DE60020352T2

DE60020352T2 - Zusammensetzung und Methode zur Inuzierung von Apptosis in Prostatakrebszellen mittels M-DNA und MCC

Info

Publication number: DE60020352T2
Application number: DE60020352T
Authority: DE
Inventors: C. Nigel PHILLIPS; C. Mario FILION; Stéphanie READER
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Current assignee: Telesta Therapeutics Inc
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2020-03-31
Also published as: CA2366090A1; EP1165106B8; EP1165106B1; EP1165106A2; CY1107455T1; CA2366090C; DE60020352D1; WO2000059518A3; JP2002541114A; ES2238996T3; AU3413500A; WO2000059518A2; AU780909B2; PT1165106E; ATE296106T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs.
Hintergrund der Erfindung
Krebs ist eine aberrierende netzartige Akkumulation von atypischen Zellen, die auf ein Übermass an Proliferation, eine ungenügende Apoptose oder eine Kombination dieser beiden Ursachen zurückzuführen sein kann. Apoptose ist ein Vorgang von aktivem Zelltod, der durch auffällige morphologische Veränderungen gekennzeichnet ist, welche die Kondensation von nuklearem Chromatin, Zellschrumpfung, nukleare Desintegration, Plasmamembran-Bläschenbildung und die Bildung von membrangebundenen apoptotischen Körpern umfassen (Wyllie et al., Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980). Ein morphologisches Kennzeichen der Apoptose ist der Abbau der nuklearen DNA der Zelle in Fragmente mit einer Länge von Oligonukleosomen als Ergebnis der Aktivierung von endogenen Nukleasen (Wyllie A. H. Nature 284:555, 1981).
Prostatakrebs ist eine Hauptursache von Krebstodesfällen in der männlichen Bevölkerung. Für Patienten mit kapselbegrenztem Prostatakrebs sind totale Prostatektomie, Radiotherapie, eine Kombination der beiden Methoden und Brachytherapie mit radiomarkierten Samenimplantaten die gebräuchlichsten Behandlungsmethoden. Eine totale Prostatektomie kann zu Impotenz und Inkontinenz führen. Radiotherapie ist mit dem erneuten Auftreten von prostataspezifischem Antigen (PSA) verbunden. Brachytherapie kann nur bei sorgfältig ausgewählten Patienten eingesetzt werden.
Für Patienten mit extrakapsulären Tumoren und Metastasen sind Androgenablation und Chemotherapie die gebräuchlichsten Behandlungsmethoden. Die Androgenablation zur Verwendung bei Patienten mit androgenabhängigem Prostatakrebs schließt chirurgische Kastration (bilaterale Orchiektomie) und chemische Kastration unter Verwendung von Antiandrogenen und Suppressoren der Bildung von Gelbkörperreifungshormon ein. Viele Patienten lehnen eine Orchiektomie ab. Wenn Antiandrogene und Suppressoren der Bildung von Gelbkörperreifungshormon zusammen verwendet werden, um eine völlige Androgenblockierung zu bewirken, so führt dies zu Androgenentzugserscheinungen und außerdem sind diese sehr teuer. Darüber hinaus ist die Antwort auf eine Androgenablationstherapie begrenzt und dauert im Mittel 12–16 Monate an (Crawford et al. New Eng. J. Med. 321:419, 1989). Eine Steigerung des programmierten Zelltods oder der Apoptose wurde als ein wünschenswertes therapeutisches Ergebnis der Behandlung von Prostatakrebs bestimmt (Kyprianou et al., Cancer Surv. 11:265, 1991). Mutationen in p53, einem Protein, das bei der Kontrolle und Induktion von Apoptose eine Rolle spielt, sind mit einer schlechten klinischen Prognose und einer verringerten Wirksamkeit eines weiten Spektrums von therapeutischen Mitteln, die bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden, verbunden (Chang et al., J. Clin. Oncol. 13:1009, 1995). Es ist bekannt, dass eine p53-Genmutation, welche zur Akkumulierung von nicht funktionalem p53 führt, mit einer mangelnden Ansprechempfindlichkeit auf die Androgenablationstherapie bei der Behandlung von Prostatakrebs in Zusammenhang steht (Navone et al., J. Natl. Cancer Inst. 85:1657, 1993).
Es ist anerkannt, dass therapeutische Mittel, die in vitro wirksam die Proliferation von Krebszellen hemmen und Apoptose in Krebszellen induzieren, einen therapeutischen Nutzen für die in vivo-Behandlung von Krebs besitzen (Furukawa et al., J. Surg. Oncol. 48:188, 1991). Z.B. hat sich herausgestellt, dass die antiproliferative in vitro-Aktivität von chemotherapeutischen Mitteln gegenüber Prostata-Adenokarzinom Krebszellen positiv mit deren Antikrebswirkung in vivo korreliert (Pienta et al., Prostate 26:270, 1995). Die Wirkung vieler dieser therapeutischen Mittel wird jedoch vom p53-Mutationsstatus beeinflusst und solche Mittel, deren Wirkungsmechanismus unabhängig von p53 zu sein scheint, sind nicht selektiv und hoch toxisch. Das vorrangige Ziel von Chemotherapie zur Verwendung bei Patienten mit androgenunabhängigem (hormonbeständigem) Prostatakrebs ist die Linderung. Die toxischen Nebenwirkungen der Chemotherapie sind jedoch hinderlich, begrenzen häufig die Dosis und beeinträchtigen die Lebensqualität des Patienten.
Kastration oder Androgenablationstherapie (entweder allein oder in Kombination) induzieren Apoptose in Prostatatumoren. Das Ausmaß der Apoptose, die in Prostatatumoren nach Androgenablation auftritt, wurde mit dem p53-Status in Zusammenhang gebracht (Westin et al., Am. J. Pathol. 146:1368, 1995). Nahezu alle Patienten mit metastatischem Prostatakrebs sind einer Androgenablationstherapie jedoch zunächst nicht zugänglich. Die Induktion der Apoptose in Prostata-Adenokarzinomen nach Androgenablation ist mit der Infiltration von Immuneffektorzellen wie beispielsweise zytotoxischen T-Zellen und aktivierten Makrophagen verbunden (Landstrom und Funa, Int. J. Cancer 71:451, 1997). Die Aktivierung von immanenten und erworbenen Immunsystemen zusätzlich zur Hemmung der Proliferation von Prostatakrebszellen wäre für die Behandlung von Prostatakrebs vorteilhaft.
WO 99/07383 beschreibt die Wirkung einer Zusammensetzung, die M-DNA oder konservierte und auf M. phlei-Zellwand (MCC) komplexierte M-DNA umfasst, auf verschiedene Typen von Krebszelllinien. Die Behandlung von Prostatakrebs ist nicht offenbart.
M. C. Filiou et al., J. Pharm. Pharmacol. 1998, 50 (Supplement):39 beschreibt ebenfalls die Fähigkeit von Komplexen aus myobakterieller Zellwand und DNA, in verschiedenen Krebszellen Apoptose zu induzieren.
Daher besteht ein Bedarf an einem neuen therapeutischen Mittel zur Behandlung von Prostatakrebs, das einfach und relativ kostengünstig hergestellt werden kann und das über die Zeit therapeutisch stabil bleibt, das in Gegenwart von mutiertem p53 wirksam ist, das geeignet ist, das immanente und oder das erworbene Immunsystem zu stimulieren und das bei Dosierungsweisen wirksam ist, die selbst bei wiederholter Verabreichung mit minimaler Toxizität verbunden sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung befriedigt den obigen Bedarf, eine Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs in einem Tier, einschließlich einem Menschen bereitzustellen, wobei eine Zusammensetzung, die Myobakterium phlei (M. phlei) DNA (M-DNA) und M-DNA umfasst, wobei die M-DNA konserviert und mit der M. phlei-Zellwand (MCC) komplexiert ist, dem Tier, das eine solche Behandlung benötigt, in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um auf Krebszellen in der Prostata des Tiers eine antineoplastische Wirkung auszuüben.
M-DNA und MCC sind einfach und relativ kostengünstig herzustellen, ihre Wirkungen sind über Präparationen reproduzierbar, sie bleiben über die Zeit therapeutisch stabil und sie sind bei Dosierungsweisen wirksam, die selbst bei wiederholter Verabreichung mit minimaler Toxizität verbunden sind.
Um MCC herzustellen, werden M. phlei in flüssigem Medium kultiviert und geerntet. Die M. phlei werden zerstört und die festen Komponenten der zerstörten M. phlei werden durch zentrifugale Sedimention gesammelt. Die festen Komponenten werden deproteinisiert, delipidiert und gewaschen. M-DNA wird aus MCC gereinigt oder direkt aus M. phlei gereinigt. Es werden DNase-freie Reagenzien verwendet, um den DNA-Abbau während der Herstellung von MCC und M-DNA zu minimieren (um DNA zu konservieren).
Eine Zusammensetzung, welche M-DNA oder MCC und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wird einem Tier, einschließlich einem Menschen, mit Prostatakrebs in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um Prostatakrebszellen in dem Tier, einschließlich dem Menschen mit Prostatakrebs vorzubeugen, zu behandeln oder zu eliminieren. Ggf. können mit der M-DNA und der MCC zusätrliche therapeutische Mittel verabreicht werden einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Antiandrogene, chemotherapeutische Mittel, immunomodulatorische Mittel und Steroide. Die unerwartete und überraschende Fähigkeit von M-DNA und von MCC, Prostatakrebszellen zu verhindern, zu behandeln oder zu eliminieren, spricht einen lang empfundenen unerfüllten Bedarf in der medizinischen Technik an und stellt einen wichtigen Nutzen für Tiere, einschließlich Menschen bereit.
Entsprechend ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist um Prostatakrebs vorzubeugen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um hormonsensitivem Prostatakrebs vorzubeugen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um hormoninsensitivem Prostatakrebs vorzubeugen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um Prostatakrebs zu behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um hormsensitiven Prostatakrebs zu behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um hormoninsensitiven Prostatakrebs zu behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um Prostatakrebs zu beseitigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um hormonsensitiven Prostatakrebs zu beseitigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um hormoninsensitiven Prostatakrebs zu beseitigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die eine antineoplastische Wirkung auf Prostatakrebszellen besitzt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die eine antineoplastische Wirkung auf hormonsensitive Prostatakrebszellen besitzt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die eine antineoplastische Wirkung auf hormoninsensitive Prostatakrebszellen besitzt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um die Proliferation von Prostatakrebszellen zu hemmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um die Proliferation von Prostatakrebszellen zu hemmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um die Proliferation von hormonsensitiven Prostatakrebszellen zu hemmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um die Proliferation von hormoninsensitiven Prostatakrebszellen zu hemmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um in Prostatakrebszellen Apoptose zu induzieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um in hormonsensitiven Prostatakrebszellen Apoptose zu induzieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um in hormoninsensitiven Prostatakrebszellen Apoptose zu induzieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um die Wirkung anderer therapeutischer Mittel bei der Behandlung von Prostatakrebs zu verstärken.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um die antineoplastische Wirkung von Antiandrogen-Mitteln bei der Behandlung von Prostatakrebs zu verstärken.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um die antineoplastische Wirkung von chemotherapeutischen Mitteln bei der Behandlung von Prostatakrebs zu verstärken.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die wirksam ist, um die antineoplastische Wirkung von Bestrahlung bei der Behandlung von Prostatakrebs zu verstärken.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitrustellen, die ihre Wirksamkeit über die Zeit beibehält.
Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einem Überblick der folgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführungsform und der beigefügten Ansprüche offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Hemmung der Proliferation von humanen Prostatakrebszellen durch MCC.
2 Hemmung der Proliferation von LNCaP und PC3 humanen Prostatakrebszellen durch M-DNA.
3 Hemmung der Proliferation von PC3 humanen Prostatakrebszellen durch MCC und durch mit DNase I-behandelte MCC.
4 Morphologische Veränderungen in PC3 humanen Prostatakrebszellen nach Behandlung mit MCC.
5 Induktion der DNA-Fragmentierung in PC3 humanen Prostatakrebszellen durch MCC.
6 Freisetzung von NuMA aus (A) LNCaP und (B) PC3 humanen Prostatakrebszellen durch MCC.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs in einem Tier, einschließlich einem Menschen, bereit, wobei eine Zusammensetzung die Myobakterium phlei (M. phlei)-DNA (M-DNA) und M-DNA umfasst, wobei die M-DNA konserviert und auf der M. phlei-Zellwand (MCC) komplexiert ist, dem Tier, das eine solche Behandlung benötigt, in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um eine antineoplastische Wirkung auf Krebszellen in der Prostata des Tiers aufzuweisen.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung "konserviert" DNA, die nicht zu einzelnen Basen abgebaut wurde.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Formulierung "komplexiert auf' die physikalische Verbindung von M-DNA mit M. phlei-Zellwand.
Wie hierin verwendet, bedeutet das Wort "Antwort" die Hemmung der Proliferation von Krebszellen, Induktion von Apoptose in Krebszellen und Stimulation der Produktion bioaktiver Moleküle durch Immunsystemzellen.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Formulierung "bioaktive Moleküle" Cytokine und reaktive Sauerstoffspezies.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Formulierung "Immunsystemzellen" Makrophagen, Monozyten, Leukozyten, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen, interstitielle Zellen und Stützzellen.
Verfahren zur Steigerung der antineoplastischen Aktivität beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf chemisches Ergänzen oder biotechnologisches Amplifizieren von M-DNA und MCC mit stimulatorischen Sequenzen oder Konformationen von DNA, die von derselben oder unterschiedlichen Bakterienspezies stammen; Ergänzen von M-DNA und MCC mit natürlich vorkommenden oder chemisch synthetisierten Nukleinsäuren und Komplexieren von M-DNA und MCC an natürliche oder synthetische Träger.
Ggf. können therapeutische Mittel einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Antiandrogen-Mittel, chemotherapeutische, steroidale und immunologische Mittel in der M-DNA- und MCC-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sein. M-DNA oder MCC und ein optionales therapeutisches Mittel können simultan oder aufeinanderfolgend, nach gleichen oder unterschiedlichen Zeitplänen verabreicht werden.
Antiandrogen-Mittel beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Flutamid, Bicalutamid, Nilutamid, Megestrolacetat, Adrenocorticotrope Hormonsekretionsinhibitoren, Ketoconazol, Östrogene, Antiöstrogene und LHRH-Produktions-Suppressoren.
Chemotherapeutische Mittel beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Antimetaboliten, DNA zerstörende, Mikrotubulus destabilisierende, Mikrotubulus stabilisierende, Aktin depolymerisierende, wachstumsinhibierende, Topoisomerase inhibierende, HMG-CoA inhibierende, Purin inhibierende, Pyrimidin inhibierende, Metalloproteinase inhibierende, CDK inhibierende, Caspase inhibierende, Proteasom inhibierende, Angiogenese inhibierende, differenzierungsinduzierende und immunotherapeutische Arzneistoffe. Diese Mittel beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Anthracyclin-Antibiotika wie beispielsweise Doxorubicin und Mitoxantron, Estramustin, Vinblastin, Paclitaxel, Etoposid, Cyclophosphamid, Cisplatin, Carboplatin und deren Kombinationen mit oder ohne Hinzufügen von Steroidarzneistoffen.
Immunologische Mittel beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Cytokine, Chemokine, Interferone, Interleukine, polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper.
Zusammensetzungen, die M-DNA und MCC und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen, werden hergestellt, indem die M-DNA und die MCC mit flüssigen Trägern, mit festen Trägem oder mit beidem einheitlich und dicht in Verbindung gebracht werden. Flüssige Träger beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf wässrige Träger, nicht wässrige Träger oder beides. Feste Träger beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf biologische Träger, chemische Träger oder beides.
M-DNA und MCC können in wässriger Suspension, Ölemulsion, Wasser-in-Öl-Emulsion, Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, stellenspezifischer Emulsion, Langzeit-beständiger Emulsion, klebriger Emulsion, Mikroemulsion, Nanoemulsion, Liposomen, Mikropartikeln, Mikrosphären, Nanosphären, Nanopartikeln, Minipumpen und mit verschiedenen natürlichen oder synthetischen Polymeren, die eine andauernde Freisetzung ermöglichen verabreicht werden.
Ferner können M-DNA und MCC mit irgendeinem, allen oder irgendeiner Kombination von Hilfsstoffen verwendet werden, ungeachtet des Trägers, der verwendet wird um die Zusammensetzung den respondierenden Zellen bereitzustellen. Diese beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika, Suspendierungsmittel, oberflächenaktive Mittel und spannungsaktive Mittel.
In einer Ausführungsform wird MCC als eine wässrige Suspension verabreicht, wobei der Größenbereich der MCC bevorzugt etwa 0,025 bis 1000 μm, weiter bevorzugt von etwa 0,050 bis 0,750 μm und am meisten bevorzugt von etwa 0,100 bis 0,500 μm beträgt. Die MCC wird in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger suspendiert wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf DNase-freies Wasser, Saline oder phosphatgepufferte Saline (PBS) und sie wird durch Standardverfahren homogenisiert und submikronisiert wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf Sonikation und Mikrofluidisierung. Beispielsweise wird lyophilisierte MCC in sterilem Wasser suspendiert und bei 20% Ausgabeleistung für 5 min beschallt (Modell W-385 Sonikator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.) oder mikrofluidisiert bei 15000 bis 30000 psi für einen oder mehrere Durchläufe (Modell M-110Y; Microfluidics, Newton, MA). Die Mischung wird entweder aseptisch verarbeitet oder abschließend sterilisiert. Ein optionales therapeutisches Mittel oder Stabilisierungsmittel kann zu der MCC während der Submikronisation oder Homogenisierung oder vor oder nach Sterilisation hinzugefügt werden.
In einer Ausführungsform wird M-DNA als eine wässrige Suspension in dem Größenbereich von bevorzugt etwa 2 bis > 12000 bp, weiter bevorzugt von etwa 2 bis 250 bp und am meisten bevorzugt von etwa 2 bis 20 bp verabreicht. Die M-DNA wird in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger suspendiert wie beispielsweise in DNase-freiem Wasser und sie wird homogenisiert und fragmentiert durch Standardverfahren wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf Sonikation und Mikrofluidisierung. Die Mischung wird aseptisch verarbeitet oder abschließend sterilisiert. Ein optionales therapeutisches Mittel oder Stabilisierungsmittel kann zu der M-DNA während der Sonikation oder Homogenisierung oder vor oder nach Sterilisation hinzugefügt werden.
Zur Verabreichung in einem nicht wässrigen Träger werden M-DNA oder MCC mit einem Mineralöl oder mit einem neutralen Öl wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf ein Diglycerid, ein Triglycerid, ein Phospholipid, ein Lipid, ein Öl und Mischungen davon emulgiert, wobei das Öl eine entsprechende Mischung von mehrfach ungesättigten und gesättigten Fettsäuren enthält. Beispiele beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Sojabohnenöl, Canolaöl, Palmöl, Olivenöl und Miglyol, wobei die Anzahl an Fettsäurekohlenstoffen zwischen 12 und 22 beträgt und wobei die Fettsäuren gesättigt oder ungesättigt sein können. Ggf. kann ein geladenes Lipid oder Phospholipid in dem neutralen Öl suspendiert sein. Z.B. wird DNase-freies Phosphatidylcholin zu DNase-freiem Triglycerid-Sojabohnenöl in einem Verhältnis von 1 g Phospholipid zu 20 ml Triglycerid hinzugefügt und es wird durch vorsichtiges Erwärmen auf 50 °C bis 60 °C gelöst. Mehrere Gramm an MCC werden zu einem trockenen autoklavierten Behälter zugegeben und die Phospholipid-Triglycerid-Lösung wird in einer Konzentration von 20 ml pro 1 g MCC hinzugefügt. Die Suspension wird für 60 min bei 20 °C inkubiert und sie wird anschließend mit DNase-freiem PBS im Verhältnis von 20 ml MCC-Suspension pro Liter PBS gemischt. Die Mischung wird emulgiert durch Sonikation bei 20% Ausgabeleistung für 5 min (Modell W-385 Sonikator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). Ggf. wird die emulgierte Mischung durch Mikrofluidisierung bei 15000 bis 30000 psi für einen oder mehrere Durchläufe homogenisiert (Modell M-110Y; Microfluidics). Die MCC-Emulsion wird zur Lagerung bei 4 °C in einen autoklavierten verschlossenen Behälter überführt. Ggf. kann ein therapeutisches Mittel oder ein Stabilisierungsmittel zu der M-DNA- oder der MCC-Zusammensetzung während der Inkubation, Emulgation oder Homogenisierung hinzugefügt werden.
M-DNA und MCC werden in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine antineoplastische Wirkung auf Krebszellen in der Prostata eines Tiers aufzuweisen. Die Dosierung von M-DNA und MCC, die verabreiht wird, wird von dem Stadium des Prostatakrebses, der behandelt wird, den Organen, welche er metastasiert haben kann, der bestimmten Formulierung oder anderen klinischen Faktoren wie beispielsweise der Größe, dem Gewicht und der Verfassung des Empfängers und der Verabreichungsweise variieren.
Bevorzugt liegt die verabreichte Menge an M-DNA und MCC bei von etwa 0,00001 bis 200 mg/kg pro Dosis, weiter bevorzugt von etwa 0,0001 bis 100 mg/kg pro Dosis und am meisten bevorzugt von etwa 0,001 bis 50 mg/kg pro Dosis. Bevorzugt ist der M-DNA-Gehalt an MCC zwischen etwa 0,001 und 90 mg/100 mg trockene MCC, weiter bevorzugt zwischen etwa 0,01 und 40 mg/100 mg trockene MCC und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,1 und 30 mg/100 mg trockene MCC. Unerwarteterweise haben wir gefunden, dass mindestens etwa 3,6% des Trockengewichts von MCC extrahierbare M-DNA ist.
Die Verabreichungswege beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf oral, topisch, subkutan, intraprostatisch, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, intraarteriell, intradermal, intrathekal, intraläsional, intratumoral, in die Blase, intravaginal, intraokular, intrarektal, intrapulmonal, intraspinal, transdermal, subdermal, Einfuhr in Kavitäten des Körpers, nasale Inhalation, pulmonale Inhalation, Impression in Haut und Elektrokorporation.
Abhängig von der Verabreichungsweise beträgt das Volumen pro Dosis bevorzugt etwa 0,001 bis 100 ml pro Dosis, weiter bevorzugt etwa 0,01 bis 50 ml pro Dosis und am meisten bevorzugt etwa 0,1 bis 30 ml pro Dosis. M-DNA und MCC können in einer Einzeldosisbehandlung oder in Mehrfachdosisbehandlungen nach einem Plan und über einen Zeitraum, der dem Stadium des behandelten Prostatakrebs, den Organen, welche er metastasiert hat, dem Zustand des Empfängers und der Verabreichungsweise entspricht, verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele werden dazu dienen, die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen.
Beispiel 1
Herstellung von MCC und M-DNA
MCC wurde aus M. phlei hergestellt wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/CA98/00744 beschrieben, die hierin als Referenz inbegriffen ist. Alle Reagenzien wurden so ausgewählt, um die DNA zu konservieren.
M-DNA wurde aus M. phlei und aus MCC hergestellt wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/CA98/00744 beschrieben, die hierin als Referenz inbegriffen ist. Alle Reagenzien wurden so ausgewählt, um die DNA-Konservierung zu steigern (sie zu konservieren).
Wenn nicht anders angegeben, wurden M-DNA und MCC in DNase-freiem Wasser oder in einem pharmazeutisch annehmbaren DNase-freien Puffer suspendiert und beschallt. Die Partikelgröße der MCC wurde während der Beschallung durch Photonenkonelationsspektroskopie bestimmt (Zetasizer 3000, Malvern Instruments, Malvern, Worcester, England). Der Durchmesser der MCC verringerte sich schrittweise mit der Beschallung (Tabelle 1). Das Molekulargewicht der M-DNA wurde während der Beschallung bestimmt durch Elektrophorese in 2,0%-igem Agarosegel, welches 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt (3 h bei 100 V). Das Molekulargewicht der M-DNA verringerte sich schrittweise bei der Beschallung (Tabelle 2).
Tabelle 1 MCC-Durchmesser
Tabelle 2 M-DNA-Molekulargewicht
M-DNA und MCC enthielten keine Endotoxine, wie unter Verwendung eines Limulus-Amebocyt-Lysat-QCL-1000-Kit (BioWhittaker, Walkersville, MD) bestimmt wurde. Die Limulus-Amebocyt-Lysat-Empfindlichkeit dieses Assays beträgt 5,5 pg Endotoxin/ml.
Beispiel 2
Herstellung von B-DNA und BCC
B-DNA und BCC werden aus M. smegmatis, M. fortuitous, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Cornybacterium parvum, M. kansaii, M. tuberculosis und M. bovis hergestellt, wie in Beispiel 1.
Beispiel 3
DNase I-Behandlung
Die Behandlung von M-DNA und MCC mit DNase I wurde wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/CA98/00744 beschrieben durchgeführt. DNase I verdaut sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA und verursacht eine nahezu vollständige Degradation der DNA.
Beispiel 4
Zellen und Reagenzien
Human-PC3 und DU-145 androgen-unabhängige und LNCaP androgen-abhängige Prostatakrebszellen wurden von dem ATCC bezogen (#CRL-1435, HTB-81 bzw. CRL-1740). Primäre humane Prostataepithelzellen (PrEc) wurden von Clonetics bezogen (#CC-2555, Walkersville, MD, USA). Alle Zelllinien wurden gemäß Herstelleranweisungen kultiviert. PC3-, DU-145-, LNCaP- und PrEc-Zellen wurden mit 3×10⁵ Zellen/ml Wachstumsmedium in 6-Well-Flachbodenmikroplatten gesät und für 24 h bei 37 °C in 5%-igem CO₂ wachsen gelassen. Nach 24 h wurde das Wachstumsmedium durch Wachstumsmedium, welches M-DNA oder MCC enthielt, ersetzt.
Beispiel 5
Hemmung der Prostatakrebszell-Proliferation durch MCC
Die Zellproliferation wurde unter Verwendung von Dimethylthiazoldiphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reduktion bestimmt (Mosman et al. J. of Immunol. Meth. 65:55, 1983).
PC3-, DU-145- und LNCaP-Prostatakrebszellen und PrEc-Prostataepithelzellen wurden mit 0, 0,01, 0,10, 1, 10 und 100 μg/ml MCC inkubiert. Nach 48 h wurden 100 μl an MTT in 5 mg/ml phosphatgepufferter Saline zu jedem Well hinzugefügt und die Inkubation wurde für 4 h fortgesetzt. Das Medium wurde anschließend aus jedem Well entfernt, es wurde 1 ml angesäuerter Isopropylalkohol hinzugefügt und reduziertes MTT wurde durch Mischen solubilisiert. Die Absorption des Reaktionsprodukts wurde bei 570 nm bestimmt. MCC mit 1, 10 und 100 μg/ml hemmte die Proliferation von androgen-abhängigen LNCaP-Prostatakrebszellen und von androgen- unabhängigen PC3- und DU-145-Prostatakrebszellen, hemmte jedoch nicht die Proliferation von normalen PrEc Prostatazellen (1).
Diese Daten zeigen, dass MCC die Proliferation von sowohl androgen-abhängigen als auch androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen in Abwesenheit von Immuneffektorzellen hemmt. MCC hemmt nicht die Proliferation von normalen Prostatazellen.
Beispiel 6
Hemmung von Prostatakrebszell-Proliferation durch M-DNA
PC3- und LNCaP-Prostatakrebszellen wurden mit 10 und 100 μg/ml M-DNA inkubiert. Die Zellproliferation wurde wie in Beispiel 5 bestimmt. M-DNA mit 10 und 100 μg/ml hemmte die Proliferation von PC3-Prostatakrebszellen (2). Diese Daten zeigen, dass M-DNA die Proliferation von androgen-abhängigen und androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen in Abwesenheit von Immuneffektorzellen hemmt.
Beispiel 7
Hemmung von Prostatakrebszell-Proliferation durch MCC und durch mit DNase I behandelte MCC
PC3-Prostatakrebszellen wurden mit 1 Einheit/ml DNase I, mit 1 μg/ml MCC und mit 1 μg/ml mit DNase I behandelter MCC inkubiert.
DNase I hemmte die Proliferation von PC3-Krebszellen zu etwa 5%, MCC hemmte die Proliferation von PC3-Krebszellen zu etwa 50% und mit DNase I behandelte MCC hemmte die Proliferation von PC3-Krebszellen zu etwa 30% (3).
Diese Daten zeigen, dass MCC die Proliferation von androgen-abhängigen Prostatakrebszellen in Abwesenheit von Immuneffektorzellen hemmt. Ferner zeigen diese Daten, dass die Behandlung von MCC mit DNase I die antiproliferative Wirkung von MCC verringert.
Beispiel 8
Induktion von Apoptose, wie durch morphologische Veränderungen angezeigt
Morphologische Veränderungen, die auf Zelltod durch Apoptose hinweisen, beinhalten die Kondensation von nuklearem Chromatin, Zellschrumpfen, nukleare Desintegration, Plasmamembran-Bläschenbildung und die Bildung von membrangebundenen Körperchen (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980).
PC3-Prostatakrebszellen wurden mit 0 und mit 200 μg/ml MCC für 48 h inkubiert. Aufnahmen wurden auf einem Lichtmikroskop mit einem 40 × 2,5 NA Apochromatobjektiv gesammelt. Zellen, die mit 0 μg/ml MCC inkubiert wurden, zeigten eine normale Morphologie, während Zellen, die mit 200 μg/ml MCC inkubiert wurden, deutliche morphologische Veränderungen aufwiesen, die Zelltod durch Apoptose anzeigen (4).
Diese Daten zeigen, dass MCC in androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen in Abwesenheit von Immuneffektorzellen Apoptose induziert.
Beispiel 9
Induktion von Apoptose, wie durch DNA-Fragmentierung angezeigt
Die Fragmentierung von zellulärer DNA in nukleosomgroße Fragmente durch die Aktivierung von endogenen Endonukleasen ist charakteristisch für Zellen, die Apoptose durchlaufen (Wyllie A. H. Nature 284:555, 1981; Newell et al. Nature 357:286, 1990).
Während der routinemäßigen Monoschichtkultur von PC3-Zellen löste sich eine beachtliche Anzahl von Zellen von der Kunststoffoberfläche der Gewebekulturwells und gelangte in das Medium (Palayoor et al., Radiation Res. 148:105, 1997). Nach 48 h der Behandlung mit MCC erhöhte sich der Anteil der abgelösten Zellen. Daher wurde die DNA-Fragmentierung sowohl in abgelösten als auch in gebundenen PC3-Zellen analysiert (Smith et al. Nature 337:795, 1989).
Abgelöste Zellen wurden gesammelt und bei 350 × G für 5 min zentrifugiert. Das Pellet der abgelösten Zellen und die verbleibenden gebundenen Zellen wurden bei 55 °C für 1 h in 50 μl Puffer lysiert, der 50 mm Tris-HCl (pH 8,0), 10 mm EDTA, 0,5% (w/v) Natriumlaurylsarkosinat (SDS) und 0,5 mg/ml Proteinase K (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario) enthielt. Zu jeder Probe wurden 10 μl an 0,5 mg/ml RNase A (Sigma-Aldrich Canada) hinzugefügt und die Inkubation wurde für 1 h fortgesetzt. Die Proben wurden auf 65 °C erwärmt und 10 μl an 10 mm EDTA (pH 8,0), welche 1 % (w/v) Agarose mit niedriger Geliertemperatur, 0,25% (w/v) Bromphenolblau, 40% (w/v) Saccharose enthielt, wurden mit jeder Probe vermischt. Die Proben wurden bei 100 V für 3 h elektrophoresiert in einem 2%-igen Agarosegel, welches Trisborat/EDTA-Puffer (TBE) enthielt. Die DNA wurde unter UV-Transillumination unter Verwendung von Ethidiumbromidanfärben sichtbar gemacht.
Abgelöste und gebundene PC3-Prostatakrebszellen wurden für 48 h mit 0 und 100 μg/ml MCC inkubiert. Abgelöste Zellen, die mit 100 μg/ml MCC behandelt wurden, zeigten deutliche DNA-Fragmentierung (5, Linien 3 und 4), während abgelöste Zellen, die mit 0 μg/ml MCC behandelt wurden, keine Fragmentierung zeigten (5, Linie 1). Gebundene Zellen, die mit 100 μg/ml MCC behandelt wurden, zeigten keine DNA-Fragmentierung (5, Linie 2).
Diese Daten zeigen, dass MCC in abgelösten androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen in Abwesenheit von Immuneffektorzellen Apoptose induziert, wie durch DNA-Fragmentierung angezeigt.
Beispiel 10
Induktion von Apoptose, wie durch NuMA-Freisetzung angezeigt
Die Induktion von Apoptose kann auch durch die Solubilisierung und Freisetzung von nuklearem Matrix (NuMA)-Protein gezeigt werden. LNCaP-Prostatakrebszellen wurden für 48 h mit 0, 100, 200 und 300 μg/ml MCC inkubiert, während PC3-Prostatakrebszellen für 48 h mit 0, 100 und 300 μg/ml MCC inkubiert wurden. Das Medium wurde entfernt, mit 10000 × G zentrifugiert und der Überstand wurde bei –20 °C eingefroren, bis er auf NuMA untersucht wurde (Miller et al. Biotech. 15:1042, 1993).
LNCaP-Prostatakrebszellen, die mit 100, 200 oder 300 μg/ml MCC behandelt wurden, setzten 20%, 50% bzw. 135% mehr NuMA-Proteine in das Medium frei als Zellen, die mit 0 μg/ml MCC behandelt wurden (6A). PC3-Prostatakrebszellen, die mit 100 und 300 μg/ml MCC behandelt wurden, setzten 24% mehr NuMA-Proteine in das Medium frei als Zellen, die mit 0 μg/ml MCC behandelt wurden (6B). Diese Daten zeigen, dass MCC in androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen in Abwesenheit von Immuneffektorzellen Apoptose induziert, wie durch NuMA-Freisetzung angezeigt.
Beispiel 11
Wirkung von MCC und M-DNA auf die IL-12- und TNF-α-Synthese durch Monozyten und LNCaP-Zellen
Humane monozytische THP-1-Zellen wurden von dem ATCC bezogen und sie wurden wie vom Hersteller empfohlen kultiviert. THP-1-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) und LNCaP-Zellen (3 × 10⁵ Zellen/ml) wurden mit 0, 0,1 und 10 μg/ml MCC für 48 h in 5%-igem CO₂ in 6 Well-Flachbodenmikroplatten inkubiert. Nach 48 h wurden die Überstände gesammelt und die Anwesenheit von IL-12 und TNF-α wurde unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (Biosource, Camarillo, CA, USA) bestimmt. MCC und M-DNA induzierten die Synthese von IL-12 (Tabelle 3) und TNF-α (Tabelle 4) durch Immunsystemzellen, THP-1-Monozyten und durch LNCaP-Prostatatumorzellen. Es zeigte sich, dass die Cytokine IL-12 und TNF-α beide eine antineoplastische Wirkung gegenüber einer Reihe von Krebszellen, einschließlich Prostatakrebszellen, aufweisen (Izquierdo et al. Anticancer Drugs 7:275, 1996; Sensibar et al. Cancer Res. 55:2431, 1995).
Tabelle 3 Induktion von IL-12 durch MCC und M-DNA
Tabelle 4 Induktion von TNF-α durch MCC und M-DNA
Beispiel 12
Wirkungen von MCC, M-DNA und von mit DNase I behandelter MCC auf PC3-Tumore in Mäusen
Androgen-unabhängige PC3-Prostatakrebszellen werden subkutan in 40 männliche nackte BALB/c-Mäuse implantiert und wachsen gelassen bis sie tastbar sind (0,1 bis 0,5 cm Durchmesser). Die Mäuse werden in vier Gruppen eingeteilt und die Tumormasse wird in jeder Maus gemessen. Die 10 Mäuse in Gruppe 1 erhalten jeweils Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 2 erhalten jeweils Saline die MCC enthält. Die 10 Mäuse in Gruppe 3 erhalten jeweils Saline die M-DNA enthält. Die 10 Mäuse in Gruppe 4 erhalten jeweils mit DNase I behandelte MCC. Nach 4 Wochen einmal wöchentlicher intratumoraler Behandlungen werden die Mäuse getötet und die Tumormasse und die Anzahl an Metastasen werden bestimmt. Die Mäuse in Gruppe 2 und in Gruppe 3 weisen geringere Tumormassen und weniger Metastasen auf als die Mäuse in Gruppe 1 und in Gruppe 4.
Beispiel 13
Wirkungen von MCC und von M-DNA allein und in Kombination mit Estramustin und Etoposid auf PC3-Tumore in Mäusen
Androgen-unabhängige PC3-Prostatakrebszellen werden subkutan in 60 männliche nackte BALB/c-Mäuse implantiert und wachsen gelassen bis sie tastbar sind (0,1 bis 0,5 cm Durchmesser). Die Mäuse werden in sechs Gruppen eingeteilt und die Tumormasse wird in jeder Maus gemesen. Die 10 Mäuse in Gruppe 1 erhalten Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 2 erhalten MCC in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 3 erhalten M-DNA in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 4 erhalten Estramustin und Etoposid in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 5 erhalten MCC in Kombination mit Estramustin und Etoposid in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 6 erhalten M-DNA in Kombination mit Estramustin und Etoposid in Saline. Nach 4 Wochen einmal wöchentlicher intratumoraler Behandlung werden die Mäuse getötet und die Tumormasse und die Anzahl an Metastasen werden bestimmt. Die Mäuse in Gruppe 1 weisen die größte Tumormasse auf. Die Mäuse in Gruppe 4 weisen eine geringer Tumormasse auf als die Mäuse in Gruppe 1. Die Mäuse in Gruppe 2 und Gruppe 3 weisen eine geringere Tumormasse auf als die Mäuse in Gruppe 4. Die Mäuse in Gruppe 5 und in Gruppe 6 weisen die geringste Tumormasse auf.
Beispiel 14
Wirkungen von MCC, M-DNA und von mit DNase I behandelter MCC auf LNCaP-Tumore in Mäusen
Androgen-abhängige LNCaP-Prostatakrebszellen werden subkutan in 40 männliche nackte BALB/c-Mäuse implantiert und wachsen gelassen bis sie tastbar sind (0,1 bis 0,5 cm Durchmesser). Die Mäuse werden in vier Gruppen eingeteilt und die Tumormasse wird in jeder Maus gemessen. Die 10 Mäuse in Gruppe 1 erhalten jeweils Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 2 erhalten jeweils Saline die MCC enthält. Die 10 Mäuse in Gruppe 3 erhalten jeweils Saline die M-DNA enthält. Die 10 Mäuse in Gruppe 4 erhalten jeweils mit DNase I behandelte MCC. Nach 4 Wochen einmal wöchentlicher intratumoraler Behandlung werden die Mäuse getötet und die Tumormasse und die Anzahl an Metastasen werden bestimmt. Die Mäuse in Gruppe 2 und in Gruppe 3 weisen eine geringere Tumormasse und weniger Metastasen auf als die Mäuse in Gruppe 1 und in Gruppe 4.
Beispiel 15
Wirkungen von MCC und von M-DNA allein und in Kombination mit Flutamid auf LNCaP-Tumore in Mäusen
Androgen-abhängige LNCaP-Prostatakrebszellen werden subkutan in 60 männliche nackte BALB/c-Mäuse implantiert und wachsen gelassen bis sie tastbar sind (0,1 bis 0,5 cm Durchmesser). Die Mäuse werden in sechs Gruppen eingeteilt und die Tumormasse wird in jeder Maus gemessen. Die 10 Mäuse in Gruppe 1 erhalten Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 2 erhalten MCC in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 3 erhalten M-DNA in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 4 erhalten Flutamid in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 5 erhalten MCC in Kombination mit Flutamid in Saline. Die 10 Mäuse in Gruppe 6 erhalten M-DNA in Kombination mit Flutamid in Saline. Nach 4 Wochen einmal wöchentlicher intratumoraler Behandlung werden die Mäuse getötet und die Tumormasse und die Anzahl an Metastasen werden bestimmt. Die Mäuse in Gruppe 1 weisen die größte Tumormasse auf. Die Mäuse in Gruppe 4 weisen eine geringere Tumormasse auf als die Mäuse in Gruppe 1. Die Mäuse in Gruppe 2 und Gruppe 3 weisen eine geringere Tumormasse auf als die Mäuse in Gruppe 4. Die Mäuse in Gruppe 5 und in Gruppe 6 weisen die geringste Tumormasse auf.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die M-DNA und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs.
Verwendung einer Zusammensetzung, die konservierte und auf M.phlei Zellwand (MCC) komplexierte M-DNA und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei der Prostatakrebs hormonsensitiver Prostatakrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei der Prostatakrebs hormoninsensitiver Prostatakrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei die Proliferation der Krebszellen in der Prostata gehemmt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei Apoptose in den Krebszellen in der Prostata induziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei die Zytokin-Synthese durch Zellen in der Prostata induziert wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Zytokine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus IL-12 und TNF-α.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Zellen in der Prostata ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Immunsystem-Zellen und Prostatakrebs-Zellen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der pharmazeutisch annehmbare Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem festen Träger und einem flüssigen Träger.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ferner Antiandrogen-Mittel, chemotherapeutische Mittel, steroidale Mittel oder/und immunologische Mittel umfasst.