DE69920506T2

DE69920506T2 - Chemotherapeutische zusammensetzung und verfahren

Info

Publication number: DE69920506T2
Application number: DE69920506T
Authority: DE
Inventors: C. Nigel PHILLIPS; C. Mario FILION
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Current assignee: Telesta Therapeutics Inc
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2019-12-04
Also published as: CA2353905A1; PT1135161E; CA2353905C; WO2000033875A1; EP1135161A1; ATE276766T1; JP4380922B2; NZ511941A; EP1135161B1; JP2002531524A; AU1541200A; ES2229792T3; DE69920506D1; AU782335B2; DK1135161T3

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität von US Provisional Anmeldung Nr. 60/111,019, eingereicht am 4. Dezember 1998, und von US Provisional Anmeldung Nr. 60/127,320, eingereicht am 1. April 1999.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend Mycobacterium phlei (M. phlei)-DNA (M-DNA), M-DNA, die auf M. phlei-Zellwand (MCC) konserviert und komplexiert ist, und ein chemotherapeutisches Mittel, wobei die M-DNA und die MCC zum Behandeln von Krebs und zum Potenzieren des antineoplastischen Effekts des chemotherapeutischen Mittels auf den Krebs wirksam sind.
Hintergrund der Erfindung
Krebs ist eine anomale Netto-Akkumulierung von atypischen Zellen, die aus einem Übermaß an Proliferation, einem nicht ausreichendem Maß an Zelltod oder einer Kombination der beiden resultiert.
Proliferation ist die Kulmination des Fortschreitens einer Zelle durch den Zellzyklus und ist durch eine Replikation der gesamten zellulären DNA und die Teilung von einer Zelle in zwei Zellen charakterisiert. Für die Zellteilung durchlaufen Säugetierzellen eine organisierte Reihe von kontrollierten Ereignissen, die als der Zellzyklus bezeichnet werden. Die Initiation eines Ereignisses während des Fortschreitens durch den Zellzyklus hängt von dem erfolgreichen Abschluß eines früheren Ereignisses ab. Der Zellzyklus kann in fünf Hauptphasen eingeteilt werden. Diese sind Go, G₁, S, G₂ und M. Während der Go-Phase ruhen die Zellen. Die meisten Zellen im Körper befinden sich zu einem Zeitpunkt in diesem Stadium. Während der G₁-Phase erzeugen Zellen in Antwort auf Teilungssignale RNA sowie die Proteine, die für die DNA-Synthese notwendig sind. Während der S-Phase (SE, frühe S-Phase; SM, mittlere S-Phase; und SL, späte S-Phase) replizieren die Zellen ihre DNA. Am Ende der S-Phase enthält jede Zelle zweimal ihren ursprünglichen DNA-Gehalt, ist aber immer noch durch eine äußere Zellmembran gebunden. Während der G₂-Phase werden Proteine in Vorbereitung für die Zellteilung angefertigt. Während der mitotischen Phase (M) teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen.
Veränderungen hinsichtlich des Durchlaufens des Zellzyklus finden bei allen Krebsen statt und können aus einer Überexpression von Genen, Mutation von regulatorischen Genen oder der Aushebung von DNA-Schädigungskontrollpunkten resultieren und können die zelluläre Antwort auf eine Behandlung mit chemotherapeutischen Mitteln modulieren (Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8:903, 1997).
Der Zelltod wird durch Immun-Mediatoren bewirkt, die cytolytische Prozesse initiieren und die die Apoptose fördern, sowie von Apoptose-Inducern, die zum Zelltod führende Pathways direkt initiieren. Apoptose ist ein aktiver Zelltodprozeß, charakterisiert durch kennzeichnende morphologische Veränderungen, die die Kondensation von Kernchromatin, Zeltschrumpfung, Kernauflösung, Plasmamembran-Bläschenbildung („blebbing") und die Bildung von Membran-gebundenen apoptotischen Körperchen („bodies") einschließen (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980). Ein molekulares Kennzeichen der Apoptose ist der Abbau der Kern-DNA der Zelle in Fragmente von Oligonukleosomen-Längen als Ergebnis der Aktivierung von endogenen Endonukleasen (Wyllie A. Nature 284:555, 1981).
Caspasen sind als Schlüsselenzyme bei der Ausführungsphase der Apoptose impliziert worden. Die Caspasefamilie besteht aus wenigstens vierzehn verwandten Cystein-Aspartan-Proteasen. Alle Caspasen enthalten ein konserviertes QACXG (wobei X R, Q oder G ist) (SEQ ID NO:1)-Pentapeptid-Motiv im aktiven Zentrum (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139,1997). Eine Anzahl von Caspasen werden als inaktive Proenzyme synthetisiert, die nach einer Spaltung an spezifischen Aspartat-Spaltstellen aktiviert werden (Cohen G., Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997), oder als inaktive Enzyme, die die Assoziation mit regulatorischen Molekülen zur Aktivierung erfordern (Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999). Die Aktivierung der Initiator-Procaspase aktiviert stromabwärts Effektor-Caspasen, was die Zelltodkaskade auslöst (Pan et al. J. Biol. Chem. 273:5841, 1998; Earnshaw W. Nature 397:387, 1999).
Neuerdings verwendete chemotherapeutische Mittel sind nicht-spezifisch cytotoxisch. Viele dieser chemotherapeutischen Mittel haben toxische Nebenwirkungen, sind entkräftend und beeinträchtigen oft die Lebensqualität des Patienten. Darüberhinaus führen Veränderungen im Transport und Metabolismus der chemotherapeutischen Mittel durch die Krebszellen zur Entwicklung von Resistenz gegenüber den chemotherapeutischen Mitteln durch die Krebszellen.
Deshalb gibt es einen andauernden Bedarf für neue Zusammensetzungen und Verfahren, die einen Zellzyklusarrest in Krebszellen induzieren, die die Proliferation von Krebszellen inhibieren, die die Apoptose in Krebszellen induzieren und die den antineoplastischen Effekt von chemotherapeutischen Mitteln auf Krebszellen potenzieren. Darüberhinaus sollten solche Zusammensetzungen einfach und relativ billig in der Herstellung sein, ihre Aktivität sollte therapeutisch stabil über die Zeit sein, und sie sollten in Dosierungsbehandlungsschemata wirksam sein, die mit minimaler Toxizität sogar bei wiederholter Verabreichung assoziiert sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse, indem sie eine Zusammensetzung bereitstellt, umfassend Mycobacterium phlei (M. phlei)-DNA (M-DNA), M-DNA, die auf M. phlei-Zellwand konserviert und komplexiert ist (MCC), ein chemotherapeutisches Mittel und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die M-DNA und die MCC Zellzyklusarrest in Krebszellen induzieren, die Proliferation von Krebszellen inhibieren, Apoptose in Krebszellen induzieren und den antineoplastischen Effekt des chemotherapeutischen Mittels auf Krebszellen potenzieren. Darüberhinaus sind M-DNA und MCC einfach und relativ billig in der Herstellung, ihre Aktivität ist reproduzierbar unter verschiedenen Zubereitungen, bleibt therapeutisch stabil über die Zeit und ist in Dosierungsbehandlungsschemata wirksam, die mit einer minimalen Toxizität sogar bei wiederholter Verabreichung assoziiert sind.
Um MCC herzustellen, werden M. phlei in flüssigem Medium wachsengelassen und geerntet. Die M. phlei werden zerstört, und die festen Bestandteile der zerstörten M. phlei werden mittels Zentrifugationssedimentierung gesammelt. Die festen Bestandteile werden entproteinisiert, entlipidiert und gewaschen. Alle Reagenzien werden ausgewählt, um die Konservierung von DNA während der MCC-Zubereitung zu verbessern. M-DNA wird aus MCC oder direkt aus M. phlei hergestellt. Wiederum werden alle Reagenzien ausgewählt, um die Konservierung von DNA während der M-DNA-Herstellung zu verbessern.
Eine Zusammensetzung, umfassend M-DNA, MCC, M-DNA + chemotherapeutisches Mittel oder MCC + chemotherapeutisches Mittel, wird an ein Tier mit Krebs, einschließlich eines Menschen, in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um den Krebs in dem Tier zu behandeln. Die unerwartete und überraschende Fähigkeit von M-DNA und MCC, einen Zellzyklusarrest in Krebszellen zu induzieren, die Proliferation von Krebszellen zu inhibieren, die Apoptose in Krebszellen zu induzieren und den antineoplastischen Effekt von chemotherapeutischen Mitteln auf Krebszellen zu potenzieren, erfüllt einen für lange Zeit wahrgenommenen, nicht erfüllten Bedarf auf dem Gebiet der Medizin und bietet einen wichtigen Vorteil für Tiere, einschließlich Menschen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die einen Zellzyklusarrest in Krebszellen induziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die die Proliferation von Krebszellen inhibiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels auf Krebszellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den Effekt eines chemotherapeutischen Mittels auf Krebszellen durch Synchronisieren des Zellzyklus der Krebszellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den Effekt eines chemotherapeutischen Mittels auf die Proliferation von Krebszellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, um Krebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, zu behandeln.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels beim Behandeln von Krebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, Krebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, zu eliminieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels beim Eliminieren von Krebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, potenziert.
Einer weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die einen Zellzyklusarrest in maligne Melanomzellen induziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die die Proliferation von malignen Melanomzellen inhibiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels auf maligne Melanomzellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels auf den Zellzyklusarrest in malignen Melanomzellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels auf die Proliferation von malignen Melanomzellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die die Apoptose in malignen Melanomzellen induziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die Caspasen in malignen Melanomzellen aktiviert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, ein malignes Melanom in einem Tier, einschließlich eines Menschen, zu behandeln.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels beim Behandeln von malignen Melanom in einem Tier, einschließlich eines Menschen, potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die wirksam ist, malignes Melanom in einem Tier, einschließlich eines Menschen, zu eliminieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den antineoplastischen Effekt eines chemotherapeutischen Mittels beim Eliminieren von malignem Melanom in einem Tier, einschließlich eines Menschen, potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den Effekt von Strahlung beim Behandeln von Krebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den Effekt von Strahlung beim Eliminieren von Krebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die den Effekt einer Radiotherapie auf Krebszellen durch Synchronisieren des Zellzyklus der Krebszellen potenziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die in großen Mengen hergestellt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die relativ billig in der Herstellung ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die eine reproduzierbare Aktivität bei mehreren Zubereitungen hat.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die mit der Zeit stabil bleibt.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsform und der angehängten Ansprüche offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Inhibition von B-16-Melanom-Zellteilung durch MCC, M-DNA, beschallte M-DNA und Heringssamen-DNA.
2. Inhibition von B-16-Melanom-Zellteilung durch Mitomycin-C, MCC und Mitomycin-C + MCC.
3. Inhibition von B-16-Melanom-Zellteilung durch 5-Fluoruracil, MCC und 5-Fluoruracil + MCC.
4. Inhibition von B-16-Melanom-Zellteilung durch Cisplatin, MCC und Cisplatin + MCC.
5. 5-Phasen-Beurteilung von B-16-Melanom-Zellen (A) und S-Phasen-Beurteilung von B-16-Melanom-Zellen nach Behandlung mit MCC (B).
6. Induktion von Apoptose in B-16-Melanom-Zellen durch MCC und M-DNA.
7. Induktion von Caspase-1-Aktivität in B-16-Melanom-Zellen durch MCC.
8. Cytotoxizität von MCC.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist eine Zusammensetzung, umfassend Mycobacterium phlei (M. phlei)-DNA (M-DNA), M-DNA, die auf M. phlei-Zellwand (MCC) konserviert und komplexiert ist, ein chemotherapeutisches Mittel und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die M-DNA und die MCC Zellzyklusarrest in Krebszellen induzieren, die Proliferation von Krebszellen inhibieren, Apoptose in Krebszellen induzieren und den antineoplastischen Effekt des chemotherapeutischen Mittels auf Krebszellen potenzieren. M-DNA und MCC sind einfach und relativ billig in der Herstellung, ihre Aktivität ist unter verschiedenen Zubereitungen reproduzierbar, bleibt therapeutisch stabil mit der Zeit und ist in Dosierungsbehand lungsschemata wirksam, die mit minimaler Toxizität sogar bei wiederholter Verabreichung assoziiert sind.
Wie hierin verwendet, schließt „M-DNA" DNA, die aus M. phlei direkt isoliert ist, und DNA ein, die aus MCC isoliert ist, hergestellt aus M. phlei.
Wie hierin verwendet, ist „MCC" M-DNA, die auf entproteinisierter, entlipidierter M. phlei-Zellwand konserviert und komplexiert ist.
Wie hierin verwendet, ist ein „chemotherapeutisches Mittel" jedes Mittel, das durch eine regulatorische Behörde eines Landes oder eine staatliche Regierung anerkannt ist oder in der US-Pharmacopoeia oder einer anderen allgemeine anerkannten Pharmacopoeia zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs in einem Tier, einschließlich eines Mensches, aufgelistet ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „antineoplastisch" auf die Verhinderung der Entwicklung, Reifung, Proliferation und Ausbreitung von Krebszellen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „potenziert" auf einen Grad des Synergismus, der größer als additiv ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Synergismus" auf die koordinierte Wirkung von zwei oder mehreren chemotherapeutischen Mitteln.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „verbessert" auf die additive Wirkung von zwei oder mehreren chemotherapeutischen Mitteln.
Verfahren zum Erhöhen der therapeutischen Wirksamkeit von M-DNA und MCC schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf chemisches Suplementieren oder biotechnologisches Amplifizieren von stimulatorischen Sequenzen oder Bestätigungen von M-DNA und Komplexieren der M-DNA, MCC-M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel an natürliche oder synthetische Träger. Fakultativ können Mittel, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf immunologische Mittel und Rezeptor-Bindungsmittel, in der M-DNA und der MCC eingeschlossen sein.
M-DNA, MCC, M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel werden in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen flüssigen Träger und einen festen Träger. Flüssige Träger sind wäßrige Träger, nicht-wäßrige Träger oder beide und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf wäßrige Suspensionen, Öl-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen, Stellen-spezifische Emulsionen, Emulsionen mit langer Verweildauer, klebrige Emulsionen, Mikroemulsionen, Nanoemulsionen und Liposomen. Feste Träger sind biologische Träger, chemische Träger oder beide und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mikropartikel, Nanopartikel, Mikrosphären, Nanosphären, Minipumpen, bakterielle Zellwandextrakte und bioabbaubare oder nicht-bioabbaubare natürliche oder synthetische Polymere, die eine verzögerte Freisetzung der M-DNA, MCC, M-DNA + chemotherapeutisches Mittel oder MCC + chemotherapeutisches Mittel ermöglichen. Solche Polymere können in der Nähe eines Ortes implantiert werden, an dem eine Abgabe benötigt. Polymere und ihre Verwendung werden in z. B. Brem et al., J. Neuroswg. 74: 441–446 (1991) beschrieben.
Bevorzugte wäßrige Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf DNase-freies Wasser, DNase-freie Salzlösung und DNase-freie physiologisch akzeptable Puffer. Bevorzugte nicht-wäßrige Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mineralöl oder neutrales Öl, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Diglycerid, ein Triglycerid, ein Phospholipid, ein Lipid, ein Öl und Mischungen davon, wobei das Öl eine angemessene Mischung an polyungesättigten und gesättigten Fettsäuren enthält. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Sojaöl, Canolaöl, Palmöl, Olivenöl und Myglyol, wobei die Anzahl an Fettsäurekohlenstoffatomen zwischen 12 und 22 liegt, und wobei die Fettsäuren gesättigt oder ungesättigt sein können. Fakultativ kann beladenes Lipid oder Phospholipid in dem neutralen Öl suspendiert sein.
In einem Beispiel wird M-DNA in DNase-freiem sterilem Wasser suspendiert und wird bei 20% Leistung für 5 Minuten beschallt (Model W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). Fakultativ wird die beschallte M-DNA mittels Mikrofluidisierung bei 15.000–30.000 psi für einen Durchfluß homogenisiert (Modell M-110Y, Microfluidics, Newton, MA) und wird in eine autoklavierte, mit einer Kappe versehene Flasche zur Zwischenlagerung bei 4°C übertragen.
In einem Beispiel wird DNase-freies Phosphatidylcholin zu DNase-freiem Triglycerid-Sojaöl in einem Verhältnis von 1 Gramm Phospholipid zu 20 ml Triglycerid zugegeben und wird durch sanftes Erwärmen auf 50–60°C aufgelöst. Mehrere Gramm MCC werden zu einem trockenen autoklavierten Behälter zugegeben, und die Phospholipid-Triglycerid-Lösung wird in einer Konzentration von 20 ml pro 1 Gramm MCC zugegeben. Die Suspension wird bei 20°C für 60 min inkubiert und wird dann mit DNase-freier PBS im Verhältnis von 20 ml MCC-Suspension pro Liter DNase-freier PBS gemischt. Die Mischung wird bei 20% Leistung für 5 Minuten beschallt (Modell W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics, Inc.). FAkultativ wird die beschallte MCC-Mischung durch Mikrofluidisierung bei 15.000–30.000 psi für einen Durchfluß homogenisiert (Modell M-110Y; Microfluidics) und wird in eine autoklavierte, mit einer Kappe versehene Flasche zur Lagerung bei 4°C übertragen.
Ein chemotherapeutisches Mittel kann M-DNA oder MCC vor, während oder nach der Beschallung oder Mikrofluidisierung oder vor oder nach der Lagerung zugegeben werden. Darüberhinaus können andere Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Herstellung von Deoxyribonukleinsäuren, bakteriellen Zellwandextrakten und chemotherapeutischen Mitteln zur Verabreichung an ein Tier, einschließlich eines Menschen, verwendet werden.
Weiterhin kann M-DNA, MCC, M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel mit einem beliebigen Bindemittel, allen Bindemitteln oder einer beliebigen Kombination von Bindemitteln ohne Rücksicht auf den verwendeten Träger verwendet werden, um die Zusammensetzung den reagierenden Zellen präsentieren. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Anti-Oxidantien, Puffer und bakteriostatische Mittel und können Suspendierungsmittel, Verdickungsmittel und Stabilisierungsmittel einschließen. Stabilisierungsmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf nicht-ionische und ionische Polymere, wie etwa z.B. Polyoxyethylensorbitan-Monooleat (Tween) oder Hyaluronsäure.
M-DNA, MCC, M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel werden an ein Tier mit Krebs in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, Zellzyklusarrest in Krebszellen zu induzieren, die Proliferation von Krebszellen zu inhibieren, Apoptose in Krebszellen zu induzieren und den antineoplastischen Effekt des chemotherapeutischen Mittels auf Krebszellen zu potenzieren. Das chemotherapeutische Mittel kann vor, zur selben Zeit wie oder nach Verabreichung der M-DNA oder des MCC verabreicht werden. Das verwendete chemotherapeutische Mittel und die Menge an M-DNA, MCC und das pro Dosis verabreichte chemotherapeutische Mittel, die Anzahl an Dosen und das Dosierungsschema werden von dem Typ des Krebses, dem Schweregrad des Krebses, dem Ort des Krebses und anderen klinischen Faktoren, wie etwa der Größe, Gewicht und dem physischen Zustand des Empfängers und der Route der Verabreichung abhängen und dem kann vom praktizierenden Arzt unter Verwendung von klinischen Standardtechniken und ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Zusätzlich können in-vitro-Assays fakultativ verwendet werden, um optimale Bereiche für die Verabreichung von M-DNA, MCC, M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel zu identifizieren.
Bevorzugt beträgt die verabreichte Menge an M-DNA von ungefähr 0,00001 bis 500 mg/kg pro Dosis, bevorzugter von ungefähr 0,0001 bis 100 mg/kg pro Dosis, und am bevorzugtesten von ungefähr 0,001 bis 40 mg/kg pro Dosis. Bevorzugt beträgt die verabreichte Menge an MCC von ungefähr 0,00001 bis 500 mg/kg pro Dosis, bevorzugter von ungefähr 0,0001 bis 100 mg/kg pro Dosis und am bevorzugtesten von ungefähr 0,001 bis 40 mg/kg pro Dosis. Bevorzugt beträgt der M-DNA-Gehalt der MCC zwischen ungefähr 0,001 und 90 mg/100 mg trockenem MCC, bevorzugt zwischen ungefähr 0,01 und 40 mg/100 mg trockenem MCC und am bevorzugtesten zwischen ungefähr 0,1 und 30 mg/100 mg trockenem MCC. Der Proteingehalt des MCC sollte weniger als ungefähr 20 mg/100 mg trockenes MCC sein, und die extrahierbare M-DNA sollte wenigstens ungefähr 4,5% des Trockengewichts von MCC betragen.
Chemotherapeutische Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf DNA-alkylierende Mittel, Anti-Tumor-Antibiotikum-Mittel und Antimetaboliten Mittel.
DNA-alkylierende Mittel, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Nitro-Harnstoffe, Schwermetallmittel und quervernetzende Mittel; Antitumor-Antibiotikum-Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mitomycin-C; Antimetaboliten-Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf 5-Fluoruracil und Methotrexat; Topoisomerase-inhibierende Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf CPT-11; Tubulin-stabilisierende Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Taxol; Tubulin-destabilisierende Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Vincristin und Vinblastin; und Hormon-Antagonisten-Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Tamoxifen.
Bevorzugt beträgt die Menge an verabreichtem chemotherapeutischen Mittel pro Dosis von ungefähr 0,0001 bis 1000 mg/m² oder von ungefähr 0,0001 bis 1000 mg/kg, bevorzugter von ungefähr 0,5 bis 70 mg/m² oder ungefähr 0,5 bis 70 mg/kg und am bevorzugtesten von ungefähr 1 bis 50 mg/m² oder ungefähr 1 bis 50 mg/kg.
Routen zur Verabreichung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf oral, topisch, subkutan, transdermal, subdermal, intramuskulär, intraperitoneal, intraartikulär, intravesical, intraarteriell, intravenös, intradermal, intrakranial, intraläsional, intratumoral, intraocular, intrapulmonal, intraspinal, Einbringen in Körperhöhlungen, Naseninhalation, Lungeninhalation, Eindrücken in die Haut und Elektrocorporation. Abhängig von der Route der Verabreichung beträgt das Volumen pro Dosis bevorzugt ungefähr 0,001 bis 500 ml pro Dosis, bevorzugter ungefähr 0,01 bis 100 ml pro Dosis und am bevorzugtesten ungefähr 0,1 bis 50 ml pro Dosis.
Die folgenden Beispiele werden dazu dienen, die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, ohne jedoch zur selben Zeit eine Beschränkung darzustellen. Im Gegenteil sollte es klar verstanden werden, daß auf verschiedene andere Ausführungsformen, Modifizierungen und Äquivalente davon zurückgegriffen werden kann, die nach Lesen der Beschreibung sich als Vorschlag für einen Fachmann ergeben können, ohne vom Geiste der vorliegenden Erfindung und/oder dem Umfang der angehängten Ansprüche abzuweichen.
Beispiel 1
Herstellung von M-DNA und MCC aus M. phlei
M-DNA und MCC wurden aus M. phlei (Stamm 110), wie in Internationaler Patentanmeldung Nr. PCR/CA98/00744 beschrieben, hergestellt, die durch Bezugnahme aufgenommen wird. Alle Reagenzien wurden ausgewählt, um die Konservierung der DNA zu verbessern. Sofern nicht anderweitig festgestellt, wurden M-DNA und MCC in DNase-freiem Wasser oder in einem pharmazeutisch akzeptablen DNase-freien Puffer resuspendiert und bei 20% Leistung für 5 Minuten beschallt (Modell W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics, Inc.). M-DNA und MCC enthielten keine Endotoxine, bestimmt unter Verwendung eines Limulus-Amöbocyten-Lysat-QCL-1000-Kits (Bio Whittaker, Walkersville, MD).
Für die DNase-Behandlung wurden M-DNA und MCC mit 1 Internationalen Einheit an RNase-freier DNase I (Life Technologies) für 1 Stunde bei 25°C in 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 2 mM MgCl₂ und 50 mM KCl verdaut. DNase I wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 2,5 mM und Erhitzen für 10 min bei 65°C aktiviert. Die DNase I verdaut sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige DNA und sorgt für einen beinahe vollständigen Abbau der DNA.
Beispiel 2
Herstellung von mycobakterieller DNA (B-DNA) und von mycobakterieller DNA, die auf mycobakterieller Zellwand konserviert und komplexiert ist (BCC) aus Species, die nicht M. phlei sind
BCC und B-DNA wurden aus mycobakteriellen Spezies hergestellt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf M. vaccae, M. chelonei, M. smegmatis, M. terrae, M. duvalii, M. tubeculosis, M. bovis BCG, M. avium, M. Szulgai, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansaii, M. gastr, M. fortuitous und M. asiaticum wie in Beispiel 1.
Beispiel 3
Zellen und Reagenzien
Humane Jurkat-T-Zell-Leukämiezellen (Jurkat), humane promyelocytische HL60-Leukämiezellen (HL-60), Mitoxantron-resistente humane promyelocytische HL-60MX1-Leukämiezellen (HL-60MX1), murine EL-4-Lymphomzellen (EL-4) und murine B-16-Melanomzellen wurden von der American Type Tissue Culture Collection (ATTC Rockville, MD, USA) erhalten und wurden in einem von der ATCC empfohlenen Medium wachsengelassen. Sofern nicht anderweitig festgestellt, wurden die Zellen in 6-Napf-Flachboden-Gewebekulturplatten in Konzentrationen von 5 × 10³ bis 1 × 10⁶ Zellen/ml ausgesät und wurden bei 37°C für 24 Stunden bis 72 Stunden gehalten.
Mitomycin-C, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Methotrexat und Heringssamen-DNA wurden von Sigma Aldrich Canada erhalten (Oakville, Ontario, Canada)
Beispiel 4
Zellzyklus-Analyse
Das Zellzyklusstadium wurde unter Verwendung eines kommerziellen CYCLETEXT^TM PLUS-DNA-Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) bestimmt. In Kürze, Kerne aus behandelten Zellen wurden durch Auflösen der Zellmembran in einem nicht-ionischen Detergens, Eliminieren des Zell-Cytoskeletts und der Kernproteine mit Trypsin, Verdauen der zellulären RNA mit RNase und Stabilisieren des Kernchromatins mit Spermin erhalten. Propidiumioid wurde zu den Zellkernen zugegeben, und ihre Fluoreszenz wurde in einem Durchflußphotometer analysiert, ausgestattet mit einer Fähigkeit zur Unterscheidung von elektronischen Dupletts (FACSCalibur, Becton Dickinson). Eine Akkumulation der Zellen in GO/G₁, S (SE, SM, SL) oder G₂/M-Phasen des Zellzyklus wurde unter Verwendung einer MODFIT LT-Software analysiert (Verity Software House Inc., Topsham, MA, USA). Die Resultate sind als prozentualer Anteil an Zellen in jeder Phase des Zellzyklus ausgedrückt.
Beispiel 5
Synchronisierung von Zellpopulationen mit Methotrexat
Um Zellpopulationen zu synchronisieren, wurden exponentiell wachsende Zellen in Gewebekulturmedium inkubiert, enthaltend 0,04 bis 0,16 μM Methotrexat (MTX) für 20 Stunden. Das MTX-Medium wurde entfernt, Zellen wurden umfassend mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, frisches Medium wurde zugegeben, die Inkubation wurde für 8 Stunden fortgesetzt und die Zellzyklusanalyse wurde wie ein Beispiel 4 durchgeführt.
Beispiel 6
Induktion des Zellzyklusarrests in synchronisiert sich teilenden Krebszellen durch MCC
Exponentiell wachsende Jurkat-, HL-60-, HL-60MX1- und EL-4-Zellen in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml und B-16-Zellen in einer Konzentration von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurden zur Analyse wie in Beispiel 5 mit 0,10 und 100 μg/ml MCC im MTX Medium hergestellt.
Tabelle 1 zeigt, daß MCC sowohl bei 10 als auch 100 μg/ml einen Arrest in der SL+G₂M-Phase des Zellzyklus in synchronisiert sich teilenden Jurkat-HL-60-, HL-60MX1-, EL-4- und B-16-Krebszellen induzierte. Die Akkumulation von Zellen in der SL+G₂M-Phase wurde von einer Verringerung von Zellen in der GO/G₁+SE-Phase oder in der GO/G₁+SE- und SM-Phase des Zellzyklus begleitet.
Tabelle 1 Induktion des Zellzyklusarrest in synchronisiert sich teilenden Krebszellen durch MCC
Diese Daten demonstrieren, daß MCC einen Arrest in synchronisiert sich teilenden Krebszellen induzierte, einschließlich HL-60MX1-Krebszellen, die eine atypische multichemotherapeutische Mittel-Resistenz, veränderte Topoisomerase-II-katalytische Aktivität und verringerte Konzentrationen an Topoisomerase-II-alpha- und beta-Proteinen aufweisen (Harker et al. Cancer Res 49:4542–4549, 1989).
Beispiel 7
Induktion von Zellzyklusarrest in synchronisiert sich teilenden Jurkat-Leukämiezellen durch MCC und DNase I-behandelter MCC
Exponentiell wachsende Jurkat-Leukämiezellen in 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden zur Analyse wie in Beispiel 5 mit 0 und 10 μg/ml MCC und 10 μg/ml DNase-I-behandelter MCC im MTX-Medium hergestellt.
Tabelle 2 zeigt, daß MCC einen Arrest in der SL+G₂M-Phase des Zellzyklus in sychronisierten Jurkatzellen induzierte. Die Akkumulation der Zellen in der SL+G₂M-Phase wurde von einer Verringerung der Zellen in der GO/G₁+SE-Phase oder in der GO/G₁+SE- und der SM-Phase des Zellzyklus begleitet. Tabelle 2 zeigt ebenso, daß DNase-I-behandelte MCC keinen Zellzyklusarrest in synchronisiert sich teilenden Jurkat-Zellen induzierte.
Tabelle 2 Induktion des Zellzyklusarest in synchronisiert sich teilenden Jurkatzellen durch MCC und durch DNase-I-behandelte MCC
MCC ist M-DNA, die auf M. phlei-Zellwand konserviert und komplexiert ist, und DNase I verdaut die M-DNA von MCC. Deshalb demonstriert die Tatsache, daß DNase I behandelte MCC keinen Arrest in synchronisiert sich teilenden Jurkat-Leukämiezellen induzierte, die Wichtigkeit von M-DNA für die MCC-Induktion des Zellzyklusarrests in sich teilenden Krebszellen.
Beispiel 8
Induktion des Zellzyklusarrests in Krebszellen durch MCC
Exponentiell wachsende Jurkat-, HL-60, HL-60MX1- und EL-4-Zellen in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml und B-16-Zellen in 3 × 10⁵ Zellen/ml wurden zur Analyse wie in Beispiel 5 in Abwesenheit von MTX und in der Anwesenheit von 0,10 und 100 μg/ml MCC hergestellt.
Tabelle 3 zeigt, daß MCC sowohl bei 10 als auch 100 μg/ml den Arrest in der SL+G₂M-Phase des Zellzyklus in asynchron sich teilenden Jurkat-, HL-60-, HL-60MX1-, EL-4- und B-16-Krebszellen induzierte. Die Akkumulation von Zellen in der SL+G₂M-Phase wurde von einer Verringerung der Zellen in der GO/G₁+SE-Phase oder in der GO/G₁+SE- und SM-Phase des Zellzyklus begleitet.
Tabelle 3 Induktion des Zellzyklusarrests in asynchron sich teilenden Krebszellen durch MCC.
MCC induzierte einen Arrest in asynchron sich teilenden Krebszellen, einschließlich in HL-60MX1-Zellen, die eine atypische multi-chemotherapeutische Mittel-Resistenz, eine veränderte Topoisomerase-II-katalytische Aktivität und verringerte Konzentrationen an Topoisomerase II-alpha- und -beta-Proteine aufweisen (Harker et al. Cancer Res 49:4542–4549, 1989).
Beispiel 9
Induktion des Zellzyklusarrests in Jurkat-Leukämiezellen durch M-DNA, MCC und DNase-I-behandelter MCC
Exponentiell wachsende Jurkat-Leukämiezellen bei 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden zur Analyse wie in Beispiel 5 in der Abwesenheit von MTX und in der Anwesenheit von 200 μg/ml M-DNA, 10 μg/ml MCC und 10 μg/ml DNase-I-behandelter MCC hergestellt.
Tabelle 4 zeigt, daß M-DNA und MCC beide den Arrest in der SL+G₂M-Phase des Zellzyklus in asynchron sich teilenden Jurkatzellen induzierte. Die Akkumulation von Zellen in der SL+G₂M-Phase wurde von einer Verringerung von Zellen in der GO/G₁+SE- und SM-Phase des Zellzyklus begleitet. Tabelle 3 zeigt ebenso, daß nach einer DNase I-Behandlung MCC weniger Zellzyklusarrest in asynchron sich teilenden Jurkatzellen induzierte.
Tabelle 4 Induktion des Zellzyklusarrest in asynchron sich teilenden Jurkat-Leukämiezellen durch M-DNA, MCC und DNase-I-behandelter MCC
M-DNA und MCC induzierten einen Zellzyklusarrest in asynchron sich teilenden Jurkatzellen. MCC ist M-DNA, die auf M. phlei-Zellwand konserviert und komplexiert ist, und DNase I verdaut die M-DNA von MCC. Deshalb zeigt die Tatsache, daß DNase-I-behandelte MCC weniger Arrest in asynchron sich teilenden Jurkatzellen induzierte, wiederum die Wichtigkeit von M-DNA für die MCC-Induktion des Zellzyklusarrests in sich teilenden Krebszellen.
Beispiel 10
Inhibition von B-16-Melanomzellproliferation durch MCC, M-DNA, beschallter M-DNA und Heringssamen-DNA
Exponentiell wachsende B-16-Melanomzellen in einer Konzentration von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurden zur Analyse wie in Beispiel 5 in der Abwesenheit von MTX und der Anwesenheit von 1 bis 100 μg/ml MCC, M-DNA oder M-DNA hergestellt, beschallt für 20 Minuten auf Eis in einem Ultraschallprozessor, Modell W-38 (Heat Systems-Ultrasonics, Inc.), um die Oligonukleotidlänge zu verringern, und Heringssamen-DNA.
Wie in 6 gezeigt, inhibierte MCC in einer Konzentration von 1 μg/ml die Proliferation um ungefähr 25%, M-DNA ungefähr 5%, beschallte M-DNA ungefähr 10% und Heringssamen-DNA 0%. Bei 10 μg/ml inhibierte MCC die Proliferation ungefähr 50%, M-DNA ungefähr 30%, beschallte M-DNA ungefähr 25% und Heringssamen-DNA 0%. Bei 100 μg/ml inhibierte MCC die Proliferation ungefähr 80%, M-DNA und beschallte DNA ungefähr 50% und Heringssamen-DNA ungefähr 5%.
MCC, M-DNA und beschallte M-DNA inhibierten jede die Proliferation von asynchron sich teilenden B-16-Melanomzellen, während Heringssamen-DNA nicht die Proliferation von asynchron sich teilenden B-16-Melanomzellen inhibierte.
Beispiel 11
Inhibition von B-16-Melanomzellenproliferation durch chemotherapeutische Mittel ± MCC
Malignes Melanom gehört zu den gegenüber einer Chemotherapie widerstandsfähigsten Krebsen, und viele chemotherapeutische Mittel scheinen nicht die Prognose dieser Krankheit zu modifizieren. Melanom-abgeleitete Zellinien zeigen ebenso eine signifikante Resistenz gegenüber den meisten chemotherapeutischen Mitteln, was die Anwesenheit einer intrinsischen zellulären Resistenz nahelegt. Diese Resistenz kann durch Mechanismen vermittelt sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf P-Glycoprotein, das Glutathion/Glutathion-S-Transferase-System multi-chemotherapeutisches Mittel-Resistenz-assoziiertes Protein, mutiertes N-Ras, Bcl-2 und p53-Oncogene und Topoisomerase-II-Enzym (Serrone et al. Melanoma Res. 9:51, 1999).
B-16-Melanomzellen in 3 × 10⁵ Zellen/ml wurden für 72 h mit den chemotherapeutischen Mitteln Mitomycin-C, 5-Fluoruracil und Cisplatin in der Abwesenheit und in der Anwesenheit von MCC inkubiert. Die Zellproliferation wurde unter Verwendung von Dimethylthiazol-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Reduktion bestimmt (Mosman et al. Journal of Immunological Methods 6:5:55–63, 1983). Nach 72 h wurde 20 μl MTT in Kulturmedium zu jedem Napf zugegeben und für 3 h inkubiert. Das Medium wurde dann aus jedem Napf aspiriert, 100 μl angesäuerter Isopropylalkohol wurde zu jeder Probe zugegeben, und reduziertes MTT wurde durch Mischen solubilisiert. Die Absorption des Reaktionsproduktes wurde unter Verwendung eines ELISA-Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer Wellenlänge von 570 nm bestimmt.
B-16-Melanomzellen wurden bei 0,01 bis 100 μg/ml Mitomycin-C mit 1 bis 100 μg/ml MCC und mit 0,01 bis 10 μg/ml Mitomycin-C + 1 μg/ml MCC inkubiert.
Mitomycin-C ist ein Anti-Tumor-Antibiotikum, hergestellt von Streptomyces caespitosus, das DNA quervernetzt, DNA depolymerisiert und freie Radikale bindet.
2 zeigt, daß bei B-16-Zellen 0,1 μg/ml Mitomycin-C die Proliferation ungefähr 5% inhibierte, 1 μg/ml ungefähr 10% und 10 und 100 μg/ml 100%, während 1 μg/ml MCC die Proliferation ungefähr 25% inhibierte, 10 μg/ml ungefähr 50% und 100 μg/ml ungefähr 80%. 2 zeigt ebenso, daß in der Anwesenheit von 1 μg/ml MCC, 0,1 μg/ml Mitomycin-C die Proliferation ungefähr 40% inhibierte, 1 μg/ml ungefähr 65% und 100 μg/ml 100%. Diese Daten zeigen, daß MCC den antineoplastischen Effekt von Mitomycin-C auf proliferierende Krebszellen potenziert.
B-16-Melanomzellen wurden mit 0,01 bis 100 μg/ml 5-Fluoruracil inkubiert, mit 1 bis 100 μg/ml MCC und mit 0,01 bis 10 μg/ml 5-Fluoruracil + 1 μg/ml MCC. 5-Fluoruracil ist ein Antimetabolit, der bei der DNA- und RNA-Synthese stört.
3 zeigt, daß mit B-16-Zellen 0,01 μg/ml 5-Fluoruracil die Proliferation ungefähr 8% inhibierte, 0,1 μg/ml ungefähr 50%, 1 μg/ml ungefähr 90% und 10 und 100 μg/ml 100%, während 1 μg/ml MCC die Proliferation ungefähr 25% inhibierte, 10 μg/ml ungefähr 50% und 100 μg/ml ungefähr 80%. 3 zeigt ebenso, daß in der Anwesenheit von 1 μg/ml MCC 0,01 μg/ml 5-Fluoruracil die Proliferation ungefähr 75% inhibierte, 0,1 μg/ml unfähr 85%, 1 μg/ml ungefähr 90% und 10 μg/ml ungefähr 100%. Diese Daten zeigen, daß MCC den antineoplastischen Effekt von 5-Fluoruracil auf proliferierende Krebszellen potenziert.
B-16-Melanomzellen wurden mit 0,01 bis 100 μg/ml Cisplatin inkubiert, mit 1 bis 100 μg/ml MCC und mit 0,01 bis 10 μg/ml Cisplatin + 1 μg/ml MCC. Cisplatin ist ein alkylierendes Mittel, das DNA quervernetzt und die DNA-Vorläufer inhibiert.
4 zeigt, daß mit B-16-Zellen 0,01 μg/ml Cisplatin die Proliferation ungefähr 0% inhibierte, 0,1 μg/ml ungefähr 8%, 1 μg/ml ungefähr 62%, 10 μg/ml ungefähr 90% und 100 μg/ml 100%, während 1 μg/ml MCC die Proliferation ungefähr 25% inhibierte, 10 μg/ml ungefähr 50% und 100 μg/ml ungefähr 80%. 4 zeigt ebenso, daß in der Anwesenheit von 1 μg/ml MCC 0,01 μg/ml Cisplatin die Proliferation ungefähr 40% inhibierte, 0,1 μg/ml ungefähr 50%, 1 μg/ml ungefähr 70% und 10 μg/ml ungefähr 90%. Diese Daten zeigen, daß MCC den anti-neoplastischen Effekt von Cisplatin auf proliferierende Krebszellen verbessert.
Tabelle 5 zeigt die Konzentrationen von Mitomycin-C, 5-Fluoruracil und Cisplatin, die für eine 50%-Inhibition von B-16 Melanom-Zellteilung in der Abwesenheit von 1 μg/ml MCC erforderlich ist.
Tabelle 5 Konzentration von Mitomycin-C, 5-Fluoruracil und Cisplatin, die für eine 50%-Inhibition von B-16 Melanom-Zellproliferation in der Abwesenheit und in der Anwesenheit von 1 μg/ml MCC erforderlich ist.
Tabelle 5 zeigt die Dosis-abhängige Inhibition von B-16-Zell-Melanom-Poliferation durch MCC bei 10 bis 100 μg/ml (IC₅₀ = 10 μg/ml) und durch Mitomycin-C, 5-Fluoruracil und Cisplatin bei 0,1 bis 10 μg/ml (IC₅₀ = 2,2, 0,17 beziehungsweise 0,6 μg/ml). Tabelle 5 zeigt ebenso, daß 10 μg/ml μg/ml MCC Mitomycin-C (IC₅₀ = 0,12 μg/ml) und 5-Fluoruracil (IC₅₀ = 0,005 μg/ml) Inhibition von B-16-Melanom-Zellproliferation potenzierte, und daß 1 μg/ml MCC Cisplatin (IC₅₀ = 0,16 μg/ml) Inhibition der B-16-Melanom-Proliferation verbesserte.
Diese Daten zeigen, daß MCC nicht nur die Krebszellproliferation inhibiert, sondern auch die anti-neoplastischen Effekte von Mitomycin-C und 5-Fluoruracil auf Krebszellproliferation potenziert und den antineoplastischen Effekt von Cisplatin auf Krebszellproliferation verbessert.
Beispiel 12
Induktion von Apoptose in B-16 Melanomzellen durch MCC und M-DNA
Die Fragmentierung von zellulärer DNA in Fragmente mit Nukleosomengröße ist charakteristisch für Zellen, die Apoptose durchlaufen (Newell et al. Nature 357:286-289, 1990). Um die DNA-Fragmentierung zu beurteilen, wurden B-16-Zellen mit 0,5 ml hyoptonischem Lysepuffer lysiert (10 mM Trispuffer, 1mM EDTA, 0,2% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), pH 7,5). Die Lysate wurden bei 13.000 g für 10 min. zentrifugiert, und die Überstände, enthaltend fragmentierte DNA, wurden über Nacht bei –20°C in 50% Isopropanol und 0,5 M NaCl ausgefüllt. Die Niederschläge wurden mittels Zentrifugation gesammelt und wurden mittels Elektrophorese in 0,7% Agarosegelen für 3 h bei 100V analysiert.
B-16 Melanomzellen in einer Konzentration von 3 × 10⁸ Zellen/ml wurden für 72 h mit 1 μg/ml M-DNA inkubiert (6, Spur 1) und mit 100 (Spur 2), 10 (Spur 3) und 1 μg/ml MCC (Spur 4) inkubiert. M-DNA- und MCC-behandelte B-16-Melanomzellen zeigten eine signifikante DNA-Fragmentierung, während unbehandelte B-16-Melanomzellen (6, Spur 5) keine DNA-Fragmentierung zeigten. Eine 123-bp DNA-Leiter (Gibco Life Science) wurde verwendet, um das Molekulargewicht der DNA-Fragmente mit Liposomengröße zu bestimmen (6, Spur L). Diese Daten zeigen, daß M-DNA und MCC die Apoptose in B-16-Melanomzellen induzieren.
Beispiel 13
Aktivierung von Caspase-1 in B-16 Melanomzellen durch MCC
Interleukin-1-umwandelndes Enzym (ICE/Caspase-1) ist eine Cysteinprotease, die bei der sequenziellen Aktivierung der Caspase-Kaskade beteiligt ist, welche zur Apoptose erforderlich ist. ICE/Caspase-1 wird durch verschiedene pro-apoptotische Stimuli rasch und vorübergehend aktiviert. Um zu bestimmen, ob MCC die ICE/Caspase-1 direkt aktivieren kann, wurde der Effekt von MCC auf ICE/Caspase-1 Aktivität in B-16-Melanomzellen getestet.
B-16-Melanomzellen in 3 × 10⁵-Zellen/ml wurden in 6-Napf-Gewebekulturplatten in einem Volumen von 1 ml ausplattiert und wurden für 3 h mit 1 bis 100 μg/ml MCC inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, und in 50 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% 3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), 10 mM DTT, 1 mM EDTA und 10% Glycerol lysiert und bei 11.000 g für 10 Minuten zentrifugiert. ICE/Caspase-1-Aktivität in dem Überstand wurde unter der Verwendung des fluorogenen synthetischen Substrats Z-tyr-val-ala-asp[OMe]-7-amino-4-methylcoumarin [Calbiochem # 6 88225] bestimmt. Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 400 nm und einer Emissionswellenlänge von 505 nm bestimmt.
Wie in 7 gezeigt, führte die Inkubation von B-16-Melanomzellen mit MCC zu einer signifikanten Dosis-abhängigen Steigerung an ICE/Caspase-1-Aktivität, während eine Inku bation von B-16-Melanomzellen ohne MCC zu keiner Veränderung hinsichtlich der ICE/Caspase-1-Aktivität führte.
Beispiel 14
Cytotoxische Effekte von MCC auf maligne Melanomzellen
Die Zellcytotoxizität ist durch den Verlust der Plasmamenbranunversehrtheit und die Freisetzung von cytoplasmatischen Enzymen charakterisiert, wie etwa, aber nicht beschränkt auf LDH (Phillips et al. Vaccine 14:898–904).
Um die Cytotoxizität von MCC zu beurteilen, wurden B-16-Melanomzellen für 48 h mit 100 μg/ml MCC oder mit Lysepuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, pH 7,5) inkubiert als eine Kontrolle für die Gesamtfreisetzung von LDH (Filion et al. Biochim Biophys Acta 1329:345–356, 1997). LDH wurde mit einem kommerziellen Assay bestimmt (Sigma-Aldrich).
Wie in 8 gezeigt, war MCC nicht cytotoxisch für die B-16-Melanomzellen. Diese Daten demonstrieren, daß MCC nicht durch ein Zerstören der Zellmembran wirkt, sondern daß MCC direkt auf die B-16-Melanomzellen wirkt, um Apoptose zu induzieren.
Beispiel 15
Effekte von M-DNA, MCC und DNase-I-behandelter MCC auf B-16-Melanom-Tumore in Mäusen
B-16-Melanomzellen werden subkutan in 20 männliche nackte BALB/c-Mäusen implantiert und für 10 Tage wachsengelassen. Die Mäuse werden in 4 Gruppen aufgeteilt, und die Tumormasse wird in jeder Maus gemessen. Am Tag 0 erhalten die Mäuse der Gruppe 1 Salzlösung, die Mäuse der Gruppe 2 erhalten MCC, die Mäuse der Gruppe 3 erhalten M-DNA und die Mäuse der Gruppe 4 erhalten DNase-I-behandelte MCC. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert, und die Tumormasse wird gemessen.
Die Mäuse der Gruppe 2 und der Gruppe 3 haben weniger Tumormasse als die Mäuse der Gruppe 1 und der Gruppe 4.
Beispiel 16
Effekte von M-DNA und MCC in Kombination mit Mitomycin-C auf B-16-Melanom-Tumoren in Mäusen
B-16-Melanomzellen werden subkutan in 30 männliche nackte BALB/c-Mäuse implantiert und für 10 Tage wachsengelassen. Die Mäuse werden in 6 Gruppen aufgeteilt, und die Tumormasse wird in jeder Maus gemessen. Am Tag 0 erhalten Mäuse der Gruppe 1 Salzlösung, die Mäuse der Gruppe 2 erhalten M-DNA, die Mäuse der Gruppe 3 erhalten MCC, die Mäuse der Gruppe 4 erhalten Mitomycin-C, die Mäuse der Gruppe 5 erhalten M-DNA und Mitomycin-C, und die Mäuse der Gruppe 6 erhalten MCC und Mitomycin-C. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert, und die Tumormasse und die Anzahl der Metastasen werden bestimmt. Die Mäuse der Gruppe 1 haben die höchste Tumormasse. Die Mäuse der Gruppe 4 haben weniger Tumormasse als die Mäuse der Gruppe 1. Die Mäuse der Gruppe 2 und der Gruppe 3 haben weniger Tumormasse als die Mäuse der Gruppe 4. Die Mäuse der Gruppe 5 und der Gruppe 6 haben die geringste Tumormasse.

Claims

Verwendung von Mycobacterium phlei DNA (M-DNA) und eines chemotherapeutischen Mittels (M-DNA + chemotherapeutisches Mittel) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Tier, wobei das chemotherapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend DNA-alkylierende Mittel, Anti-Tumor-Antibiotikum-Mittel und Antimetaboliten-Mittel.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die M-DNA konserviert und an Mycobacterium phlei-Zellwand (MCC) komplexiert ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das DNA-alkylierende Mittel Cisplatin ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Anti-Tumor-Antibiotikum-Mittel Mitomycin C ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antimetaboliten-Mittel 5-Fluoruracil ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel einen Zellzyklusarrest in Krebszellen induziert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel die Proliferation von Krebszellen inhibiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die M-DNA + chemotherapeutisches Mittel und MCC + chemotherapeutisches Mittel Apoptose in Krebszellen induziert.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Krebs Leukämie, Lymphom oder Melanom ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Krebs Melanom ist.
Verwendung von M-DNA zur Herstellung eines Medikaments zum Induzieren eines Zellzyklusarrestes in Krebszellen in einem Tier, zum Aktivieren von Caspase-Aktivität in malignen Melanomzellen oder zum Inhibieren von neoplastischer Aktivität in Krebszellen in einem Tier.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die M-DNA konserviert und auf Mycobacterium phlei-Zellwand (MCC) komplexiert ist.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Zellzyklusarrest in Krebszellen in der Phase SL+GM2 des Zellzyklus induziert wird.
Verwendung nach Anspruch 11, 12 oder 13, wobei die Krebszellen Melanomzellen sind.
Zusammensetzung, umfassend M-DNA und ein chemotherapeutisches Mittel, wobei die M-DNA die Anti-Krebs-Aktivität des chemotherapeutischen Mittels beim Behandeln von Krebs in einem Tier mit Krebs potenziert, und wobei das chemotherapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend DNA-alkylierende Mittel, Anti-Tumor-Antibiotikum-Mittel und Antimetaboliten-Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die M-DNA konserviert und an Mycobacterium phlei-Zellwand (MCC) komplexiert ist, und wobei die MCC die Anti-Krebs-Aktivität des chemotherapeutischen Mittels beim Behandeln von Krebs in einem Tier mit Krebs potenziert.