CN114958831A - 一种难裂解细菌基因组dna提取方法 - Google Patents

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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种难裂解细菌基因组DNA提取方法。该方法包括：（1）设定压力、高压时间、低压时间和循环参数；（2）将含有难裂解细菌基因组DNA的样本置于裂解缓冲液中，放入能够持续承受压力的装置，根据设定的参数进行高压、低压快速循环；（3）获得裂解的细菌基因组DNA。本发明公开的方法，可以获得高质量的DNA。采用本发明方法提取的DNA还可适用于各种常规分子生物学操作，如酶切、PCR、实时荧光PCR、LAMP、文库构建、Southern杂交、芯片检测、高通量测序等。

Description

一种难裂解细菌基因组DNA提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种难裂解细菌基因组DNA提取方法。
背景技术
细菌基因组DNA提取是当前分子扩增和检测领域中最基本的实验操作之一，有着很多经典的方法，如匀浆器法、球磨法、反复冻融循环法等，但是这些方法针对诸如蜡样芽孢杆菌这类难裂解细菌的基因组DNA提取无法达到理想的效果。因此，需要一种难裂解细菌基因组DNA提取方法。
蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）属于产芽孢的革兰氏阳性杆菌，广泛分布于各种环境中，由于其芽孢具有抗逆性，可在经过高温处理、脱水干燥等食品杀菌的工艺中存活，同时由于难裂解，因而提取获得的DNA产量较低，以致影响后续实验。
高压循环技术（Pressure cycling technology，简称PCT）利用流体力学的原理，使用快速交替的高压和低压变换促使细胞溶解或裂解达到裂解样品目的，从而提高DNA的获得数量及质量。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于采用常规提取方法获得的蜡样芽孢杆菌等难裂解细菌的基因组DNA的质量不高的问题，提供一种难裂解细菌基因组DNA提取方法。
本发明提供一种难裂解细菌基因组DNA的方法，基于PCT技术改进了难裂解细菌DNA的提取方法，可以获得高质量的DNA，包括以下步骤：
（1）设定压力、高压时间、低压时间和循环参数；
（2）将含有难裂解细菌基因组DNA的样本置于裂解缓冲液中，放入能够持续承受压力的装置，根据设定的参数进行高压、低压快速循环；
（3）获得裂解的细菌基因组DNA；
所述的压力参数为5-35 kpsi，所述的高压时间参数为1-99s，所述的低压时间参数为1-99s，所述的循环参数为1-99。
本发明首次将PCT技术应用于处理蜡样芽孢杆菌，实现了对难裂解细菌基因组DNA的高效提取。
较好的，本发明的方法可以在能够持续承受压力的装置中进行，例如，能够承受压力参数为5-35 kpsi、高压时间为1-99s、低压时间为1-99s、循环参数为1-99的情况。在本发明的一个优选例中，所述的方法在压力室中进行。
本发明的难裂解细菌基因组DNA提取方法中，所述的压力参数可以根据需要裂解的样品进行调整，较好的，所述的压力参数可以采用10-35 kpsi，更好的，所述的压力参数可以采用20-35kpsi。
本发明的难裂解细菌基因组DNA提取方法中，所述的高压时间可以根据压力和需要处理的样本进行调整，较好的，采用3-30s，更好的，高压时间为5-10秒。
本发明的难裂解细菌基因组DNA提取方法中，所述的低压时间可以根据压力和需要处理的样本进行调整，较好的，低压时间为2-20s，更好的，低压时间为5-10秒。
本发明的难裂解细菌基因组DNA提取方法中，所述的循环参数为3-50次。较好的，所述的循环参数为5-20次，更好的，所述的循环参数为10-15次。
本发明方法中，所述的样本为难裂解细菌，其中细菌包括但不限于蜡样芽孢杆菌。
本发明方法中，所述的裂解缓冲液可以使用本领域常用的裂解缓冲液，也可以使用适用于难裂解细菌的裂解缓冲液。更好的，可以水代替，例如，去离子水、双蒸水，或者采用三蒸水。
本发明方法中，所述的DNA纯化可以使用本领域的常规方法，包括且不限于CTAB法、试剂盒法。
本发明方法中，在一具体实施方案中，所述的一种难裂解细菌为蜡样芽孢杆菌，所述的压力参数为35 kpsi，所述的时间参数为20s，所述的循环参数为14。
所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法还可以包括DNA分离或者纯化的步骤，对步骤（3）获得裂解的细菌基因组DNA进行分离或者纯化。
相应的，本发明的方法包括以下步骤：
设定压力、高压时间、低压时间和循环参数；
将样本放入压力室，根据设定的参数进行高压、低压快速循环；
将处理后的样本进行DNA纯化。
本发明提出的一种难裂解细菌基因组DNA提取方法，使用快速交替的高压和低压变换促使细胞溶解或裂解达到裂解样品目的，提高了DNA的获得数量及质量。所提取的细菌基因组DNA符合酶切、PCR、实时荧光PCR、LAMP、文库构建、Southern杂交、芯片检测、高通量测序中的一项或者多项的要求。
本发明的有益效果包括：能够高效地进行样品溶解，释放出质量好、数量足的生物分子，且操作方便、快速。采用本发明方法提取的基因组DNA浓度比目前常规使用的DNA提取方法更加快速，所得DNA的浓度大幅提高。可适用于各种常规分子生物学操作，包括酶切、PCR、实时荧光PCR、LAMP、文库构建、Southern杂交、芯片检测、高通量测序等实验。
具体实施方式
本发明提供了一种难裂解细菌基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤：
（1）设定压力、高压时间、低压时间和循环参数；
（2）将样本放入压力室，根据设定的参数进行高压、低压快速循环；
（3）将处理后的样本进行DNA纯化。
所述的压力参数为5-35 kpsi，所述的高压时间参数为1-99s，所述的低压时间参数为1-99s，所述的循环参数为1-99。
所述的压力参数为35 kpsi，所述的高压时间参数为10s，所述的低压时间参数为10s，所述的循环参数为14。
所述的样本为蜡样芽孢杆菌，所述的DNA纯化包括CTAB法、试剂盒法。
下面将通过本申请的实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分优选实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动所获得的所有其他实施例，都属于本申请的保护范围。
对比例
常规试剂盒法提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA：
蜡样芽孢杆菌菌种购于中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.3760。
取1mL细菌培养物使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒，按照其说明书，对蜡样芽孢杆菌进行裂解和基因组DNA提取，然后采用Nanodrop对提取的DNA进行测定。实验重复两次。通过上述步骤完成蜡样芽孢杆菌裂解和基因组DNA提取后，测得DNA浓度分别为3.98ng/µL和3.72ng/µL。
实施例1
采用本发明方法提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA：
蜡样芽孢杆菌菌种购于中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.3760。
首先在NEP2320仪器上进行参数设定：设定压力为35 kpsi，高压时间为10s，低压时间为10s，循环数为14。然后，将蜡样芽孢杆菌培养液放入压力室，运行程序；
取1mL处理后的样本使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒，按照其说明书，对蜡样芽孢杆菌进行裂解和基因组DNA提取，然后采用Nanodrop对提取的DNA进行测定。通过上述步骤完成蜡样芽孢杆菌基因组DNA提取后，测得DNA浓度为8.32ng/µL。
将提取获得的蜡样芽孢杆菌基因组DNA，采用特异性引物进行实时荧光PCR扩增，结果也获得了预期的扩增结果，表明采用本发明方法获得的蜡样芽孢杆菌基因组DNA质量很好。对比例采用常规试剂盒法提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA相比，提取的基因组DNA的浓度显著提高，表明本发明方法效果显著。
实施例2
采用本发明方法提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA
除了裂解细胞的缓冲液用水代替外，其余均按照实施例1的方法进行蜡样芽孢杆菌裂解和基因组DNA提取。通过上述步骤完成蜡样芽孢杆菌基因组DNA提取后，测得DNA浓度为28.3ng/µL。
将提取获得的蜡样芽孢杆菌基因组DNA，采用特异性引物进行实时荧光PCR扩增，结果也获得了预期的扩增结果，表明采用本发明方法获得的蜡样芽孢杆菌基因组DNA质量很好。与对比例采用常规试剂盒法提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA相比，提取的基因组DNA的浓度显著提高，表明本发明方法效果显著。
以上所述的实施例仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以本申请中权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心、国纳纳米技术研究（河北）有限公司
<120> 一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法
<130> 20220630
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
taaagccaca tccaatatag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
tgccttacat tgatgctg 18
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
gtcgttggtg agcaattgag gagtatcgtt ccagatttgt ga 42
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
cgactagggg tagtaatcat tggccacttt gctatggaac gtaac 45

Claims (10)

1.一种难裂解细菌基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤：
（1）设定压力、高压时间、低压时间和循环参数；
（2）将含有难裂解细菌基因组DNA的样本置于裂解缓冲液中，放入能够持续承受压力的装置，根据设定的参数进行高压、低压快速循环；
（3）获得裂解的细菌基因组DNA；
所述的压力参数为5-35 kpsi，所述的高压时间参数为1-99s，所述的低压时间参数为1-99s，所述的循环参数为1-99。
2.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的压力参数为35 kpsi。
3.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的高压时间参数为10s。
4.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的低压时间参数为10s。
5.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的循环参数为14。
6.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的样本含有蜡样芽孢杆菌。
7.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法包括DNA分离或者纯化的步骤，对步骤（3）获得裂解的细菌基因组DNA进行分离或者纯化。
8.根据权利要求7所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的DNA纯化选自CTAB法或者试剂盒法。
9.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所提取的细菌基因组DNA符合酶切、PCR、实时荧光PCR、LAMP、文库构建、Southern杂交、芯片检测、高通量测序中的一项或者多项的要求。
10.根据权利要求1所述的难裂解细菌基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的裂解缓冲液使用水代替。
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