CN1102855C - 免疫治疗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对治疗多种动物及人类疾病都有效的免疫治疗药。更具体讲，本发明是一种不含油的改性分枝杆菌细胞壁提取物的制剂，它可以刺激人或动物的免疫系统，导致机体中和、抑制或消除感染、肿瘤及其他疾病。

Description

免疫治疗组合物
本发明涉及一种对各种动物及人类疾病有疗效的免疫治疗药。更具体地讲，本发明是一种不含油的改性分枝杆菌细胞壁提取物的制剂，它可以刺激动物或人的免疫系统，导致机体中和、抑制或消除感染、肿瘤及其他疾病。
利用分枝杆菌细胞壁提取物的免疫治疗在动物肿瘤模型、癌症患者及治疗感染性疾病中已得到广泛评估。在主动免疫治疗中，根据增强内源性抵抗肿瘤生长的想法，将多种免疫刺激物、免疫恢复剂及肿瘤细胞疫苗直接给予肿瘤患者。作为一种对肿瘤生长的免疫学抑制的尝试，有数种细菌及细菌产品已被给予患者。在细菌当中，卡介苗(BCG)、棒杆菌菌种、小棒杆菌，分枝杆菌菌种、棒形细菌、疮疱丙酸杆菌(C.parvum)、红球菌菌种、真杆菌种、单核细胞增生李斯特氏菌、博德特氏菌种及诺卡氏菌种的提取物已经用于这种研究。总的来说，使用免疫刺激物进行免疫治疗成功的要素是：对肿瘤的免疫原性，给予免疫刺激物最佳剂量和方案，及免疫刺激物与肿瘤细胞的直接接触。
已有报道说，病灶内注射带油的卡介苗可以使豚鼠真皮内已良好建立起来的带有淋巴结转移的肝细胞瘤移植物发生退化，并能建立全身的肿瘤特异性免疫，来消除远端疾患。用含油的卡介苗对黑瘤病灶直接注射，注射的瘤产生退化，而未注射的瘤退化程度小得多。这种治疗伴有严重的类似流感的全身症状，在注射后几小时内开始并持续约24小时。以后的不利作用是使注射部位的皮肤发生溃疡，囊内给予卡介苗已使浅表膀胱肿瘤发生退化。
两种与所述免疫刺激活性有关的成分已从卡介苗复合物中鉴别并分离出来。N-乙酰-胞壁酰-丙氨酰-3-异谷氨酰胺(胞壁酰二肽或MDP)是分枝杆菌细胞壁的一种小成分，可以介导福氏完全佐剂的存在油包水乳剂中的完整分枝杆菌产生的佐剂作用。已有报道说，MDP可以激活巨噬细胞并增强T细胞和B细胞介导的反应。巨噬细胞可通过胞吞作用吞入被脂质体包裹的MDP而激活。有报道说，在肿瘤转移实验中，多次注射脂质体包裹MDP可以减少肺及淋巴结转移。海藻糖二霉菌酸酯(TDM)是另一种有佐剂活性的分枝杆菌成分，已报道说其在鼠肿瘤模型中有抗肿瘤活性。
其他化学物质也作为增强肿瘤细胞杀伤作用的物质进行了试验，其中有吡喃共聚物及一种驱虫药左旋咪唑。左旋咪唑在治疗人类癌症中无明显有益效果。
对卡介苗及其他细菌产品的局部及区域性效果，人们提出有两种基本作用。肿瘤细胞可能被免疫刺激物引起的严重炎性反应杀死，或者这些同样的制剂可以作为佐剂增强对肿瘤的免疫。与巨噬细胞接触(直接被某些细菌产品激活或通过T细胞介导物的产生而被间接激活)被认为是杀死肿瘤细胞的一个重要因素。
无论使用大分子如肽聚糖类或脂多糖还是小分子如胞壁酰二肽，佐剂作用的机制都是激活巨噬细胞。用佐剂刺激巨噬细胞可增强抗原摄入、细胞毒作用、细胞吞噬作用、过氧化氢的产生、增强花生四烯酸代射、酶脱粒作用和多肽细胞因子的合成及释放。多肽细胞因子起重要作用，因为它们在不同细胞中都有强生物学性能。迄今为止，这些细胞因子包括白细胞介素1、α-干扰素、肿瘤坏死因子(cachectin)及集落刺激因子。每种细胞因子可刺激其他细胞产生有生物学活性的细胞因子。
在那些证明分枝杆菌细胞壁提取物活性的研究当中，这种提取物在给予受体之前都要先与油混合，通常作为一种乳剂。据信需要油去有效地将细胞壁成分递呈给免疫系统中的适当细胞。但是制剂中油的存在使这类制剂作为治疗药的使用大大复杂化了。分枝杆菌细胞壁提取物制剂中存在油有导致在注射部位发生严重反应的危险。另外，油可导致肉芽形成。细胞壁提取物制剂中的油导致的严重反应使这种制剂作为一种治疗药对人类来说难以接受。
因此，需要一种分枝杆菌细胞壁提取物，它可以刺激人或动物的免疫系统且不产生由于制剂中油的存在而导致的反应。这一制剂的免疫刺激作用应与油乳剂中的分枝杆菌细胞壁提取物制剂的作用相似。此外，不含油的细胞壁提取物允许对成品进行终产物消毒(高压消毒)，产生一种无菌产品。
本发明通过提供一种基本不含脂类和蛋白质的分枝杆菌细胞壁提取物的悬液解决了上述问题，这种悬液给予人或动物，可全面刺激人和动物的免疫系统。这种分枝杆菌细胞壁提取物优选从包括草分枝杆菌在内的分枝杆菌属种中提取。此外，棒杆菌菌种和诺卡氏菌种也是分枝杆菌细胞壁提取物的优选来源。人或动物的免疫系统受到上述悬液的刺激可导致对感染物的中和/或阻碍癌细胞生长。
给予本发明的分枝杆菌细胞壁提取物可使免疫系统受到全面刺激。例如，当一种病毒感染由于使用分枝杆菌细胞壁提取物而被抑制的时候，由病毒复制和继发性细菌感染所产生的症状和体征也显著减少或消失，因为病毒复制被打断中断了感染周期。
本发明包括一种改性分枝杆菌细胞壁提取物在盐水或其他水溶液中不含油的悬液。这种细胞壁提取物可以从卡介苗(BCG)、棒杆菌属种、小棒杆菌、分枝杆菌菌种、棒形细菌、疮疱丙酸杆菌、红球菌菌种、真杆菌菌种、单核细胞增生李斯特菌、博德特氏菌种或诺卡氏属种中提取。简要地说，细菌在液体培养基上生长并收集。细胞壁是通过破裂细菌并通过离心沉降收集而制备的。细胞壁成分(由离心步骤中得到的沉淀物)用蛋白分解酶消化而去蛋白。剩下的部分用去垢剂处理并冲洗，处理过的不溶部分进行冻干。这种提取物在水溶液(例如盐水)中悬浮，注射给动物或人以刺激其免疫系统。本发明的一个基本要素在于这种改性的细胞壁成分不被油成分吸附或与之混合。出人意外地发现，这种改性的细胞壁提取物在制剂中不使用油的情况下疗效很高。
去蛋白的细胞壁提取物可用来治疗多种由病毒、细菌或细胞内生物引起的感染，包括但不限于由疱疹病毒引起的感染如马鼻肺炎、传染性牛鼻气管炎、单纯疱疹、带状疱疹、眼疱疹、猫病毒性鼻气管炎，及感染猫呼吸道的疱疹病毒。本发明在辅助治疗幼犬的细小病毒感染时也有效。本发明的分枝菌细胞壁提取物对治疗人的生殖器疱疹及获得性免疫缺陷综合症以及治疗其他动物或人的病毒感染有效。本发明对治疗多种人及动物的癌症也有效。肿瘤可以是原发的，也可是转移的。
本发明的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液与传统的治疗不同，本发明非特异性地激活免疫系统，对抗多种微生物感染及抗肿瘤提供保护。因此，本发明对治疗对感染物没有免疫力的动物的感染有效。
综上所述，本发明的目的是提供一种不含油成分，但仍能有效地刺激人或动物的免疫系统的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分对治疗多种微生物感染有效的分枝杆菌细胞壁提取物水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含有可能对接受者具有毒性作用的油成分的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分的不使接受者对皮肤结核菌素试验敏感的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种对治疗肿瘤有效的不含油成分的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不油成分可以长期贮存而保持有效的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分因而导致微栓形成的危险低的细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分因此不会导致肉芽脂肪栓的细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分不会使接受者产生反应的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
本发明的另一目的是在免疫耐受和免疫抑制情况下重新刺激免疫系统产生正常免疫反应。
本发明的另一目的是提供一种不含油的经过终产物消毒的(高压消毒)无菌产品。
本发明的另一目的是提供一种不会在给药部位导致反应的分枝杆菌细胞壁提取物制剂。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分不会在注射部位导致严重反应的细胞壁提取物水悬液。
本发明的另一目的是提供一种不含油成分的不会导致超敏反应的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。
阅读以下公开的实施方案的具体描述及所附权利要求后，本发明的这些及其它目的、特点及优点会变得很明显。
本发明涉及一种对治疗人及动物的免疫系统有效的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液。这种水悬液内可任选地含有葡糖氨基聚糖如透明质酸作为一种成分。本发明是一种不含油或类油物质的改性细菌细胞壁的水制剂。因为组成本发明的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液中不含油，所以在现有技术中那些细胞壁制剂中出现的所不希望的副反应被消除了。这种分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液可以刺激人或动物的免疫系统，使机体中和或抑制感染，或阻碍或消除肿瘤生长。
本发明对接受者不引起阳性结核菌素反应并在反复注射时很少引起超敏反应。本发明的分枝杆菌细胞壁提取物水悬液可用来治疗人或动物的多种疾病。
需要理解的是，本发明并非是一种免疫接种方法，而是一种能够全面刺激动物或人的免疫系统从而使个体自身免疫系统能很快消除疾病的药物。因此，本发明的分枝杆菌细胞壁提取物水悬液非常适用于治疗正在进行中的病毒感染，与传统的预防免疫接种相比，是一种新的免疫治疗药物。
对被给予这种水悬液的动物或人来说，这种分枝杆菌细胞壁提取物对全面刺激免疫系统是有作用的。特别是，本发明对治疗微生物引起的传染性疾病有作用，特别是病毒感染。另外，本发明对阻碍或消除包括原发癌和转移癌的多种肿瘤的生长有作用。当用来治疗原发肿瘤时，这种水悬液可直接注射到肿瘤中，也可全身给药。
本发明包含一种不含油或类油物质的改性的分枝杆菌细胞壁制剂的水悬液。这种水悬液可以任选地含有葡糖氨基聚糖(GAG)作为一种成分。例如包括但不限于多硫酸化的葡糖氨基聚糖、和包括透明质酸钠在内的透明质酸盐。优选的葡糖氨基聚糖是鸡冠或链球菌来源的透明质酸。从链球菌得到的透明质酸分子量范围是300,000到2,000,000道尔顿(D)，优选范围是500,000到1,200,000D，浓度范围是0.001％到1.0％，优选0.01％到0.1％。
优选微生物是草分枝杆菌。但任何分枝杆菌菌种都可用来制备本发明的分枝杆菌细胞壁水悬液。其他可用作细胞壁来源的细菌包括但不限于：卡介苗(BCG)、棒杆菌菌种、小棒杆菌、分枝杆菌菌种、棒形细菌、疮疱丙酸杆菌(C.parvum)、红球菌菌种、真杆菌种、单核细胞增生李斯特氏菌、博德特菌种和诺卡氏菌种。
本发明基本上是这样来制备的：将微生物如草分枝杆菌经过在Petragnani培养基(Difco Labs，Detroit，MI)或Lowenstein-Jensen培养基(Difco Labs，Detoit，MI)上初步培养10-20天后，在Bocto AC肉汤培养基(Difco Labs，Detroit，MI)上生长10-20天。通过离心沉降收集细胞并用压力或超声波使细胞破裂。细胞破裂就是使细菌细胞壁破裂从而使细菌的可溶性内容物释放到周围环境中。离心收集破裂的细胞并重新悬浮在蒸馏水中。细胞/水悬液先在高速混合器中处理，再在超声波发生器如Branson超声波350细胞破碎器(Branson Sonic Power Co.，Danbury，CT)中破裂细菌细胞。也可用高压细胞破碎器如Ribi细胞破碎器来破裂细胞，这种特殊的细胞破碎器已不再生产，但为本领域中的普通技术人员所熟知。细菌细胞被放在高压细胞破碎器的一个小室内，然后对小室加压到高于30,000磅/平方英寸的压力，然后快速减压使细胞破裂。
然后洗涤细胞壁部分并与未破裂细胞分离，流出物或超声裂解产物被移至离心管中，在15℃时用中速离心机以27,500xg离心1小时。离心后，弃去上清液，沉淀的粗制细胞壁被转移到一混合器内。在这一步中，弃去最底层白色的未破裂细胞的沉淀非常重要。将细胞壁悬浮在去离子无菌水中并通过离心冲洗。洗过的细胞壁重新在无菌去离子水中悬浮，并且低速(约350至500xg)离心去掉任何未破裂细胞。低速离心后，用27500xg离心使上清液中细胞壁沉淀出来。
然后用几种蛋白酶处理粗制的细胞壁使之脱蛋白。应认识到在此步细胞壁改性方法中可使用许多不同的蛋白酶，甚至化学提取方法。优选的细胞壁去蛋白方法是用胰蛋白酶和链霉蛋白酶连续处理细胞壁。粗制细胞壁在水缓冲液如0.05M Tris-HCl，pH7.5中重新悬浮，并加入胰蛋白酶(胰蛋白酶，Sigma，chemical Co.，St.LouisMO)，混合物在室温下搅拌6到24小时。用胰蛋白酶处理后，加入链霉蛋白酶(灰色链霉菌蛋白酶，Sigma Chomical Co.，St.LouisMO)，并在室温下孵育这一悬液6-24小时。
然后细胞壁部分可任选地用去垢剂或苯酚处理以萃取可能出现在细胞壁中的任何核酸和/或脂类。优选的萃取混合物是尿素、Tri-tonX-100和苯酚。例如，在每升去蛋白细胞壁悬液中加入40-80克尿素，0.5-4.0ml 100％TrilonX-100和50-150克苯酚。将悬液加热到60-80℃并搅拌1小时，与苯酚和去垢剂加热处理后，悬液在GSA转子的中速离心机的带盖离心管中，以16000Xg离心10分钟。滗去上清液，小心去除沉淀物下深色的酚溶液。细胞壁沉淀用离心方法再洗几次以除去任何残余的酚。
然后将这种改性的细胞壁沉淀物冻干，冻干是一种本领域普通技术人员熟知的方法。冻干后的细胞壁沉淀物可在干燥器中在-20℃下无限期保存。可任选地加入硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸，Sig-ma Chemical Co.，St，Louis MO)作为防腐剂。优选的硫柳汞浓度为大约0.1g/l。硫柳汞和其他缓冲液可任选地加入乳化的细胞壁中，然后在60-80℃下混合1小时。
使冻干的细胞壁提取物在盐溶液中重新悬液后，提取物可用下列两个方法之一处理。首先，提取物可在无菌条件下操作，将提取物装入小瓶并无菌密封。另一方法是对提取物进行终产物消毒(高压消毒)以避免在处理提取物的过程中所需的无菌条件。
不含油的制剂可进行终产物消毒。而且，经过终产物消毒的制剂可以保证是无菌的，而无菌操作的制剂都不能达到这种肯定程度，有可能被污染。因此，不含油的细胞壁提取物的更进一步的优点是它可以保证是无菌的，可降低费用并较易于制备。
在本发明的一种实施方案中，从草分枝杆菌分离分枝杆菌细胞壁提取物(MCW)的方法简述如下：
1.细胞生长a.鉴别种子培养物为纯的草分枝杆菌。b.接种到锥形瓶内肉汤培养基上。c.36℃孵育7-14天。2.全细胞浓缩a离心。3.全细胞冲洗a.在蒸馏水中反复离心。4.细胞灭活与破裂a.Branson超声仪(或)b.Ribi细胞破碎器。5.破碎细胞的解毒a.在去离子水中反复离心。6.粗制分枝杆菌细胞壁的浓缩a.离心。7.粗制分枝杆菌细胞壁的去蛋白a.悬浮于酸性溶液中。b.在胰蛋白酶中降解6-24小时。c.在链霉蛋白酶中降解6-24小时。d.在尿素/苯酚中孵育1小时。8.60°-80℃巴氏灭菌1小时9.去蛋白并纯化的分枝杆菌细胞壁的浓缩a.离心。10.稳定化a.冻干。
b.任选加硫柳汞。
11.盐水中重新悬浮
a.无菌装填(或)
b.高压终产物消毒。
本发明的优选使用方法是单剂量肌肉注射。但应认识到，本发明在皮下注射、静脉注射或肿瘤内给药、囊内给药，局部给药或口服给药时也有效。治疗原发癌时，分枝杆菌细胞壁提取物水悬液可直接注入肿瘤中。对于某些疾病，可能需要多次治疗。本发明的分枝杆菌细胞壁提取物水悬液的最适剂量根据被治疗的动物或人的大小而变化。只需要足够刺激免疫系统的量。通常单剂量是约0.25-5.0ml悬液，每毫升悬液含细胞壁500μg到10mg。优选的单剂量是一种每毫升含有约300μg到6mg细胞壁的乳液。最优剂量是100μg-2mg细胞壁/ml，总体积约0.25到5ml的乳液。
本发明的一个关键方面是这种分枝杆菌细胞壁提取物水悬液不含任何油或类油物。发明者们所知道的现有技术中所有分枝杆菌细胞壁提取物制剂都含有油成分或类油成分。出乎意料的是根据本发明制作的分枝杆菌细胞壁提取物不需为在人或动物中有免疫刺激活性而含有油。本发明的分枝杆菌细胞壁提取物的水悬液的抗感染或抗肿瘤的特异性活性一般等同于或稍小于现有技术中的油包水制剂的特异活性。但是，已经发现增加水溶液中的分枝杆菌细胞壁提取物浓度不会引起任何不希望的副作用。
下面的实施例将对本发明做进一步描述，但同时不构成任何限制。正相反，应清楚认识到，对本领域技术人员来说，读完下面的描述，会使他们在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，采取各种不同的实施方案、改进措施及其等同手段。
实施例I
草分枝杆菌是从西德Borstel的Institute for ExperimentalBiologic and Medizin得到的，并悬于-60℃消毒牛奶中保存。分离的细菌在1976到1985年间约传代11次，而改性细胞壁的免疫刺激活性没有任何减小。草分枝杆菌在Petragnani培养基((DifcoLabs，Detroit，MI)中培养。
实施例II
细菌细胞壁通过Ribi细胞破碎器制备。每次使用前，要擦净、安装Rib圆筒活塞和阀门等元件。将约400克湿细胞团放入容积约1200毫升的洁净混合器中。将细胞团高速混匀30到60秒。混匀后，加入6毫升吐温80及200到400毫升无菌水。然后整个细胞悬液在混合器中低速混匀约10秒钟。将此细胞悬液冷冻，在每次填充Ribi圆筒前，重新混匀。装有细胞悬液的Ribi圆筒在破碎器中以33000磅/平方英寸的压力处理。然后重新填充圆筒并重复，这一过程直至处理完全部细胞悬液。在破碎过程中从Ribi圆筒中流出的物质贮存在冰上的无菌烧瓶中。
实施例III
在实施例II中从破碎器流出的物质被转移到250ml离心管中用GSA转子的中速离心机在15℃下，以27,500xg离心1小时。滗出并弃去离心上清液。最下层未破裂细胞的白色沉淀也弃去。将沉淀下来的粗制细胞壁部分转入混合器中，低速混合，悬浮在无菌、去离子水中。粗制细胞壁部分通过重新悬浮和离心(27500Xg，1小时，15℃)进行冲洗，弃去最下面未破裂细胞的白色块。
粗制细胞壁洗过后，使沉淀物重新在无菌去离子水中悬浮，以350Xg离心5分钟沉淀未裂解细胞，同时使细胞壁保持在上清液中。滗出上清液，在15℃以27,500Xg离心1小时以沉淀粗制细胞壁。
实施例IV
实施例III中的粗制细胞壁用蛋白水解酶消化去蛋白。从400克全细胞中得到的细胞壁通过低速混合重新悬浮在1升0.05M的Tris-HCl，ph75中。当这种粗制细胞壁在Tris缓冲液中彻底重新悬浮以后，加入50mg胰蛋白酶(胰蛋白酶Sigma Chemical Co.，St.Lauis MO)，在室温下用磁力搅拌器搅拌24小时。用胰蛋白酶处理后，在每升胰蛋白酶消化过的细胞壁悬液中加入50mg链霉蛋白酶(灰色链霉菌蛋白酶Sigma Chamical Co.，St.Louis MO)，在室温下，用磁力搅拌器搅拌24小时。
实施例V
实施例IV中用蛋白酶消化过的细胞壁用去垢剂和苯酚处理。每升细胞壁悬液中加60g脲(J.T.Baker Chemical Co.Phillips-burg，NJ)、2.0毫升100％Triton X100(聚乙烯醚Sigma ChemicalCo.，St.Louis MO)和100g苯酚晶体(Fisher Scientific，FairLawn，NJ)。装有悬液的烧瓶用铝箔松散地盖住并加热到60-80℃，搅拌1小时。去蛋白的细胞壁在GSA转子(IV an Sorvall，Inc.，Norwalk，CT)中以16,000xg离心10分钟，滗出并弃去上清部分，用一次性的移液管将沉淀物下的深色液体移去。将细胞壁沉淀物在约1升无菌水中重新悬浮洗涤三次，在GSA转子中以16,000xg离心10分钟。
实施例VI
将含有洗净的改性细胞壁沉淀物的悬液移入装有少量无菌去离子水的冻干烧瓶中冻干。每30克湿细胞壁原料放入一个300ml的冻干烧瓶内。通过在干冰冷却的乙醇内旋转烧瓶将细胞壁悬液进行薄膜冷冻。烧瓶内容物凝固以后，将烧瓶与冻干机(Virtis Co.，Inc.，Gardiner，NY)连结。样品被冻干后，移入无菌的有螺旋盖子的容器内。在有无水硫酸钙的干燥器内于-12℃保存这些物质。
实施例VII
为检验不含油的细胞壁制剂的效力，进行了小鼠脾大效力试验。使用7-8周龄、体重20-30g的雌性CD1小鼠进行试验。将动物随机分为11组，每组20只。每5只装入一笼。自由摄食和水。从实施例VI中所得分枝杆菌细胞壁提取物的终浓度为400μg/ml。在临注射试验物质前，将3ml成品用4.5ml PBS或PBS-D稀释。PBS-D的组成如下：16.5ml 0.2M NaH2PO4，33.5ml 0.2MNa2HPO4，7.4g NaCl，最后用水稀释到1升。
动物取背卧位，头向下，用27号标准1/2英寸针头在腹膜下注入0.5ml试验物质。
20只小鼠注射试验物质组合物(0.5ml，400μg/ml)，另20只对照组小鼠注射0.5ml盐水(PBS)。其他各组的20只小鼠分别注射表1中所列的其他各种试验物质各0.5ml。每天记录任何反常规象(厌食，痛苦，聚堆，皮毛粗糙或死亡)。
每1000ml水包油悬液(乳液对照组)的组成如下：1000μg分枝杆菌细胞壁提取物(MCWE)、2％矿物油、100mg/L硫柳汞和975PBS-D。所有悬液注射前要混匀。
7天后，断颈或二氧化碳中毒处死全部实验动物，称量体重。处死后，立即沿体中线解剖小鼠，打开腹壁，暴露内脏。剪开腹膜，移走肠以及脾周围的器官。在确保不含其他组织的情况下摘出脾脏，用敏感度至少为0.001g的天平对每个脾脏称重。
用下面的公式把每只动物脾重转变为mg脾/100g体重来确定脾和体重的关系：对实验组和对照组的每个脾重(mg)/100g体重的值取平均值。用方差分析(ANOVA)比较对照组与产品试验组的平均脾重。统计显著性p＜0.01时，认为是阳性效力试验。
                                       表1
试验物质  平均mg脾重/100g体重 平均脾重 对PBS的P值 对HA的P值 对MCWE+油的P值
盐水(PBS)对照  369.920  99.630   --     .91     --
仅用HA的对照  374.335  91.000   .9139     --     --
乳剂对照  425.567  108.500   0.0633     --     --
盐水中MCWEa  539.377  134.100   .00034     --     .1254
MCWE(23E)b  633.980  167.850   .000025     .00013     --
1mg HAc/1000μg MCWE  651.784  154.700   .0013     .0016     .8242
1mg HA/1500μg MCWE  606.616  144.200   .0027     .0027     .7272
1mg HA/2000μg MCWE  713.030  165.300   .0018     .0019     .3657
0.1mg HA/1000μg MCWE  685.213  171.900   .00072     .00033     .6253
0.1mg HA/1500μg MCWE  552.600  140.900   .0458     .0567     .349
0.1mg HA/2000μg MCWE  574.894  151.400   .0066     .0076     .4529
a.MCWE＝如实施例I-IV中所述的分枝杆菌细胞壁提取物。
b.23E＝为阳性对照的产品序号No.Lot921123E；常规MCWE水包油悬液。
c.HA＝来自鸡冠或链球菌的透明质酸。
如表I所示，不含油的分枝杆菌细胞壁提取物几乎与传统的水包油乳剂的分枝杆菌细胞壁提取物制剂一样有效。
当然，应认识到前述只涉及本发明的优选实施方案，在不脱离本发明的精神和如所附权利要求所述范围的情况下，可以进行各种改动或变化。

Claims (6)

1.一种含分枝杆菌细胞壁提取物水悬液的组合物，其中所述分枝杆菌细胞壁提取物是水不溶的并且不含油成分和蛋白质。
2.根据权利要求1的组合物，其进一步含有葡糖氨基聚糖。
3.根据权利要求2的组合物，其中葡糖氨基聚糖是透明质酸。
4.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中分枝杆菌细胞壁提取物是从选自下组的一种细菌株制备的：分枝杆菌菌种(Mycobacterium species)、卡介苗(bacille Calmette-Guerin)、棒形细菌(Coryneform bacteria)、红球菌菌种(Rhodococcusspecies)、真杆菌菌种(Eubacterium species)和诺卡氏菌菌种(Norcardia species)。
5.根据权利要求4的组合物，其中分枝杆菌细胞壁提取物来自草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)。
6.权利要求1-5任一项的含分枝杆菌细胞壁提取物水悬液的组合物在制备刺激人或动物免疫系统的药物中的用途，其中所述分枝杆菌细胞壁提取物是水不溶的并且不含油成分和蛋白质。
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