DE4310935A1

DE4310935A1 - Mikroemulsionen, deren Herstellung sowie Verwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen

Info

Publication number: DE4310935A1
Application number: DE4310935A
Authority: DE
Inventors: Raul Cavalcante Maranhao
Original assignee: Zerbini Fundacao Ej Sao Paulo Br; ZERBINI E J FUNDACAO
Current assignee: Icell Therapeutics Corrp Richmond Bc Ca
Priority date: 1992-04-02
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 1993-11-18
Also published as: US5578583A; BR9201168A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mikroemulsionen, die Träger für the rapeutische Wirkstoffe sein können, und insbesondere proteinfreie Mikroemul sionen, die sich für den Transport therapeutischer Wirkstoffe an den Ort der Wirksamkeit dieser Stoffe, insbesondere Krebszellen, eignen.

Die Herstellung von proteinfreien Lipid-Mikroemulsionen ist aus der Literatur bekannt (Ginsburg, Atkinson und Small, J. Biol. Chem. 257 : 8216, 1982; At kinson und Redinger, J. Lipid. Res. 31 : 849 1990, sowie weitere Literaturzi tate). Solche Mikroemulsionen werden aus Phospholipiden hergestellt.

Die vorliegende Erfindung stellt nun proteinfreie Mikroemulsionen zur Verfü gung, die bezüglich ihrer Lipidzusammensetzung mit LDL (Low Density Lipo protein) Ähnlichkeiten aufweisen, jedoch keinen Proteinanteil besitzen.

Diese Mikroemulsionen können an die LDL-spezifischen Rezeptoren binden, die in den meisten körpereigenen Geweben vorhanden sind. Diese LDL-spezifi schen Rezeptoren sind die sogenannten B,E-Rezeptoren. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß eine proteinfreie Mikroemulsion bei der Injektion in das Plasma durch Kollision mit nativem Lipoprotein Apolipoprotein E an sich bindet, das auf der Oberfläche von nativem VLDL (Verv Low Density Lipoprotein) oder HDL (High Densitv Lipoprotein) vorhanden ist.

Es wurde festgestellt, daß der Rezeptor an die Mikroemulsion gebundenes Apo E bindet, was es ermöglicht, daß die künstliche Mikroemulsion mittels Rezep tor-mediierter Endozytose in die Zellen eindringen kann. Da verschiedene neo plastische Zellinien eine stark erhöhte Anzahl an LDL-Rezeptoren aufweisen (dies ist aus der Literatur bereits bekannt, und die Anzahl der Rezeptoren kann im Vergleich zu normalen Zellen auf das 100-fache vergrößert sein), können sie große Mengen der Mikroemulsions-Teilchen inkorporieren. Normale Zellen haben dagegen im wesentlichen "geschlossene Türen" für das Eindringen der künstlichen Teilchen. Die Gesetze der physikalischen Chemie ermöglichen es, daß hydrophobe, lipophile Substanzen in den hydrophoben Kern der Mikroemulsionsteilchen eingearbeitet werden. Die Einarbeitung dieser therapeu tischen Wirkstoffe verringert die Aufnahme von Apo E aus dem Plasma durch die Teilchen der Mikroemulsion und die Bindungsfähigkeit an die Rezeptoren nicht. Die Erfinder konnten feststellen, daß bei Verabreichung radioaktiv mar kierter Mikroemulsionen an Kontrollpersonen keine Veränderungen der im Plasma beobachtbaren kinetischen Daten auftraten, unabhängig davon, ob Carmustin oder Cytosinarabinosid in den Mikroemulsionen vorhanden war oder nicht. Jeder therapeutische Wirkstoff, der lipophil ist oder lipophil gemacht werden kann, kann in die Mikroemulsionen eingearbeitet werden.

Die Mikroemulsionen verhalten sich ähnlich wie Lipoproteine, die im zirkulie renden Plasma vorhanden sind. Sie sind deshalb für den Organismus nicht to xisch. Es lassen sich daher Mengen bis zu mehreren Gramm der Mikroemulsion in den Blutstrom infundieren, die beispielsweise in einer physiologischen Koch salzlösung verdünnt ist. Die Konzentration an Apo E im Plasma ist ausrei chend, um mehrere Gramm der Mikroemulsion mit dieser Substanz zu verse hen und zu bewirken, daß innerhalb von etwa 10 bis 20 Stunden diese künstli chen Teilchen von den neoplastischen Zellen aufgenommen werden. Nach bisherigen Berechnungen können bis zu 20 bis 25 % eines hydrophoben therapeutischen Wirkstoffs, beispielsweise eines Krebsmittels, in den Kern der künstlichen Teilchen eingebracht werden. Mit derartigen Wirkstoffen beladene Emulsionen verändern die biologisch determinierte Verteilung des Mittels im Körper, denn an die Stelle der normalerweise zu erwartenden Verteilung tritt eine Verteilung, die dem Muster der Verteilung der Mikroemulsion folgt.

Die Menge an Mikroemulsion und die Menge an darin eingearbeitetem Wirk stoff hängt von der Art des Wirkstoffs und der spezifischen Krebserkrankung ab.

Wenn in diesen Mikroemulsionen die hydrophobe Phase die diskontinuierliche Phase ist, besteht sie aus einem hydrophoben Innenteil, vorzugsweise aus Cholesterinester, der zusätzlich Triglycerid(e) enthalten kann, sowie einer die sen Innenteil umschließenden Monoschicht, die gewöhnlich aus Phospholi pid(en) besteht, jedoch auch freies Cholesterin enthalten kann.

Die Herstellung einer derartigen Mikroemulsion erfolgt dadurch, daß die hydro phoben Teile dieser Mikroemulsion in einem wäßrigen Medium, z. B. einer Salzlösung und vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, einer Ultra schallbehandlung unterworfen und anschließend mit Hilfe verschiedener Me thoden gereinigt werden. Für die Reinigung eignet sich Ultrazentrifugation oder auch Gelfitration. Die Lipidmischung kann auch durch Pressen durch eine French-Presse emulgiert werden.

Wird eine hier beschriebene Mikroemulsion in die Blutbahn injiziert, bindet sie an ihrer Oberfläche das Apolipoprotein E (Apo E), das im Plasma vorkommt, und zwar entweder in an die Plasmalipoproteine assozierter oder in freier Form. Das Apolipoprotein E dient so als Verbindungsglied zwischen den Partikeln der Mikroemulsion und den LDL-Rezeptoren auf den Zelloberflächen, welche das Apo E erkennen. Aus der Literatur ist bekannt, daß die Anzahl der LDL-Rezep toren in verschiedenen neuplasmatischen Zellschüben stark erhöht ist.

Therapeutische Wirkstoffe, und insbesondere solche gegen Krebs, können in LDL inkorporiert werden. Aufgrund der hohen Expression von Rezeptoren auf neoplastischen Zellen können diese therapeutischen Wirkstoffe in hohen Kon zentrationen zu den und in die neoplastischen Zellen gebracht werden, wäh rend gleichzeitig diese Wirkstoffe nur wenig auf normale Zellen einwirken, da deren Zahl an LDL-Rezeptoren vergleichsweise niedrig ist. Es ist deshalb mög lich, Arzneimittel ganz gezielt in neoplastische Gewebe zu bringen, wobei die toxischen Effekte dieser Arzneimittel gegenüber normalem Gewebe und ande ren Organen vermieden werden.

Allerdings ist das Plasma-LDL für eine derartige Behandlung aus technischen Gründen nicht geeignet. Dagegen können die erfindungsgemäßen Mikroemul sionen als Trägersubstanzen zum Transportieren derartiger therapeutischer Wirkstoffe, insbesondere chemotherapeutische Wirkstoffe, und speziell zur Be handlung von neoplastischem Gewebe eingesetzt werden. Da auch die erfin dungsgemäßen Mikroemulsionen LDL-Rezeptoren binden können, wenn auch mit Hilfe eines anderen Proteins, nämlich des Apolipoproteins E, während das LDL mit Hilfe des Apolipoproteins B an diese Rezeptoren bindet, können auch die künstlich hergestellten Mikroemulsionen der vorliegenden Erfindung als Trägermaterialien für die genannten therapeutischen Wirkstoffe dienen.

Die oben erwähnte Hypothese bezüglich der Bindung von LDL an LDL-Rezepto ren mit Hilfe von Apolipoproteinen ist an Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) bestätigt worden, einer Krankheit, bei der die LDL-Rezeptoren 3- bis 100fach erhöht sind. In dieser Gruppe war nach einer Injektion einer Mikroemulsion die Abnahme der im Plasma vorhandenen Menge dieser Emul sion, die mit einem radioaktiven Cholesterinester markiert war, viel schneller als bei normalen Testpersonen oder Individuen mit akuter Lymphozytenleu kämie, einer Krankheit, bei der die Rezeptoren in normaler Menge expremiert werden. Durch die Behandlung von AML-Patienten, die zu einem Rückgang der Erkrankung führte, d. h. zu einem Zustand, in welchem die Zellen mit einer übergroßen Anzahl an LDL-Rezeptoren verschwinden, normalisierte sich die Abnahme der im Plasma vorhandenen Menge an Mikroemulsion, was deutlich zeigt, daß die Mikroemulsion tatsächlich in der Lage ist, spezifisch in neoplasti sche Zellen einzudringen. Gegen Krebserkrankungen wirksame Medikamente oder Wirkstoffe, und zwar insbesondere solche, die hydrophob sind, können also in die Mikroemulsionen eingearbeitet werden, die dann die genannten Arz neimittel zu den Krebszellen transportieren, während sie dabei auf die normalen Gewebe nur minimal einwirken. Die Folge ist nicht nur der spezifische Trans port des therapeutischen Wirkstoffs zum Ort seiner Wirksamkeit, sondern auch eine starke Herabsetzung der Toxizität dieses Wirkstoffs. Dieser Effekt kann immer dann beobachtet werden, wenn der Typ der zu behandelnden Zellinie LDL-Rezeptoren in gesteigerter Menge expremiert, was in der Literatur bereits für akute myeloische Leukämie, myeloproliferative Erkrankungen, Gliom, en dometranes Karzinom, Prostatakarzinom, Uteruskarzinom, Mammakarzinon, Gallenblasenkarzinom und Lungenkarzinom beschrieben ist. Aufgrund ihrer ho hen Affinität gegenüber den Rezeptoren können mit Radioaktivität oder anders markierte Mikroemulsionen auch für diagnostische Zwecke oder für die Lokali sierung maligner Tumore verwendet werden. So eignen sich beispielsweise Mi kroemulsionen, die mit ^99mTC (^99mTechnicium Radioisotop) markiert sind, für die bildgebende Abbildung fester Tumore, wie Mammakarzinom, Gallenblasen karzinom etc., in der Nuklearmedizin.

Die Einarbeitung hydrophober Wirkstoffe, z. B. von Carmustin oder Zytosinara binosid zur Ausbildung der Zusammensetzung Emulsion/Wirkstoff erfolgt, nachdem die Mikroemulsion bereits hergestellt wurde, durch gemeinsame Be schallung der Mikroemulsion mit dem Wirkstoff für 1 min. oder durch einfache Einarbeitung. Bei einem Versuch betrug die Endzusammensetzung der Emulsion 64% Phospholipid(e), 33% Cholesteryloleat, 1 % Cholesterin und 2% Triolein. Das gesamte Verfahren wurde dabei unter sterilen Bedingungen vorgenommen, um das Auftreten von Pyrogenen zu vermeiden. Die Mikroemulsion war aus einer Mischung von 40 mg Phosphatylcholin, 20 mg Cholesteryloleat, 1 mg Triolein und 0,5 mg Cholesterin gebildet. Zu dieser Mischung wurde eine physiologische Kochsalzlösung zugegeben, die während 1 Std. mit einer Leistung von 70 bis 80 Watt beschallt wurde, wobei die Temperatur bei rund 50 bis 54°C gehalten wurde.

Die erhaltene Emulsion wurde durch Ultrazentrifugieren gereinigt wie dies in der einleitend angegebenen Literatur bereits beschrieben ist, dialysiert und ste rilfiltriert für eine Injektion bei menschlichen Patienten. Der Wirkstoff Carmustin wurde bis zu 12 Gew.-% des Gesamtgewichtes eingelagert.

Die Zusammensetzung der Emulsion kann zur besseren Einlagerung chemothe rapeutischer Wirkstoffe modifiziert werden, da eine Vielzahl solcher Wirkstoffe in die Emulsion inkorporiert werden können. So kann z. B. der Anteil an Triolein auf 20% zur Ausbildung größerer Mikroemulsionspartikel gesteigert werden, durch die eine größere Menge an Wirkstoff pro Partikel transportiert werden kann. Dabei können viele Variationen der Mikroemulsion, die von den Erfindern studiert wurden, zum selben Ergebnis führen, d. h. wenn sie in mit Apo E ver setztes Plasma injiziert werden, binden sie an die LDL-spezifischen Rezeptoren und werden bevorzugt in neoplastischen Zellen aufgenommen, die eine stark erhöhte Anzahl solcher Rezeptoren aufweisen, wobei die Mikroemulsionen für diese Mechanismen mit gegenüber Krebskrankheiten wirksamen Wirkstoffen spezifisch für solche Zellen beladen sind.

Claims

1. Mikroemulsion, umfassend als hydrophoben Teil ein Cholesterinester, Phospholipid (e) sowie fakultativ Triglycerid(e) und/oder freies Cholesterin ent haltende Mischung.

2. Mikroemulsion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Phosphati dyldolin als Phospholipid eingesetzt wird.

3. Mikroemulsion nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Cho lesteryloleat als Cholesterinester eingesetzt wird.

4. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Triolein als Triglycerid eingesetzt wird.

5. Mikroemulsion nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die hydro phobe Phase Teilchen mit einem Kern aus Cholesterinestern und fakultativ Trigylcerid(en) sowie eine umgebende Monoschicht aus Phosphorlipid(en) und fakultativ freiem Cholesterin enthält.

6. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobe Phase aus
64 % Phospholipid,
33 % Cholesteryloleat,
1 % Cholesterin sowie
2 % Triolein
basierend auf Gewichts- oder Volumen-Anteilen, besteht.

7. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie als hydrophilen Teil eine Salzlösung, vorzugsweise eine physiologische Kochsalzlösung, enthält.

8. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin einen therapeutischen Wirkstoff enthält.

9. Mikroemulsion nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirk stoff lipophil ist.

10. Mikroemulsion nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen gegenüber Krebskrankheiten wirksamen Wirkstoff, vorzugsweise Char mustin und/oder Cytosinarabinosid, enthält.

11. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeich net, daß der Wirkstoff in einer Menge von bis zu 25 Gew.-%, vorzugsweise bis zu 20 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt bis zu 12 Gew.-% der Gesamt menge der Mikroemulsion, enthalten ist.

12. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeich net, daß sie einen Marker, vorzugsweise einen radioaktiven Marker, enthält.

13. Verfahren zum Herstellen einer Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch die folgenden, nacheinander durchgeführten Schritte:

- Emulgieren der hydrophoben Phase mit der hydrophilen Phase, vorzugsweise mit Hilfe von Ultraschallbehandlung oder Pressen mit Hilfe einer French-Presse;
- Reinigen der entstandenen Emulsion, vorzugsweise durch Ultrazentrifugation, Ultrafiltration oder Gelfiltration, sowie fakultativ
- Einarbeiten eines therapeutischen Wirkstoffs in die Mikroemulsion, vorzugs weise durch Ultraschallbehandlung.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die fertige Mi kroemulsion dialysiert und/oder sterilfiltriert wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeich net, daß die Verfahrensschritte unter Sterilbedingungen erfolgen.

16. Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Anwendung bei der therapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen.

17. Verwendung der Mikroemulsion nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Behandlung von Krebserkrankungen.

18. Mikroemulsion nach Anspruch 12 zur Anwendung für diagnostische Zwecke.

19. Mikroemulsion nach Anspruch 12 zur Anwendung bei der Lokalisierung von Tumoren.

20. Verwendung der Mikroemulsion nach Anspruch 12 für diagnostische Zwecke oder zum Lokalisieren maligner Tumore.