KR100533576B1 - 세포증식 및 세포사멸 조절용 조성물 및 방법 - Google Patents
세포증식 및 세포사멸 조절용 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다세포 유기체에서 세포 증식 및 세포 사멸 조절에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 박테리아 DNA(B-DNA) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 B-DNA는 동물의 반응성 세포에서 반응을 유도한다. 본 발명은 좀더 구체적으로 말하면, 마이코박테리아 DNA(M-DNA) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서, M-DNA는 동물의 반응성 세포의 증식을 억제하고, 동물의 반응성 세포에서 아폽토시스를 유도하며 동물의 면역 시스템의 반응성 세포의 생물활성 분자 생성을 자극한다. M-DNA 조성물의 제조방법 및 이를 사용하는 방법도 기재된다.
Description
본 발명은 마이코박테리아 DNA(B-DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기에서 B-DNA는 동물의 반응성 세포에서의 반응 유도에 효과적이다. 특히, 본 발명은 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei)-DNA(M-DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기에서 M-DNA는 반응성 세포의 증식을 억제하고 이러한 세포에서의 아폽토시스를 유도하며 면역 시스템의 반응성 세포를 자극하여 생물활성 분자를 생성한다. M-DNA의 제조방법 및 이의 사용방법도 기재된다.
다세포 유기체에 있어서, 조직내 세포수는 세포 증식 속도 - 세포 제거 속도에 의해 결정된다. 아폽토시스는 성체 조직을 포함한(이에 한정되지는 않음) 조직에서 유전적으로 프로그램된, 비-염증성, 에너지-의존 형태의 세포사멸이다. 아폽토시스는 4 가지 순차적 단계로 이루어진다: (1)세포외 또는 세포내 트리거에 의한 사멸로의 실행, (2)세포내 프로테아제 및 뉴클레아제의 활성화에 의한 세포사멸, (3)타 세포에 의한 사멸 세포의 포획, 및 (4)식균 세포의 라이소좀내에서 사멸 세포의 분해[참조문헌:Steller H. Science 267:1445-1449, 1995]. 세포 증식, 세포 아폽토시스, 또는 이들 둘의 조합의 조절에 있어 일탈은 암, 신경퇴행, 자가면역 및 심장 질환을 포함한(이에 한정되지는 않는다) 각종 질환의 병인과 관련되어 있다.
아폽토시스는 Fas(CD95)[참조문헌:French et al. Journal of Cell Biology 133:355-364, 1996] 및 종양 괴사 인자 수용체 1(TNFR1)를 포함한(이에 한정되지 않음) 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드에 의해 개시될 수 있다. FasL의 Fas에의 결합 및 TNF의 TNFR1에의 결합은 세포내 시그널링을 개시하여, 핵 DNA-단편화, 핵 매트릭스 단백질(NuMA)의 방출 및 세포 기질 접촉의 상실과 연관되어 있는 아폽토시스 실행의 치사적인 분해 캐스케이드를 개시하는 시스테인 아스파틸 프로테아제(카스파제 caspase)의 활성화를 일으킨다[참조문헌:Muzio et al., Cell 85:817-827, 1996].
아폽토시스는 또한, p53/p21 조절자[참조문헌:Levine, A. Cell 88:323-331, 1997]를 포함한(이에 한정되지 않음) 세포내 단백질에 의해 유도될 수 있다. p53/p21은 내용물이 세포질 중으로 누출되어 아폽토시스 카스파제를 활성화하는 세포 미토콘드리아에 손상을 주게 되는 유리 라디칼을 생성하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한(이에 한정되지 않음) 아폽토시스-매개 유전자의 발현을 활성화하기 위한 전사 인자로서 작용한다.
암은 증식 과잉, 아폽토시스의 불충분, 또는 이들 둘의 조합으로 발생하는 불규칙 세포의 일탈적인 순 축적현상이다. Fas, TNFR1 및 p53/p21(이에 한정되지 않음) 같은 아폽토시스-관련 유전자에서의 돌연변이는 각각 암의 병인에 연루되어 왔다[참조문헌:Levine A. Cell 88:323-331, 1997; Fisher D. Cell 78:529-542, 1994]. 아폽토시스는 암의 병인에 중요할 뿐만 아니라 항암요법에 대한 내성 가능성에도 중요하다.
아폽토시스 유도에 대한 내성은 치료 실패의 상당부분을 해명해 줄 것같은 다중 내약성(MDR)의 중요한 카테고리로 출현하였다. MDR, 즉 구조적으로 및 기능적으로 관련되지 않은 화학요법제에 대한 동시 내성은 선천적 및 후천적 모두일 수 있다. 즉, 일부의 암은 요법에 결코 반응하지 않는 반면에, 다른 암은 요법에 초기에 민감하여 내약성을 발생시킨다. 화학요법제는 치료 효과상 암세포에서의 아폽토시스 유도에 주로 의존함에 따라, 화학요법제의 효율을 감소시키는 내약성은 직간접으로 감소된 아폽토시스를 초래하게 되고 일반적으로 각종 암에서의 불량한 예후와 연관되어 있다.
세포용해는 세포의 완전 또는 부분적 파괴 현상이며 면역 시스템에 의해 매개된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단핵구, 대식구 및 백혈구는 면역 시스템에 포함된다. 활성화된 대식구 및 단핵구는 동물의 반응성 세포에서 반응을 촉진, 증폭 및 조절하는 생물활성 분자를 생성한다. 이러한 생물활성 분자에는 사이토킨 및 반응성 산소 종이 포함되며 이에 한정되지는 않는다.
사이토킨으로는 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12) 및 GM-CSF가 포함되며 이에 한정되지는 않는다. IL-12는 단독으로 또는 다른 사이토킨과 함께, B 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 NK 세포를 포함한(이에 한정되지 않음) 백혈구의 성숙을 촉진하며, 감마 인터페론의 분비를 유도한다. IL-12는 일부 암세포에서 항암활성을 보이는 것으로 보고되어 있다[참조문헌:Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420-421, 1996: Chen et al., Journal of Immunology 159:351-359, 1997]. 이러한 활성에는 특이적 세포용해성 T 림프구의 활성화, 네츄럴 킬러(NK) 세포의 활성화 및 항-맥관형성 단백질 IP-10 및 MiG의 유도가 포함되며 이에 한정되지 않는다. IP-10은 암의 증식과 전이를 억제하고, 암-유도성 혈관신생을 억제하며, 또한 NK 세포를 활성화한다[참조문헌:Angillo et al., Annals NY Academy of Sciences 795:158-165, 1996]. GM-CSF는 일부 암세포에서 프로-암(pro-cancer) 활성을 지닌 것으로 보고되어 있다[참조문헌:Hawkyard et al., Journal of Urology 150:514-518, 1993].
반응성 산소 종으로는 산화질소, 수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록실 라디칼이 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 산화질소, 수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록실 라디칼은 활성 중에서도, 반응성 표적 세포에서 아폽토시스 및 세포용해를 유도한다.
박테리아 제제를 포함한(이에 한정되지는 않음) 생물학적 및 화학적 기원의 천연 및 합성 제제가 동물에서 반응성 세포의 자극 또는 억제에 사용되어 왔다. 마이코박테리움 종으로부터의 세포벽 제제는 암을 포함한(이에 한정되지 않음) 질병의 치료에 사용되어 왔다(U.S. 특허 제4,503,048호). 그러나, 이러한 제제를 사용하여 수득된 치료상의 혜택은 가변적이고 일관되지 않으며, 제제가 제조, 정제 및 전달되는 방법, 및 제제의 안정성에 좌우되는 것으로 보인다.
종래의 항암제는 임상적인 적용에는 보다 덜 적당한 것으로 입증되었다. 이들 제제 중 다수는 비효율적이거나[참조문헌:Bischoff et al., Science 274:373-376, 1996] 유독하고, 심각한 부작용을 보이며[참조문헌:Lamm et al., Journal of Urology 153:1444-1450, 1995], 내약성의 발생 또는 면역민감화를 일으키며, 수용자를 쇠약하게 만든다. 아울러, 이들 제제 중 다수는 이들의 효율이 Fas, TNFR1 또는 p53/p21에 좌우된다.
따라서, 암세포의 증식을 억제하고 암세포에서 아폽토시스를 유도하며, 면역 시스템의 반응성 세포를 자극하여 사이토킨 및 반응성 산소 종을 생성하는 새로운 치료제가 필요하다. 이러한 치료제는 항암제로서 및 타 함암제에 대한 보조제로서 유용하여야 한다. 보조제란 치료 효율 증가를 위해 타 항암제와 사용될 수 있음을 의미한다. 또한, 이러한 치료제는 제조가 간단하고 비교적 비용이 적게 들어야 하고, 제제 간에 활성이 재현 가능하여야 하며, 활성은 시간 경과에도 안정상태로 남아야 하며, 암세포에 대한 효과는 최소 독성과 결부되는 용량 처방으로 달성될 수 있어야 한다.
발명의 개요
본 발명은 마이코박테리아 DNA(B-DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하고, 동물의 반응성 세포에서 반응 유도에 효과적인 치료 조성물을 제공함으로써 상기 요구조건을 충족한다. 특히, 본 발명은 마이코박테리움 플레이-DNA(M-DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하는 치료 조성물을 제공하며, 여기에서 반응은 암세포를 포함한(이에 한정되지 않음) 반응성 세포의 증식 억제 및 이러한 세포에서의 아폽토시스 유도, 및 면역 시스템의 반응성 세포의 생물활성 분자 생성 자극을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
M-DNA 조성물은 제조가 간단하고 비교적 비용이 적게 들며, 제제 간에 활성이 재현 가능하며, 활성이 시간 경과에도 안정상태로 남으며, 최소 독성과 결부되는 용량 처방에서 효과적이다.
M-DNA는 온전한 마이코박테리움 플레이(M. phlei)로부터 라이소자임, 프로테이나제 및 나트륨 도데실 설페이트에 의한 분해, 및 페놀 추출과 에탄올 침전(M. phlei-DNA)에 의해 제조된다. 이와 달리, M-DNA는 M. phlei를 붕괴시키고 고형 성분을 수집하여, M-DNA-M. phlei 세포벽 복합체(MCC)를 제조함으로써 제조된다. DNase-비함유 시약을 사용하여 제조 중 M-DNA 분해를 최소화한다. M-DNA는 MCC로부터 페놀 추출 및 에탄올 침전(MCC-DNA)에 의해 제조된다.
M-DNA 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하는 M-DNA 조성물을 반응성 세포의 증식을 억제하고 이러한 세포에서의 아폽토시스를 유도하며, 면역 시스템의 반응성 세포를 자극하여 생물활성 분자를 생성하기에 충분한 용량으로 동물에 투여한다. 이러한 약학적으로 허용되는 제 1 담체로는 액상 담체, 고체상 담체 및 이들 모두가 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 액상 담체에는 수성 담체, 비-수성 담체, 또는 이들 모두가 포함되며 이에 한정되지 않는다. 고체상 담체로는 화학 합성 담체 및 천연 담체가 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 수성 담체로는 물, 식염수 및 생리학적 완충액이 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 비-수성 담체에는 오일 또는 기타 소수성 액상 제형 및 리포솜이 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 천연 담체로는 단백질 제거, 지질 제거, 세척된 M. phlei 세포벽이 포함되며 이에 한정되지는 않으며, 여기에서 M-DNA는 M. phlei 세포벽 상에서 복합체(MCC)를 형성한다.
또한, M-DNA 조성물은 약학적으로 허용되는 제 2 담체로 투여될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 제 2 담체로는 액상 담체 및 고체상 담체가 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 액상 담체에는 수성 담체, 비-수성 담체, 또는 이들 모두가 포함된다. 고체상 담체로는 화학 합성 담체 및 천연 담체가 포함된다.
본 발명의 M-DNA 조성물은 질환의 예방, 치료 및 제거에 유용하다. 암과 같은 원치않고 통제되지 않은 세포 증식에 의해 매개되는 질환의 치료에 특히 유용하다. M-DNA 조성물은 또한, 타 항암제의 효율을 증진시키기 위한 보조제로도 효과적이다. 이러한 제제에는 약제, 면역자극제, 항원, 항체, 백신, 방사선 및 화학요법제, 유전자 제제, 생물학적 공학처리된 제제 및 화학 합성 제제, 및 활성화 또는 불활성화를 위한 세포사멸 분자를 표적화하고 반응성 세포의 증식을 억제하고 이러한 세포에서 아폽토시스를 유도하는 제제가 포함되며 이에 한정되지는 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은 동물의 반응성 세포에서 치료반응을 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 반응성 세포의 증식을 억제하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 반응성 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 Fas와 독립적인 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 TNFR1과 독립적인 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 p53/p21과 독립적인 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 내약성과 독립적인 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 반응성 세포에서 카스파제 활성을 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포에서 반응을 유도하여 생물활성 분자를 생성하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포가 생물활성 분자를 생성하도록 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포가 사이토킨을 생성하도록 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포가 IL-6를 생성하도록 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포가 IL-10을 생성하도록 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포가 IL-12를 생성하도록 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 면역 시스템의 반응성 세포가 반응성 산소 종을 생성하도록 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 동물에서 암의 예방에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 동물에서 암의 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 동물에서 암의 제거에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 화학요법에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 화학적 항암제에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 생물학적 항암제에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 생물학적 공학처리 항암제에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 항암 백신에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 핵산 기본 항암 백신에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 방사선 요법에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 불완전 분화 세포의 말기 분화를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 대량으로 제조될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 비교적 저렴하게 제조될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 제제 간에 재현 가능한 활성을 지니는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 시간 경과에도 안정한 상태로 잔류하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 시간 경과에도 자체 효율을 유지하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 수용자에 최소한의 독성을 띠는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 수용자에서 아나필락시스를 일으키지 않을 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 수용자를 튜버쿨린 피부 시험에 민감하게 하지 않는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적 및 장점은 하기 기재된 양태의 상세한 설명 및 첨부 특허청구의 범위를 고찰한 후 자명해진다.
도 1: M. phlei-DNA 및 MCC-DNA의 올리고뉴클레오타이드 분포이다.
도 2: M. phlei-DNA (2a) 및 MCC-DNA (2b), 송아지 흉선-DNA (2a & 2b) 및 청어 정충-DNA (2a & 2b)에 의한 HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60, HL-60 MX-1 암세포의 증식 억제. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 3: MCC에 의한 HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60, HL-60 MX-1 암세포의 증식 억제. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 4: M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 hIL-12에 의한 인간 백혈병 THP-1 단핵구의 증식 억제. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 5: MCC 및 LPS에 의한 HT-1197 (5a) 및 HT-1376 (5b) 인간 방광암 세포의 증식 억제. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 6: PBS, 청어 정충-DNA 및 비처리 및 DNase I 처리 M. phlei-DNA 및 MCC에 의한 인간 백혈병 THP-1 단핵구에서의 DNA 단편화 유도. 결과는 각각 유사한 결과를 나타낸 3 번의 실험 중 1 번에 대한 것이다.
도 7: PBS, 비처리 및 DNase I 처리 청어 정충-DNA 및 M. phlei-DNA 및 hIL-12에 의한 인간 백혈병 THP-1 단핵구에서의 DNA 단편화 유도. 결과는 각각 유사한 결과를 나타낸 3 번의 실험 중 1 번에 대한 것이다.
도 8: MCC 및 hIL-12에 의한 HT-1197 (8a) 및 HT-1376 (8b) 인간 방광암 세포에서의 DNA 단편화 유도. 결과는 각각 유사한 결과를 나타낸 3 번의 실험 중 1 번에 대한 것이다.
도 9: MCC, M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 청어 정충-DNA에 의한 인간 백혈병 THP-1 단핵구로부터 NuMA 방출. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 10: 비처리 및 DNase I 처리 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC에 의한 인간 백혈병 THP-1 단핵구로부터 NuMA 방출. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 11: MCC 농도 증가에 따른 HT-1376 및 HT-1197 인간 방광암 세포로부터 NuMA 방출. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 12: 1 ㎍/ml MCC 또는 100 ㎍/ml MCC에 의한 48 시간에 걸친 HT-1197 (12a) 및 HT-1376 (12b) 인간 방광암 세포로부터 NuMA 방출. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 13: PBS, CH-11 항체, ZB4 항체, M. phlei-DNA, CH-11 항체 + M. phlei-DNA 및 ZB4 항체 + M. phlei-DNA와 배양된 Jurkat 세포로부터 NuMA 방출.
도 14: PBS, M. phlei-DNA, 음파처리, BstU 1 분해, 오토클레이빙 및 메틸화된 M. phlei-DNA에 의한 인간 백혈병 THP-1 단핵구로부터 NuMA 방출.
도 15: 기니 피그내 세포주 10 간암에서 MCC 및 DNase I 처리 MCC의 항암활성. 결과는 각 실험그룹에서 7 마리의 평균±SD이다.
도 16: MCC 세포독성의 지표로서 HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포로부터 % LDH 방출. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 17: HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포, 인간 THP-1 단핵구, 쥐 대식구, 쥐 RAW 264.7 단핵구 및 쥐 비장 세포에 의한 IL-6, IL-12 및 GM-CSF의 MCC 자극. 결과는 3 번의 독립적인 실험의 평균±SD이다.
도 18: 인간 THP-1 단핵구에 의한 MCC-DNA 및 MCC 유도된 IL-12 생성에 미치는 CD14 수용체에 대한 항체의 영향.
도 19: 인간 THP-1 단핵구에 의한 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC 자극된 IL-12에 미치는 사이토캘러신 D의 영향.
도 20: 쥐 대식구에 의한 IL-12 생성에 미치는 비처리 및 DNase 처리 MCC-DNA, MCC 및 RegressinR의 영향.
도 21: 쥐 RAW 264.7 단핵구에 의한 NO 생성의 MCC 자극.
도 22: 50 mg/kg MCC의 복막내 주사에 의한 CD-1 마우스에서 IL-6, IL-10, IL-12 및 GM-CSF의 자극.
도 23: 6.6 mg/kg MCC의 정맥내 주사에 의한 CD-1 마우스에서 IL-12의 자극.
도 24: 보관 6개월 동안의 MCC 안정성.
본 발명은 박테리아 디옥시리보 핵산(DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하고, 인간을 포함하여 동물의 반응성 세포에서 반응 유도에 효과적인 치료 조성물에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말해서, 본 발명은 마이코박테리아 DNA (B-DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하고, 동물의 반응성 세포에서 반응 유도에 효과적인 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 M. phlei DNA(M-DNA) 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하고, 반응성 세포의 증식 억제 및 이러한 세포에서의 아폽토시스 유도, 및 면역 시스템의 반응성 세포의 생물활성 분자 생성 자극에 효과적인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 M-DNA 조성물은 제조가 간편하고 비교적 비용이 적게 들며, 활성이 제제 간에 재현 가능하며 시간 경과에도 안정한 상태로 잔류한다. 더욱이, 수용자에 독성이 있더라도 최소이며, 수용자에서 양성 튜버쿨린 반응을 일으키지 않으며, 반복 투여시에 조차도 수용자에서 아나필락시스 반응을 거의 일으키지 않는다.
코린형 박테리아, 코린박테리움 종, 로도코커스 종, 유박테리움 종, 보데텔라 종, 에쉐리키아 종, 리스테리아 종, 노카디아 종 및 마이코박테리움 종을 포함한(이에 한정되지 않음) 다수의 박테리아 종이 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 DNA는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 포투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 칸사아시(M. kansaasii), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 백시(M. vacciae) 및 마이코박테리움 아비움(M. avium)을 포함한 마이코박테리움 종(이에 한정되지 않음)으로부터 제조된다. 가장 바람직하게는, 마이코박테리아 DNA는 마이코박테리움 종 마이코박테리아 플레이로부터 제조된다.
M-DNA의 치료 활성을 증가시키기 위한 방법에는 자극 서열을 화학적으로 보충하거나 생물공학적으로 증폭 또는 동일하거나 상이한 박테리아 종으로부터 유도된 DNA의 확인, 또는 적당한 자극 서열을 함유하는 박테리아 플라스미드 사용 또는 동일하거나 상이한 박테리아 종으로부터 유도된 DNA의 확인이 포함되며 이에 한정되지는 않는다. M-DNA의 치료 활성을 증가시키기 위한 다른 방법으로는 M-DNA를 합성 또는 생물학적 담체와 복합체를 형성시키거나 M-DNA를 조직형 또는 세포형 지정 리간드 또는 항체와 커플링시키는 것이 포함되며 이에 한정되지는 않는다.
M-DNA는 M-DNA와 이의 담체를 회합시킴으로써 제조될 수 있는 약학적으로 허용되는 제 1 담체에 제공된다. 바람직하게는, M-DNA 조성물은 M-DNA를 액상 담체, 고체상 담체, 또는 이들 모두와 균일하고 긴밀하게 회합되도록 함으로써 제조된다. 액상 담체로는 수성 담체, 비-수성 담체, 또는 둘다가 포함되며, 이에 한정되지는 않는다. 고체상 담체로는 화학 합성 담체 및 천연 담체가 포함되며 이에 한정되지는 않는다.
수성 담체로 투여하기 위해서, M-DNA는 혼합, 음파처리 및 미세유동화를 포함한(이에 한정되지는 않음) 기술에 의해 물에, 식염수에 또는 약학적으로 허용되는 완충액에 현탁된다.
비-수성 담체로 투여하기 위해서는, M-DNA를 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 인지질, 지질, 오일 및 이들의 혼합물(이에 한정되지는 않음)과 같은 중성 오일로 유화시키며, 여기에서 오일은 다불포화 및 포화 지방산의 적당한 혼합물을 함유한다. 이러한 예로는 대두 오일, 캐놀라 오일, 팜 오일, 올리브 오일 및 마이글리올이 포함되며(이에 한정되지는 않음), 여기에서 지방산은 포화되거나 불포화될 수 있다. 임의로, 하전된 지질 또는 인지질을 중성 오일에 현탁시킬 수 있다.
MCC(이에 한정되지 않음) 같은 천연 담체로 투여하기 위해서는, M-DNA를 보존하여 MCC 제조 중에 M. phlei 세포벽 상에서 복합체를 형성시킨다. MCC에서, M-DNA의 양은 온전한 M. phlei 세포내 M-DNA의 양에 비해 풍부해지며, M-DNA는 온전한 M. phlei 세포내 M-DNA의 경우보다 반응성 세포에 더욱 접근가능하다. M-DNA 사용에 대해 기술한 방법이 MCC에 대해서도 사용될 수 있음이 숙지된다.
M-DNA 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하는 M-DNA 조성물은 약학적으로 허용되는 제 2 담체로도 투여될 수 있다. M-DNA 조성물 및 약학적으로 허용되는 제 2 담체 제형은 M-DNA 조성물을 액상 담체, 고체상 담체, 또는 이들 모두와 균일하고 긴밀하게 회합시킴으로써 제조될 수 있다. 액상 담체로는 수성 담체, 비-수성 담체, 또는 이들 모두가 포함되며 이에 한정되지는 않는다. 고체상 담체로는 화학 합성 담체 및 천연 담체가 포함되며 이에 한정되지는 않는다.
M-DNA 및 M-DNA 조성물 모두 오일 에멀션, 유중수 에멀션, 또는 수중 유중수 에멀션으로서 투여될 수 있다. 더욱이, 이들은 리포솜, 부위-특이성 에멀션, 장기 체류 에멀션, 점착성 에멀션, 마이크로에멀션, 나노에멀션, 마이크로입자, 마이크로구체, 나노구체, 나노입자 및 미니펌프를 포함한(이에 한정되지 않음) 담체로, 및 M-DNA의 지속 방출을 허용하는 각종 천연 또는 합성 중합체와 투여될 수 있으며, 미니펌프 또는 중합체는 약제 전달이 요구되는 근방에 이식된다. 중합체 및 이의 사용에 대해서는 예를 들면, 문헌[참조:Brem et al., Journal of Neurosurgery 74:441-446, 1991]에 기재되어 있다. 또한, M-DNA 및 M-DNA 조성물은 반응 세포로의 M-DNA 제공에 사용된 약학적으로 허용되는 제 1 담체 또는 약학적으로 허용되는 제 2 담체와 무관한 부형제 중 어느 하나, 전부 또는 임의 배합물과 사용될 수도 있다. 이러한 부형제에는 항산화제, 완충제, 및 제균제가 포함되며 이에 한정되지 않으며, 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다.
하기 가설에 구애됨이 없이, M-DNA의 치료 효과는 반응성 세포의 아폽토시스를 일으키는 세포내 시그널링의 개시, 및 반응성 세포의 세포질 용해 및 아폽토시스를 일으키게 되는 사이토킨 및 반응성 산소 종 생성의 자극(이에 한정되지 않음)을 포함하는 것으로 추측된다. 아폽토시스 및 세포질 용해는 개별적으로 및 조합하여 항암활성 및 보조제 활성 모두를 지닌다. 즉, 본 발명의 M-DNA 조성물은 단독으로 항암제로서 사용될 수 있거나, 치료 효율을 증가시키기 위해 다른 항암제의 사용 전에, 동시에, 또는 후에 사용될 수도 있다.
M-DNA 조성물은 치료 반응 유도 유효량으로 투여된다. 투여된 M-DNA의 용량은 치료될 증상, 특정 제형, 및 수용자의 체중 및 상태 및 투여 경로에 따라 좌우된다. 바람직하게는, 투여되는 M-DNA의 양은 투여 용량당 약 0.00001 내지 약 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 투여 용량당 약 0.0001 내지 약 50 mg/kg, 가장 바람직하게는 투여 용량당 약 0.001 내지 약 10 mg/kg이다.
M-DNA가 MCC로서 투여될 경우, 바람직하게는 MCC의 DNA 함량은 약 0.001 내지 약 90 mg DNA/100 mg 건조 MCC, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 약 40 mg DNA/100 mg 건조 MCC, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 30 mg DNA/100 mg 건조 MCC이다. 또한, M. phlei 세포벽의 단백질 함량 약 2 mg/100 mg 건조 MCC 이하, 지방산 함량 약 2 mg/100 mg 건조 MCC 이하가 바람직하다.
또한, M-DNA가 MCC로서 투여될 경우, MCC의 양은 바람직하게는 투여 용량당 약 0.00001 내지 약 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 투여 용량당 약 0.001 내지 약 50 mg/kg MCC, 가장 바람직하게는 투여 용량당 약 0.001 내지 약 10 mg/kg MCC이다.
투여경로로는 경구, 국소, 피하, 근육내, 복막내, 정맥내, 피내, 포막내, 병변내, 종양내, 방광내, 질내, 안내, 직장내, 폐내, 척추내, 경피, 피하, 체강내 배치, 코 흡입, 폐 흡입, 피부 중으로의 각인 및 전기투공이 있으며 이에 한정되지는 않는다.
투여경로에 따라, 용량당 부피는 바람직하게는 약 0.001 내지 약 100 ml/투여 용량, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 약 50 ml/투여 용량, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 30 ml/투여 용량이다. M-DNA 조성물은 스케쥴 및 치료되는 암에 적절한 기간에 걸쳐서, 수용자의 상태 및 투여경로에 따라 단일 용량 처치 또는 다용량 처치로 투여될 수 있다.
M-DNA의 투여는 면역화 과정이 아니라, 암을 포함한(이에 한정되지는 않음) 질환을 예방, 치료 또는 일소하는 요법상의 치료책이다. 이러한 암으로는 편평세포 암종, 섬유육종, 육종성 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 직결장암, 직장암, 골육종, 피부 흑색종, 기저 세포 암종, 췌장암, 방광암, 난소암, 백혈병, 림프종 및 이로부터 유도된 전이가 있으며 이에 한정되지는 않는다.
MCC는 M-DNA 염기쌍 길이를 감소시키는 음파처리 및 오토클레이빙 후, 및 회문식 올리고뉴클레오타이드 서열 퓨린-퓨린-C-G-피리미딘-피리미딘의 활성을 없애는 GpC 메틸화 후에도 자체 효율을 유지한다.
더욱이, Fas 이상, p52/21 이상 및 내약성 암세포주를 포함한(이에 한정되지 않음) 각종 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 M-DNA의 예상치 못하고 놀라운 능력은 의학 분야에서 오래동안 절감해 온 달성되지 못했던 요구를 역점을 두어 다루며 인간을 포함한 동물에 대한 중요한 혜택을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하며 이에 제한되지 않는다. 본 명세서를 숙독한 후 본 발명의 취지 및/또는 첨부 청구의 범위로부터 일탈함이 없이 다양한 기타 양태, 변형, 및 등가물이 가능함이 당업자에게 자명해진다.
실시예 1
마이코박테리움 플레이로부터 MCC의 제조
마이코박테리움 플레이(균주 110)로부터 MCC를 제조한다. M. phlei는 Institut fur Experimental Biologie and Medizin(독일 보르스텔 소재)로부터 입수되며, -60 ℃에서 멸균 우유 중의 현탁액으로 보관되어 있다. M. phlei는 Petragnani 배지(Difco Labs, 미국 미시건 디트로이트 소재)에 배양되고 10 내지 20일간 Bacto AC 육즙(Difco Labs)에서 증식시킨다. 세포를 원심분리 침강에 의해 수거한다. 하기 절차에 사용된 모든 시약은 M. phlei DNA의 보존을 증진하도록 선택된다.
축축한 세포 매스 약 400 g을 약 1200 ml 용량의 오토클레이빙 블렌더에 넣는다. 세포 매스를 30 내지 60초간 고속으로 혼합한다. 혼합 후, DNase-비함유 트윈 80(Sigma Chemical Co., 미국 미주리 세인트 루이스 소재) 6 ml 및 오토클레이빙수 200 내지 400 ml를 세포 혼합물에 가한다. 전 세포 현탁액을 블렌더에서 약 10초간 저속으로 다시 혼합한다.
음파처리에 의해 세포를 붕괴시킨다. 세포가 용적의 약 50 내지 70%를 구성하는 세포 현탁액 500 ml를 1 리터 용량의 오토클레이빙 비이커에 넣고 음파처리한다. 분획화 과정 동안 음파처리물을 얼음 위의 오토클레이빙 플라스크에 보관한다. 비파괴 세포를 저속 원심분리로 제거한다. 저속 원심분리로부터의 상등액을 15℃에서 27,500 g으로 1 시간 동안 원심분리하고 이 원심분리로부터의 상등액을 버린다.
27,000 g 원심분리로부터의 침강물을 오토클레이빙 블렌더로 옮기고 오토클레이빙 탈이온수에 저속에서 혼합하여 현탁시킨다. 이 현탁액을 15℃에서 27,000 g로 1 시간 동안 다시 원심분리한 다음 상등액을 다시 버린다. 침강물을 오토클레이빙 탈이온수에 현탁시키고 350 g으로 5 분간 스피닝하여 여타 잔류하는 비파괴 세포를 침강시킨다. 상등액을 경사시키고 15℃에서 27,000 g로 1 시간 동안 원심분리하여 조 세포 벽 분획을 침강시킨다.
조 세포 벽 분획을 단백질 분해 효소로 분해하여 단백질을 제거하며, 이때 가능하면 제제 중의 DNA 양을 최적화하고 제제 중의 DNA 구조를 보존하기 위하여 DNase-비함유 시약의 사용에 주의를 기하여야 한다. 완전 세포 약 400 g으로부터 유도된 조 세포벽 분획을 고속 혼합에 의해 0.05 M DNase-비함유 트리스-HCl, pH 7.5 1 리터에 현탁시킨다. 조 세포벽 분획을 완전히 현탁시킨 후, DNase-비함유 트립신(Sigma Chemical Co.) 50 mg을 가하고 현탁액을 마그네틱 교반 바를 사용하여 35℃에서 6 시간 교반한다. 트립신 처리 뒤에, DNase-비함유 프로나제(Amersham Canada Limited, 캐나다 온타리오 오우크빌 소재) 50 mg을 트립신 처리 조 세포벽 현탁액 각각 1 리터에 가한다. 현탁액을 마그네틱 교반 바를 사용하여 35℃에서 12 내지 18 시간 교반한다.
단백질 분해 후, 조 세포벽 분획을 세제와 페놀을 사용하여 지질을 제거한다. 현탁액 각각 1 리터에, DNase-비함유 우레아(Sigma Chemical Co.) 60 g, DNase-비함유 100% 페놀 2.0 ml 또는 90% w/v 페놀(Sigma Chemical Co.) 150 ml를 가한다. 현탁액을 함유하는 플라스크를 알루미늄박으로 느슨하게 덮고 60 내지 80℃로 가온한 다음 1 시간 동안 교반한다. 현탁액을 10분간 16,000 g로 스피닝한다. 상등액 분획과 펠릿 아래의 유체를 버린다. 펠릿을 오토클레이빙 탈이온수 약 1 리터에 재현탁시켜 3회 세척하고 10분간 16,000 g에서 원심분리한다.
현탁액을 소량의 오토클레이빙수와 함께 오토클레이빙 동결건조 플라스크에 옮김으로써 세척, 단백질 제거 및 지질 제거된 MCC를 동결건조시킨다. 축축한 세포 복합체 출발물질 각각 30 g에 대해 하나의 300 ml 용량 동결건조 플라스크를 사용한다. 고체 이산화탄소로 냉각시킨 에탄올에서 플라스크를 회전시켜 MCC 현탁액을 쉘 동결시킨다. 플라스크 내용물을 동결시킨 후, 플라스크를 동결건조 장치(Virtis Co. Inc. 미국 뉴욕 가디너 소재)에 부착한 다음 동결건조시킨다. 동결건조 후, 샘플을 오토클레이빙 스크루-캡 용기에 옮긴 다음 무수 황산칼슘이 들어있는 건조기내 -20℃에서 보관한다.
달리 언급하지 않는 한, 동결건조 MCC는 오토클레이빙 탈이온수에 또는 약학적으로 허용되는 DNase-비함유 완충제, 예를 들면 식염수 및 PBS(이에 한정되지 않음)에 재현탁시키고 음파처리로 유화시킨다. 임의로, 유화된 MCC 혼합물을 1 유동-통과에 대해 15,000 내지 30,000 psi에서 마이크로 유동화에 의해 균질화한다. MCC 현탁액을 무균 조건하에서 처리하거나 오토클레이빙에 의해 멸균시킨다.
실시예 2
MCC 및 M. phlei로부터 M-DNA의 정제
MCC를 실시예 1에서와 같이 제조한다. 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출 및 에탄올 침전[참조문헌:Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons Inc., New York, USA]에 의해 MCC로부터 M-DNA를 정제한다. 예상치 못하게도, MCC 건량의 적어도 약 3.6%가 추출가능한 M-DNA임이 밝혀졌다.
M. phlei(균주 110)를 DNase-비함유 50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0 5 ml에 현탁시키고, DNase-비함유 라이소자임(Sigma Chemical Co.)을 1 mg/ml의 농도가 되게 가한 다음 37℃에서 90분간 배양함으로써 M. phlei로부터 M-DNA를 정제한다(M. phlei-DNA). DNase-비함유 프로테이나제 K(Life Technologies, 캐나다 온타리오 벌링턴 소재)를 0.1 mg/ml의 농도가 되도록 가하고, DNase-비함유 나트륨 도데실 설페이트(BioRad, 미국 캘리포니아 리치먼드 소재)를 1% 농도가 되도록 가한 다음 65℃에서 10분간 배양을 계속한다. M-DNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출한 다음 에탄올 침전시킨다.
달리 언급하지 않는 한, M-DNA는 오토클레이빙 탈이온수에 또는 DNase-비함유 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 식염수 및 PBS(이에 한정되지 않음)에서 음파처리된다. MCC, MCC-DNA 및 M. phlei-DNA는 Limulus 아메바양세포 용해물 QCL-100 키트(BioWhittaker, 미국 메릴랜드 워커스빌 소재)를 사용하여 측정하였을 때 내독소를 함유하지 않는다.
실시예 3
박테리아-DNA-박테리아 세포벽 복합체 및 기타 박테리아 종으로부터의 박테리아 DNA의 제조
박테리아 DNA-박테리아 세포벽 복합체를 실시예 1에서와 같이 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 포투이터스, 노카디아 루브라, 노카디아 애스터로이즈, 코린박테리움 파붐, 마이코박테리움 칸사아시, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 및 마이코박테리움 보비스로부터 제조한다. 실시예 2에서와 같이 박테리아 DNA-박테리아 세포벽 복합체 및 온전한 박테리아로부터 박테리아 DNA를 정제한다.
실시예 4
DNase 처리
각각 M-DNA 1 ㎍를 함유하는 MCC-DNA, M. phlei-DNA 및 MCC, 및 RegressinR(미국 특허 제4,744,9840)를 20 mM 트리스 HCl, pH 8.4, 2 mM MgCl2 및 50 mM KCl 중 25℃에서 1 시간 동안 RNase-비함유-DNase I(Life Technologies) 1 국제단위(IU)로 분해한다. EDTA를 최종 농도 2.5 mM이 되도록 가하고 65℃에서 10분간 가열하여 DNase I를 불활성화시킨다. DNase I은 일본쇄 및 이본쇄 DNA를 분해한다. DNase I에 의해 분해하면 DNA가 거의 완전히 분해된다. RegressinR(Bioniche, Inc. 캐나다 온타리오 런던 소재)은 1 mg 마이코박테리아 세포벽 추출물, 1 ml PBS 중의 20 ㎕ 미네럴 오일 NF 및 트윈 80 0.5% v/v를 함유하는 제형이다.
실시예 5
MCC-DNA와 M. phlei-DNA의 비교
MCC-DNA와 M. phlei-DNA를 당업자에 공지된 절차를 이용하여 5% 아가로스 겔(3 시간: 100 V)에서 전기영동한다. DNA 분자량 분포를 1D 메인 프로그램 소프트웨어(Advance American Biotechnology, 미국 캘리포니아 풀러튼 소재)를 사용하여 겔 포토 스캐닝에 의해 분석한다.
도 1에 도시된 바와 같이, M. phlei-DNA는 약 5 내지 약 10,000 염기쌍(bp)의 광범위 올리고뉴클레오타이드, 및 게놈 DNA(＞12,000 bp)를 함유한다. MCC-DNA는 약 5 내지 약 250 염기쌍 범위의 올리고뉴클레오타이드, 약 40 염기쌍에서의 주된 피크, 및 작은 게놈 DNA를 함유한다.
실시예 6
세포 및 시약
OC2 및 SW260을 제외한, 모든 세포주는 어메리칸 타입 컬춰 컬렉션(ATCC, 미국 메릴랜드 로크빌 소재)으로부터 입수되며 ATCC에 의해 권장된 배지에서 배양된다. OC2 및 SW260은 J.K. Collins 박사(University College Cork, 아일랜드 코크 소재)로부터 입수하며 10% PCS로 보충한 DMEM 배지에 배양한다. 표 1은 세포주, 이의 기원 및 이의 성질을 보여준다.
| 세포주 | 기원 | 성질 |
| THP-1 | 인간 급성 단핵구성 백혈병 | |
| HL-60 | 인간 전골수구성 백혈병 | |
| HL-60 MX-1 | 인간 전골수구성 백혈병 | 믹소산트론에 대한 비정형적인 내약성 |
| RAW 264.7 | 쥐 단핵구성 백혈병 | |
| JURKAT | 인간 T 림프아구 | |
| HT-1376 | 인간 방광암 | p53/p21 MDR에서의 돌연변이 |
| HT-1197 | 인간 방광암 | |
| B-16-F1 | 쥐의 흑색종 | |
| SW260 | 인간 대장선종 | FAS-L 내성 |
| OC2 | 인간 식도암 | |
| LS1034 | 인간 맹장암 | 통상적인 MDR |
1.5 ml의 멸균 브루어스 Brewer's 티오글리콜레이트 육즙(Difco, 미국 미시건 디트로이트 소재)을 복막내 주사한 CD1 마우스 암컷으로부터 쥐의 대식구를 수득한다. 복막 삼출물(＞85% 대식구)을 4 시간째에 수거하여 HBSS에서 원심분리로 세척한 다음 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 20 mM HEPES(Life Technologies)로 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양한다. 세포를 18 시간 동안 부착되도록 하고 그 후 비-부착 세포를 따뜻한 배지로 부드럽게 세척하여 제거한다.
쥐의 비장 세포를 멸균 스테인레스강 스크린을 통해 부드러운 티징(잘게 자름)에 의해 제조한다. 세포 상등액을 Lympholyte-M 세포 분리 배지(CedarLane, 캐나다 온타리오 혼비 소재)에 층으로 깐 다음 2200 rpm으로 30분간 원심분리하여 적혈구와 사멸 세포를 제거한다. 이들 세포를 10% FCS, 2mM l-글루타민 및 20 mM HEPES(Life Technologies)로 보충한 RPMI-1640 배지에 배양한다.
달리 언급하지 않는 한, 세포를 6웰 평저 조직 배양판에 3 X 105 내지 106 세포/ml의 농도로 시딩하고 5% CO2 대기 중 37℃에서 유지한다.
송아지 흉선-DNA, 청어 정충-DNA 및 이.콜라이 리포폴리사카라이드(LPS)를 Sigma Chemical Co.로부터 입수한다. 재조합 인간 IL-12(hIL-12)를 R&D Systems(미국 미네소타 미네아폴리스 소재)로부터 입수한다.
실시예 7
세포증식의 억제
디메틸티아졸-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 환원법[참조문헌:Mosman et al., Journal of Immunological Methods 65:55-63, 1983]을 이용하여 세포 증식을 측정한다. 간단히, PBS에 5 mg/ml로 용해시킨 MTT(Sigma-Aldrich) 100 ㎕를 플레이트의 웰에 가한다. 4 시간 후, 산-이소프로판올, 즉 이소프로판올 중의 0.04 N HCl 1 ml를 가하고 환원된 MTT를 파장 570 nm에서 측정한다.
HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 및 HL-60 MX-1 세포를 M. phlei-DNA, MCC-DNA, 청어 정충-DNA 및 송아지 흉선-DNA 0 내지 10 ㎍/ml과 24 시간 배양한다. M. phlei-DNA(도 2a) 및 MCC-DNA(도 2b)는 시험된 암세포주 각각에서 용량 의존식으로 증식을 억제한 반면에, 청어 정충-DNA(도 2a & 2b) 및 송아지 흉선-DNA(도 2a 및 2b)는 시험된 세포주의 증식을 억제하지 않았다.
HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 및 HL-60 MX-1 세포를 MCC 0 내지 10 ㎍/ml과 24 시간 배양한다. MCC는 시험된 암세포주 각각에서 용량 의존식으로 증식을 억제하였다 (도 3).
인간 백혈병 THP-1 단핵구를 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 hIL-12 0 내지 10 ㎍/ml과 24 시간 배양한다. M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC는 용량 의존식으로 증식을 억제하였다. hIL-12는 증식을 억제하지 않았다(도 4).
HT-1197(도 5a) 및 HT-1376(도 5b) 인간 방광암 세포를 MCC 및 LPS 0 내지 100 ㎍/ml과 20 시간 배양한다. MCC는 증식을 억제하였다. LPS는 증식을 억제하지 않았다.
M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC(여기에서, 약학적으로 허용되는 제 1 담체는 M. phlei 세포벽이다)는 시험된 각 암세포의 증식을 억제한다. 이와 대조적으로, 일부 암세포주에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고된 비특이성 면역자극제인 LPS[참조문헌:Izquierdo et al., Anticancer Drugs 7:275-2801996]; 일부 암세포주에서 아폽토시를 유도하는 것으로 보고된 사이토킨인 hIL-12[참조문헌:Stine et al., Annals NY Academy of Science 795:420-421, 1996] 및 송아지 흉선 및 청어 정충으로부터의 DNA는 시험된 암세포 어느 것의 증식도 억제하지 않는다. 이러한 데이터는 M-DNA가 시험된 암세포주에서의 증식 억제에 원인이 되며 다른 DNA(청어 정충 DNA 및 송아지 흉선 DNA)는 M-DNA를 대신할 수 없음을 보여준다. 이러한 데이터는 또한, 세포 증식의 M-DNA 억제가 비특이성 면역자극(LPS) 또는 사이토킨 활성(hIL-12)으로부터 생기는 것이 아님을 보여준다. 더욱이, 그 중에서도 억제된 암세포는 p53/p21 이상 및 내약성 HT-1376 인간 방광암 세포 및 비정형적인 내약성 HL-60 MX-1 인간 전골수구성 백혈병 세포이다.
실시예 8
DNA 단편화에 의해 표시되는 아폽토시스의 유도
세포 DNA의 뉴클레오좀-크기 단편으로의 단편화는 아폽토시스를 겪는 세포의 특징이다. 뉴클레오좀-크기 단편은 아가로스 겔 전기영동으로 측정하여 약 200 염기쌍의 차이를 보유하는 DNA 단편이다[참조문헌:Newell et al., Nature 357:286-289, 1990]. DNA 단편화를 평가하기 위하여, 200 g에서 10 분간의 원심분리로 비흡착 세포를 수거해낸다. 비흡착 세포 및 잔류 흡착 세포의 펠릿을 저장성 용해 완충액(10 mM 트리스 완충제, 1 mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100, pH 7.5) 0.5 ml로 용해시킨다. 용해물을 13,000 g에서 10분간 원심분리하고 단편화된 DNA를 함유하는 상등액을 50% 이소프로판올 및 0.5 M NaCl 중 -20℃에서 철야 침전시킨다. 침전물을 원심분리로 수거하여 0.7 % 아가로스 겔 중 전기영동에 의해 100 V에서 3 시간 분석한다.
인간 백혈병 THP-1 단핵구의 현탁 배양액을 PBS와 및 비처리 또는 DNase I 처리 M. phlei-DNA 및 MCC 1 ㎍/ml와 및 비처리 청어-정충-DNA와 48 시간 배양한다(도 6). M. phlei-DNA(레인 2) 및 MCC(레인 4)는 상당한 DNA 단편화를 유도하는 반면에, PBS(레인 1), DNase I 처리 M. phlei-DNA(레인 3), DNase I 처리 MCC(레인 5) 및 청어 정충-DNA(레인 6)는 DNA 단편화를 유도하지 않았다. 123-bp DNA 래더(Life Technologies)를 사용하여 뉴클레오좀-크기 DNA 단편의 분자량을 측정한다(레인 L).
THP-1 단핵구의 현탁 배양액을 PBS와 및 비처리 또는 DNase I 처리 M. phlei-DNA 및 청어-정충-DNA 1 ㎍/ml와 및 hIL-12와 48 시간 배양한다(도 7). M. phlei-DNA는 상당한 DNA 단편화를 유도하는 반면에(도5), DNase I 처리 M. phlei-DNA(레인 4), 청어 정충-DNA(레인 3), DNase I 처리 청어 정충-DNA(레인 2), hIL-12(레인 1) 및 PBS(레인 6)는 DNA 단편화를 유도하지 않았다. 123-bp DNA 래더(Life Technologies)를 사용하여 뉴클레오좀-크기 DNA 단편의 분자량을 측정한다(레인 L).
HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포를 1 ㎍/ml MCC와 또는 hIL-12와 48 시간 배양한다(도 8). MCC는 비흡착 HT-1197(도 8a, 레인 2) 및 HT-1376(도 8b, 레인 2) 세포에서 상당한 DNA 단편화를 유도하였지만, 흡착 HT-1197(도 8a, 레인 3) 및 HT-1376(도 8b, 레인 3) 세포에서는 유도하지 않았다. PBS(도 8a & 8b, 레인 5), hIL-12(도 8a & 8b, 레인 4), DNase I-처리 MCC(도 8a & 8b, 레인 7) 및 비처리 세포(도 8a & 8b, 레인 1)는 비흡착 HT-1197 또는 HT-1376 세포에서 DNA 단편화를 유도하지 않았다. 123-bp DNA 래더(Life Technologies)를 사용하여 뉴클레오좀-크기 DNA 단편의 분자량을 측정한다(도 8a & 8b, 레인 L).
M. phlei-DNA 및 MCC(여기에서, M-DNA는 보존되고 M. phlei 세포벽 상에서 복합체를 형성함)는 인간 백혈병 THP-1 단핵구에서 및 HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 반면에, 청어 정충-DNA, hIL-12, 및 DNase I 처리 M. phlei DNA 및 MCC는 이들 세포에서 아폽토시스를 유도하지 않는다. 이러한 데이터는 M-DNA가 시험된 암세포주에서 아폽토시스의 유도에 원인이 되고, M-DNA의 올리고뉴크레오타이드는 온전하여야 하며(DNase I 처리) 다른 DNA(청어 정충-DNA)는 M-DNA를 대치할 수 없음을 보여준다. 이러한 데이터는 또한, 아폽토시스의 M-DNA 유도가 비특이성 면역자극(LPS)에서 연유하는 것이 아님을 보여준다.
실시예 9
핵 유사분열 단백질 장치(NuMA)의 가용화에 의해 표시되는 아폽토시스의 유도
가용화에 의해 초래된 세포핵의 현저한 형태학적 변화 및 NuMA의 방출은 아폽토시스의 특징이다. NuMA의 가용화 및 방출을 측정하기 위하여, 배양세포로부터의 배지를 제거하여 200 g에서 10분간 원심분리한다. 상등액을 수집하여 각 상등액 100 ㎕를, 상업적인 ELISA(Calbiochem, 미국 매사추세츠 케임브리지 소재)[참조문헌:Miller et al., Biotechniques 15:1042-1047, 1993]를 이용하는 NuMA 방출(단위/ml, U/ml)의 정량에 사용한다.
인간 백혈병 THP-1 단핵구를 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 청어 정충-DNA 0 내지 10 ㎍/ml와 48 시간 배양한다. M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC는 NuMA의 방출을 용량 의존식으로 유도한 반면, 청어 정충-DNA는 NuMA의 방출을 유도하지 않았다(도 9). M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC의 DNase I 처리는 이들 세포로부터 NuMA 방출의 유도를 상당히 억제하였다(도 10).
HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포를 MCC 0 내지 100 ㎍/ml와 배양한다. MCC는 NuMA의 방출을 용량 의존식으로(도 11) 및 시간 의존식으로(도 12a & 12b) 유도하였다. NuMA의 증진된 방출은 MCC 100 ㎍/ml과 HT-1197 세포와(도 12a) 및 HT-1376(도 12b) 세포와의 배양 후 24 시간내 검출된다.
각각 M-DNA를 함유하는 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC는 아폽토시스 암세포를 유도한다. MCC(여기에서, 약학적으로 허용되는 제 1 담체는 M. phlei 세포벽이다)는 M. phlei-DNA 또는 MCC-DNA보다 더 아폽토시스를 유도한다. 이러한 사실은 M-DNA를 반응성 세포에 제공하는 담체가 아폽토시스의 M-DNA 유도를 실행함을 암시한다.
실시예 10
M. phlei-DNA에 의한 Jurkat 인간 T 림프아구에서 아폽토시스의 Fas 의존형 유도
Jurkat 인간 T 림프아구를 PBS와, 1 ㎍/ml CH-11 항체, 즉 Fas와 결합하고 아폽토시스를 유도하는 항체(+ 대조군)(Coulter-Immunotech, 미국 플로리다 하이알레 소재)와 또는 1 ㎍/ml ZB4 항체, 즉 Fas와 결합하고 아폽토시스를 억제하는 항체(- 대조군)(Coulter-Immunotech)와 1 시간 배양한다. M. phlei-DNA 1 ㎍/ml를 가하고 NuMA 방출을 48 시간 후 측정한다.
도 13에 나타낸 바와 같이, M. phlei-DNA는 ZB4의 존재 및 부재하 모두에서 아폽토시스를 유도하였다. 이러한 데이터는 M. phlei-DNA에 의한 아폽토시스 유도가 Fas와 독립적임을 입증한다.
실시예 11
세포 증식 및 아폽토시스에 미치는 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC의 영향의 요약
표 2는 인간 및 쥐의 암세포주에서 DNA 단편화, NuMA 방출 및 유동 혈구계산 분석으로 측정한 암세포에서의 증식 억제 및 아폽토시스 유도에 미치는 M. phlei-DNA 및 MCC의 영향을 요약한다.
| 세포 | 증식억제 | 뉴클레오좀- 크기 DNA | NuMA 방출 | 유동 혈구계산분석 |
| THP-1 | 있음 | 있음 | 있음 | ND* |
| HL-60 | 있음 | 있음 | 있음 | ND |
| HO-60 MX-1 | 있음 | 있음 | 있음 | ND |
| RAW 264.7 | 있음 | 있음 | 있음 | ND |
| JURKAT | 있음 | 있음 | 있음 | ND |
| HT-1376 | 있음 | 있음 | 있음 | ND |
| HT-1197 | 있음 | 있음 | 있음 | ND |
| B-16-FI | 있음 | 있음 | ND | ND |
| SW260 | ND | ND | ND | 있음 |
| OC2 | ND | ND | ND | 있음 |
| LS1Q34 | 있음 | ND | 있음 | ND |
| *ND = 비실행 | ||||
M. pHlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC(여기에서, 약학적으로 허용되는 제 1 담체는 M. phlei 세포벽이고 M-DNA는 세포벽상에서 복합체를 형성한다)는 시험된 암세포주 각각에서 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도한다. 이들 세포주는 비정형적 내약성 HL-60 MX-1 인간 전골수구성 백혈병, p53/p21 이상 및 내약성 HT-1376 인간 방광, Fas 이상 SW260 인간 결장, 및 통상적인 내약성 LS1034 인간 맹장암 세포를 포함한다.
실시예 12
인간 백혈병 THP-1 단핵구에서 카스파제-3의 MCC 활성화
카스파제-3는 Fas-FasL 시그널링의 다운스트림에 있는 아폽토시스 경로에서의 주 효소이다. MCC가 Fas를 바이패스하고 암세포에서 카스파제 캐스케이드를 직접 활성화할 수 있는 지를 측정하기 위하여, 카스파제-3 활성에 대한 MCC의 영향을 인간 백혈병 THP-1 단핵구에서 분석한다.
THP-1 단핵구(2 X 107 세포)를 MCC(100 ㎍/ml)와 48 시간 배양한다. THP-1 세포를 50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, 1 mM EDTA 및 10% 글리세롤에 용해시킨다. 포함된 기질, 억제제 및 정제된 카스파제-3 효소를 사용하여, 상업적인 ELISA(BIOMOL Research Laboratories, Inc. 미국 펜실베이니아 플리머스 미팅 소재)로 카스파제-3 활성을 측정한다. 결과를 405 nm에서 광학밀도로 표현하였다.
| 배양 | p-니트로아날라이드 흡광도, 405 nm | |
| O.D. x 10-1, 3 시간 배양 | O.D. x 10-1, 6 시간 배양 | |
| THP-1 단독 | 0.19 | 0.06 |
| THP-1 + MCC 세포 추출물 | 0.44 | 0.20 |
| DNase 세포 추출물 처리 THP-1 + MCC | 0.12 | 0.11 |
| 정제된 카스파제-3 | 0.87 | 0.58 |
| 정제된 카스파제-3 + 카스파제-3 억제제 | 0.00 | 0.00 |
| THP-1 + MCC 세포 추출물 + 카스파제-3 억제제 | 0.00 | 0.00 |
표 3에 나타낸 바와 같이, MCC와의 배양으로 인간 THP-1 단핵구에서 카스파제-3 및 카스파제-3 유사 활성이 232%(3 시간) 및 333%(6 시간) 증가하였다. 카스파제-3 및 카스파제-3 유사 활성의 MCC 유도는 MCC의 DNase I 처리에 의해 제거되었다. 카스파제-3 및 카스파제-3 유사 활성의 MCC 유도의 특이성은 카스파제-3 억제제를 사용하여 입증된다. 카스파제-3 억제제를 MCC-처리 THP-1 세포 추출물에 첨가하면 측정가능한 활성이 완전히 제거된다. 인간 백혈병 THP-1 단핵구에서 카스파제-3 및 카스파제-3 유사 활성을 특이적이고 직접 유도하는 MCC의 능력이 전혀 예상되지 않는다. 카스파제-3 및 카스파제-3 유사 활성을 특이적으로 자극하기 위해서, MCC는 하나 이상의 메커니즘에 의해 세포로 유입되어야 하고, 아폽토시스 실행의 치사성 단백질 분해 캐스케이드를 개시하여야 한다.
실시예 13
인간 백혈병 THP-1 단핵구에서 MCC 유도된 아폽토시스에 미치는 태목시펜의 영향
인간 백혈병 THP-1 단핵구를 대조군 배지 또는 10 ㎍/ml 태목시펜(Sigma-Aldrich), 즉 발전된 유방암의 완화적인 치료에 사용되는 항-에스트로겐을 함유하는 배지에서 90분간 배양한다. 세포를 빙냉 배지로 철저히 세척하고(2회), 배지에 약 106 세포/ml로 재현탁시킨 다음 MCC 0, 1, 10 및 100 ㎍/ml과 48 시간 배양한다. NuMA를 측정하여 아폽토시스를 정량한다.
| +MCC 1㎍/ml | +MCC 10㎍/ml | +MCC 100 ㎍/ml | +배지 단독 | |
| 대조군 | 174.6 | 260.0 | 237.2 | 174.6 |
| 태목시펜(10 ㎍/ml) | 354.9 (↑50.8%) | 406.2 (↑36.0%) | 410.0 (↑42.1%) | 284.7 |
표 4에 나타낸 바와 같이, 태목시펜에서의 예비배양은 사용된 각각의 MCC 농도에서 MCC 유도된 아폽토시스를 상당히 증가시켰다. 이러한 데이터는 MCC(여기에서, M-DNA는 M. phlei 세포벽 상에서 복합체를 형성한다)가 치료 효율을 증가시키기 위해 다른 항암제에 대한 보조제로서 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 14
메틸화, 음파처리 및 오토클레이빙에 의한 M. phlei-DNA의 변형
바실러스 Calmette-Guerin(BCG)로부터의 핵산 제제는 암의 증식을 억제한다(미국 특허 제4,579,941호; Tokunaga et al., Microbiology and Immunology 36:55-666, 1992]. BCG 핵산내 활성 성분은 회문성 올리고뉴클레오타이드 서열 퓨린-퓨린-C-G-피리미딘-피리미딘(CG 모티프)으로서 확인된다. CpG 메틸라제에 의한 사이토신 메틸화는 이러한 DNA의 활성을 제거한다[참조문헌:Krieg et al., Nature 374:546-549, 1995]. 따라서, M. phlei-DNA의 아폽토시스 유도능에 미치는 CpG 메틸화의 영향을 측정한다.
M. phlei-DNA 1 ㎍을 10 mM 트리스-HCl, pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1mM DTT 및 160 μM S-아데노실메티오닌 중, 37℃에서 1 시간 동안 CpG Sss I 메틸라제(New England Biolabs, 캐나다 온타리오 미시소가 소재) 2.5 U를 사용하여 메틸화한다. 천연 및 메틸화 M. phlei-DNA를 50 mM NaCl, 10 mM 트리스 HCl, 10 mM MgCl2 및 1 mM DTT, pH 7.9 중 60℃에서 1 시간 동안 BstU I 제한 엔도뉴클레아제(New England Biolabs)로 절단한다. 0.5% 아가로스 겔 중 100 V에서 3 시간 동안의 전기영동 분석은 천연 M. phlei-DNA가 BstU I 제한 엔도뉴클레아제에 의해 분해되는 반면에, 메틸화된 M. phlei-DNA는 BstU I 제한 엔도뉴클레아제에 의해 분해되지 않았음을 보여준다. 이러한 사실은 M. phlei-DNA의 메틸화가 완전함을 확인시켜 준다.
도 14에 나타난 바와 같이, 메틸화는 인간 백혈병 THP-1 단핵구로부터의 M. phlei 유도된 NuMA 방출을 변성시키지 않았다. 이러한 데이터는 BCG와 달리, CG-모티프가 M. phlei-DNA에 의한 아폽토시스 유도에 필수가 아님을 입증한다.
M. phlei-DNA(1 ㎍)의 염기쌍 길이는 모델 W-38 울트라소닉 프로세서(Heat Systems-Ultrasonics, Inc.)에서 15초간 또는 얼음위에서 20분간 음파처리에 의해, BstU I 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해, 또는 121℃에서 30분간 오토클레이빙에 의해(Castle Sybron MDT, 미국 아이오와 두부큐) 감소시킨다. 도 14에 도시된 바와 같이, 음파처리, BstU I 분해 및 오토클레이빙(이들 각각은 염기쌍 길이를 약 5 내지 약 250 염기쌍 범위로 감소시킨다)은 THP-1 단핵구로부터 NuMA 방출의 M. phlei-DNA 유도에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 M. phlei-DNA가 암세포에서, 심지어 짧은 올리고뉴클레오타이드 길이(약 5 내지 약 250 염기쌍)에서도 아폽토시스를 유도함을 입증한다.
인간 백혈병 THP-1 단핵구를 비처리 M. phlei-DNA 및 MCC와 및 121℃에서 30분간 오토크레이빙한 M. phlei-DNA 및 MCC와 배양한다. DNA의 염기쌍 길이를 감소시키는 오토클레이빙은 이들 세포에서 M. phlei-DNA 또는 MCC의 증식 억제능(표 5a) 또는 아폽토시스 유도능(표 5b)에 영향을 미치지 않았다.
| 비-오토클레이빙 % 억제 | 오토클레이빙 % 억제 | |
| MCC 1 ㎍/ml | 87±4 | 84±10 |
| MCC 10 ㎍/ml | 68±1 | 74±6 |
| MCC 100 ㎍/ml | 59±7 | 64±6 |
| M. phlei-DNA 1 ㎍/ml | 88±8 | 84±11 |
| M. phlei-DNA 10 ㎍/ml | 80±8 | 74±6 |
| M. phlei-DNA 100 ㎍/ml | 68±4 | 64±5 |
| 비-오토클레이빙 | 오토클레이빙 | |
| MCC 1 ㎍/ml | 298.0 | 277.1 |
| MCC 10 ㎍/ml | 325.9 | 322.4 |
| MCC 100 ㎍/ml | 339.9 | 357.3 |
| M. phlei-DNA* 100 ㎍/ml | 261.4 | 268.4 |
| M. phlei-DNA 10 ㎍/ml | 317.2 | 278.4 |
| M. phlei-DNA 1 ㎍/ml | 306.8 | 285.8 |
실시예 15
MCC에 의한 시험관내 암 증식 억제
MCC 및 DNase I 처리 MCC를 4℃에서 5 분간 음파처리에 의해(Heat Systems-Ultrasonics, Inc.) 2% w/v 미네럴 오일 및 0.02% w/v 트윈 80(Fisher Chemical Co.)을 함유하는 PBS 중 최종 농도 1 mg/l가 되도록 유화시킨다.
계통-2-기니 피그에 대해 동유전자형인 라인 10 간암세포를 신속히 해동시켜 원심분리 세척하고 M199 배지에 재현탁시켜 106 세포/ml의 농도가 되게 한다. 1.5 X 106 세포를 함유하는 1/10 ml를 생후 3개월된 계통 2 기니 피그의 옆구리에 피하
주사한다. 암이 약 0.5 내지 약 0.8 cm 직경이 되었을 때 주사한지 6 내지 7일 후 처리를 개시한다. 7 마리는 유화 완충액만으로(대조군), 7 마리는 MCC를 함유하는 유화 완충액으로, 및 7 마리는 DNase I 처리 MCC를 함유하는 유화 완충액으로 처리한다. 에멀션은 암 및 주변 정상 조직에 직접 주입시킨다. MCC 또는 DNase I 처리 MCC 1 mg를 함유하는 총량 1 ml에 대해 0 시간 및 6 시간에서 에멀션 0.5 ml를 투여한다.
암의 직경(최대 직경 + 최소 직경)을 3주 동안 매주 기록한다. 암의 크기를 0.5 x a(최대 직경) x b2(최소 직경)으로서 mm3으로 계산해내고 처리일 0에 대한 암 크기의 증가를 각각의 기니 피그에 대해 계산해낸다. 동일 반복으로 2-웨이 ANOVA(PHARM/PCS 버전 4.2, MCS, 미국 펜실베이니아 필라델피아 소재)를 이용하여 통계적 분석을 수행한다. 처리 차이는 p≤0.05에서 유의성이 있는 것으로 생각된다.
도 15에 나타난 바와 같이, 대조군 에멀션으로는 암의 크기가 3주째까지 약 22배 정도 증가한 반면에, MCC로는 암 증식이 대조군 에멀션에 비해 현격히 억제되었다(도 15, 표 6). DNase I 처리 MCC로는 암 증식이 대조군과 유의할 만하게 상이하지는 않았다(도 15, 표 6).
| 처리 비교 | p 값 |
| 대조군 대 MCC | p＜0.01 |
| 대조군 대 MCC+DNase | 유의성 없음 |
| MCC 대 MCC+DNase | p＜0.01 |
이들 데이터는 종양 부위에서 MCC의 점적이 종양 퇴행을 가져옴을 보여준다. 더욱이, MCC와 DNase I 처리 MCC 간의 암 증식 억제에 있어 유의(p＜0.01)차는 비분해 M-DNA가 생체내 MCC의 항암활성에 필수임을 보여준다.
실시예 16
MCC 세포독성
세포의 세포독성은 원형질막 보존성의 상실 및 LDH(이에 한정되지 않음)[참조문헌:Wyllie et al., International Review of Cytology 68:251-306, 1980; Phillips et al., Vaccine, 14:898-904, 1996]와 같은 세포질 효소의 방출을 특징으로 한다. 인간 방광암 세포는 세포 독성제로 처리하였을 때 LDH를 방출한다[참조문헌:Rahman M. Urology International 53:12-17, 1994].
MCC의 세포독성을 평가하기 위하여, HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포를 MCC 0 내지 100 ㎍/ml와 또는 전체 LDH 방출에 대한 대조군으로 용해 완충액(10 mM 트리스, 1mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100, pH 7.5)[참조문헌:Filion et al., Biochim Biophys Acta 1329:345-356, 1997]과 48 시간 배양한다. 상업적 분석(Sigma-Aldrich)을 이용하여 배양 상등액 중으로의 LDH 방출을 측정한다.
LDH 방출에 의해 측정된 바와 같이, MCC는 HT-1197 또는 HT-1376 세포에 대해 세포독성이 아니었다(도 17). 세포독성의 부재는 MCC가 암세포에서 증식 억제 및 아폽토시스 유도에 직접 작용함을 입증한다.
실시예 17
시험관내에서 사이토킨 합성의 자극
IL-12는 일부 암세포에서 항암활성이 있는 것으로 보고되어 있으며[참조문헌:Voest et al., Journal National Cancer Institue 87:581-596, 1995:Stine et al., Annals NY Academy of Science 795:420-421, 1996], 반면에 GM-CSF는 일부 암세포에서 프로-암활성이 있는 것으로 보고되어 있다[참조문헌:Hawkyard et al., Journal of Urology 150:514-518, 1993]. 더욱이, 일부 암세포는 사이토킨을 분비하는 것으로 보고되어 있다[참조문헌:De Reijke et al., Urology Research 21:349-352, 1993; Bevers et al., British Journal of Urology 80:30-39, 1997]. 따라서, HT-1197 및 HT-1376 인간 방광암 세포에 의한 및 인간 THP-1 단핵구, 쥐 대식구, 쥐 RAW 264.7 단핵구, 및 쥐 비장 세포에 의한 IL-6, IL-12 및 GM-CSF 합성에 미치는 MCC의 영향을 측정한다.
사이토킨 생성은 적당한 상업적 ELISA(BioSource, 미국 캘리포니아 캐머릴로 소재)를 이용하여 배양 상등액 100 ㎕ 중의 pg/ml로 측정한다. IL-12 ELISA는 IL-12 p70 복합체 및 유리 p40 아단위 모두 측정한다.
HT-1197 및 HT-1376, THP-1, 대식구, RAW 264.7, 및 쥐 비장 세포를 1 ㎍/ml
MCC와 48 시간 배양한다. 도 1에 도시된 바와 같이, MCC는 인간 단핵구 및 쥐 대식구에 의한 IL-6 및 IL-12의 생성을 자극하였지만 인간 방광암 세포, 쥐 단핵구 또는 비장 세포에 의한 생성은 자극하지 않았다. MCC는 시험된 어떠한 암세포에서도 GM-CSF 생성을 촉진하지 않았다.
이들 데이터는 MCC(여기에서, M. phlei 세포벽은 약학적으로 허용되는 제 1 담체이다)가 인간 단핵구 및 쥐 대식구에 의한 항암 사이토킨 IL-6 및 IL-12의 생성을 자극함을 보여준다. MCC는 인간 방광암 세포에 의한 사이토킨 생성을 자극하지 않는다. MCC는 프로-암 사이토킨 GB-CSF의 생성을 자극하지 않는다.
실시예 18
인간 THP-1 단핵구에 의한 IL-12 생성에 미치는 비처리 및 DNase I 처리 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 Regressin
R
의 영향
인간 THP-1 단핵구를 DNase I 처리 전, DNase I 처리 후, 및 M-DNA의 DNase I 처리 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC로의 첨가 후, M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 RegressinR과 48 시간 배양한다.
| 처리 | IL-12 생성, pg/ml 배양 상등액 | |||
| M. phlei-DNA 1 ㎍/ml | MCC-DNA 1 ㎍/ml | MCC 1 ㎍/ml | RegressinR 1 ㎍/ml | |
| 없음 | 407 | 676 | 1222 | 196 |
| DNase | 178 | 367 | 729 | 200 |
| DNase +1 ㎍ DNA | 424 | 658 | 783 | 비실행 |
도 7에 나타난 바와 같이, M. pheli-DNA, MCC-DNA 및 MCC 각각은 IL-12를 생성하도록 THP-1 단핵구를 자극하였다. MCC는 M. phlei-DNA 또는 MCC-DNA보다 더 IL-12 생성을 자극하였다. RegressinR은 최소의 IL-12 생성을 자극하였다. DNase I 처리는 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC 자극된 IL-12 생성을 약 50%까지 감소시켰다. RegressinR은 DNase I 처리에 영향을 받지 않았다. M. phlei-DNA의 DNase I-처리 M. phlei로의 첨가 및 MCC-DNA의 DNase I 처리 MCC-DNA로의 첨가는 IL-12 생성의 자극을 복구하였다. MCC-DNA의 DNase I-처리 MCC로의 첨가는 IL-12 생성의 자극을 복구하지 않았다.
MCC(여기에서, M. phlei 세포벽은 약학적으로 허용되는 제 1 담체이다)가 M. phlei-DNA 또는 MCC-DNA보다 더 IL-12 생성을 자극한다는 점은 반응성 세포에 M-DNA의 제공에 사용된 담체가 M-DNA 자극된 IL-12에 영향을 미침을 암시한다. M-DNA를 분해하는 DNase I 처리가 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC 자극된 IL-12 생성을 현저히 감소시킨다는 점은 M-DNA의 올리고뉴클레오타이드 형태가 IL-12 생성의 최적 자극을 위해 보존되어야 함을 암시한다. M-DNA의 DNase I 처리 MCC로의 첨가가 IL-12 생성의 자극을 복구하지 않는다는 점은 M-DNA가 MCC내 M. phlei 세포벽 상에서 복합체를 형성하는 방식이 인간 단핵구에 의한 IL-12 생성의 최적 자극에 중요함을 암시한다.
실시예 19
인간 THP-1 단핵구에 의한 IL-12 생성의 M. phlei-DNA 및 MCC 자극에 미치는 오토클레이빙의 영향
인간 THP-1 단핵구를 MCC 및 M. phlei-DNA와 및 멸균수에서 30분간 오토클레이빙한 MCC 및 M. phlei-DNA와 48 시간 배양한다.
| 비-오토클레이빙 IL-12(pg/ml) | 오토클레이빙 IL-12(pg/ml) | |
| MCC 1 ㎍/ml | 1017.4 | 905.2 |
| MCC 10 ㎍/ml | 1061.6 | 1076.8 |
| M. phlei-DNA 1 ㎍/ml | 902.0 | 1088.6 |
| M. phlei-DNA 10 ㎍/ml | 1027.1 | 949.5 |
표 8에 나타낸 바와 같이, DNA 염기쌍 크기를 감소시키는 오토클레이빙은 단핵구에 의한 IL-12 생성이 MCC 또는 M. phlei-DNA 자극에 영향을 미치지 않는다.
실시예 20
인간 THP-1 단핵구에 의한 MCC-DNA 및 MCC 자극된 IL-12 생성에 미치는 CD14 항체 처리의 영향
인간 THP-1 단핵구를 PBS와 또는 항-CD14 항체(클론 MY4, Coulter-Immunotech) 10 ㎍/ml와 1 시간 배양한다. 이어서, MCC-DNA 또는 MCC 5 ㎍/ml를 가하고 48 시간 배양을 지속한다. 세포 표면 상의 CD14 수용체에 결합하는 CD14 항체는 MCC-DNA 자극된 IL-12 생성을 85% 감소시키고 MCC 자극된 IL-12 생성을 약 20% 감소시켰다(도 18).
실시예 21
인간 THP-1 단핵구에 의한 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC 자극된 IL-12 생성에 미치는 사이토캘러신 D의 영향
인간 THP-1 단핵구를 PBS와 또는 사이토캘러신 D(Sigma Chemical Co.) 10 ㎍/ml의 부재 또는 존재하에 M. phlei-DNA, MCC-DNA 또는 MCC 1 ㎍/ml와 배양한다. 식균작용을 억제하는 사이토캘러신 D는 M. phlei-DNA에서 64% 감소, MCC-DNA에서 50% 감소 및 MCC 자극된 IL-12 생성에서 55% 감소를 일으켰다(도 19).
비록 하기 가설에 구애받기를 원하지는 않지만, 도 18과 19에서 나타난 데이터를 토대로 해보면, M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 MCC가 다중 메커니즘에 의해 단핵구와 상호작용함이 추정된다. 도 18은 이들이 GPI-결합 막 수용체 CD14와 상호작용하고 내부화됨을 암시한다. 이러한 메커니즘은 불용성 MCC에 대해서 보다는 가용성 M. phlei-DNA 및 MCC-DNA에 대해 더 특이적이다. 도 19는 이들이 스캐빈저 수용체와 같은 식균세포 수용체와 상호작용하고, 내부화됨을 암시한다. 이러한 메커니즘은 가용성 M. phlei-DNA 및 MCC-DNA에 대해서 보다는 불용성 MCC에 대해 더욱 특이적이다.
실시예 22
인간 THP-1 단핵구에 의한 IL-12 생성에 미치는 CG 서열 및 MCC의 영향
BCG로부터의 핵산 제제는 림프구 증식, B-림프구에 의한 IL-6 및 IL-12의 분비, 단핵구에 의한 IL-12의 분비, T-림프구에 의한 IL-6 및 감마 인터페론의 분비 및 NK 세포에 의한 감마 인터페론의 분비를 자극하는 것으로 보고되어 있다[참조문헌:Klinman et al., Proceeding of the National Academy of Science USA 93:2879-2883, 1996].
BCG 핵산의 활성 성분이 CG 모티프로 확인됨에 따라, 인간 THP-1 단핵구를 MCC 또는 자동 DNA 합성기를 이용한 고체상 합성에 의해 제조된 5′-GCTAGACGTTAGCGT-3′DNA 서열 0.5, 1 및 5 ㎍/ml와 48 시간 배양한다.
| 5 ㎍/ml | 1 ㎍/ml | 0.5 ㎍/ml | |
| GCTAGACGTTAGCGT | 검출불가 | 검출불가 | 검출불가 |
| MCC | 비실행 | 1239 | 비실행 |
표 9에 나타낸 바와 같이, CG-함유 올리고뉴클레오타이드 서열은 시험된 3 가지 농도 어디에서도 IL-12 생성을 자극하지 않은 반면에, MCC는 1 ㎍/ml에서 IL-12 생성에 상당한 자극 효과가 있었다.
실시예 23
쥐 대식구에 의한 IL-12 생성의 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 Regressin
R
자극에 미치는 열처리 및 DNase I 처리의 영향
쥐의 복막 대식구를 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 RegressinR과 및 100℃에서 10분간 가열한 다음 얼음에서 2 분간 냉각시킨 M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 RegressinR과 배양한다.
| 처리 | IL-12 생성, pg/ml 상등액 | ||
| 12.5 ㎍/ml | 5.0 ㎍/ml | 0.1 ㎍/ml | |
| M. phlei-DNA가열처리 M. phlei-DNA | 228 278 | 207 222 | 140 164 |
| MCC-DNA가열처리 MCC-DNA | 비실행 비실행 | 176 235 | 164 131 |
| MCC | 비실행 | 745 | 비실행 |
| RegressinR 가열처리 RegressinR | 110 93 | 96 82 | 80 79 |
표 10에 나타낸 바와 같이, 5 ㎍/ml의 농도에서, IL-12 생성은 MCC에 의해 가장 많이, M. phlei-DNA 및 MCC-DNA에 의해 적게, 그리고 RegressinR에 의해 가장 적게 자극되었다. M. phlei-DNA, MCC-DNA 및 RegressinR의 가열처리는 IL-12 생성의 자극에 유의할 만한 영향을 미치지 않았다. 나타내지는 않았지만, MCC의 가열처리는 IL-12 생성에 있어 유의성은 없지만 약간의 증가를 초래하였다.
쥐의 복막 대식구를 비처리 및 DNase I 처리 MCC-DNA, MCC 및 RegressinR과 48 시간 배양한다(도 20). IL-20 생성은 MCC에 의해 가장 많이, MCC-DNA에 의해 적게, 그리고 RegressinR에 의해 가장 적게 자극되었다. MCC-DNA 및 MCC의 DNase I 처리는 쥐 대식구에 의한 IL-12 생성의 자극을 현저히 감소시켰다. RegressinR의 DNase I 처리는 활성에 영향을 미치지 않았다. 이러한 데이터 역시, 단핵구로 하였을 때 처럼(실시예 18), 쥐 대식구에 의한 IL-12 생성의 최적 생성을 위해 M-DNA의 올리고뉴클레오타이드 구조가 보존되어야 함을 암시한다.
실시예 24
쥐 복막 대식구에 의한 산화질소(NO) 생성에 미치는 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 Regressin
R
의 영향
대식구 활성화는 산화질소(NO), 수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록실 라디칼을 포함한(이에 한정되지는 않음) 반응성 산소 종의 생성을 자극한다. 이러한 반응성 산소 종은 반응성 세포에서 세포용해 및 아폽토시스를 유도하고 따라서 항암활성을 지닌다.
쥐 복막 대식구를 M. phlei-DNA, MCC-DNA, MCC 및 RegressinR 0.1, 5.0 또는 12.5 ㎍/ml와 48 시간 배양한다. 배양 상등액 100 ㎍를 사용하여 NO2
-와 Griess 시약의 반응에 의해 어떠한 생성(nmol/L)도 측정되지 않았다.
| 처리 | NO 생성, nmol/L | ||
| 12.5 ㎍/ml | 5.0 ㎍/ml | 0.1 ㎍/ml | |
| M. phlei-DNA | 18.9 | 8.3 | 2.6 |
| MCC-DNA | 비실행 | 3.0 | 1.8 |
| MCC | 비실행 | 36.2 | 비실행 |
| RegressinR | 1.6 | 2.6 | 0.1 |
표 11에 나타낸 바와 같이, 5 ㎍/ml에서, MCC는 M. phlei-DNA, MCC-DNA 또는 RegressinR보다 현저히 더 NO 생성을 자극하였다.
쥐의 대식구를 1 ㎍/ml 비처리 및 DNase I 처리 MCC와 및 비처리 M. phlei-DNA 및 MCC-DNA와 48 시간 배양한다.
| 실험 #1 NO(nmol/ml) | 실험 #2 NO(nmol/ml) | |
| MCC | 43.7 | 30.7 |
| MCC+DNase I(1 U) | 0.0 | 2.1 |
| MCC-DNA | 2.6 | 2.1 |
| M. phlei-DNA | 0.0 | 1.6 |
표 12에 나타난 바와 같이, M. phlei 세포벽 상에 MCC로서 복합체를 형성한 M-DNA는 NO 생성을 상당히 자극하였다. M-DNA를 분해하는 MCC의 DNase I 처리는 NO 생성의 MCC 자극을 제거하였다. MCC-DNA 및 M. phlei-DNA는 NO 생성을 최소로 자극하였다. 이러한 데이터는 M-DNA의 온전한 올리고뉴클레오타이드 구조 및 대식구에 이러한 뉴클레오타이드를 제공하는 담체 둘 모두가 NO 생성의 최적 자극에 중요함을 입증한다.
실시예 25
쥐 RAW 264.7 단핵구에 의한 산화질소(NO) 생성에 미치는 MCC의 영향
쥐 RAW 264.7 단핵구를 MCC 0.5 내지 95 ㎍/ml와 24 시간 배양한다. MCC 농도의 증가는 NO 생성량의 증가를 자극하였다(도 21). 이러한 현상은 NO 유도에 대한 수용체가 단핵구 상에서 최적으로 발현되지 않고, 따라서 NO 생성이 통상적으로 단핵구와 연관되어 있지 않음에 따라 예상밖이었다. 동일한 조건에서, RegressinR 을 자극하지 않았다.
실시예 26
시험관내 사이토킨 합성의 자극
각각 5 마리로 이루어진 4 개 그룹의 CD-1 마우스에 MCC 50 mg/kg을 복막내 주사한다. 혈액을 주사한 지 0, 3, 6 및 24 시간 후 수집하여 혈청 중 IL-6, IL-10, IL-12 및 GMSF의 농도(pg/ml)를 주사 후 0, 3, 6 및 24 시간에서 측정한다(도 22). 복막내 MCC로는, IL-6, IL-10 및 IL-12의 혈청 농도가 주사 후 3 및 6 시간에서 현저히 증가하였고, 주사 후 24 시간에서 대략 대조치(0 시간)로 감소하였다. GM-CSF의 혈청 농도는 주사 후 3, 6 및 24 시간에서 약 대조치(0 시간)로 잔류하였다.
각각 5 마리로 이루어진 5 개 그룹의 CD-1 마우스에 MCC 6.6 mg/kg을 정맥내 주사한다. 혈액을 주사한 지 0, 3, 6 및 24 시간 후 수집하여 혈청 중 IL-10 및 IL-12의 농도(pg/ml)를 주사 후 0, 3, 6 및 24 시간에서 측정한다(도 23). 정맥내 MCC로는, IL-12의 혈청 농도가 주사 후 3 및 6 시간에서 현저히 증가하였고, 주사 후 24 시간에서 대략 대조치(0 시간)로 감소하였다. IL-10의 혈청 농도는 주사 후 3, 6 및 24 시간에서 약 대조치(0 시간)로 잔류하였다.
이러한 데이터는 M-DNA(여기에서, M-DNA는 M. phlei 세포벽상에서 MCC로서 복합체를 형성한다)의 생체내 투여는 항암 사이토킨 IL-6, IL-10 및 IL-12의 생성을 자극하지만, 프로-암 사이토킨 GM-CSF의 생성은 자극하지 않음을 보여준다. 또한, 이들 데이터는 투여된 MCC의 양과 투여되는 경로 모두가 MCC의 생체내 사이토킨 생성 자극능에 영향을 미침을 입증한다.
각각 4 마리로 이루어진 4 개 그룹의 CD-1 마우스를 비처리 및 DNase I 처리 M. phlei-DNA 및 MCC로 복막내 주사한다. 3 시간 후, 마우스를 참수시켜 심장 미세천자에 의해 채혈한 다음 혈청 중의 IL-12의 농도(pg/ml)를 측정한다(표 13).
| MCC | MCC+DNase | % 억제 | ||
| 마우스 #1 | 255 | 마우스 #5 | 126 | 49% |
| 마우스 #2 | 180 | 마우스 #6 | 57 | 68% |
| 마우스 #3 | 146 | 마우스 #7 | 121 | 17% |
| 마우스 #4 | 199 | 마우스 #8 | 143 | 28% |
| 평균 | 195±46 | 111±38 | 40.5±22.6% | |
| M. phlei-DNA | M. phlei-DNA+DNase | % 억제 | ||
| 마우스 #9 | 135 | 마우스 #13 | 110 | 19% |
| 마우스 #10 | 283 | 마우스 #14 | 146 | 48% |
| 마우스 #11 | 118 | 마우스 #15 | 121 | 82% |
| 마우스 #12 | 270 | 마우스 #16 | 169 | 37% |
| 평균 | 195±46 | 111±38 | 46.4±26.5% |
표 13에 나타낸 바와 같이, MCC 및 M. phlei-DNA의 생체내 투여는 항암 사이토킨 IL-12의 생성을 자극한다. DNase I 처리 후, MCC는 IL-12 생성을 40.5% 감소되도록 자극하였고 M. phlei-DNA는 IL-12 생성을 46.5% 감소되도록 자극하였다. 이러한 점은 M-DNA의 올리고뉴클레오타이드 구조가 생체내 IL-12 생성의 최적 자극을 위해 보존되어야 함을 입증한다.
실시예 27
MCC 안정성
1 mg/ml에서 MCC를 4℃의 암실에서 또는 6개월간 0.85% w/v NaCl 중의 멸균 현탁액으로 보관한다. 광자 상관 스펙트로스코피(N4 Plus, Coulter Electronics Inc.)를 이용하여 평균 입자 직경을 계산해낸다. MCC 현탁액을 0.85% w/v NaCl로 5 x 104 내지 106 카운트/초의 입자 계수율이 되도록 희석한다. 하기의 조건을 이용하여 크기 분포 프로세서 모드(SDP)로 평균 입자 직경을 산정한다: 유체 굴절률 1.33, 온도 20 ℃, 점도 0.93 센티포이즈, 측정각 90.0。, 샘플 시간 10.5 μs, 샘플 실행 시간 100초. 입자와 벌크 용매 간의 유체역학적 계면에서의 잠정적인 전기 전하를 하기 조건을 이용하여 Delsa 440SX(Coulter Electronics Inc.)에서 측정한다: 전류 0.7 mA, 주파수 범위 500 Hz, 온도 20℃, 유체 굴절률 1.33, 점도 0.93 센티포이즈, 유전상수 78.3, 전도율 16.7 ms/cm, 온 타임 2.5초, 오프 타임 0.5초, 및 샘플 실행 시간 60초.
도 24에 도시된 바와 같이, MCC 전하 및 MCC 직경은 보관 6개월간 비교적 불변상태로 잔류하였다. 더욱이, THP-1 단핵구에서 IL-12 생성의 MCC 자극 및 아폽토시스의 MCC 유도는 보관 6개월간 불변상태로 잔류하였다.
실시예 28
인간 결장암의 MCC-DNA 및 MCC 처리
인간 결장암 세포(ICM12C)를 면역결핍성 무흉선 누드 마우스(nu/nu 마우스)의 피하조직내 전위 고형암으로서 설정하고 마우스를 5 개 그룹으로 나눈다. 제 1 그룹에는 비히클만을 투여한다. 제 2 그룹에는 MCC-DNA를 투여한다. 제 3 그룹에는 DNase I 처리 MCC-DNA를 투여한다. 제 4 그룹에는 MCC를 투여한다. 제 5 그룹에는 DNase I 처리 MCC를 투여한다. 암 매스를 처리 전 및 처리 4 주간 매주 측정한다. 제 2 그룹의 마우스와 제 4 그룹의 마우스는 암 매스의 퇴행을 보인다.
실시예 29
인간 난소암의 M. phlei-DNA 및 MCC 처리
인간 난소암 세포(36M2)를 면역결핍성 무흉선 누드 마우스(nu/nu 마우스)의 복강내 복수로서 설정하고 마우스를 5 개 그룹으로 나눈다. 제 1 그룹에는 비히클만을 투여한다. 제 2 그룹에는 M. phlei-DNA를 투여한다. 제 3 그룹에는 DNase I 처리 M. phlei-DNA를 투여한다. 제 4 그룹에는 MCC를 투여한다. 제 5 그룹에는 DNase I 처리 MCC를 투여한다. 암 매스를 처리 전 및 처리 4 주간 매주 측정한다. 제 2 그룹의 마우스와 제 4 그룹의 마우스는 복수의 암세포 증식 억제를 보인다.
실시예 30
개 전파성 성병암의 MCC 치료
성병암(VT)에 걸린 개를 4 개 그룹으로 나눈다. 제 1 그룹은 빈크리스틴을 투여한다. 제 2 그룹은 메토트렉세이트 및 사이클로포스파미드와 배합된 빈크리스틴을 투여한다. 제 3 그룹에는 마이코박테리아 세포벽(MCC)인 담체와 복합체를 형성하고 담체상에 제공된 MCC-DNA를 투여한다. 제 4 그룹은 빈크리스틴 및 MCC를 투여한다. 암의 매스를 처리 전 및 처리 12 주간 매주 측정한다. 제 4 그룹의 개는 VT의 퇴행을 보인다.
실시예 31
수성 담체내 현탁액
M-DNA를 약학적으로 허용되는 제 1 담체에 현탁시키고 20% 출력으로 5분간 음파처리한다(모델 W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). 임의로, 음파처리 조성물을 1 유동-통과에 대해 15,000 내지 30,000 psi로 미세유동화하여 균질화시킨다(모델 M-110Y; Microfluidics, 미국 매사추세츠 뉴턴 소재).
Claims (61)
- a. 마이코박테리움 플레이 (M. phlei) 데옥시핵산 (M-DNA), 및b. 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 포함하는,암 치료 또는 예방용 조성물.
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- a. 마이코박테리움 플레이 (M. phlei) 데옥시핵산 (M-DNA),b. M. phlei 세포벽(여기에서, M-DNA는 보존되고 M. phlei 세포벽 상에서 복합체(MCC)를 형성한다), 및c. 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는,암 치료 또는 예방용 조성물.
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- 제 1 항에 있어서, M-DNA가 항암 활성을 갖는 조성물.
- 제 14 항에 있어서, MCC가 항암 활성을 갖는 조성물.
- 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 항암활성이 암세포의 증식 억제인 조성물.
- 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 항암활성이 암세포에서의 아폽토시스 유도인 조성물.
- 제 51 항에 있어서, 암세포에서의 아폽토시스 유도가 Fas, p53/p21, 및 내약성으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 인자와 독립적인 조성물.
- 제 51 항에 있어서, 암세포에서의 아폽토시스 유도가 암세포에서의 카스파제-3 활성의 유도인 조성물.
- 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 항암활성이 면역 시스템 세포에 의한 사이토킨 생성의 자극인 조성물.
- 제 53 항에 있어서, 면역 시스템의 세포가 대식구 및 단핵구로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
- 제 53 항에 있어서, 사이토킨이 IL-6, IL-10 및 IL-12로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
- 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 항암활성이 면역 시스템 세포에 의한 반응성 산소 종 생성의 자극인 조성물.
- 제 56 항에 있어서, 면역 시스템 세포가 대식구인 조성물.
- 제 14 항에 있어서, M. phlei 세포벽은 단백질제거되며 지질제거된 조성물.
- 인간을 제외한 동물에서의 암 치료 유효량의 M-DNA 및 약학적으로 허용되는 제 1 담체를 치료를 요하는 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물에서의 암 치료방법.
- 인간을 제외한 동물의 암치료 유효량의, M-DNA 및 M. phlei 세포벽(여기에서, M-DNA는 보존되고 M. phlei 세포벽 상에서 복합체(MCC)를 형성한다), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 치료를 요하는 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는. 인간을 제외한 동물의 암치료 방법.
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