávéHtottűk, és 10 percig, 200 g-n centrifugái fűk. A Ιοί ül úszókat összegvöt töttűk, és 10 0-100 ni térfogatú felniúszóból, egy, a kereskedelemben hozzáférhető E'LI'SA-reagenskészlet (Calbiochem, Cambridge, MA) (Miller és munkatársai: Bioteohnigues 15, 1042 (.1933) j alkalmazásával egység/ml-ben (U/ml) meghatároztuk a NuMA-felszabadulást.

Humán leukémiás THE-i~monocitákat inkuóáltnnk 4 8 órán át 0 gg/ml és 10 ug/ml közé eső koncentrációjú ,M. p.ö.ley DNS-sei, MCC-DNS-sel vagy beringsperma-DNS-sei. Az At pb.ley DNS, ACC-DUS és MCC NuMA-felszabadulást váltott ki dözisfügggö módon, mig a boringsperma-DNS nem idézett elő NuMA- felszabadul ást (9. ábra) . A. M. pnley DNS, MCC-DNS és MCC DHáz-l-kezelése jelentős mértékben gátolta, azok NuMAfel szabadulást kiváltó hatását ezekből a sejtekből (10. ábra) .

ET-1I37-· ás HT1370-einevezésü humán hólyagráksejteket inkubáituxxk ö ug/m.1 és 100 ug/mi közé eső koncentrációjú

MCC-vel. Az MCC NuMA-felszabadulást váltott ki dózis- (11.

ábra) és időfüggő módon (12.A és 12.S ábrák). Fokozott mértékű KuMA~felszabadulás veit 'kimutatható a HT-1197- (12.A ábra) és HT137624- (12 «.ö ábra) sejtek 100 p.g/m.i MCC-vei történő inkubációját követően, 24 órán belül.

A M. phley eredetű DNS, MCC-DNS és MCC. - amelyek mindegyike tartalmaz M-DNS-t - apoptózist vált ki ráksejtekben. Amennyiben az első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagként Ml pbiey sejtfalat alkalmazunk, az MCC nagyobb mértékű apoptózist vált ki, raínt a A. pé.ley DNS vagy MCCDNS, Ez azt jelenti, hogy az M-DdS-t érzékeny sejtek szamára prezentáló hordozóanyag befolyásolja az M-DNS apoptózist ki vá11 ö kép ess é gé t, νί»« * ο «β χ * * * V %

4** *

V*

10. példa

Apoptőzis Fás-független. idukcioja M. phiey DNS-sel, Jurkatféle humán T-limfoblaszt-sejtekfcen

Jurkat-féle humán T-limfoblaszt-sej teket inkába ltunk. 1 órán át DBS, 1 ug/mi CH-11-ellenanyag - Fas-receptorhoz. kötődő, és apoptözist kiváltó ellenanyag (Coniter-izmouiotech, Rualeah, FLh (pozitív kontroll) - vagy 1 ug/mi 2B4-ellenanyag - Fas-receptorhoz kötődő, és apoptözist gátló ellenanyag (negatív kontroll) jelenlétében. A sejtekhez I po/ml koncentrációban M. phiey DNS-t adtunk, és 48 óra múlva meghatároztuk a HnMA-felszabadulást.

Amint azt a 13. ábra mutatja, A. phiey eredetű DNS apoptözist váltott ki 2'B4-eilenányag hiányában és jelenlétében egyaránt. Ennek alapján erre a következtetésre jutottunk, hogy az apoptozis M. phiey DNS-sel történő indukciója Fás-független folyamat.

.2 2, példa

Az alábbiakban összegezzük a bt phiey etedetű DNS, MCC-DNS :isra k 1 f e j tett ha tusait

A 2. táblázatban a áh phiey eredetű DNS, MCC-DNS és MCC humán és egéreredetű ráksejtekre kifejtett sejtproli feráciő-gátló és anoptézisíndukáló hatásait foglaltuk össze a DFS-fragmentáció vizsgálata, a NubA~feiszapadulás meghatározása és áramláson citometrzás analízis alapján.

*·% * «· *· .ϊ μ* » »»» '4. 1 ϊ»* * ηγ

2. táblázat

Ρr ο 11 ferác£Dgá 11 á s és &poptőz'isíridukció_J-!V:.rnán és egéreredetű rákos sejtvonalakban

Sej fék	Proliferáci ógátlás	Nu kl.se szórna méretű DNS	NuMA- felszabadulás	Aramd.ásos citoaíetrrás analízis
ΊΉΡ1-	Igen	Igen	Igen	ND. *
HL-60	Igen	Igen	Igen	ND.
HL-60 AX-I	1 gén	Igen	Igen	ND.
RAN 264.7	Igen	Igen	Igen	ND.
HURKÁT	igen	Igen	Igen	ND.
H11376	Igen	I gén	Igen	ND.
HlII97	I gén	Igen	1 gén	ND.
8-16-FI	Igen	Igen	ND.	ND.
SN260	NO.	ND,	ND.	Igen
OS 2	NO.	ND.	ND.	Igen
1,510 34	Igen	ND.	Igen	ND.

* :. Nem vizsgáltuk (ND· .

Amennyiben az első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag M. phiey sejtfal, és az A-DNS-t a sejtfallal alkotott komplexként alkalmazzuk, a A. phley eredetű DNS, MCC-DNS és MCC gátolja a proliferáclót, és apoptözist vált ki valamennyi vizsgáit tnmorsejtvonslban, Megjegyzendő, rogy a vizsgált tumorsejtvonalak közt találunk atlpusos drogrezisztens, HL-60-AX-l-nek elnevezett humán promielooitás 1eukémiasejtvonalat; ΝΤ-1376-nak elnevezett, pS3/p21* « rendellenes es drogrezisztens humán hőiyagráksejhvonaiat; SW260-jelzesü, Fas-rendelienes humán vastagfoéirák-sejtvonalat, és LSlO34~nek elnevezett, szokásos hatóanyagokra rezisztens, banán vakbélkarcinöna sejtvonalat.

22. példa

Casnase-S aktiválása MCC-vei, THPl-l-elnevezésű humán, le-ukérniás monocihákban

A ca.spase-3 az apoptetikus út egyik, kuicsenzime a FásFasL~jelakadástól lefele eső szignáltovábbításban. Annak meghatározására, hagy az bCC képes-e áthidalni a Fas-jelátadást, és közvetlenül aktiválni a oaspase-kaszkádot ráksejtekben, megvizsgáltuk az b€C caspase-3-akti.vitásra kifejtett hatását THP-1-jelzésű humán leukémiás monociiákban.

THP-l-monocitákat Í2x!ü'' sejtet) inkufoáltunk 4« órán át MCC (100 ug/ml) jeieniétében. A THP-i-sejteket az alábbi összetételű oldatban irzáltaftuk; 50 mmoi/I HEPES (pH~7,4i; 100 mmol/L NaC.1; 0,11 CEAPS, 10 mmol/1 DTT; 1 moi/1 ADTA; 10% glicerin. A easpase-3-ak.t i ví tást egy, kereskedelemben hozzáférhető ELLSA-reagen.skészlettel határoztuk meg {8IGMQL Research Laboratories, Inc. Piymonth Menting, PA) a reágenskészlebhez mellékeit szubsztrát, inhibitor és tisztított caspase-3-enzín alkalmazásával. Eredményeinket a 405 ni.a~.en mért fényeinyeléssei („opéicai densi ty; CnD,) adtuk meg.

3. táblázat

Caspase-3-enz im-aktivl.tás indukciója MCC C10-0 pg/xal) alkalma, zása v<il, ΊΉΡ-1-nek elnevezett humán leukémiás mono;ítákban

................................................... Inkubáció	.......... ...................................................................................... p-mitroanili.á iényelnyeiése 405 nm hűl- ; iámhosszon
	O.b.xiO'd 3 őrás inkubáció	O.D.xlö1, 6 órás inkubáció
Csat Inc—i	0,19	0,06
TüPI a MCC sejtextrákéul	0,44	0,20
THP1 a Odáz-kezelt MCC sejtextraktuxs	0, Ϊ2	0, II
Tiszti tett capsaae- 3	0, s?	0, 58
Tiszt Írott capsase- 3 t napsase-3- inhibitor	0,0ö	0,00
THP-1 a MCC sajt- extraktam, capsass-3-inhibitor	0,00	0,0 0

Amint azt a 3. táblázat mutatja, MCC-vel történd inkubáiás 232i~ban í3 ára) és 3331-ban (ő éra; gátoltéi, a csspase-5- és oespase~3~szerű aktivitást THP-l-nek elnevezett hnmáxx leukémiás monociiákban„ A csapass 3- és caspase3~szerű aktivitás MCC-vei történő indukálnatésága az MCC DNáz-l-kezeiését követően megszűnt. A caspase-3- és caspase-3~:S.zerö aktivitás MCC-vel történő indnká.lha lóságának specifikus voltát caspase-3-inbibitor alkalma zásával szemléltettük. Amennyiben az MCC-késélt THP-l-eeátek extraktumához eaepace-3~inbibitort adtunk, aktivitás nem volt többé kimutatható. Az MCC azon képessége, hogy specifikus módon, és közvetlenül indukálja a oaspase-3~ és oaspase-3szerű aktivitást THP~1-nek elnevezett humán leukémiás monocitákban, teljesen váratlan volt. Ahho2, hegy az MCC specifikus módon stimulálhassa a caspare-3- és caspase-3-szerű aktivitást, annak egy vagy több mechanizmus révén, be keli jutnia a sejtekbe, és ott meg keli indítania az apoptózishoz vezető letális proteolitikus kaszkádot.

23. példa

Tamoxifen hatása MCC-xndukált apopfeózisra THP-l-nek elnevezett humán leukémiás monoerbakban

THP-l-nek elnevezett humán leukémiás mcnocítákat inkaháltunk 90 percig kontroli tápközegben vagy 10 ug/ml tamoxifsnt (Sigrsa-Aidrich) .....egy, előrehaladott emlőrák paiiiatlv kezelésére alkalmazott antiöszzrogént - tartalmazó tápközegben,. A sejteket jéghideg tápközeggel alaposan mostuk ί2ki , körülbelül líű ssdt/ml sűrűségig tápközegben szuszpendáituk, majd 4 a órán át, 0, 1, 10 vagy Inc ng/ml

MCC-vel inkubáituk.. Az apoptözist NnMA-felszabadulás alaptan határoztuk meg kvantitatív módón.

. táblázat

Tamoxrfen. hatása MCC-indukált apeptózisra THib-i-nek einevezhumán leukérniás munocitákb an a KnAA-felszabadnlás V/ml egyse gekbsn történ ő roe gh a tarozás a, aiapjás

	í-M-CC rpg/ml	•rMCö iOgg/mi	•dicc 1OOpg/mi	e tápkbzeg : c s a n
Kontroll	171, δ	ISO, 0	237,2	174,6
lamoxifen	354,3	4 60,2	410,0	2 81,7
(.10 gg/mi)	(’toO, 3%)	(Í36, üt:	Ο'όζ,ΙΑ

Amint az a 4. táblázat adatai alapján látható, tamoxifenne 1 történd eiőinkabálá.s valamennyi vizsgált M.CCkoncentrációnál jelentés mértékben növelte az MCC-indukált apoptózist, Szék az adatok arra utalnak, hegy az ACC amelyben az A-DMS A. phley sejtfalon, azzal alkotott komplexként van jelen - alkalmazható más rákellenes hatóanyagokkal végzett terápia kiegészítőjeként, a kezelés hatásának növelésére.

14. példa

M. phley DNS módosítása ntetiíezésse .1, u 11 r a hars gk ez el é s s el és autoklávozással.

Ismert, hogy a thimet-Önerőn- (BCG-) baoillnsbői készített nnkleiosav-készőtmények gátolják a tumnrnbvekedást ílásd a 4 S79 941 szama amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; valamint Toknnaga és munkatársai:

__ Λ; ♦.·* * ♦ * **«u '? * * * * * ♦ * » « » »WV A« V « ♦ « ♦ » * « * «««* *·♦ ** ** ♦♦

Nicrobiology and immunology ;y 55 (1992}) . A 3CGnukleinsav aktív összetevőjeként a „pnrin~purin-C~G~ p í r 1m1 dl. n -p r r i ml d 1 η p a 1 i.ndr öma ο11g on u k1e o t i d- sze kven ciki ÍCG-elemet) azonosították. GnG-raet Házzal végzett cltozinmetilezés megszünteti, ennek a DNS-nek az aktivitását [Krieu és munkatársai: Natúré 374, 546 U595)). Ezért, megvizsgáltuk, hogy a CpG-metélezés miként; befolyásolja a AL pnley DNS apoptézist kiváltó képességét.

M. phiey SHS-t (.1 gg) mecíleztünk 2,5 egység CpG Sssimetílázzai (Geo England Bioiabs, dississauga, Ontario, Kanada) az alábbi összetételű pof lenben: 10 eme;./1 Tris-HCl ;p.H~7,9); .50 mmol/1 NaCl; 10 mxsol/i. MgClp .1 mmol/1 DTT; és 160 umol/1 S-adenozIlmefionin, 1 órán át, 37°c~on. Natív és metiiezett M. pbley DNS-t Bstlil restrikciós endcnukleázzai (New England Bioiabs) hasítottunk 1 órán át, 6-0°C~on, a következő összetételű pufferben: 50 mmol/i NaCl; 10 mol/l

Tris-HCl; 10 mmol/i ygOŰ.p és 1 mmol/I DTT ípH^l, 9) . Három óráig, 100 Volt mellett, 0,51~os agarőzgéien végzett elektroforézises analízis szerint, a. natív Ah phiey DNS-t emésztette a BstGT restrikciós endonukleáz, mig a metiiezett AL pnley DN3~t nem. emésztette a BstDi restrikciós endonukleáz. Ezzel igazoltuk, hogy a M, phiey eredetű DNS metilezése teljes volt.

Amint azt a 17. ábra mutatja, a metiiezés nem változtatta meg a Ah phiey által Indokait hűhó-· lei szabadulás t

THF-i-nek elnevezett humán leukémiás menőéi rákból . Ezek az eredmények azt jelentik, hogy - szemben a BCG-vel -, a Ah priey DNS alkalmazásával történő apoptözísindukcióhoz nincs szükség CG-eiemek jelenlétére.

A A. phiey DNS-t íl ug/mx! alkotó bázispárok hosszát 15 másodpercig vagy 20 percig, jégen, „bódéi a-35 -típusú ultrahangkészülékkel (HeatS'ystems-Ultrasonics, Inc,) végzett ultrahang-kezeléssel; vagy föstlll restrikciós endonnkleázzal végzett emésztéssel; vagy 30 percig, 121⁶C-on végzett autoklávozással (Castle Sybron MDT, Dnbuque, lov/a) lecsökkentettük. Amint azt a 14. ábra mutatja, az ultrahangkezelés, a BstUx-emésztés és az autoklávozás - amelyek mindegyike úgy csökkentette a bázispárok hosszát, hogy mintegy 5-250 bázíspár közé eső tartományba eső oiigonukleotidőket kaptunk, nem befolyásolta a A. phley eredetű

DNS NuMA-felszabadulást indukáló hatását THP-l-monocitákbél. Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a A, pháey DNS - még rövid {mintegy 5-250 bázispár; otígonnkleotidhosszúság mellett is ~ apoptózist vált ki ráksejtekben.

THP-l-nek elnevezett humán leukémiás monocifákat inkubáltunk 48 órán át kezeletlen A. pbiey DNS-sel és MCC-vel, valamint 30 percig, 121'⁼C-on aafokiávozott A. phley eredetű DNS-se1 és MCC-vei. Az autoklávozás, amely a DNS bázíspárhosszának csökkenését eredményezi, nem befolyásolta a M. pbley DNS vagy MCC proliferáciöt gátié képességét (5.A. ábra; vagy apoptózist indukáló képességét (5.3 ábra) ezekben a sejtekben.

♦ X 4 4* 4* W* * 4

4 44 4 4' * * « X X44 44 4 « * 4 4 4 4 4 *

4 4 44 4 *4 44 4* <7 táblázat

	Bem sutok)avozott ) í% gátlás)	Autoklávozott (b gátlás)	)1
111 · ( ·:ΜΒΒ:ζ1ΐ?ΰρ|Α1111111((	8 .· -r / 4 i.	))))))))))))))))))))))))11|IM
tz ll(AO22i0lái|eill211l	bös/~l	()(()()())()))1())))1))())())1111)11))1^
MCA Ivó ugt mi.	33*/~7	64 + /--3	1()1)
Ab phioy 2112	8 Se/-8	34+/-11
1 uy/mi:
Al petty WS	lg 1)1 SÍ Ai8(..l.-(í)z)))	744./-6
lö pg/ml
Aí. pbioy bb		ΖΖΖΖ:ΖΖΖ:ΖΖ2Ζ(((Ζθ O/kOt ft( (1/1(ζ((ζ(Α7
) ,()>( (230( ((pUpöl < t t : V

S.B táblázat

	bem. au tok Iá vo zott	())(())()(())β1)|β
)) /)l(Mbvllul))(iil)/)Íl)())))l))))))Z	())))))))i)i)li))li())(l|si)l))))))))i)()()())()()))))))^	))1))))))1)))))))1:11)11)11))1)())))((^^
232 10 pg/:zl	22 5,9	322, 4
HCC 100 pg/nl	339,9	337, 3
A. pb3ty DOS*	2 01,4	2 32,4
))())(I((b(O((s(pg:/pá()<?)(Z(():Z)(l
( A (11(1( 11 < 1 11 7+1((1( ') i ( .Ab ())ipii)á«y (l)llb	31.7,2	2 7 3,2
Z(t)())i(Z))7b(())(((zib7sl(i))))))))(())(ZZ()((Z)
P pélsy BAB	306, 3	2 3 3, I
1 gg/m.l

φ « * φ ♦ * « « ♦ χ * Φ φ φ Χ*>

15. példa

Ag MCC gátolja a turaornóvekedést in vivő

MCC-t és DNáz-.I.~keze.lt MCC-t ennigesitunk 1 mg/ml koncentrációig 2 vegyes-i ásványi olajat és 0,02 vegyes-i Tween-'80-at (Fzsher Chemical Co.) tartalmazó PBS-ben, 5 percig, 4⁴C~on végzett uitrahangkezeiéssel (Heat Systemsültrasonics, Inc.;.

Kettes törzshöz tartozó tengerima lacokka.l s z ingén, 10— es jelzésű hepatömasegtehet gyorsan felolvasztottunk, centrifugáiássai mostunk, és ICC sejt/mi koncentrációig Misatápközegben szuszpendáitunk. Egy-tized ml, 1,5x10 sejtet tartalmazó szuszpenziöt injektáltunk Intradermálisan, 3 hónapos, 2-es törzshöz tartozó tengerimaiaook oldalába. A kezelést 6-7 nappal az injektálást követően kezdtük el, amikorra a rákok körülbelül 0,5-0,8 cm átmérőt értek el. Hét állatot csak emulgeáiö pufferrel kezeltünk (kontroll); hét állatot MÜC-t tartalmazó emulgeáiö pufferrel kezeltünk; és hét állatot DNáz-I-kezelt MCC-t tartalmazó emulgeáiö pufferrel kezeltünk. Az emulziót közvetlenül a tumorba, és az azt körülvevő normális szövetbe installáltuk. Fél-fél ml emulziót adtunk be a 0. és a 6. órában, azaz Összesen 1 ml térfogatú, 1 mg/ MCC-t vagy DMáz-I-kezelt MCC-t tartalmazó emulziót adtunk be.

A tumorátmérőkét (leghosszabb és legrövidebb átmérő réz; 3 hétig hetente feljegyeztük. A tumortérfogatokat rmró-ben számítottuk k(, a következő képlet alapján: 0,5ta (leghoszszabc átmérői xb (legrövidebb átmérő); és minden egyes tengerimalac esetében kiszúrni tettük a tumortérfogat növeke-

dósét a kezelés 0. napjához viszonyítva. Statisztikai analízist két utas AHOVA programcsomaggal végezténk, ismétlésekkel {PHARM/PCS 4,2-változat; MOS, Philadelphia, PA}. A kezelések eltéréseit p<-0, 05 teljesülése esetén tekintettük szignifikánsnak.

Amint azt a 15. ábra mutatja, kontrol lemül z iö alkalmazása esetén a tumortérfogat körülbelül. 22-szeresére növekedett a 3, hétre, míg MCC alkalmazása szignifikáns módon, gátolta a tumornovekedést a kontroliemui sióhoz képes t (lásd 15. ábra; 6. táblázat; . DNáz-I-kezelt MCC alkalmazását követően a tumornövekedés nem tért el szignifikáns módon a kontroll létől ilásd 15. ábra; ő, táblázat) .

6, táblázat

Két utas AHOVA, ismétlésekkel

Kezelések össze ha s ο η 1 i f á sa	......................... .............................................: p-érték
Kontroli versus MCC	p>0,01
Kon toli verses MCC·;· DNáz	nem szignó, fikáns
MCC vers üs MCC a DNáz	p>6,ül

A fenti adatok szerint, MCC instiiláci.ója a tumor helyére tumorregressziót idéz elő. Ezen felül, az MCC-vei és DNáz-l-kezelt MCC-vei végzett kezelések tumornövekedést gátló hatása közt kimutatható szignifikáns eltérés (p>ö,0l· arra utal, hogy az MCC in vivő rákellenes aktivitásához nem-degradálödott M-DNS jelenlétére van szükség.

26, példa

MCC-oi to toxi el. tá.s

A sej teltotoxioifást a plazmamembrán épségének elvesztése és oitopiazmatikus enzimek, például, de anélkül, hogy igényünket arra korlátoznánk, DDH kiszabadulása jellemzi (Nyliie és munkatársai: International Kevíem of Cytoiogy 68, 251 (1980); valamint Phillips és munkatársai; Vaccine

14, 89« (1996)1. Leírták, hogy citotoxikus .hatóanyaggal kezelt husién hölyagráksejlekből LDK szabadni fel (Rahman M, ; Uroiogy International 53, 12 (1994)1.

Az MCC citotoxikus hatásának mégha tarozására KT-1189nek és KT-1576-nak elnevezett humán hölyagráksejtokét tf

lakúba ltunk 48 órán át Ο gg/ml és 100 ug/ml közé eső koncentrációjú MCC-vei vagy - a teljes LDH-felszabadulás kor/olijakért - lizispufferrel pö mmol/1 Tris; 1 mm.oi/1 EuTA; 0,2% i ton-X-i00 {pH^:::7,5;} [kiden és munkatársai: Biochim., Siophys Aota. 1320, 345 (1037) ] , A tenyészet felülúszójába kiszabaduló LDH-t egy, a kereskedelemben hozzáférhető reagens készlettől ÍSigma-Al.drzch} határoztuk meg.

Az LDH-felszabadulás meghatározása szerint az MCC nem volt citoioxikus a HT-dld- vagy Ηΐ-1376-soj tekrs [17, ábra) . A cibotoxicitás hiánya arra mutat, hogy az MCC közvetlenül gátolja ráksejtek pro!iterációját, és közvetlenül indukál apoptózist ráksejtekben.

Citokinszintézls stimulációja in yifc.ro

Az TL-12-ről ismert, hogy bizonyos ráksejtekben rákellenes hatást fejt ki (Vöest és munkatársai: Journal

National Cancer l'nstítute 87, 581 {1995); valamint stine és munkatársaiAnnals NY Academy of Science 795, 420 (1908)1, mig a CM-CSF-ről leírták, hogy egyes ráksejtek esetében elősegíti a tumorfejlödést [Hawkyard és munkatársad Journal of Urology 150, 514 (1993)1., Ismert továbbá, hogy egyes ráksejtek citokinoket szekretáinak [De Reá.jke és munkatársai: ürologv Research 21, 349 [1993); Bevers és munkatársai.: British Journal of Urology 8Θ, 35 81997)d Megvizsgáltuk tehát az MCC 1L-6-, 11.-12- és GM-CSF-szintézisre kifejtett hatását KT~ü 97-nek és RT-1376-nak elnevezett hozmán hólyagráksejtekben, humán THF-l-monociiákban, egéreredetü ++ β«4 makrofágokban, egéreredetű EAb~264.7-monocitákban és egéreredetű iépsejtekben.

A cztokinzsrneiódési pg/ml mértékegységben határsatuk meg, 100 ul tenyészetfeluiúszőra vonatkoztatva, a megfeleld, kereskedelemben hozzáférhető ELlSA-resgenskésslet CSioSoarce, Camarlllo, CA) alkalmazásával. Az 1L-12-SLISA mind 1L12 pto-kompexek, mind szabad p4ö-alegységek meghatároz ásara alkaimas,

Η T1197-«fejteket, HT~13 76-s e jt e ke t, TΗr-1-s e j t e ke t, makrofágokat, PAW-2S4.7-monocítákat és egéreredetü iépsejteket inknbáitunk 43 érén át I ug/ml MCC-vei. Amint az az

1, ábrán látható, az MCC stimulálta az TL-6 és lh-12 termelődését humán monooitákban és egér makrótágokban, de nem stimulálta; humán hólyagráksejtekben, egéreredetü monocl tárban vagy Iépsejtekben. Az MCC egyik vizsgáit tumorsejt esetében sem stimulálta a GM-CSF-termelődést.

A fenti eredmények szerint, amennyiben első, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagként A, pÁlsy sejtfalat alkalmazunk, az MCC stimulálja az Ih-C- és IL-12-nek nevezett rákellenes eitokinek termelődését humán monocifákban és egéreredetű makrózágokban. Az MCC ne® stimulál citokintermelődést humán hóiyagráksejtekben, Az MCC nem stimulálja

a. tumornövekedést fokosé citokin, a GM-CSE termelődését.

Υ*'♦ Λ Μ* »* β*** κ * * χ * « « >

X Φ ΦΧΧ »« X > ♦ * * X * « * «Λ·** «♦« ** ♦♦ ♦*

28, példa

Kezeletlen és DNás-l-kezelt M. phley DNS, MCC-DNS, MCC: és

Regressln© hatása az IP-12-termelődésre humán THP-l-monocr dákban

Humán 1HP-1 -monom iákat inkufeéltank 43 órán át éh páiey DNS, MCC-DN3, MCC vagy Regressin® jelenlétében D.Náz~I~ kezelést megelőzően, azt követően., valamint azután, hogy MDNS-t adtunk DNáz-I-kezelt éh pá.ley DNS~hez, MCC-DNS-hez vagy MCC-nez.

7_. táblázat

Humán THP-1-monooi tá k In- 12-termelése pg/ml mérték egységben

Kezelés	IL~12~fcermelés, pg/ml tenyészet felülúszó egységben
Kezelés nélkül	4 0?	676	.1222	106
DNáz	I7S	367	72.0	203
DNáz + 1 pg DNS	424	653	733	nem vizsgál kuk

Amint az a. 7. táblázat adataiból krolvashatö, a ék p/íiey DNS, NCC-DNS és MCC egyaránt stimulálta a THP-1manociták lL-12-tarm.eIését. Az IC jobban stimulálta az ILII- termelést, mint a éh phiey DNS vagy MCC-DNS. á Legressin® minimális mértékben fokozta az IL-12-termeiő~ »ν· fc » < * * <· Ν

Μ» Φ* Φ* dóst. DNáz-1-kezelés körülbelül SOI-kai csökkentette a hh phley DNS-, MCC-DNS- és MCC-stimulált IL-12-termelést. A Regress:in® hatását a DMáz-T-kezelós nem befolyásolta. Amennyiben DNáz-I-kezelt Ah pá;ey DNS-hez Ab pk.iey DNS-t adtunk, vagy DNáz-I-kszelz MCC-DNS-hez MCC-SMS-f adtunk, azok iL-12-termelődést stimuláló hatása helyreállt. DMáz-1kezeit MCC iL-~Í2~termelőöést stimuláló hatásét MCC-DNShozzáadásávai nem tudtuk visszaállítani.

Az, hogy az MCC - amennyiben az első, gyögyás zatiiag elfogadható hordozóanyag M. phley sejtfal - több IL-12termelést indukál, mint a Ah phley DNS vagy MCC-DMS, azt jelenti, hogy az M-DNS-t érzékeny sejtek számára prezentáló· hordozóanyag befolyásolja az M-DNS I.L-.12-termelést stimuláló képességet. Az a tény, begy a DNáz-l-kezelés - amely az M-DNS degradációját eredményezi - szignifikáns mértékben csökkenti az .Ah phiey DNS, MCC-DNS és MCC IL-l2-termelést fokozó hatását, arra. utal, hogy az IL-12-termelés optimális stimulációjához meg kell őriznünk az M-DNS oiigonukleotidformaját. Annak alapján, hogy a DNáz-l-kezelt MCC IL-I2termelést stimuláló aktivitása M-DNS hozzáadásával nem állítható helyre, arra következtetünk, hogy az .a mód, ahogy az M-eNS az MCC-ben komplexként meg van jelenítve a éh phley sejtfalon, lényeges az IL- 12-term.elés optimális stimulációjához humán monocitákban.

Λ. -φ

29. példa

Autoklávozás hatása az IL-12-termelés M. pbley DNS és MCC általi sfcimuláolójára humán THP-1-monod fcákban

Humán THP-i~monociiákat ínkubéltunk 48 órán át NCC vagy

AD phlsy DNS, vagy 30 percig steril vízben autók lévezott NCC vagy bt phley DNS jelenlétében.

'3. táblázat

Autoklávozás hatása, at 1L-12terse1és M. páíey DNS és HCC általistimulációjára humán THP-I-monccíiákban (az eredményeket pg/mi mértékegységben adtuk meg;

	Nem antokiávozott 1L-12 ípg/ml?	Antokiávozott IL-12 (pg/mi;
NCC 1 ug/mi	1017,4	005,2
HCC 10 pg/mi	1001,6	1070,8
M. pÁley DNS	902,0	1088,3
1 ug/ml
M, pbley DNS	1027,1	949, 5
10 pg/mi

Amint azt a 0. táblázat adatai mutatják, az antokiávozás, amely a DNS bázispárhosszának csökkenését eredményezi, nem befolyásolta az HCC vagy a M, palóc DNS lL-12-termeIést stimuláló képességet moncoitákban.

20. példa

CD14-elienanyagkegelés hatása aa IL-12-termelés MCC-DNS-sel vagy MCC-vel történő stimulációjára humán THP-iroonoci'tákban

Humán THE-i-monocitákat inkuháltunk 1 órán át FBS vagy 10 ug/ml anti-CDlé-ellenanyag íMYl-klön; Coulter irmminoteeh) jelenlétében. Est követően, a sejtekhez 5 ug/ml MCC-DNS-t vagy MCC-t adtunk, és az inkubálást további 48 órán át folytattuk. A CDI4-ellenanyagok₍ amelyek a sejtek felszínén található CDI4-receptorokhoz kötődnek, mintegy

85%-kal csökkentették az ϊΰ-12-te.rmelés MCC-DNS általi stimulációját, és mintegy 20%-kal csökkentették az 11-12termelés MCC általi stimulációját (18, ábra).

21. példa

Cyto-chalasin-D hatása az IL-12-fcerme.lés M. phiey DNS-sel,

MCC-SNS-se.1 vagy MCC-vel történő stimulációjára harcán THP1 -monoci. tákban .Humán THE-l-monociIákat inkubáltunk 1 órán át PBS vagy 1 ng/ml M. phley DNS, MCC-DNS vagy NCC jelenlétében, 10 ng/ml cytochalasin-D [Sígma Chemical Co.) hozzáadásával vagy anélkül. A cytochaiasin-D, amely gátolja a fagocitézist, 64%-kai csökkentette a áh phiey DNS, 50%-kal az NCCDNS és 55%~kai az MCC IL-12-termelést stimuláló hatását

Cl·, ábrái.

Anélkül, hogy igényünket az alábbi feltetézésre kívánnánk korlátozni, de a 13. és 19. táblázatban közölt adatok alaptan, arra a következtetésre jutottunk, hogy a Eh phley

DNS, GCC-DhS és DSC többféle mechanizmus révén 1ép kölcsönhatásba monocítákkal. A 18. táblázat eredményei azt sugallják, hogy azok a CDI2-nek elnevezett, GPl-kötött membránreceptorral lépnek kölcsönhatásba, és bejutnak a sejtbe. Sz a mechanizmus sokkal specifikusabb a szolúbilis A. phzey

DNS-re és NCC-DNS-re, mint az inszoiűbílis ACC-re. A 19.

táblázat eredményei arra utalnak, hogy azok fagocitareceptorokkal, például a ,,ocaveoyer^w~receptorral lépnek kölcsönhatásba, és Így jutnak a sejtbe. Ez a mechanizmus jellemzőbb az inszoiúbilis ACC-re, mint a szolúbilis A. pá.ley DNS-re és MCC-DNS-re.

22. példa

CG-szekvencia ss MCC hatása az IL-X2-termelésre humán THP1 -monoci tákban ismert, hogy BCG-böl készített nukieinsavkészítmények stimulálják a iimfocilaproiiferációt, 3-ii.mfociták 1L-6- és IL-12-szekrécíógát, monociták 1L-12-szekrécióját, T-iim.fociták ib~S~ és gammainterferon-szekréciöját, valamint NKsejtek gammainterferon-szekréciói át [Klínman és munkatársai.: Proceeding of the National Aeademy of Science USA 93, 2879 (19965

Mivel a BCG-nukiéinsav aktív összetevőjeként a CGelemet azonosították, humán T:HF~1-monoci iákat inkubáitunk 43 órán át, u,5ug/ml és 5 pg/ml GCC vagy szilárd tézisé szintézis technológiával, automatizált DNS-szinetizéié készülékkel előállított 1’-GCTAGAAGSTAGCGf-3^? DNS-szekvencia jelenlétében.

V « » * « *

9. táblázat

CG-tartalmú oligonakleotíd és_MCC hatása az IL-12t orma 1 és re.....(pg/mi; THP-1 - monoc1 t á kb an

	5 pg/mi	1 pg/mi	0	,5 pg/ml
GŐTAGA-	nem kimutatna-	nem kímutatha-	n a®	mutatható
CGTTAGCGT	tő	tó		ki
MCC	nem vizsgáltuk	1239	nem	vizsgáltuk

A 9.. táblázat eredményei azt matatják, hogy CG-tartalmú oiigonukleotiá-szekvencía egyik vizsgáit koncentráció mellett se stimulálta az ID-12-termelest, míg az MCC 1 yg/mi koncentrációban, alkalmazva jelentősen fokozta az IL-12termelést.

23. példa

Hőkezelés és DNáz-I-kezeléshatása az IL-12:-temel és M.

phiey DNS, MCC-DNS, MCC és Regressín® alkalmazásával történő stimulál ására egréreredstű makrótágokban

Egéreredetű pe-rí törte ál.i s makrofágokat inkufoá ltunk 43 órán át M. phiey DNS, MCC-DNS, MCC vagy Hegyessin© jelenlétében, valamint 10 percig 100°C-on hőkezelt és 2 percig jégen lehűtött áh phiey DNS, MCC-DNS és Rsgressin© jelenlété10. táblázat

IL ~.12~ termelés egéreredetű makrótágokban (pg/mi)

kezelés	1L~12-termelés (pg/ml felülűszó)
	12,S pg/ml	5, 0 ng./ml	0,1 pg/ml
.bt pk 1 e.y DNS	228	2 07	140
ií, pndey DNS -	270	•Μ Ί: M. .C.	164
hőkezelt
MCC-DNS	nem vizsgáltuk	176	164
MCC-DNS - hő··	nem vizsgáltuk	2SS	131
kezeit
MCC	nem v a z s g á11uk	74 5	n e m v i z s g á 11 u k
Regressin®	110	9 b	80
Regressin® -	93	32	79
hőkezelt

Amint azt a 10. táblázat adatai mutatják, 5 gg/mi koncentráció alkalmazása mellett az lh-12-termelést az MCC stimulálta leginkább, kevésbé stimulálta az MCC-DNS és MCC, és legkevésbé a Regressin®, A M. phley DNS, MCC-DNS és Regressin® hőkezelése nem befolyásolta szignifikáns mértékben azok !L-12-termelést stimuláló hatását. Bár az erre vonatkozó adatokat nem. tüntettük fel, MCC hőkezelése enyhe, de szignifikáns mértékben fokozta az IL-X2-termelést.

kgér eredete perinoneálís makrofágokat in.kubál tunk 43 órán át kezeletlen és BNáz~l~kezsIt MCC-DNS, MCC vagy Regressin® jelenlétében {20. ábra), Az IL-12··termelést légnagyobb mértékben az MCC stimulálta, kevésbé stimulálta az

MCC-DNS, és legkevésbé a Regre ssínán Az MCC-DNS és MCC DNáz-l-kezelese szignifikáns mértékben csökkentette azok lL-12-termeIést stimuláló tatását egéreredetű nekrológokbán, A Regressinö DNáz-I-kezeiése nem befolyásolta annak aktivitását. A fenti adatok ugyancsak arra utalnak, hogy monocitáknái tapasztaltakhoz hasonlóan, az M-DNS olígonukleotidsfruktúráiát meg keli őriznünk ahhoz, hogy az 1L~ Íz-termelés optimális stimuiáciéját érjük el makro!ágokban.

24. példa

2L phley DNS, MCC-DRS, MCC és Regressin® hatása nitrogénoxxd (NO) termelésre egéreredetű peri toneális nakrofágokban

A makrofágaktivácié reaktív oxigénvegyüietek, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, nítrogénoxid (NO), szuperoxidgyökök és hidroxilgyökök termelődését stimulálja. Ezek s reaktív oxigénvegyüietek cltoll zist és apoptózist indukálnak érzékeny sejtekben, és ezáltal rákellenes aktivitást fejtenek ki.

Egéreredetü peritoneális makrofágokat inkubáltnnk 48 órán át 0,1 gg/ml, 5,0 pg/ml vagy 12,5 pg/ml Ab phley DNS, MCC-DNS, MCC vagy Regressinb jelenlétében. Az Nö-termelodést nmol/1 egységekben, a NOÖ Oriess-reagenssel történő reagáltatásával határoztuk meg, 100 pl tenyészetielülúszó alkalmazásával,

11. t áblázat

M. phley DNS, MCC-DNS, MCC és RegressíníD hatása a nitrogénoxid ;MO) termelésre egéreredetű makrofágokban

Kezelés	i NO-termelés (nmol/i)
	12,5 ng/ml	5, 0 pg/ml	0,1 ug/m.I
: A, p.oiey DNS	13,5 ng/ml	8, 3	2,5
MCC-DNS	nem vizsgáltak	3, 0	1, 8
MCC	nem vizsgáltak	36, 2	nem vizsgáltak
Regressin®	1,6	2, 6	0, I

A 11, táblázatban, közölt adatok szerint, 5 p.g/ml. koncentrációnál az MCC szignifikánsan több NO termelődését váltotta ki, mint az A. pniey DNS, MCC-DNS vagy Regressinén

Egéreredeta makro tágakat i.nkubáitnnk 48 órán át 1 gg/ml kezeletlen: vagy DNá.z-T-kezelt MCC-vei, vagy kezeletlen. M. phley DNS-sel vagy MCC-DNS-sei.

12. táblázat

NO-termelés stimnláoioga egéreredetű makraiágokban MCC,

DM é.kl.í.Cp Andi t MCC, MCC-DNS vagy Μ. pá 1 ey DNS a lkaimé zásává 1

	1. kísérlet NO {nmnl/ml.?	2, kísérlet NO (nmei/ml)
MCC	43,7	30,7
MC C t DNaz-1	0,0	2, 1
ö. egység)
MCC-DC5	2, 6
A, phley DNS	0, 0 ............ .....................................-— ——	1, β

A 12. táblázatban összegzett eredmények szerint, & 4?.. phiey sejtfalon komplexként. jelen levő M-DNS szignifikáns: mennyiségű NO termelődését váltotta .ki. Az MCC DNáz-ikezelése, ami az M-DNS degradálódását eredményezi, megszüntette az MCC NO-termelődést stimuláló hatását. Az MCC-DNS és M. phiey DNS minimális mennyiségű NO termelődését váltotta ki. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az NO-termelés optimális stimulációja szempontiából mind az M-DNS intakt oiigonukieotidstruktűrája, mind a fenti oligonukleotidokat a makrofágok számára prezentáló hordozó lényeges.

25, példa

MCC hatása a d. trogénoxid- (NO-) termelődésre egereredetú

RAW 264,7-aonocitákban

Egéreredetü RAW 254.7-monocitákat inkubál tu.uk 24 órán át 0,5-95 ag/ml MCC jelenlétében. Növekvő koncentrációjú MCC növekvő mennyiségű NO termelődését váltotta ki (21. ábra) , Ez meglepő volt, mivei NG-indukciöt kiváltó receptorok nem. expresszálőönak optimálisan monod,fákon, és ezért az NO-termelést rendszerint nem. hozzuk kapcsolatba monoéi Iákkal. Ugyanilyen köröliaények mellett a RegressinA nem stimulálta az NO-termelődést.

251 példa

Citokinszinfcézös stimulációja lm vivő

Négy, CDl-egerekből álló, egyenként 5-5 egeret tártálnazó csoportot, injektáltunk intraperitcneáiisan 50 mg/kg NCC-vei. Az injektálást kővetően 0., 5., 6. és 24 órával * ««

X * » * vért vettünk, és a szérumokban meghatároztuk az IL~0, IL10, 1L-12 és GMS.F-koncentrációkat (pg/mii (22. ábra), MCC intraperitomeális beadását követően az IL-6, IL-iu és 11,-12 szérnmkoxrcentráciöga az injektálást követő 3. és 6. órára szignifikánsan nőtt, az injektálást követő 24 őrára pedig körülbelül a kontrollértékek szintjére (0. őrs; csökkent. A GM-CGF széramkoncex'xtrácíö ja az injektálást követő 3., 6. és 24 órára körülbelül a kontrollértékek szintjén maradt (0.

óra) .

Öt, egyenként 5-5 egerei tartalmazó, CDi-egerekből álló csoportot injektáltunk intravénásán ö, 6 mg/kg MCC-vei. Az injektálást követően Q„, 3., 6, és 24 órával vért vettünk, és a szérumokban meghatároztuk az' IL-10- és 11-12konoentrációkat (pg/ml) (23. ábra). MCC intravénás beadását követően az 1L-I2 szérumkoncenfcráciöja az injektálást követő 3. és 6. órára szignó.fikánsan nőtt, az injektálást követő 24 órára pedig körülbelül a kontroliértékek szintjére (0. éra; csökkent. .Az IL-IO szérumkoncentráciöja az injektálást követő 3., 61 és 24 órára körülbelül a kontroliértekek szintjei; maradt (0. őrá; .

A fenti eredmények szerint, az M-DMS in vivő beadása amennyiben az M-DMS-t M. phiey sejtfallal alkotott komplexként, MCC formájában, alkalmazzak stimulálja az .IL-β, ILIO és IL-I2 rákellenes oitokinek termelődését, de nem stimulálja a tumorfejiódést elősegítő GM-CSF termelődését. A fenti adatok alapján az a következtetés is levonható, hogy mind a beadott MCC mennyisége, mind a beadás módja befolyásolja az MCC oitokintermeiést stimuláló képességét in vivő.

Négy, CDl-egerekből álló, egyenként 4-4 egeret tartalmazó csoportot injektáltunk intraperitoneálisan kezeletlen vagy DAáz-l-kezelt 2C phiey DNS-sel vagy ACC-vel. Három óra nalve az egereket leéltük, azoktól szivmikropukcióvai vért vettünk, és a szérumokban meghatároztok az IL-.12 koncentrációját (mg/ml; (13. táblázat).

táblázat

Kezeltlen és DNáz-I-kezelt MCC és M, púley DNS hatása az

11-12-1ermeIésre (pg/mlj CD-I~egerekben

	ACC		ACC+DAáz	% gátlás
#1, egér	253	#5. egér	126	491
#2. egér	iáé	#6. egér	57	68%
#3. egér	146	#7. egér	------------ — 121	17%
#4. egér	193	43 . egér	145	23%
átlag	195a/-46		111+/-33	40,5 + ,/- 2 2,6%

	ACC		A. ph2ey DNS + SNáz	% gátlás
69. egér	135	#13. egér	110	197
#10. egér	283	#14. egér	145	48%
#11. egér	I 18	#15. egér	121	82%
#12. egér	270	#16. egér	169	37%
áti ag	195+/-46		111+-/-38	4 6 ? 5 e / ~ 26,5%

X * *φ Φ * Φ Φ

Φ «- ΦΦφ. XX Φ «- » * * φ « » φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦ χ* ** ΦΦ

Amint azt a 1.3. táblázat adatai matatják, MCC és M, phiey M-DMS in vivő beadása stimulálja az IL-12-nek nevezett rákellenes citokin termelődését. Dház-I-kezeiést követően, az MCC által stimulált IL-12-termelés iö,5I~kal csökkent, és a M, phiey DNS által stimulált IL-12-termelés Iö,5á~kai csökkent. A fenti eredmények szerint, autóz, hogy az 11,-12-termelés optimális stimulációját érjük el in vivő, az M-DN.S oligonukleo-tidstruktűráját meg kell. őriznünk.

7, példa

A.c MCC stabilitása

MCC-t il mg/ml) steril szuszpenzlőkéni tároltunk 0,3.5 vegyes-% NaCl-ban, sötétben, iőC-on, 6 hónapig. Az átlagos részecskeátmérőt foton korrelációs spektroszkópiával határoztuk meg (Né Pina, Goul.tér Electronics Inc.). Az MCCszuszpenziöt 0,35 vegye.s-% NaCl-oldatban SxlO⁵ és ICC beütésszám/másodperc közé eső részecskeimpulzus-sűrűségig hígítottunk. Az átlagos részecskeátmérőt méretmegosziás-processzor üzemmódban (size dis£.ridn.;t'ion processor morfe, SDP) határoztuk meg, a következő beállítások alkalmazása mellett: folyadék-tör ésmutató M'fla.id reilracfive index) : 1,33; hőmérséklet: üti viszkozitás:

0,03 centipolse; mérési szög; 90 ; mintavételi idő:

10,5 ps, mintafuttatási idő: 100 másodperc. A. feszültségét, azaz a részecskék és a többségben jelen lévő oldószer hidrodinamikai határán jelentkező elektromos töltést .Pe.lsa ilcöX (Couiter Electronics Inc.) készülékkel mértük, a kcparameterek beállítása mellett: áramerősség:

0,7 mA; frekvenciatartomány; 500 Hz; hőmérséklet; 20°C; folyadék-törésmutató : 1,33; viszkozitás: 0,93 centipoi.se;

dieiektromos állandó: 78,3; vezetőképesség; lő, 7 ms/cm; ’-'on elme: 2,5 másodperc; ezt time; 0,5 másodperc; xaintafuttatási idő; 60 másodperc.

Axaint az a 24. ábrán látható, az MCG-tÖltős és MCCátmérö viszonylag változatlan maradt a 6 hónapos tárolási idő során. Ezen felül, az bCC .11.-12-termelődést stimuláló és apoptözísindukáló hatása TH.P-l-monocitákban változatlan, maradt a 6 hónapos tárolás során.

2S. példa

Humán 'vastagbélrák kezelése MCC-BNS és MCC alkalmazásával

Humán vastagbéiráksejteket (IOÍ12C) telepítettünk meg ektöpiás szolid humorként immundef ioiens tíwszh lányos „nude^íZ~egerek („nu/nu-egerek> szubkután szöveteiben, majd az egereket öt csoportra osztottuk. .Az 1. csoport csak hordozóanyagot kapott. A 2. csoportot MCC-DüS-sel kezeltük. A 3. csoport Düáz-l-kezelt MCC-DNS-t kapott. A 4. csoport MCC-kezeiésben részesült. Az 5. csoport Dbáz-i-kezeit MCü-t kapott. A tumortömeget lemértük a kezelés előtt, és azt kővetően, a négy hetes kezelés során hetente. A z. és 4. csoportba tartozó egerekben a tumortömeg regresszióját észleltük.

* ♦

FA, példa

M. phley DNS és MCC alkalmazásává humán petefészekrákra végzett kezelés hatása

Humán petefészekrák-sejteket (36Ή2) aszciteszként telepítettünk meg immundeficiens tímuszhiányos „nade-egerek (,,nu/nu~agerek) perátoneális üregében, majd az egereket öt csoportra osztottak. Az 1. csoport csak hordozóanyagot kapott, A 2. csoportot M. phley DNS-sel kezeltük. A 3, -csoport DNáz-l-kezelt M. phiey DNS-t kapott, A. 4. csoport MCCkezelésben részesült. Az 5. csoport DNáz-!~kezeifc Hcü-t kapott. A tumortÖmeget lemértük a kezelés előtt, és azt követően, a négy hetes kezelés során hetente. A 2, és 4, csoportba tartozó egerekben az aszciteszes ráksejtek prolirelációjának gátlását figyeltük meg.

3d. példa

Kutyák nemi úton terjedő rákjának kezelése MCC-vei

Nemi úton terjedő rákban véréréül cancer, VT) szenvedő kutyákat 4 csoportra osztottunk. Az 1. csoport vincristint kapott. A. 2. csoport vincristint kapott methotr.exáttal és cyclophosphsmiddal kombinálva. A 3. csoportot NCC-DNS-sel kezeltük, hordozóanyaggal alkotott komplexként, azon prezentálva, hordozóanyagként pedig mycobakteriális sejtfalat (MCC-tg alkalmaztunk. A 4. csoport vincristint és MCC-t kapott. A tumortömeget lemértük a kezelés előtt, ás azt kővetően, a .12 hetes kezelés során hetente. A. 4. csoportba tartozó kutyáknál a VT regresszióját figyeltük meg.

32, példa

Szuszpenzíő vizes bázisú hordozóanyagbán

M-DNS-t egy első, gyégyátdatilag elfogadható hordozóanyagban sznszpendáltank, és 20% toljesÍtmény mellett, 5 percig ultrahanggal kezeltünk („Módéi. á-tSh Sonleator;

heat Systems~bitrasoni.cs ót:.·. Adott esetben, az ultrahangtereit Részi Irányt mikrofiuidisáiással homogenizáltuk, 15 00-0-30 000 psí mellett, egy átrolyatással („Módéi ΜΠΟΙ; Microfiuldics, Newton, MA).

Claims (15)

1. Szabadaíut í igénypontok

   1. Kósxtoéay, amely tartalmazza a következőket;

   a) AÁw&öcíe:rúcm páZef-DNS (M-DNS), és

   b) egy első gyógyászatiíag elfogadható hordozó, ahol az M-BbíS rákellenes aktivitású.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az M-DNS rákellenes aktivitása ráksejtek prtdiiéráeiőjánák gátlásában aytívásöul meg,
3. 3. Az 1. igénypont szerinti tóadtomy, altul az. M-DNS rákellenes aktivitása ráksejtek ^xsptósisának indufcálásában nyilvánul meg.
4. 4. Az í. igénypont szeriori készítmény, ahol az M-DNS rákellenes aktivitása az immunrendszer sejtjei által történő eitokm-íermelödés stimulálásáhan nyilvánít! meg.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az első gyógyászatiíag elfogadható hordozó a következőkből álló csoportból van kiválasztva.' vizes hordozó, a aeovvízes hordozó és Mycofeacíeriaí»·pföei (Af. pá/eá) sejtfal.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, ahol az első gyógyászatiíag elfogadható hordozó M ph/eí sejtfal,.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti készitmétjy, amely tartalmaz egy második gyógyászatiíag elfogadható hordozót is, amely második gyógyászatiíag elfogadható hordozó a kóyetkezókból álló csoportból van kiválasztva:: vizes hordozó és nem-vizes hordozó.
8. 8. Készítmény amely' tartalmaz;

   a) M-BNS-t,

   b) »W. púiéi sejtfalat, ahol az M-DNS struktúrája meg van Őrizve és komplex alva van az Aó pkiet sejtfalon (MCC), és

   e) gyógyászatiíag elfogadható hordozót, ahol az MCG rákellenes aktivitású.
9. 9. A 8, igénypont szerinti készítmény, ahol az MCC rákellenes aktivitása ráksejtek proliferációjának gátlásában nyilvánul meg.

   !ö. A 8. igénypont szerinti készítmény, ahol az MCC rákellenes aktivitása ráksejtek apoptózisfmak indukáiásáfc&n nyilvánul meg,

   1 i. A 3. vagy 10, igénypont szerinti készítmény, ahol a ráksejtek apoptózisának mdukálása független a kővetkezőkből álló csoportból kiválasztott bármely faktortól; Fás, p53/p21 és hatéanyag-rezíszteocia.
10. 12. A 3. 'vagy 8. igénypont szerinti készítmény, ahol a ráksejtek apoptózisának indakálása kaszpáz-3 aktivitás ráksejtekben történő indakáiásában nyilvánul meg.
11. 13. A 8. igénypont szerinti készítmény, ahol az MCC rákellenes aktivitása az immunrendszer sejtjei által történő eitokin-temielődés stintnlálásában nyilvánul: meg.
12. 14. A 4. vagy 13. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunrendszer sejtjei a kővetkezőkből álló csoportból vannak kiválasztva; makrolagok és moaeeiták,
13. 15. A 4, vagy 13:, igénypont szerinti késziítnény, almi adtokat a kővetkezőkből álló csoportból van kiválasztva; IL-ő, IL-lö és IL-12,

    1 é. Az 1., vagy 8. igénypont szerinti készítmény, ahol az MCC rákellenes aktivitása aktív oxigéngyököknek, az immunrendszer sejtjei által történő termelődésének stmmlálásában nyilvánul. meg.
14. 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, «hol az imnmnrendszersejtjai. materofágok,
15. 18. Az. 1 -17. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása, ember vagy állat eseté» rák kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.