ES2829416T3 - Composiciones de pared celular del ácido ribonucleico bacteriano y procedimientos para prepararlas y usarlas - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende ARN micobacteriano aislado de células micobacterianas; y, paredes celulares micobacterianas aisladas de células micobacterianas, donde la composición no contiene fenol o pronasa, y donde el ARN está en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de 2 a 150 bases de longitud.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de pared celular del ácido ribonucleico bacteriano y procedimientos para prepararlas y usarlas CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevas composiciones que comprenden ARN micobacteriano y paredes celulares micobacterianas y procedimientos para preparar y usar estas composiciones. Estas composiciones tienen actividad inmunoestimulante y anticancerosa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
J. M. Grange y col., Vaccine 26 (2008) 4984-4990 describen el uso de agentes a base de adyuvantes micobacterianos para la inmunoterapia del cáncer.
I. Millman y col., Infection and Immunity, American Society for Microbiology, vol. 14, núm. 4, octubre de 1967, págs.
929-933 describen una comparación de ácido ribonucleico micobacteriano con fracciones de pared celular micobacteriana para la regresión del crecimiento tumoral murino.
I. Millman y col., Experimental Biology and Medicine, diciembre de 1974, vol. 147, núm. 3, 765-768 describe que tanto una cepa H37Ra de Mycobacterium tuberculosis como la fracción de ARN ribosómico de esta cepa son inhibidores eficaces del crecimiento tumoral en ratones.
R. Mendes y col., British Journal of Cancer (2002) 86, 336-341 describe la evaluación clínica e inmunológica de Mycobacterium vaccae (SRLI72) con quimioterapia en pacientes con mesotelioma maligno.
J. Bahn y col., J. Allergy Clin Immunol, vol. 115, No. 2, Abstract S27, 110 describe la tasa de sensibilización de empinasa (pronasa) en trabajadores expuestos en el hospital y la identificación de su alérgeno.
G. Post y col., Cell Biology and Toxicology, vol. 2, núm. 2, 1986, pág. 231-246 describe el metabolismo del benceno y el fenol en macrófagos in vitro y la inhibición de la síntesis de ARN por los metabolitos del benceno.
El documento WO 03/049667 A2 describe un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende la administración de una formulación que se prepara usando Mycobacterium w o una composición farmacéutica obtenida de Mycobacterium w solo o en combinación y también con o sin adyuvantes a un sujeto que ha padecido cáncer. MC Fillon y col., British Journal of Cancer (1999) 79 (2), 229-235 describe que el complejo de pared celular de Mycobacterium phlei induce directamente la apoptosis en células cancerosas de vejiga humana.
S. Reader y col., XP-000946798 describen que un complejo de ADN y pared celular micobacteriana (MCC) inhibe la proliferación e induce la apoptosis en células cancerosas de próstata humanas independientes y dependientes de andrógenos.
T-H Paik y col., Vaccine 28 (2010) 7873-7880 describen el esqueleto de la pared celular micobacteriana como un portador de vacuna universal para la conjugación de antígenos.
El documento WO 98/20900 A1 describe composiciones de pared celular micobacteriana.
El tratamiento del cáncer sigue siendo un problema para la medicina clínica y veterinaria. Los regímenes de tratamiento disponibles en la actualidad incluyen cirugía, radiación, quimioterapia, inmunoterapia (incluida la terapia de células autólogas y heterólogas) o combinaciones de las mismas
La cirugía a menudo falla debido a que el tejido tumoral no se reconoce y no se elimina. La radiación y la quimioterapia también fallan con frecuencia, y los efectos secundarios de los tratamientos a menudo disminuyen la calidad de vida de los pacientes. La cirugía y la quimioterapia se asocian con una supresión significativa y a menudo inespecífica del sistema inmunitario(Hammer y col., Eur. Surg. Res., 199224:133-137; Joos y Tam, Proc. A.m. Thorac. Soc. 2005: 445-448). Esta inmunosupresión se asocia a menudo con la aparición de infecciones oportunistas, según queda ejemplificado por la alta tasa conocida de complicaciones infecciosas en individuos sometidos a irradiación de cuerpo entero con dosis altas (Gil y col., Infección, 200735:421-427). La radiación, la cirugía y la quimioterapia se asocian además con la supresión hematopoyética y mieloide multilinaje (mielosupresión) tal como, de modo no taxativo, leucopenia, neutropenia, trombocitopenia y/o anemia (Montoya. J. Infus. Nurs. 2007; 30:168-172). Estas afecciones pueden poner en peligro la vida de los pacientes. La quimioterapia a menudo se ve comprometida por la presencia o el desarrollo posterior de resistencia, que a menudo puede abarcar diferentes clases de fármacos (resistencia a múltiples fármacos).
La inmunoterapia para el cáncer se ha utilizado durante muchos años. Uno de los primeros tratamientos inmunitarios fue una vacuna bacteriana mixta (vacuna de Coley), cuyo ingrediente activo es el lipopolisacárido bacteriano. Cabe señalar que las autoridades normativas se esfuerzan por limitar o eliminar la presencia de lipopolisacárido de agentes farmacéuticos debido a efectos no deseados y a menudo tóxicos. Más recientemente, se han usado mezclas de células de melanoma malignas irradiadas para inducir respuestas inmunitarias en pacientes con melanoma maligno, lo que aumentó la supervivencia en varios pacientes (Morton, y col. Ann. Surg. 1992, 216:463-482). Uno de los principales beneficios que ofrece la terapia inmunitaria (inmunoterapia) es que generalmente no se asocia con los efectos secundarios de la cirugía, la radiación o la quimioterapia. En tres estudios que utilizaron inmunoterapia con células dendríticas en pacientes con cáncer, se informaron efectos secundarios mínimos o nulos (Hsu, y col. Nature Medicine, 19962:52-58; Murphy, y col. The Prostate, 199629:371-380; Nestlé y col.Nature Medicine, 1998, 4(3):328-332).
Se sabe que las paredes celulares micobacterianas estimulan los mecanismos de defensa inmunitaria del huésped (tanto innatos a través de la interacción con los receptores de patrón molecular asociados a patógenos - PAMP, como adquiridos a través de la presencia de especies moleculares inmunogénicas). La inmunoterapia con micobacterias viables enteras se utiliza clínicamente en el tratamiento del cáncer de vejiga. El mycobacterium bacillus Calmette-Guérin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium bovis, se instila repetidamente en la vejiga de individuos con cáncer de vejiga, cuando es posible y preferentemetne en un entorno adyuvante después de la extirpación del tumor mediante cirugía (como se describe en, por ejemplo, European Association of Urology Guidelines edición 2007, páginas 8-9). Sin embargo, su uso está asociado a una variedad de efectos secundarios adversos relacionados con su naturaleza viable (Koya, y col. J. Urology 2006, 175:2004-2010) así como una eficacia clínica y una duración de la tasa de respuesta a menudo bajas, especialmente en pacientes que experimentan una recaída en el tratamiento (Witjes y Hendricksen. Eur. Urol. 2008; 53:24-26). Su uso para el tratamiento de otros cánceres está contraindicado porque contiene micobacterias vivas y puede dar lugar a infecciones sistémicas fatales (Orifice, y col. Tumori 1978, 64:437-443). Se ha intentado la inmunoterapia del cáncer usando micobacterias intactas pero inactivadas con micobacterias Mycobacterium vaccae,pero hasta ahora no se ha identificado en estudios clínicos una supervivencia definitiva a largo plazo después de su uso (véase Stanford y col., Eur. J. Cancer (2008), 44, 224-227). Está claro que las micobacterias intactas, viables o inactivadas, no representan la forma más eficaz de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer.
Se ha evaluado extensamente la inmunoterapia que utiliza paredes celulares bacterianas y extractos bacterianos en modelos tumorales animales, en pacientes que padecen cáncer (patentes de los EE. UU. núms. 4.503.048, 5.759.554 y 6.326.357), y como tratamientos para enfermedades infecciosas, tales como infecciones bacterianas y virales (patentes de los EE. UU. núms. 3.172.815, y 4.744.984).
Las composiciones de pared celular micobacteriana con actividad anticancerosa e inmunoestimulante (por ejemplo, como se describe en las patentes de los EE. UU. núms. 4.503.048, 5.759.554 y 6.329.347 o en Ribi y col., J. Bacteriol.
1965, 91:975-983) presentan la desventaja de que se requieren reactivos y materiales biológicos, reactivos químicos, solventes o diluyentes y tratamientos enzimáticos para su preparación, con el potencial de contaminación con proteínas extrañas y químicos nocivos. Además, se ha informado que para obtener una actividad anticancerosa óptima con paredes celulares micobacterianas altamente purificadas (que consisten esencialmente en el esqueleto de la pared celular después de extensos tratamientos químicos y enzimáticos), se requiere una formulación como emulsiones oleosas (Yarkoni y Rapp, Cancer Res., 197939:535-7). Las emulsiones oleosas que contienen paredes celulares micobacterianas a menudo son físicamente inestables y difíciles de preparar de forma reproducible, y pueden ser tóxicas para el receptor debido al conocido potencial de inducir reacciones de hipersensibilidad. También se han descrito paredes celulares micobacterianas que contienen ADN acomplejado biológicamente activo que poseen actividad inmunoterapéutica y anticancerosa y que no dependen de la presencia de aceite (patente de los EE. UU. núm. 6.326.357), pero nuevamente estas presentan la desventaja de que se requieren tratamientos químicos y enzimáticos para su preparación, con el potencial de contaminación de proteínas extrañas y químicos nocivos. Además, utilizando tales composiciones no se ha demostrado que sea posible optimizar preferentemente ni la actividad inmunoterapéutica ni la actividad anticancerosa.
Los expertos en la materia reconocen que la alteración de microorganismos puede alcanzarse usando volúmenes de muestras pequeñas y células de presión refrigeradas (tales como la célula de presión Sorvall) a temperaturas altas de entre 40.000 y 45.000 libras por pulgada cuadrada (PSI, equivalente a 276-317 mPa) (véase Ribi y col., J. Bacterial., 1966, 91:975-983). Estos procedimientos requieren mucho tiempo, son ineficaces y de bajo volumen, y además se ven obstaculizados por la actual falta de disponibilidad de este tipo de equipo. Se han descrito procedimientos más eficaces que usan homogeneización a alta presión para el aislamiento de proteínas (como cuerpos de inclusión) de microorganismos modificados genéticamente (véase Peternel y Komel: Isolation of biologically active nanomaterial [inclusion bodies] from bacterial cells. Microbial Cell Factories 2010 9:66). Sin embargo, los expertos en la materia reconocen que los organismos grampositivos son resistentes a tales procedimientos en virtud de su contenido y estructura de peptidoglicano (véase Diels y Michaels: High pressure homogenization as a non-thermal technique for the inactivation of microorganisms. Crit. Rev. Microbiol., 2006; 32:201-216). Los expertos en la materia también enseñan el uso de técnicas para minimizar la cantidad de ciclos de homogeneización (véaseBailey y col., Improved homogenization of recombinant Escherichia coli following pretreatment with guanidinium chloride: Biotech. Prog., 1995; 11:533-539). De hecho, el uso de tales procedimientos está claramente diseñado para extraer los fragmentos de la pared celular, no para preservarlos. La presencia de ácidos nucleicos como el ADN mediante técnicas de alteración a alta presión se enseña además como un material contaminante que debe extraerse, no preservarse (véaseRathore y col., Analysis for residual host cell proteins and DNA in process streams of a recombinant protein product expressed in Escherichia coli cells: J. Pharm. Biomed. Anal., 2003; 32:1199-1211). Lo que se necesita son nuevos procedimientos para la preparación de nuevas composiciones de ácido nucleico bacteriano que utilicen volúmenes de trabajo que sean escalables, que oscilen de varios ml a volúmenes de varios litros, y den como resultado la producción eficaz de nuevas composiciones de ácido nucleico bacteriano y de la pared celular.
Se sabe que las paredes de las células micobacterianas y sus componentes pueden estimular y activar macrófagos, monocitos y células dendríticas para producir moléculas bioactivas que pueden iniciar, acelerar, amplificar y estimular las células sensibles del sistema inmunitario de manera de lograr el efecto estimulador inmunitario. Estas moléculas bioactivas incluyen, de modo no taxativo, factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides, citocinas y quimiocinas.
Los factores de crecimiento son proteínas que se unen a receptores en la superficie celular, con el resultado principal de activar la proliferación y/o la diferenciación celular. Las citocinas son una familia única de proteínas reguladoras. Las citocinas, secretadas principalmente a partir de células del sistema inmunitario, como, entre otros, leucocitos, y que actúan como mediadores intercelulares, estimulan la respuesta inmunitaria humoral y celular, así como la activación de las células fagocíticas. Las citocinas secretadas por los linfocitos se denominan linfocinas, mientras que las secretadas por los monocitos o macrófagos se denominan monoquinas. Muchas de las linfocinas también se conocen como interleucinas (IL), ya que no solo son secretadas por los leucocitos, sino que también pueden afectar las respuestas celulares de los leucocitos. Las quimiocinas son una clase de citocinas que tienen la capacidad de atraer y activar leucocitos, especialmente en respuesta a infecciones (un procedimiento denominado quimiotaxis). Se pueden dividir en al menos tres ramas estructurales: c (quimiocinas, c), cc (quimiocinas, cc) y cxc (quimiocinas, cxc), según las variaciones en un motivo de cisteína compartido (Johrer y col. Exp. Opin. Biol. Ther. 2008, 8: 269-290.). Los efectos nocivos de los agentes quimioterapéuticos o la radioterapia sobre la producción de las células del sistema inmunitario que son responsables de producir estos factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides, citocinas y quimiocinas dan como resultado una mayor susceptibilidad a las infecciones oportunistas.
El cáncer (del cual hay más de 100 enfermedades) es una acumulación neta aberrante de células atípicas, resultante de una división celular descontrolada, una apoptosis insuficiente o defectuosa, o una combinación de ambas. Mutaciones en genes relacionados con la apoptosis como, entre otros, Fas, TNFR1 y p53/p21 han estado implicados en la patogenia de los cánceres (Levine, A. Cell 88:323-331, 1997; Fisher, D. Cell 78:529-542, 1994). La apoptosis aberrante es importante no solo para la patogénesis de los cánceres, sino también para la probabilidad de resistencia del cáncer a muchas terapias contra el cáncer.
resistencia a la inducción de la apoptosis ha surgido como una categoría importante de resistencia a múltiples fármacos (MDR, por sus siglas en inglés), que probablemente explica una proporción significativa de los fracasos del tratamiento. La MDR, la resistencia simultánea a clases de agentes quimioterapéuticos estructural y funcionalmente no relacionados, puede ser tanto inherente como adquirida. Es decir, algunos cánceres nunca responden a la terapia, mientras que otros cánceres, inicialmente sensibles a la terapia, desarrollan posteriormente resistencia a los fármacos mediante la selección de clones resistentes. Como los agentes quimioterapéuticos dependen principalmente de la inducción de la apoptosis en las células cancerosas para su efecto terapéutico, la resistencia a los fármacos, que disminuye la eficacia de los agentes quimioterapéuticos, conduce directa o indirectamente a una apoptosis reducida y generalmente se asocia con un pronóstico clínico precario en una variedad de cánceres.
Los agentes anticáncer de la técnica anterior han demostrado ser menos que adecuados para aplicaciones clínicas. Muchos de estos agentes son ineficaces (Bischoff y col. Science 274:373-376, 1996) o tóxicos, tienen efectos secundarios significativos (Lamm y col. Journal of Urology 153:1444-1450, 1995), dan lugar al desarrollo de farmacorresistencia o reacciones de sensibilización e hipersensibilidad inmunitarias, y son debilitantes para el receptor.
Por lo tanto, existe una necesidad de nuevas composiciones terapéuticas que estimulen las células sensibles del sistema inmunitario para producir citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides, inhibir la proliferación de células cancerosas e inducir apoptosis en células cancerosas. Estas composiciones terapéuticas deberían ser útiles como agentes anticancerosos por derecho propio, además de tener una actividad adyuvante con respecto a otros agentes anticancerosos. Esta composición terapéutica debería ser útil para prevenir o tratar la mielosupresión asociada con cáncer, cirugía, radiación o quimioterapia. Además, tal composición terapéutica debe ser simple y relativamente económica de preparar, su actividad debe ser reproducible entre preparaciones, su actividad debe mantenerse estable a lo largo del tiempo y sus efectos sobre las células cancerosas deben poder lograrse con regímenes de dosis asociados con una reactividad adversa y toxicidad mínimas. Además, existe la necesidad de procedimientos para fabricar nuevas composiciones terapéuticas que sean eficaces y que no den lugar a la presencia de enzimas o productos químicos usados en su preparación.
También existe la necesidad de una nueva composición terapéutica que trate, prevenga, mitigue o mejore los trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias o infecciosas, mielosupresión o anomalías hematopoyéticas y mieloides. La composición terapéutica debería ser útil como adyuvante con otros agentes terapéuticos. Además, tal composición terapéutica debe ser simple y relativamente económica de preparar, su actividad debe ser reproducible entre preparaciones, su actividad debe mantenerse estable a lo largo del tiempo y sus efectos sobre las células cancerosas deben poder lograrse con regímenes de dosis asociados con una toxicidad mínima.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición que comprende ARN micobacteriano aislado de células micobacterianas; y paredes celulares micobacterianas aisladas de células micobacterianas, donde la composición no contiene fenol o pronasa, y donde el ARN está en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de 2 a 150 bases de longitud. La presente invención y sus realizaciones se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención satisface las necesidades anteriores al proporcionar nuevas composiciones que comprenden ácido ribonucleico (ARN) y paredes celulares (definidas como RNC en esta solicitud) que se derivan de micobacterias. La presente invención satisface las necesidades anteriores proporcionando nuevas composiciones que comprenden ARN micobacteriano y paredes celulares micobacterianas (definidas como MRNC) y procedimientos para preparar y usar estas composiciones. Estas nuevas composiciones comprenden ARN micobacteriano en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos en los que el ARN puede existir como cadenas simples (ss), cadenas dobles (ds) o cadenas híbridas mono-bicatenarias (hs), aisladas de micobacterias y paredes celulares micobacterianas, donde el ARN se formula en un portador farmacéuticamente aceptable o complejado (donde el término complejo se usa para describir la asociación química de dos o más especies moleculares) con un sistema de portador farmacéuticamente aceptable. Aunque se pueden usar sistemas de portadores farmacéuticos conocidos por los expertos en la materia, en una realización el sistema portador se basa en paredes celulares micobacterianas. Las composiciones de la presente invención también pueden contener células bacterianas o micobacterianas intactas, cuyo contenido se selecciona según la intención terapéutica deseada.
Las composiciones de la presente invención poseen actividad anticancerosa. Las composiciones de la presente invención también contienen actividad estimulante del sistema inmunitario. Las composiciones de la presente invención también actúan como adyuvantes de otras modalidades terapéuticas.
Se usan tres nombres diferentes en la presente solicitud para describir estas composiciones. Primero, el término composición de ARN bacteriano (BRNC, por sus siglas en inglés) se usa generalmente para describir las composiciones hechas de diferentes especies de bacterias. Las BRNC se pueden preparar a partir de diferentes bacterias gramnegativas o grampositivas con los procedimientos descritos en esta solicitud. En segundo lugar, el término composición de ARN micobacteriano (MRNc ) se utiliza para describir las composiciones elaboradas a partir de diferentes micobacterias. En diferentes realizaciones, las MRNC se pueden preparar a partir de cualquier micobacteria. En tercer lugar, en otras realizaciones, se utilizan especies micobacterianas específicas, complejos micobacterianos o cepas micobacterianas para preparar MRNC. Ejemplos de estos son, de modo no taxativo, Mycobacterium avium(que incluye la subespecieparatuberculosis, comúnmente denominada MAP),Mycobacterium bovisBCG,Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatisoMycobacterium vaccaecon los procedimientos descritos en esta solicitud. Un experto en la materia reconocerá que los procedimientos de preparación de las composiciones descritas en la presente son aplicables a la preparación de MRNC a partir micobacterias distintas de las descritas en la descripción detallada y los ejemplos.
El término composición de ARN micobacteriano (MpRNC) se usa para describir las composiciones que comprenden ARN y paredes celulares hechas de Mycobacterium phlei.Los términos composición de ARN de la cepa BCG deMycobacterium bovis(MbRNC), composición de ARN deMycobacterium smegmatis(MsRNC), composición de ARN deMycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis(MAP) (MapRNC) y composición de ARN deMycobacterium vaccae(MvRNC) se usan para describir las composiciones celulares que comprenden ARN y paredes celulares hechas deMycobacterium bovisBCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisyMycobacterium vaccae,respectivamente. En cada composición, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, se aísla el ARN micobacteriano usando un procedimiento que da lugar a una producción eficaz de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos.
En otra realización, cada MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, también pueden contener diferentes cantidades de células micobacterianas intactas. Las células intactas pueden estar presentes en MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC en cantidades de aproximadamente 0-99 %, 0,05-95 %, 0,07-50 %, 0,1-20 % o 0,19-19 % en peso, o en una cantidad dentro de cualquiera de estos intervalos, o menos de 0,75 % o menos de 0,2 % en peso.
Las nuevas composiciones poseen un contenido de ARN (que puede variar de aproximadamente el 30 % al 100 % del contenido total de ácido nucleico) en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que tienen de 2 a 150 bases de longitud.
En otra realización, estas nuevas composiciones poseen un contenido de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos (aproximadamente 30-100 % del contenido total de ácido nucleico) principalmente en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que tienen una longitud de 20 a 40 bases.
La actividad anticancerosa de las presentes composiciones se maximiza cuando hay un contenido mínimo de células micobacterianas intactas. La actividad inmunoestimuladora se maximiza cuando hay un contenido de células micobacterianas intactas en el intervalo de 5-50 % p/p. El contenido deseado decélulasintactas micobacterianas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecieparatuberculosisoMycobacterium vaccaese puede lograr controlando el procedimiento de preparación como se detalla en los ejemplos, o agregando micobacterias intactas,Mycobacterium phleiBCG,Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisoMycobacterium vaccaecélulas a MRNc , MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC. La MRNC puede usarse sola como una composición preparada a partir de una especie, cepa, subcepa o complejo micobacteriano, o en combinación con MRNC de otras especies, cepa, subcepa o complejo micobacterianos. Por ejemplo, una combinación de MpRNC y MvRNC proporcionará una activación óptima de NOD2 y TLR2 para la estimulación inmunitaria y la inducción de citocinas. De manera similar, una combinación de MpRNC y MvRNC proporcionará una actividad anticancerosa y una estimulación inmunitaria óptimas.
Estas nuevas composiciones poseen actividad inmunoestimuladora, anticancerosa y estimulante del factor de crecimiento de células madre hematopoyéticas y mieloides.. A diferencia de las preparaciones de la técnica anterior, estas nuevas composiciones contienen oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos (tales como, de modo no taxativo, cadenas simples (ss), cadenas dobles (ds) o mezclas de las mismas), y contienen niveles de micobacterias intactas apropiados para la aplicación pretendida. Además, a diferencia de la técnica anterior, donde se requieren combinaciones de agentes sintéticos (véaseUehara y col., Muramyldipeptide and diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides in combination with chemically synthesized Toll-like receptor agonists synergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2- and NOD-dependent manner, respectively, in human monocytic cells in culture: Cell. Microbiol., 2005; 7:53-61), estas nuevas composiciones tienen la capacidad de activar los receptores del dominio 2 de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD2) y del receptor tipo Toll 2 (TLR2), demostrando así una actividad agonista bifuncional inesperada para los receptores del sistema inmunitario que es útil para la estimulación. del sistema inmunitario, estimulando la proliferación de células madre hematopoyéticas y mieloides y en el tratamiento del cáncer en regímenes de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos. En diferentes realizaciones, estas composiciones son eficaces para inducir una respuesta en las células sensibles del sistema inmunitario de un animal, para inducir la detención o apoptosis del ciclo celular e inhibir la proliferación celular. Estas composiciones inducen a las células sensibles del sistema inmunitario a producir citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento de células madre hematopoyéticas y mieloides.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son relativamente económicas de preparar y su actividad es reproducible entre preparaciones. Mr Nc , MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se mantienen estables y eficaces a lo largo del tiempo y en regímenes de dosis que se asocian con una toxicidad mínima.
En una realización de la invención, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC and MvRNC, se preparan a partir de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae respectivamente, como sigue: las micobacterias se cultivan y se extraen. Las micobacterias se alteran para extraer según sea necesario las micobacterias intactas mediante la utilización de homogeneización a alta presión seguida de un procedimiento de centrifugación para extraer según sea necesario cualquier célula micobacteriana intacta residual. Es importante destacar que se usan reactivos sin RNasa o sin nucleasas no específicos para optimizar la recuperación del RNC.
Se utiliza una fuerza centrífuga relativa baja para extraer las micobacterias intactas según sea necesario. A continuación, se pueden aislar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos usando técnicas de extracción convencionales, por ejemplo extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, o se aplica una fuerza centrífuga relativa alta al sobrenadante después de la extracción de micobacterias intactas para aislar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que permanecen formulados con paredes celulares micobacterianas. después de la alteración celular. Es importante destacar que los reactivos que no contienen contaminación por nucleasas (endo y exonucleasas o ribonucleasas no específicas) se usan para extraer o minimizar la degradación del ARN y, por lo tanto, optimizar el rendimiento durante las etapas de preparación.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son agentes terapéuticos eficaces para prevenir, tratar, disminuir el impacto y extraer una variedad de enfermedades que incluyen, entre otras, enfermedades malignas, autoinmunitarias y de inmunodeficiencia, mielosupresión y anomalías hematopoyéticas y mieloides. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son particularmente útiles para tratar enfermedades y procedimientos mediados por la proliferación celular no deseada y descontrolada, como el cáncer. Estas composiciones también son eficaces como adyuvantes para mejorar la eficacia de otros agentes anticancerosos. Tales agentes anticancerosos incluyen, entre otros, fármacos, estimulantes inmunitarios, antígenos, anticuerpos, vacunas, radiación, agentes quimioterapéuticos, agentes genéticos, genéticamente modificados y sintetizados químicamente, y agentes que se dirigen a moléculas de muerte celular para activación o inactivación. agentes que inhiben la proliferación de células cancerosas y que inducen apoptosis en células cancerosas. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC también son eficaces para la prevención o el tratamiento de la mielosupresión (monocitopenia o neutropenia) asociada con el tratamiento del cáncer o el cáncer en sí, y para la prevención o el tratamiento de diversas anomalías hematopoyéticas y mieloides. asociado con medicamentos o enfermedades, tales como, de modo no taxativo, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), síndromes mielodisplásicos, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades renales en etapa terminal o infecciones virales.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, en un portador farmacéuticamente aceptable, se pueden administrar a un animal o humano en una dosis eficaz para estimular una respuesta en las células sensibles del sistema inmunitario y para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en las células sensibles. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC se pueden administrar mediante procedimientos que incluyen, entre otros, suspensión en formulaciones acuosas, en cremas y geles, mediante emulsificación en aceite u otras formulaciones líquidas hidrófobas, encierro en liposomas y complejación con portadores naturales o artificiales, con ligandos específicos de tejido o célula o con anticuerpos específicos de tejido o célula.
En una realización, la presente invención proporciona nuevas composiciones que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, y procedimientos para preparar estas composiciones.
También se describen aquí procedimientos de preparación para la preparación de composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC que optimizan el contenido de fuentes de carbono, nitrógeno y hierro en los medios de cultivo para la preparación de masa celular micobacteriana.
En esta solicitud también se describen medios sintéticos útiles para cultivar la masa de células micobacterianas. En esta solicitud también se describen los procedimientos de preparación para la preparación de composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC que optimizan el contenido de carbono, nitrógeno y hierro en los medios de cultivo y que eliminan la necesidad de materiales biológicos exógenos para la preparación de masa celular micobacteriana, y que eliminan el uso de agentes biológicos o químicos exógenos durante el procedimiento de preparación posterior.
En otra realización más, la presente invención proporciona nuevos MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC terapéuticos, en un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización adicional, la presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, y procedimientos para usar estas composiciones terapéuticas para inducir una respuesta terapéutica en células sensibles de un animal o un ser humano.
En otra realización, la presente invención proporciona estas composiciones terapéuticas para su uso en la estimulación de las células sensibles del sistema inmunitario mediante la administración de estas composiciones terapéuticas a un animal o un ser humano.
En aun otra realización, la presente invención proporciona estas composiciones terapéuticas para uso en la estimulación de células sensibles del sistema inmunitario para producir moléculas bioactivas tales como citocinas, quimiocinas, interleucinas y/o factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides mediante la administración de estas composiciones terapéuticas a un animal o un ser humano.
En otra realización, la presente invención proporciona estas composiciones terapéuticas para su uso para tratar una enfermedad en un animal o un ser humano mediante la administración de estas composiciones terapéuticas a un animal o un ser humano.
En otra realización, la presente invención proporciona estas composiciones terapéuticas para su uso para tratar el cáncer en un animal o un ser humano mediante la administración de estas composiciones terapéuticas a un animal o un ser humano.
En esta solicitud se describe una composición y un procedimiento que inhibe la proliferación de células sensibles de un animal.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición y un procedimiento que induce la apoptosis en células sensibles de un animal.
En aun otra realización, la presente invención proporciona una composición y un procedimiento que es eficaz como adyuvante de otras terapias contra el cáncer.
En aun otra realización , la presente invención proporciona una composición y un procedimiento que es eficaz como adyuvante de otras terapias inmunoestimuladoras.
En una realización adicional, la presente invención proporciona una composición y un procedimiento que es eficaz para el tratamiento de enfermedades por inmunodeficiencia.
En aun otra realización, la presente invención proporciona una composición y un procedimiento que es eficaz para la prevención o el tratamiento de la mielosupresión (leucopenia, neutropenia, trombocitopenia o anemia) o anomalías hematopoyéticas y mieloides.
En aun otra realización, la presente invención proporciona una composición y un procedimiento que es eficaz como adyuvante de otras terapias para la prevención o el tratamiento de la mielosupresión o anomalías hematopoyéticas y mieloides.
En otra realización, la presente invención proporciona estas composiciones terapéuticas para su uso para tratar una enfermedad autoinmunitaria en un animal o un ser humano mediante la administración de estas composiciones terapéuticas a un animal o un ser humano.
En aun otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación que no da lugar a la presencia de productos químicos o enzimas en la composición.
Estos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes después de la revisión de la siguiente descripción detallada de la realización descrita y las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. Micrografías electrónicas de transmisión (TEM) deMycobacterium phlei(1a), MCWE (1b), MCC (1c), MpRNC baja (1d), MpRNC intermedia (1e) y MpRNC alta (if). Las barras son de 1 pm para 1a, 1b y 1c, y de 2 pm para 1d, 1e y 1f.
FIGURA 2. Análisis electroforético de la longitud del oligonucleótido de ácido nucleico. 2a. Escalera de ARN estándar y MpRNC intermedia antes de esterilización en autoclave con el kit de ARN nano 6000. 2b. MpRNC que contiene proporciones variables de células deM. phleiesterilizadas en autoclave (MpRNC alta, MpRNC baja o y MpRNC intermedia) después de la esterilización en autoclave con el kit de ARN pequeño (el pico de 4 nucleótidos es el estándar de oligonucleótidos interno y no está asociado con ácidos nucleicos en la MpRNC. FU = unidades de fluorescencia, nt = longitud de nucleótidos
FIGURA 3. Contenido de ARN y ADN de MpRNC que contiene proporciones variables de célulasM. phleiesterilizadas en autoclave intactas (3a alta, 3b baja o 3c intermedia) yMycobacterium phlei(3d) esterilizadas en autoclave según se determinó antes y después del tratamiento con RNasa-A.
FIGURA 4. Ácido nucleico (AN) susceptible a la RNasa en MpRNC, MbRNC, MsRNC y MvRNC. 4a: electroforesis en gel de urea-PAGE de ácidos nucleicos extraídos tratados con control y tratados con RNasa; 4b: La proporción de ARN en los ácidos nucleicos extraídos determinada por densitometría de barrido.
FIGURA 5. Perfil de ácido micólico de MpRNC Intermedia. 5a: perfil de ácido micólico utilizando estándar de ácido behénico para la cuantificación de lípidos extraíbles; 5b: Perfil de ácido micólico utilizando estándares de número de carbonos de ácido micólico alto y bajo (estimado en ~C40 y -C110) para la cuantificación de lípidos saponificables.
FIGURA 6. Activación de NOD2 por RNC micobacteriana. Se utilizaron células HEK293 que expresan NOD2 para determinar la actividad agonista de NOD2 de RNC preparadas a partir de 4 especies micobacterianas: Mycobacterium phlei, Mycobacterium boviscepa BCG,Mycobacterium smegmatisyMycobacterium vaccae.La activación de NOD2 da lugar a la inducción de fosfatasa alcalina embrionaria secretora (SEAP) impulsada por NF-kB. Después de la hidrólisis del sustrato por SEAP en el sobrenadante del cultivo celular, la actividad enzimática se expresa como la DO a 630 nm y es proporcional a la activación de NOD2. Media ± de determinaciones por triplicado.
FIGURA 7. Activación de TLR2 por RNC micobacteriano. Se usaron células HEK293 que expresan el receptor TLR2 para determinar la actividad agonista de TLR2 de MRNC preparada a partir de 4 especies micobacterianas: Mycobacterium phlei, Mycobacterium boviscepa BCG, Mycobacterium smegmatisyMycobacterium vaccae.La activación de TLR2 da lugar a la inducción de SEAP impulsada por NF-kB. Después de la hidrólisis del sustrato por SEAP en el sobrenadante del cultivo celular, la actividad enzimática se expresa como la DO a 630 nm y es proporcional a la activación de NOD2. Media ± de determinaciones por triplicado.
FIGURA 8. Estimulación de la producción de IL-10 e IL-12 en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) por medio de MpRNC intermedia que contiene proporciones variables deMycobacterium. phleiintacto esterilizado en autoclave.La producción de subunidades de IL-10 e IL-12p40 por PBMc humanas después del tratamiento con MpRNC yMycobacterium phleiesterilizado en autoclave se determinó mediante ELISA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones 1-21 y proporciona nuevas composiciones que comprenden ácido ribonucleico (ARN) y paredes celulares (definidas como RNC en esta solicitud) que se derivan de micobacterias. La presente invención proporciona nuevas composiciones que comprenden ARN micobacteriano y paredes celulares micobacterianas (definidas como MRNC) y procedimientos para preparar y usar estas composiciones. Estas composiciones se pueden formular con portadores, y/o células. Estas nuevas composiciones comprenden paredes celulares de micobacterias y ARN en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de ARN micobacteriano en los que los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos pueden existir como cadenas simples (ss), cadenas dobles (ds) o cadenas híbridas de una sola cadena doble (hs). . Estas composiciones pueden formularse en un vehículo farmacéuticamente aceptable o complejarse (donde el término complejo se usa para describir la asociación química de 2 o más especies moleculares) a un sistema portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la presente invención también pueden contener células bacterianas o micobacterianas intactas, cuyo contenido se optimiza para la intención terapéutica deseada.
Estas nuevas composiciones poseen actividad inmunoestimuladora, anticancerosa y actividad estimulante del factor de crecimiento de células madre hematopoyéticas y mieloides. A diferencia de las preparaciones de la técnica anterior, estas nuevas composiciones contienen oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos (tales como, entre otros, cadenas simples (ss), cadenas dobles (ds) o mezclas de las mismas) y opcionalmente contienen niveles seleccionados de micobacterias intactas apropiadas para la aplicación prevista. . También, en contraposición a la técnica anterior, donde se requieren combinaciones de agentes sintéticos (véase Uehara et al., Muramyldipeptide and diaminopimelic acidcontaining desmuramylpeptides in combination with chemically synthesized Toll-like receptor agonists synergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2- and NOD-dependent manner, respectively, in human monocytic cells in culture: Cell. Microbiol., 2005; 7:53-61), estas nuevas composiciones tienen la capacidad de activar los receptores del dominio 2 de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD2) y del receptor tipo Toll 2 (TLR2), demostrando así una actividad agonista bifuncional inesperada para los receptores del sistema inmunitario que es útil para la estimulación del sistema inmunitario, estimulando la proliferación de células madre hematopoyéticas y mieloides y en el tratamiento del cáncer en regímenes de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos. En diferentes realizaciones, estas composiciones son eficaces para inducir una respuesta en las células sensibles del sistema inmunitario de un animal, para inducir la detención o apoptosis del ciclo celular e inhibir la proliferación celular. Estas composiciones inducen a las células sensibles del sistema inmunitario a producir citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento de células madre hematopoyéticas y mieloides.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son agentes terapéuticos eficaces para prevenir, tratar, disminuir el impacto y extraer una variedad de enfermedades que incluyen, entre otras, enfermedades malignas, autoinmunitarias y de inmunodeficiencia, mielosupresión y anomalías hematopoyéticas y mieloides. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son particularmente útiles para tratar enfermedades y procedimientos mediados por la proliferación celular no deseada y descontrolada, como el cáncer. Estas composiciones también son eficaces como adyuvantes para mejorar la eficacia de otros agentes anticancerosos. Tales agentes anticancerosos incluyen, entre otros, fármacos, estimulantes inmunitarios, antígenos, anticuerpos, vacunas, radiación, agentes quimioterapéuticos, agentes genéticos, genéticamente modificados y sintetizados químicamente, y agentes que se dirigen a moléculas de muerte celular para activación o inactivación. agentes que inhiben la proliferación de células cancerosas y que inducen apoptosis en células cancerosas. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC también son eficaces para la prevención o el tratamiento de la mielosupresión (monocitopenia o neutropenia) asociada con el tratamiento del cáncer o el cáncer en sí, y para la prevención o el tratamiento de diversas anomalías hematopoyéticas y mieloides. asociado con medicamentos o enfermedades, tales como, de modo no taxativo, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), síndromes mielodisplásicos, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades renales en etapa terminal o infecciones virales.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, en un portador farmacéuticamente aceptable, se pueden administrar a un animal o humano en una dosis eficaz para estimular una respuesta en las células sensibles del sistema inmunitario y para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en las células sensibles. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC se pueden administrar mediante procedimientos que incluyen, entre otros, suspensión en formulaciones acuosas, en cremas y geles, mediante emulsificación en aceite u otras formulaciones líquidas hidrófobas, encierro en liposomas y complejación con portadores naturales o artificiales, con ligandos específicos de tejido o célula, o con anticuerpos específicos de tejido o célula.
Definiciones
El término optimización de los procedimientos de preparación se usa para describir el procedimiento mediante el cual la fermentación para obtener masa de células micobacterianas usa un medio de cultivo donde hay un contenido apropiado de carbono, nitrógeno y hierro, lo que da como resultado rendimientos mejorados de masa celular micobacteriana.
El término optimización del procedimiento de preparación también se refiere a la extracción del requisito del uso de productos químicos o enzimas en la preparación de las composiciones de la pared celular micobacteriana.
Se usan tres nombres diferentes en la presente solicitud para describir las composiciones. Primero, el término composición de ARN bacteriano (BRNC) se usa generalmente para describir las composiciones hechas de diferentes especies de bacterias. Las BRNC se pueden preparar a partir de diferentes bacterias gramnegativas o grampositivas con los procedimientos descritos en esta solicitud. En segundo lugar, el término composición de ARN micobacteriano (MRNC) se usa para describir las composiciones elaboradas a partir de diferentes micobacterias. En diferentes realizaciones, las MRNC se pueden preparar a partir de cualquier micobacteria. En tercer lugar, en otras realizaciones, se usan especies micobacterianas específicas, complejos micobacterianos o cepas micobacterianas para preparar MRNC. Ejemplos de estos son, de modo no taxativo, Mycobacterium avium(que incluye la subespecieparatuberculosis,comúnmente denominada MAP),Mycobacterium bovisBCG,Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatisoMycobacterium vaccaecon los procedimientos descritos en esta solicitud. Un experto en la materia reconocerá que los procedimientos de preparación de las composiciones descritas en esta solicitud son aplicables a la preparación de MRNC a partir micobacterias distintas de las descritas en la descripción detallada y los ejemplos.
El término composición de ARN micobacteriano (MpRNC) se usa para describir las composiciones que comprenden ARN y paredes celulares hechas de Mycobacterium phlei. Los términos composición de ARN de la cepa BCG de Mycobacterium bovis(MbRNC), composición de ARN deMycobacterium smegmatis(MsRNC), composición de ARN deMycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis(MAP) (MapRNC) y composición de ARN deMycobacterium vaccae(MvRNC) se usan para describir las composiciones celulares que comprenden ARN y paredes celulares hechas deMycobacterium bovisBCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisyMycobacterium vaccae,respectivamente. En cada composición, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, se aísla el ARN micobacteriano usando un procedimiento que da lugar a una producción eficaz de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos.
El término composición de ARN micobacteriano (MRNC) se usa para describir las composiciones elaboradas a partir de diferentes micobacterias En diferentes realizaciones, las MRNC pueden prepararse a partir de cualquier micobacteria. En otras realizaciones, se usan especies micobacterianas específicas, complejos micobacterianos o cepas micobacterianas para preparar MRNC. Ejemplos de estos son, de modo no taxativo,Mycobacterium avium (que incluye la subespecieparatuberculosis,comúnmente denominada MAP),Mycobacterium bovisBCG,Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatisoMycobacterium vaccaecon los procedimientos descritos en esta solicitud. Un experto en la materia reconocerá que los procedimientos de preparación de las composiciones descritas en esta solicitud son aplicables a la preparación de composiciones de pared celular a partir de micobacterias distintas de las descritas en la descripción detallada y los ejemplos.
El término composición de ARN de Mycobacterium phlei (MpRNC) se usa para describir las composiciones hechas de Mycobacterium phlei. Los términos composición de ARN de BCG de la cepa deMycobacterium bovis (MbRNC), composición de ARN deMycobacterium smegmatis(MsRNC), composición de ARN deMycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis(MAP) (MapRNC) y composición de ARN deMycobacterium vaccae(MvRNC) se usan para describir las composiciones deMycobacterium bovispreparadas a partir de BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisyMycobacterium vaccae,respectivamente. En cada composición, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRnC, se aísla el ARN de las micobacterias usando un procedimiento que da lugar a una producción eficiente de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos.
Como se define en esta solicitud, las composiciones de medios de cultivo micobacterianos (MCMC) se refieren a medios de cultivo sintéticos que contienen fuentes optimizadas de carbono, nitrógeno y hierro que se utilizan para preparar la masa de células micobacterianas y donde el contenido de carbono, nitrógeno y hierro de los medios es tal que existe una utilización óptima del carbono y un rendimiento óptimo de la masa celular húmeda micobacteriana.
Como se define en esta solicitud, cultivo se refiere al procedimiento de generación de la masa celular micobacteriana donde las micobacterias se cultivan en un medio optimizado, pero no limitado al contenido de carbono, nitrógeno y hierro que asegura la división óptima de las bacterias o micobacterias. Se puede hacer uso de equipos y condiciones de cultivo conocidas por los expertos en la materia.
Como se define en esta solicitud, el procesamiento o preparación posterior se refiere al procedimiento de tomar la masa de células micobacterianas preparada mediante cultivo y preparar composiciones que contienen ARN o composiciones de pared celular que contienen ARN mediante el uso de combinaciones apropiadas de homogeneización a alta presión, centrifugación diferencial y tratamiento con calor. Se puede hacer uso de técnicas conocidas por los expertos en la materia que son comparables en efecto a la homogeneización a alta presión sin apartarse del alcance o las enseñanzas de la invención.
Como se define en esta solicitud, pared celular bacteriana se refiere a una pared celular de un miembro del reino bacteriano que contiene componentes moleculares de la pared celular, y donde como mínimo estas moléculas comprenden polisacáridos y cadenas peptídicas que contienen alanina (ALA), comúnmente llamadas peptidoglicano.
Como se define en esta solicitud, pared celular micobacteriana se refiere a cualquier composición de pared celular preparada a partir de un miembro de la familia mycobacteriaceae y del género mycobacterium que contiene como mínimo peptidoglicano y ácidos micólicos, y donde el peptidoglicano está compuesto por un polímero que consta de unidades repetidas de [ácido N-acetilglucosamina-N-acilmurámico]n donde N-acilo es N-acetilo o N-glicolilo, y donde las cadenas poliméricas están enlazadas por puentes peptídicos, y donde los ácidos micólicos son ácidos grasos de cadena muy larga p-bidroxilados a-sustituidos. La composición exacta de aminoácidos de estos puentes peptídicos está altamente conservada entre diferentes especies micobacterianas y sus cepas, y es conocida por los expertos en la materia, pero a menudo incluye ácido diaminopimélico (DAP) y, hasta donde se sabe, siempre incluye alanina (ALA) enlazada al ácido N-acilmurámico a través del resto de ácido láctico. Los tipos de ácido micólico son específicos de las especies micobacterianas individuales y se subdividen en grupos según la longitud de la molécula (intervalo de -60-90 átomos de carbono).
Como se define en esta solicitud, la contaminación exógena se refiere a la presencia de cualquier material exógeno, que incluye, de modo no taxativo, proteínas, bioquímicos o productos químicos, que se usan convencionalmente en la preparación de composiciones derivadas de bacterias o micobacterias (incluidas la preparación de biomasa celular bacteriana o micobacteriana y composiciones de pared celular bacteriana o micobacteriana). A diferencia de los procedimientos previos para preparar composiciones de pared celular bacteriana y micobacteriana, las proteínas bacterianas y micobacterianas asociadas con las composiciones de RNC preparadas con los presentes procedimientos se conservan debido a la ausencia de tratamientos con enzimas proteolíticas exógenas. A diferencia de los procedimientos anteriores para preparar composiciones de pared celular bacteriana y micobacteriana, los lípidos de la pared celular bacteriana y micobacteriana se conservan debido a la ausencia de tratamientos con disolventes deslipidantes exógenos.
Como se define en esta solicitud, el término preparación se refiere al procedimiento mediante el cual se aísla una RNC, en la que se alteran células bacterianas o micobacterianas intactas para formar fragmentos de pared celular, y donde dichos fragmentos se aíslan luego en combinación con ARN para dar una RNC de pared celular bacteriana o micobacteriana.
Tal como se define en esta solicitud, los términos oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos se refieren, respectivamente, a moléculas de ARN, de 2 a aproximadamente 20 bases o de 20 a aproximadamente 150 bases de longitud obtenidas de bacterias, micobacterias, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis cepa BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae.El a Rn junto con las paredes celulares bacterianas o micobacterianas se define como RNC. El ARN puede estar compuesto de cadenas simples (ss), cadenas dobles (ds), cadenas híbridas mono bicatenarias (hs) y el ARN se obtiene de bacterias, más preferentemente de micobacterias y más preferentemente deMycobacterium phlei, Mycobacterium bovisBCG Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisoMycobacterium vaccae.La RNC puede comprender una o más RNC de diferentes bacterias o micobacterias, y además puede comprender células intactas de diferentes bacterias o micobacterias. El RNC también se puede formular utilizando paredes celulares de una o más bacterias o micobacterias.
Como se define en esta solicitud, la homogeneización a alta presión de bacterias o micobacterias se refiere a un procedimiento mediante el cual una suspensión de bacterias o micobacterias intactas en un excipiente acuoso se hace pasar a presión a través de un pequeño espacio en una válvula creando condiciones de alta turbulencia y fuerza de cizallamiento, que causan la desintegración de las bacterias o micobacterias en fragmentos de la pared celular y la liberación de componentes citoplasmáticos, incluidas proteínas y lípidos.
Como se define en esta solicitud, la centrifugación a baja velocidad se refiere a una fuerza centrífuga relativa (RCF) suficiente para sedimentar bacterias o micobacterias no alteradas.
Como se define en esta solicitud, la centrifugación a alta velocidad se refiere a una fuerza centrífuga relativa suficiente para sedimentar la RNC de pared celular bacteriana o micobacteriana.
Como se define en esta solicitud, la estimulación inmunitaria se refiere a la estimulación del sistema inmunitario innato o adquirido, de modo de desencadenar una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede estar compuesta por, entre otros, uno o más de los siguientes: diferenciación y división de células inmunitarias, activación de receptores tipo Toll, activación de receptores NOD, activación de receptores distintos al tipo Toll o NOD, inducción de quimiocinas y síntesis de citocinas, inducción de la síntesis del factor de crecimiento, aumento de la expresión de marcadores de superficie celular, disminución de la expresión de marcadores de superficie celular, activación de actividad citocida o citotóxica, estimulación de la producción de anticuerpos o estimulación de la inmunidad mediada por células.
Como se define en esta solicitud, la actividad anticancerosa se refiere a cualquier procedimiento que dé como resultado la inhibición o la muerte de las células cancerosas. Tal actividad anticancerosa puede ser el resultado de un efecto directo sobre dianas de células cancerosas, o el resultado de un efecto indirecto debido a la estimulación del sistema inmunitario.
El término animal incluye al ser humano en esta solicitud.
El término producir significa sintetizar y/o liberar en esta aplicación.
Composiciones para el cultivo de micobacterias
En esta solicitud se proporcionan medios para cultivar micobacterias que contienen niveles y proporciones optimizadas de carbono, nitrógeno y hierro para la generación de masa de células micobacterianas de manera oportuna. Estos medios usan fuentes de nitrógeno orgánico o fuentes de nitrógeno inorgánico y proporcionan procedimientos donde se puede proporcionar carbono, nitrógeno y hierro adicionales dentro de una molécula. Estos medios de cultivo no requieren la adición de proteínas exógenas como la albúmina bovina o catalasa para la producción eficaz de masa celular micobacteriana.
El nitrógeno optimizado se proporciona mediante la adición de sales de amonio inorgánicas que incluyen, entre otras, sulfato de amonio. El carbono optimizado se proporciona mediante la adición de moléculas orgánicas que incluyen, de modo no taxativo, azúcares como glucosa (dextrosa), glicoles como el glicerol o ácidos como el ácido cítrico, y que contienen carbono que puede ser metabolizado por las micobacterias.
El nitrógeno y el carbono optimizados son proporcionados por moléculas que contienen ambos átomos, incluidos, entre otros, citrato de amonio (dibásico) o aminoácidos como, entre otros, asparagina.
El carbono, el nitrógeno y el hierro optimizados son proporcionados por moléculas que contienen los tres átomos, incluido, entre otros, el citrato de amonio férrico.
Se puede hacer uso de medios de cultivo que proporcionen carbono, nitrógeno y hierro optimizados, así como cationes divalentes adicionales, incluidos, entre otros, calcio y magnesio.
Los medios de cultivo se formulan sin agentes biológicos exógenos adicionales que incluyen, entre otros, albúminas, enzimas o materiales potenciadores del crecimiento que incluyen, entre otros, micobactina.
Se usan procedimientos de mezcla y aireación para optimizar el acceso al oxígeno y garantizar un rápido crecimiento aeróbico de las bacterias o micobacterias.
Nuevas composiciones micobacterianas
La presente invención proporciona nuevas composiciones micobacterianas que comprenden ARN aislado de micobacterias y una pared celular micobacteriana. Estas composiciones incluyen MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, como se definió anteriormente. Estas composiciones contienen opcionalmente diferentes cantidades de células bacterianas o micobacterianas intactas. En otra realización, cada composición, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, también puede contener cantidades diferentes de micobacterias intactas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis,o células deMycobacterium vaccae. Las células intactas pueden estar presentes en MRNC, MpRNC, MbRNC MsRNC, MapRNC o MvRNC en cantidades de 0-99 %, 0,05-95 %, 0,07-50 %, 0,1-20 % o 0,19-19 % en peso, o en una cantidad dentro de estos intervalos.
Estas nuevas composiciones poseen un contenido de composición de ARN (que puede variar desde aproximadamente el 30 % al 100 % del contenido total de ácido nucleico) en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de entre 2 y 150 bases de longitud. En otra realización, estas nuevas composiciones poseen un contenido de ARN (30­ 100 % del contenido total de ácido nucleico) que se encuentra principalmente en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que tienen entre 20 y 40 bases de longitud.
En una realización, las nuevas composiciones de RNC que contienen aproximadamente el 90 % o más de ARN en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos se preparan mediante extracción de ARN de micobacterias, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) o Mycobacterium vaccae, usando, por ejemplo, extracción con tiocianato de guanidinio-fenolcloroformo. Tales preparaciones de ARN pueden tratarse con calor (por ejemplo, de modo no taxativo, a 121 °C durante entre 5 y 30 min) para dar una composición de RNC en la que la longitud de la cadena de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos está entre 2 y 4000 bases. Esta composición de RNC puede combinarse con un portador farmacéuticamente aceptable.
La actividad anticancerosa se optimiza cuando hay un contenido mínimo de células micobacterianas intactas. La actividad inmunoestimuladora se optimiza cuando hay un contenido de células micobacterianas intactas en el intervalo de 5-50 % p/p. La cantidad decélulasintactas bacterianas, micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecieparatuberculosis(MAP) o Mycobacterium vaccaese puede modular controlando el procedimiento de preparación como se detalla en los ejemplos, o agregando células intactas micobacterianas, de Mycobacterium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG,Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis (MAP)oMycobacterium vaccae a MRNc , MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC.
Estas nuevas composiciones, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC, poseen actividad inmunoestimulante, anticancerosa y estimulante del factor de crecimiento celular hematopoyético y mieloide. A diferencia de las preparaciones de la técnica anterior, estas nuevas composiciones contienen cadenas simples, monocatenarias (ss), bicatenarias (ds) y cadenas híbridas mono-bicatenarias (hs), están optimizadas para la actividad inmunoestimuladora y anticancerosa y están formuladas con paredes celulares micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis(MAP) oMycobacterium vaccae. En una realización, estas composiciones comprenden además niveles de células micobacterianas intactas apropiados para la aplicación prevista.
Las composiciones de la presente invención son eficaces para estimular el sistema inmunitario, estimular la síntesis de factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides y tratar el cáncer. En diferentes realizaciones, estas composiciones son eficaces para inducir una respuesta en las células sensibles del sistema inmunitario de un animal, para inducir la detención o apoptosis del ciclo celular e inhibir la proliferación celular. Estas composiciones inducen a las células sensibles del sistema inmunitario a producir citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento de células madre hematopoyéticas y mieloides.
Las composiciones de la presente invención son eficaces para estimular el sistema inmunitario y para tratar el cáncer cuando se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable para formar una composición terapéutica y se administran a un animal. En diferentes realizaciones, estas composiciones terapéuticas inducen una respuesta en células sensibles del sistema inmunitario de un animal, inducen la detención del ciclo celular o apoptosis e inhiben la proliferación de células cancerosas. Estas composiciones inducen a las células sensibles del sistema inmunitario a producir citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento de células madre hematopoyéticas y mieloides.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son agentes terapéuticos eficaces para prevenir, tratar, disminuir el impacto y extraer una variedad de enfermedades que incluyen, entre otras, enfermedades malignas, autoinmunitarias y de inmunodeficiencia, mielosupresión y anomalías hematopoyéticas y mieloides. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son particularmente útiles para tratar enfermedades y procedimientos mediados por la proliferación celular no deseada y descontrolada, tal como, de modo no taxativo, el cáncer. Estas composiciones también son eficaces como adyuvantes para mejorar la eficacia de otros agentes anticancerosos. Tales agentes anticancerosos incluyen, de modo no taxativo, fármacos, estimulantes de la función inmunitaria, inhibidores de la función inmunitaria, antígenos, anticuerpos, vacunas, radiación, agentes quimioterapéuticos (solos o en combinaciones apropiadas conocidas por los expertos en la materia), agentes genéticos, diseñados biológicamente y sintetizados químicamente, y agentes que se dirigen a moléculas de muerte celular para su activación o inactivación, agentes que inhiben la proliferación de células cancerosas y que inducen apoptosis en células cancerosas. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC también son eficaces para la prevención o el tratamiento de la mielosupresión (leucopenia, neutropenia,) asociada al tratamiento del cáncer o inducida por el propio cáncer, y para la prevención o tratamiento de diversas anomalías hematopoyéticas y mieloides asociadas con medicamentos o enfermedades, tales como, entre otros, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), síndromes mielodisplásicos, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades renales en etapa terminal o infecciones virales. Se pueden usar combinaciones de dos o más composiciones de la presente invención para optimizar la modulación del sistema inmunitario y para tratar el cáncer. Por ejemplo, una combinación de MpRNC y MvRNC proporcionará una activación óptima de NOD2 y TLR2 para la estimulación inmunitaria y la inducción de citocinas. De manera similar, una combinación de MpRNC y MvRNC proporcionará una actividad anticancerosa y una estimulación inmunitaria óptimas.
Pueden usarse micobacterias para proporcionar una composición de MRNC que comprenda ARN micobacteriano en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos, paredes celulares micobacterianas y un portador o vehículo farmacéutico. En otra realización, las composiciones de MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC comprendenARN de Mycobacterium phlei, ARN deBCG de Mycobacterium bovis, ARN deMycobacterium smegmatis, ARN dedeMycobacterium aviumsubespecie paratuberculosis o ARN de Mycobacterium vaccae respectivamente, en forma de oligorribonucleóticos y polirribonucleótidos, en combinación con paredes celulares de estas especies, y un portador, excipiente o vehículo farmacéutico.
En una realización, las composiciones de MRNC, MpRNC MbRNC, MsRNC o MvRNC se formulan con un sistema de administración farmacéutica tal como, de modo no taxativo, nanopartículas de quitosano o liposomas catiónicos.
Cada una de estas composiciones, MRNAC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden combinarse con un portador aceptable, tal como un portador, excipiente, vehículo u otro sistema de administración farmacéuticamente aceptable conocido por los expertos en la materia para formar una composición. que puede administrarse a un animal o un ser humano. Cada una de estas composiciones, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden combinarse con cantidades seleccionadas de células bacterianas intactas, células micobacterianas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovisBCG,Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis o Mycobacterium vaccae, respectivamente, para formar una composición que pueda administrarse a un animal o un ser humano.
MRNAC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son eficaces para inducir a las células sensibles del sistema inmunitario a producir citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides, y para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en células sensibles, incluidas, entre otras, las células cancerosas, en un animal.
Se pueden usar especies eubacterianas incluidas, entre otras, especies de Coryneform, especies de Corynebacterium, especies de Rhodococcus, especies de Bordetella, especies de Escherichia, especies de Listeria, especies de Nocardia y especies micobacterianas para producir BRNC o MRNC. Las especies micobacterianas que incluyen, de modo no taxativo, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansaii, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium aviumy subespecies asociadas y Mycobacterium phleipueden usarse para producir MRNC. En otra realización más, las especies micobacterianas Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovisBCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis o Mycobacterium vaccaese utilizan para preparar MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC o MvRNC. En aun otra realización, se pueden usar especies arquebacterianas para preparar BRNC.
Método para fabricar composiciones que contienen ARN de pared celular micobacteriana (MRNC)
En esta solicitud, se describe un procedimiento para fabricar composiciones de ARN de pared celular micobacteriana a partir de cualquier especie micobacteriana. Los listados completos de especies micobacterianas, complejos micobacterianos, subespecies micobacterianas y cepas micobacterianas que pueden usarse para preparar a Rn de pared celular micobacteriana usando el procedimiento de la presente invención se mantienen y están fácilmente disponibles en, por ejemplo, el NCBI de los EE. UU (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Aunque la presente invención proporciona procedimientos para la preparación de MRNC a partir de todas las especies y cepas micobacterianas, las especies y cepas micobacterianas preferidas son aquellas que se sabe que crecen rápidamente en cultivo y, por lo tanto, son capaces de proporcionar biomasa de células micobacterianas en cortos períodos de tiempo. También se prefieren aquellas especies y cepas micobacterianas que se sabe que crecen rápidamente y además no son patógenas para los individuos inmunocompetentes.
BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son relativamente económicas de preparar, su actividad es reproducible entre preparaciones y permanece estable a lo largo del tiempo, y no están contaminadas por materiales exógenos, incluidas, entre otros, proteínas, enzimas, productos bioquímicos o productos químicos utilizados por los expertos en la materia para preparar composiciones de pared celular micobacteriana. Además, las preparaciones de b RnC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son mínimamente, si acaso, tóxicas para el receptor.
Para preparar BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, se cultivan especies bacterianas, especies micobacterianas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae respectivamente, en un medio líquido optimizado, con un contenido de carbono, nitrógeno y hierro optimizado que asegura la completa utilización de las fuentes de carbono y se extraen. Los aminoácidos proporcionan una fuente de nitrógeno. Los aminoácidos dibásicos que incluyen, de modo no taxativo, asparagina son fuentes preferidas de nitrógeno. Otras fuentes de nitrógeno incluyen sales de amonio o su equivalente. Fuentes adicionales de hierro son las sales inorgánicas o las sales orgánicas, que incluyen, de modo no taxativo, el citrato, que proporcionan fuentes adicionales de carbono. Los complejos de hierro, que incluyen, de modo no taxativo, el citrato de amonio férrico (citrato férrico de amonio), proporcionan fuentes adicionales de hierro, nitrógeno y carbono. Las concentraciones preferidas de carbono (como glucosa u otra fuente de carbono disponible metabólicamente) son 500-2500 mMol/litro. En diferentes realizaciones, las proporciones de C a N son de aproximadamente 1:0.0095 a 1:0.06, de aproximadamente 1:0.02 a 1:0.06, o de o aproximadamente 1:0.06. En diferentes realizaciones, las proporciones de C a Fe son de o aproximadamente 1:1.8 x 10-4 a 1:3.2 x 10-3; de o aproximadamente 1:1.8 x 10-3 a 2,7 x 10-4; o de o aproximadamente 1:2.7 x 10-4. Se puede utilizar cualquier fuente aceptable de carbono, nitrógeno o hierro conocida por los expertos en la materia. Tales medios también pueden contener sales adicionales así como vitaminas, y cabe esperar que la presencia y concentraciones de estos se ajusten según las necesidades particulares.
Las bacterias o micobacterias se alteran para liberar ARN y asegurar la extracción controlada de bacterias intactas, micobacterias, células de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae. La alteración se produce mediante el uso de un procedimiento de homogeneización a alta presión seguido de un procedimiento de centrifugación. La fuerza centrífuga relativa baja elimina las bacterias o micobacterias intactas. El Ar N de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se puede extraer en esta etapa usando tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo o procedimientos similares conocidos por los expertos en la materia. Alternativamente, se pueden usar fuerzas centrífugas relativas elevadas para aislar BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC formulados con paredes celulares bacterianas, micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovisBCG,Mycobacterium smegmatis,Mycobacterium vacuberium después de la alteración celular bacteriana o micobacteriana. Es importante destacar que se utilizan nucleasas y reactivos libres de DNasa/RNasa (actividad endo y exonucleasa) y el procedimiento se lleva a cabo a o aproximadamente a 4 ° C para minimizar la degradación del ARN durante las etapas de preparación.
Las secuencias de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos, la longitud de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos y las estructuras de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos (tales como, entre otras, moléculas monocatenarias, moléculas bicatenarias, híbridos que contienen cadenas simples y dobles o estructuras de apareamiento de bases de intraoligorribonucleótidos y polirribonucleótidos) de ARN bacteriano son necesarias para la actividad biológica de BRNC. Más específicamente, las secuencias de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos, la longitud de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos y las estructuras de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos (tales como, entre otras, moléculas monocatenarias, moléculas bicatenarias, híbridos que contienen cadenas simples y dobles o estructuras de apareamiento de bases de intraoligorribonucleótidos y polirribonucleótidos) de ARN micobacteriano son necesarias para la actividad biológica de las MRNC. El uso de paredes celulares bacterianas, micobacterianas oMycobacterium phlei, Mycobacterium bovisBCG, Mycobacterium. smegmatis, Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis o Mycobacterium vaccaepara formular BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC dan como resultado un sistema de transporte y administración biológico que es importante para maximizar la actividad biológica (estimulación inmunitaria y actividad anticancerosa) de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC.
Procedimientos para preparar MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC que contienen diferentes cantidades de células bacterianas o micobacterianas intactas
La presente invención proporciona además un procedimiento para fabricar MRNC a partir de cualquier especie micobacteriana. Los listados completos de especies micobacterianas, complejos micobacterianos, subespecies micobacterianas y cepas micobacterianas que pueden usarse para preparar RNC de pared celular micobacteriana usando el procedimiento de la presente invención son mantenidos y están fácilmente disponibles en, por ejemplo, el NCBI de los EE. UU. (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Las especies micobacterianas preferidas son aquellas que se sabe que crecen rápidamente en cultivo y, por lo tanto, son capaces de proporcionar biomasa micobacteriana en cortos períodos de tiempo. También se prefieren las especies que se sabe que crecen rápidamente y que se reconoce que no son patógenas para los individuos inmunocompetentes.
En una realización, la cantidad de células bacterianas intactas presentes en MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC puede controlarse mediante el uso apropiado de una alta presión definida durante la homogeneización y junto con un número definido de ciclos de homogeneización que son usados en la preparación de formulaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC que contienen paredes celulares micobacterianas o paredes celulares de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae. Los inventores han descubierto inesperadamente que variar la cantidad de células bacterianas intactas presentes en MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC puede afectar la actividad inmunoestimuladora y anticancerosa de estas composiciones de manera de lograr la modulación inmunitaria deseada y óptima o la actividad anticancerosa deseada y óptima.
En una realización, la cantidad de células micobacterianas intactas en las formulaciones de pared celular micobacteriana, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden reducirse 20 veces en comparación con una muestra equivalente de micobacterias que no se ha sometido a un tratamiento de homogeneización a alta presión y centrifugación a baja velocidad. En otra realización, la cantidad de células micobacterianas intactas en MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se puede reducir al menos 30 veces en comparación con una muestra equivalente de micobacterias,Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatium aviumsubespecie.paratuberculosisoMycobacterium vaccae que no ha sufrido una homogeneización a alta presión, centrifugación a baja velocidad seguida de un tratamiento adicional de homogeneización a alta presión de la preparación de células bacterianas. En una realización adicional, la cantidad decélulasintactas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecieparatuberculosisoMycobacterium vaccaeenMRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se puede comparar al menos en 35 veces a una muestra equivalente de las micobacterias que no se ha sometido a una homogeneización a alta presión, centrifugación a baja velocidad seguida de un tratamiento adicional de homogeneización a alta presión de la preparación celular micobacteriana o de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisoMycobacterium vaccae.
En una realización, se pueden preparar composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC que contienen altos niveles de contenido de células micobacterianas intactas o Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis or Mycobacterium vaccae respectivamente (por ejemplo, más que aproximadamente 1-50 % p/p). Tales técnicas incluyen, por ejemplo, cuatro ciclos de homogeneización a alta presión, donde dos de los cuatro ciclos de homogeneización a alta presión se llevan a cabo antes de una etapa de centrifugación a alta velocidad, y dos de las etapas de homogeneización a alta presión se llevan a cabo después de la etapa de centrifugación.
En otra realización, se pueden preparar preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC que contienen niveles intermedios de contenido celular micobacteriano intacto, contenido celular de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae, respectivamente (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,9 % p/p). Tales técnicas incluyen, por ejemplo, siete ciclos de homogeneización a alta presión, donde cinco de los siete ciclos de homogeneización a alta presión se llevan a cabo antes de una etapa de centrifugación a alta velocidad, y dos de las etapas de homogeneización a alta presión se llevan a cabo después de la etapa de centrifugación.
En otra realización, se pueden preparar preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC que contienen niveles ultrabajos de contenido celular micobacteriano intacto, contenido celular de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,2 % p/p). Tales técnicas incluyen, por ejemplo, diez ciclos de homogeneización a alta presión, donde cinco de los diez ciclos de homogeneización a alta presión se llevan a cabo antes de una etapa de centrifugación a alta velocidad, tres ciclos de homogeneización a alta presión se llevan a cabo después de la centrifugación a baja presión y dos de las etapas de homogeneización a alta presión se llevan a cabo después de la etapa de centrifugación a alta velocidad.
En las técnicas anteriores, «homogeneización a alta presión» significa un ciclo de homogeneización a alta presión suficiente para provocar la ruptura eficaz de micobacterias, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae de tal forma de obtener composiciones de fragmentos de pared celular que contienen ARN. También se pueden usar otros procedimientos que son comparables a la homogeneización a alta presión tales como, de modo no taxativo, microfluidización. Debe entenderse que un experto en la materia de la alteración de células bacterianas y micobacterianas, después de leer la presente invención, puede determinar fácilmente la presión óptima para la especie, cepa, subcepa o complejo micobacteriano específico que se alterará.
Tal como se define en esta solicitud, la centrifugación a baja velocidad se refiere a una fuerza centrífuga relativa (RCF) suficiente para sedimentar bacterias, micobacterias, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae no alteradas.Debe entenderse que un experto en la técnica de la centrifugación, después de leer la presente invención, puede determinar fácilmente la RCF óptima para la sedimentación de cualquier bacteria o micobacteria intacta que quede después de la alteración celular como se describió anteriormente.
La centrifugación a alta velocidad, tal como se define en esta solicitud, se refiere a una fuerza centrífuga relativa suficiente para sedimentar las paredes celulares bacterianas, micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae. Cabe esperar que un experto en la materia de la centrifugación, después de leer la presente invención, pueda determinar fácilmente la fuerza centrífuga relativa óptima para la sedimentación de las paredes celulares de la bacteria o micobacteria después de la alteración y extracción de la cantidad deseada de bacterias y micobacterias intactas mediante centrifugación a baja velocidad como se describe anteriormente.
El uso de las técnicas de homogeneización a alta presión anteriores se puede usar para preparar MRNC que contiene diferentes niveles de micobacterias intactas (por ejemplo, alta, intermedia o baja) mediante el uso apropiado de presiones de homogeneización a alta presión, centrifugación a baja velocidad y alta velocidad, o combinaciones de las mismas. Además, las técnicas de homogeneización a alta presión descritas se han usado para preparar MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC que contienen niveles altos, bajos o intermedios de micobacterias, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovisBCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis oMycobacterium vaccae, respectivamente.
] En una realización, las preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, preparadas mediante los procedimientos de homogeneización a alta presión descritos anteriormente, contienen una cantidad reducida de células micobacterianas intactas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae, respectivamente, en comparación con preparaciones micobacterianas que se han sometido a centrifugación diferencial para extraer células micobacterianas intactas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae de la preparación (es decir, sin tratamiento de homogeneización a alta presión). En una realización, el porcentaje de células micobacterianas intactas, células de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae para la preparación de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC (p/p), respectivamente, es menor que aproximadamente 50 % p/p, menor que aproximadamente 40 % p/p, menor que aproximadamente 30 % p/p, menor que aproximadamente 20 % p/p, menor que aproximadamente 10 % p/p, menor que aproximadamente 5 % p/p, menor que aproximadamente 1 % p/p, o menor que aproximadamente 0,5 % p/p.
En otra realización, las preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se someten a un procedimiento de tratamiento con calor tal como, de modo no taxativo, por ejemplo, calentar a 95 ° C durante 5-30 min o, por ejemplo, calentar a 121 ° C durante 5-30 min, que es suficiente para inactivar cualquier micobacteria intacta, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae que quede en la composición.
En otra realización, el tratamiento con calor (por ejemplo 121 ° C, 5-30 min u otras condiciones conocidas por los expertos en la materia) de preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se usa para generar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos en el intervalo de aproximadamente 2 a 150, de aproximadamente 10 a 100, o de aproximadamente 20 a 40 bases de longitud.
En una realización, un procedimiento para preparar MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC comprende alterar una biomasa de células micobacterianas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae tpara preparar paredes celulares de las mismas y oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos asociados, que separan células intactas no alteradas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae; y separar los contenidos solubles citosólicos de la porción de las células alteradas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis or Mycobacterium vaccae de las paredes celulares y oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos para obtener un RNC de pared celular bacteriana, micobacteriana, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae (BRNC, Mr Nc , MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC).
En otra realización, un procedimiento para preparar preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC comprende alterar la biomasa de células micobacterianas para liberar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos; separar los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de las células intactas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae; repetir las etapas para controlar la cantidad de células intactas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae; y a continuación calentar los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos a una temperatura suficiente para obtener una longitud de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de aproximadamente 20 a 40 bases nucleotídicas.
Contenido de ácido nucleico de las composiciones
El contenido de ácido nucleico de estas composiciones, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, es de aproximadamente 500 a 50000 ng/mg, de aproximadamente 500 a 5000 ng/mg o de aproximadamente 500 a 3000 ng/mg. En diferentes realizaciones, la longitud de los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos extraídos de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC es de 2 a 150 bases de longitud. En diferentes realizaciones, la longitud de los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos extraídos de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC es de 10 a 50 bases de longitud, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 bases de longitud. En diferentes realizaciones, la longitud de los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos extraídos de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC es menor que 150 bases, o menor que 100 bases.
Será evidente para un experto en la materia que los procedimientos anteriores pueden modificarse de modo que se incluyan otras etapas, siempre que no afecten negativamente la calidad y la recuperación general de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC. .
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC aumentan su eficacia terapéutica tras la homogeneización a alta presión y la centrifugación a baja velocidad, porque el procedimiento de homogeneización a alta presión reduce la longitud de las moléculas de ARN extraídas al generar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos, y elimina células intactas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae de la preparación respectiva. Pueden lograrse fácilmente reducciones adicionales en la longitud de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos mediante el uso, de modo no taxativo, de tratamiento con calor (por ejemplo, mediante tratamiento con calor a 121 °C durante 30 min) o mediante el uso apropiado de endonucleasas restringidas de secuencia de bases. Los inventores han descubierto inesperadamente que las preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se reducen significativamente en su capacidad para actuar como estimulantes inmunitarios o agentes anticancerosos después del tratamiento con RNasa, que digiere el ARN. En consecuencia, las preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC tienen una eficacia terapéutica limitada tras el tratamiento con RNasa o la exposición inadvertida a ribonucleasas, a menos que el ARN esté protegido mediante el uso de formulaciones y sistemas de transporte que restrinjan el acceso del ARN a la acción degradante de RNasa (endo o exo) o nucleasas.
Actividad inmunoestimuladora y anticancerosa de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC
Se encontró que la reducción en la cantidad total de células intactas micobacterianas, de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis o Mycobacterium vaccae presentes en las preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC tiene un efecto significativo en la actividad inmunoestimuladora medida por ensayos de inducción de citocinas. También se encontró que una reducción en la cantidad total de células micobacterianas intactas presentes en MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC tiene un efecto positivo significativo sobre la actividad inmunoestimuladora, como el aumento de la inducción de IL-10 e IL-12p40 en células mononucleares sanguíneas periféricas. Además, sedescubrió queuna reducción en la cantidad total de células intactas micobacterianas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisoMycobacterium vaccaepresentes en las preparaciones anteriores tiene un efecto positivo que mejora la actividad anticancerosa de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC medido por la inhibición de la proliferación de células cancerosas.
En una realización, la actividad inmunoestimuladora de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC sobre factores de crecimiento hematopoyéticos y mieloides en un animal o ser humano puede medirse usando ensayos de inducción de citocinas. En otra realización, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC inducen la actividad inmunoestimuladora de las citocinas, incluso, de modo no taxativo, IL-10 e IL-12.
En una realización adicional, las composiciones terapéuticas que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC poseen actividad anticancerosa. En una realización, la actividad anticancerosa de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC C puede determinarse usando ensayos de proliferación de células cancerosas conocidos por los expertos en la materia. Los expertos en la materia saben que el uso de tales ensayos para identificar la actividad anticancerosa es predictivo de/aactividad anticancerosa in vivo .
La administración de composiciones que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en un entorno profiláctico o terapéutico no es en sí misma un procedimiento de inmunización. Es un tratamiento profiláctico o terapéutico que estimula una respuesta en las células sensibles del sistema inmunitario y que inhibe la proliferación e induce la apoptosis en las células sensibles tales como, de modo no taxativo, las células cancerosas. Este tratamiento profiláctico o terapéutico es útil para prevenir, tratar, reducir o extraer una enfermedad que incluye, de modo no taxativo, el cáncer.
Sin embargo, se debe reconocer que la administración de preparaciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC provocará una respuesta inmunitaria contra los componentes de la pared celular micobacteriana cuando se use en la formulación, que es adicionalmente mejorada por la actividad estimuladora inmunitaria de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC (efecto adyuvante inmunitario). Los expertos en la materia reconocerán que tal respuesta será eficaz en el tratamiento de infecciones micobacterianas oportunistas o patógenas cuando se prepare el MRNC a partir de ellas. Específicamente, existe la necesidad de un tratamiento que sea capaz de reducir la inflamación y la morbilidad asociadas con, de modo no taxativo, tuberculosis, enfermedad de Johne o enfermedad de Crohn. Más específicamente, el uso de composiciones que comprenden MapRNC con actividad inmunoestimuladora optimizada y antígeno de vacuna y adyuvante de vacuna puede usarse con ventaja para prevenir o tratar infecciones por MAP en ganado y seres humanos. Las composiciones que comprenden RNC de más de una especie micobacteriana que contienen antígenos que reaccionan de forma cruzada con los de MAP pueden usarse para dar lugar a una respuesta protectora que dé como resultado el control de la infección por MAP.
Los efectos terapéuticos de las composiciones que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC incluyen, de modo no taxativo, la estimulación de células sensibles del sistema inmunitario para producir citocinas, que puede dar como resultado la activación de células del sistema inmunitario y subsiguiente citólisis, o activación de caspasas y apoptosis, en células sensibles. La citólisis y la apoptosis, tanto individualmente como en combinación, tienen actividad anticancerosa y actividad adyuvante. Es decir, las composiciones terapéuticas que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC y MvRNC pueden administrarse solas como un agente anticanceroso y las composiciones que comprenden MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden administrarse antes, al mismo tiempo, o después de otro agente anticanceroso para aumentar la eficacia del tratamiento.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son agentes profilácticos y terapéuticos eficaces para prevenir, tratar, disminuir el impacto y extraer una variedad de enfermedades que incluyen, de modo no taxativo, enfermedades malignas, autoinmunitarias y de inmunodeficiencia, mielosupresión y anomalías hematopoyéticas y mieloides. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC también son eficaces como adyuvantes para mejorar la eficacia de otros agentes. Tales agentes anticancerosos incluyen, de modo no taxativo, fármacos, estimulantes inmunitarios, antígenos, anticuerpos, vacunas, radiación, agentes quimioterapéuticos, agentes genéticos, genéticamente modificados y sintetizados químicamente, y agentes que se dirigen a moléculas de muerte celular para activación o inactivación, que inhiben la proliferación y que inducen apoptosis en células cancerosas.
En cada uno de los aspectos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, también se contemplan específicamente en esta solicitud adyuvantes de combinación o terapias distintas de las descritas anteriormente. En una realización, las composiciones de la presente invención pueden administrarse con uno o más de los agentes quimioterapéuticos disponibles actualmente conocidos por un experto en la materia.
En otra realización, las composiciones de la presente invención pueden administrarse con uno o más antibióticos, antifungicidas, agentes antivirales, agentes antiparasitarios, fármacos o agentes antiinflamatorios o inmunoestimuladores conocidos por un experto en la materia.
En aun otra realización, las composiciones de la presente invención pueden administrarse con uno o más fármacos o agentes conocidos por un experto en la materia para la prevención o el tratamiento de la mielosupresión o anomalías hematopoyéticas y mieloides.
Las composiciones de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de sujetos animales o pacientes, y más preferentemente, mamíferos, incluidos humanos, así como mamíferos tales como primates, perros, gatos, caballos, ganado vacuno, porcinos, roedores y peces.
Portadores farmacéuticamente aceptables y procedimientos de administración de las composiciones
La composición de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se puede formular, preparar o administrar fácilmente con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales preparaciones pueden prepararse mediante diversas técnicas. Tales técnicas incluyen asociar la composición de Mr Nc , MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC y su portador. En una realización, las composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se preparan asociando de manera uniforme e íntima las composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC con portadores líquidos, con portadores sólidos o con ambos. Los portadores líquidos incluyen, de modo no taxativo, formulaciones acuosas, formulaciones no acuosas o ambas. Los portadores sólidos incluyen, de modo no taxativo, portadores biológicos, portadores químicos o ambos.
Las composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden administrarse en una suspensión acuosa, una emulsión de aceite, una emulsión de agua en aceite y una emulsión de agua en aceite en agua, y en portadores que incluyen, de modo no taxativo, cremas, geles, liposomas (neutrales, aniónicos o catiónicos), nanoesferas o microesferas de lípidos, nanopartículas o micropartículas poliméricas neutras, aniónicas o catiónicas, emulsiones de sitio específico, emulsiones de larga residencia, emulsiones pegajosas, microemulsiones, nanoemulsiones, microesferas, nanoesferas, nanopartículas y minibombas, y con varios polímeros naturales o sintéticos que permiten la liberación mantenida de la composición, incluidos polisacáridos aniónicos, neutros o catiónicos y polímeros o copolímeros aniónicos, catiónicos neutros, implantando las minibombas o polímeros en las proximidades de donde se requiere la entrega de la composición. Los polímeros y su uso se describen, por ejemplo, enBrem y col. (Journal of Neurosurgery 1991, 74:441-446). Además, Mr NC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se pueden usar con cualquiera o con cualquier combinación de portadores. Estos incluyen, de modo no taxativo, antioxidantes, tampones y agentes bacteriostáticos, y pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.
En una realización, las composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC o preparaciones a base de portadores se administran como una suspensión acuosa libre de RNasa. Para la administración como una suspensión acuosa, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se suspenden en un excipiente, tampón o portador farmacéuticamente aceptable libre de RNasa y nucleasa que incluye, de modo no taxativo, agua para inyección, solución salina fisiológica o soluciones de dextrosa, o mediante técnicas que incluyen, de modo no taxativo, homogeneización a alta presión, sonicación y microfluidización, y pueden procesarse asépticamente o esterilizarse terminalmente. En otro ejemplo, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsrNc , MapRNC y MvRNC liofilizados (criodesecados) se pueden almacenar en ampollas o viales sellados que solo requieren la adición de un excipiente, tampón o portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua esterilizada libre de RNasa y nucleasa, inmediatamente antes de su uso.
Para la administración en un portador no acuoso, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden emulsionarse con un aceite mineral o con un aceite neutro como, entre otros, un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un lípido, un aceite y mezclas de los mismos, donde el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poliinsaturados y saturados. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, aceite de soja, aceite de canola, aceite de palma, aceite de oliva y migliol, donde el número de carbonos de ácidos grasos está entre 12 y 22 y donde los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Opcionalmente, el lípido o fosfolípido cargado puede suspenderse en el aceite neutro. Más específicamente, se puede utilizar fosfatidilserina, que se dirige a los receptores de los macrófagos. Se puede hacer uso de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNc y MvRNC formuladas en medios acuosos o de Mr NC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC liofilizadas en polvo para preparar emulsiones usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Por tanto, la invención proporciona composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. El portador, diluyente y/o excipiente deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y no ser perjudiciales para su receptor.
Las composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se administran en una cantidad eficaz para inducir una respuesta terapéutica en un animal, incluido un ser humano. La dosificación de la composición de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsrNc , MapRNC y MvRNC administrada dependerá de la afección que se esté tratando, la formulación particular y otros factores clínicos tales como el peso y el estado del receptor y la vía de administración. En una realización, la cantidad de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC administradas es de aproximadamente 0,00001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dosis. En otra realización, la cantidad de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC administradas es de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg por dosis. En una realización adicional, la cantidad de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC administradas es de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por dosis. En otra realización, la cantidad de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC administradas es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg por dosis. En una realización adicional, la cantidad de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC administradas es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg por dosis.
Las dosificaciones útiles de los compuestos de la presente invención pueden determinarse al comparar su actividad in vitro e in vivo en modelos animales. Los procedimientos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones, y otros animales, a seres humanos son conocidos en la materia, por ejemplo, véase la patente de los EE.UU. núm.
4.938.949.
Los modos de administración de las composiciones usadas en la invención se ejemplifican a continuación. Sin embargo, las composiciones pueden administrarse por cualquiera de una variedad de vías que incluyen: por inyección (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal), por infusión intravenosa continua, por vía cutánea, dérmica, transdérmica, oral (por ejemplo, tableta , píldora, medicamento líquido, tira de película comestible), mediante bombas osmóticas implantadas, mediante supositorios o aerosol. Las vías de administración incluyen, de modo no taxativo, tópica, intradérmica, intratecal, intralesional, intratumoral, intravejiga, intravaginal, intraocular, intrarrectal, intrapulmonar, intraespinal, dérmica, subdérmica, intraarticular, colocación dentro de las cavidades del cuerpo, inhalación nasal, inhalación pulmonar, impresión en la piel y electroporación.
En función de la vía de administración, el volumen de una composición que comprende MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en un portador aceptable, por dosis, es aproximadamente 0,001 ml a aproximadamente 100 ml.
En una modalidad, el volumen de una composición que comprende MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en un portador aceptable, por dosis, es aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 50 ml. En otra modalidad, el volumen de una composición que comprende MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en un portador aceptable, por dosis, es aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 30 ml. Una composición que comprende MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en un portador aceptable puede administrarse en un tratamiento de dosis única o en tratamientos de dosis múltiples, en un programa o durante un período de tiempo apropiado para la enfermedad que se está tratando, el estado del receptor y vía de administración. La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una dosis única o en dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, de dos, tres, cuatro o más subdosis al día. Las subdosis en sí mismas pueden dividirse además en, por ejemplo, una cantidad de administraciones discretas espaciadas holgadamente.
Composiciones para uso para activar los receptores del sistema inmunitario
La presente invención proporciona composiciones para uso para activar los receptores del sistema inmunitario que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC y un portador farmacéuticamente aceptable. Los receptores del sistema inmunitario que pueden activarse mediante la presente invención son (de modo no taxativo) el dominio de oligomerización de unión a nucleótidos 2 (NOD2), un receptor de reconocimiento de estándares (PRR) responsable de detectar la molécula de patrón molecular asociado a patógenos (PAMP), dipéptido de muramilo, el componente estructural mínimo del peptidoglicano bacteriano con actividad inmunoestimuladora, y el receptor tipo Toll 2 (TLR2), un receptor de reconocimiento de estándares (PRR) responsable de detectar una amplia gama de moléculas de estándares moleculares asociados a patógenos (PAMP) como el peptidoglicano, lipomanano (LM), lipoarabinomanano (LAM) y lipoproteínas y lipopéptidos que contienen una cisteína o cisteínas N-terminal derivadas de (ácido palmítico)n. Los expertos en la materia saben que la activación de estos dos receptores del sistema inmunitario da como resultado la generación de actividad anticancerosa y antiinfecciosa (incluidas, de modo no taxativo, infecciones bacterianas, fúngicas y virales), así como una estimulación. de la actividad adyuvante de la vacuna y la diferenciación de CD14 de médula ósea humana+ células. La capacidad de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC para funcionar como agonistas de ambos receptores proporciona una necesidad insatisfecha y además proporciona ventajas significativas sobre los agonistas monofuncionales de NOD2 o TLR2 que se usan como agentes terapéuticos en los campos de la oncología, enfermedades infecciosas o vacunas.
Composiciones según se reivindica para su uso en el tratamiento de enfermedades que incluyen el cáncer y trastornos del sistema inmunitario
En esta solicitud, se describen composiciones para su uso para el tratamiento del cáncer que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, los procedimientos y composiciones son útiles en el tratamiento terapéutico del cáncer y enfermedades o trastornos del sistema inmunitario. En otra realización más, algunos cánceres se pueden prevenir mediante la administración oportuna de las composiciones como profiláctico, antes de la aparición de síntomas o signos, o antes de la aparición de síntomas o signos graves de una enfermedad cancerosa. Por tanto, un paciente en riesgo de una enfermedad cancerosa particular puede tratarse con una o más de las composiciones de la presente invención como medida de precaución.
En otro aspecto más, la presente divulgación está dirigida a aliviar o mejorar el cáncer o el desarrollo de tumores, metástasis, proliferación celular en células cancerosas, y/o inhibición de los síntomas asociados con una o más de las enfermedades cancerosas identificadas anteriormente y/o indicaciones de cáncer en un sujeto que padece una o más de las enfermedades de cáncer identificadas anteriormente o indicación de cáncer. Esto comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en un portador farmacéuticamente aceptable. La MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se pueden administrar con un portador farmacéuticamente aceptable, ya sea solo o en combinación con uno o más compuestos antiinflamatorios, agentes inmunoestimuladores o agentes anticancerosos, en los que la MRNC, MpRNC , MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC es suficiente para inhibir el desarrollo de cáncer o tumor, metástasis, y/o proliferación celular en células cancerosas.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son eficaces como agentes terapéuticos para tratar, mitigar o extraer una enfermedad que incluye, de modo no taxativo, un cáncer. Los cánceres incluyen, de modo no taxativo, cánceres primarios o metastásicos, carcinoma de células escamosas, fibrosarcoma, carcinoma sarcoide, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, osteosarcoma, melanoma cutáneo, carcinoma de células basales, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de uretra, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de próstata, leucemia, linfoma y metástasis derivadas de los mismos.
En un aspecto, las enfermedades cancerosas y los trastornos cancerosos que pueden tratarse usando las composiciones de MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC de la presente invención incluyen, por ejemplo, de modo no taxativo, cánceres asociados al SIDA, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cánceres de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos, tumores cerebrales pediátricos, cáncer de mama, cáncer de mama masculino, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio y otros cánceres uterinos, cáncer de esófago, cánceres de vesícula biliar y vías biliares, cáncer gástrico (estómago), cánceres de cabeza y cuello, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, metástasis hepáticas, cáncer de pulmón, linfomas, adenocarcinoma mamario, melanoma, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cánceres pediátricos, tumores pituitarios, cáncer de próstata , trastornos hematológicos, sarcoma, tumores sólidos, retinoblastoma, cáncer de piel, sarcoma de tejidos blandos, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cánceres de útero, tumor de Wilms, cáncer de bronquio, cáncer de colon y recto, cáncer urinario, linfoma no Hodgkin, melanomas de la piel, cáncer de riñón y renal, cáncer de pelvis, cáncer de páncreas, cáncer de cavidad oral y cáncer de faringe, cáncer de esófago, de estómago, cáncer de vías biliares intrahepáticas, cáncer de laringe , leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, cáncer de tejidos blandos, incluido el corazón, GIST (tumores estromales gastrointestinales), cáncer de intestino delgado, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, cáncer de ano y canal anal, cáncer anorrectal, cáncer de vulva, cáncer de pleura, mesotelioma maligno, cáncer de huesos y articulaciones, cáncer de hipofaringe, cáncer de ojo y órbita, cáncer de nariz y cavidad nasal, cáncer de oído medio, cáncer de nasofaringe, cáncer ureteral, cáncer de peritoneo, cáncer de epiplón y mesenterio, y tumores carcinoides gastrointestinales o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más, las enfermedades cancerosas y los trastornos cancerosos que pueden tratarse usando la presente invención incluyen, de modo no taxativo, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de ovario, osteosarcoma, carcinoma hepatocelular, linfoma de Burkitt, linfomas de derrame primario, linfadenopatía angioinmunoblástica, linfoma relacionado con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), linfomas de células T, leucoplaquia pilosa oral, enfermedad linfoproliferativa, carcinoma linfoepitelial, linfoma de cavidades corporales o linfomas de células B, carcinoma no queratinizante, carcinoma nasofaríngeo de células escamosas, tumores epiteliales asociados al trasplante de riñón, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, hiperplasia angiolinfoide, neoplasia prostática, retinoblastoma, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de Gardner, síndrome de Werner, síndrome de carcinoma nervoide de células basales, neurofibromatosplasia cervical tipo 1, macroglobulinemia primaria, insulinoma, micosis fungoide, sarcoma osteogénico, lesiones cutáneas premalignas (tópicas), rabdomiosarcoma, osteogénico, policitemia vera, trombocitosis esencial o cualquier combinación de los mismos. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden usarse como agentes antiinfecciosos. La invención también es útil para proteger a los animales tras la exposición a materiales patógenos, tales como virus y bacterias. La presente invención es útil para regular la hematopoyesis de mamíferos o para inducir la recuperación hematopoyética y mieloide (leucopenia, neutropenia, trombocitopenia o anemia) en animales con cáncer que se recuperan de irradiación, cirugía o tratamiento quimioterapéutico. La presente invención es útil para la prevención o el tratamiento de diversas anomalías hematopoyéticas y mieloides asociadas con medicamentos o enfermedades, tales como, entre otros, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), síndromes mielodisplásicos, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades renales en etapa terminal o infecciones virales.
En esta solicitud, se describe el tratamiento o la remisión de trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias e infecciosas. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se pueden usar para tratar una amplia variedad de infecciones causadas por virus, bacterias, micobacterias (como, entre otras, Mycobacterium tuberculosisoMycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis)u organismos intracelulares que incluyen, de modo no taxativo, infección por virus del herpes como rinoneumonitis equina, rinotraqueítis infecciosa bovina, endometritis, herpes simple, herpes zóster, herpes ocular, rinotraqueítis viral felina y un virus del herpes que infecta las vías respiratorias de los gatos. La composición aquí descrita también es eficaz en el tratamiento de infecciones por parvovirus de perros jóvenes. Las composiciones aquí descritas son eficaces como agente terapéutico para las infecciones por herpes genital y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida de seres humanos, así como para otras infecciones virales de animales y seres humanos. Por ejemplo, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC pueden usarse para tratar infecciones virales, bacterianas, protozoarias y fúngicas, como, de modo no taxativo, el virus del herpes equino, el virus de la influenza equina, elherpes simple, lasespecies de estreptococos como, de modo no taxativo, Streptococcus zooepidemicus, E. coliyLlama Babesia
Se proporcionan los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1
Cultivo de micobacterias en medio sintético
La preparación de composiciones de pared celular micobacteriana como se reseña en la patente de los EE. UU. núm.
4.744.984 y la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357 especificaron el uso de caldo BACTO™ AC (Difco Labs, ahora Becton Dickenson) para la preparación de masa celular micobacteriana. Este caldo contiene proteosa peptona núm.
3, extracto de carne, extracto de levadura y extracto de malta (Difco ™ & BBL ™ Manual of Microbiological Culture Media, segunda edición, 2009, págs. 35-36). Además, las reservas de inóculos deMycobacterium phlei usadas como ejemplo en estas patentes se almacenaron en leche bovina antes de la generación de biomasa. Las patentes antes mencionadas también reseñan que el cultivo es estático y que los cultivos micobacterianos crecen como una película superficial en el medio de cultivo.
Con el fin de extraer el potencial de contaminación de la biomasa micobacteriana por las sustancias mencionadas anteriormente, se desarrolló un medio sintético para el cultivo de micobacterias. El caldo Middlebrook 7H9 es conocido por los expertos en la materia por ser adecuado para el cultivo de cultivos puros de micobacterias, pero requiere la adición de suplementos que contienen material de origen animal (enriquecimiento de Middlebrook a Dc que contiene albúmina de suero bovino y catalasa) y además se beneficia del uso de polisorbato 80 o glicerol (Difco ™ & BBL ™ Manual of Microbiological Culture Media, segunda edición, 2009, págs. 355-356). Sin embargo, se encontró inesperadamente que el crecimiento eficaz de micobacterias se produjo en Middlebrook 7H9 sin el uso de las proteínas exógenas, albúmina bovina o catalasa que se encuentran en el medio de enriquecimiento de ADC de Middlebrook, o del detergente no iónico polisorbato 80. También se encontró inesperadamente que el uso de hierro adicional (como citrato de amonio férrico) y una fuente de carbono y nitrógeno adicional (como, de modo no taxativo, asparagina o citrato de amonio) produjo rendimientos superiores de masa micobacteriana en comparación con el cultivo con caldo Middlebrook 7H9 solamente. El uso de carbono, nitrógeno y hierro adicional en una proporción adecuada se usa para facilitar la actividad metabólica y la división celular mediante la optimización de la proporción de carbono a nitrógeno para la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, así como para mejorar el metabolismo a través de aumento de la disponibilidad de hierro, aumentando así la tasa de división micobacteriana y la masa celular micobacteriana.
Los siguientes resultados sirven para demostrar el impacto de cambiar la proporción de C:N:Fe en el medio de cultivo sobre el crecimiento de Mycobacterium phlei, usada aquí como un ejemplo de una especie micobacteriana representativa. Debe tenerse en cuenta que los hallazgos descritos a continuación pueden replicarse utilizando fuentes alternativas de C, N y Fe, y pueden aplicarse a otras micobacterias.
La composición del caldo Middlebrook 7H9 y ADC está disponible, por ejemplo, en el Difco and BBL Manual of Microbiological Culture Media, 2.a edición, 2009, páginas 355-356. El crecimiento deMycobacterium phleise determinó en los siguientes medios de cultivo desarrollados, que se definen a continuación como composiciones de medios de cultivo micobacterianos (MCMC):
A. Composición de MCMC que contiene Middlebrook 7H9 (BD Canadá, Mississauga, Ontario), glucosa y glicerol. B. Composición de MCMC que contiene glucosa Middlebrook 7H9, glicerol y Fe adicional (como citrato de amonio férrico) y asparagina como fuentes de hierro, carbono y nitrógeno.
C. Composición de MCMC que contiene glucosa, glicerol y que contiene Fe (como citrato de amonio férrico), asparagina y citrato de amonio (dibásico) como fuentes de hierro, carbono y nitrógeno.
D. Composición de MCMC que contiene glucosa, glicerol y Fe (como citrato de amonio férrico), y citrato de amonio (dibásico) como fuentes de hierro, carbono y nitrógeno.
En un estudio independiente, también se determinó el impacto de una composición de MCMC que contenía hierro y asparagina como el estereoisómero L, DL o D usando la Composición C descrita anteriormente.
Para preparar MCMC A y MCMC B, caldo Middlebrook 7H9, se combinaron 9,4 g de medio en polvo Middlebrook 7H9 con los aditivos a excepción de glucosa, combinados con glicerol y aditivos, disueltos en agua (900 mL) y esterilizados mediante esterilización en autoclave de vapor. La glucosa se disolvió en agua y siempre se esterilizó por filtración por separado y se añadió posteriormente para dar un volumen final de 1000 ml. MCMC C y MCMC D no contienen medio en polvo Middlebrook 7H9. La Tabla 1 muestra el contenido molar de C, N y Fe, por litro de medio de cultivo para el caldo Middlebrook 7H9 que contiene glicerol, glucosa y los aditivos descritos anteriormente, así como los dos medios de cultivo que no contienen el caldo Middlebrook 7H9 en polvo.
Tabla 1. n ni N F l m i in i r r r r l m l l mi terianas
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Se obtuvo polvo Middlebrook 7H9 de BD Canadá, Mississauga, Ontario que es conocido por el experto en la materia. La fórmula aproximada para preparar aproximadamente 900 mL de caldo Difco™ Middlebrook 7H9 es como sigue: sulfato de amonio (0,5 g), ácido L-glutámico (0,5 g), citrato de sodio (0,1 g), piridoxina (1,0 mg), biotina (0,5 mg), fosfato disódico (2,5 g), fosfato monopotásico (1,0 g), citrato de amonio férrico (0,04 g), sulfato de magnesio (0,05 g), cloruro de calcio (0,5 mg), sulfato de zinc (1,0 mg), sulfato de cobre (1,0 mg).
Todos los demás reactivos eran de Sigma, Oakville, Ontario. La composición en g/L de los medios de cultivo usados para preparar MCMC-A, MCMC-B, MCMC-C y MCMC-D se muestran a continuación. Sin embargo, debe entenderse que si bien cada número específico enumerado es para una receta de MCMC-A, MCMC-B, MCMC-C y MCMC-D, cada uno de estos números se puede aumentar o disminuir en aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 % para hacer variaciones de los medios de cultivo MCMC-A, MCMC-B, MCMC-C y m Cm C-D, con los cambios correspondientes en las proporciones de C:N y C:Fe.
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MCMC-B
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MCMC-C
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MCMC-C D-asaraina
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MCMC-C L as ara ina
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MCMC-D
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El siguiente procedimiento describe la preparación de masa celular micobacteriana a partir de Mycobacterium phlei, y, por lo tanto, sirve como ejemplo general para la preparación de masa celular micobacteriana a partir de micobacterias en general. Se reconoce que un experto en la materia al leer este ejemplo modificará apropiadamente los procedimientos para abordar las necesidades específicas de especies, complejos y cepas micobacterianas individuales.
Se almacenó Mycobacterium phlei(cepa 110) como colonias en inclinaciones Petriagani a 4 ° C o como una suspensión en Middlebrook 7H9 que contenía glicerol al 20 % a -80 ° C. La determinación de las proporciones óptimas de carbono, nitrógeno y hierro de cultivo se llevó a cabo usando cultivos de inóculos preparados a partir de inclinaciones Petriagani. Las colonias de la inclinación Petriagani se colocaron en 1,2 L del medio M y después de dispersión se cultivaron durante 7 días (250 rpm, 37 °C en un agitador orbital, Lab-Line Instruments, Melrose Park, IL, EE. UU.). Después del ajuste a una DO estandarizada, se agregaron 200 mL a una serie de matraces de cultivo que contenían 1 L de la MCMC respectiva. Se continuó el cultivo (250 rpm, 37 °C en un agitador orbital LAB-Line) y se retiraron los matraces replicados a intervalos durante un período de 10 días. La masa micobacteriana se aisló mediante lavado por centrifugación a baja velocidad, se liofilizó y se determinó el peso seco. Cuando la liofilización no era práctica, se calculó el peso seco de la masa celular húmeda usando el factor de conversión masa celular húmeda/6,81=masa celular seca (se determinó previamente por experimentación que la media ± DE para este factor era 6,81 ± 1,16, n=7). Los resultados de la Tabla 2 muestran el impacto de diferentes proporciones de carbono, nitrógeno y hierro en el MCMC sobre el rendimiento de Mycobacterium phlei, así como el tiempo de rendimiento óptimo en días, y los resultados de la Tabla 3 muestran el impacto del uso de DL racémico -, D- o L -asparagina sobre el rendimiento de la masa celular micobacteriana. Debe entenderse que estos estudios se realizaron en diferentes momentos y que los rendimientos absolutos de masa celular micobacteriana varían de un estudio a otro.
Tabla 2. Im l n ni N F n l r n imi n l m l l r M terium phlei
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Tabla 3. Impacto del estereoisómero de asparagina D, L o una mezcla racémica de DL en el rendimiento deMycobacterium hlei
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Los resultados que se muestran en la Tabla 2 demuestran que aumentar la cantidad de carbono, nitrógeno y hierro disponible da lugar a aumentos en el rendimiento de la masa celular, así como a una disminución del tiempo requerido para obtener el rendimiento máximo. Los resultados también muestran que el uso de, por ejemplo, de modo no taxativo, asparagina o citrato de amonio (es decir, una fuente disponible de nitrógeno, ya sea en forma de molécula orgánica o inorgánica) aumenta el rendimiento. Dos ventajas asociadas con el uso de citrato de amonio en lugar de sulfato de amonio, son el metabolismo relativamente lento de los carbonos de citrato (la sal de un ácido débil, que proporciona una capacidad tamponadora sustancial al medio) y las fluctuaciones reducidas observadas en el pH de el caldo durante el cultivo que son coherentes con la generación de ácido sulfúrico a partir del sulfato no metabolizable (la sal de un ácido fuerte).
Los resultados que se muestran en la Tabla 3 demuestran que el uso de D-asparagina o una mezcla racémica de DL asparagina dio un rendimiento de masa celular micobacteriana menor que cuando se usó el estereoisómero L. Estos datos concuerdan con una utilización más eficaz del estereoisómero L de asparagina en lugar del estereoisómero D o la mezcla racémica. El citrato de amonio parece poseer una ventaja adicional como fuente de nitrógeno porque los iones de amonio no son racémicos.
Se realizó un tercer estudio usando el MCMC-C optimizado donde se compararon los rendimientos de Mycobacterium phlei y Mycobacterium smegmatis.Se preparóMycobacterium smegmatis(ATCC, Manassas, VA, cepa ATCC14468) como se describe paraMycobacterium phlei,y se realizaron cultivos mano a mano como se describió anteriormente. Tabla 4. M M - r l r r i n m l l r M ri m hl i M ri m megmatis
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Los resultados que se muestran en la Tabla 4 demuestran que el uso de la composición C de MCMC da como resultado cantidades significativas de masa celular micobacteriana en un período de tiempo relativamente corto, y que tales rendimientos no se limitan aMycobacterium phlei.
Se realizó un estudio separado para determinar el efecto de una aireación adicional del medio durante el cultivo. El cultivo deMycobacterium phleise llevó a cabo como se describió anteriormente, excepto que se usaron matraces Fermbach con deflectores triples para aumentar la mezcla del medio y el acceso al oxígeno atmosférico. El crecimiento deMycobacterium phleien medio MCMC-C se comparó con su crecimiento en caldo Bacto™ AC y MCMC-A.Elrendimiento de masa celular de Mycobacterium phlei a las 120 horas se determinó como g de peso en seco de masa celular micobacteriana/medio de cultivo en litros. Los resultados mostraron que al usar el caldo Bacto™ AC era 5,0 g/L, usar el caldo MCMC-A era 3,15 g/L, y usar MCMC-C el rendimiento era 9,2 g/L (coeficaz de aumento de 2,9 versus MCMC-A y coeficaz de aumento de 1,84 versus caldo Bacto™ AC). Estos datos demuestran que en condiciones de cultivo que aumentan el mezclado y la aireación (como, entre otros, los matraces de Fermbach), hay más aumentos en el rendimiento deMycobacterium phlei,y que el rendimiento en la nueva composición del medio es mayor que el encontrado con el caldo Bacto™ AC o MCMC-A.
La preparación del RNC de la pared celular micobacteriana de la presente invención se llevó a cabo usando cultivos de nóculos de micobacterias preparados a partir de reservas congeladas. Se preparó un cultivo de inóculo a partir de las reservas congeladas agregando 1 vial de la reserva congelada a 600 mL del medio de cultivo modificado, y el cultivo se llevó a cabo durante 7 días a 37 ° C con agitación en un agitador orbital a 160-250 rpm (Lab -Line, Melrose Park, IL, EE. UU.). El cultivo de inóculos se usó después para inocular un mayor volumen de cultivo a una dilución 1:10 y el cultivo se llevó a cabo en las mismas condiciones durante 7 días. La biomasa micobacteriana se recogió mediante lavado centrífugo de baja velocidad, después de lo cual las micobacterias sedimentadas se resuspendieron en agua para inyección (libre de nucleasas) para dar una suspensión de 10 % p/v. Las composiciones de la presente invención se prepararon a partir de esta suspensión como se describe en los siguientes ejemplos.
Típicamente, el cultivo de Mycobacterium phlei según se describió en la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357 se desarrolla entre 7 a 10 días para la generación de un cultivo de inóculos y de 10 a 20 días adicionales para la generación de biomasa celular micobacteriana (tiempo de cultivo total entre 17 a 30 días). El rendimiento de este procedimiento de preparación es de aproximadamente 20 g de peso húmedo de Mycobacterium phlei/litro de medio de cultivo, correspondiente a un peso en seco de aproximadamente 2-3 g deMycobacterium phlei/litro. El nuevo procedimiento de preparación descrito anteriormente usando las composiciones de MCMC y las condiciones de cultivo tarda 14 días en total, y el rendimiento es de aproximadamente 6,5-7,6 g de peso en seco de Mycobacterium phlei/litro, proporcionando así una disminución significativa en el tiempo requerido para preparar la biomasa además de un aumento significativo en el rendimiento de la masa celular micobacteriana. Tales mejoras proporcionan aumentos inesperados en la eficacia de producción de biomasa en comparación con las enseñanzas anteriores.
Debe tenerse en cuenta que los principios importantes descritos en este ejemplo son el uso de un medio de cultivo para la preparación de masa de células micobacterianas que no contenga material exógeno animal, vegetal o fúngico, y un procedimiento de cultivo que optimice el crecimiento de las micobacterias mediante el uso de un medio optimizado junto con agitación para mantener las micobacterias en suspensión, en lugar de como una película que es característica de las condiciones de cultivo de crecimiento estacionario. Un experto en la materia puede realizar la modificación de estos principios después de leer este ejemplo que da como resultado un crecimiento óptimo de una especie, complejo o cepa micobacteriana particular.
EJEMPLO 2
Controlar la cantidad de micobacterias intactas durante la preparación de composiciones inmunoestimuladoras y anticancerosas.
El siguiente ejemplo identifica nuevos procedimientos para la preparación de las composiciones de la presente invención que usan volúmenes de trabajo que son escalables, oscilan de varios mL a volúmenes de varios litros, y dan como resultado la producción eficaz de nuevas composiciones bacterianas que comprenden ácidos nucleicos y paredes celulares.
Se preparó la masa celular micobacteriana (Mycobacterium phlei se usa como un ejemplo ilustrativo y representativo de masa celular micobacteriana) como se describe en el Ejemplo 1. Después de la sedimentación mediante centrifugación a baja velocidad para extraer componentes del medio de cultivo, se alteraron células de M. phlei (preparadas como una suspensión al 10 % p/v en agua libre de DNasa y RNasa para inyección) mediante homogeneización a alta presión (18.000 libras por pulgada cuadrada [PSI], 5 ciclos, a una temperatura de 4 °C) mediante el uso de un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5 (Avestin, Ottawa, Ontario, Canadá). Se puede recurrir a sistemas similares o equivalentes sin apartarse de la presente invención. El homogenato se centrifugó a continuación a una fuerza centrífuga relativa identificada como óptima para la extracción de micobacterias intactas (3,160 x g durante 30 min a 4°C). En este ejemplo, muestras de la suspensión de M. phei al 10 % p/v , el homogenato después de la homogeneización a alta presión, el sobrenadante de la centrifugación a baja velocidad (que contieneM. phleiintacto y contaminante) y el sobrenadante de la centrifugación a baja velocidad que se había sometido a ciclos adicionales de homogeneización a alta presión se diluyeron en serie (diluciones de 10-2a 10-7en agua para inyección) y el número de unidades formadoras de colonias (UFC) determinado por el cultivo en placas en medio de crecimiento de agar de soja tríptico, se incubaron durante 72 a 96 horas a 37 ° C y se contaron las colonias y se expresaron las mismas como UFC/mL.
Se ha informado que el sistema de homogeneización a alta presión Avestin alcanza una alteración de ~100 % de células de levadura y Escherichia coli después de 1 a 3 ciclos (http://www.avestin.com/Engl¡sh/efappl¡cat¡ons.html#Rupture). El fracaso de 5 etapas de homogeneización para lograr el 100 % de alteración deMycobacterium phleiindicaría a los expertos en la materia que este sería el límite de eficacia para este microorganismo. Inesperadamente, sin embargo, se encontró que someter el sobrenadante de la centrifugación a baja velocidad que contenía células de Mycobacterium phlei intactas que eran aparentemente resistentes a 5 ciclos de homogeneización a alta presión a (2-3) etapas adicionales de homogeneización a alta presión a 18.000 PSI a una temperatura de 4 °C dio como resultado nuevas reducciones en las células de Mycobacterium phlei intactas (tabla 5). Los beneficios inesperados de las etapas adicionales de homogeneización a alta presión son reducciones más controladas en el número de células intactas deMycobacterium phleiy un aumento en el rendimiento de la pared celular micobacteriana-RNC.
Dado que Mycobacterium phlei crece en agregados de células en cultivo en suspensión, es imposible determinar directamente la cantidad de UFC en la suspensión micobacteriana (que se determina que es una subestimación de aproximadamente 100 veces). Se usó una estimación calculada determinada como sigue: el tamaño del microorganismo como se muestra en la Figura 1 es similar al deEscherichia coli(0,5 x 2 pm: obtención de imágenes de bacteriasEscherichia coli completasmediante el uso de difracción de rayos X de una sola partícula.Miao J, y col. PNAS 2003, 100:110-112), permitiendo así un cálculo de la UFC estimada de un 10 % p/v de suspensión deMycobacterium phleibasada en el peso deEscherichia coliindividual, que es 665 femtogramos (fg) (detección de células individuales con osciladores micromecánicos.Illic, B y col., J. Vac. Sci. Technol. B. 2001, 19(6):2825-2828)
T l . Ef l h m n iz i n l r i n r l n m r mi ri in
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Los resultados mostrados en la tabla 5 demuestran que el uso de 5 ciclos de homogeneización a alta presión es coherente con la alteración eficaz de las micobacterias en la suspensión (99,42 % basado en el cálculo anterior). La centrifugación a baja velocidad después de 5 ciclos de homogeneización a alta presión produjo una reducción de 5.000 veces en la cantidad de células micobacterianas viables intactas en comparación con una muestra equivalente de M. phlei que no se había sometido a homogeneización a alta presión. El uso de más etapas de homogeneización a alta presión mediante el uso del sobrenadante de la centrifugación a baja velocidad produjo un contenido adicional del 0,007 % que representa una reducción de 2.895 veces en la cantidad de células micobacterianas viables intactas en comparación con muestras equivalentes de Mycobacterium phlei que no se habían sometido a homogeneización a alta presión.
Debe tenerse en cuenta que los principios importantes demostrados en este ejemplo son los beneficios inesperados que surgen del uso de etapas adicionales de homogeneización que son una mayor alteración de las micobacterias intactas, que como microorganismos Gram positivos se consideran resistentes a la homogeneización a alta presión, y la capacidad de controlar mediante el uso de diferentes etapas de homogeneización el nivel de micobacterias intactas en la fracción de RNC de la pared celular micobacteriana contenida en el sobrenadante de centrifugación a baja velocidad.
EJEMPLO 3
Preparación de composiciones que comprenden paredes celulares micobacterianas y ARN (MpRNC)
Para demostrar aún más la utilidad del nuevo enfoque descrito anteriormente para preparar composiciones de pared celular micobacteriana, se desarrollaron nuevos procedimientos que requerían el uso de diferentes presiones de homogeneización y un número de ciclos de homogeneización que permitiera la preparación de nuevas composiciones de ARN de pared celular micobacteriana (MRNC) formuladas con paredes celulares micobacterianas y que comprenden: a) una reducción controlada del contenido de células micobacterianas intactas; b) la generación de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de longitud definida, y c) la generación de actividad estimulante inmunitaria inesperada.
En este ejemplo, la masa de células micobacterianas (se usa Mycobacterium phlei como un ejemplo ilustrativo y representativo de masa de células micobacterianas, y debe tenerse en cuenta que los procedimientos de preparación descritos en este ejemplo son aplicables tanto a bacterias como micobacterias) se preparó como se describe en el ejemplo 1. Las células intactas de Mycobacterium phleise lavaron primero mediante centrifugación a baja velocidad para extraer los componentes del medio de cultivo, y luego se alteraron mediante el uso de homogeneización a alta presión con un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5 (Avestin, Ottawa, Ontario, Canadá). Después de la homogeneización a alta presión, las células micobacterianas intactas restantes se extrajeron mediante centrifugación diferencial usando fuerzas centrífugas relativas que se optimizaron para la extracción controlada de cualquier micobacteria residual, intacta y no alterada, así como la extracción de material soluble (contenido citoplasmático, incluidas proteínas). La preparación intacta sin células micobacterianas, que comprende el ARN de la micobacteria en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos asociados con fragmentos de pared celular micobacteriana, se purificó adicionalmente mediante lavado por centrifugación a una fuerza centrífuga relativa más alta, con el fin de extraer los contaminantes solubles. La fracción de MpRNC se aisló como un sedimento después del lavado por centrifugación a una fuerza centrífuga relativa alta. La cantidad de micobacterias vivas en la fracción de MpRNC se determinó sembrando en placas diluciones en serie de la fracción libre de células intactas micobacterianas en medio de crecimiento de agar tríptico de soja, incubando durante 72-96 h a 37 ° C y determinando la cantidad de unidades formadoras de colonias ( UFC). A continuación, la suspensión de MpRNC se trató con calor a 121 °C durante entre 5 y 30 minutos. La Tabla 6 muestra los pasos utilizados para preparar MpRNC con un contenido alto, intermedio o bajo de células micobacterianas intactas (en lo sucesivo, MpRNC alta, MpRNC intermedia y MpRNC baja, respectivamente).
Tabla . Pr r i n M RN ni n niv l l in rm i M ri m hl iintacto
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Los resultados mostrados en la Tabla 7 muestran la cantidad de UFC en MpRNC preparadas usando los diversos procedimientos descritos en la Tabla 6.
Tabla 7. Pre aración de M RNC con diferentes niveles de contenido de células micobacterianas intactas
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Los datos muestran que al aumentar la presión de homogeneización y la cantidad de ciclos de homogeneización, la MpRNC sufre una reducción significativa y, lo que es más importante, controlada en el número de células viables intactas de Mycobacterium phlei presentes en la MpRNC. El cálculo del % en peso de micobacterias intactas (basado en un peso bacteriano de 665 fg) mostró un intervalo controlado de <0,2 % (MpRNC baja) a 19,6 % (MpRNC alta). Los expertos en la materia reconocerán que la cantidad de células micobacterianas viables en la MpRNC se puede controlar fácilmente en un intervalo de 100 veces mediante el uso apropiado de un procedimiento definido, como el uso controlado de la presión de homogeneización, la cantidad de ciclos de homogeneización y el uso de centrifugación diferencial como se describe en la presente invención.
EJEMPLO 4
Preparación de MRNC de la cepa BCG de Mycobacterium bovis, Mycobacterium smegmatis y Mycobacterium vaccae
En este ejemplo, se usaron tres micobacterias diferentes, una conocida por ser de crecimiento lento en cultivo y dos conocidas por ser de crecimiento rápido en cultivo, para preparar diferentes composiciones de MRNC. Como tal, este ejemplo junto con los Ejemplos 1, 2 y 3 de la presente invención enseña a un experto en la materia cómo preparar MRNC a partir de cualquier especie o cepa micobacteriana. Con el fin de preservar la composición de ácido nucleico, se utilizaron reactivos sin nucleasas (sin RNasa y sin DNasa). Un experto en la materia al leer la presente invención también reconocerá que la aplicación del uso de diferentes ciclos y presiones de homogeneización, y el uso selectivo de centrifugación diferencial, como se describe en detalle en los Ejemplos 1, 2 y 3 para la preparación de MpRNC deMycobacterium phlei,permite la preparación de composiciones de RNC que contienen el nivel óptimo de células micobacterianas intactas de otras especies para la aplicación deseada.
Se puede usar Mycobacterium bovis BCG de biomasa micobacteriana o de fuentes disponibles comercialmente para preparar composiciones de MbRNC. En este ejemplo se utilizó la cepa Connaught de BCG. BCG está disponible comercialmente como un polvo liofilizado que contiene 2-10x108 UFC/mg (Immucyst, Aventis, Toronto, ON, Canadá). El polvo liofilizado se resuspendió primero en agua para inyección (Wisent) durante 30 min a 20 ° C con agitación intermitente. Las células suspendidas se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad y luego se alteraron usando homogeneización a alta presión con un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5 seguido de centrifugación diferencial para aislar MbRNC como se describe para MpRNC intermedia con modificaciones menores. Específicamente, una suspensión de Mycobacterium bovis BCG 0,243 % p/v en agua para inyección se sometió a 5 ciclos de homogeneización a alta presión a 18.000 psi con agua circulante en un intercambiador térmico a 4 °C. El homogenato se centrifugó a continuación a 3.160 x g durante 30 min para sedimentar cualquier Mycobacterium bovis BCG residual, intacto e inalterado. El sobrenadante, que contenía ARN de la micobacteria asociada con los fragmentos de pared celular micobacteriana, se centrifugó a continuación a 38.400 x g durante 1 hora para extraer contaminantes solubles y para sedimentar las paredes celulares de RNC y Mycobacterium bovis BCG (MbRNC). A continuación, el sedimento se resuspendió en agua para inyección y se homogeneizó durante dos ciclos adicionales como se describió anteriormente. La suspensión que contenía Mycobacterium bovisMbRNC se trató con calor a 121 ° C durante entre 5 y 30 min.
Se usó Mycobacterium smegmatis (obtenida de la ATCC, Manassas, VA, cepa 14468) de biomasa micobacteriana cultivada para preparar MsRNC. Las células de Mycobacterium smegmatis se prepararon como se describe en el ejemplo 1. Las micobacterias intactas (Mycobacterium smegmatis) se lavaron primero mediante centrifugación a baja velocidad para extraer los componentes del medio de cultivo, y luego se alteraron mediante homogeneización a alta presión con un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5 seguido de centrifugación diferencial como se describe para MpRNC. En detalle, un 10 % p/v de suspensión celular de Mycobacterium smegmatis en agua para inyección se sometió a 5 ciclos de homogeneización a alta presión a 18.000 psi. El homogenato se centrifugó a continuación a 3.160 x g durante 30 min a 4 °C para sedimentar Mycobacterium intacta e inalterada. El sobrenadante, que contenía ARN de la micobacteria asociada con los fragmentos de pared celular micobacteriana, se centrifugó a continuación a 38.400 x g durante 1 hora a 4 °C para extraer los contaminantes solubles y sedimentar MsRNC. A continuación, el sedimento MsRNC se resuspendió en agua para inyección y se homogeneizó durante dos ciclos adicionales como se describió anteriormente. La suspensión que contenía Mycobacterium smegmatis RNC (MsRNC) se trató con calor a 121 °C durante entre 5 y 30 min.
Se cultivó Mycobacterium vaccae (cepa ATCC 15483, American Typing Culture Collections, Manassas, Virginia, EE. UU.) en caldo Middlebrook 7H9 suministrado con enriquecimiento OADC (BD Diagnostic System, Sparks, Maryland, EE. UU.). Las bacterias sedimentadas se almacenaron a -20 ° C antes de su uso). El uso de caldo Middlebrook 7H9 suministrado con enriquecimiento OADC (BD) permitió un crecimiento óptimo deMycobacterium vaccaeen comparación con el crecimiento en el medio sintético debido a la presencia de factores de crecimiento aún desconocidos en el enriquecimiento de OADC. En este ejemplo, se hizo uso del nuevo procedimiento de preparación descrito en esta solicitud para garantizar que no hubiera exposición adicional a materiales exógenos. Las células se lavaron primero mediante centrifugación a baja velocidad para extraer los componentes del medio de cultivo, y luego se alteraron usando homogeneización a alta presión con un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5 seguido de centrifugación diferencial como se describe para MpRNC. En detalle, una suspensión de Mycobacterium vaccae al 10 % p/v en agua para inyección se sometió a 5 pasadas de homogeneización a alta presión a 18.000 psi. El sobrenadante, que contenía ARN de la micobacteria asociada con los fragmentos de pared celular micobacteriana, se centrifugó a continuación a 38.400 x g durante 1 hora para extraer los contaminantes solubles y sedimentar MvRNC. A continuación, el sedimento se resuspendió en agua para inyección y se homogeneizó durante dos ciclos adicionales como se describió anteriormente. La suspensión que contenía Mycobacterium vaccae RNC (MvRNC) se trató con calor a 121 °C durante entre 5 a 30 min.
EJEMPLO 5 (ejemplo de comparación)
Preparación de BRNC a partir de bacterias gramnegativas
Las composiciones de BRNC se pueden preparar a partir de una o varias bacterias Gram negativas, por ejemplo, mediante la alteración de la bacteria seguida de la extracción de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol (como se describe en Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, Ausubel y col. Eds., John Wiley & Sons Inc., Nueva York, EE. UU.). Se pueden utilizar procedimientos enzimáticos que están diseñados para digerir especies químicas no deseadas antes de la extracción de composiciones que contienen ácido nucleico y así optimizar el rendimiento. Por ejemplo, se suspendieron bacterias Gram-negativas en 5 ml de Tris-HCl 50 mM libre de RNasa, EDTA 5 mM, pH 8.0, agregando lisozima libre de RNasa (Sigma-Aldrich) a una concentración de 1 mg/mL e incubando durante 90 min a 37 °C. Se añadió a continuación proteínasa K libre de RNasa (Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadá) para dar una concentración final de 0,1 mg/mL, dodecilsulfato de sodio libre de Rnasa (BioRad, Richmond, California) para dar una concentración final de 1 % p/v, y la incubación continuó durante 10 min a 65°C. A continuación, el ácido nucleico se aísla mediante extracción de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Las composiciones que contienen ARN pueden tratarse opcionalmente (por ejemplo, mediante el uso de homogeneización a alta presión, cizallamiento mecánico, sonicación o esterilización en autoclave) para generar los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos.
El ARN bacteriano se puede utilizar opcionalmente para preparar formulaciones de RNC de pared celular bacteriana (BRNC), mediante el uso de homogeneización a alta presión y centrifugación diferencial y tratamiento con calor como se describe en los ejemplos 1, 2, 3 y 4 de la presente invención, de manera que tengan actividad anticancerosa e inmunoestimulante. La BRNC se puede combinar además con portadores farmacéuticos tales como, de modo no taxativo, liposomas catiónicos o nanopartículas como se describe en los ejemplos 36 y 37.
EJEMPLO 6
Preparación de BRNC o MRNC a partir de bacterias grampositivas
Las composiciones de BRNC y las composiciones de MRNC de la presente invención se pueden preparar a partir de una o varias bacterias Gram positivas (incluidas las micobacterias) mediante, por ejemplo, la alteración de la bacteria o micobacteria seguida de extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol (como se describe en Short Protocols in Molecular Biology, 3.a edición, Ausubel y col.. Eds., John Wiley & Sons Inc., Nueva York, EE. UU.). Se pueden utilizar procedimientos enzimáticos que están diseñados para digerir especies químicas no deseadas antes de la extracción de ARN y así optimizar el rendimiento. Como ejemplo de la aplicabilidad de los nuevos procedimientos descritos anteriormente. Se suspendieron bacterias gramnegativas en 5 ml de Tris-HCl 50 mM libre de RNasa, EDTA 5 mM, pH 8.0, agregando lisozima libre de RNasa (Sigma-Aldrich) a una concentración de 1 mg/mL e incubando durante 90 min a 37 °C. A continuación, se añadió proteinasa Klibrede RNasa (preparada a partir de Tritirachium album. Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadá) para dar una concentración final de 0,1 mg/mL, dodecilsulfato de sodio libre de RNasa (BioRad, Mississauga, Ontario, Canadá) para dar una concentración final de 1 % p/v, y la incubación continuó durante 10 min a 65 °C. A continuación, se aisló el ARN mediante extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol.
El BRNC y el MRNC se pueden tratar opcionalmente (por ejemplo, mediante el uso de homogeneización a alta presión, cizallamiento mecánico, sonicación o tratamiento con calor) para generar los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de la presente invención.
El ARN bacteriano puede usarse opcionalmente para preparar formulaciones de BRNC, mediante el uso de homogeneización a alta presión y centrifugación diferencial y tratamiento con calor como se describe en los Ejemplos 1, 2, 3 y 4 de la presente invención, de manera que tengan actividad anticancerosa e inmunoestimulante. El RNC bacteriano se puede combinar adicionalmente con portadores farmacéuticos como, de modo no taxativo, liposomas catiónicos o nanopartículas como se describe en los ejemplos 36 y 37.
El ARN micobacteriano se puede usar opcionalmente para preparar formulaciones de MRNC, mediante el uso de homogeneización a alta presión y centrifugación diferencial y tratamiento con calor como se describe en los ejemplos 1, 2, 3 y 4 de la presente invención, de manera que tengan actividad anticancerosa e inmunoestimulante. La MRNC se puede combinar además con portadores farmacéuticos tales como, de modo no taxativo, liposomas catiónicos o nanopartículas como se describe en los ejemplos 36 y 37.
EJEMPLO 7
Examen morfológico de las composiciones de la pared celular micobacteriana en busca de células micobacterianas intactas
Se llevó a cabo una comparación morfológica de las composiciones de la pared celular micobacteriana usando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Debe tenerse en cuenta que en este ejemplo se usa MpRNC como un ejemplo ilustrativo y representativo del contenido de células intactas de BRNC y MRNC.
Se preparó una muestra de biomasa de Mycobacterium phlei como se describe en el ejemplo 1, se preparó una muestra de MpRNC alta, intermedia y baja, como se describe en el ejemplo 3, se preparó una muestra de MCC como se describe en la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357, se preparó una muestra de MCWE como se describe en la patente de los e E. UU. núm. 5.759.554. Los dos últimos procedimientos de preparación usan procedimientos que utilizan digestión de pronasa/tripsina y tratamiento con fenol/urea. Todas las muestras se examinaron morfológicamente usando TEM. Las muestras preparadas como suspensión en agua para inyección (1 mg/mL p/v) se prefijaron con 5 % p/v de glutaraldehído (relación de volumen: 1:1) durante 1 hora. Después de la centrifugación (8.000 x g durante 10 min), los sedimentos se suspendieron en 2,5 % v/v de glutaraldehído fresco y se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, las muestras se lavaron con tampón de lavado y se mantuvieron en tampón de lavado a 4 ° C antes de su procesamiento adicional. Después de lavar tres veces en tampón de lavado, las muestras se tiñeron previamente con tetróxido de osmio y ferrocianuro de potasio durante 2 horas, se lavaron y se deshidrataron en acetona. A continuación, las muestras se infiltraron con concentraciones crecientes de Epon ™ en acetona y se polimerizaron a 58 °C durante 48 horas. Se colocaron secciones gruesas (90-100 nm) en rejillas de cobre de malla 200 y se tiñeron con acetato de uranilo seguido de plomo de Reynolds. Las muestran se examinaron en JEOL JEM-2011200kV c/Fas TEM c/ sistema microanalítico Quartz XOne y una cámara Gatan DualView 300W 1,3k x 1k CCD o un Philips CM200200 kV TEM equipado con un cámara AMT 2k x 2k CCD.
Los resultados del análisis morfológico se muestran en la figura 1. La figura 1a muestra Mycobacterium phlei intacta (usada como un material de referencia), la Figura 1b muestra MCC preparada de acuerdo con la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357, y la figura 1c muestra MCWE preparado de acuerdo con la patente de los EE. UU. núm.
5.759.554. Seobservaroncélulas de M. phlei no alteradas como una estructura densa en electrones y contenían muy poca, si es que la había, membrana celular o fragmentos de pared celular. Inesperadamente, dada la etapa de centrifugación diferencial usada en la preparación de MCWE y MCC, se observó que sus composiciones eran una mezcla de estructuras densas de electrones y transparentes de electrones coherentes con una mezcla de micobacterias intactas y fragmentos de pared celular (estimadas en 8,5 y 3,0 % de bacterias intactas, respectivamente). Las figuras 1d, 1e y 1f muestran que la cantidad de micobacterias intactas en la MpRNC baja, media y alta, respectivamente, se controla a través del uso de procedimientos de preparación en el ejemplo 3 de la presente invención (que se estima que es 0,0, 2,5 y 12,5 %, respectivamente).
Los resultados de este análisis morfológico demuestran que el procedimiento de preparación de la presente invención da como resultado un contenido de células micobacterianas intactas controlable de las formulaciones de MpRNC. EJEMPLO 8
Preparación de contaminantes en composiciones de paredes celulares micobacterianas
La preparación de paredes celulares micobacterianas de acuerdo con la patente de los EE. UU. núm. 5.759.554 (MCWE) y la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357 (MCC), ambas usan digestión de enzimas proteolíticas (Streptomyces griseus pronasa/tripsina bovina) en conjunción con una etapa de tratamiento con fenol/urea. Tal procedimiento podría dar lugar a la contaminación con enzimas proteolíticas y fenol de la composición final de la pared celular, aunque ambas patentes enseñan el uso de procedimientos de lavado para eliminar estos y otros contaminantes.
En este ejemplo, el contenido de fenol/contaminación de las paredes celulares micobacterianas preparadas de acuerdo con la patente de los EE.UU. núm, 5.759.554, patente de los EE. UU. núm. 6.326.357, y m RnC preparada de acuerdo con el ejemplo 3 de la presente invención se determinó mediante HPLC. El intermedio de MpRNC se usó como un ejemplo representativo de MRNC, y debe comprenderse que los principios de preparación enseñados en el ejemplo 3 de la presente invención son aplicables a todos los MRNC así como a BRNC.
Las suspensiones de las diferentes composiciones de la pared celular micobacteriana (1 mg/mL en agua para inyección) o estándares de fenol apropiados en agua (0-10 pg/mL) se trataron con HCl 12 M a 100 ° C durante 60 min. Después de enfriar, las composiciones de la pared celular micobacteriana o los estándares de fenol se extrajeron con éter dietílico (2 ml de éter dietílico/mg de composición de pared celular). La fase de éter dietílico se extrajo y mezcló con 0,05 M de NaOH en metanol (3 mL/mg de composición de pared celular). Después de la evaporación a sequedad mediante el uso de una corriente de nitrógeno, el residuo se disolvió en agua (0,2 mL/mg de pared celular micobacteriana), y se analizaron 100 pL mediante HPLC para el contenido de fenol. El sistema de HPLC para análisis utilizó un sistema de HPLC Waters Breeze que consistía en un automuestreador 717 plus, una bomba de HPLC binaria Waters 1525 y un detector de absorbancia de longitud de onda Waters 248L Dual conectado a una columna de 4,6 x 150 mm de fase analítica inversa C-18 (Waters, Nova-Pak C18, WAT 044375), rellena con 4 |jm de sílice (Waters Ltd., Lachine, Quebec, Canadá). Las separaciones por HPLC se realizaron a temperatura ambiente mediante el uso de volúmenes de muestra de 100 jL y un flujo de 1,0 mL/min mediante el uso de las siguientes condiciones de elución de gradiente: el eluyente A se acidificó con agua con 1 % de ácido acético (v/v) y el eluyente B era 100 % de acetonitrilo. El eluyente A se mantuvo al 95 % durante 2 min y luego disminuyó linealmente al 60 % durante 15 min, donde se mantuvo durante 3 min. La detección UV de fenol se realizó a 270 nm.
Para la detección de proteínas exógenas, se liofilizaron 20 mL de las diferentes composiciones de pared celular micobacteriana durante un período de 72 h. Las proteínas se extrajeron de las composiciones de pared celular micobacteriana liofilizada mediante el uso de un tampón de extracción RIPA modificado (1 % de Triton X-100, 0,5 % de NP-40 %, 1 % de SDS, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10 mM de Tris pH 7,5 a 4°C). El contenido de proteína total del extracto se midió según el procedimiento Macart (Macart y Gerbaut, 1982 Clin. Chim. Acta 122:93-101). Las muestras se diluyeron con un tampón de muestras Laemmli (62,5 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 2 % de SDS, 25 % de glicerol, 0,01 % de azul de bromofenol y 5 % de mercaptoetanol) para dar una concentración de 1 mg de proteína por mL. Se cargó un total de 60 jL de muestras diluidas en 10 %-20 % geles de SDS-PAGE en gradiente (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá) y se llevó a cabo la electroforesis a temperatura ambiente a 140 V durante 6 a 8 horas. Para la calibración, se procesaron mezclas estándar de peso molecular (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá) en paralelo con las muestras. Los geles se tiñeron para la proteína mediante el uso de tinción con azul coloidal (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) durante 38 horas a temperatura ambiente. Las bandas de interés (80, que contenían proteínas de diferentes pesos moleculares) se escindieron de los geles y se colocaron en placas de 96 pocillos y después se lavaron con agua. La digestión tríptica se realizó en un robot de manipulación de líquidos MassPrep (Waters, Milford, MA, EE. UU.) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Brevemente, las proteínas se redujeron con 10 mM de DTT y se alquilaron con 55 mM de yodoacetamida. La digestión con tripsina se realizó usando 105 mM de tripsina porcina modificada (grado de secuenciación, Promega, Madison, WI, EE. UU.) a 58 ° C durante 1 h. Los productos de la digestión se extrajeron mediante el uso de 1 % de ácido fórmico, 2 % de acetonitrilo seguido de 1 % de ácido fórmico, 50 % de acetonitrilo. Los extractos recuperados se agruparon, se secaron por centrifugación al vacío y después se suspendieron en 8 jL de 0,1 % de ácido fórmico y se analizaron 4 jL mediante espectrometría de masas. Las muestras de péptidos se separaron mediante cromatografía líquida capilar a nanoescala (nanoLC) de fase inversa (RP) en línea y se analizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización (ES MS/MS). Los experimentos se realizaron con una bomba Thermo Surveyor MS conectada a un espectrómetro de masas de trampa de iones lineales LTQ (ThermoFisher, San José, CA, EE. UU.) equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización (ThermoFisher). La separación de péptidos tuvo lugar en una columna PicoFrit BioBasic C18, diámetro interno de 10 cm x 0,075 mm (New Objective, Woburn, MA) con un gradiente lineal de 2-50 % de solvente B (acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico) en 30 min, a 200 nL/min (obtenida mediante separación de flujo). Los espectros de masas se adquirieron mediante el uso de un modo de adquisición dependiente de datos mediante el uso del software Xcalibur versión 2.0. Cada espectro de masas de escaneo completo (400 a 2000 m/z) fue seguido de disociación inducida por colisión de los siete iones más intensos. La función de exclusión dinámica (duración de exclusión de 30 segundos) se habilitó y la energía de fragmentación de colisión relativa se estableció en 35 %. Todas las muestras de MS/MS se analizaron mediante el uso de Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido; versión 2.2.0). Mascot fue creado para buscar en la base de datos Uniref100 asumiendo que la enzima de digestión era tripsina. Se realizó una búsqueda en Mascot con una tolerancia de masa de iones fragmento de 0,50 Da y una tolerancia de iones parentales de 2,0 Da. El derivado de yodoacetamida de cisteína se especificó como una modificación fija y la oxidación de la metionina se especificó como una modificación variable. Se permitieron dos sitios de escisión de digestión tríptica perdidos. Se utilizó un cóntigo (Proteome Software Inc., Portland, OR) para validar identificaciones de MS/MS basadas en péptidos y proteínas. Se aceptaron identificaciones de péptidos si podían establecerse en una probabilidad mayor que 95,0 % según lo especificado por el algoritmo de de péptido profeta (Keller, A et al Anal. Chem. 2002; 74(20):5383-92). Se aceptaron las identificaciones de proteínas si podían establecerse con una probablilidad mayor al 95,0 % y contenían al menos 2 péptidos identificados. Las probabilidades de proteínas fueron asignadas según el algoritmo de proteína profeta (Nesvizhskii, AI Anal Chem. 2003 Sep 1;75(17):4646-58). Las proteínas que contenían péptidos similares y que no se pudieron diferenciar con base en el análisis MS/MS solamente se agruparon para generar el menor número de proteínas.
Los resultados obtenidos (Tabla 8) muestran que tanto MCWE como MCC están contaminados con fenol y la proteasa aminopeptidasa, una enzima proteolítica principal que se encuentra en la pronasa de Streptomycesgriseus.La MpRNC fabricada como se describe en el ejemplo 3, tabla 7, no contenía fenol ni ningún componente de pronasa detectable.
Tabla . n min i n n f n l r n ri in l m i i n l r l l r mi eriana
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Los datos de la tabla 8 demuestran que el uso de fenol en la preparación de paredes celulares micobacterianas conduce a una contaminación detectable por fenol y proteína exógena (pronasa aminopeptidasa) que en el caso de MCWE y MCC fue comparable. Una ventaja de usar los procedimientos de preparación de la presente invención en los que solo se usa agua para inyección sin RNasa para obtener composiciones de MRNC es que las composiciones resultantes están libres de contaminación de fenol y proteínas exógenas.
El fenol es anfifílico y su posterior presencia en las paredes celulares de las micobacterias concuerda con la localización en las regiones hidrófobas de la pared celular de las micobacterias (ácidos micólicos unidos covalentemente), donde permanece atrapado a pesar de los lavados repetidos por centrifugación.
Los análisis de proteínas contaminantes en MCWE y MCC, específicamente Streptomyces griseus aminopeptidasa, fueron positivos, confirmando así que el tratamiento enzimático utilizado en la preparación de paredes celulares micobacterianas da como resultado la presencia de proteínas exógenas y potencialmente inmunogénicas.
EJEMPLO 9
Contenido de ácido nucleico y perfil de las composiciones de MpRNC determinado por electroforesis
El intermedio de MpRNC se usó como un ejemplo representativo de MRNC, y debe tenerse en cuenta que los análisis enseñados en este ejemplo son aplicables a todas las composiciones de MRNC y BRNC.
La suspensión de MpRNC intermedia en agua para inyección recogida antes y después del tratamiento con calor (121 °C, 30 min) se analizó electroforéticamente para determinar su perfil de ácido nucleico usando el sistema Bioanalyzer (Bioanalyzer modelo núm. 2100, Agilent, Santa Clara, CA, EE. Uu .). La fracción de ácido nucleico se obtuvo como se describe en el ejemplo 6. La fracción de ácido nucleico se diluyó a una concentración de 30 ng/pL. El análisis electroforético de la longitud del ácido nucleico extraído se realizó con la unidad de electroforesis Bioanalyzer usando el kit nano RNA 6000 (Agilent núm. 5067-1511). Este kit proporciona información sobre la calidad del ARN en un intervalo de 25 a 6000 nucleótidos. Se analizó posteriormente la MpRNC intermedia después de la esterilización en autoclave usando el kit de Small RNA (Agilent Technologies Canada Inc., St. Núm. 5067-1548), que está diseñado para el análisis de ácidos nucleicos pequeños en el intervalo de tamaño de 6 a 150 nucleótidos. La MpRNC alta y la MpRNC baja también se analizaron después del tratamiento tratamiento con calor o (121 ° C, 30 min) usando el kit Small RNA (Agilent). Los resultados de los diferentes análisis electroforéticos se muestran en la figura 2a y la figura 2b.
figura 2a demuestra que la MpRNC intermedia antes de la esterilización en autoclave posee un perfil de ácido nucleico de entre aproximadamente 25 bases y cerca de 4000 bases cuando se analiza con el kit RNA nano 6000. El resultado demuestra que el uso de etapas de homogeneización a alta presión (presurización diferente y número de ciclos) para preparar la MpRNC intermedia da como resultado una composición que contiene una longitud de cadena de polirribonucleótidos de 25-4000 bases. Después de la esterilización en autoclave, la MpRNC intermedia muestra una distribución nucleica más compacta que osciló entre 25 bases y 200 bases (figura 2b). Un análisis posterior con el kit Small RNA demostró, en contraste con el perfil obtenido de la preparación antes de la esterilización en autoclave, que todas las preparaciones de MpRNC (alta, intermedia y baja) poseen un perfil de ácido nucleico comparable (figura 2b) pero que difiere en cantidad (alta>intermedia>baja).
La Figura 2b demuestra que la MpRNC intermedia posee un pico de oligorribonucleótidos que es máximo entre 20-40 bases y con un perfil de ácido nucleico de entre 5 y 60 bases de longitud. Las composiciones de MpRNC tenían solo cantidades menores de material de ácido nucleico que eluía a 100 bases, e incluso menos material de oligorribonucleótidos que eluía a aproximadamente 150 bases de longitud. Los resultados demuestran que el uso de etapas de homogeneización a alta presión y tratamiento con calor (diferente presurización y cantidad de ciclos junto con el tratamiento con calor) para preparar MpRNC da como resultado una composición que contiene una longitud de cadena de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de menos de 60 bases. También se observan perfiles de ácido nucleico comparables en MpRNC baja y MpRNC alta (figura 2b).
EJEMPLO 10
Análisis de ácidos nucleicos en composiciones de Mycobacterium phlei y MpRNC
En este ejemplo, se determinó el contenido de ácido nucleico de las composiciones de Mycobacterium phlei y MpRNC (alto, bajo e intermedio). Las composiciones de MpRNC se prepararon como se describe en el ejemplo 3. Debe observarse que en este ejemplo se usa MpRNC como un ejemplo ilustrativo y representativo del contenido de ácido nucleico de MRNC.
Los ácidos nucleicos se extrajeron de las respectivas composiciones usando el siguiente procedimiento. Una alícuota de la composición respectiva (700 pL a una concentración de 1 mg/ml) se digirió con lisozima libre de DNasa y RNasa, seguido de inactivación y digestión adicional con proteinasa K libre de DNasa y RNasa (ambas de Sigma-Aldrich Canadá, Oakville, Ontario). Los ácidos nucleicos se extrajeron con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1 v/v), y se precipitaron mediante la adición de glucógeno, acetato de sodio y etanol. Los precipitados se lavaron con etanol helado al 80 % y se solubilizaron en 50 pl de agua destilada. La concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un espectrofotómetro UV. El contenido de ácido nucleico de cada composición se muestra en la tabla 9.
Tabla 9. Contenido de ácido nucleico de M RNC
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Estos resultados demuestran que una cantidad creciente de células micobacterianas intactas en MpRNC (por ejemplo, MpRNC alta) está asociada con una cantidad creciente de ácidos nucleicos en la composición de MpRNC. Los resultados también muestran que el contenido de ácido nucleico de MpRNC (2.683-15.686 ng/mg) es significativamente diferente que el de Mycobacterium phlei intacta (44.786 ng/mg).
EJEMPLO 11
Determinación de la proporción de ADN/ ARN enMpRNCy Mycobacterium phlei esterilizados en autoclave
Las composiciones de MpRNC se usaron como ejemplos representativos de MRNC, y debe tenerse en cuenta que los análisis enseñados en este ejemplo son aplicables a todas las composiciones de MRNC y BRNC.
El análisis de la relación de ADN a ARN de MpRNC alta, MpRNC intermedia y MpRNC baja preparadas como en el ejemplo 3, así como células de Mycobacterium phlei esterilizadas en autoclave (preparadas como se describe en el ejemplo 1) se realizó primero mediante el uso de digestión enzimática con RNasa-A de los ácidos nucleicos extraídos seguido de análisis exhaustivo por electroforesis Bioanalyzer 2100 y la cuantificación del contenido de oligorribonucleótidos mediante el uso del kit Agilent Small RNA (kit núm. 5067-1548).
La digestión de la RNasa-A de los ácidos nucleicos extraídos (1260 ng/pL en tampón de RNasa) se llevó a cabo mediante el uso de ribonucleasa A libre de DNasa (RNAsa-A, tratada a 100 °C durante 30 min para extraer la actividad DNasa) (0,1 pg de enzima, 2 h a 37°C). La RNasa-A se obtuvo de Ameresco (Solon, OH, EE. UU.). Una muestra (20 ng/pL) de ácido nucleico tratado con RNasa A se analizó usando el Bioanalyzer. La cantidad de ADN y ARN se determinó en MpRNC alta, MpRNC intermedia y MpRNC baja, así como en células de Mycobacterium phleiesterilizadas en autoclave intactas mediante la ecuación:
Contenido de ADN = (Contenido total de Ácido Nucleico - Contenido de Ácido Nucleico tras tratamiento de RNasa-A Los resultados del análisis del Bioanalizador se muestran en la figura 3a para MpRNC alta, Figura 3b para MpRNC intermedia, 3c para MpRNC baja y 3d para células enteras de Mycobacterium phlei esterilizadas en autoclave. Los resultados del análisis de MpRNC (alta, baja e intermedia) con respecto al contenido de ARN y ADN se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Contenido de ADN ARN de las com osiciones de M RNC
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En segundo lugar, el análisis del contenido de ácido nucleico y la proporción de ADN a ARN de las MpRNC de la presente invención (baja, intermedia y alta) se realizó usando procedimientos cuantitativos más sensibles como sigue: la fracción de ácido nucleico obtenida en el ejemplo 6 se recuperó por ultrafiltración usando una unidad Microsep 1K (corte de peso molecular =1000 Da, Pall® Life Sciences, Ann Arbor, MI, EE. UU.). La solución de ácido nucleico se digirió a continuación a una mezcla de nucleósidos 5'-monofosfatos mediante el uso de nucleasa PI (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá) siguiendo el procedimiento informado por Liang (Liang y col., Ann. Chim. Acta. 2009 (650), 106­ 110). Para asegurar una digestión óptima de la nucleasa PI, se calentó un total de 50 pl de las soluciones acuosas de ácido nucleico para investigar en un baño de agua a 95-100 ° C durante 10 min, seguido de un enfriamiento inmediato en hielo. Se preparó la nucleasa PI a razón de 5 unidades/pL en 30mM de tampón de acetato de sodio que contenía 0,5mM de ZnCb, pH 5.3. Para la digestión enzimática, se mezclaron 50 pL de ácido nucleico en solución acuosa con el mismo volumen de solución de nucleasa PI y a continuación se incubó a 50 °C durante 30 min. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de un filtro Nanosep 10K mediante centrifugación a razón de 10.000 g durante 20 min a temperatura ambiente antes de análisis por HPLC.
También se trataron diluciones en serie de una mezcla de estándares de mononucleótidos (desoxirribo y ribonucleótidos, Sigma-Aldrich) que contenían 100, 10, 5, 2,5, 1 ng/pL cada uno de los mononucleótidos presentes en el ADN y el ARN con un tratamiento con nucleasa PI y se filtraron para su uso como estándares en el análisis por HPLC. El orden de elución de estos nucleótidos se confirmó comparando el tiempo de retención de los nucleótidos individuales en las mismas condiciones de HPLC. El análisis de HPLC se realizó usando un sistema de HPLC de la serie 1200 (Agilent, St-Laurent, Quebec, Canadá), que estaba equipado con una bomba cuaternaria con desgasificador, un muestreador automático, un calentador de columna y un detector UV de longitud de onda múltiple. Se usó una columna Zorbax Bonus-RP (Agilent) y las fases móviles comprendieron un gradiente lineal de 10 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7.2 y metanol (0-10 % de metanol). Los mononucleótidos se detectaron a 260 nm.
La proporción deADN:ARN se determinó después de la cuantificación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos de ADN y ARN (tabla 11).
Tabla 11. Cantidad ro orción de ADN/ARN en M RNC alta, M RNC intermedia M RNC baja
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Estos resultados demuestran que al pasar de MpRNC alta a MpRNC baja hay una disminución general en el contenido de ácido nucleico de ~50 %, coherente con un contenido reducido de células intactas de Mycobacterium phlei. Todas las composiciones de MpRNC en este análisis poseían tanto ADN como ARN, siendo comparable la proporción en la MpRNC intermedia y la MpRNC baja. Estos datos son coherentes con la extracción del ácido nucleico de la célula micobacteriana completa al pasar de MpRNC alta a MpRNC baja, de modo que el ARN en MpRNC está unido a la pared celular y por lo tanto es óptimamente activo con respecto a la actividad biológica.
EJEMPLO 12
Proporciones de ARN y ADN de MpRNC, MbRNC, MsRNC y MvRNC
Las composiciones de RNC micobacterianas se analizaron electroforéticamente para determinar su proporción de ARN:ADN mediante el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE). Debe entenderse que las micobacterias usadas en este ejemplo se usan como representantes de las micobacterias en general. Se preparó MRNC deMycobacterium phlei, Mycobacteriumbovis cepa BCG, Mycobacterium smegmatisy Mycobacterium vaccaecomo se describe en los ejemplos 3 y 4. La fracción de ácido nucleico se preparó como se describe en el ejemplo 6. La fracción de ácido nucleico (50 j L) se dividió en dos alícuotas de 25 jL cada una. Una alícuota se trató con 10 jg de RNasa A (Amresco, Solon, Ohio, EE. UU.) y la otra se trató con agua para inyección (Wisent, libre de RNasa y DNasa) a 37 °C durante 2 horas antes de cargarlas en un gel de urea-PAGE desnaturalizado prepreparado a 25V/cm durante 2,5 horas. El gel se manchó con solución SYBRGold® (Invitrogen) diluida 10.000x en 1 x tampón de Tris borato (89 mM de Tris, 89 mM de ácido bórico, 2 mM de EDTA, pH 8,0) durante 15 min antes de visualizarse mediante UV a una longitud de onda de 312 nm. La imagen del gel se digitalizó mediante el uso del software de análisis y procesamiento de imágenes ImageJ del NIH (Bethesda, Maryland, EE. UU.). Los resultados se muestran en la figura 4. La distribución de tamaño de los ácidos nucleicos demostrada por electroforesis PAGE desnaturalizante (figura 4a) se confirmó mediante análisis de ARN en chip microfluídico como se describe en el ejemplo 11 paraMycobacterium phleiRNC.
La proporción de ARN susceptible a RNasa se muestra en la figura 4b. El tratamiento de la fracción de ARN de los RNC micobacterianos con RNasa A produjo una reducción del 26,3 % en la intensidad de la señal para MbRNC, una reducción del 46,1 % para MsRNC, una reducción del 53 % para MpRNC, y una reducción del 60 % para Mycobacterium smegmatis RNC. Por tanto, las composiciones de MRNC de la presente invención contienen ARN susceptible a RNasa.
La mayor proporción de ARN en Mycobacterium vaccae RNC, Mycobacterium phlei RNC y Mycobacterium smegmatis RNC en comparación con Mycobacterium bovis BCG RNC es coherente con el hecho de que Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium vaccae son todas especies de crecimiento rápido cuando se las compara con Mycobacterium bovis BCG, y que tienen un promotor de expresión de ARN ribosómico más fuerte y un operón de ARN ribosómico adicional (Gonzalez-Y-Merchand, y col. 1997. J. Med. 179 (22), 6949-6958). Tales datos son coherentes con un requerimiento metabólico incrementado, expresado como niveles incrementados de ARN tanto en los grupos de ARNm como de ARNr de las especies micobacterianas de crecimiento más rápido.
EJEMPLO 13
Contenido de lípidos de MpRNC
Se determinó el contenido de lípidos y las clases moleculares presentes en MpRNC. Debe tenerse en cuenta que en este ejemplo, la MpRNC intermedia se usa como ejemplo ilustrativo y representativo del contenido de lípidos de MRNC preparada mediante el uso de los procedimientos descritos en los ejemplos 2 y 3 de la presente invención. También debe tenerse en cuenta que diferentes especies micobacterianas tienen diferentes perfiles de ácido micólico, pero que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a la familia mycobacteriaceae y al género mycobacterium.
Las composiciones de pared celular de micobacterias a menudo se tratan en su preparación con disolventes para extraer los lípidos (véase, por ejemplo Ribiy col., 1966, J. Bacteriol., 91:975-983, donde se describe el uso de éter de petróleo o acetona). Tales procedimientos conllevan el riesgo de contaminación por disolventes debido a la solubilización de los productos químicos en especies de lípidos no extraíbles y unidos covalentemente. Los lípidos de las micobacterias se dividen convencionalmente en 2 grupos: los que están unidos de forma no covalente y, por lo tanto, son extraíbles con disolventes orgánicos o detergentes (incluidos los mono y dimicolatos y lipoproteínas de trehalosa) y los que están unidos covalentemente a la pared celular (ácidos micólicos). A menos que se realice la saponificación, la extracción con solvente orgánico o detergente solo elimina los lípidos unidos de forma no covalente. Se determinó el impacto del procedimiento de preparación de MpRNC descrito en el ejemplo 3 de la presente invención sobre el contenido de lípidos de MpRNC.
Se usó una modificación del procedimiento de Dole para la extracción de lípidos libres unidos de forma no covalente, incluidos fosfolípidos, glicolípidos y ácidos grasos libres (Dole y Meinertz, 1960, J. Biol. Chem. 235:2595-2599, según lo modificación de Puttmann y col., 1993 Clin. Chem. 39:825-832). Se añadió un ml de sedimento de MpRNC intermedia o sobrenadante de la etapa 3 del procedimiento de preparación del ejemplo 3 preparado a partir de una suspensión de MpRNC intermedia 10 mg/mL en agua para inyección y sometido a centrifugación a alta velocidad a 3 mL de la mezcla de solventes n-heptano/isopropanol/ácido fosfórico (10/40/1, v/v/v) y se mezcló vigorosamente en un tubo de vidrio con una tapa forrada de Teflon®. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Después de agregar 1 mL de n-heptano, seguido de 1 mL de agua, el tubo se tapó herméticamente, se mezcló completamente y se dejó reposar. Se recogió la fase orgánica superior y se extrajo la fase acuosa restante que contenía la pared celular deslipidada o el sobrenadante mediante la adición de 1 ml de heptano. Las dos fases de heptano, que contenían lípidos libres extraíbles, unidos de forma no covalente, se reunieron y secaron a 50 °C bajo una corriente de nitrógeno en un tubo de vidrio con una tapa revestida de Teflon® hasta que se secaron completamente. Los extractos de lípidos secos se almacenaron a 4 ° C protegidos de la luz hasta la derivatización. El residuo que contenía MpRNC empobrecido en lípidos libres se recogió, se mantuvo a -20 °C y se usó para la extracción de lípidos unidos covalentemente (definidos como la fracción de pared celular de ácido micólico unida covalentemente).
La derivatización de los ácidos grasos para HPLC se llevó a cabo como sigue. En primer lugar, se añadió 0,1 mL de solución de KHCO3 (4 g de KHCO3 disueltos en 98 mL de agua y 98 mL de metanol) a extractos de lípidos libres secos y se secaron al aire a 50 °C bajo una corriente de aire filtrado. Luego, se añadió 1 mL de n-heptano y 5o pl de reactivopbromofenacil-8 (Pierce Chemical Co. Rockford, IL, EE. UU.) y se mezclaron completamente. Los tubos se sellaron y calentaron durante 30 min a 85°C. Después de enfriar a temperatura ambiente, la solución se aclaró mediante la adición de 1 ml de una mezcla de HCl (6 M)-metanol-agua. (1:2:1), y agitando vigorosamente. Los tubos se dejaron reposar durante 5 min y a continuación la capa orgánica se recogió en un vial de vidrio y se secó bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos libres derivatizados dep-bromofenacilo secos se mantuvieron a 4 °C protegidos de la luz hasta HPLC de fase inversa con análisis de detección UV (RP-HPLC-UV).
El análisis por RP-HPLC-UV de los derivados del éster p-bromofenacilo de los lípidos y ácidos grasos libres no unidos covalentemente se llevó a cabo usando un sistema de HPLC Waters Breeze con una bomba binaria y un detector UV de absorbancia de longitud de onda dual (Waters Ltd., Lachine , Quebec, Canadá). Se usó una columna de separación de fase inversa de 4 micrones (Waters, Nova-Pak, C184,6 mm x 150 mm) para análisis. Los derivados de ácidos grasos de p-bromofenacil-éster secos se disolvieron en 100 pL de acetonitrilo y se inyectaron 5 pL en la columna para separación mediante el uso de una mezcla de gradientes de 77 % de acetonitrilo y 23 % de agua durante 0 a 20 min: de 20 min a 25 min la concentración de acetonitrilo se elevó de 77 % a 96 % y después disminuyó de 96 % a 77 % durante los últimos 5 min de análisis a un flujo de 0,25 mL/min. La temperatura de la columna era de 30 °C y los picos se detectaron a 254 nm. Se usó ácido mirístico (C14:0) (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canadá) como estándar de ácidos grasos para la cuantificación de lípidos libres.
La fracción del sedimento de la etapa 3 y el sobrenadante de la etapa 3 que quedan después de la extracción de lípidos no unidos covalentemente se secaron bajo una corriente de nitrógeno a 50 ° C, a continuación se hidrolizaron con 2 ml de reactivo de hidrólisis (50 % p/v de hidróxido de potasio en agua y 50 % de metanol, 1:1, v/v) durante 1 hora a 100 ° C en un tubo de vidrio con una tapa forrada de Teflon® para liberar lípidos unidos covalentemente. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, se añadieron 2 mL de cloroformo seguido de 1,5 mL de reactivo de acidificación (HCl concentrado/metanol (1:1, v/v)). Después de mezclar vigorosamente, los tubos se dejaron reposar durante 5 min para la separación de fases. La fase de cloroformo (fase inferior) se recuperó y se transfirió a un nuevo tubo de vidrio con un tapón revestido con Teflon®. A continuación, la fase acuosa restante se volvió a extraer con 1 ml de cloroformo 2 veces más. Las 3 fases de cloroformo se agruparon y secaron a 80 °C bajo una corriente de nitrógeno y se mantuvieron a 4 ° C protegidas de la luz hasta la derivatización.
La derivatización de los ácidos grasos hidrolizados unidos covalentemente se llevó a cabo como se describe para los lípidos extraíbles excepto que se usó cloroformo en lugar de n-heptano. Los ácidos grasos derivados de pbromofenacilo secos se mantuvieron a 4 °C protegidos de la luz hasta el análisis de lípidos libres de RP-HPLC-UV.
El análisis por RP-HPLC-UV de los derivados del éter de p-bromofenacilo de los lípidos unidos covalentemente (definidos como la fracción de ácido micólico en este análisis) se llevó a cabo mediante el uso de un sistema de HPLC Waters Breeze con una bomba binaria y un detector UV de absorbancia de longitud de onda dual. Se usó una columna de separación de fase inversa de 4 micrones (Waters, Nova-Pak, C18 4,6 mm x 150 mm) para separación. Los derivados de ácido micólico de ésterp-bromofenacilo secados se disolvieron en 100 pl de diclorometano, se inyectaron 20 pl en la columna y la detección se realizó a 254 nm. Se usó ácido behénico (C22:0, Sigma-Aldrich) como patrón interno para la cuantificación de lípidos unidos covalentemente. La columna se eluyó mediante el uso de un gradiente de metanol/diclorometano (98 % de metanol/2 % de diclorometano a 20 % de metanol/80 % de diclorometano durante 20 min) a un flujo de 2,5 mL/min. Se usó ácido behénico (C22:00, Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canadá) como estándar interno para cuantificación, y se usaron estándares de ácido micólico alto y bajo internos (generalmente aceptados como ~C40:n y ~C110:n respectivamente, y originalmente suministrados por Corixa Corporation Seattle, Washington, EE. UU.) para estimar la longitud de la cadena de carbonos de los ácidos micólicos en el grupo 1 y grupo 2.
Los resultados de los análisis de lípidos enlazados no covalentemente (extraíbles) y de lípidos enlazados covalentemente para la MpRNC intermedia se muestran en la figura 5a y la figura 5b y en la tabla 5. La figura 5A muestra que los lípidos unidos después de la extracción e hidrólisis están compuestos por una mayoría de ácidos grasos de cadena corta con una longitud de cadena de carbono menor que C22, y que estén presentes los 2 grupos de ácido micólico que son característicos de Mycobacterium phlei.La figura 5B muestra que el lípido hidrolizable obtenido después de la saponificación está compuesto por especies de bajo y alto peso molecular, y que los 2 grupos de ácido micólico se encuentran entre los 2 estándares de ácido micólico (figura 5b). Se determinó que la relación entre el tiempo de retención y la longitud de la cadena de carbono para los estándares de ácido micólico era lineal. Los picos de lípidos obtenidos después de la saponificación se clasificaron como ácidos grasos de cadena corta (definidos en este análisis como el resultado de la descomposición de los ésteres de cera de ácido micólico durante la hidrólisis en ácidos carboxílicos de bajo peso molecular y un alcohol) con un tiempo de elución de 0,5-5 min, grupo de ácido micólico 1 (tiempo de elución de 7-9 min, que comprende ácidos micólicos de entre 45 y 55 carbonos) y grupo de ácido micólico 2 (tiempo de elución de 10,5-13,5 min que comprende ácidos micólicos de entre 70-85 carbonos). Las cantidades de cada una de estas fracciones en el sedimento y el sobrenadante del paso 3 se muestran en la tabla 12
Tabla 12. Lí idos no covalentes unidos covalentemente en M RNC intermedia
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El sedimento de centrifugación a alta velocidad del intermedio MpRNC de la etapa 3 del ejemplo 3, que contenía la composición de MpRNC, contenía lípido extraíble, así como lípido unido covalentemente. El lípido unido covalentemente, que se consideró que representaba los ácidos micólicos, representó el 90 % del lípido total. El sobrenadante de alta velocidad, por el contrario, contenía muy poco lípido unido covalentemente, y la mayor parte del lípido no estaba unido covalentemente (93 %).
En otro experimento, un total de 30 mg de MpRNC intermedia y MCC se secaron bajo una corriente de nitrógeno a 50 ° C, luego se hidrolizaron con 2 mL de reactivo de hidrólisis (50 % p/v de hidróxido de potasio en agua y 50 % de metanol, 1:1, v/v) durante 1 hora a 100 ° C en un tubo de vidrio con una tapa forrada de Teflon® para liberar lípidos unidos covalentemente. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, se añadieron 2 mL de cloroformo seguido de 1,5 mL de reactivo de acidificación (HCl concentrado/metanol (1:1, v/v)). Después de mezclar vigorosamente, los tubos se dejaron reposar durante 5 min para la separación de fases. La fase de cloroformo (fase inferior) se recuperó y se transfirió a un nuevo tubo de vidrio con un tapón revestido con Teflon®. A continuación, la fase acuosa restante se volvió a extraer con 1 ml de cloroformo 2 veces más. Las 3 fases de cloroformo se reunieron y se secaron a 80 °C bajo una corriente de nitrógeno y se pesaron. La extracción se llevó a cabo dos veces y el contenido de lípido fue de 14,1 ± 5,1 mg/30 mg MCC y 9,7 ± 0,14 mg/30 mg de MpRNC intermedia.
La presencia de un contenido de lípidos tan alto (y un contenido de ácido micólico bajo) en el sobrenadante es coherente con la liberación de lípidos que no pertenecen a la pared celular (ácidos grasos extraíbles, no unidos covalentemente y micolatos no unidos covalentemente) después de la alteración de las micobacterias por homogeneización a alta presión, y que se extraen de la composición de la pared celular mediante etapas de centrifugación diferencial a alta velocidad descritas en el ejemplo 3. Este procedimiento, por lo tanto, elimina la necesidad de extracción con disolventes orgánicos o detergentes y el riesgo de contaminación como un medio para reducir el contenido de lípidos de las composiciones de la pared celular micobacteriana. Sin embargo, los ácidos micólicos unidos covalentemente, un componente integral de las paredes celulares micobacterianas, se conservaron mediante el procedimiento de preparación del ejemplo 3, proporcionando así el beneficio de la identificación definitiva de las paredes celulares de una especie micobacteriana dada mediante el análisis de grupos de ácido micólico. EJEMPLO 14
Contenido de ácido diaminopimélico (DAP) y alanina de MpRNC alta, MpRNC intermedia, MpRNC baja y de Mycobacterium phlei esterilizada en autoclave
En este ejemplo, la composición intermedia de MpRNC se usó como un ejemplo representativo de MRNC, y debe tenerse en cuenta que los análisis enseñados en este ejemplo son aplicables a todas las MRNC, y muchas composiciones de BRNC preparadas a partir, de modo no taxativo, de especies de Nocardia, especies de Rhodococcus, y especies de Corynebacteria.
El ácido diaminopimélico (ácido 2,6-diaminoheptanodiótico, DAP) y la alanina (ALA) son componentes principales del peptidoglicano de Mycobacterium phlei.El peptidoglicano es en sí mismo un componente importante de las paredes celulares de las micobacterias. El DAP está involucrado en los enlaces de la cadena interpeptídica y ALA es un componente de la cadena peptídica del peptidoglicano. La medición del contenido de DAP y ALA proporciona así una determinación indirecta del grado de contenido de células micobacterianas intactas, por medio de lo cual el aumento del contenido de células micobacterianas produce una disminución del contenido de DAP. El contenido de DAP y ALA de MpRNC alta, MpRNC intermedia, MpRNC baja y células deMycobacterium phleiesterilizadas en autoclave se determinaron mediante análisis por HPLC. MpRNC alta, MpRNC intermedia, MpRNC baja y células de Mycobacterium phlei esterilizadas en autoclave se diluyeron en agua de grado HPLC a una concentración de 0,2 mg/mL. Una alícuota de 20 |jl de cada preparación de muestra diluida junto con un blanco de hidrólisis respectivo y un control de albúmina de suero bovino se secaron al vacío en tubos de pirólisis y se hidrolizaron a 165 °C durante 60 min usando 6M de vapor de HCl. Se derivatizaron DAP y ALA con carbamato de 6-aminoquiolil-N-hidroisuccinimidilo (AQC) (kit AccQ Fluor Reagent, Waters, Milford, MA, EE.UU.). Se prepararon curvas estándar usando DAP y ALA sintéticos y comercialmente disponibles. Se determinó el contenido de DAP y ALA de MpRNC alta, MpRNC intermedia, MpRNC baja y de células de Mycobacterium phlei esterilizadas en autoclave mediante el uso de muestras por triplicado mediante HPLC (volumen de inyección de 5 jL de cada muestra mediante el uso de una columna ACCQ-Tag Novo-Pak Ci84 jm, 3,9 x 150 mm [Waters] y HPLC Agilent modelo 1100, Santa Clara, CA, EE. UU. equipada con detectores de fluorescencia y UV). Los resultados de las determinaciones del contenido de DAP y ALA se muestran en la tabla 13.
Tabla 13. Contenido de DAP y ALA de MpRNC alta, MpRNC intermedia, MpRNC baja y Mycobacterium hleiesterilizada en autoclave .
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La tabla 13 demuestra que con un número decreciente de células micobacterianas intactas presentes en MpRNC (alta a baja), hay un aumento correspondiente en el contenido de ALA y DAP. Los resultados son coherentes con un aumento en el contenido de peptidoglicano de la pared celular en las composiciones de MpRNC al pasar de MpRNC alta a MpRNC baja concomitante con una disminución de células micobacterianas intactas. La tabla 11 y la tabla 13 juntas también muestran que el aislamiento de una composición de formulación de oligorribonucleótidos/polirribonucleótidos que contiene paredes celulares está asociada con cantidades crecientes de peptidoglicano (según lo determinado por mediciones de DAP y alanina, o por mediciones de alanina (para aquellas bacterias y micobacterias que no contienen DAP) y que cantidades decrecientes de DAP y alanina están asociadas con niveles crecientes de micobacterias intactas. Por lo tanto, tales mediciones pueden usarse para verificar y controlar con precisión el contenido intacto micobacteriano (o bacteriano) de tales composiciones
EJEMPLO 15
Contenido de proteína de MpRNC
El intermedio de MpRNC se usó como un ejemplo representativo de MRNC, y debe tenerse en cuenta que los análisis enseñados en este ejemplo son aplicables a todas las composiciones de MRNC y BRNC.
El contenido de proteína de la MpRNC intermedia preparada como se describe en el ejemplo 3 de la presente invención se comparó con el de las células deMycobacterium phlei. Para garantizar una determinación precisa del contenido de proteínas, las muestras se prepararon como 1 mg/mL de suspensión en agua para inyección y se sometieron a ultrasonicación con sonda para asegurar la alteración de cualquier micobacteria intacta y así asegurar una determinación precisa de proteína. El contenido de proteína se determinó antes y después de la sonicación. Las célulasintactas de M. phlei (cultivadas según el ejemplo 1 de la presente invención usando MCMC-C) y la MpRNC intermedia preparadas según el ejemplo 3 de la presente invención (ambas a una concentración de 1 mg/mL en agua para inyección) se sometieron a sonicación con sonda (Misonix Inc, sonda de % ", ajuste 8, 1-15 min en hielo). Las muestras se extrajeron en varios momentos para el análisis de proteínas usando el procedimiento Macar! Brevemente, el contenido de proteína se determinó mezclando 15 pL deMycobacterium phleio MpRNC intermedia apropiada con 300 pL de solución MACART (L. Gerbaut y M. Macart, Clinical Chemistry (1982) 32, 353-355) en pocillos de placas de microvaloración e incubación durante 5 min a temperatura ambiente, tras lo cual se determinó la DO a 630 nm usando un lector de microplacas. La cantidad de proteína en cada muestra se determinó usando como referencia una dilución en serie de albúmina de suero bovino (2 mg/mL estándar de proteínas, Sigma). Los resultados se muestran en la Tabla 14.
T l 14. n ni r ín M ri m hl i M RN in rm i
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Los datos mostrados en la tabla 14 muestran que la MpRNC intermedia preparada de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3 tenía un contenido de proteína significativamente diferente en comparación con Mycobacterium phlei (13 % p/v frente al 45 % p/v respectivamente), demostrando así que el procedimiento de preparación produce una disminución en el contenido de proteínas en comparación con la biomasa celular de partida. Estos datos muestran también que, sin el uso de un procedimiento de alteración adicional, el contenido de proteína de MpRNC se subestimó en aproximadamente 30 %. El ligero aumento de proteína obtenido después de la sonicación de MpRNC intermedia es coherente con la presencia de 3 compartimentos que contienen proteínas: proteínas de fragmentos de la pared celular accesibles al reactivo de análisis de proteínas, proteínas dentro de los fragmentos de la pared celular que no son accesibles para el reactivo de análisis de proteínas, y proteínas dentro micobacterias residuales intactas, y tampoco son accesibles para el reactivo de análisis de proteínas. Estas proteínas se vuelven accesibles tras la alteración de los fragmentos de la pared celular o de las células mediante sonicación u otros medios. Debe entenderse que el nivel de proteína de MpRNC baja y MpRNC intermedia y MpRNC alta será un reflejo de la proporción de células intactas a fragmentos de pared celular en las respectivas formulaciones.
EJEMPLO 16
MpRNC induce la activación del receptor de patrón molecular asociado a patógenos humanos (PAMP) NOD2
El dominio de oligomerización de unión a nucleótidos 2 (NOD2) es un receptor de reconocimiento de patrones (PRR), uno de una familia diversa de receptores responsables de detectar estándares moleculares asociados a patógenos (PAMP) asociados con patógenos microbianos o estrés celular. NOD2 es un receptor de dipéptido de muramilo (MDP), conocido por ser la estructura mínima del peptidoglicano bacteriano que posee actividad inmunoestimulante. Se sabe que los agonistas de NOD2 MDP activan las células del sistema inmunitario innato (monocitos, macrófagos y células dendríticas), modulan la inflamación, tienen actividad analgésica, poseen actividad anticancerosa, poseen actividad antiinfecciosa, inducen la diferenciación de CD34 de la médula ósea humana células y aumentan la protección de la vacuna a través de su actividad adyuvante inmunitaria. Se ha demostrado que el MDP y y una gran cantidad de análogos y derivados son agentes eficaces para el tratamiento del cáncer y la infección y pueden actuar como adyuvantes de vacunas.
La actividad de activación de NOD2 de MpRNC se evaluó usando células HEK-293 diseñadas para expresar el receptor NOD2 humano y un marcador de señalización corriente abajo IL-8 bajo el control de NF-kB dirigido por NOD2. Debe entenderse que se usa MpRNC como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias. La capacidad de la MpRNC intermedia de activar NOD2 se comparó con el MCC preparado de acuerdo con la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357.
La línea celular humana HEK293-NOD2 (InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) se cultivó y mantuvo en DMEM con alto contenido de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10 % (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá), 100 |jg/mL de Normocin ™ y 10 jg/mL de blasticidina (ambos de InvivoGen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO .2. Las células HEK293-NOD2 se inocularon a 5 x 105 células/mL en un volumen de 0,2 mL en microplacas de tejido de fondo plano de 96 pocillos estériles en el medio de cultivo celular descrito anteriormente, y se incubaron durante 48 horas con 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 jg/mL de MpRNC intermedia o MCC a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Se recogieron los sobrenadantes después de la incubación, se centrifugaron a 4.000 x RCF durante 5 min a 4°C para extraer las células y los desechos y el sobrenadante se almacenó a -20 °C para análisis. Se midió la IL-8 humana en el sobrenadante después de 48 horas de cultivo con una suspensión de MpRNC intermedia mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima comercial (ELISA) de BioSource, Camarillo, CA, EE. UU. Los datos se capturaron de un lector de placas ELISA (ELx-808IU BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) y se expresaron en pg/mL de IL-8 sintetizada.
La tabla 15 muestra que la MpRNC intermedia funciona de manera relacionada con la dosis como un potente agonista de NOD al inducir la liberación de IL-8 en función de NOD2 de manera dependiente de concentración, mientras que el MCC preparado según la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357 era significativamente menos potente como agonista de NOD, con una actividad marginal solo observada a la concentración más alta sometida a prueba.
T l 1. A ivi iv r N D2 l m i i n l r l l r mi ri n
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Está claro que la MpRNC tiene ventajas significativas e inesperadas sobre otras composiciones de pared celular micobacteriana tales como el MCC con respecto a la actividad inmunoestimulante mediada a través del receptor NOD2.
En un estudio separado, se comparó la actividad de activación de NOD2 de MpRNC alta, MpRNC intermedia y MpRNC baja determinando la potencia de MpRNC alta y MpRNC baja en relación con la de MpRNC intermedia. Se determinó la actividad activadora de NOD2 en el intervalo de dosis de 0,625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 y 80 jg/mL como se describió anteriormente, y las potencias relativas se calcularon mediante el uso del software PHARM/PCS versión 4.2 (Microcomputer Specialists, Filadelfia, PA, EE. UU.). Los resultados mostrados en la tabla 16 demuestran que la actividad de activación de NOD2 de MpRNC alta y de MpRNC baja no difiere de la de MpRNC intermedia.
Tabla 16. Las otencias relativas de M RNC alta, intermedia baa ara la activación de NOD2
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Estos datos demuestran que la presencia de niveles variables de micobacterias intactas en las diferentes composiciones de MpRNC no tiene ningún efecto sobre su capacidad para activar NOD2, y que todas las composiciones de MpRNC (alta, intermedia y baja) poseen la misma capacidad para activar este receptor del sistema inmunitario innato. .
EJEMPLO 17
La RNC micobacteriana induce la activación del receptor de patrón molecular asociado a patógenos humanos (PAMP) NOD2
La actividad de activación de NOD2 de las micobacterias RNC preparadas a partir de Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis y Mycobacterium vaccae se comparó con RNC de Mycobacterium phlei usando células HEK-Blue ™ -NOD2 diseñadas para expresar el receptor NOD2 humano (InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) cuya activación impulsa la síntesis del fosfato alcalino embrionario secretor (SEAP) bajo el control de NF-kB impulsado por NOD2. La medición de SEAP en el sobrenadante proporciona una medida de la activación de NOD2.
Debe entenderse que MRNC de Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis y Mycobacterium vaccaese usan como ejemplos representativos de la familia de las micobacterias, y que los principios enseñados y los datos mostrados en este ejemplo son aplicables a las MRNC de otras micobacterias. En este ejemplo se usó la composición de MRNC intermedia deMycobacterium phlei(MpRNC), dada la demostración de la comparabilidad de la actividad entre MpRNC alta, intermedia y baja en el ejemplo 16.
La línea celular HEK293-NOD2 se cultivó y se mantuvo en DMEM con alto contenido de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10 % (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá), 30 pg/mL de blasticidina, 100 pg/mL de Normocin ™ y Zeocin ™ (ambos de InvivoGen) así como 50 U/mL de penicilina y 50 pg/mL de estreptomicina (todos de Wisent) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2. Las células se inocularon a 1 x 105 células/mL en un volumen de 0,2 mL en microplacas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos estériles en el medio de cultivo celular descrito anteriormente, y se incubaron durante 72 horas con 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, y 80 pg/mL de MRNC intermedia. Se recogieron los sobrenadantes para análisis después de incubación, y se centrifugaron a 4.000 x RCF durante 5 min a 4 °C para extraer células y desechos. Se mezclaron veinte pl de sobrenadante con 180 pl de QUANTI-Blue ™ (InvivoGen) en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a 37 °C durante 2 horas. La expresión de SEAP se midió a 630 nm usando un lector de microplacas ELx-808IU (BioTek Instrument, Winooski, VT) usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments). La figura 6 muestra la activación de NOD2 relacionada con la dosis para las cuatro composiciones de MRNC.
Todas las composiciones de MRNC demostraron actividad activadora de NOD2.La RNC de Mycobacterium phlei fue el activador más eficaz de NOD2, seguido deMycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovisBCG y Mycobacterium vaccae. Tanto Mycobacterium bovisBCG comoMycobacterium vaccaemostraron una activación marginal de NOD2 a la dosis más alta probada (80 pg/mL). La potencia de las composiciones de RNC micobacterianas en relación conMycobacterium phleiRNC para la activación de NOD2 se determinó usando PharmPC V4.2 (Microcomputer Specialists, Filadelfia, PA) y se muestra en la tabla 17.
Ta l 17.A iv i n N D2 RN mi ri n n r l i n n M RN M ri m hlei
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EJEMPLO 18
MpRNC induce la activación del receptor de patrón molecular asociado a patógenos humanos (PAMP) TLR2 El receptor tipo Toll 2 (TLR2) es un receptor de reconocimiento de estándares (PRR) responsable de detectar patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) comúnmente asociados con patógenos microbianos. Los componentes estructurales de la pared celular bacteriana y micobacteriana como el peptidoglicano, lipomanano (LM), lipoarabinomanano (LAM), lipoproteínas y lipopéptidos parecen ser en gran parte responsables de la activación de TLR2. Los expertos en la materia saben que TLR2 se expresa en muchas células del sistema inmunitario, incluidos macrófagos, y que los agonistas de TLR2 son capaces de inducir la síntesis de varias quimiocinas y citocinas por parte de tales células. La actividad de activación de TLR2 de la MpRNC intermedia preparada como se describe en el ejemplo 3 de la presente invención y MCC preparada de acuerdo con la patente de los EE. UU. núm. 6.326.357 se compararon usando células HEK293 diseñadas para expresar el receptor TLR2 humano, brindando así un procedimiento conveniente y aceptado para determinar el potencial estimulante inmunitario.
Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de otras micobacterias, así como a la familia de las micobacterias.
] La línea celular humana HEK293-TLR2 se obtuvo de InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU. Las células HEK293-TLR2 se transfectan de manera estable con el gen TLR2 y un gen de fosfatasa alcalina embrionaria secretada impulsada por receptor (SEAP), colocado bajo el control del gen NF-kB. La activación de TLR2 da lugar a la generación de actividad fosfato alcalina en el medio de cultivo celular, que se usa para cuantificar la activación del receptor. Las células se cultivaron y mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10 % (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá) y 1x Normocin ™ (InvivoGen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Las células de HEK293-TLR2 se inocularon a 5 x 105 células/mL en un volumen de 0,2 mL en microplacas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos estériles en medio de detección HEK-Blue™ (InvivoGen), y se incubaron durante 18 horas con 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 pg/mL de MpRNC intermedia o MCC a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. El medio de detección HEK-Blue™ agregado a los pocillos está diseñado para la detección de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina alcalina embrionaria soluble inducida por NF-kB (actividad SEAP). Después de una incubación de 18 horas, se determinó la densidad óptica (que es proporcional a la activación de NF-kB a través de la interacción de TLR2) a 630 nm usando un lector de microplacas (modelo ELx-808IU, BioTek Instrument, Winooski, VT, EE. UU.). Los datos se capturaron usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments).
La tabla 18 muestra la activación de TLR2 (expresada como la DO a 630 nm) y demuestra que la MpRNC intermedia preparada mediante el uso del procedimiento descrito en el ejemplo 3 tiene actividad de activación de TLR2 relacionada con la dosis La determinación de la potencia de MpRNC intermedia en relación con MCC mostró que aunque las actividades eran comparables a las de MCC preparada como se describe en la patente de los EE. Uu . Núm. 6.326.357. MpRNC intermedia era 10,6 veces más potente que MCC como activador de TLR2 (lo que se determinó mediante el uso del software PHARM/PCS versión 4.2, Microcomputer Specialists, Filadelfia, PA, EE. UU.).
Tabla 18. Actividad activadora de TLR2 de M RNC intermedia MCC
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Estos datos, junto con los datos de la evaluación de la capacidad de MpRNC para activar NOD2 como se muestra en el ejemplo 16, demuestran que las composiciones de pared celular de MpRNC poseen actividad agonista dual hacia 2 receptores claves del sistema inmunitario innato, específicamente la capacidad de activar ambos NOD2 y TLR2 sin recurrir al uso de agonistas sintéticos.
EJEMPLO 19
La RNC micobacteriana induce la activación del receptor de patrón molecular asociado a patógenos humanos (PAMP) TLR2
La actividad de activación de TLR2 de las composiciones de RNC micobacterianas preparadas en el ejemplo 4 se determinó mediante el uso del sistema indicador de células HEK-293 diseñado para expresar el receptor TLR2 humano y se comparó con la RNC intermedia de Mycobacterium phlei.
La línea celular humana HEK293-TLR2 se obtuvo de InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU. Las células HEK293-TLR2 se transfectan de manera estable con el gen TLR2 y un gen de fosfatasa alcalina embrionaria secretada impulsada por receptor (SEAP), colocado bajo el control del gen NF-kB. La activación de TLR2 da lugar a la generación de actividad fosfato alcalina en el medio de cultivo celular, que se usa para cuantificar la activación del receptor. Las células se cultivaron y mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10 % (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá) y 1x Normocin ™ (InvivoGen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Las células HEK293-TLR2 se inocularon a 5 x 105 células/mL en un volumen de 0,2 mL en microplacas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos estériles en medio de detección HEK-Blue™ (InvivoGen), y se incubaron durante 18 horas con 2,5, 5, 10, 20, 40 y 80 pg/mL de RNC micobacteriana a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. El medio de detección HEK-Blue™ agregado a los pocillos está diseñado para la detección de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina embrionaria soluble inducida por TLR2/ NF-kB (actividad SEAP). Después de una incubación de 18 horas, se determinó la densidad óptica (que es proporcional a la activación de NF-kB a través de la interacción de TLR2) a 630 nm mediante el uso de un lector de microplacas (modelo ELx-808IU, BioTek Instrument, Winooski, VT, EE. UU.). Los datos se capturaron usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments).
La figura 7 muestra que las 4 RNC micobacterianas indujeron la activación de TLR2 de una manera dependiente de dosis en el intervalo de dosis de 2,5-80 pg/mL.La RNC de Mycobacterium vaccae fue la más activa, seguida en orden decreciente de actividad por parte de r Nc de Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovisBCG y Mycobacterium phlei. La potencia de las composiciones de RNC micobacterianas en relación con RNC de Mycobacterium phlei para la activación de TLR2 se determinó usando PharmPC v4.2 (Microcomputer Specialists, Filadelfia, PA, EE. UU.) y se muestra en la tabla 19.
Ta l 1 .A iv i n TLR2 RN mi ri n n r l i n n M RN M ri m hlei
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El intervalo de potencias observado para la activación de TLR2 ( < intervalo de diferencia de 6 veces) indica que las 4 composiciones de RNC micobacterianas tienen una actividad agonista de TLR2 comparable. Está claro que un experto en la materia al leer este y otros ejemplos en la presente solicitud (por ejemplo, activación de NOD2) hará uso de la combinación más apropiada de actividades estimulantes inmunitarias y función agonista del receptor del sistema inmunitario asociada con una composición de RNC micobacteriana particular. en la determinación de la aplicabilidad de una RNC micobacteriana específica o una combinación de las mismas para una aplicación profiláctica o terapéutica particular o específica.
EJEMPLO 20
Estimulación de TLR por MpRNC intermedia
Los agonistas de TLR2 generalmente se reconocen como asociados con PAMP de la pared celular de bacterias grampositivas y micobacterias. Los agonistas de TLR3 generalmente se reconocen como ARN viral de doble cadena. Los agonistas de TLR4 generalmente se reconocen como lipopolisacárido. TLR5 interactúa específicamente con flagelina bacteriana. Los agonistas de TLR7 y TLR8 generalmente se reconocen como ARN monocatenario. Los agonistas de TLR9 generalmente se reconocen como ADN no metilado que contiene secuencias de dinucleótidos CpG (motivo CpG). El ejemplo 18 mostró que el intermedio de MpRNC estimuló TLR2. La MpRNC intermedia también contiene ARN y ADN (ejemplo 10). Por lo tanto, se determinó la capacidad de MpRNC intermedia para estimular TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 y TLR9 para ver si la presencia de ARN y ADN en MpRNC intermedia provocaba la activación de TLR específicos de ácido nucleico o de cualquier otro TLR. . Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
La actividad estimulante de TLR de MpRNC intermedia se probó en células HEK293 que están diseñadas para expresar un TLR específico (InvivoGen). La activación de un TLR dado da lugar a la síntesis impulsada por NF-kB de SEAP, cuya actividad enzimática se detecta en el sobrenadante como se describe en el ejemplo 19. El tratamiento de las células HEK293 que expresan los diferentes TLR con la MpRNC intermedia se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 18 usando una concentración final de 90 pg/mL. Los agonistas de TLR de control positivo usados en este estudio se muestran en la tabla 20, así como la concentración final usada en el ensayo.
Tabla 20. Controles ositivos a onistas de TLR
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Los resultados de la evaluación se muestran en la tabla 21. Todos los controles agonistas de TLR dieron respuestas positivas. Se observó una estimulación significativa de las células HEK293 que expresan TLR2 con MpRNC intermedia, y aunque se observó cierta estimulación débil de las células HEK293 que expresan TLR3 o TLR5, esta fue significativamente menor que en los respectivos controles positivos. poly(I:C) y flagelina (3 % y 4 % de la actividad de control positivo respectivamente). Posteriormente, se demostró que la estimulación aparente de TLR3 y TLR5 no era reproducible ni estaba relacionada con la dosis, ni activa a las concentraciones de los estándares, y por lo tanto se consideró un artefacto. La MpRNC intermedia no estimuló ningún otro TLR, incluidos TLR7 y TLR8 específicos de ARN, así como el TLR9 específico del motivo CpG de ADN.
Tabla 21. Actividad a onista de TLR de la M RNC intermedia
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Se pueden extraer tres conclusiones de estos datos. Primero, MpRNC solo activa el TLR TLR2; en segundo lugar, la presencia de ARN en MpRNC intermedia no da lugar a la activación de los TLR específicos de ARN TLR3, TLR7 o TLR8; y en tercer lugar, la presencia de ADN en la MpRNC intermedia no da lugar a la activación del receptor TLR9 de CpG, lo que demuestra una ausencia de motivos CpG funcionales en la MpRNC intermedia.
EJEMPLO 21
Impacto de las células intactas de Mycobacterium phlei sobre la actividad inmunoestimuladora de las composiciones de MpRNC
El impacto de la presencia de células intactas de Mycobacterium phlei sobre la actividad inmunoestimuladora de MpRNC preparada como se describe en el ejemplo 2 se determinó usando un ensayo de inducción de citocina/quimiocina. Específicamente, se determinó la actividad inmunoestimulante de las composiciones de MpRNC que contienen diversas proporciones de células deMycobacterium phleiintactas. Debe tenerse en cuenta que este ejemplo se usa como un ejemplo ilustrativo y representativo de la influencia de células micobacterianas intactas sobre la actividad inmunoestimuladora de MRNC. Debe entenderse que se usa MpRNC como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNc de la familia de las micobacterias.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 6 individuos sanos mediante centrifugación por densidad en Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Ste-Anne-de-Bellevue, Quebec, Canadá). La sangre anticoagulada (sal de litio de heparina) se centrifugó a baja velocidad para extraer las plaquetas y las PBMC se aislaron mediante centrifugación en cojín usando Ficoll-Hypaque. Las PBMC aisladas se lavaron mediante centrifugación a baja velocidad (150 x Rc F durante 10 min a 4 ° C) en RPMI 1640 (Wisent Inc., St Bruno, Quebec, Canadá) que contenía suero bovino fetal inactivado con calor al 10 % (Wisent Inc. ) y 10 pg/mL gentamicina (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canadá) y suspendida a una concentración de 5 x 105células viables/mL de medio. Se sembró un ml en los pocilios de las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Las células se dejaron incubar durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. MpRNC intermedia o MpRNC intermedia que contenía cantidades variables de células deMycobacterium phleitratadas con calor (121 ° C, 30 min) a las placas de cultivo de tejidos (concentración final 10 |jg/mL para inducción de IL-10, 1 jg/mL para la inducción de IL-12p40), y las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera de 5 % de CO2durante 48 horas adicionales. Los sobrenadantes se extrajeron, se clarificaron mediante filtración de membrana de 0,2 micrones y los niveles de IL-10 e IL-12p40 se determinaron mediante el kit ELISA (BioSource, Camarillo, CA, EE.UU., números de catálogo KHC0102 y KHC0122, respectivamente) usando los procedimientos recomendados por los proveedores.
Los resultados se muestran en la Figura 8. Se puede ver que la MpRNC intermedia (que contenía un 0,7 % p/p calculado de micobacterias intactas), que contenía distintas proporciones de células de Mycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave (el intervalo sometido a prueba fue 100 % de MpRNC intermedia a 100 % de células de Mycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave para reflejar los niveles potenciales de micobacterias intactas inherentes en los nuevos procedimientos de preparación y composiciones) indujo la producción de IL-10 (panel superior de la figura 8) con una respuesta en forma de campana, estando la proporción óptima de células de Mycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave en el intervalo de aproximadamente 5 a 30 % p/p. Se encontró que la inducción de IL-10 con MpRNC intermedia que contiene células deMycobacterium phlei tratadas intactas esterilizadas en autoclave en una proporción de aproximadamente 5-30 % p/p era más alta que la composición intermedia de MpRNC al 100 % o una composición que comprende 100 % células deMycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave.
La figura 8 (panel inferior) muestra que la composición de MpRNC intermedia que contiene proporciones variables de células de Mycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave (intervalo sometido a prueba: 100 % de MpRNC intermedia hasta 100 % de Mycobacterium phlei intacta esterilizada en autoclave) indujo la producción de IL-12p40 con una respuesta en forma de campana, con la proporción óptima de células de Mycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave en el intervalo de aproximadamente 10-50 % p/p. La inducción de IL-12 con composición de MpRNC intermedia que contenía células deMycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave en una proporción de aproximadamente 10 a 50 % p/p era superior a una composición que comprendía 100 % de MpRNC intermedia o una composición que comprendía 100 % de células deMycobacterium phlei intactas esterilizadas en autoclave.
El análisis de varianza (ANOVA, dos vías sin réplicas) mostró que la proporción de células de Mycobacterium phlei intactas en MpRNC influía significativamente sobre la inducción de citocinas (p<0,025 en un alfa de 0,05), y que los niveles de IL-10 y IL-12 inducidos por MpRNC eran estadísticamente diferentes (p<0,05E-6 en un alfa de 0,05). EJEMPLO 22
MpRNC induce la síntesis de quimiocinas y citocinas en células efectoras inmunitarias
La actividad inductora de quimiocinas y citocinas de MpRNC se analizó mediante el uso de un kit de análisis de quimiocinas/citocinas Milliplex®. Debe entenderse que se usa MpRNC como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
Se aislaron PBMC humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll de sangre completa (13 individuos sanos en total). Se prepararon PBMC en medio RPMI 1640 que contenía un 10 % v/v de suero bovino fetal inactivado con calor (56°C/30 min) (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá) y 50 jg/mL de sulfato de gentamicina (Sigma-Aldrich Canadá, Oakville, Ontario, Canadá). Se inoculó PBMC (1 x 106 células) en un volumen de 1,0 mL en microplacas de fondo plano de 6 pocillos y se incubó a 37 °C/5 % de CO2/100 % de humedad en el medio de cultivo celular descrito anteriormente con o sin (controles no tratados) 160 jg/mL de MpRNC intermedia de concentración final. Los niveles de citocina, quimiocina y factor de crecimiento hematopoyético en el medio de cultivo se midieron después de 48 horas de incubación usando un kit Milliplex® MAP para quimiocinas/citocinas humanas (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU.) en un sistema Bio-Plex 200 (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Los resultados mostrados se expresan como el factor de multiplicación medio en los niveles de quimiocina/citocina frente a la PBMC no tratadas.
Los resultados mostrados en la Tabla 22 demuestran que MpRNC intermedia tiene la capacidad de estimular una variedad de quimiocinas, citocinas y factores de crecimiento celular de las células efectoras inmunitarias presentes en PBMC, demostrando así su capacidad para actuar como un estimulante inmunitario para la inducción de quimiocinas, citocinas y factores de crecimiento celular.
Tabla 22. Inducción de uimiocinas, citocinas factor de crecimiento celular mediante M RNC intermedia
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EJEMPLO 23
Estimulación de la síntesis de GM-CSF, MU-CSF, M-CSF, G-CSF, SDF-1a y LIF en células mononucleares de sangre periférica humana mediante MpRNC
El factor estimulante de colonias múltiples (MU-CSF; también conocido como IL-3), que estimula la diferenciación de células hematopoyéticas pluripotentes en células progenitoras mieloides, además de estimular la producción de eritrocitos, células dendríticas, granulocitos, megacariocitos y monocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF-1a) y factor inhibidor de leucemia (LIF) son factores de crecimiento hematopoyético humanos que muestran una amplia gama de actividades biológicas que incluyen la promoción del crecimiento y la diferenciación celular de diferentes tipos de células diana (células progenitoras), la estimulación de la hematopoyesis y la movilización de células madre. Se determinó la capacidad de la MpRNC intermedia para estimular la síntesis de estos factores de crecimiento a partir de células inmunitarias. Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 6 individuos sanos mediante centrifugación por densidad en Ficoll-Hypaque. Las PBMC se incubaron a 0,5 x 106 células por mL en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos con 1,6-160 pg/mL de MpRNC intermedia (preparadas como se describe en esta solicitud, véase las tablas 2 y 3) durante 48 horas. Los niveles de MU-CSF, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, SDF-la y LIF se midieron después de 48 horas en los sobrenadantes usando un sistema Bioplex® (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá) con microesferas apropiadas y anticuerpos usando reactivos Bi-Rad o Millipore. Se usó un aumento del 50 % en el nivel del factor de crecimiento en el sobrenadante después del tratamiento de la PBMC con MpRNC intermedia frente a células tratadas con control (aumento de > 1,5 veces) para definir un efector estimulador positivo.
La tabla 23 muestra que la MpRNC intermedia indujo una estimulación relacionada con dosis (aumento de >1,5 veces) en la síntesis de todos los factores de crecimiento medidos.
Tabla 23: Estimulación de la síntesis de GM-CSF, MU-CSF, M-CSF, G-CSF, SDF-la y LIF en PBMC humanas por M RNC intermedia
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Los datos de la tabla 23 muestran que la MpRNC estimula la síntesis de factores de crecimiento hematopoyéticos de las células inmunitarias que se encuentran en la sangre periférica, observándose el mayor factor multiplicador con GM-CSF y G-CSF, seguido por el factor de crecimiento pluripotente MU-CSF. M-CSF, SDF-la y LIF también mostraron aumentos por encima del nivel de umbral de respuesta definido.
EJEMPLO 24
Estimulación de la síntesis de GM-CSF, MU-CSF y LIF en células epiteliales del tracto urinario humano normal por MpRNC
Se examinó la capacidad de MpRNC intermedia para estimular la síntesis del factor de crecimiento por células no inmunitarias usando células epiteliales de la vejiga urinaria humana. Estas se usaron como un ejemplo de células epiteliales en general. Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNc , y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
La línea celular epitelial del tracto urinario humano SV-HUC-1 (obtenida de la ATCC, Manassas, VA) se incubó a 1,0 x 105 células por mL de medio de cultivo tisular (según lo recomendado por ATCC) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 0,016-160 pg/mL de concentración final de MpRNC intermedia (preparada como se describe en el ejemplo 3) durante 48 horas. Los niveles de MU-CSF, M-CSF, Gm -CSF, G-CSF, SDF-la y LIF se midieron después de 48 horas en los sobrenadantes usando un sistema Bioplex® (Bio-Rad Laboratories (Canada) Inc., Mississauga, Ontario, Canadá) con microesferas y anticuerpos Milliplex® apropiados (Millipore Corporation, Billerica, Massachussetts, EE. UU.) . Un aumento del 50 % en el nivel del factor de crecimiento frente a las células tratadas con control se usó para identificar la estimulación positiva después del tratamiento con MpRNC intermedia (aumento de > 1,5 veces).
La tabla 24 muestra el aumento en la producción de factor de crecimiento a partir de células epiteliales de vejiga humana normales después del tratamiento con MpRNC intermedia.
Tabla 24: Estimulación de la síntesis del factor de crecimiento en células SV-HUC-1 humanas después del tratamiento con M RNC intermedia
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Los datos de la tabla 24 muestran que el tratamiento de células epiteliales del tracto urinario humano normal con MpRNC intermedia produjo una estimulación relacionada con la dosis de la síntesis de MU-CSF (respuesta en forma de campana), GM-CSF y LIF (respuesta en forma de campana), según lo definido por el valor umbral de incremento de >1,5 veces.
EJEMPLO 25
Estimulación de la síntesis de GM-CSF y MU-CSF en células cancerosas de vejiga humana por MpRNC
La capacidad de MpRNC intermedia para estimular la síntesis del factor de crecimiento en células no inmunitarias se examinó usando células cancerosas de vejiga urinaria humana. Estas se usaron como un ejemplo de células cancerosas en general. Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
Las líneas celulares cancerosas de vejiga humana SV-HUC-2 y T24 (ambas obtenidas de ATCC, Manassas, VA) se incubaron a 1,0 x 105 células por ml en placas de cultivo celular de 96 pocillos (usando el medio de cultivo celular recomendado por la ATCC) con una concentración final de MpRNC intermedia de 0,016-160 pg/ml durante 48 horas. Los niveles de MU-CSF, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, SDF-la y LIF se midieron después de 48 horas en los sobrenadantes usando un sistema Bioplex® (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá) con microesferas apropiadas y anticuerpos usando reactivos Bio-Rad o Millipore. Se usó un aumento del 50 % en el nivel de factor de crecimiento frente a células tratadas con control (aumento de > 1,5 veces) para identificar la estimulación positiva después del tratamiento con MpRNC intermedia.
La tabla 25 muestra el aumento en la producción de factor de crecimiento de las células SV-HUC-2 después del tratamiento con MpRNC intermedia, y la tabla 23 muestra el aumento en la producción de factor de crecimiento de las células T24 después del tratamiento con MpRNC intermedia.
Tabla 25: Estimulación de la síntesis del factor de crecimiento en células SV-HUC-2 humanas después del tratamiento con M RNC
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Es evidente a partir de los datos mostrados en la tabla 26 que la incubación de la línea celular de cáncer de vejiga humana SV-HUC-2 con MpRNC intermedia dio lugar a una estimulación relacionada con la dosis de la síntesis de GM-CSF y MU-CSF.
Tabla 26: Estimulación de la síntesis del factor de crecimiento en células T24 humanas después del tratamiento con
M RNC
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Los datos mostrados en la tabla 26 demuestran que el tratamiento de la línea celular de cáncer de vejiga humana T24 con MpRNC intermedia estimula la inducción de la síntesis de GM-CSF de manera relacionada con la dosis (aumento del 50 % en 1,6 pg/mL de MpRNC y 100 % de aumento en 160 pg/mL de MpRNC). Por lo tanto, MpRNC estimula la síntesis del factor de crecimiento hematopoyético de las células cancerosas.
EJEMPLO 26
Estimulación de factores estimulantes de colonias por MpRNC después de la administración intraperitoneal (IP) en ratones
Este ejemplo sirve para mostrar que la MpRNC intermedia estimula la producción de factores de crecimiento in vivo. Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
Se trataron grupos de 2 ratones hembras C57BL/6 con 1,0 mg/kg de peso corporal de MpRNC intermedia (preparada a una concentración de 1 mg/mL en agua para inyección según se describe en el ejemplo 3) por vía IP. Se determinaron los niveles de factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos (GM-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en el suero usando un sistema Bioplex® con microesferas y anticuerpos apropiados (reactivos Bio-Rad y/o Millipore) 1, 4, 7 y 24 horas después de la inyección. Se usó un aumento del 50 % en el nivel de factor de crecimiento frente a ratones tratados con control (aumento de > 1,5 veces en el nivel umbral) para identificar la estimulación positiva del factor de crecimiento después del tratamiento con MpRNC.
La tabla 27 muestra el aumento en los niveles de GM-CSF y G-CSF en el suero de los ratones tratados en varios momentos después de la inyección de MpRNC intermedia.
Tabla 27. Estimulación de la síntesis de GM-CSF y G-CSF después de la administración IP de MpRNC intermedia a ratones hembra C57BL/6
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Los datos de la tabla 27 muestran que la MpRNC intermedia estimula la síntesis de GM-CSF y G-CSF in vivo, alcanzando un pico a las 4 horas después del tratamiento para GM-CSF y a las 4-7 horas después del tratamiento para G-CSF. Los resultados mostraron que hubo un aumento medio máximo de 56 veces en los niveles séricos de GM-CSF 4 horas después de la inyección de MpRNC intermedia en comparación con los ratones tratados con control, y un aumento medio máximo de 300 veces en los niveles séricos de G-CSF de 4 a 7 horas después de la inyección en comparación con los ratones de control. Estos datos demuestran que la MpRNC intermedia tiene actividad inmunoestimulante (inducción del factor estimulante de colonias)in vivodespués de la administración sistémica.
EJEMPLO 27
Actividad anticancerosa de MpRNC e impacto de células intactas de Mycobacterium phlei
Este ejemplo sirve para demostrar que MpRNC tiene actividad anticancerosa. Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNc , y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias. El impacto de la presencia de células intactas de Mycobacterium phleisobre la actividad anticancerosa de MpRNC intermedia o MpRNC baja como se preparó en el ejemplo 3 (es decir, usando una formulación de pared celular de RNC micobacterianas) se determinó usando un ensayo de inhibición de proliferación de células cancerosas. Debe entenderse que este ejemplo se usa como un ejemplo ilustrativo y representativo de la influencia de células micobacterianas intactas sobre la actividad anticancerosa de MRNC en general.
] Células cancerosas de vejiga humana RT4 (ATCC, Manassas, VA, catálogo núm. HTB-2 ™) se sembraron en placas en medio de cultivo DMEM suplementado con FBS inactivado con calor al 10 % (ambos de Wisent) y 10 pg/mL gentamicina (Sigma-Aldrich) a una concentración de 5 x 105 células/ml en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (volumen de 50 pL), y se dejaron adherir a la superficie de los pocillos durante la noche a una temperatura de 37 ° C en una atmósfera de 5 % de CO2. Se añadieron las células de Mycobacterium phlei esterilizadas en autoclave (121°C, 30 min), la MpRNC intermedia o baja tratada con calor (121 °C, 30 min) o combinaciones de células de Mycobacterium phlei esterilizadas en autoclave mezcladas con MpRNC intermedia o baja esterilizada en autoclave en un volumen de 50 pL de medio de cultivo tisular a las células para dar concentraciones finales de 0,01,0,1, 1,0 y 10 pg/mL de MpRNC. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. La actividad antiproliferativa contra la línea celular de cáncer de vejiga RT4 se determinó usando un ensayo de reducción de MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio). Brevemente, se añadieron 10 pL de una solución MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo después de 48 horas de incubación, y la incubación continuó durante 4 horas más. Luego se detuvo la reacción mediante la adición de 100 pL de isopropanol:HCl (24:1 v/v). La reducción de MTT conduce a la producción de formazán. Se solubilizó formazán mediante el uso de una micropipeta y se determinó la densidad óptica (DO) en un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm frente a controles apropiados. El porcentaje de inhibición de la proliferación celular se determinó mediante la ecuación:
% Inhibición = 100 -[(Prueba DO - Control DO)/Control DO].
Los resultados obtenidos con MpRNC baja (véase el ejemplo 3, tabla 6; la tercera composición) más el contenido controlado de células de Mycobacterium phlei cphlei y la MpRNC intermedia (ejemplo 3, tabla 6; la segunda composición) más el contenido de células controladas de Mycobacterium phlei usando la línea de células cancerosas de vejiga humana RT4 se muestran en las tablas 28 y 29, respectivamente. Las determinaciones de potencia relativas a Mycobacterium phlei se determinaron usando PharmPC v4.2 (Microcomputer Specialists, Filadelfia, PA, EE. UU.).
Tabla 28. Inhibición de la proliferación de células cancerosas de vejiga RT4 por MpRNC baja esterilizada en autoclave,Mycobacterium phleiesterilizada en autoclave o una combinación de MpRNC (baja) esterilizada en l v M ri m hl i riliz n l v n iv r r r i n
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Tabla 29. Inhibición de la proliferación de células cancerosas de vejiga RT-4 por MpRNC intermedia, Mycobacterium ph/eiesterilizada en autoclave o una combinación de MpRNC intermedia esterilizada en autoclave y Mycobacterium h i riliz n l v n v ri r r i n
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Los resultados muestran que MpRNC baja y MpRNC intermedia tienen actividad anticancerosa, y que Mycobacterium ph/eiesterilizada en autoclave (es decir, una preparación que comprende células micobacterianas intactas) tiene menos actividad antiproliferativa contra las células cancerosas de vejiga RT4 que MpRNC que contiene Mycobacterium ph/ei añadida equivalente a eso en MpRNC baja o MpRNC alta. Además, las composiciones de MpRNC conMycobacterium ph/eiintacta tenían una actividad antiproliferativa menor que la óptima. El cálculo de la potencia relativa de MpRNC sin células micobacterianas intactas añadidas en relación con MpRNC con un contenido creciente de células micobacterianas intactas demostró que ambas RNC micobacterianas eran considerablemente más potentes queMycobacterium ph/eiintactas (91 veces y 263 veces para MpRNC baja e intermedia, respectivamente). La adición de células micobacterianas intactas dio lugar a una disminución significativa en la potencia cuando el 10 % p/p o más, y el contenido óptimo de células micobacterianas intactas fue <1,0 % p/p dependiendo del grado inicial de contenido de células micobacterianas intactas (0 % para MpRNC intermedia, y 1 % para MpRNC baja. Las composiciones y formulaciones de MRNC destinadas a aplicaciones anticancerosas se benefician por tanto de un bajo contenido de células micobacterianas intactas.
EJEMPLO 28
Actividad anticancerosa de /a MpRNC intermedia frente a/ carcinoma de pu/món de Lewis
Este ejemplo sirve para demostrar que la MpRNC intermedia posee actividad anticancerosa tanto in vitro como in vivo.Debe entenderse que se usa MpRNC intermedia como un ejemplo de MRNC, y que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
La actividad anticancerosa directa de la MpRNC intermedia preparada de acuerdo con el procedimiento de la presente invención y formulada en agua libre de RNasa se determinó usando la línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC). Las células de LLC se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). La LLC se usa ampliamente en el desarrollo de agentes anticancerosos quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos (véase, por ejemplo,Kimura, Y. New Anticancer agents: In vitro and in vivo evaluation of antitumor and antimetastatic action of various compounds isolated from medicinal plants. in vivo 2005; 19:37-60). Las células de LLC se mantuvieron en medio de DMEM que contenía 10 % v/v de suero bovino fetal inactivado con calor (56 °C durante 30 min) (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá), y 10,0 pg/mL de sulfato de gentamicina (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canadá) a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. Se inocularon las células de LLC en DMEM/10 % de FBS inactivado con calor sin gentamicina a 4,0 x 104 células en un volumen de 0,1 mL en microplacas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos y se añadió suspensión de MpRNC intermedia (0,1 mL) a pocillos por triplicado para dar concentraciones finales de 0,01-100,0 pg/mL. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C, 5 % de CO2. La actividad antiproliferativa de MpRNC se determinó como se describe para la línea celular de cáncer de vejiga RT4 (reducción de formazán) en el ejemplo 27. Los resultados se muestran en la tabla 30.
T l . Inhi i i n l r lif r i n l l r LL r M RN in rm i
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Los resultados mostrados son la media ± DE de 2 experimentos.
Los resultados que se muestran en la tabla 30 demuestran que la MpRNC tiene actividad anticancerosa relacionada con la dosis contra células de LLC, según se determina mediante la medición de la inhibición de la proliferación. El ejemplo 27 y este ejemplo (ejemplo 28) demuestran por lo tanto que la actividad anticancerosa directa de MpRNC no es de tipo de célula cancerosa y, por extensión, no es específica del cáncer.
Las metástasis en sitios distantes son la principal causa de mortalidad asociada al cáncer (Kim y col., Carcinoma produced factors activate myeloid cells via TLT2 to stimulate metastasis. Nature 2009;457:102-106). Pueden producirse metástasis hepáticas experimentales mediante la inyección de células de LLC en el bazo (Ligo y col.,Therapeutic activity and tissue distribution of ME2303, a new anthracycline containing fluorin, and its metabolites in mice bearing hepatic metastases of Lewis lung carcinoma. Anti-Cancer Drugs 1990;1:77-82 and Alino et al Morphofunctional study of vascular fluorochrome delivery to lung and liver metastases of Lewis lung carcinoma (3LL), Tumori 1991;77:206-211). Los loci tumorales inducidos en el hígado por la inyección intraesplénica de células de LLC se consideran un modelo de diseminación metastásica al hígado, y donde el número de focos tumorales aumenta al bloquear la actividad de las células de Kupffer (macrófagos especializados que recubren los sinusoides del hígado) con carragenina. Por tanto, este modelo proporciona una herramienta útil para estudiar diferentes aspectos de las metástasis hepáticas, (Kopper y col., Experimental model for liver metastasis formation using Lewis lung tumor. J. Cancer Res y Clin. Oncol. 1982;103:31-38). El objetivo de los siguientes estudios fue determinar la eficacia de la suspensión de MpRNC, después de la administración intravenosa (IV), como tratamiento para las metástasis hepáticas experimentales inducidas por la inyección intraesplénica de células LLC en C57BL/6 ratones.
Las células de LLC se mantuvieron en medio DMEM que contenía un 10 % v/v de suero bovino fetal inactivado con calor como se describe anteriormente. Las células se pasaron en serie cada 3-4 días y se usaron en los pases 2-3. Las células se recolectaron, mediante tripsinización (4 min a 37 ° C), se lavaron dos veces en medio DMEM sin suero bovino fetal y sulfato de gentamicina, se centrifugaron a 250 x g durante 5 min a 4 ° C y el sedimento celular se suspendió en medio DMEM sin suero bovino fetal y sulfato de gentamicina. El número de células se ajustó a la concentración requerida después de determinar la viabilidad celular usando exclusión con azul de tripano y recuento en un hemacitómetro. Las células se mantuvieron en hielo hasta la inyección intraesplénica.
Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6, de 10 a 12 semanas de edad, de Charles River Laboratories Ltd., St. Constant, Quebec, Canadá. Esta cepa de ratón es singénica para las células de LLC. Se indujeron metástasis hepáticas mediante inyección intraesplénica, bajo anestesia general, de células de LLC (1,0-3,0 x 105 células de LLC en un volumen de 100 j L). Se extirpó el bazo después de la inyección de células cancerosas. En primer lugar se examinó el efecto de tratar a los ratones antes de la inyección de LLC (tratamiento profiláctico) o después de la inyección de células de LLC (tratamiento terapéutico). Se inyectó MpRNC intermedia 1 día antes (régimen profiláctico), los días 2, 5, 7, 9 y 12 (régimen terapéutico), o los días -1,2, 45, 7, 9 y 12 (régimen profiláctico y terapéutico) después de la inyección de células LLC usando grupos de 10 ratones. La MpRNC intermedia formulada en agua para inyección libre de RNasa como se describe en el ejemplo 3 se administró en un volumen de dosis de 100 j L, correspondiente a una dosis de 5 mg/kg de peso corporal. El número de metástasis hepáticas se determinó el día 15 después de la inyección de células de lLc . Los resultados (tabla 31) muestran que el protocolo de administración terapéutica profiláctica fue el régimen de tratamiento más eficaz, seguido del régimen de tratamiento profiláctico, y el régimen de tratamiento terapéutico fue el menos eficaz. Por tanto, una combinación de terapia profiláctica y terapéutica es la más eficaz para el tratamiento de las metástasis hepáticas de LLC.
T l 1. Tr mi n m i h i LL x rim n l m i n M RN in rm ia
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Estos datos demuestran que el uso de MRNC intermedia como terapia única o en entornos neoadyuvantes y adyuvantes para el tratamiento del cáncer sería beneficioso para reducir los tumores resultantes de la metástasis del carcinoma primario. Los resultados que se muestran en la Tabla 31 son coherentes con la activación de los mecanismos de defensa del huésped en el órgano diana antes de la exposición a las células cancerosas (actividad profiláctica), lo que da lugar a una disminución de la inoculación de células tumorales en el hígado, así como un efecto terapéutico sobre las células cancerosas tras su implantación inicial en el órgano diana (actividad terapéutica). La demostración del anticanceroso directo hacia las dianas celulares de LLC demostradas en la Tabla 30 respalda este modo de acción.
Se realizó un segundo estudio para determinar el efecto del tratamiento de suspensión de MpRNC intermedia en metástasis hepáticas de LLC usando el régimen profiláctico/terapéutico en un mayor número de animales. Se establecieron metástasis hepáticas de LLC experimentales como se describió anteriormente usando grupos de 20 ratones, y se llevó a cabo un tratamiento profiláctico/terapéutico con MpRNC intermedia a una dosis de 5 mg/kg peso corporal.
TLos resultados de este estudio mostraron que hubo 141 ± 72 (media ± DE) metástasis en el grupo de control, y que al usar un protocolo de tratamiento profiláctico y terapéutico como se describe anteriormente, el tratamiento de MpRNC intermedia redujo significativamente el número de metástasis a 62 ± 41 (media ± DE, p < 0,0002, prueba U de Mann-Whitney), demostrando así una actividad anticancerosa significativa in vivo frente a metástasis hepáticas inducidas experimentalmente. Por lo tanto, la actividad anticancerosa demostrada contra las células de LLCin vitrose confirma como una medida predictiva del efecto inhibidor contra el desarrollo de metástasis hepáticasin vivo.
EJEMPLO 29
Actividad anticancerosa de RNC micobacterianas
Este ejemplo sirve para demostrar que las MRNC poseen actividad anticancerosa. Debe entenderse que los principios enseñados en este ejemplo son aplicables a MRNC de la familia de las micobacterias.
Se determinó la actividad anticancerosa de las RNC micobacterianas preparadas en los ejemplos 3 y 4 usando un ensayo de inhibición de la proliferación de células cancerosas. Los expertos en la materia reconocen que se sabe que tales estudios predicen la actividad anticancerosain vivo.En este ejemplo, las líneas celulares de cáncer de vejiga se usaron como representativas de las líneas celulares cancerosas en general, y debe entenderse que un experto en la materia apreciará inmediatamente que los estudios de actividad anticancerosa que usan tales líneas celulares cancerosas pueden extrapolarse fácilmente a otras líneas de células cancerosas.
En el ejemplo, se usó un total de cuatro células cancerosas de vejiga humana, y todas se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). El cultivo de las líneas celulares se llevó a cabo según lo recomendado por la ATCC. Los detalles de las líneas celulares de cáncer de vejiga se muestran en la tabla 32.
T l 2. r rí i l lín l l r l n r v i
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Las células de la línea de cáncer de vejiga se sembraron en placas en medio de cultivo de DMEM suplementado con FBS al 10 % inactivado con calor (ambos de Wisent) y 10 pg/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich) a una concentración de 5 x 105células/ml en placas de cultivo tisular de 96 pocilios (volumen de 50 j L), y se dejaron adherir a la superficie de los pocillos durante la noche a una temperatura de 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. Se añadió a las células RNC intermedia micobacteriana preparada como se describe en el ejemplo 3 y el ejemplo 4 en un volumen de 50 j l de medio de cultivo tisular para dar concentraciones finales de 0,0016, 0,016, 0,16, 1,6, 16 y 80 jg/mL de MpRNC. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. La actividad antiproliferativa se determinó usando un ensayo de reducción de MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio). Brevemente, se añadieron 10 jL de una solución MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo después de 48 horas de incubación, y la incubación continuó durante 4 horas más. Luego se detuvo la reacción mediante la adición de 100 jL de isopropanol:HCl (24:1 v/v). La reducción de MTT conduce a la producción de formazán. El formazán se solubilizó mediante el uso de una micropipeta y se determinó la densidad óptica (DO) usando un lector de microplacas ELx-808IU (BioTek Instrument, Winooski, VT, EE. UU.) usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments) a una longitud de onda de 570 nm contra controles apropiados. El porcentaje de inhibición de la proliferación celular se determinó mediante la ecuación:
% Inhibición = 100 -[(Prueba DO - Control DO)/Control DO].
La potencia de las composiciones de MRNC se determinó usando PharmPC v4.2 (Computer Associates, Filadelfia, PA)
Los resultados obtenidos con la MRNC usando las cuatro líneas celulares de cáncer de vejiga humana se muestran en la tabla 33. Todas las composiciones de MRNC demostraron actividad antiproliferativa dependiente de la dosis contra las líneas celulares de cáncer de vejiga. La MbRNC de la cepa BCG deMycobacterium bovisfue la menos eficaz, demostrando una actividad antiproliferativa relacionada con la dosis, con una inhibición de -20-40 % (dependiendo de la línea celular de cáncer de vejiga) a la dosis más alta probada. Todas las demás MRNC demostraron actividad antiproliferativa relacionada con la dosis, con una inhibición de aproximadamente35-70 % (dependiendo de la línea celular de cáncer de vejiga) a la dosis más alta probada. Por esta razón, se determinó la potencia de las diferentes MRNC en relación con las MRNC de la cepa BCG deMycobacterium bovis, y los resultados se muestran en la tabla 33.
T l . P n i ni r lif r iv MRN n r l i n n M RN M ri m vi B
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La MRNC más potente para la inhibición de la proliferación del cáncer de vejiga fue el obtenida de Mycobacterium vaccae, seguida en orden decreciente de potencia por MpRNC deMycobacterium phlei, MsRNC de Mycobacterium smegmatis, y MbRNC de Mycobacterium bovis cepa BCG. Se mantuvo la magnitud y el orden de potencia de las composiciones de RNC micobacterianas para las 4 líneas celulares de cáncer de vejiga, independientemente de su origen (grado bajo, grado alto) o estado mutacional, siendo la MvRNC de Mycobacterium vaccaey la MpRNC de Mycobacterium phlei unas -6800 veces y -4000 veces más potentes respectivamentegue la MbRNC de Mycobacterium bovisBCG.
Debe tenerse en cuenta que este ejemplo enseña tres principios importantes. En primer lugar, las MRNC preparadas a partir de especies micobacterianas dispares (patógenas, no patógenas, de crecimiento rápido, de crecimiento lento) poseen actividad anticancerosa y, por tanto, dicha actividad es aplicable a las MRNC preparadas a partir de especies miembros de la familia de las micobacterias. En segundo lugar, el estado mutacional de la diana de la célula cancerosa no parece jugar un papel en la determinación de la actividad anticancerosa. De hecho, se observa una actividad anticancerosa significativa con líneas de células cancerosas que poseen genotipos resistentes al tratamiento conocidos (mutaciones p53 y p21) y fenotipos MDR (por ejemplo, HT1376). Los expertos en la materia saben que tales mutaciones y fenotipos de resistencia son característicos del cáncer en general, y no se limitan a las células cancerosas de vejiga, y apreciarán que la actividad anticancerosa de MRNC es, por tanto, aplicable a muchos otros tipos de cáncer. En tercer lugar, la MRNC preparada a partir de tres especies micobacterianas de crecimiento rápido es más eficaz que la MRNC preparada a partir de una especie micobacteriana de crecimiento lento como la cepa BCG deMycobacterium bovis.
EJEMPLO 30
Preparación de la composición que contiene ARN de Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis (MapRNC) y determinación de la actividad anticancerosa
En este ejemplo, las células intactas de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis se lavan primero mediante centrifugación a baja velocidad para extraer los componentes del medio de cultivo, y luego se alteran usando homogeneización a alta presión con un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5 como se describe en el ejemplo 3. Después de la homogeneización a alta presión, las micobacterias intactas restantes se extraen mediante centrifugación diferencial usando fuerzas centrífugas relativas que están optimizadas para la extracción controlada de cualquier micobacteria residual, intacta y no alterada. La fracción agotada de células micobacterianas, que comprende ácidos nucleicos de la micobacteria asociados con fragmentos de pared celular micobacteriana y las cantidades deseadas y controladas de células micobacterianas intactas para una actividad anticancerosa óptima, se purifica aún más mediante lavado por centrifugación a una fuerza centrífuga relativa más alta, para extraer los contaminantes solubles. La MapRNC se aisló como un sedimento después del lavado por centrifugación a una fuerza centrífuga relativa alta. La MapRNC se trata luego con calor a 121 ° C durante entre 5 y 30 minutos. La actividad anticancerosa de MapRNC se determina usando líneas de células cancerosas representativas de los principales tipos de células cancerosas, como se describe en los ejemplos 8 y 9. Los resultados muestran que la MapRNC tratada con calor tiene actividad antiproliferativa relacionada con la dosis contra líneas celulares cancerosas y contra metástasis hepáticas. . EJEMPLO 31
Actividad anticancerosa del ARN total de Mycobacterium phlei
La actividad biológica de una preparación de ARN total a partir de células de Mycobacterium phlei se determinó usando un ensayo de proliferación de células cancerosas. El ARN se preparó usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante después de la lisis celular en FastRNA Blue-Tubes (Bio-101 Inc.) usando un aparato batidor de microesferas FastPrep FP120 (Savant, Thermo- Fisher, Nepean, ON, Canadá) durante 1 min a nivel 4,5. A continuación, la preparación de ARN se trató con reactivo "libre de ADN" para extraer el ADN genómico residual de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ambion, Austin, TX, EE. UU.). RT4 (catálogo ATCC núm.HTB-2) y HT1376 células cancerosas de vejiga humana (catálogo ATCC núm. CRL-1472) se sembraron en medio de cultivo DMEM suplementado con FBS al 10 % (ambos de Wisent) y 10 pg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich) a una concentración de 2 x 105 células/ml en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (volumen de 50 pL), y se dejaron adherir a la superficie de los pocillos durante la noche a una temperatura de 37 ° C en una atmósfera de 5 % c O 2. Se añadió el a Rn total en un volumen de 50 pL de medio de cultivo tisular al medio de cultivo para dar concentraciones finales de 0,01, 0,1, 1,0 pg/mL de RNA. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. La actividad antiproliferativa contra las líneas celulares cancerosas se determinó usando un ensayo de reducción de MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio). Brevemente, se añadieron 10 pL de una solución MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo después de 72 horas de incubación, y la incubación continuó durante 4 horas más. Luego se detuvo la reacción mediante la adición de 100 pL de isopropanol:HCl (24:1 v/v). La reducción de MTT conduce a la producción de formazán. Se solubilizó formazán mediante el uso de una micropipeta y se determinó la densidad óptica (DO) en un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm frente a controles apropiados. El porcentaje de inhibición de la proliferación celular se determinó mediante la ecuación:
% Inhibición = 100 -[(Prueba DO - Control DO)/Control DO].
Los resultados muestran una actividad anticancerosa moderada del ARN total de Mycobacterium phlei contra HT1376 con una actividad inhibitoria del 2,2 %, 7,1 % y 6,8 % a 0,1 pg/mL, 1,0 pg/mL y 10,0 pg/mL de ARN, respectivamente, y una actividad ligeramente más inhibitoria contra RT4 con una inhibición de proliferación de 3,1 %, 7,6 % y 18,6 % a 0,1 pg/mL, 1,0 pg/mL y 10,0 pg/mL de ARN, respectivamente. Cuando se compara con los resultados obtenidos en el ejemplo 27 o el ejemplo 29, donde el ARN micobacteriano estaba en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos formulados con una pared celular micobacteriana, está claro que se pueden obtener ventajas distintas e inesperadas con respecto a la actividad biológica cuando se usa una composición de ARN de pared celular micobacteriana (u otros portadores farmacéuticamente aceptables tales como quitosano o liposomas catiónicos).
EJEMPLO 32
Determinación del índice de potencia integrado de la pared celular micobacteriana RNC
Las RNC de pared celular micobacteriana (MRNC) de la presente invención tienen la capacidad de estimular el sistema inmunitario a través de 2 sistemas de receptores distintos e inhibir la división de células cancerosas, y por tanto son composiciones terapéuticas trifuncionales. Usando los datos de los ejemplos 29, 17 y 19 (potencia antiproliferativa, potencia de activación de NOD2 y potencia de activación de TLR2 respectivamente), se determinó un índice de potencia integrado para la MpRNC intermedia, MsRNC intermedia y MvRNC intermedia en relación con la MbRNC intermedia como un medio para integrar las actividades generales contra el cáncer e inmunoestimulantes. Debido al amplio intervalo de valores numéricos para las potencias relativas entre los diferentes ensayos (>3 magnitudes), se usó una transformación de logaritmo natural (log) en esta determinación y se sumaron los valores para cada actividad. A MbRNC se le asignó una potencia de 1 y se determinó la potencia de las otras MRNC en relación con MbRNC. Debe entenderse que el logaritmo natural de 1 es 0. Los resultados se muestran en la tabla 34.
Tabla 34. Índice de otencia inte rado de MRNC intermedia.
Figure imgf000060_0001
Está claro que aunque todas las MRNC tenían potencias similares y comparables con respecto a la activación de TLR2, MpRNC, MsRNC y MvRNC eran todas más potentes que MbRNC con respecto a la actividad anticancerosa. Sin embargo, MpNAC fue la MRNC más potente con respecto a la activación de NOD2. La determinación del índice de potencia integrada mostró que MpRNC tiene la potencia general más alta, seguida, en orden descendente, MvRNC, MsRNC y MbRNC.
EJEMPLO 33
Preparación de composiciones de MpRNC con cantidades controladas de células micobacterianas intactas para la estimulación inmunitaria.
MpRNC se prepara convenientemente con cantidades controladas de micobacterias intactas esterilizadas en autoclave preparando MpRNC baja (como se detalla en el ejemplo 2 y el ejemplo 3) y añadiendo células micobacterianas intactas esterilizadas en autoclave a MpRNC para dar la proporción deseada óptima para la inducción de respuestas inmunitarias. Generalmente, los inventores han descubierto que la proporción óptima de células intactas deMycobacterium phleinecesarias para inducir una respuesta inmunitaria está dentro del intervalo de aproximadamente 5-50 % por peso, tales proporciones dan lugar a una actividad inmunoestimuladora óptima.
EJEMPLO 34
Preparación de composiciones de MRNC con cantidades controladas de células micobacterianas intactas para la estimulación inmunitaria.
MRNC se prepara convenientemente a partir de una determinada especie micobacteriana de la familia mycobacteriaceae, tal como, pero limitada a Mycobacterium bovis, cepa BCG, Mycobacterium avium subcepa paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis o Mycobacterium vaccae, preparando MRNC baja (como se describe en el ejemplo 3 para MpRNC intacta) y añadiendo células micobacterianas intactas esterilizadas en autoclave a MRNC para dar la proporción deseada óptima para la inducción de respuestas inmunitarias. Generalmente, los inventores han descubierto que la proporción óptima de células micobacterianas intactas necesarias para inducir una respuesta inmunitaria está dentro del intervalo de aproximadamente 5-50 % en peso, dando lugar tales proporciones a una actividad inmunoestimuladora óptima.
EJEMPLO 35
Tratamiento de MpRNC con ribonucleasa-A
El tratamiento de MpRNC con ribonucleasa (por ejemplo, las condiciones de digestión enzimática descritas en el ejemplo 10) da lugar a una reducción significativa en la cantidad de ARN contenido en una composición de MRNC o MpRNC. Tales reducciones reducen significativamente la capacidad de MRNC o MpRNC para actuar como agentes terapéuticos.
La MpRNC intermedia se preparó como se describe en el ejemplo 3, excepto que antes de los dos ciclos finales de homogeneización a alta presión, el sedimento de MpRNC intermedia lavado se resuspendió en agua para inyección con o sin RNasa A (Sigma, concentración final de 10 pg/mL; MpRNC-RNasa y MpRNC-Control respectivamente) durante 3 horas a 37 ° C. Las MpRNC se lavaron a continuación mediante centrifugación a alta velocidad para extraer la RNasa A y se resuspendieron en agua para inyección a una concentración de 1 mg/mL. Las suspensiones se homogeneizaron posteriormente y se esterilizaron terminalmente. La actividad anticancerosa de MpRNC-RNasa y MpRNC control se determinó usando las líneas celulares de cáncer de vejiga HT1376 y RT-4 como se describe en el ejemplo 27. La potencia relativa de las dos formulaciones de MpRNC se calculó a partir de la parte lineal de la curva de dosis-respuesta usando PharmPC v4.2 (Microcomputer Specialists, Filadelfia, PA, EE. UU.).
Ambas formulaciones de MpRNC inhibieron la proliferación de células cancerosas de vejiga HT1376 y RT-4 de una manera relacionada con la dosis (tabla 35 y 36 respectivamente). Sin embargo, el tratamiento con RNasa dio lugar a una reducción en la actividad antiproliferativa de MpRNC hacia ambas líneas celulares de cáncer de vejiga.
Tabla 35. El tratamiento con RNasa reduce la actividad antiproliferativa de MpRNC hacia las células cancerosas de v i HT1 7
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Tabla 36. El tratamiento con RNasa reduce la actividad antiproliferativa de MpRNC hacia las células cancerosas de v i RT-4
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La potencia antiproliferativa de MpRNC intermedia-RNasa tratada en relación con MpRNC intermedia-Control tratada contra las líneas celulares de cáncer de vejiga HT-1376 y RT-4 se muestra en la tabla 37.
Tabla 37. El tratamiento con RNasa reduce la otencia anticancerosa de M RNC intermedia
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La extracción de ARN en la MpRNC intermedia como resultado del tratamiento con RNasa dio lugar a una reducción considerable de la potencia anticancerosa (4 y 7 veces para las células cancerosas de vejiga HT1376 y RT-4, respectivamente), lo que demuestra que la preservación del ARN en MpRNC es un requisito para una actividad anticancerosa óptima.
EJEMPLO 36
Formulación de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC con liposomas catiónicos y determinación de actividad anticancerosa
Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en condiciones asépticas estériles. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se preparan mediante la alteración de bacterias intactas, micobacterias oM phleimediante homogeneización a alta presión, extracción de bacterias noalteradas, micobacterias o M. phlei mediante centrifugación a baja RCF y extracción de la composición de RNC usando precipitación de fenol/cloroformo/isoamilo con alcohol y etanol. El ARN extraído en la composición de RNC se reduce en longitud de cadena mediante tratamiento con calor a 121 ° C durante 5 min para preparar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que contienen entre aproximadamente 20-40 bases. Se preparan liposomas catiónicos compuestos de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina/1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOPE/DOTAP) en la relación molar 1:1 disolviendo el fosfolípido y el lípido catiónico en cloroformo anhidro (1 mg/mL) seguido de evaporación rotatoria a presión reducida en matraces de fondo redondo para formar una fina película de fosfolípidos/lípidos. Los liposomas de control se preparan mediante la adición del volumen requerido de NaCl (0,85 % p/v) a la película fina de fosfolípidos y agitación a 65 °C para formar liposomas. Los liposomas catiónicos que contenían BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se prepararon mediante la adición de una solución de NaCl que contenía BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC a una concentración de 0,1 mg/mL a la película fina de fosfolípidos/lípidos, y agitación a 65 °C para formar liposomas. Los liposomas catiónicos que contienen BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC tendrán un diámetro medio de aproximadamente 825 nm y un potencial Z de aproximadamente 36 mV. La inhibición del melanoma de murino B16 del ensayo de proliferación se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 27, mediante el uso de un intervalo de concentración de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC liposomales de 0,01 a 10|jg/mL. Las incubaciones de control se realizan usando las concentraciones correspondientes de liposomas catiónicos de control o de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC no liposomales. La reducción de MTT se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 27, y se determina la cantidad de inhibición de la proliferación celular. Los resultados muestran que los liposomas catiónicos que contienen BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC inhiben la proliferación de células de melanoma B16 de una manera dependiente de la dosis y que los liposomas catiónicos solos no tienen actividad inhibidora. La actividad inhibidora de los liposomas catiónicos que contienen BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC es significativamente mayor que BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC solas. Estos datos demuestran que una formulación de liposomas catiónicos actúa como un sistema de administración farmacéutica para BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC.
Debe entenderse que el ARN puede aislarse de bacterias gramnegativas y grampositivas y micobacterianas, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis y Mycobacterium vaccae, y formularse con los liposomas catiónicos como se describe en este ejemplo sin agregar las paredes celulares de estas especies.
Debe tenerse en cuenta que las células de melanoma B16 se usan en este ejemplo como representativas de una célula cancerosa típica, y que los liposomas catiónicos se usan en este ejemplo como un sistema de suministro farmacéutico típico para Na , y que un experto en la materia apreciará la aplicabilidad usando tales tipos de sistemas de administración y formulaciones farmacéuticas en el tratamiento del cáncer en general.
EJEMPLO 37
Formulación de BRNC, MRNC, MRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC con nanopartículas de quitosano y determinación de la actividad anticancerosa
Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en condiciones asépticas estériles. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC se preparan alterando bacterias intactas, micobacterias oM. phleimediante homogeneización a alta presión, eliminando bacterias noalteradas, micobacterias o M. phlei mediante centrifugación a baja RCF y extrayendo el ARN usando precipitación de fenol/cloroformo/isoamilo con alcohol y etanol. El ARN extraído se reduce en longitud de cadena mediante esterilización en autoclave a 121 ° C durante 5 min para preparar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que contienen entre aproximadamente 20-40 bases. Se prepararon nanopartículas de quitosano mezclando volúmenes iguales de tripolifosfato (0,5 mg/mL en agua) y quitosano (peso molecular promedio de 500.000, concentración de 1 mg/mL en agua) durante 2 min a 20 °C para formar nanopartículas de quitosano de control o mediante la mezcla de volúmenes iguales de oligorribonudeótidos y polirribonucleótidos bacterianos, micobacterianos o M. phlei (BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC, 0,5 mg/mL en agua) y quitosano (peso molecular promedio de 500.000, concentración de 1 mg/mL en agua) durante 2 min a 20°C. La incorporación de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en las nanopartículas de quitosano es 100 %. Las nanopartículas de quitosano se lavan mediante centrifugación y se determina su tamaño y potencial Z (una medida indirecta de la carga superficial de las partículas). Las nanopartículas de quitosano tienen un tamaño en el intervalo de aproximadamente 200 a 1000 nm y un potencial Z de aproximadamente -20 a -35 mV. Las células de melanoma B16 se cultivan hasta la confluencia en MEM suplementado con aminoácidos no esenciales MEM, gentamicina (50 pg/mL) y 10 % v/v de suero fetal inactivado con calor a 37 ° C y 5 % de CO2. Las células se recogieron por tripsinización, se resuspendieron en medio de cultivo tisular MEM y se sembraron en los pocillos de placas de cultivo tisular (placas de 96 pocillos, 100 pL que contenían 5 x 103células) y se dejaron adherir durante 3 horas a 37 ° C en 5 % de CO2. Las nanopartículas de quitosano que contienen b RNc , MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC and MvRNC se añaden a continuación a las células de melanoma B16 (ATCC) para dar una concentración final de BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC en el intervalo de 0,001 a 100 pg/mL. Se añaden nanopartículas de quitosano de control o BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC sin nanopartículas de quitosano a las células de melanoma B16 para dar concentraciones comparables a las de quitosano de Br NC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC. Las células de melanoma murino B16 se incuban durante 48 horas a 37°C/5 % de CO2y el crecimiento celular durante este tiempo se determina usando un ensayo de reducción de MTT. El nivel de MTT reducido, que corresponde al número de células viables, se determina a 570 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados muestran que las nanopartículas de quitosano que contienen BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC inhiben la proliferación de células de melanoma B16 de manera dependiente de la dosis, que las nanopartículas de quitosano por sí solas no tienen actividad inhibidora y que la actividad inhibidora de las nanopartículas de quitosano que contienen BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC son significativamente mayores que Br Nc , MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC solas. Estos datos demuestran que una formulación de nanopartículas de quitosano actúa como un sistema de administración farmacéutica para b RnC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC y MvRNC.
Debe entenderse que el ARN puede aislarse de bacterias gramnegativas y grampositivas y de micobacterias, Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis y Mycobacterium vaccae, y formularse con las nanopartículas de quitosano como se describe en este ejemplo sin agregar las paredes celulares de estas especies.
Debe tenerse en cuenta que se usan células de melanoma B16 en este ejemplo de una célula cancerosa típica, y que las nanopartículas de quitosano se usan en este ejemplo como un sistema de administración farmacéutica típica para NA, y que un experto en la materia apreciará la aplicabilidad usando tales tipos de sistemas de administración y formulaciones farmacéuticas en el tratamiento del cáncer en general.
EJEMPLO 38
Preparación de la composición que contiene ARN de Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosis (MapRNC)
En este ejemplo, las células intactas de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis se lavan primero mediante centrifugación a baja velocidad para extraer los componentes del medio de cultivo, y luego se alteran usando homogeneización a alta presión con un homogeneizador a alta presión Avestin EmulsiFlex-C5. Después de la homogeneización a alta presión, las micobacterias intactas restantes se eliminan mediante centrifugación diferencial usando fuerzas centrífugas relativas que están optimizadas para la extracción controlada de cualquier micobacteria residual, intacta y no alterada. La fracción desprovista de células micobacterianas, que comprende ácidos nucleicos de la micobacteria asociados con fragmentos de pared celular micobacteriana y las cantidades deseadas y controladas de células micobacterianas intactas, se purifica adicionalmente mediante lavado por centrifugación a una fuerza centrífuga relativa más alta, para extraer contaminantes solubles. La fracción desprovista de células micobacterianas se aisló como un sedimento después del lavado por centrifugación a una fuerza centrífuga relativa alta. La fracción micobacteriana desprovista en células se trata a continuación con calor a 121 ° C durante entre 5 y 30 minutos y se usa como RNC micobacteriana deMycobacterium avium paratuberculosis(MapRNC).
EJEMPLO 39
Análisis de ácidos nucleicos en MapRNC
En este ejemplo, se determinan el tipo de ácido nucleico, la longitud de la cadena de oligorribonucleótidos y el contenido de MapRNC . Los experimentos se realizaron como se describe en el ejemplo 38. Los ácidos nucleicos se extraen mediante el siguiente procedimiento. Una alícuota de la 700 pL a una concentración de 1 mg/ml) se digiere con lisozima libre de DNasa y RNasa, seguida de inactivación y digestión adicional con proteinasa K libre de DNasa y RNasa (ambas de Sigma-Aldrich Canadá, Oakville, Ontario). Los ácidos nucleicos se extrajeron con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1 v/v), y se precipitaron mediante la adición de glucógeno, acetato de sodio y etanol. Los precipitados se lavan con etanol helado al 80 % y se resuspenden en 50 pl de agua destilada. La concentración se determina midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un espectrofotómetro UV. Se determina el contenido de ácido nucleico de cada composición.
Las preparaciones de MapRNC recogidas antes y después del tratamiento con calor (121 ° C, 30 min) se analizaron electroforéticamente para determinar su perfil de ácido nucleico usando el sistema Bioanalyzer (Bioanalyzer modelo núm. 2100, Agilent, Santa Clara, CA, e E. UU.). La fracción de ácido nucleico se diluye a una concentración de 30 ng/pL. El análisis electroforético de la longitud del ácido nucleico extraído se realizó con la unidad de electroforesis Bioanalyzer usando el kit nano RNA 6000 (Agilent núm. 5067-1511). Este kit proporciona información sobre la calidad del ARN en un intervalo de 25 a 6000 nucleótidos. Se analizó posteriormente la MapRNC después de la esterilización en autoclave usando el kit de Small RNA (Agilent Technologies Canada Inc., St. Laurent, Quebec, Canadá, kit núm.
5067-1548), que está diseñado para el análisis de ácidos nucleicos pequeños en el intervalo de tamaño de 6 a 150 nucleótidos. La MapRNC antes del tratamiento con calor posee un perfil de ácido nucleico de entre aproximadamente 25 bases y cerca de 4000 bases cuando se analiza con el kit RNA nano 6000. El resultado demuestra que el uso de etapas de homogeneización a alta presión (diferente presurización y número de ciclos) para preparar MapRNC da como resultado una composición que contiene una longitud de cadena de polirribonucleótidos de 25-4000 bases. Después del tratamiento con calor, la MapRNC muestra una distribución más compacta. La MapRNC posee un pico de oligorribonucleótido que es máximo entre 20-40 bases y con un perfil de ácido nucleico de entre 5 y 60 bases de longitud. Las composiciones de MapRNC tienen solo cantidades menores de ácido nucleico eluyendo a 100 bases, e incluso menos material de oligorribonucleótidos eluyendo a aproximadamente 150 bases de longitud. Los resultados demuestran que el uso de pasos de homogeneización a alta presión y tratamiento con calor (diferente presurización y número de ciclos junto con esterilización en autoclave) para preparar MapRNC da lugar a una composición que contiene una longitud de cadena de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de menos de 60 bases.
El análisis de la relación de ADN a ARN de MapRNC preparado como en el ejemplo 38 se realiza primero usando digestión enzimática con RNasa-A de los ácidos nucleicos extraídos, seguida de la determinación del perfil de electroforesis del Bioanalyzer 2100 y la cuantificación del contenido de oligorribonucleótidos usando el kit Small RNA de Agilent (kit núm. 5067-1548). La digestión de la RNasa-A de los ácidos nucleicos extraídos se llevó a cabo mediante el uso de ribonucleasa A libre de DNasa (RNAsa-A, tratada a 100 °C durante 30 min para extraer la actividad DNasa) (0,1 pg de enzima, 2 h a 37°C). La RNasa A se obtuvo de Ameresco (Solon, OH, e E. UU.). Una muestra (20 ng/pL) de ácido nucleico tratado con RNasa A se analizó usando el Bioanalyzer. La cantidad de ADN y ARN se determina en MapRNC usando la ecuación:
Contenido ADN = (Contenido total Ácido Nucleico - Contenido Ácido Nucleico tras RNasa-A
El análisis de MapRNC muestra la presencia de ADN y ARN en el extracto de MapRNC.
El análisis de la relación de ADN a ARN de MapRNC de la presente invención se realiza como sigue. La fracción de ácido nucleico se recupera por ultrafiltración usando una unidad Microsep 1K (corte de peso molecular =1000 Da, Pall® Life Sciences, Ann Arbor, MI, EE. UU.). La solución de ácido nucleico se digiere a continuación a una mezcla de nucleósidos 5'-monofosfatos usando nucleasa P1 (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá) siguiendo el procedimiento informado por Liang (Liang y col., Ann. Chim. Acta. 2009 (650), 106-110). Para asegurar una digestión óptima de la nucleasa P1, se calentó un total de 50 pl de las soluciones acuosas de ácido nucleico para investigar en un baño de agua a 95-100 ° C durante 10 min, seguido de un enfriamiento inmediato en hielo. Se preparó la nucleasa P1 a razón de 5 unidades/pL en 30mM de tampón de acetato de sodio que contenía 0,5mM de ZnCb, pH 5.3. Para la digestión enzimática, se mezclaron 50 pL de ácido nucleico en solución acuosa con el mismo volumen de solución de nucleasa P1 y a continuación se incubó a 50 °C durante 30 min. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de un filtro Nanosep 10K mediante centrifugación a razón de 10.000 g durante 20 min a temperatura ambiente antes de análisis por HPLC.
Diluciones en serie de una mezcla de estándares de mononucleótidos (5'-desoxirribonucleótidos y 5'-ribonucleótidos, Sigma-Aldrich) que contienen 100, 10, 5, 2,5, 1 ng/pL cada uno de los mononucleótidos presentes en el ADN y el ARN también se tratan con un tratamiento con nucleasa P1 y se filtran para su uso como estándares en el análisis de HPLC. El orden de elución de estos nucleótidos se confirmó comparando el tiempo de retención de los nucleótidos individuales en la misma condición de HPLC. El análisis de HPLC se realizó usando un sistema de HPLC de la serie 1200 (Agilent, St-Laurent, Quebec, Canadá), que estaba equipado con una bomba cuaternaria con desgasificador, un muestreador automático, un calentador de columna y un detector UV de longitud de onda múltiple. Se usó un columna Zorbax Bonus-RP (Agilent) y las fases móviles comprendieron un gradiente lineal de 10 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7.2 y metanol (0-10 % de metanol). Los mononucleótidos se detectaron a 260 nm. La proporción de ADN:ARN se determina después de la determinación del contenido de ADN y ARN. El resultado demuestra que el ARN está presente en MapRNC además del ADN.
EJEMPLO 40
La MapRNC induce la activación del receptor de patrón molecular asociado a patógenos humanos (PAMP) NOD2 La actividad de activación de NOD2 de MapRNC preparada en el ejemplo 38 se evalúa usando células HEK-293 diseñadas para expresar el receptor NOD2 humano que dirige NF-kB y un marcador de señalización corriente abajo IL-8.
La línea celular humana HEK293-NOD2 (InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) se cultiva y mantiene en DMEM con alto contenido de glucosa, suplementado con 10 % de suero bovino fetal (ambos de Wisent, St-Bruno, Québec, Canadá), 100 pg/mL de Normocin ™ y 10 pg/mL de blasticidina (ambos de InvivoGen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2. Las células de HEK293-NOD2 se sembraron a razón de 5 x 105 células/mL en un volumen de 0,2 mL en microplacas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos estériles en el medio de cultivo celular descrito arriba, y se incubaron durante 48 horas con 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 pg/mL de MapRNC a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Se recogieron los sobrenadantes después de la incubación, se centrifugaron a 4000 x RCF durante 5 min a 4 °C para extraer las células y los desechos y el sobrenadante se almacenó a -20 °C para análisis. Se midió la IL-8 humana en el sobrenadante en los sobrenadantes después de 48 horas de cultivo con MapRNC mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima comercial (ELISA) de BioSource, Camarillo, CA, e E. UU. Los datos se capturaron de un lector de placas ELISA (ELx-808IU BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) y se expresaron en pg/mL de IL-8 sintetizada. MapRNC induce la síntesis y excreción de IL-8 de una manera dependiente de la dosis. Por tanto, el resultado muestra que MapRNC funciona como un agonista de NOD2 induciendo la liberación de IL-8 impulsada por NOD2 de una manera dependiente de la dosis.
EJEMPLO 41
MapRNC tiene actividad de activación de TLR2 humana
La actividad de activación de TLR2 de MapRNC preparada en el ejemplo 38 se mide usando células HEK-293 diseñadas para expresar el receptor TLR2 humano.
La línea celular humana HEK293-TLR2 se obtuvo de InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU. Las células HEK293-TLR2 se transfectan de manera estable con el gen TLR2 y un gen de fosfatasa alcalina embrionaria secretada impulsada por TLR2 receptor (SEAP), colocado bajo el control del gen NF-kB. La activación de TLR2 da lugar a la generación de actividad fosfato alcalina en el medio de cultivo celular, que se usa para cuantificar la activación del receptor. Las células se cultivan y se mantienen en DMEM con alto contenido de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10 % (ambos de Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá) y 1x Normocin ™ (InvivoGen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2. Las células HEK293-TLR2 se inoculan a razón de 5 x 105 células/mL en un volumen de 0,2 mL en microplacas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos estériles en medio de detección HEK-Blue™ (InvivoGen), y se incuban durante 18 horas con 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 pg/mL de MapRNC a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2. El medio de detección HEK-Blue™ agregado a los pocillos está diseñado para la detección de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina alcalina embrionaria soluble inducida por NF-kB (actividad SEAP). Después de una incubación de 18 horas, se determinó la densidad óptica (que es proporcional a la activación de NF-kB a través de la interacción de TLR2) a 630 nm usando un lector espectrofotómetro de microplacas (modelo ELx-808IU, BioTek Instrument, Winooski, VT, EE. UU.). Los datos se capturaron usando el paquete de software KC Junior (BioTek Instruments). La actividad SEAP en el sobrenadante celular aumenta de una manera relacionada con la dosis después del tratamiento con MapRNC. Por tanto, los resultados muestran que la MapRNC es capaz de activar TLR2 de una manera dependiente de la dosis (es decir, MapRNC actúa como un agonista de TLR2).
EJEMPLO 42
Actividad anticancerosa de MapRNC
La actividad anticancerosa de MapRNC como se preparó en el ejemplo 38 se determina usando líneas de células cancerosas representativas de los principales tipos de células cancerosas. Las células cancerosas de vejiga humana RT4 (catálogo ATCC núm. HTB-2™) se cultivan en placas en medio de cultivo DMEM y líneas celulares de cáncer de colon murino CT26 (catálogo ATCC núm. CRL-2638 ™) en medio RPMI 1640 ambos suplementados con 10 % de FBS inactivado con calor (ambos de Wisent) y 10 pg/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich) a una concentración de 5 x 105 células/mL en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (volumen de 50 pL), y se dejaron adherir a la superficie de los pocillos durante la noche a una temperatura de 37 ° C en una atmósfera de 5 % de CO2antes del tratamiento. Se suspende Jurkat de células de leucemia humana (ATCC TIB-152 ™) en medio de cultivo DMEM suplementado con FBS inactivado con calor al 10 % y 10 pg/mL de gentamicina a una concentración de 1x106 células/mL en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (volumen de 50 pl). La MapRNC tratada con calor (por ejemplo, 121 °C, 30 min) en un volumen de 50 pL de medio de cultivo tisular se añadió a las células para dar concentraciones finales de 0,01, 0,1, 1,0 y 10 pg/mL de MapRNC. A continuación, las células se incubaron durante 48 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5 % de CO2. La actividad antiproliferativa contra las líneas celulares cancerosas se determinó usando un ensayo de reducción de MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio). Brevemente, se añadieron 10 pL de una solución MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo después de 48 horas de incubación, y la incubación continuó durante 4 horas más. A continuación, se detuvo la reacción mediante la adición de 100 pL de isopropanol:HCl (24:1 v/v). La reducción de MTT conduce a la producción de formazán. Se solubilizó formazán mediante el uso de una micropipeta y se determinó la densidad óptica (DO) en un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm frente a controles apropiados. El porcentaje de inhibición de la proliferación celular se determinó mediante el uso de la ecuación:
% Inhibición = 100 -[(Prueba DO - Control DO)/Control DO].
Los resultados muestran que MapRNC tratada con calor tiene actividad antiproliferativa relacionada con la dosis contra las células cancerosas de vejiga RT4 y las células cancerosas de colon CT26, así como contra las células leucémicas de Jurkat. Por lo tanto, la MapRNC tiene una actividad anticancerosa que no se limita al tipo de cáncer.
EJEMPLO 43
Formulaciones combinadas de MRNC para la estimulación inmunitaria
Un experto en la materia después de leer los ejemplos anteriores usará una combinación apropiada de MRNC para lograr una actividad terapéutica óptima para la indicación deseada. Por lo tanto, una combinación de MpRNC y MvRNC proporcionará una activación óptima de NOD2 y TLR2 para la estimulación inmunitaria y la inducción de citocinas. De manera similar, una combinación de MpRNC y MvRNC proporcionará una actividad anticancerosa y una estimulación inmunitaria óptimas.
EJEMPLO 44
Combinación de MRNC con agentes terapéuticos usados en el tratamiento del cáncer.
Las composiciones de MRNC de la presente invención se combinan con quimioterapia y/o inmunoterapia para mejorar la eficacia clínica. La adición de MRNC a los siguientes regímenes quimioterapéuticos no pretende ser una lista completa (tal lista está disponible, por ejemplo, enThe Elsevier Guide to Oncology Drugs and Regimens, 2006, que describe más de 220 regímenes farmacológicos comúnmente en el tratamiento del cáncer), y debe entenderse que los expertos en la materia, después de leer los ejemplos de la presente invención, usarán las composiciones de la presente invención en el tratamiento del cáncer en entornos neoadyuvantes o adyuvantes con los regímenes de quimioterapia más apropiada. Los siguientes 2 protocolos sirven para ilustrar el principio de cómo se usa MRNC en combinación con quimioterapia e inmunoterapia:
Cánceres de colon y recto: los pacientes con cánceres de colon y recto que tienen enfermedad localmente avanzada tienen un alto riesgo de metástasis de hígado a través de la inoculación de la vena portal hepática del hígado. La quimioterapia a menudo se inicia antes o después de la resección quirúrgica (configuración neoadyuvante o adyuvante) con el objetivo de reducir la incidencia de metástasis hepáticas y metástasis secundarias posteriores a otros órganos. El 5-flurouracilo se usa a menudo en el tratamiento de la enfermedad metastásica o avanzada mediante el uso de un régimen de 1000 mg/m2por infusión intravenosa continua diaria durante 5 días que se repite cada 28 días. La MRNC de la presente invención puede administrarse como un bolo intravenoso o una infusión a una dosis terapéuticamente activa (determinada mediante estudios de evaluación clínica) antes, durante o después del tratamiento con 5-fluorouracilo. Las formulaciones de MRNC pueden administrarse a una dosis determinada en pruebas preclínicas y evaluaciones clínicas (estudios clínicos de fase 1, fase 2 y fase 3) para que sean las más eficaces. Tales dosis estarán en el intervalo de 0,00001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dosis. Los pacientes que reciben terapia combinada se benefician de un mayor tiempo hasta la recurrencia, una disminución de las metástasis, una disminución de la carga tumoral o la erradicación del tumor en comparación con los pacientes que reciben la terapia con 5-fluorouracilo solamente. Se pueden hacer uso de otros regímenes de quimioterapia conocidos por los expertos en la materia tales como, de modo no taxativo, 5-fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino con o sin bevacizumab; irinotecán, leucovorina y 5-fluorouracilo, con o sin cetuximab; o mitomicina c y 5-fluorouracilo, sin limitar la eficacia de MRNC.
Cáncer de pulmón: la ciclofosfamida en combinación con otros agentes quimioterapéuticos se usa para el tratamiento de pacientes no tratados previamente o pacientes con cáncer avanzado, recurrente o metastásico. Los regímenes típicos son, entre otros, ciclofosfamida, doxorrubicina (adriamicina) y etopósido (CAE), donde la ciclofosfamida se administra en una dosis de 1000 mg/m 2 IV el día 1, la doxorrubicina se administra a una dosis de 45 mg/m 2 IV el día 1, y el etopósido se administra a una dosis de 100 mg/m 2 IV en los días 1 a 3. El ciclo de tratamiento se repite cada 28 días. La MRNC de la presente invención se administra como un bolo intravenoso a una dosis óptima (las formulaciones determinadas de MRNC pueden administrarse a una dosis determinada en pruebas preclínicas y evaluaciones clínicas (estudios clínicos de fase 1, fase 2 y fase 3) para ser la más eficaz para mejorar la producción de macrófagos y granulocitos mediante la estimulación de MU-CSF, G-CSF y GM-CSF antes, durante o después de cada ciclo de tratamiento farmacológico quimioterapéutico. Tales dosis estarán en el intervalo de 0,00001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dosis. Los pacientes tratados con MRNC tienen una incidencia reducida de episodios infecciosos y ciclos de tratamiento retrasados relacionados con reducciones inducidas por la quimioterapia en los recuentos de monocitos y neutrófilos en comparación con los pacientes tratados con quimioterapia sola. Se pueden utilizar otros regímenes de quimioterapia para el tratamiento del cáncer de pulmón (primario o metastásico) sin limitar la eficacia de la MRNC.
Cáncer de cuello uterino: el cáncer de cuello uterino está asociado con la infección por VPH. Aunque unos 15 tipos de VPH son oncogénicos, se cree que los VPH 16 y 16 son responsables del 70 % de todos los cánceres de cuello uterino. Los protocolos de inmunización actuales son eficaces para prevenir infecciones, pero no lo son para tratar infecciones establecidas. Existe una necesidad insatisfecha en el tratamiento del cáncer de cuello uterino donde se requiere terapia contra las células cancerosas y una infección viral en curso si se quiere preservar la función cervical. La enfermedad avanzada, recurrente o metastásica se trata con carboplatino 50-100 mg/m2 IV y doxorrubicina 45-60 mg/m2 IV el día 1 y el ciclo se repite cada 21 días. La MRNC se administra localmente en el cuello uterino mediante una inyección intracervical a una dosis que se determina que es óptima para la estimulación inmunitaria mediante una investigación clínica previa antes, durante o después de la quimioterapia. Las formulaciones de MRNC pueden administrarse a una dosis determinada en pruebas preclínicas y evaluaciones clínicas (estudios clínicos de fase 1, fase 2 y fase 3) para que sean las más eficaces. Tales dosis estarán en el intervalo de 0,00001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dosis. MRNC tiene 2 efectos, primero hay una reducción en la carga viral de los virus del VPH (incluidos los VPH 16 y 18) en el cuello uterino a través de la generación de una respuesta inmunitaria contra las células infectadas por virus a través de la inducción de una respuesta inmunitaria, y segundo, un aumento de la eficacia clínica de los agentes quimioterapéuticos mediante la inducción de MU-CSF, G-CSF y GM-CSF.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende
ARN micobacteriano aislado de células micobacterianas; y,
paredes celulares micobacterianas aisladas de células micobacterianas,
donde la composición no contiene fenol o pronasa, y donde el ARN está en forma de oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de 2 a 150 bases de longitud.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además células micobacterianas intactas.
3. La composición de la reivindicación 1, donde la longitud de los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos es de 20 a 40 bases, o de 2 a 40 bases.
4. La composición de la reivindicación 2, donde las células micobacterianas intactas comprenden de 0,05 % a 95 % o de 0,19 % a 19,6 % de la composición en peso (% p).
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un portador o sistema de administración farmacéuticamente aceptable.
6. Un procedimiento para preparar la composición de la reivindicación 1, que comprende las etapas secuenciales de: A) alterar una biomasa de células micobacterianas para generar células micobacterianas alteradas, células micobacterianas intactas, paredes celulares micobacterianas alteradas y ARN;
B) opcionalmente separar las células micobacterianas intactas de las paredes de las células micobacterianas alteradas y el ARN;
C) separar el contenido citosólico soluble de una porción de las células micobacterianas alteradas de las paredes celulares micobacterianas alteradas y el ARN para obtener una pared celular micobacteriana, composición de ácido ribonucleico; y
D) calentar a una temperatura suficiente para generar oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos de 2 a 150 bases de longitud, donde las células micobacterianas intactas están inactivadas.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, donde los oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos tienen de 20 a 40 bases de longitud, o de 2 a 40 bases de longitud.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, donde la etapa de alteración A comprende homogeneización a alta presión a 10.000 psi o más.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, donde la etapa de alteración A se repite de 2 a 5 veces antes de las etapas de separación B o C.
10. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además repetir la etapa de alteración A de 2 a 5 veces después de la etapa de separación C.
11. El procedimiento de la reivindicación 6, donde la etapa de separación B es la centrifugación a baja velocidad y la etapa de separación C es la centrifugación a alta velocidad.
12. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además las etapas secuenciales de:
repetir las etapas A) y B) para controlar el número de células micobacterianas intactas.
13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso para el tratamiento del cáncer.
14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso para estimular un sistema inmunitario.
15. La composición de la reivindicación 14, donde estimular el sistema inmunitario comprende estimular la diferenciación de progenitor(es) hematopoyético(s), aumentar la secreción de citocinas o quimiocinas, aumentar la síntesis de factores de crecimiento hematopoyéticos, activar el dominio de oligomerización de unión a nucleótidos 2 (NOD2 ), o activar el receptor Toll-like 2 (TLr2).
16. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como medicamento para estimular la síntesis de factores de crecimiento hematopoyéticos.
17. La composición de la reivindicación 15 o 16, donde la micobacteria esMycobacterium phleiy los factores de crecimiento hematopoyéticos se seleccionan del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF-1a) y factor inhibidor de la leucemia (LIF), y combinaciones de los mismos.
18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como adyuvante de la terapia del cáncer o como adyuvante de la terapia inmunoestimulante.
19. La composición de la reivindicación 1 o 2 o el procedimiento de la reivindicación 6, donde las células micobacterianas son células de una o más micobacterias seleccionadas del grupo que consiste enMycobacterium phlei, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium aviumsubespecieparatuberculosisyMycobacterium bovisBCG. .
20. La composición para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de colon, leucemia, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de hígado o cáncer de cuello uterino.
21. La composición de la reivindicación 1 o 2 o el procedimiento de la reivindicación 6, donde las células micobacterianas son células deMycobacterium phlei.
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