NO322450B1 - Blanding for regulering av celleproliferasjon og celledod samt anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører blanding for regulering av celleproliferasjon og celledød samt anvendelse derav. Blandingen omfatter et mykobakterielt DNA (B-DNA) og en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori B-DNA er effektiv for indusering av en respons i responderende celler til et dyr. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt en blanding omfattende Mycobacterium phlei- DNA (M-DNA) og en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori M-DNA inhiberer proliferasjonen av og induserer apoptose i responderende celler og stimulerer responderende celler av immunsystemet til å produsere bioaktive molekyler.

Yamamoto et al., (JPN. J. Cancer Res., (1988), 79(7), 866-873) beskriver en nukleinsyrerik fraksjon ekstrahert og renset fra Mycobacterium bovis BCG (MY-1). MY-1 ble funnet å øke aktiviteten til naturlige drepeceller i villceller fra mus in vitro og produsere faktorer som viser anti-viral aktivitet og gjør normale makrofager cytotoksiske overfor tumorceller.

Shimada et al., (J. Nat. Cancer Instit. (1985), 74(3), 681-688) beskriver antitumoraktiviteten til en DNA fraksjon (MY-1) ekstrahert fra BCG. MY-1 som er en nukleinsyre-rik fraksjon ble vist å ikke innha noen direkte in vitro cytoksisitet overfor forskjellige typer av dyrkede cellelinjer og at veksten av forskjellige musetumorer ble betydelig hemmet når tumorcellene ble inokkulert sammen med MY-1 eller når gjentatte injeksjoner av MY-1 ble gitt til tumorbærende mus.

Kataoka et al., (JPN. Cancer Res. (1992), 83(3), 244-247) beskriver 45-mer og 30-mer oligonukleotider. Sekvensene ble tilfeldig selektert fra kjent cDNA kodende for tre forskjellige mykobakterielle proteiner og syntetisert. Deres biologiske aktiviteter ble testet in vitro. Seks av tretten oligonukleotider som inneholdt en heksamer paiindrom sekvens viste antitumoraktivitet, mens de andre uten palindromstruktur ikke viste denne aktiviteten.

I flercellede organismer blir antall celler i vev bestemt av celleproliferasjons-raten minus celle eliminiasjonsraten. Apoptose er en genetisk programmert, ikke-inflammatorisk, energi-avhengig form for celledød i vev som innbefatter, men er ikke begrenset til, vev fra voksne. Apoptose består av fire sekvensielle trinn: (1) betinget til død av ekstracellulære eller intracellulære triggere, (2) celledød ved aktivering av intracellulære proteaser og nukleaser, (3) inntak av den døde cellen av andre celler og (4) degradering av den døde cellen innenfor lysosomene til fagocytiske celler (Steller H. Science 267:1445-1449,1995). Avvik i regulering av celleproliferasjon, celle apoptose eller en kombinasjon av de to er assosiert med patogenesen til forskjellige sykdommer som innbefatter, men er ikke begrenset til, cancer, neurodegenerasjon, autoimmunitet og hjertedød.

Apoptose kan bli initiert av ligander som bindes til celleoverf latereseptorer som inkluderer, men er ikke begrenset til, Fas (CD95) (French et al. Journal of Cell Biology 133:355-364,1996) og tumor nekrosefaktor reseptor 1 (TNFR1). FasL binding til Fas og TNF binding til TNFR1 initierer intracellulær signalisering som resulterer i aktivering av cystein aspartylproteaser (kaspaser) som initierer den letale protelytiske kaskaden av apoptoseutførelsen som er assosiert med nukleær DNA-fragmentering, frigjøring av nukleære matriksproteiher (NuMA) og tap av celle-substratkontakt (Muzio et al. Cell 85:817-827,1996).

Apoptose kan også bli indusert av intracellulære proteiner som inkluderer, men er ikke begrenset til, p53/p21 regulatorer (Levine, A. Cell 88:323-331,1997). p53/p21 virker som en transkripsjonsfaktor for å aktivere ekspresjonen av apoptose-medierte gener, inkludert, men ikke begrenset til, gener kodende for proteiner som danner frie radikaler som dermed skader cellens mitokondrier, hvori innholdet lekker ut i cytoplasma og aktiverer apoptotiske kaskader (Polyak et al. Nature 389:300-305, 1997).

Cancer er en variant av "net" akkumulering til atypiske celler som er et resultat av omfattende proliferasjon, utilstrekkelig apoptose eller en kombinasjon av de to. Mutasjoner i apoptose-relaterte gener, men ikke begrenset til, Fas TNFR1 og p53/p21 har hver vært implikert i patogenesen til cancerformer (Levine A. Cell 88:323-331,1997; Fisher D. Cell 78:529-542,1994). Apoptose er ikke bare viktig ved patogenesen til cancer, men har også sannsynlighet for resistens overfor anti-cancer terapier.

Resistens overfor apoptoseinduksjon er vist å være en viktig kategori ved multippel medikamentresistens (MDR) og som sannsynligvis forklarer en betydelig andel av svikt ved behandling. MDR omfattende samtidig resistens overfor strukturelle og funksjonelt ikke-relaterte kjemoterapeutiske midler kan være både iboende og ervervet. Noen cancerformer reagerer aldri overfor terapi, mens andre cancerformer som innledningsvis er følsomme for terapi utvikler medikamentresistens. Idet kjemoterapeutiske midler er hovedsakelig basert på induksjon av apoptose i cancerceller for deres terapeutiske effekt fører medikamentresistens som reduserer effektiviteten til de kjemoterapeutiske midlene til direkte eller indirekte redusering av apoptosen og er generelt assosiert med dårlig prognose i forskjellige cancerformer.

Cytolyse er den fullstendige eller delvise destruksjonen av en celle og er mediert av immunsystemet. Anvendt heri er monocytter, makrofager og leukocytter inkludert i immunsystemet. Aktiverte makrofager og monocytter produserer bioaktive molekyler som akselererer, amplifiserer og modulerer responser i responderende celler tii et dyr. Ved produserer menes syntetiserer og utskiller. Disse bioaktive molekylene innbefatter, men er ikke begrenset til, cytokiner og reaktive oksygenarter.

Cytokiner, innbefatter, men er ikke begrenset til interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), interleukin-12 (IL-12) og GM-CSF. IL-12, alene og i kombinasjon med andre cytokiner, fremmer modningen av leukocytter som inkluderer, men er ikke begrenset til, B-lymfocytter, CD4+ T-celler, CD8+ T-celler og NK-celler, og induserer sekresjon av interferon-gamma. IL-12 er rapport å ha anti-canceraktivitet i noen cancerceller (Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420-421,1996; Chen et al. Journal of Immunology 159:351-359,1997). Denne aktiviteten innbefatter, men er ikke begrenset til, aktivering av spesifikke cytolytiske T-lymfocytter, aktivering av naturlige killer (NK) celler og induksjonav anti-angiogeniske proteiner IP-10 og MiG. IP-10 inhiberer cancervekst og metastaser, inhiberer cancer-indusert neovaskularisering og aktiverer videre NK-cellene (Angillo et al. Annals NY Academy of Science 795:158-165,1996). GM-CSF er rapportert å ha pro-canceraktivitet i noen cancerceller (Hawkyard et al. Journal of Urology 150:514-518,1993).

Reaktive oksygenarter innbefatter, men er ikke begrenset til, nitrogenoksid, superoksidradikaler og hydroksylradikaler. Nitrogenoksid, superoksidradikaler og hydroksylradikaler induserer apoptose og cytolyse i responderende målceller i tillegg til andre aktiviteter.

Naturlige og syntetiske preparater med biologisk og kjemisk opprinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, preparater fra bakterier, er blitt anvendt for å stimulere eller inhibere responderende celler i et dyr. Preparater av celleveggen fra Mycobacterium- arter er blitt anvendt for å behandle sykdommer som inkluderer, men er ikke begrenset til, cancerformer (US-patent nr. 4.503.048). De terapeutiske fordelene oppnådd ved anvendelse av slike preparater er variable og ikke-ensartede, og ser ut til å avhenge av fremgangsmåten hvorved preparatet blir fremstilt, renset og levert, og på stabiliteten til preparatet.

Anti-cancermidler ifølge teknikkens stand har vist seg å være utilstrekkelig for kliniske anvendelser. Mange av disse midlene er ineffektive (Bischoff et al. Science 274:373-376,1996) eller toksiske, har betydelige bivirkninger (Lamm et al. Journal of Uroiogy 153:1444-1450,1995), resulterer i utvikling av medikamentresistens og immunsensibilisering, og er ødeleggende for mottakeren. Mange av disse midlene avhenger derimot av Fas, TNFR1 eller p53/p21 for deres effektivitet.

Det er derfor et behov for et nytt terapeutisk middel som inhiberer proliferasjonen av og induserer apoptose i cancerceller og som stimulerer responderende celler i immunsystemet tii å produsere cytokiner og reaktive oksygenformer. Dette terapeutiske middel bør være nyttig som et anti-cancermiddel og som en adjuvant til andre anti-cancermidler. Med adjuvant menes nyttig med andre anti-cancermidler for å øke behandlingseffektiviteten. Et slikt terapeutisk middel bør være enkelt og relativt billig å fremstille, dets aktivitet bør være reproduserbar blant preparater, og dets aktivitet bør forbli stabil over tid og dets effekter på cancerceller bør oppnås med doseregimer som er assosiert med minimal toksisitet.

Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller overnevnte behov ved å tilveiebringe en sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter

a. Myobacterium p/e/-DNA (M-DNA), og

b. en første farmasøytisk akseptabel bærer,

hvori M-DNA har anti-cancer aktivitet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesielt en terapeutisk sammensetning omfattende et Mycobacterium pft/eADNA (M-DNA) og en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori responsene innbefatter, men er ikke begrenset til, inhibisjon av proliferasjon til og induksjon av apoptose i responderende celler som innbefatter, men er ikke begrenset til cancerceller, og stimulering av responderende celler i immunsystemet til å produsere bioaktive molekyler.

M-DNA sammensetningen er enkel og relativt billig å fremstille, dets aktivitet er reproduserbar blant preparater, den forblir stabil over tid og er effektiv ved dose-regimet som er assosiert med minimal toksisitet.

M-DNA blir fremstilt fra intakt Mycobacterium phlei ( M. phlei) ved spaltning med lysozym, proteinase K og natrium dodecylsulfat, og fenolekstrahering og etanolpresipitering ( M. ptøeADNA). Alternativt blir M-DNA fremstilt ved ødelegging av M. phlei, samling av de faste komponentene og fremstilling av et M-DNA-Af. phlei ce\ le-veggkompleks (MCC). DNase-frie reagenser blir anvendt for å minimalisere M-DNA degradering i løpet av prepareringen. M-DNA blir fremstilt fra MCC ved fenolekstrahering og etanolpresipitering (MCC-DNA).

M-DNA sammensetningen, omfattende M-DNA og en første farmasøytisk akseptabel bærer, blir administrert til et dyr i en dose som er tilstrekkelig for å inhibere proliferasjonen av og indusere apoptose i responderende celler, og stimulerer responderende celler i immunsystemet til å produsere bioaktive molekyler. Slike første farmasøytiske akseptable bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, flytende bærere, faste bærere og begge. Flytende bærer innbefatter, men er ikke begrenset til, vandige bærere, ikke-vandige bærere eller begge. Faste bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, kjemisk syntetiserte bærere og naturligere bærere. Vandige bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, vann, saltvann og fysiologiske buffere. Ikke-vandige bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, oljer eller andre hydrofobe flytende formuleringer og liposomer. Naturlige bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, deproteinisert, delipidert, vasket M. phlei cellevegg, hvori M-DNA er koplet til M. phlei celleveggen (MCC).

M-DNA sammensetningen kan videre bli administrert i en andre farmasøytisk akseptabel bærer. Slike andre farmasøytisk akseptable bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, flytende bærere og faste bærere. Igjen innbefatter flytende bærere vandige bærere, ikke-vandige bærere eller begge. Igjen innbefatter faste bærere kjemisk syntetiserte bærere og naturlige bærere.

M-DNA sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig for forhindring, behandling og eliminering av en sykdom. Den er spesielt nyttig for behandling av en sykdom mediert av uønsket og ukontrollert celleproliferasjon, så som en cancer. M-DNA blandingen er også effektiv som et tillegg til å forsterke effektiviteten til andre anti-cancermidler. Slike midler innbefatter, men er ikke begrenset til, medikamenter, immunstimulerende midler, antigener, antistoffer, vaksiner, bestrålingsmidler og kjemoterapeutiske midler, genetiske midler, biologisk omkonstruering og kjemisk syntetiserte midler, og midler som søker celledødmolekyler for aktivering eller inaktivering og som inhiberer proliferasjonen av og induserer apoptose i responderende celler.

Det er følgelig en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en sammensetning.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 1, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteten til M-DNA er inhibisjon av proliferasjon av cancerceller.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 1, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteten til M-DNA er unduksjon av apoptose i cancerceller.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krev 1, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteten til M-DNA er stimulering av cytokinproduksjonen av celler av immunsystemet.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den første farmasøytisk akseptable bæreren er valgt fra gruppen bestående av en vandig bærer, en ikke-vandig bærer og en Mycobacterium phlei ( M. phlei) cellevegg.|

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 5, kjennetegnet ved at den første farmasøytisk akseptable bæreren er M. Phlei cellevegg.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe sammensetning ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den videre omfatter en andre farmasøytisk akseptabel bærer, hvori den andre farmasøytisk akseptable bæreren er valgt fra gruppen bestående av en vandig bærer og en ikke-vandig bærer.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter

a. M-DNA,

b. M. phlei cellevegg, hvori M-DNA er konservert og kompleks bundet på

M. phlei celleveggen (MCC) og,

c. en farmasøytisk akseptabel bærer,

hvori MCC har anti-cancer aktivitet.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 8, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er inhibisjon av proliferasjon av cancerceller.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 8, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteter til MCC er induksjon av apoptose i cancerceller.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 3 eller 10, kjennetegnet ved at induksjon av apoptose i cancerceller er uavhengig av en faktor valgt fra gruppen bestående av Fas, p53/p21 og medikamentresistens.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 3 eller 8, kjennetegnet ved at induksjon av apoptose i cancerceller er induksjon av caspase-3 aktivitet i cancerceller.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 8, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er stimulering av cytokinproduksjon av celler i immunsystemet.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 4 eller 13, kjennetegnet ved at cellene i immunsystemet er valgt fra gruppen bestående av makrofager, og monocytter.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe sammensetninger ifølge krav 4 eller 13, kjennetegnet ved at cytokinet er valgt fra gruppen bestående av IL-6, IL-10 og IL-12.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 1 eller 8, kjennetegnet ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er stimulering av reaktiv oksygen-art-produksjon av cellene i immunsystemet.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sammensetning ifølge krav 16, kjennetegnet ved at cellene i immunsystemet er makrofager.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelse av en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-17 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cancer i et dyr.

Disse og andre hensikter, trekk og fordeler ifølge foreliggende oppfinnelse vil fremgå med en gjennomgang av følgende detaljerte beskrivelse og beskrevne utførelsesform og vedlagte krav.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1. Oligonukleotidfordeling av M. phlei- DNA og MCC-DNA.

Fig. 2. Inhibisjon av proliferasjon til HT-1376. HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60, HL-60 MX-1 cancerceller til M. phlei- DNA (2A) og MCC-

DNA (2B), kalvetymus-DNA (2A & 2B) og sildesperm-DNA (2A & 2B). Resultater er gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 3. Inhibisjon av proliferasjon av HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60, HL-60 MX-1 cancerceller ved MCC. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter.

Fig. 4. Inhibisjon av proliferasjon til humane leukemi THP-1 monocytter

til M. phlei- DUA, MCC-DNA, MCC og hlL-12. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter.

Fig. 5. Inhibisjon av proliferasjon til HT-1197 (5A) og HT-1376 (5B) humane blærecancercelier til MCC og LPS. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 6. Induksjon av DNA-fragmentering i humane leukemi THP-1 monocytter ved PBS, sildesperm-DNA og ubehandlet og DNase I behandlet M. phlei-DNA og MCC. Resultater vist er for 1 av 3 eksperimenter og hver ga lignende resultater. Fig. 7. Induksjon av DNA-fragmentering i humane leukemi THP-1 monocytter av PBS, ubehandlet og DNase I behandlet sildesperm-DNA og M. phlei-DNA og av hlL-12. Resultater vist er for 1 av 3 eksperimenter som hver ga lignende resultater. Fig. 8. Induksjon av DNA-fragmentering i HT-1197 (8A) og HT-1376 (8B) humane blærecancercelier til MCC og hlL-12. Resultatene vist er for 1 av 3 eksperimenter som hver ga lignende resultater. Fig. 9. NuMA-frigjøring fra humane leukemi THP-1 monocytter ved MCC, M. phlei- DNA, MCC-DNA og laksesperm-DNA. Resultatene er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 10. NuMA-frigjøring fra humane leukemi THP-1 monocytter av ubehandlet og DNase behandlet M. phlei- DHA, MCC-DNA og MCC. Resultatene er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 11. NuMA-frigjøring fra HT-1376 og HT-1197 humane blærecancercelier med økende konsentrasjon av MCC. Resultatene er gjennomsnitt SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 12. NuMA-frigjøring fra HT-1197 (12A) og HT-1376 (12B) humane blærecancercelier med 1 ug/ml MCC eller med 100 ug/ml MCC over 481. Resultatene er gjennomsnitt SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 13. NuMA-frigjøring fra Jurkat-celler inkubert med PBS, CH-11 antistoffer, ZB4 antistoffer, M. p/j/eADNA; CH-11 antistoffer + M. p/j/eADNA og ZB4 antistoffer + M. p/j/eADNA. Fig. 14. NuMA-frigjøring fra humane leukemi THP-1 monocytter av PBS, M. p/7/eADNA, sonikert, BsftJ 1 spaltet, autoklavert og metylert M. ph/eADNA. Fig. 15. Anti-canceraktivitet til MCC og DNase I behandlet MCC i linje 10 hepatom i marsvin. Resultater er gjennomsnitt ± SD av 7 dyr i hver eksperiment-gruppe. Fig. 16. Prosent LDH-frigjøring fra HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier som en indikator på MCC cytotoksisitet. Resultatene er gjennomsnitt SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 17. MCC stimulering av IL-12 og GM-CSF produksjon av HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier, humane THP-1 monocytter, murine makro-fagen murine RAW 264.7 monocytter og murine miltceller. Resultatene er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Fig. 18. Effekt av antistoffer mot CD14 reseptorer på MCC-DNA og på MCC induserte IL-12 produksjon av humane THP-1 monocytter. Fig. 19. Effekt av cytokalasin D på M. p/7/eADNA, MCC-DNA og MCC stimulerte IL-12 av humane THP-1 monocytter. Fig. 20. Effekt av ubehandlet og DNase behandlet MCC-DNA, MCC og Regressin<®> på IL-12 produksjonen av murine makrofager. Fig. 21. MCC-stimulering av NO-produksjon av murine RAW 264.7 monocytter. Fig. 22. Stimulering av IL-6, IL-10, IL-12 og GM-CSF i CD-1 mus ved intraperitoneal injeksjon av 50 mg/kg MCC. Fig. 23. Stimulering av IL-12 produksjon i CD-1 mus ved intravenøs injeksjon av 6,6 mg/kg MCC.

Fig. 24. Stabiliteten til MCC i løpet av lagring i 6 måneder.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en terapeutisk sammensetning, omfattende en bakteriell deoksyribonukleinsyre (DNA) og en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori blandingen er effektiv for indusering av en respons i responderende celler til et dyr, inkludert et menneske. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt en sammensetning omfattende et myobakterielt DNA (B-DNA) og en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori blandingen er effektiv for indusering av en respons i responderende celler til et dyr. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt en sammensetning omfattende M. p/7/eADNA (M-DNA) og en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori blandingen er effektiv for inhibering av proliferasjonen og indusering av apoptosen i responderende celler, og for stimulering av responderende celler i immunsystemet til å produsere bioaktive molekyler.

M-DNA sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse er enkel og relativt billig å fremstille og dets aktivitet er reproduserbar blant preparater og forblir stabil over tid. Videre er den minimalt, eller i det hele tatt ikke toksisk for mottakeren og forårsaker ikke en positiv tuberkulinreaksjon i mottakeren og forårsaker sjelden en anafylaktisk respons i mottakeren selv ved gjentatt administrering.

Mange bakterielle arter kan bli anvendt for å praktisere foreliggende oppfinnelse inkludert, men ikke begrenset til, Coryneform bakteriell, Corynebacterium arter, Rhodococcus arter, Eubacterium arter, Bordetella arter, Escherichia arter, Listeria arter, Nocardia arter og Mycobacterium arter. Bakteriell DNA blir fortrinnsvis fremstilt fra en Mycobacterium art, inkludert, men ikke begrenset til, M. phlei, M. smegmatis, M. fotuitum, M. kansaasii, M. tuberculosis, M. bovis, M. vacciae og M. avium. Det er foretrukket at mykobakteriell-DNA blir fremstilt fra Mycobacterium arten M. phlei.

Fremgangsmåter for å øke den terapeutiske aktiviteten til M-DNA innbefatter, men ikke begrenset til, kjemisk supplementering eller bioteknologiske amplifiserings-stimulerende sekvenser eller bekreftelser på DNA avledet fra samme eller forskjellige bakterielle arter, eller anvendelse av bakterielle plasmider inneholdende hensiktsmessige stimulatoriske sekvenser eller bekreftelser på DNA avledet fra samme eller forskjellige bakterielle arter. Andre fremgangsmåter for å øke den terapeutiske aktiviteten til M-DNA innbefatter, men ikke begrenset til, kopling av M-DNA til syntetiske eller biologiske bærere eller kopling av M-DNA til vev-type eller celle-type rettete ligander eller antistoffer.

M-DNA er tilveiebragt i en første farmasøytisk akseptabel bærer som kan bli fremstilt ved å bringe M-DNA sammen med dets bærer. Det er foretrukket at M-DNA blandingen blir fremstilt ved jevnt og intim sammenbringing av M-DNA med en flytende bærer, med en fast bærer eller med begge. Flytende bærere innbefatter, men er ikke begrenset til, vandige bærere, ikke-vandige bærere eller begge. Faste bærere innbefatter, men ikke begrenset til, kjemisk syntetiserte og naturlige bærere.

For administrering i en vandig bærer blir M-DNA suspendert i vann, saltvann eller i en farmasøytisk akseptabel buffer ved hjelp av teknikker som innbefatter, men ikke begrenset til, blanding, sonikering og mikrofluidisering.

For administrering i en ikke-vandig bærer blir M-DNA emulgert med en nøytral olje så som, men ikke begrenset til, et diglyserid, et triglyserid, et fosfolipid, et lipid,

en olje og blandinger derav, hvori oljen inneholder en hensiktsmessig blanding av polyumettede og mettede fettsyrer. Eksempler innbefatter, men ikke begrenset til, soyabønneolje, kanolaolje, palmeolje, olivenolje og myglyol, hvori antall fettsyre-karboner er mellom 12 og 22 og hvori fettsyrene kan være mettede eller umettede. Eventuelt kan ladet lipid eller fosfolipid bli suspendert i den nøytrale oljen.

For administrering i en nøytral bærer så som, men ikke begrenset til, MCC blir M-DNA konservert og koplet til M. phlei celleveggen i løpet av preparering av MCC. I MCC er mengden av M-DNA anriket i forhold til mengden av M-DNA i en intakt M. phlei celle, og M-DNA er mer mottagelig for responderende celler enn M-DNA innenfor den intakte M. phlei cellen. Det er å bemerke at fremgangsmåtene.beskrevet for anvendelse av M-DNA kan også bli anvendt for MCC.

M-DNA sammensetningen, omfattende M-DNA og en første farmasøytisk akseptabel bærer kan videre bli administrert i en andre farmasøytisk akseptabel bærer. M-DNA sammensetningen og andre farmasøytisk akseptable bærerformuleringer kan bli fremstilt ved ensartet og intim assosiasjon av M-DNA blandingen med en flytende bærer, med en fast bærer eller med begge. Flytende bærere innbefatter, men ikke begrenset til, vandige bærere, ikke-vandige bærere eller begge. Faste bærere innbefatter, men ikke begrenset til, kjemisk syntetiserte bærere og naturlige bærere.

Både M-DNA og M-DNA-sammensetningen kan bli administrert som en oljeemulsjon, vann i oljeemulsjon eller vann-i-olje-i-vann emulsjon. Videre kan de bli administrert i bærere som innbefatter, men ikke begrenset til, liposomer, sete-spesifikke emulsjoner, lang-resistens emulsjoner, klebrige emulsjoner, mikroemulsjoner, nanoemulsjoner, mikropartikler, mikrosfærer, nanosfærer, nanopartikler og minipumper, og forskjellige naturlige eller syntetiske polymerer som . muliggjør vedvarende frigjøring av M-DNA, idet minipumper eller polymerer blir implantert i nærheten av hvor medikamentlevering er påkrevd. Polymerer og anvendelse derav er f.eks beskrevet i Brem et al. (Journal of Neurosurgery 74:441-446,1991). I tillegg kan M-DNA og M-DNA-blandingen bli anvendt med hvilke som helst, alle eller en hvilken som helst kombinasjon av eksipienter uansett første farmasøytisk akseptabel bærer eller andre farmasøytisk akseptabel bærer anvendt for å presentere M-DNA for responderende celler. Deres eksipienter innbefatter,

men ikke begrenset til, antioksidanter, buffere og bakteriostater og kan innbefatte suspenderingsmidler og fortykningsmidler.

Uten å være bundet av følgende hypotese antas det at de terapeutiske effektene til M-DNA innbefatter, men er ikke begrenset til, initiering av intracellulær signalisering som resulterer i apoptose av responderende celler, og stimulering av cytokin og reaktiv oksygenform produksjon som resulterer i cytolyse og i apoptose av responderende celler. Apoptose og cytolyse, begge individuelt og i kombinasjon, har begge anti-canceraktivitet og samhørende aktivitet. M-DNA-sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt alene som et anti-cancermiddel eller kan bli anvendt før, på samme tid eller etter et annet anti-cancermiddel for å øke behandlingseffektivitet.

M-DNA-blandingen blir administrert i en mengde som er effektiv for å indusere en terapeutisk respons. Dosering av M-DNA som blir administrert vil avhenge av tilstanden som blir behandlet, den bestemte formuleringen og andre kliniske faktorer så som vekt og betingelsene for mottakeren og administreringsveien. Mengden av M-DNA som blir administrert er fra omtrent 0,00001 mg/kg til omtrent 100 mg/kg pr dose, fortrinnsvis fra omtrent 0,0001 mg/kg til omtrent 50 mg/kg pr dose og mest foretrukket er fra 0,001 mg/kg til omtrent 10 mg/kg pr dose.

Når M-DNA blir administrert som MCC er DNA-innholdet av MCC fortrinnsvis mellom omtrent 0,001 mg DNA/100 mg tørr MCC og omtrent 90 mg DNA/100 mg tørr MCC, mer foretrukket er mellom omtrent 0,01 DNA/100 mg tørr MCC og omtrent 40 mg DNA/100 mg tørr MCC, mest foretrukket er mellom omtrent 0,1 mg DNA/100 mg tørr MCC og omtrent 30 mg DNA/100 mg tørr MCC. Det er videre foretrukket at proteininnholdet til M. phlei celleveggen er mindre enn omtrent 2 mg/100 mg tørr MCC og fettsyreinnholdet mindre enn omtrent 2 mg/100 mg tørr MCC.

Videre, når M-DNA blir administrert som MCC er mengden av MCC fortrinnsvis fra omtrent 0,0001 mg/kg til omtrent 100 mg/kg pr dose, mer foretrukket fra omtrent 0,0001 mg/kg til omtrent 50 mg/kg MCC pr dose og mest foretrukket fra omtrent 0,001 mg/kg til omtrent 10 mg/kg MCC pr dose.

Administrasjonsveier innbefatter, men ikke begrenset til, oral, topisk, subkutan, intra-muskulær, intra-peritoneal, intra-venøs, intra-dermal, intra-tekal, intra-lesjonal, intra-tumoral, intra-blære, intra-vaginal, intra-okular, intra-rektal, intra-pulmonal, intra-spinal, transdermal, subdermal, plassering innenfor kroppshul-rommet, nasal inhalering, lunge inhalering, impresjon i hud og elektrokorporasjon.

Avhengig av administrasjonsveién er volum pr dose fortrinnsvis omtrent 0,001 ml til omtrent 100 ml pr dose, mer forretrukket er omtrent 0,01 ml til omtrent 50 ml pr dose og mest foretrukket er omtrent 0,1 ml til omtrent 30 ml pr dose. M-DNA-sammensetningen kan bli administrert i enkel dosebehandling eller i flere-dose behandlinger i et skjema og over en tidsperiode som er hensiktsmessig for cancer-formen som blir behandlet, tilstanden til mottakeren og. administrasjonsveién.

Administrering av M-DNA er ikke en immuniseringsprosess, men en terapeutisk behandling som forhindrer, behandler eller eliminerer en sykdom inkludert, men ikke begrenset til, cancer. En slik cancer innbefatter, men er ikke begrenset til, skvamøs cellekarsinom, fibrosarkom, sarkoid karsinom, melanom, brystcancer, lungecancer, kolorektalcancer, nyrecancer, osteosarkom, kutan melanom, basal cellekarsinom, bukspyttkjertelcancer, blærecancer, ovariecancer, leukemi, lymfom og metastaser avledet derifra.

MCC beholder effektiviteten etter sonikering og autoklavering, som reduserer M-DNA baseparlengden, og etter GpC metylering, som negliserer aktiviteten tii palindrom oligonukleotidsekvens, purin-puirn-C-G-pyrimidin-pyrimidin.

Den uventede og overraskende evnen som M-DNA har til å indusere apoptose i forskjellige cancercellelinjer innbefatter, men er ikke begrenset til, Fas unormal, p52/21 unormal og medikamentresistente cancercellelinjer beskriver et lenge ikke-tilf redsstilt behov innen medisinske områder, og tilveiebringer en viktig fordel for dyr, inkludert mennesker.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse ytterligere.

Eksempel 1

Fremstillling av MCC fra Mycobacterium phlei

MCC ble fremstilt fra Mycobacterium phlei (stamme 110). M. phlei ble

oppnådd fra Institut fur Experimental Biologie and Medizin, Borstel, Tyskland, og ble lagret som en suspensjon i steril melk ved -60°C. M. phlei ble dyrket på Petragnani medium (Difco Labs, Detroit, Ml) og ble dyrket i Bacto AC kraft (Difco Labs) i 10 til 20 dager. Cellene ble høstet ved sentrrfugalsedimentering. Alle reagensene anvendt i følgende prosedyre ble valgt for å forsterke konservering av M. phlei DNA. . Omtrent 400 g av fuktig cellemasse ble plassert inn i en autoklavert blander med en kapasitet på omtrent 1200 ml. Cellemassen ble blandet i høy hastighet i mellom 30 til 60 sek. Etter blanding ble 6 ml DNase-fri Tween 80 (Sigma Chemical., St. Lous, MO) og mellom 200 og 400 ml autoklavert vann tilsatt til celleblandingen. Hele cellesuspensjonen ble på ny blandet i blanderen ved tav hastighet ved omtrent 10 sek.

Celleødeleggelse ble oppnådd ved sonikering. Fem hundre ml cellesuspen-sjon, hvori cellene omfattet omtrent 50 volum% til 70 volum%, ble plassert i en autoklavert beholder på en liter og sonikert. Sonikatet ble lagret i en autoklavert flaske på is i løpet av fraksjoneringsprosessen. Celler som ikke er blitt brutt opp ble fjernet ved sentrifugering i lav hastighet. Supematanten fra sentrifugeringen med lav hastighet ble sentrifugert i 11 ved 27.500 g ved 15°C og supematanten fra denne sentrifugeringen ble kastet.

Sedimenter f ra 27.000 g sentrifugeringen ble overført til en autoklavert blander og suspendert i autoklavert deionisert vann ved blanding med lav hastighet. Denne suspensjonen ble på nytt sentrifugert ved 27.000 g ved 15°C i 11 og supematanten ble på ny kastet. Sedimentet ble suspendert i autoklavert deionisert vann og sentrifugert i 5 min ved 350 g for å sedimentere eventult gjenværende ikke-ødelagte celler. Supematanten ble dekantert og sentrifugert ved 27.000 g i 11 ved 15°C for å sedimentere den rå celleveggfraksjonen.

Den rå celleveggfraksjonen ble deproteinisert ved spaltning med proteolytiske enzymer og det ble forsøkt å anvende DNase-frie reagenser hvor det var mulig for å optimalisere mengden av DNA i preparatet og konservere strukturen av DNA i preparatet. Den rå celleveggfraksjonen avledet fra omtrent 400 g hele celler ble suspendert i 1 liter 0,05 M DNase-fri Tris-HCI, pH 7,5, ved blanding ved en lav hastighet. Etter at den rå celleveggfraksjonen har blitt grundig suspendert ble 50 mg DNase-fri trypsin (Sigma Chemical Co) tilsatt og suspensjonen ble omrørt ved anvendelse av en magnetisk rørestav ved 35°C i 61. Etter trypsinbehandling ble 50 mg DNase-fri pronase (Amersham Canada Limited, Oakville, Ontario) tilsatt til hver liter trypsin-behandlet rå celleveggsuspensjon. Suspensjonen ble omrørt ved anvendelse av en magnetisk rørestav i 12 til 181 ved 35°C.

Etter protolytisk spaltning ble den rå celleveggfraksjonen delipidert med detergent og fenol. Til hver liter suspensjon ble 60 g DNase-fri urea (Sigma Chemical Co.), 2,0 ml DNase-fri 100% fenol eller 150 ml 90% v/v fenol (Sigma Chemical Co.) tilsatt. Flasken inneholdende suspensjonen ble forsiktig tildekket med aluminiumfolie, varmet til 60°-80°C og omrørt i 11. Suspensjonen ble sentrifugert i 10 min ved 16.000 g. Supernatantfraksjonen og fluidet under pelleten ble fjernet. Pelleten bie vasket 3 ganger ved suspensjon i omtrent 1 liter autoklavert deionisert vann og sentrifugert i 10 min ved 16.000 g.

Vasket, deproteinisert, delipidert MCC ble lyofilisert ved overføring av suspensjon til en autoklavert lyofiliseringsflaske med en liten mengde autoklavert vann. En 300 ml lyofiliseringsflaske ble anvendt for hver 30 gr våt cellekompleks av utgangsmaterialet. MCC-suspensjonen ble kaldfrosset ved rotering av flasken i etanol avkjølt med fast karbondioksid. Etter at innholdet av flasken var blitt frosset, ble flasken koplet til en lyofiliseringsapparatur (Virtis Co. Inc., Gardiner, NY) og lyofilisert. Etter lyofilisering ble prøven overført til en autoklavert beholder med skru-lokk og lagret ved -20°C i en desikatorbeholder inneholdende vannfri kalsiumsulfat.

Dersom ikke annet er angitt ble lyofilisert MCC resuspendert i autoklavert deionisert vann eller i en farmasøytisk akseptabel DNase-fri buffer så som, men ikke begrenset til, saltvann og PBS, og emulgert ved sonikering. Eventuelt ble den emulgerte MCC-blandingen homogenisert ved mikrofluidisering ved 15.000-30.000 psi ved en gjennomstrømning. MCC-suspensjonen ble enten bearbeidet under aseptiske betingelser eller ble sterilisert ved autoklavering.

Eksempel 2

Rensning av M-DNA fra MCC og fra M. phlei

MCC ble fremstilt som i eksempel 1. M-DNA ble renset fra MCC (MCC-DNA) ved fenol/kloroform/isoamyl alkoholekstrahering og etanol presipitering (Short Protocols i Molecular Biology, 3rd Edition, Ausubel et al. Eds., John Wiley & Sons Inc., New York, USA). Vi oppdaget uventet at minst omtrent 3,6% av tørrvekten til MCC er ekstraherbar M-DNA.

M-DNA ble renset fra M. phlei ( M. phlei- DNA) ved suspendering av M. phlei (stamme 110) i 5 ml DNase-fri 50 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, pH 8,0, tilsetning av DNase-fri lysozym (Sigma Chemical Co.) til en konsentrasjon på 1 mg/ml og inkubering i 90 min ved 37°C. DNase-fri Proteinase K (Life Technologies, Burlington, Ontario, Canada) ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml, DNase-fri natriumdodecylsulfat (BioRad, Richmond, CA) ble tilsatt til en konsentrasjon på 1% og inkubasjonen ble fortsatt i 10 min ved 65°C. M-DNA ble fenol/kloroform/isoamyl alkohol ekstrahert og etanol presipitert.

Dersom ikke annet er angitt ble M-DNA sonikert i autoklavert deionisert vann eller i en DNase-fri farmasøytisk akseptabel buffer så som, men ikke begrenset til, saltvann og PBS. MCC, MCC-DNA og M. pri/ef-DNA inneholder ikke endotoksiner som det fremgår ved anvendelse av et Limulus amebocyttlysat QCL-1000 sett (BioWhittaker, Walkersville, MD).

Eksempel 3

Fremstilling av bakteriell-DNA-bakteriell celleveggkompleks og bakterielt DNA fra andre bakterielle arter.

Bakterielt DNA-bakteriell celleveggkompleks blir fremstilt fra M. smegmatis, M. fortuitous, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Cornybacterium parvum, M. kansaasii, M. tuberculosis og M. bovis som i eksempel 1. Bakteriell-DNA blir renset fra bakterielt DNA-bakteriell celleveggkompleks og fra intakte bakterier som i eksempel 2.

Eksempel 4

DNase behandling

MCC-DNA, M-phlei-DNA og MCC, hver inneholdende 1 ug M-DNA og Regressin<®> (US-patent nr. 4.744.9840) ble spaltet med 1 internasjonal enhet (IU) RNase-fri NDase I (Life Technologies) i 11 ved 25°C i 20 mM Tris HCI, pH 8,4, 2 mM MgCI2 og 50 mM KCI. DNase I ble inaktivert ved tilsetning av EDTA til en sluttkonsentrasjon på 2,5 mM og oppvarming i 10 min ved 65°C. DNase I spalter både enkelttrådet og dobbelttrådet DNA. Spaltning med DNase I resulterer i nesten total degradering av DNA. Regressin<®> (Bioniche, Inc. London, Ontario, Canada) er en formulering inneholdende 1 mg mykobakterielt celleveggekstrakt, 20 uJ mineralolje NF i 1 ml PBS og 0,5% v/v Tween 80.

Eksempel 5

Sammenligning av MCC-DNA og M. pft/eADNA

MCC-DNA og M. phlei- DNA ble elektroforesekjørt i en 5% agarosegel (3t; 100 V) ved anvendelse av prosedyrer kjent for fagfolk innenfor dette området. Mblekyl-vektsfordelingen av DNA ble analysert med gelfotoscanning ved anvendelse av 1D Main Program programvare (Advance American Biotechnology, Fullerton, CA).

Som vist i fig. 1 inneholder M. phlei- DNA et bredt spekter av oligonukleotider mellom omtrent 5 og mellom 10.000 basepar (bp), samt genomisk DNA (>12.000 bp). MCC-DNA inneholder en rekke oligonukleotider mellom omtrent 5 og omtrent 250 basepar, 1 hovedtopp ved omtrent 40 basepar og lite genomisk DNA.

Eksempel 6

Celler og reagenser

Alle cellelinjer, unntatt OC2 og SW260 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og ble dyrket i medium anbefalt av ATCC. OC2 og SW260 ble oppnådd fra Dr. J.K. Collins (University College Cork, Cork, Irland) og ble dyrket i DMEM medium suppiementert med 10% FCS. Tabell 1 viser cellelinjer, deres opprinnelse og egenskaper.

Murine makrofager ble oppnådd fra hunn CD1 mus injisert intraperitonealt med 1,5 ml steril Brewers tioglykolatkraft (Difco, Detroit, Ml). Peritonealeksudatet (>85% makrofager) ble høstet på dag 4, vasket ved sentrifugering i HBSS og dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin og 20 mM HEPES (Life Technologies). Cellene ble latt adherere i 181 hvoretter ikke-adherente celler ble fjernet ved forsiktig vasking med varmt medium.

Murine miltceller ble dannet ved forsiktig føring gjennom sterile rustfrie stål-sikter. Cellesuspensjoner ble belagt på Lympholyte-M celle separasjonsmedium (CedarLane, Hornby, Ontario, Canada) og sentrifugert ved 2200 rpm i 30 min for å fjerne røde blodceller og døde celler. Disse cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium . supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin og 20 mM HEPES (Life Technologies).

Dersom ikke annet er angitt ble cellene sådd ut i 6-brønn flatbunnet vevs-kulturskåler i konsentrasjoner på mellom 3 X 10s og 10<6> celler/ml og ble opprettholdt ved 37°C i en 5% C02 atmosfære.

Kalvetymus-DNA, sildesperm-DNA og Escherichia coti lipopolysakkarid (LPS) ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. Rekombinant human IL-12 (hlL-12) ble oppnådd fra R&D Systems (Minneapolis, MN).

Eksempel 7

Inhibisjon av celleproliferasjon

Celleproliferasjonen ble bestemt ved anvendelse av dimetyltiazol-difenyltetrazoliumbromid (MTT) reduksjon (Mosman et al. Journal of Immunological Methods 65:55-63,1983). 100 pj MTT (Sigma-Aldrich) oppløst i PBS ved 5 mg/ml ble tilsatt til skålbrønnene. Etter 41 ble syre-isopropanol, 1 ml 0,04 N HCI i isopropanol tilsatt og redusert MTT ble målt ved en bølgelengde på 570 nm.

HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 og HL-60 MX-1 celler ble inkubert i 241 med fra 0 ug/ml til 10 |ig/ml M. ptøeADNA, MCC-DNA, sildesperm-DNA og kalvetymus-DNA. M. phlei- DNA (fig. 2A) og MCC-DNA (fig. 2B) inhibisjonsproliferasjon i hver av cancercellelinjene testet på en dose-avhengig måte, mens sildesperm-DNA (fig. 2A og 2B) og kalvetymus-DNA (fig. 2A og 2B) inhiberte ikke proliferasjonen av noen av de testede cellelinjene.

HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurtcat, HL-60 og HL-60 MX-1 cellene ble inkubert i 241 med fra 0 ug/ml til 10 ug/ml MCC. MCC inhiberte proliferasjonen i hver av cancercellelinjene som ble testet på en dose-avhengig måte (fig. 3).

Humane leukemi THP-1 monocytter ble inkubert i 241 med fra 0 ug/ml til 10 Hg/ml M. phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og hlL-12. M. phlei- DNA, MCC-DNA og MCC inhiberte proliferasjonen på en dose-avhengig måte. hlL-12 inhiberte ikke proliferasjonen (fig. 4).

HT-1197 (fig. 5A) og HT-1376 (fig. 5B) humane blærecancercelier ble inkubert i 201 med fra 0 til 100 ug/ml MCC og LPS. MCC inhiberte proliferasjonen. LPS inhiberte ikke proliferasjonen.

M. phlei- DNÅ, MCC-DNA og MCC, hvori den første farmasøytisk akseptable bæreren er M. phlei celleveggen, inhiberte proliferasjonen til hver av cancercellelinjene som ble testet. LPS derimot, som ér ét uspesifikt immunstimulerende middel rapportert å indusere apoptose i noen cancercellelinjer (Izquierdo et al. Anticancer Drugs 7:275-280 1996); hlL-12, som er et cytokin rapportert å indusere apoptose i noen cancercellelinjer (Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420-421, 1996) og DNA fra kalvetymus og sildespermier inhiberer ikke proliferasjonen av noen av de testede cancercellelinjene. Disse data viser at M-DNA er ansvarlig for inhibisjon av proliferasjonen i cancercellelinjer som er blitt testet og at andre DNA (sildesperm-DNA og kalvetymus-DNA) ikke kan erstatte M-DNA. Disse data viser også at M-DNA inhibisjonen til celleproliferasjonen ikke er et resultat av uspesifikk immunstimulering (LPS) eller fra cytokinaktiviteten (hlL-12). Blant cancerceller som blir inhibert er p53/p21 unormale og medikamentresistente HT-1376 humane blærecancercelier og atypiske medikamentresistente HL-60 MX-1 humane promyelo-cytiske. leukemiceller.

Eksempels Induksjon av apoptose som indikert ved DNA-fragmentering

Fragmentering av cellulært DNA til nukleosom-størrelses fragmenter er karakteristiske for celler som undergår apoptose. Nukleosom-størrelse fragmenter er DNA-fragmenter som har en forskjell på omtrent 200 base-par i lengde bestemt ved agarose gel elektroforese (Newell et al. Nature 357:286-289,1990). For å vurdere DNA-fragmentering ble ikke-adherente celler samlet ved sentrifugering ved 200 g i 10 min. Pelleter fra ikke-adherente celler og gjenværende adherente celler ble lysert med 0,5 ml hypotonisk lyseringsbuffer (10 mM Tris buffer, 1 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, pH 7,5). Lysatene ble sentrifugert ved 13.000 g i 10 min og supematanter, inneholdende fragmentert DNA, ble presipitert over natt ved -20°C i 50% isopropanol og 0,5 M NaCI. Presipitater ble samlet ved sentrifugering og analysert ved elektroforese i 0,7% agarose geler i 31 ved 100 V.

Suspensjonskuttur av humane leukemi THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med PBS og med 1 ug/ml ubehandlet eller DNase I behandlet Af. phlei- DNA og MCC og med ubehandlet sildesperm-DNA (fig. 6). M. phlei- DNA (kolonne 2) og MCC (kolonne 4) induserte betydelig DNA-fragmentering, men mens PBS (kolonne 1), DNase I behandlet M. phlei- DNA (kolonne 3), DNase I behandlet MCC (kolonne 5) og sildesperm-DNA (kolonne 6) induserte ikke DNA-fragmentering. En 123-bp DNA stige (Life Technologies) ble anvendt for å bestemme molekylvekten til nukleosom-størrelse DNA fragmenter (kolonne L).

En suspensjonskuttur av THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med PBS og med 1 ug/ml ubehandlet eller DNase I behandlet M. phlei- DNA og sildesperm-DNA og med hlL-12 (fig. 7). M. phlei- DNA indusert betydelig DNA-fragmentering (kolonne 5) , mens DNase I behandlet M. p/jfeADNA (kolonne 4) sildesperm-DNA (kolonne 3), DNase I behandlet sildesperm-DNA (kolonne 2), hlL-12 (kolonne 1) og PBS (kolonne

6) induserte ikke DNA-fragmentering. En 123-bp DNA-stige (Life Technologies) ble anvendt for å bestemme molekylvekten til nukleosom-størrelse DNA-fragmenter

(kolonne L).

HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier ble inkubert i 481 med 1 ug/ml MCC eller med hll_-12 (fig. 8). MCC induserte betydelig DNA-fragmentering i ikke-adherente HT-1197 (fig. 8A, kolonne 2) og HT-1376 (fig. 8B, kolonne 2) celler, men ikke i adherente HT-1197 (fig. 8A, kolonne 3) og HT-1376 (fig. 8B, kolonne 3) celler. PBS (fig. 8A & 8B, kolonne 5), hlL-12 (fig. 8A & 8B, kolonne 4), DNase I-behandlet MCC (fig. 8A & 8B, kolonne 7) og ubehandlede celler (fig. 8A & 8B, kolonne 1) induserte ikke-fragmentering i ikke-adherente HT-1197 eller HT-1376 celler. En 123-bp DNA-stige (Life Technologies) ble anvendt for å bestemme molekylvekten til nukleosom-størrelse DNA-fragmenter (fig. 8A & 8B, kolonne L). M. phlei- DNA og MCC, hvori M-DNA er bevart og bundet til M. phlei celleveggen, induserte apoptose i humane leukemiske THP-1 monocytter og i HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier, mens sildesperm-DNA, hlL-12 og DNase I behandlet M. phlei DNA og MCC og induserer ikke apoptose i disse cellene. Disse data viser at M-DNA er ansvarlig for induksjon av apoptose i cancercellelinjer som er blitt testet, og at oligonukleotider av M-DNA må være intakt (DNase I behandlet) og at andre DNA (sildesperm-DNA) ikke kan erstatte M-DNA. Disse data viser også at M-DNA induksjon av apoptose ikke resulterer i uspesifikk immunstimulering (LPS).

Eksempel 9

Induksjon av apoptose som vist ved solubilisering av nukleær mitotisk protein-apparatur (NuMA)

Betydelige morfologiske forandringer i cellekjernen forårsaket av solubilisering og frigjøring av NuMA er karakteristisk for apoptose. For å bestemme solubilisering og frigjøring av NuMA, ble mediet fra dyrkete celler fjernet og sentrifugert ved 200 g i 10 min. Supematantene ble samlet og 100 (il av hver supematant ble anvendt for å kvantifisere NuMA frigjøring i enheter/ml (U/ml) ved anvendelse av en kommersiell ELISA (Calbiochem, Cambridge, MA) (Miller et al. Biotechniques 15:1042-1047, 1993).

Humane leukemi THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med 0 ug/ml til 10 ug/ml M. phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og sildesperm-DNA. M. phlei induserte frigjøring av NuMA på en dose-avhengig måte, mens sildesperm-DNA ikke induserte frigjøring av NuMA (fig. 9). DNase I behandling av M. phlei- DNA, MCC-DNA og MCC inhiberte betydelig deres induksjon av NuMA-frigjøring fra disse cellene (fig. 10).

HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier ble inkubert med 0 ug/ml til 100 ug/ml MCC. MCC induserte frigjøring av NuMA på en dose-avhengig måte (fig. 11) og på en tids-avhengig måte (fig. 12A & 12B). Forsterket frigjøring av NuMA ble detektert i løpet av 241 etter inkubasjon av HT-1197 celler (fig. 12A) og av HT-1376 (fig. 12B) celler med 100 ug/ml MCC. M. phlei- DNA, MCC-DNA og MCC idet hver inneholder M-DNA, induserer apoptose cancerceller. MCC, hvori den første farmasøytisk akseptable bæreren er M. phlei cellevegg, induserer mer apoptose enn M. phlei- DNA eller MCC-DNA. Dette tyder på at bæreren som presenterer M-DNA til responderende celler påvirker M-DNA induksjon av apoptose.

Eksempel 10

Fast uavhengig induksjon av apoptose i Jurkat humané T-lymfoblastceller ved M.

phlei- DNA

Jurkat humane T-lymfoblastceller ble inkubert i 11 med PBS, med 1 jig/ml CH-11 antistoff, et antistoff som blir bundet til Fas og induserer apoptose (+ kontroll)

(Coulter-lmmunotech, Hialeah, FL) eller med 1 ug/ml ZB4 antistoff, et antistoff som bindes til Fas og som inhiberer apoptose (- kontroll) (Coulter-lmmunotech). M. phlei-DNA, 1 u.g/ml, ble tilsatt og NuMA frigjøring ble bestemt etter 481.

Som vist i fig. 13 induserer M. phlei- DNA apoptose både i fravær av og i nærvær av ZB4. Disse data demonstrerer at induksjon av apoptose ved M. phlei-DNA er uavhengig av Fas.

Eksempel 11

Oppsummering av effektene til M. phlei- DNA, MCC-DNA og MCC på celleproliferasjon og på apoptose

Tabell 2 oppsummerer effektene av M. phlei- DNA, MCC-DNA og MCC på inhibisjon av proliferasjonen og på induksjonen av apoptose i cancerceller bestemt ved DNA-fragmentering, NuMA-frigjøring og strømningscytometrisk analyse i humane og murine cancercellelinjer. M. phlei- DNA, MCC-DNA og MCC, hvori den første farmasøytiske akseptable bæreren er M. phlei celleveggen og hvori M-DNA er kompjeksbundet på celleveggen, inhiberer proliferasjonen og induserer apoptose i hver av de testede cancercellelinjene. Disse cancercellelinjene innbefatter atypisk medikamentresistent HL-60 MX-1 human promyelocytisk leukemi, p53/p21 unormal og medikamentresistent HT-1376 human blære, Fas unormal SW260 human tarm og konvensjonelle medikamentresistente LS1034 humane cecum karsinomceller.

Eksempel 12

MCC-aktivering av kaspase-3 i humane leukemi THP-1 monocytter

Kaspase 3 er et nøkkelenzym i apoptotisk reaksjonsvei nedstrøms for Fas-FasL signalisering. For å bestemme om MCC kan forbi Fas og direkte aktivere kaspase kaskaden i cancercellene, ble effekten av MCC på kaspase-3 aktiviteten analysert i humane leukemi THP-1 monocytter.

THP-1 monocytter (2 X 10<7> celler) ble inkubert i 481 med MCC (100 ug/ml).

THP-1 cellene ble lysert i 50 mM HEPES, pH 7,4,100 mM NaCI, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT, 1 mM EDTA og 10% glyserol. Kaspase-3 aktiviteten ble bestemt med en kommersiell ELISA (BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA), ved anvendelse av det inkluderte substratet, inhibitor og renset kaspase-3 enzym. Resultatene blir uttrykt som optisk tetthet avlesning ved 405 nm.

Som vist i tabell 3 resulterer inkubasjon med MCC i en 232% (31) og 333% (6 t) økning i kaspase-3 og kaspase-3 lignende aktivitet i humane leukemi THP-1 monocytter. MCC induksjonen av kaspase-3 og kaspase-3 lignende aktivitet ble unngått av DNase I behandling av MCC. Spesifisiteten til MCC-induksjon av kaspase-3 og kaspase-3 lignende aktivitet ble demonstrert ved anvendelse av kaspase-3 inhibitor. Tilsetning av kaspase-3 inhibitor til MCC-behandlet THP-1 celle-ekstrakt unngikk fullstendig målbar aktivitet. Evne som MCC har til å spesifikt og direkte indusere kaspase-3 og kaspase-3 lignende aktivitet i humane leukemi THP-1 monocytter er totalt uventet. For spesifikt å stimulere kaspase-3 og kaspase-3 lignende aktivitet må MCC gå inn i cellene ved en eller flere mekanismer, og initiere den dødelige protolytiske kaskaden ved apoptose eksekusjon.

Eksempel 13

Effekt av tamoksifen og MCC-indusert apoptose i humane leukemi THP-1 monocytter

Humane leukemi THP-1 monocytter ble inkubert i 90 min i kontrollmedium eller i medium inneholdende 10 u,g/ml tamoksifen (Sigma-Aldrich), et anti-østrogen anvendt i den pallitative behandlingen av fremskredet brystcancer. Cellene ble omfattende vasket med is-kaldt medium (2X), resuspendert til omtrent 10<6> celler/ml i medium og inkubert i 481 med 0,1,10 og 100 ug/ml MCC. Apoptose ble kvantifisert ved måling av NuMA.

Som vist i tabell 4 førte preinkubasjon i tamoksifen til betydelig øket MCC-indusert apoptose ved hver av de anvendte MCC konsentrasjonene. Disse data demonstrerer at MCC, hvori M-DNA er kompleksbundet på M. phlei celleveggen, kan bli anvendt som et tillegg til andre anti-cancermidler for å øke effektiviteten til behandlingen.

Eksempel 14

Modifikasjon av M. phlei- DNA ved metylering, sonikering og autoklavering

Nukleinsyrepreparater fra bacillus Calmette- Guerin (BCG) inhiberer cancerveksten (US-patent 4.579.941; Tokunaga et al. Microbiology and Immunology 36:55-666,1992). Den aktive bestanddelen i BCG nukleinsyren er blitt identifisert som palindromisk oligonukleotidsekvens purin-purin-C-G-pyrimidin-pyrimidin (CG motiv). Cytosinmetylering med CpG metylase omgår aktiviteten til denne DNA. (Krieg et al. Nature 374:546-549,1995). Effekt av CpG metylering på evnen som M. phlei- DNA har til å indusere apoptose ble følgelig bestemt. M. phlei- DNA, 1 u.g ble metylert ved anvendelse av 2,5 U CpG Sss I metylase (New England Biolabs, Mississauga, Ontario, Canada) i 10 mM Tris-HCI, pH 7,9, 50 mM NaCI, 10 mM MgCI2,1 mM DTT og 160 uM S-adenosylmetionin i 1 t ved 37°C. Nativ og metylert M. phlei- DNA ble utsatt for spaltning med BsflJ I restriksjons endonuklease (New England Biolabs) i 11 ved 60°C i 50 mM NaCI, 10 mM Tris HCI, 10 mM MgCI2 og 1 mM DTT, pH 7,9). Elektroforetisk analyse i 0,5% agarosegel i 31 ved 100 V viste at nativ M. phlei- DNA bie spaltet med Bs/U I restriksjons endonuklease, mens metylert M. phlei- DNA ikke ble spaltet med Ss/U I restriksjons endonuklease. Dette bekreftet at metylering av M. phlei- DNA var fullstendig.

Som vist i fig. 14 modifiserte metyleringen ikke M. phlei indusert NuMA frigjøring frå humane leukemi THP-1 monocytter. Disse data demonstrerer at CG-motivene til forskjell fra BCG er ikke nødvendigvis apoptose-indusert av M. phlei-DNA.

Baseparlengden til M. phlei- DNA (1 ug) redusert ved sonikering i 15 sek eller i 20 min på is i en modell W-38 ultrasonisk prosessor (HeatSystems-Ultrasonics, Inc.), ved spaltning med BstU I restriksjons endonuklease eller ved autoklavering ved 121°C i 30 min (Castle Sybron MDT, Dubuque, Iowa). Som vist i fig. 14 førte sonikering, BstU I spaltning og autoklavering som hver reduserer baseparlengden til et område på omtrent 5 basepar til omtrent 250 basepar ikke tii noen påvirkning av M. phlei- DNA induksjon av NuMA frigjøring fra THP-1 monocytter. Disse resultatene demonstrerer at M. phlei- DNA induserer apoptose i cancerceller, selv ved kort oligonukleotidlengde (omtrent 5 basepar til omtrent 250 basepar).

Humane leukemiske THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med ubehandlet M. phlei- DNA og MCC og med M. phlei- DNA og MCC autoklavert i 30 min ved 121°C. Autoklavering som reduserer baseparlengden til DNA påvirket ikke evnen som M. phlei- DNA eller MCC har til å inhibere proliferasjonen av (tabell 5A) eller indusere apoptose i (tabell 5B) disse cellene.

Eksempel 15

MCC inhiberer cancervekst in vivo

MCC og DNase I behandlet MCC ble emulgert til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml i PBS inneholdende 2% w/v mineralolje og 0,02% w/v Tween 80 (Fisher Chemical Co.) ved sonikering ved 4°C i 5 min (Heat Systems-Ultrasonics, Inc.).

Linje 10 hepatomceller, syngeniske for stamme-2-marsvin ble hurtig tint, vasket ved sentrifugering og resuspendert i M199 medium til en konsetrasjon på 10<6 >celler/mi. En-tiendels ml inneholdende 1,5 X 10<6> celler ble injisert intra-dermalt inn i flankene til 3 mndr gamle stamme-2 marsvin. Behandlingen ble initiert 6 til 7 dager etter injeksjon når cancerene var mellom 0,5 og omtrent 0,8 cm i diameter. Syv dyr ble behandlet med kun emulgeringsbuffer (kontroll), 7 med emulgeringsbuffer inneholdende MCC og 7 med emulgeringsbuffer inneholdende DNase I behandlet MCC. Emulgeringene ble direkte ført til cancerene og omgivende normalvev. Halv ml emulsjon ble administrert i 01 og 61, idet et totalvolum på 1 ml inneholdene 1 mg MCC eller DNase I behandlet MCC.

Diameterene til cancermassene (lengste diameter + korteste diameter) ble registrert hver uke i 3 uker. Volum av cancermaterialet ble beregnet i mm<3> som 0,5 x a (lengste diameter) x b2 (korteste diameter) og økningen i cancervolum i forhold til dag 0 av behandling ble beregnet for hvert marsvin. Statistiske analyser ble utført ved anvendelse 2-veis ANOVA med replikater (PHARM/PCS versjon 4.2, MCS, Philadelphia, PA). Forskjeller i behandling var betraktet å være signifikant ved p<0,05.

Som vist i fig. 15 økte med kontrollemulsjon cancervolumet med omtrent 22-ganger innen uke 3, mens med MCC ble cancerveksten betydelig inhibert sammen-lignet med kontrollemulsjonen (fig. 15, tabell 6). Med DNase I behandlet MCC var cancerveksten ikke betydelig forskjellig fra kontrollen (fig. 15, tabell 6).

Disse data viser at innføring av MCC ved tumorsteder resulterer i tumor-regresjon. Den betydelige (p<0,01) forskjellen i inhibisjon av cancervekst mellom MCC og DNase I behandlet MCC viser at udegradert M-DNA er nødvendig for anti-cance rakt i vitet av MCC in vivo.

Eksempel 16

MCC cytotoksisitet

Celletoksisitet er karakterisert ved tap av plasma membranintegritet og frigjøring av cytoplasmiske enzymer så som, men ikke begrenset til, LDH (Wyllie et al. International Review of Cytology 68:251-306,1980; Phillips et al. Vaccine, 14:898-904,1996). Humane blærecancercelier frigjør LDH når behandlet med cytotoksiske midler (Rahman M. Urology International 53:12-17,1994).

For å vurdere cytotoksisiteten av MCC ble HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier inkubert i 481 med fra 0 ug/ml til 100 ug/ml MCC eller med lyseringsbuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, pH 7,5) som en kontroll for total LDH-frigjøring (Filion et al. Biochim Biophys Acta 1329:345-356,1997). LDH-frigjøring inn i kultursupernatanten ble bestemt ved anvendelse av en kommersiell analyse (Sigma-Aldrich).

Som bestemt ved LDH-frigjøring var MCC ikke cytotoksisk overfor HT-1197 eller overfor HT-1376 celler (fig. 17). Fravær av cytotoksisitet demonstrerer at MCC virker direkte på inhibering av proliferasjonen og induserer, også apoptose i cancerceller.

Eksempel 17

Stimulering av cytokinsyntese in vitro

IL-12 er rapportert å ha anti-canceraktivitet i noen cancerceller (Voest et al. Journal National Cancer Institute 87:581-586,1995; Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420-421,1996), mens GM-CSF er rapportert å ha pro-canceraktivitet i noen cancerceller (Hawkyard et al. Journal of Urology 150: 514-518,1993). Noen cancerceller er rapportert å utskille cytokiner (De Reijke et al. Urology Research 21:349-352,1993; Bevers et al. British Journal of Urology 80:35-39,1997). Effekten av MCC på IL-6, IL-12 og GM-CSF syntesen ved HT-1197 og HT-1376 humane blærecancercelier og av humane THP-1 monocytter, murine makrofager, murine RAW 264.7 monocytter og murine miltceller ble bestemt.

Cytokinproduksjonen ble bestemt i pg/ml i 100 ul kultursupematant ved anvendelse av hensiktsmessig kommersiell ELISA (BioSource, Camarille, CA). IL-12 ELISA måler både IL-12 p70 kompleks og fri p40 subenhet.

HT-1197 og HT-1376, THP-1, makrofag, RAW 264.7 og murine miltceller ble inkubert i 481 med 1 |ig/ml MCC. Som vist i fig. 1 stimulerte MCC produksjonen av IL-6 og IL-12 ved humane monocytter og murine makrofager, men ikke humane blærecancercelier, murine monocytter eller miltceller. MCC stimulerte ikke GM-CSF produksjonen tii noen av cancercellene som var blitt testet.

Disse data viser at MCC, hvori M. phlei celleveggen er den første farmasøytisk akseptable bæreren, stimulerer produksjon av anti-cancer cytokinene IL-6 og IL-12 til humane monocytter og murine makrofager. MCC stimulerer ikke cytokinproduksjonen ved humane blærecancercelier. MCC stimulerer ikke produksjonen av pro-cancer cytokin GM-CSF.

Eksempel 18

Effekt av ubehandlet og DNase I behandlet M- phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og Regressin® på IL-12 produksjon ved humane THP-1 monocytter

Humane THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med M-ph/eADNA, MCC-DNA, MCC og Regressin<®> før behandling med DNase I, etter behandling med DNase I, og etter tilsetning av M-DNA til DNase I behandlet M-ph/eADNA, MCC-DNA og MCC.

Som vist i tabell 7 stimulerte M- phlei- DNA, MCC-DNA og MCC THP-1 monocytter til å produsere IL-12. MCC stimulerte mer IL-12 produksjon enn M- phlei- DNA eller MCC-DNA. Regressin<®> stimulerte minimal IL-12 produksjon. DNase I behandlingen ble redusert med omtrent 50% M-ph/eADNA, MCC-DNA og MCC stimulerte IL-12 produksjon. Regressin<®> ble ikke påvirket av DNase I behandlingen. Tilsetning av M- phlei- DNA til DNase I behandlet M- phlei og MCC-DNA til DNase I behandlet MCC-DNA opprettet deres stimulering av IL-12 produksjonen. Tilsetning av MCC-DNA til DNase l-behandlet MCC gjenopprettet ikke stimulering av IL-12 produksjonen.

Det MC, hvori M- phlei veggen er den første farmasøytisk akseptable bæreren, stimulerer mer IL-12 produksjonen enn M- phlei- DNA eller MCC-DNA som tyder på at bæreren anvendt for å forhindre M-DNA til responderende celler påvirker M-DNA stimulert IL-12. DNase I behandlingen som degraderer M-DNA reduserer i betydelig grad M- phlei- DNA, MCC-DNA og MCC stimulert IL-12 produksjonen tyder på at oligonukleotidformen av M-DNA må være konservert for optimal stimulering av IL-12 produksjonen. Tilsetning av M-DNA til DNase I behandlet MCC gjenopprettet ikke dets stimulering av IL-12 produksjonen som tyder på at den måten hvorved M-DNA er kompleksbundet på M- phlei celleveggen i MCC er viktig for optimal stimulering av IL-12 produksjonen av humane monocytter.

Eksempel 19

Effekt av autoklavering på M- phlei- DNA og MCC stimulering av IL-12 produksjonen ved humane THP-1 monocytter

Humane THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med MCC og M- phlei- DNA og

med MCC og M- phlei- DNA autoklavert i 30 min i sterilt vann.

Som vist i tabell 8 påvirket ikke autoklavering, som reduserer DNA base-parstørrelsen MCC eller M- phlei- DNA stimulering av IL-12 produksjonen ved monocytter.

Eksempel 20

Effekt av CD14 antistoff behandling på MCC-DNA og MCC stimulert IL-12 produksjonen ved humane THP-1 monocytter.

Humane THP-1 monocytter ble inkubert med PBS eller med 10 ug/ml anti-CD14 antistoff (klon MY4, Coulter-lmmunotech) i 11. Deretter ble 5 ug/ml MCC-DNA eller MCC tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 481. CD14 antistoffer, som blir bundet til CD14 reseptorer på celleoverflaten forårsaket en omtrent 85% reduksjon i MCC-DNA stimulert IL-12 produksjon og omtrent en 20% reduksjon i MCC stimulert IL-12 produksjon (fig. 18).

Eksempel 21

Effekt av cytokalasin D på M- phlei- DNA, MCC-DNA og MCC stimulert IL-12 produksjon ved humane THP-1 monocytter

Humane THP-1 monocytter ble inkubert i 481 med PBS eller med 1 ug/ml M-phlei- DNA, MCC-DNA eller MCC i fravær av eller i nærvær av 10 ug/ml cytokalasin D (Sigma Chemical Co.). Cytokalasin D, som inhiberer fagocytosen, forårsaker en 64% reduksjon i M- phlei- DNA, en 50% reduksjon i MCC-DNA og en 55% reduksjon i MCC stimulert IL-12 produksjon (fig. 19).

Uten å være bundet til følgende hypotese, men basert på data vist i fig. 18 og 19, antas det at M- phlei- DNA, MCC-DNA og MCC reagerer med monocytter med multiple mekanismer. Fig. 18 tyder på at de reagerer med GPI-koplet membran-reseptor CD14 og blir opptatt. Denne mekanismen er mer spesifikk for oppløselig M-phlei- DNA og MCC-DNA enn for uoppløselig MCC. Fig. 19 tyder på at de reagerer med fagocytiske reseptorer, så som oppfangingsreseptoren, og blir inntatt. Denne mekanismen er mer spesifikk for uoppløselig MCC enn for oppløselig M- phlei- DNA og MCC-DNA.

Eksempel 22

Effekt av CG sekvensen og av MCC på IL-12 produksjonen av humane THP-1 monocytter

Nukleinsyrepreparater fra BCG er rapportert å stimulere lymfocytt-proliferasjonen, sekresjon av IL-6 og IL-12 ved B-lymfocytter, sekresjon av IL-12 ved monocytter, sekresjon av IL-6 og interferon-gamma ved T-lymfocytter og sekresjon av interferon-gamma ved NK-celler (Klinman et al. Proceeding of the National Academy of Science USA 93:2879-2883,1996).

Som aktiv bestanddel av BCG er nukleinsyren blitt identifisert som CG motivet, ble humane THP-1 monocytter inkubert i 481 med 0,5,1 og 5 ug/ml MCC eller 5'-GCTAGACGTTAGCGT-3' DNA sekvensen dannet ved fast fasesyntese ved anvendelse av en automatisert DNA syntetisator.

Som vist i tabell 9 stimulerte den CG-inneholdende oligonukleotidsekvensen ikke IL-12 produksjonen ved noen av de tre testede konsentrasjonene, mens MCC ved 1 ug/ml hadde en betydelig stimulatorisk effekt på IL-12 produksjonen.

Eksempel 23 Effekt av varmebehandling og av DNase I behandling på M- phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og Regressin<*> stimulering åv IL-12 produksjonen til murine makrofager ;Murine periotineale makrofager ble inkubert i 481 med M- phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og Regressin<*> og med M- phlei- DNA, MCC-DNA og Regressin<®>, som var blitt oppvarmet ved 100°C i 10 min og avkjølt på is i 2 min.

Som vist i tabell 10 ble ved en konsentrasjon på 5 ug/ml, IL-12 produksjonen mest stimulert av MCC, mindre av M- phlei- DNA og MCC-DNA og minst av Regressin<®>. Varmebehandling av M- phlei- DNA, MCC-DNA og Regressin<®> hadde ingen betydelig effekt på deres stimulering av IL-12 produksjonen. Til tross for at dette ikke er vist forårsaket varmebehandling av MCC en liten, men betydelig, økning i IL-12 produksjonen.

Murine peritoneale makrofager ble inkubert i 481 med ubehandlet og med DNase I behandlet MCC-DNA, MCC og Regressin® (fig. 20). IL-12 produksjonen ble mest stimulert av MCC, minst av MCC-DNA og minst av Regressin<®>. DNase I behandling av MCC-DNA og MCC reduserte i betydelig grad deres stimulering av IL-12 produksjonen ved murine makrofager. DNase I behandling av Regressin<® >hadde ingen effekt på aktiviteten derav. Disse data tyder igjen på at, som med monocytter (eksempel 18), må oligonukleotidstrukturen M-DNA bli konservert for optimal stimulering av IL-12 produksjonen ved murine makrofager.

Eksempel 24

Effekt av M- phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og Regressin<®> på nitrogenoksid (NO) produksjonen til murine peritoneale makrofager

Makrofagaktivering stimulerer produksjonen av reaktiv oksygenformer inkludert, men ikke begrenset til, nitrogenoksid (NO), superoksidradikaler og hydroksylradikaler. Disse reaktive oksygenartene induserer cytolyse og apoptose i responderende celler og har derfor anti-canceraktivitet.

Murine peritoneale makrofager ble inkubert i 481 med 0,1, 5,0 eller 12,5 u,g/ml M- phlei- DNA, MCC-DNA, MCC og Regressin<®>. NO-produksjonen ble målt i nmol/l ved reaksjon med NO2" med Griess reagens ved anvendelse av 100 ul kultursupematant.

Som vist i tabell 11, ved 5 ug/ml, MCC stimulerte betydelig mer NO-produksjon enn M- phlei- DNA, MCC-DNA eller Regressin<®>.

Murine makrofager ble inkubert i 481 med 1 ug/ml ubehandlet og DNase I behandlet MCC og med ubehandlet M- phlei- DNA og MCC-DNA.

Som vist i tabell 12 stimulerte M-DNA, kompleksbundet på M- phlei celleveggen, som MCC betydelig NO-produksjonen. DNase I behandling av MCC, som degraderer M-DNA, omgår MCC-stimulering av NO-produksjonen. MCC-DNA og M- phlei- DNA stimulerer minimal NO-produksjon. Disse data demonstrerer at både intakt oligonukleotidstruktur til M-DNA og bæreren som presenterer disse nukleo-tidene til makrofagene er viktige for optimal stimulering av NO-produksjonen.

Eksempel 25

Effekt av MCC på produksjon av nitrogenoksid (NO) tii murine RAW264.7 monocytter

Murine RAW264.7 monocytter ble inkubert i 241 med 0,5 til 95 ug/ml MCC. Økende konsentrasjoner av MCC stimulerte økende mengder av NO-produksjon (fig. 21). Dette var uventet idet reseptorer for NO-induksjon ikke blir optimalt uttrykt på monocytter og NO-produksjonen er derfor ikke vanligvis assosiert med monocytter. Under de samme betingelsene stimulerte Regressin® ikke NO-produksjon.

Eksempel 26

Stimulering av cytokinsyntese in vivo

Fire grupper av CD-1 mus, hver inneholdende 5 mus, ble injisert intraperitonealt med 50 mg/kg MCC. Biod ble samlet 0, 3, 6 og 241 etter injeksjon og konsentrasjoner (pg/ml) av IL-6, IL-10, IL-12 og GMSF i sera ble bestemt 0, 3, 6 og 241 etter injeksjon (fig. 22). Med intraperitoneal MCC ble serakonsentrasjoner av IL-6, IL-10 og IL-12 betydelig forøket 3 og 61 etter injeksjonen, og ble redusert til omtrent kontrollverdiene (01) 241 etter injeksjon. Serakonsentrasjoner av GM-CSF forble ved omtrent kontrollverdier (01) 3, 6 og 241 etter injeksjon.

Fem grupper av CD-1 mus, hver inneholdende 5 mus, ble injisert intravenøst med 6,6 mg/kg MCC. Blod ble samlet 0, 3, 6 og 241 etter injeksjon og konsentrasjoner (pg/ml) av IL-10 og IL-12 i sera ble bestemt 0,3, 6 og 241 etter injeksjon (fig. 23). Med intravenøs MCC ble serakonsentrasjoner av IL-6 betydelig forøket 3 og 61 etter injeksjonen, og ble redusert til omtrent kontrollverdiene (01) 24 t etter injeksjon. Serakonsentrasjoner av IL-10 forble ved omtrent kontrollverdier (0 t) 3, 6 og 241 etter injeksjon.

Disse data demonstrerer at in vivo administrering av M-DNA, hvori M-DNA er kompleksbundet på M. phlei celleveggen, som MCC stimulerer produksjonen av anti-cancer cytokinene IL-6, IL-10 og IL-12, men ikke pro-cancer cytokin GM-CSF. Disse data demonstrerer videre at mengden av MCC administrert og veien hvorved det blir administrert begge påvirker evnen som MCC har til å stimulere cytokinproduksjon in vivo.

Fire grupper av CD-1 mus, hver inneholdende 4 mus, ble injisert intraperitonealt med ubehandlet og med DNase I behandlet M. phlei- DNA og MCC. Etter 31 ble musene ofret, blod ble samlet ved hjertemikropunktur og konsentra-sjonen (pg/ml) IL-12 i sera ble målt (tabell 13).

Som vist i tabell 13 stimulerer in vivo administrering av MCC og M. phlei- DNA produksjonen av anti-cancer cytokin IL-12. Etter DNase I behandling ble MCC stimulert IL-12 produksjon redusert med 40,5% og M. phlei- DNA stimulert IL-12 produksjon ble redusert med 46,5%. Dette demonstrerer at oligonukleotidstrukturen til M-DNA må bli konservert for optimal stimulering av IL-12 produksjonen in vivo.

Eksempel 27

MCC stabilitet

MCC ved 1 mg/ml ble lagret som en steril suspensjon i 0,85% w/v NaCI i mørket ved 4°C eller 6 mndr. Gjennomsnittlig partikkeldiameter ble beregnet ved anvendelse av fotonkorrelasjons spektroskopi (N4 Plus, Coulter Electronics Inc.) MCC suspensjonen ble fortynnet med 0,85% w/v NaCI til en partikkel tellerrate mellom 5 x 10<4> og 10<6> tellinger/sek. Gjennomsnittlig partikkeldiameter ble beregnet ved størrelsesfordelings prosessormetoden (SDP) ved anvendelse av følgende betingelser: fluid refraksjonsindeks 1,33, temperatur 20°C, viskositet 0,93 centipoise, målingsvinkel 90,0°, prøvetid 10,5 us og prøvekjøretid 100 sek. Potensialet, den elektriske ladning ved den hydrodynamiske grensen mellom partiklene og bulkløsningsmiddelet, som målt i en Deisa 440SX (Coulter Electronics Inc.) ved anvendelse av følgende betingelser: strøm 0,7 mA, frekvensområde 500 Hz, temperatur 20°C, fluid refraksjonsindeks 1,33, viskositet 0,93 centipoise, die lekt risk konstant 78,3, ledningsevne 16,7 ms/cm, tid på 2,5 sek, tid av 0,5 sek og prøvekjøretid 60 sek.

Som vist i fig. 24 forblir MCC ladning og MCC diameter relativt uforandret i

løpet av lagring i 6 mndr. MCC stimulering av IL-12 produksjon og MCC induksjon av apoptose i THP-1 monocytter forble uforandret i løpet av lagring i 6 mndr.

Eksempel 28

MCC-DNA og MCC behandling av human tarmcancer

Humane tarmcancerceller (ICM12C) blir etablert som en ektopisk fast tumor i subkutane vev til immunsvikt atymiske nakne mus (nu/nu mus) og musene blir delt inn i 5 grupper. Gruppe 1 mottar kun bærer. Gruppe 2 mottar MCC-DNA. Gruppe 3 mottar DNase I behandlet MCC-DNA. Gruppe 4 mottar MCC. Gruppe 5 mottar DNase I behandlet MCC. Cancermassen blir målt for behandling og hver uke i

løpet av 4 ukers behandling. Gruppe 2 og gruppe 4 mus viser regresjon av cancermassen.

Eksempel 29

M. phlei- DNA og MCC behandling av human ovariecancer

Humane ovariecancerceller (36M2) blir etablert som ascites i peritonealhul-rommet til immunsvikt atymiske nakne mus (nu/nu mus) og musene blir delt inn i 5 grupper. Gruppe 1 mottar kun bærer. Gruppe 2 mottar M. phlei- DNA. Gruppe 3 mottar DNase I behandlet M. phlei- DNA. Gruppe 4 mottar MCC. Gruppe 5 mottar DNase I behandlet MCC. Cancermassen blir målt før behandling og hver uke i

løpet av den 4 uker lange behandlingen. Gruppe 2 mus og gruppe 4 mus viser inhibisjon av ascites cancercelleproliferasjonen.

Eksempel 30

MCC-behandling av canine transmisibel venereal cancer

Hunder med veneral cancerformer (VT) blir delt inn i fire grupper. Gruppe 1 mottar vinkristin. Gruppe 2 mottar vinkristin kombinert med metotreksat og cyklofosfamid. Gruppe 3 mottar MCC-DNA, kompleksbundet med og presentert på en bærer, hvori bæreren er mykobakteriell cellevegg (MCC). Gruppe 4 mottar vinkristin og MCC. Cancermassen blir målt før behandling og hver uke i løpet av den 12 uker lange behandlingen. Hunder i gruppe 4 viser regresjon av VT.

Eksempel 31

Suspensjon i vandig bærer

M-DNA blir suspendert i en første farmasøytisk akseptabel bærer og blir sonikert ved 20% utløp i 5 min (modell W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). Den sonikerte blandingen blir eventuelt homogenisert ved mikrofluidisering

ved 15.000-30.000 psi ved en gjennomstrømning (modéll M-110Y; Microfluidics, Newton, MA).

Claims (18)

1. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter a. Myobacterium pte/-DNA (M-DNA), og b. en første farmasøytisk akseptabel bærer, hvori M-DNA har anti-cancer aktivitet.

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til M-DNA er inhibisjon av proliferasjon av cancerceller.

3. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til M-DNA er induksjon av apoptose i cancerceller.

4. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til M-DNA er stimulering av cytokinproduksjonen til celler av immunsystemet.

5. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at den første farmasøytisk akseptable bæreren er valgt fra gruppen bestående av en vandig bærer, en ikke-vandig bærer og en Mycobacterium phlei ( M. phlei) cellevegg.

6. Sammensetning ifølge krav 5, karakterisert ved at den første farmasøytisk akseptable bæreren er M. phlei cellevegg.

7. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at den videre omfatter en andre farmasøytisk akseptabel bærer, hvori den andre farmasøytisk akseptable bæreren er valgt fra gruppen bestående av en vandig bærer og en ikke-vandig bærer.

8. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter a. M-DNA, b. M. phlei cellevegg, hvori M-DNA er konservert og kompleks bundet på M. phlei celleveggen (MCC) og, c. en farmasøytisk akseptabel bærer, hvori MCC har anti-cancer aktivitet.

9. Sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er inhibisjon av proliferasjon av cancerceller.

10. Sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er induksjon av apoptose i cancerceller.

11. Sammensetning ifølge krav 3 eller 10, karakterisert ved at induksjon av apoptose i cancerceller er uavhengig av en faktor valgt fra gruppen bestående av Fas, p53/p21 og medikamentresistens.

12. Sammensetning ifølge krav 3 eller 8, karakterisert ved at induksjon av apoptose i cancerceller er induksjon av caspase-3 aktivitet i cancerceller.

13. Sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er stimulering av cytokinproduksjon av celler i immunsystemet.

14. Sammensetning ifølge krav 4 eller 13, karakterisert ved at cellene i immunsystemet er valgt fra gruppen bestående av makrofager og monocytter.

15. Sammensetninger ifølge krav 4 eller 13, karakterisert ved at cytokinet er valgt fra gruppen bestående av IL-6, IL-10 og IL-12.

16. Sammensetning ifølge krav 1 eller 8, karakterisert ved at anti-cancer aktiviteten til MCC er stimulering av reaktiv oksygen-art-produksjon av cellene i immunsystemet.

17. Sammensetning ifølge krav 16, karakterisert ved at cellene i immunsystemet er makrofager.

18. Anvendelse av en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-17 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cancer i et dyr.